KR100312070B1 - 고속 선별법을 포함하는 개선된 형질을 갖는 효소 변이체의 제조방법 - Google Patents

고속 선별법을 포함하는 개선된 형질을 갖는 효소 변이체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고속 선별법을 포함하는 개선된 형질을 갖는 효소 변이체의 선별방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 효소 유전자의 돌연변이 유발단계; 돌연변이 유발된 효소 유전자를 표면 발현 단백질의 유전자를 포함하는 발현벡터에 결합한 다음, 미생물 숙주에 도입하는 효소 유전자 변이체 라이브러리의 구축단계; 구축된 효소 유전자 변이체 라이브러리의 미생물 숙주 표면으로의 발현단계; 그리고 증가된 증식속도 또는 효소활성을 나타내는 미생물 숙주의 탐색 및 선별 단계를 포함하는 효소 변이체의 선별방법에 관한 것으로서, 신속하게 효소 변이체의 탐색 및 선별단계를 수행할 수 있어 전체 과정이 용이하게 되는 효과가 있다.

Description

고속 선별법을 포함하는 개선된 형질을 갖는 효소 변이체의 제조방법{Method of Selecting Enzyme Variants Including High Throughput Screening}
본 발명은 개선된 형질을 갖는 효소 변이체의 선별방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 고속 선별법을 포함하는 개선된 형질을 갖는 효소 변이체의 선별방법에 관한 것이다.
효소의 인공적개량에 필수적인 대량의 효소변이체 라이브러리로부터 신속히 목적성질을 갖는 효소변이체를 탐색할 수 있는 신규 선택방법에 관한 것이다.
일반적으로 효소의 인공적 개량이라 함은 무작위적 돌연변이 (random mutagenesis)와 탐색 (screening)을 연속적으로 수행함으로써 원하는 성질를 갖는 효소변이체를 얻는 것을 말한다. 원하는 성질의 개량 (directed evolution)이라 함은 자연적으로 존재하는 다양한 유기체로부터의 추출로 얻을 수 있는 효소의 성질과는 달리 효소활성 자체의 증가; 기질 특이성의 변화; 광학 활성기질에 대한 선택성 변화; 온도, 유기용매 또는 고농도 염에 대한 안정성의 증가와 같은 효소의 산업적인 응용을 위해 필요로 하는 신규 성질을 갖게 됨을 말한다 (Kuchner 와 Arnold, Trends Biotechnol., 15, 523-530(1997)). 이에, 효소의 인공적 개량은 효소의 어떤 성질을 개량해야 할 지를 먼저 결정하고 적당한 숙주세포에 활성을 갖는 가용성 효소로 발현한 다음 다양한 선택과 탐색방법을 이용하여 최종 효소를 얻는 세단계로 구성되는 연속과정이라 할 수 있다.
상기한 효소의 개량을 위해서는 먼저 돌연변이된 효소의 변이체 라이브러리를 구축해야 한다. 어떤 한 단백질의 개량을 위한 유전적 다양성, 즉 변이체 라이브러리의 생성은 에러 유발 PCR (error prone PCR), 돌연변이유발 숙주세포를 이용한 변이와 같은 포인트 돌연변이법 (point mutation), 조합형 카세트 돌연변이법 (combinatorial cassette mutagenesis) 또는 DNA 셔플링 (DNA shuffling) (Stemmer, Nature, 370, 389-391(1994년))과 같은 방법으로 수행될 수 있다.
한편, 효소개량의 제한요소는 대상 유전자에 대한 이러한 유전적 라이브러리를 제조하는 것이 아니라 제조된 효소변이체 라이브러리로부터 어떻게 빠른 시간안에 목적성질을 갖는 효소변이체를 탐색 및 선택하느냐 하는 것이다.
현재까지 개발된 효소변이체 탐색 및 선별방법은 다음과 같다: 항생제농도가 증가된 한천배지에서의 형성된 콜로니의 선택법으로 향상된 항생제 내성을 보이는 항생제분해 효소의 개량법 (Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci., 91, 10747-10751(1994)); 가시적인 탐색을 위한 발색기질의 사용법 (Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94, 4504-4509(1997); Moore 과 Arnold, Nature Biotechnol., 14, 458-467(1996년)); 그리고 영양요구성 숙주세포를 사용한 능동적 선택법 (Yano et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 95, 5511-5515(1998년)).
최근에는 이러한 탐색 및 선별법의 중요성이 대두되면서 보다 효과적인 다음과 같은 방법들이 개발되었다: 서브틸리신 (subtilisin)을 분비하는 고초균을 실관막에서 배양하여 소혈청알부민을 유일 질소원으로 사용하여 보다 빠르게 증식하는 클론을 선택하는 방법 (Naki et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 43, 230-234(1998년)); 파아지의 감염성을 이용한 새로운 탐색법 (Spada et al., J. Biol.Chem., 378, 445-456(1997)); 그리고 물과 기름 현탁액 내에서의 유전자 DNA와 발현된 효소와의 구분법을 이용한 탐색법 (Tawfik과 Griffiths, Nature Biotechnol., 16, 652-656(1998년)).
한편, 보다 신속하고 간편한 탐색 및 선별법에 대한 요구는 계속되고 있는 실정이다.
본 발명자들은 상기한 신속하고 간편한 탐색 및 선별법을 포함하는 효소 변이체 선별방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 외래단백질을 박테리아 표면에 안정하고 효과적으로 발현할 수 있는 박테리아 표면발현 시스템을 이용하는 경우에는 효소 변이체의 탐색 및 선별이 신속하고 간편하게 되며 결과적으로 용이하게 효소 변이체를 선별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 고속 선별법을 포함하는 개선된 형질을 갖는 효소 변이체의 제조방법을 제공하는 데 있다.
도 1은 카복시메칠셀룰라제에 의한 카복시메칠셀룰로오스의 분해산물의 이온크로마토그램이다.
도 2는 본 발명에서 이용되는 재조합 플라스미드 pYSK3의 개열지도이다.
도 3은 카복시메칠셀룰로오스가 포함된 M9 최소평판배지에서 증식한 형질전환체 대장균 JM109/pYSK3의 콜로니를 나타낸 사진이다.
도 4는 본 발명 선별과정 중 구축된 효소 변이체 라이브러리를 카복시메칠셀룰로오스가 포함된 M9 최소평판배지에서 증식한 콜로니를 나타낸 사진이다.
도 5는 증가된 증식속도를 나타낸 라이브러리 변이체 콜로니를 콩고래드 염색시약으로 처리하여 환 형성을 관찰한 사진이다.
도 6은 본 발명에 따라 제조된 변이체의 전세포 효소활성을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따라 선별된 활성이 증가된 효소 변이체를 세포내 유리된 형태로 발현시켜 측정한 비효소활성을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 고속 선별법을 포함하는 개선된 형질을 갖는 효소 변이체의 선별방법을 특징으로 한다.
본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다:
본 발명의 개선된 형질을 갖는 효소 변이체의 제조방법은 효소 유전자의 돌연변이 유발단계; 돌연변이 유발된 효소 유전자를 표면 발현 단백질의 유전자를 포함하는 발현벡터에 결합한 다음, 미생물 숙주에 도입하는 효소 유전자 변이체 라이브러리의 구축단계; 구축된 효소 유전자 변이체 라이브러리의 미생물 숙주 표면으로의 발현단계; 그리고 증가된 증식속도 또는 효소활성을 나타내는 미생물 숙주의 탐색 및 선별 단계를 포함한다.
본 발명에 있어서, 돌연변이 유발되는 효소는 가수분해효소가 효과적이며, 바람직하게는 다당류 가수분해효소이고, 보다 바람직하게는 카복시메칠셀룰라제 또는 키틴나제이다.
한편, 상기 효소 유전자의 돌연변이 유발은 DNA 셔플링법, 에러유발 PCR, 포인트 돌연변이법 및 조합형 카세트 돌연변이법으로 구성된 그룹에서 선택되는 1종의 방법으로 수행되는 무작위 돌연변이 유발을 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 이용되는 상기 발현벡터는 복제원점; 항생제 내성 유전자; 제한효소 자리; 세포-표면 발현 단백질을 코딩하는 유전자; 그리고 세포-표면 발현 단백질을 코딩하는 유전자에 인접한 효소 유전자 삽입자리를 포함하는 것으로서, 바람직하게는 도 2에 도시된 개열지도를 갖는 pYSK3를 이용하는 것이다.
한편, 상기 발현벡터 pYSK3는 본 발명자들에 의해 발명 및 특허등록 (대한민국 특허 제 185335 호)한 빙핵활성단백질 표면발현시스템을 이용한 것으로서, 이 발현시스템은 기존의 다른 기술이 갖고 있는 단점, 예를 들어 세포외막의 구조에 직접적으로 영향을 주고 숙주세포의 생존력를 떨어뜨리는 등의 단점 (죠르지유 등, Protein Engineering, 9권, 239-247(1996))이 없는 안정하고 효과적인 기술이다 (정흥채 등, Nature Biotechnology, 16, 576-580(1998)).
따라서, 상기 발현벡터 pYSK3를 이용하는 경우에는 효소 라이브러리를 표면에 발현하게 됨으로써 박테리아 표면에 구축된 효소는 기질과의 접근이 용이하고 콜로니가 직접 한천배지위에서 환을 형성할 수 있어 대량의 콜로니를 가시적으로 구분할 수 있다. 특히, 카복시메칠셀룰라제 효소의 기질이 다당체의 고분자일 경우 상기한 장점이 더욱 분명하게 되는 바, 숙주세포가 이용할 수는 없지만 해당효소의 작용에 의해 생겨나는 산물에는 성장할수 있는 효소의 기질을 유일영양원으로 사용할 경우는 표면에 발현된 기질분해효소의 양에 의존하거나 효소의 활성에 의존하여 미생물이 증식하게 되고, 효소활성이 증가된 효소변이체에 의존하여 빠른 속도로 증식하여 고분자기질을 포함한 최소한천배지에서 보다 큰 콜로니를 형성하게 된다. 따라서, 탐색 및 선별을 가시적으로 신속하게 수행할 수 있게 된다.
한편, 본 발명에서 이용되는 미생물 숙주는 그람 음성 박테리아가 바람직하다.
본 발명 탐색 및 선별단계에서 행하는 증가된 증식속도의 측정은 최소 한천배지에서 증식하는 미생물 숙주에 의해 형성되는 환 크기를 측정하여 수행되며, 선별하고자 하는 효소 변이체가 카복시메칠셀룰라제인 경우에는 카복시메칠셀룰로오스를 유일 탄소원으로 하는 최소한천배지에서 표면발현되는 카복시메칠셀룰라제에 의해 형성되는 환 크기를 측정하여 증식속도를 측정한다.
또한, 증가된 효소활성 측정은 미생물 숙주를 파쇄하지 않고 직접 배지 위에서 수행하는 발색반응에 의해 이루어지며, 제조하고자 하는 효소 변이체가 카복시메칠셀룰라제인 경우에는 표면발현된 카복시메칠셀룰라제에 의해 분해된 카복실메칠셀룰로오스의 분해산물을 환원당 염색시약으로 발색하여 환 크기를 측정하여 수행한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 특히 카복시메칠셀룰라제는 예시일 뿐 본 발명이 제공하는 효소 변이체 제조방법은 다른 효소, 바람직하게는 가수분해 효소에 적용된다.
실시예 1: 카복시메칠셀룰로오스의 카복시메칠셀룰라제에 의한 분해
베타-글루코시다제의 일종인 고초균 유래 카복시메칠셀룰라제에 의해 분해되는 카복시메칠셀룰로오스의 분해산물을 본 발명에서 이용되는 숙주세포인 대장균이 이용할 수 있는 지를 확인하기 위하여, 디오넥스 (Dionex)사 이온 크로마토그라피의 일종이고 펄스전류탐지계 (PAD-Pulsed amperometric detection)가 부착된 고페하 음이온교환 크로마트그라피 (HPAEC-High pH anion exchange chromatography)를 이용하여 분해산물을 분석하였다. 이때, 칼럼은 디오넥스사의 카르보팩 (Carbopac) PA1 분석용을 사용하였고 용출액 1은 탈이온화 물, 용출액 2는 200 mM 수산화나트륨, 용출액 3은 200 mM 수산화나트륨 및 1 M 초산나트륨을 사용하였으며 유속은 분당 1 ㎖로 하였다.
한편, 표준시료로서 포도당 (G1), 포도당다이머 (G2), 포도당트리머 (G3), 포도당테트라머 (G4) 및 포도당펜타머 (G5)를 각각 증류수 1 ℓ당 1 g이 되도록 용해한 다음 상기한 방법으로 분석한 결과를 도 1의 (A)에 나타내었다.
카복시메칠셀룰로오스를 0.5%가 되도록 50 mM 구연산염 완충용액에 용해하고 부분순수분리된 카복시메칠셀룰라제를 첨가한 다음, 55℃에서 15시간 반응시킨 후 생성물을 분석하였는 바, 포도당, 포도당다이머, 포도당트리머 및 소량의 포도당테트라머가 생성됨을 확인할 수 있었다 (참조: 도 1의 (B)). 따라서 숙주세포로 이용될 대장균이 생성된 포도당을 이용하여 증식할 수 있음을 알 수 있었다.
한편, 동일한 조건하에서 본 발명에 따라 제조된 신규 효소 변이체인 2R59을 사용하여 분해하였을 경우도 동일한 결과를 얻을 수 있었다 (참조: 도 1의 (C)).
실시예 2: 카복시메칠셀룰라제의 대장균 표면으로의 발현
카복시메칠셀룰라제를 대장균표면에 발현시키기 위하여 다음과 같이 본 발명자들에 의해 개발된 빙핵활성단백질 표면발현시스템을 이용하였다: 우선, 카복시메칠셀룰라제 유전자를 빙핵활성단백질 표면발현벡터인 pSSTS110 (KCTC 0327BP; 정흥채 등, Nature Biotechnol., 16, 576-580(1998))에 서브클로닝하기 위하여 서열 1 및 서열 2에 기재된 올리고 뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하고, 카복시메칠셀룰라아제 유전자를 갖고 있는 플라스미드 pUBS101 (박승환 등, Agri. Biol. Chem., 55, 441-448(1991))를 주형으로 사용하여 PCR을 수행하였다 (다카라 ExTaq DNA 중합효소, 30회전, 94℃, 1분/50℃, 1분/72℃, 1분). 이어, 증폭된 1.3 kb DNA 단편을XmaI 과HindIII로 절단한 후 동일한 제한효소로 처리한 pSSTS110에 연결하고, 다시KpnI 및HindIII로 절단된 DNA 단편을 동일한 효소로 처리된 벡터 pEIN229 (정홍채 등, Nature Biotechnol., 16, 576-580(1998))에 서브클로닝함으로써, 새로운 벡터 pYSK3를 제조하였다 (참조: 도 2). 도 2에서 mCMCase는 카복시메칠셀룰라제, INP는 빙핵활성단백질을 각각 나타내는 것이다. 그런 다음, 제조된 pYSK3를 대장균 JM109에 도입시켜 형질전환체 대장균 JM109/pYSK3를 제조하였다.
이에, pYSK3에 의해 형질전환된 대장균 JM109를 대장균 (Escherichia coli) JM109/pYSK라 명명하고, 이를 한국과학기술연구원 유전자은행에 1999년 3월 5일자로 기탁하여, 기탁번호 KCTC 0584BP를 부여받았다.
제조된 플라스미드 pYSK3의 염기서열은 염기서열 결정용 빅다이 터미네이터 반응키트 (퍼킨엘머사, 미국)를 사용할 수 있는 ABI 프리즘 377 DNA 시컨서기기(퍼킨엘머사, 미국)를 이용하여 결정하였으며, 그 결과는 서열 8에 나타내었고, 이에 의해 결정되는 아미노산 서열은 서열 9에 나타내었으며, 숙주인 대장균에 형질전환시킨 다음 유도체로 유도할 경우 카복시메칠셀룰라제 및 빙핵활성단백질이 융합된 형태로 발현됨을 알 수 있었다.
실시예 3. 카복시메칠셀룰라제를 표면발현한 대장균의 카복시메칠셀룰로오스를 이용한 증식
실시예 1에서 보았듯이 카복시메칠셀룰라제의 분해산물중에는 대장균 세포가 이용할 수 있는 소량의 포도당이 생성되었다. 숙주세포 대장균이 표면에 발현된 카복시메칠셀룰라제에 의존하여 카복시메칠셀룰로오스를 유일탄소원으로 증식하는지를 시험하기 위하여 실시예 2에서 제조된 플라스미드 pYSK3를 대장균 JM109에 도입하고 카복시메칠셀룰로오스 0.5% (w/v), 유도체 (IPTG; isopropyl-β-D-glucopyranoside) 1mM, 티아민 100 ㎍/㎖ 및 암피실린 50 ㎍/㎖ 가 포함된 M9 최소한천배지에 도말하여 37℃에 72시간 배양하고 콜로니 형성 여부를 관찰하였다.
도 3에서 볼 수 있듯이 형질전환체 대장균 JM109/pYSK는 상기 최소한천배지에서 증식하여 콜로니를 형성함을 알 수 있었다.
실시예 4: 카복시메칠셀룰라제 유전자 돌연변이 유발 및 변이체 라이브러리의 구축
카복시메칠셀룰라제 유전자 변이체 라이브러리는 스테머가 개발한 DNA 셔플링법 (Stemmer, Nature, 370, 389-391(1994))을 사용하여 다음과 같이 구축하였다:
DNA 셔플링법은 (1) 해당 유전자의 PCR 증폭 및 프라이머 제거, (2) 증폭된 유전자 단편의 DNaseI으로의 분해 및 50-100 bp 핵산 단편들의 분리, (3) 프라이머가 없는 PCR을 통한 핵산단편들의 재조립, 최종적으로 (4) 프라이머를 이용한 최종 PCR의 수행에 의한 해당 유전자의 제조 순서로 행하여지며 PCR의 에러유발 돌연변이와 핵산단편화후 재조립과정중의 재조합에 의한 인위적인 돌연변이로 전체적으로 해당유전자의 돌연변이체 라이브러리를 구축할 수 있는 방법이다.
본 발명에서의 카복시메칠셀룰라제 유전자를 1차 셔플링하는 과정은 다음과 같다. 우선, 셔플링 출발 핵산단편은 실시예 2에서 제조된 플라스미드 pYSK3에 존재하는 카복시메칠셀룰라제 유전자를 100 pmol 서열 3의 프라이머 및 100 pmol 서열 4의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭한 후 (30회전, 94℃, 1분/50℃, 1분/72℃, 1분), 프라이머를 제거할 수 있는 유전자 분리키트 (키아엑스II DNA 분리정제키트, 키아젠사, 독일)를 이용하여 0.8% 아가로스 겔 전기영동함으로써 1.3 kb 핵산만을 순수분리하여 사용하였다.
이어, 순수분리된 1.3 kb 핵산단편 4 ㎍을 DNaseI으로 분해하여 2% 아가로스 겔 전기영동후 50-200 bp 단편들만을 순수분리하고 프라이머 없이 재조립 PCR을 수행하였다. 이때 다카라 재조합 Taq DNA 중합효소를 사용하고 94℃, 30초/50℃, 30초/72℃ 및 65초 조건으로 60회전을 수행하였다.
그런 다음, 재조합된 반응물을 50배 희석하여 100 ㎕ 최종부피에 30 pmol 서열 5의 프라이머 및 30 pmol 서열 6의 프라이머를 사용하고 94℃, 60초/55℃, 60초/72℃, 60초 조건으로 30회전하여 최종 PCR를 수행하였다. 그 결과 1.3 kb 크기의 셔플링된 카복시메칠셀룰라제 유전자 단편들을 얻었으며, 상기 분리된 유전자 단편은XmaI 및HindIII로 처리하고 다시 순수분리여 동일한 제한효소로 처리한 pYSK3에 연결하였다.
그리고 나서, 상기 과정에 의해 제조된 재조합 플라스미드를 대장균 JM109에고효율 형질전환법 (Inoue et al., Gene, 96, 23-28(1990))을 이용하여 도입함으로써 최종적으로 카복시메칠셀룰라제 유전자 변이체 라이브러리를 구축하였다.
실시예 5: 카복시메칠셀룰라제 유전자 변이체 라이브러리의 표면발현과 1차 탐색 및 선별
실시예 4에서 제조된 카복시메칠셀룰라제 유전자 변이체를 실시예 3에서와 동일한 방법으로 카복시메칠셀룰로오스가 포함된 M9 최소 한천배지에 도말하고 37℃에서 72시간 배양한 다음, 콜로니 직경을 서로 비교하여 약 10000개의 변이체 중 증식 속도가 큰 200여개를 탐색 및 선별하였다 (참조: 도 4).
상기 증식차이로 1차 선별된 콜로니를 콩고 레드 염색법을 이용하여 다음과 같이 재비교, 확인하였다: 우선, 상기 선별된 200여개의 변이체를 1 mM IPTG 유도체 및 100 ㎍/㎖의 루리아-버타니 한천배지 (LB배지, 효모액기스 5 g/ℓ, 트립톤 10 g/ℓ 및 소금 5 g/ℓ)에 하룻밤 계대배양한 다음, 톱아가 0.75% 및 카복시메칠셀룰로오스 0.5%(w/v)가 포함된 LB배지로 덮어 씌우고 카복시메칠셀룰로오스가 분해되도록 37℃에서 6시간동안 방치하였다. 이어, 변이체 콜로니 주위에 생성된 환원당을 콩고 레드 염색시약 (0.2% (w/v))으로 30분동안 염색하고, 1 M 소금물로 10분동안 세정하여 생성된 환크기를 비교함으로써 대장균 표면에 발현된 카복시메칠셀룰라제 변이체의 활성이 증가한 것을 재비교할 수 있었다 (참조: 도 5).
실시예 6: 2차 및 3차 셔플링을 이용한 카복시메칠셀룰라제 변이체 라이브러리의 구축, 표면발현, 탐색 및 선별
실시예 5에서 1차 탐색된 200개의 변이체는 다시 2차 DNA 셔플링을 위한 기질로 사용하였다. 각각의 변이체 유전자는 서열 1 및 서열 2의 프라이머를 이용하여 200개의 변이체로부터 콜로니를 마이크로튜브에 옮기고 10 ㎕ 증류수를 첨가한 다음, 100℃에서 가열하여 DNA를 유리하고, 원심분리하여 상등액을 유전자원으로 사용하여 카복시메칠셀룰라제 유전자만을 PCR 전반응체키트 (PCR 프리믹스, 바이오니아사)로 증폭 (30회전, 94℃, 1분/50℃, 1분/72℃, 1분)하여 확보하였다.
이어, 상기 확보된 1.3 kb의 카복시메칠셀룰라제 변이 유전자를 서로 혼합한 약 5 ㎍를 2차 DNA 셔플링을 위한 기질로 사용하여 실시예 4와 동일한 방법으로 변이체 라이브러리를 구축하였다. 그런 다음, 실시예 5에 개시된 방법과 동일하게 표면발현, 탐색한 후 150 여개의 카복시메칠셀룰라제 효소활성이 증가한 변이체를 선별하였다.
상기한 방법과 동일하게 3차 셔플링에 의한 변이체를 제조하고, 최종적으로 150 여개의 변이체를 선별하였다.
실시예 7: 단계별로 선별된 표면발현된 변이체들의 전세포 효소활성비교
상기한 실시예 4, 5 및 6에서의 1차 2차 및 3차의 탐색으로 얻어진 각각 150-200 여개의 서로 다른 변이체의 표면에 발현된 효소의 전세포 효소활성을 비교하여 각 단계에서 활성이 가장 우수한 3개씩의 클론을 각각 선택하였다.
상기 전세포 효소활성은 다음과 같이 측정하였다: 우선, 대장균 변이체를 암피실린 100 ㎍/㎖이 포함된 LB 배지에서 37℃로 배양하고 600 nm에서 현탁도를 측정하여 흡광도가 0.4일 때 IPTG 유도체 1 mM로 1시간 30분동안 단백질 발현을 유도하였다. 이어, 발현이 유도된 대장균 배양액 1 ㎖을 윈심분리하여 세포를 회수하고 0.05 M 구연산염 완충용액 (pH 5.5)으로 세정한 다음, 동일한 완충용액 0.5 ㎖에 재현탁하고 1% 카복시메칠셀룰로오스용액 0.5 ㎖과 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시키고 원심분리하여 세포를 제거한 후 상등액에 유리된 환원당의 양을 디엔에스법으로 측정하여 효소활성을 확인하였다 (박승환 등, Agric. Biol. Chem., 55, 441-448(1991)). 그런 다음, 각 단계에서 활성이 가장 우수한 3개씩의 클론을 각각 선택하였다.
1차 탐색결과 활성이 우수한 변이체를 1R86, 1R169 및 1R186이라 명명하고, 2차 탐색결과 활성이 우수한 변이체를 2R29, 2R33 및 2R59라 명명하였으며, 3차 탐색결과 활성이 우수한 변이체를 3R38, 3R139 및 3R256이라 명명하고, 이들의 전세포활성은 도 6에 나타내었으며, 흡광도는 600nm에서 측정한 것이다. 도 6에서 볼 수 있듯이, 3차 탐색의 결과 전세포 활성이 약 4배 이상 증가된 변이체 3R256을 얻었다.
실시예 8: 단계별로 선별된 효소 변이체들의 유리된 형태로의 발현 및 효소활성비교
실시예 7에서 선별된 효소 변이체가 빙핵활성단백질과 유리된 자유형태로 발현되어도 동일하게 우수한 활성을 나타내는 지를 확인하기 위하여 효소변이체 유전자를 각각 독립적으로 발현되도록 발현용 벡터인 pKK223-3 (파마시아사, 스웨덴)을 이용하여 다음과 같이 서브클로닝을 하였다:
우선, 각각의 유전자를 서브클로닝하기 위하여 서열 6 및 서열 7의 프라이머를 각각 사용하고 실시예 2와 동일한 방법으로 유전자를 증폭하여 제한효소XmaI 과HindIII로 처리하고 동일한 효소로 처리된 벡터 pKK233-3 (파마시아사, 스웨덴)에 연결하였다.
이어, 제조된 각각의 재조합 플라스미드를 대장균 JM109에 형질전환시킨 다음, LB배지에서 유도체인 IPTG 1 mM로 발현을 유도하였다. 그런 다음, 세포내에 발현된 효소활성을 측정하기 위하여 세포를 파쇄하고 상기 실시예 7의 전세포 효소활성측정과 동일한 방법으로 효소활성을 측정하였으며, 총 단백질량은 브래드포드법 키트 (바이오래드사)를 사용하여 결정하였다.
한편, 측정된 카복시메칠셀룰라제의 비효소활성은 도 7에 나타내었다. 도 7에서 알 수 있듯이, 상기 실시예 7의 전세포 효소활성과는 달리 모효소활성보다 2배정도 증가된 변이체 2R29, 2R59, 3R38 및 3R256을 확인할 수 있었다.
실시예 9: 효소 변이체 염기서열 및 아미노산 서열의 비교
상기 실시예 7 및 8에서 선택된 9개의 효소 변이체의 유전자 염기서열은 염기서열 결정용 빅다이 터미네이터 반응키트 (퍼킨엘머사, 미국)를 이용할 수 있는 ABI 프리즘 377 DNA 시컨서기 (퍼킨엘머사, 미국)를 이용하여 결정하였으며, 그 결과 변이가 발생된 아미노산은 다음 표 1에 나타내었다.
상기 표 1에서 알 수 있듯이, 각각의 변이체에서는 무작위로 돌연변이가 일어났고, 어떠한 공통된 치환된 아미노산 위치도 발견할 수 없었다. 특히, 3R38인 경우는 효소의 활성부분만 존재하고 셀룰로오스와 결합할 수 있는 결합부위가 절단된 변이체이지만 비교적 높은 효소활성을 보였다.
예언적 실시예 1
상기 실시예들과 동일한 방법으로 세라티아 마르세슨스 (Serratia marcescens) 유래 키틴나제 유전자 1.7 kb를 PCR 증폭하여 실시예 2에서 제조한 빙핵활성단백질 표면발현 벡터 pYSK3에 존재하는 1.3 kb의 카복시메칠셀룰라제 유전자 대신 삽입하여 대장균에 형질도입하면 키틴나제는 빙핵활성단백질에 의해 대장균의 표면에 부착발현된다. 이렇게 제조된 재조합 대장균은 키틴을 유일 탄소원으로 증식할 수 있으며 실시예 4와 같이 키틴나제 유전자의 변이체 라이브러리를 제조하고 실시예 5와 같이 대장균의 표면에 발현할 수 있다. 표면발현된 다양한 라이브러리 콜로니는 키틴 최소 한천평판배지에서 표면발현된 효소의 활성에 따라 증식 차이에 기인한 크기 차이가 있으며 동시에 키틴분해에 의한 콜로니 주위에 투명한 환을 볼 수 있다.
따라서 동시에 콜로니크기와 콜로니 주위의 투명환의 차이에 의한 가시적이고 신속한 활성 비교가 가능하다.
본 발명은 개선된 형질을 갖는 효소 변이체의 선별방법을 제공한다. 본 발명의 선별방법은 표면발현시스템을 갖는 발현벡터를 이용함으로써, 탐색 및 선별을 가시적으로 신속하게 수행할 수 있어, 전체 과정이 용이하게 수행될 수 있는 효과가 있다.

Claims (13)

  1. 다음과 같은 단계를 포함하는 개선된 형질을 갖는 효소 변이체의 선별방법:
    (1) 효소 유전자의 돌연변이 유발단계;
    (2) 돌연변이 유발된 효소 유전자를 빙핵활성 단백질을 코딩하고 있는 발현벡터에 결합한 다음, 미생물 숙주에 도입하는 효소 유전자 변이체 라이브러리의 구축단계;
    (3) 상기에서 구축된 효소 유전자 변이체 라이브러리의 형질전환시킨 미생물 숙주세포를, 상기 효소와 반응하여 생성된 산물을 필수영양분으로 포함하고 있는 배지에 배양시켜 숙주세포의 표면에 목적하는 효소를 발현시키는 단계; 그리고
    (4) 증가된 증식속도 또는 효소활성을 나타내는 미생물 숙주의 탐색 및 선별단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 변이된 효소는 가수분해효소인 것을 특징으로 하는 개선된 형질을 갖는 효소 변이체의 선별방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 가수분해효소는 다당류 가수분해효소인 것을 특징으로 하는 개선된 형질을 갖는 효소 변이체의 선별방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 다당류 가수분해효소는 카복시메칠셀룰라제 또는 키틴나제인 것을 특징으로 하는 개선된 형질을 갖는 효소 변이체의 선별방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 효소 유전자의 돌연변이 유발은 DNA 셔플링법, 에러유발 PCR, 포인트 돌연변이법 및 조합형 카세트 돌연변이법으로 구성된 그룹에서 선택되는 1종의 방법으로 수행되는 무작위 돌연변이 유발인 것을 특징으로 하는 개선된 형질을 갖는 효소 변이체의 선별방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 발현벡터는 복제원점; 항생제 내성 유전자; 제한효소 자리; 세포-표면 발현 단백질을 코딩하는 유전자; 그리고 세포-표면 발현 단백질을 코딩하는 유전자에 인접한 효소 유전자 삽입자리를 포함하는 것을 특징으로 하는 개선된 형질을 갖는 효소 변이체의 선별방법.
  7. 제 1 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 2에 도시된 개열지도를 갖는 pYSK3 (KCTC 0584BP)인 것을 특징으로 하는 개선된 형질을 갖는 효소 변이체의 선별방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 미생물 숙주는 그람 음성 박테리아인 것을 특징으로 하는 개선된 형질을 갖는 효소 변이체의 선별방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 증가된 증식속도의 측정은 최소 한천배지에서 증식하는 미생물 숙주에 의해 형성되는 환 크기를 측정하여 수행되는 것임을 특징으로 하는 개선된 형질을 갖는 효소 변이체의 선별방법.
  10. 제 1 항 또는 제 9 항에 있어서, 상기 증가된 증식속도의 측정은 카복시메칠셀룰로오스를 유일 탄소원으로 하는 최소한천배지에서 표면발현되는 카복시메칠셀룰라제에 의해 형성되는 환 크기를 측정하여 수행되는 것임을 특징으로 하는 개선된 형질을 갖는 효소 변이체의 선별방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 증가된 효소활성 측정은 미생물 숙주를 파쇄하지 않고 직접 배지 위에서 수행하는 발색반응에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 개선된 형질을 갖는 효소 변이체의 선별방법.
  12. 제 1 항 또는 11 항에 있어서, 상기 증가된 효소활성 측정은 표면발현된 카복시메칠셀룰라제에 의해 분해된 카복실메칠셀룰로오스의 분해산물을 환원당 염색시약으로 발색하여 환 크기를 측정하여 수행되는 것임을 특징으로 하는 개선된 형질을 갖는 효소 변이체의 제조방법.
  13. 도 2에 도시된 개열지도를 갖는 pYSK3로 형질전환된 대장균 JM109/pYSK3(KCTC 0584BP).
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