CN102212580B - 酵母展示脂肪酶催化合成葡萄糖月桂酸酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酵母展示脂肪酶催化合成葡萄糖月桂酸酯的方法，包括：将葡萄糖和月桂酸溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，于50～60℃反应10～14小时，分离、纯化制得葡萄糖月桂酸酯；将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；本发明通过将脂肪酶展示在细胞外，利用该酶制剂催化合成葡萄糖月桂酸酯，不仅提高了转化效率，而且缩短了反应时间，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种酵母展示脂肪酶催化合成葡萄糖月桂酸酯的方法。
背景技术
糖酯是由碳水化合物作为亲水基团，脂肪酸作为疏水基团的非离子表面活性剂，具有无毒、易生物降解、HLB值范围广(1-16)及良好的表面活性等优点，并且具有分散润滑、去污、起泡、调节粘度、防止老化、防止结晶、抑菌性等作用，因此被广泛用于食品、医药和化妆品等行业，是联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)推荐使用的食品添加剂。
目前市售的糖酯产品基本上是化学合成的，产物为复杂的混合物，要得到高纯度的产品需进行繁杂的分离工作。脂肪酶是目前糖酯合成中使用最广泛的酶，但是生产成本高、固定化过程繁杂费时大大局限了其商业化应用。
发明内容
本发明提供了一种酵母展示脂肪酶催化合成葡萄糖月桂酸酯的方法，可显著降低葡萄糖月桂酸酯生产成本，同时达到较高的酯化反应效率和产率。
一种酵母展示脂肪酶催化合成葡萄糖月桂酸酯的方法，包括：
将葡萄糖和月桂酸溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，于50～60℃反应10～14小时，分离、纯化制得葡萄糖月桂酸酯。
优选的，所述的有机溶剂为丙酮。
优选的，每升有机溶剂中葡萄糖、月桂酸和酵母展示脂肪酶的加入量分别为20～100g、50～100g、1～2g。
所述反应置于水浴摇床中进行，水浴摇床转速为150～200转/分钟。
优选的，在分离纯化前加入分子筛，继续搅拌反应10～12h，锁住水分，促进酯化反应进一步进行。
所述的分离、纯化为：离心取上清液，旋转蒸发除去有机溶剂，水洗后溶于正己烷，重结晶。
所述的酵母展示脂肪酶通过如下方法制备：
将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；
所述的重组质粒由原始载体pPIC9K和依次插入原始载体pPIC9K中MFα1信号肽下游的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。
所述的脂肪酶基因可选用Genbank号为AF229435的序列，毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115为商业化产品，可从Invitrogen公司购得。它的细胞壁α凝集素基因序列的Genbank号为M28164。
载体pPIC9K为商业化产品(如Invitrogen公司)，它存在MFα1信号肽序列(Genbank号：M17301)，同时该载体内信号肽序列上游存在AOX1启动子(Genbank号：Z46233)。重组质粒线性化处理的目的是为了与胞内基因组发生同源重组，提高表达稳定性。
优选的，所述生物印迹所用配体为油酸，它可以诱导酶结构改变，提高转化率。
本发明通过将脂肪酶基因和细胞壁α凝集素基因导入毕赤酵母细胞GS115，毕赤酵母细胞诱导培养后，脂肪酶表达并分泌到胞外，同时利用细胞壁α凝集素将该脂肪酶固定在细胞表面。利用该酵母展示脂肪酶对酯化反应进行催化，可有效提高操作稳定性、耐热性以及重复性，由于酶反应的特异性该酶能大幅度抑制副反应的发生，酯化转化率在80％以上。
具体实施方式
实施例1制备酵母展示脂肪酶
通过人工合成的方法，合成米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶基因(Genbank号：AF229435)和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因(Genbank号为M28164)，同时在脂肪酶基因C端加上连接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS(linker)，连接后得到核苷酸序列pro-ROL-linker-α-agglutinin，同时在序列两端添加EcoR I和Not I酶切位点，其中pro-ROL为脂肪酶基因，α-agglutinin为细胞壁α凝集素基因。
以上述人工合成序列为模板，利用下述引物对，进行PCR扩增，
上游引物：5’-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3’；
下游引物：5’-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3’
PCR反应体系为：模板DNA为1μl，高保真DNA聚合酶0.5μl，dNTP(50mM)0.4μl，上下游引物各0.5μl，10×PCR缓冲液5μl，加水至50μl。
PCR运行条件为：94℃3分钟，35个循环(94℃30秒，60℃1分钟，72℃30秒)，72℃10分钟。
用EocR I和Not I同时酶切PCR产物和pPIC9K质粒，并在T4连接酶的作用下过夜连接形成pPIC9K-ROL质粒，通过电泳检验并回收质粒。为使目的基因与毕赤酵母GS115发生His 4单位点置换重组，用Sal I对pPIC9K-ROL质粒进行酶切线性化处理。将酶切线性化处理好的目的基因约15μl加入到事先准备好的毕赤酵母GS115感受态细胞中，转入电转杯中，冰浴15min，然后在1500V，400Ω，25uF条件下电击10ms，并加入约1ml预冷的山梨醇。将上述混匀的电转产物约400μl涂于MD平板上，筛选阳性转化子，然后将阳性转化子涂于不同浓度的G418平板上，根据阳性转化子对G418的抗性筛选出Mut表型的多拷贝阳性重组菌株。
将多拷贝阳性重组菌株接种在BMGY培养基中发酵培养30h，离心收集细胞；再将细胞置于含有0.5％(体积百分比)甲醇的BMMY培养基中诱导培养144h，离心收集细胞，用水冲洗后，接种至YGC培养基中30℃培养120h，然后3000g离心分钟收集菌体，蒸馏水洗涤后再用50mM pH7.0磷酸缓冲液洗涤，然后与2倍体积油酸混合，-80℃下预冻后再经德国Christ真空冷冻干燥机干燥24h，用己烷洗涤除去油酸，再进行再真空干燥去除己烷，即得到经生物印迹处理的酵母展示脂肪酶。
实施例2酵母展示脂肪酶催化合成葡萄糖月桂酸酯
实例1取葡萄糖0.2g、月桂酸0.5g，加入含有10mL丙酮的具塞三角瓶，混合、预热10min，然后加入酵母展示脂肪酶0.01g，置于水浴摇床开始反应，转速为200转/分钟，反应温度保持在50℃，反应12h后加入0.5g分子筛(孔径小于2nm)，继续反应12h后，离心沉淀除去酵母展示脂肪酶及分子筛，取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂，水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得葡萄糖月桂酸酯产品，烘干、粉碎即可。
实例2取葡萄糖1g、月桂酸1g，加入含有10mL丙酮的具塞三角瓶，混合、预热10min，然后加入酵母展示脂肪酶0.02g，置于水浴摇床开始反应，转速为180转/分钟，反应温度保持在55℃，反应12h后加入0.5g分子筛(孔径小于2nm)，继续反应12h后，离心沉淀除去酵母展示脂肪酶及分子筛，取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂，水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得葡萄糖月桂酸酯产品，烘干、粉碎即可。
实施例3采用传统化学法合成葡萄糖月桂酸酯
取葡萄糖0.2g、月桂酸0.5g，加入含有10mL丙酮的具塞三角瓶，混合、预热10min，置于水浴摇床开始反应，转速为200转/分钟，反应温度保持在50℃，反应12h后加入0.5g分子筛(孔径小于2nm)，继续反应12h后，离心沉淀除去分子筛，取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂，水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得葡萄糖月桂酸酯产品，烘干、粉碎即可。
实施例3测定反应转化率
将反应液离心，取上清液，真空旋转蒸发除去有机溶剂，用甲醇(色谱纯)溶解，经0.45μm滤膜过滤，上样测定。液相色谱(HPLC)检测条件：色谱柱SunfireTM C18(5μm，4.6mm×150mm)；流动相为V(甲醇)∶V(水)＝95∶5；流速1mL/min，柱温35℃，蒸发光检测器，进样量2μL。平行测定三次，取平均值。
酯化转化率计算公式如下：
转化率(％)＝(单酯摩尔数/糖摩尔数)×100％
通过上述方法检测计算，实施例2中，实例1合成葡萄糖月桂酸酯的转化率达80.9％，实例2合成葡萄糖月桂酸酯的转化率达82.4％。而实施例3采用传统化学法合成葡萄糖月桂酸酯的转化率仅为50％左右。
Claims (1)
1.一种酵母展示脂肪酶催化合成葡萄糖月桂酸酯的方法，包括：
人工合成米根霉（Rhizopus oryzae）的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因，接着在脂肪酶基因C端加上编码连接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS的基因片段，连接得到核苷酸序列pro-ROL-linker-α-agglutinin，pro-ROL代表脂肪酶基因，Genbank号为：AF229435，α-agglutinin代表细胞壁α凝集素基因，Genbank号为：M28164，linker代表编码连接肽的基因片段；
以人工合成序列为模板，利用下述引物对，进行PCR扩增；
上游引物：5’-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3’；
下游引物：5’-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3’；
PCR反应体系为：模板DNA为1μL，DNA聚合酶0.5μL，50mM的dNTP0.4μL，上下游引物各0.5μL，10×PCR缓冲液5μL，加水至50μL；
PCR运行条件为：94℃3分钟；35个循环，每个循环为：94℃30秒，60℃1分钟，72℃30秒；72℃10分钟；
用EocR I和Not I同时酶切PCR产物和pPIC9K质粒，并在T4连接酶的作用下过夜连接形成pPIC9K-ROL质粒，通过电泳检验并回收质粒；用Sal I对pPIC9K-ROL质粒进行酶切线性化处理，将酶切线性化处理好的目的基因约15μL加入到事先准备好的毕赤酵母GS115感受态细胞中，转入电转杯中，冰浴15min，然后在1500V，400Ω，25uF条件下电击10ms，并加入约1mL预冷的山梨醇；
将混匀的电转产物400μL涂于MD平板上，筛选阳性转化子，然后将阳性转化子涂于不同浓度的G418平板上，根据阳性转化子对G418的抗性筛选出Mut表型的多拷贝阳性重组菌株；
将多拷贝阳性重组菌株接种在BMGY培养基中发酵培养30h，离心收集细胞；再将细胞置于含有体积百分比0.5%甲醇的BMMY培养基中诱导培养144h，离心收集细胞，用水冲洗后，接种至YGC培养基中30℃培养120h，然后3000g离心收集菌体，蒸馏水洗涤后再用50mM pH7.0磷酸缓冲液洗涤，然后与2倍体积油酸混合，-80℃下预冻后再经德国Christ真空冷冻干燥机干燥24h，用己烷洗涤除去油酸，再进行再真空干燥去除己烷，即得到经生物印迹处理的酵母展示脂肪酶；
取葡萄糖1g、月桂酸1g，加入含有10mL丙酮的具塞三角瓶，混合、预热10min，然后加入酵母展示脂肪酶0.02g，置于水浴摇床开始反应，转速为180转/分钟，反应温度保持在55℃，反应12h后加入0.5g孔径小于2nm的分子筛，继续反应12h后，离心沉淀除去酵母展示脂肪酶及分子筛，取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂，水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得葡萄糖月桂酸酯产品，烘干、粉碎。
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