CN102212584B - 酵母展示脂肪酶催化合成淀粉醋酸酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酵母展示脂肪酶催化合成淀粉醋酸酯的方法,包括:将谷物淀粉溶于水,吸涨后加入醋酸酐和酵母展示脂肪酶,在65~75℃下搅拌反应2~2.5小时,分离、纯化制得淀粉醋酸酯。所述的酵母展示脂肪酶制备方法为:将线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,将所得转化子接种于BMMY培养基中,诱导培养72~144小时后离心收集菌体,菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶。本发明通过将脂肪酶展现在细胞外,利用该酶制剂催化合成淀粉醋酸酯,不仅提高了转化效率,而且缩短了反应时间,降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域,尤其涉及一种酵母展示脂肪酶催化合成淀粉醋酸酯的方法。
背景技术
淀粉醋酸酯是变性淀粉的一个重要类型,可生产出抗凝性、透明度及其它使用性能均好于原淀粉的产品,相较于原淀粉,经过乙酰化作用后的淀粉醋酸酯表现出如下性能特点:易糊化,糊化温度降低,粘度性稳定,溶液呈中性,即使冷却也不形成凝胶,成膜性较好,热稳定性有较大提高,其综合性能得到了很大改善,现已应用于食品、造纸、纺织、粘合剂等工业部门。
相较于化学法合成淀粉醋酸酯,生物酶法可以在较短时间内获得高取代度的反应产物。就相同反应体系而言,生物酶法相比化学法显著提升反应效率和产率,糊化液粘度和透明度也有显著提高。同时,采用生物酶法避免了化学法反应条件苛刻(强酸、碱催化、高温高压)、无特异性、产物复杂、副产物多、分离难、安全性差等弊端。脂肪酶是目前酯化合成中使用最广泛的酶,但是生产成本高、固定化过程繁杂费时大大局限了其商业化应用。
发明内容
本发明提供了一种酵母展示脂肪酶催化合成淀粉醋酸酯的方法,该方法可提高淀粉醋酸酯合成的酯化反应效率和产率,降低合成成本。
一种酵母展示脂肪酶催化合成淀粉醋酸酯的方法,包括:
将谷物淀粉溶于水,吸涨后加入醋酸酐和酵母展示脂肪酶,在65~75℃下搅拌反应2~2.5小时,分离、纯化制得淀粉醋酸酯;
以重量份计,反应各原料配比可以如下:水100份、谷物淀粉35~40份、醋酸酐1~2份、酵母展示脂肪酶1~2份。
优选的,所述的分离、纯化方法为:将反应液pH值调节至5~7进行沉淀,沉淀经洗涤,抽滤,干燥制得淀粉醋酸酯。
优选的,所述的搅拌速率为100~200转/分钟。
所述的酵母展示脂肪酶通过如下方法制备:
将线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,将所得转化子接种于BMMY培养基中,诱导培养72~144小时后离心收集菌体,菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶;
所述的重组质粒由原始载体pPIC9K和依次插入原始载体pPIC9K中MFα1信号肽下游的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。
所述的脂肪酶基因可选用Genbank号为AF229435的序列,毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115为商业化产品,可从Invitrogen公司购得。它的细胞壁α凝集素基因序列的Genbank号为M28164。
载体pPIC9K为商业化产品(如Invitrogen公司),它存在MFα1信号肽序列(Genbank号:M17301),同时该载体内信号肽序列上游存在AOX1启动子(Genbank号:Z46233)。重组质粒线性化处理的目的是为了与胞内基因组发生同源重组,提高表达稳定性。
优选的,所述生物印迹所用配体为油酸,它可以诱导酶结构改变,提高转化率。
本发明通过将脂肪酶基因和细胞壁α凝集素基因导入毕赤酵母细胞GS115,毕赤酵母细胞诱导培养后,脂肪酶表达并分泌到胞外,同时利用细胞壁α凝集素将该脂肪酶固定在细胞表面。利用该酵母展现脂肪酶对酯化反应进行催化,不仅提高了操作稳定性、耐热性以及重复性,反应时间也大大缩短,从原来的15小时下降到2~3小时,另外该酵母展现脂肪酶生物催化剂生产成本低,催化合成转化效率高。
具体实施方式
实施例1制备酵母展示脂肪酶
通过人工合成的方法,合成米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶基因(Genbank号:AF229435)和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因(Genbank号为M28164),同时在脂肪酶基因C端加上连接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS(linker),连接后得到核苷酸序列pro-ROL-linker-α-agglutinin,同时在序列两端添加EcoR I和Not I酶切位点,其中pro-ROL为脂肪酶基因,α-agglutinin为细胞壁α凝集素基因。
以上述人工合成序列为模板,利用下述引物对,进行PCR扩增,
上游引物:5’-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3’;
下游引物:5’-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3’
PCR反应体系为:模板DNA为1μl,高保真DNA聚合酶0.5μl,dNTP(50mM)0.4μl,上下游引物各0.5μl,10×PCR缓冲液5μl,加水至50μl。
PCR运行条件为:94℃3分钟,35个循环(94℃30秒,60℃1分钟,72℃30秒),72℃10分钟。
用EocR I和Not I同时酶切PCR产物和pPIC9K质粒,并在T4连接酶的作用下过夜连接形成pPIC9K-ROL质粒,通过电泳检验并回收质粒。为使目的基因与毕赤酵母GS115发生His 4单位点置换重组,用Sal I对pPIC9K-ROL质粒进行酶切线性化处理。将酶切线性化处理好的目的基因约15μl加入到事先准备好的毕赤酵母GS115感受态细胞中,转入电转杯中,冰浴15min,然后在1500V,400Ω,25uF条件下电击10ms,并加入约1ml预冷的山梨醇。将上述混匀的电转产物约400μl涂于MD平板上,筛选阳性转化子,然后将阳性转化子涂于不同浓度的G418平板上,根据阳性转化子对G418的抗性筛选出Mut表型的多拷贝阳性重组菌株。
将多拷贝阳性重组菌株接种在BMGY培养基中发酵培养30h,离心收集细胞;再将细胞置于含有0.5%(体积百分比)甲醇的BMMY培养基中诱导培养144h,离心收集细胞,用水冲洗后,接种至YGC培养基中30℃培养120h,然后3000g离心分钟收集菌体,蒸馏水洗涤后再用50mM pH7.0磷酸缓冲液洗涤,然后与2倍体积油酸混合,-80℃下预冻后再经德国Christ真空冷冻干燥机干燥24h,用己烷洗涤除去油酸,再进行再真空干燥去除己烷,即得到经生物印迹处理的酵母表面展示脂肪酶。
实施例2酵母展示脂肪酶催化合成淀粉醋酸酯
实例1取350g谷物淀粉用水配制成35%淀粉乳(淀粉干基)、于65℃下吸水处理15min使淀粉乳吸水膨胀,冷却后加入1g上述制备的酵母展示脂肪酶,然后分批加入10g醋酸酐,置于85-1型磁力搅拌器中搅拌开始反应,转速为100转/分钟,反应温度保持在66℃,反应2h后停止搅拌,调节pH值为6.0,离心取沉淀,用水多次洗涤沉淀,洗去未反应的醋酸酐,然后将沉淀干燥、粉碎即为成品。
实例2取400g谷物淀粉用水配制成40%淀粉乳(淀粉干基)、于65℃下吸水处理15min使淀粉乳吸水膨胀,冷却后加入2g上述制备的酵母展示脂肪酶,然后分批加入15g醋酸酐,置于85-1型磁力搅拌器中搅拌开始反应,转速为150转/分钟,反应温度保持在69℃,反应2.5h后停止搅拌,调节pH值为6.0,离心取沉淀,用水多次洗涤沉淀,洗去未反应的醋酸酐,然后将沉淀干燥、粉碎即为成品。
实施例3采用传统化学法合成淀粉醋酸酯
取350g谷物淀粉用水配制成35%淀粉乳(淀粉干基)、于65℃下吸水处理15min使淀粉乳吸水膨胀,然后分批加入10g醋酸酐,置于85-1型磁力搅拌器中搅拌开始反应,转速为100转/分钟,反应温度保持在66℃,反应2h后停止搅拌,调节pH值为6.0,离心取沉淀,用水多次洗涤沉淀,洗去未反应的醋酸酐,然后将沉淀干燥、粉碎即为成品。
实施例4测定取代度和乙酰基含量
精确称取磨细样品1g,置于250mL锥形瓶中,加入50mL 75%乙醇溶液,用塞子塞紧,不停摇动并加热到50℃,保温30min;然后冷却到室温,加入40mL 0.5mol/L氢氧化钠溶液,摇匀,塞住瓶口,室温放置72h,并不时摇动,用0.3mol/L盐酸标准溶液滴定剩余碱量,以酚酞做指示剂。放置2h,样品可能析出碱,再滴定。另外,皂化过程中引起少量降解,会消耗碱。为此,要用原淀粉进行滴定,并用下式计算乙酰基含量和取代度:
W(干基)=[(空白样品-样品)滴定(mL)×酸浓度(mol/L)×0.43]/样品质量(g,干基)×100%
DS=(162×W)/(43×100-42×W)
式中:W-乙酰基质量分数;DS-取代度;162-淀粉分子的摩尔质量;43-酰基分子量;42-乙酰基分子量与氢原子原子量之间的差值。
取代反应效率=实际取代度/理论取代度×100%
根据上述方法对制得的淀粉醋酸酯样品进行检测,实施例2中,实例1产品的取代度和反应效率分别为0.372和85.2%,实例2产品的取代度和反应效率分别为0.365和83%。而实施例3产品的取代度和反应效率仅为0.2973和75%
Claims (1)
1.一种酵母展示脂肪酶催化合成淀粉醋酸酯的方法,包括:
人工合成米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因,接着在脂肪酶基因C端加上编码连接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS的基因片段,连接得到核苷酸序列pro-ROL-linker-α-agglutinin,pro-ROL代表脂肪酶基因,Genbank号为:AF229435,α-agglutinin代表细胞壁α凝集素基因,Genbank号为:M28164,linker代表编码连接肽的基因片段;
以人工合成序列为模板,利用以下引物对,进行PCR扩增,使得在序列两端添加EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点;
上游引物:5’-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3’;
下游引物:5’-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3’;
PCR反应体系为:模板DNA为1μl,高保真DNA聚合酶0.5μl,50mM的dNTP0.4μl,上下游引物各0.5μl,10×PCR缓冲液5μl,加水至50μl;
PCR运行条件为:94℃3分钟;35个循环,每个循环为:94℃30秒,60℃1分钟,72℃30秒;72℃10分钟;
用EocR I和Not I同时酶切PCR产物和pPIC9K质粒,并在T4连接酶的作用下过夜连接形成pPIC9K-ROL质粒,通过电泳检验并回收质粒,用Sal I对pPIC9K-ROL质粒进行酶切线性化处理,将酶切线性化处理好的目的基因15μl加入到毕赤酵母GS115感受态细胞中,转入电转杯中,冰浴15min,然后在1500V,400Ω,25μF条件下电击10ms,并加入1mL预冷的山梨醇;
将混匀的电转产物400μl涂于MD平板上,筛选阳性转化子,然后将阳性转化子涂于不同浓度的G418平板上,根据阳性转化子对G418的抗性筛选出Mut表型的多拷贝阳性重组菌株;
将多拷贝阳性重组菌株接种在BMGY培养基中发酵培养30h,离心收集细胞;再将细胞置于含有体积百分比0.5%甲醇的BMMY培养基中诱导培养144h,离心收集细胞,用水冲洗后,接种至YGC培养基中30℃培养120h,然后3000g离心分钟收集菌体,蒸馏水洗涤后再用50mM pH7.0磷酸缓冲液洗涤,然后与2倍体积油酸混合,-80℃下预冻后再经德国Christ真空冷冻干燥机干燥24h,用己烷洗涤除去油酸,再进行再真空干燥去除己烷,即得到经生物印迹处理的酵母展示脂肪酶;
取350g谷物淀粉用水配制成35%淀粉乳,于65℃下吸水处理15min,冷却后加入1g上述制备的酵母展示脂肪酶,然后分批加入10g醋酸酐,置于85-1型磁力搅拌器中搅拌开始反应,转速为100转/分钟,反应温度保持在66℃,反应2h后停止搅拌,调节pH值为6.0,离心取沉淀,用水多次洗涤沉淀,洗去未反应的醋酸酐,然后将沉淀干燥、粉碎。
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