CN101792721A - 表面展示calb的毕赤酵母工程菌及催化合成短链芳香酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了表面展示CALB的毕赤酵母工程菌及催化合成短链芳香酯的方法。该方法将表面展示CALB的毕赤酵母工程菌菌株摇瓶发酵，收获菌体，真空冷冻干燥24h以上，制成全细胞酶制剂；采用短链酸和短链醇为原料，以全细胞酶制剂为催化剂，以能够溶解短链酸和短链醇的液态物质为溶剂，进行酯化反应，得到短链芳香酯产品；酯化反应温度为20-60℃；反应物中全细胞酶制剂在反应体系中的浓度为10-40g/L，反应时间1-6h。该方法较以往报道反应时间大大缩短、产率高达98％、连续操作稳定性好，且反应后全细胞催化剂经离心回收即可重复利用，大大降低生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种能在毕赤巴斯德酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶B的基因表达载体和展示有高活力脂肪酶的毕赤酵母工程菌，特别是涉及一种用全细胞酶制剂高效地催化合成短链芳香酯的方法。
背景技术
短链芳香酯大多具有食用水果香味，如己酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯等。这些短链酯不仅是香精、香料重要的组分，更作为常用的主要食品添加剂用于食品、饮料、酿造行业，仅我国的己酸乙酯，每年产量就达2千多吨，产值数亿元。目前生产中所使用的这些酯类香精主要是在无机催化剂存在下通过化学法合成的，其生产工艺常涉及高温、高压及强酸、强碱，对环境污染大。酶法催化合成短链芳香酯具有反应条件温和、催化效率高、催化专一性强等优点。美国FDA认为酶法生产的产品是“natural”(天然的)，因而酶法生产的短链芳香酯，符合人们对天然高品质的、有利于环境保护和可再生利用产品的日益增长的需求。
但是，短链芳香酯的脂肪酶催化生产停滞在小规模实验室水平，主要存在脂肪酶的规模制备困难、回收率低、固定化酶成本较高等生产瓶颈以及催化反应本省反应周期长、产物产率低等瓶颈，其工业化规模生产不可能。
来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)的南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)是一类重要的脂肪酶，在酯化、水解、转酯、以及其它类型反应中都显示了较其它脂肪酶更为出色的催化性能。基于CALB的优良特性，人们对其进行了商业化的开发，但高成本依然限制了CALB广泛应用于实践生产。
利用酵母表面展示技术，外源CALB可借助于锚定在细胞壁的载体蛋白α-凝集素固定在酵母细胞表面，类似酶的固定化，保持了脂肪酶相对独立的空间构象和原有的生物活性，省去了酶的分离纯化以及固定化等步骤，更拥有固定化酶回收方便、可重复使用的优点，具有良好的操作稳定性。近来，日本的研究学者尝试将野生型CALB展示于酿酒细胞表面，但酶在酿酒酵母细胞表面展示后表现出催化效率偏低，制约了应用(T.Tanino，T.Ohno，T.Aoki，H.Fukuda，A.Kondo，Appl.Microbiol.Biotechol.2007，5：1319-1325.)
中国发明专利CN1223300公开了一种微生物脂肪酶酶法合成酯的方法，所用的酶为自产华根霉脂肪酶或商业化的固定化酶Lypozyme IM脂肪酶，催化反应时间长达10-36h，生产周期长，成本也较高，缩短反应周期，降低酶制备成本是促进短链芳香酯酶法生产工业化的迫切需要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供反应1-6h后产率均可达到90％以上、操作稳定性好、成本低的全细胞酶制剂催化合成短链芳香酯的方法。
本发明的另一目的在于提供表面展示CALB的毕赤酵母工程菌菌株。
利用该方法可生产的短链芳香酯包括：乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、己酸丁酯、己酸己酯、己酸辛酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸异戊酯和丁酸异戊酯。
一种表面展示CALB的巴斯德毕赤酵母(GS115/pKNS-CALB Pichia pastorisGS115/pKNS-CALB)于2009年9月30日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCCNO：M 209217，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学(邮编430072)。
应用表面展示CALB的毕赤酵母工程菌催化合成短链芳香酯的方法，包括如下步骤：
(1)将所述表面展示CALB的毕赤酵母工程菌菌株经摇瓶发酵，收获菌体，真空冷冻干燥24h以上，制成全细胞酶制剂；
(2)短链芳香酯的合成：采用短链酸和短链醇为原料，以所述全细胞酶制剂为催化剂，以能够溶解短链酸和短链醇的液态物质为溶剂，进行酯化反应，得到短链芳香酯产品；底物中所述短链酸含量为0.2mol/L～1mol/L，短链酸和短链醇的摩尔比为1∶0.75～1∶2，酯化反应温度为20-60℃；反应物中全细胞酶制剂在反应体系中的浓度为10-40g/L，反应时间1-6h；
所述的溶剂选自正己烷、正庚烷、异辛烷中的一种或多种；
所述短链酸为C链长度C2-C10的直链酸；
所述C链长度为C2-C10的直链或支链醇。
所述的C链长度为C2-C10的直链或支链醇为乙醇、丁醇、辛醇、己醇或异戊醇。
所述的C链长度C2-C10的直链酸为乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、辛酸、癸酸。
所述的全细胞酶制剂为表面展示CALB的毕赤酵母工程菌菌体冻干粉。
本发明提供了指导CALB在毕赤酵母表面展示实现展示的酵母展示表达载体pKNS-CALB，此展示表达载体是在商用载体pPIC9K(Invitrogen公司真核表达载体)的基础上利用限制性内切酶EcoR I和Not I将原载体上的信号肽部分基因切除，在此基础上引入南极假丝酵母脂肪酶B与来源于酿酒酵母的α凝集素的融合基因。凝集素位于融合蛋白C端，可共价锚定在酵母细胞壁上，位于N端的CALB可借助α凝集素定位于细胞壁实现在毕赤酵母细胞表面展示。该重组质粒主要包含5’AOX1(醇氧化酶-1基因的启动子)、3’AOX1(醇氧化酶-1基因的转录终止子)、CALB(南极假丝酵母脂肪酶B)、NS(α凝集素基因)、HIS4(组氨酸脱氢酶基因)，以及Amp+(氨苄青霉素抗性)、Kna+(卡那霉素抗性)等元件。
菌体干粉制备过程如下：首先，针对南极假丝酵母脂肪B基因和来源于α凝集素设计拼接引物，以南极假丝酵母基因组和酿酒酵母基因组为模板或含脂肪酶基因、α凝集素的质粒为模板进行PCR(聚合酶链式反应)扩增，融合基因PCR产物与商用载体pPIC9K经同样的限制性内切酶处理，经T4连接酶体外连接后，转化大肠杆菌感受态，涂布抗性平板，挑选鉴定阳性单克隆。阳性单克隆摇瓶培养提取重组质粒pKNS-CALB。重组质粒pKNS-CALB线性化后转化毕赤酵母宿主菌，转化物涂布抗性平板，28～32℃培养2～3d后，筛选获得重组转化子。重组转化子经BMGY扩大培养24～48h后，采用6000g～10000g离心力室温离心收集菌体，再用同体积的BMMY诱导培养，每隔24h添加甲醇至终浓度为1～2％。7000g～10000g离心力、4℃离心10～15分钟，弃上清，用去离子水洗涤菌体三次，重悬菌体经真空冷冻干燥24h以上收获菌体干粉。
相对于现有技术本发明具有如下优点和有益效果：
本发明采用以展示有高活力CALB的毕赤酵母全细胞酶制剂作为催化剂，具有固定化酶的优点，反应时间短、产率高、操作稳定性好。反应后离心收集菌体即可重复利用，大大降低生产成本。酵母具有良好的生物安全性，其取代化学载体固定脂肪酶生产短链芳香酯，符合天然产物的要求。毕赤酵母全细胞酶制剂冻干粉在非水相的反应体系中，以有机溶剂为溶剂，能有效的催化短链酸和短链醇酯化生成短链芳香酯，反应1-6h后，酸的摩尔转化率可达到或超过90％，经过10批次的连续使用，全细胞酶制剂催化的相对转化率保持在85％以上，具有良好的操作稳定性。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明，需要说明的是，这些实施例并不构成对本发明保护范围的限制。
实施例1
表面展示南极假丝酵母脂肪酶B的毕赤酵母全细胞酶制剂的生产。
首先，根据南极假丝酵母脂肪酶(calb)基因LF058的核苷酸序列设计引物(上游引物为5’TGTAGAATTCCTGCCTTCCGGTTCGGACCCTG 3’，引入了EcoR I酶切位点，下游引物5’GAGGCCGTAGCAGTGGGGATGCGCATAGAGCTCAGGTCCTCCACGAG 3’，引入Mlu I酶切位点)。以南极假丝酵母基因组DNA为模板进行PCR扩增全长calb，PCR程序如下：95℃预变性5min，以94℃1min、60℃1min、72℃1min进行30个循环，72℃延伸10min。
其次，根据α凝集素的核苷酸序列设计引物，上游引物为5’CTCCGGCATCGTCACCCCTACGCGTATCTCGAGTCCAGGAGGTGCTC 3’，引入CALB基因下游末尾19bp和MluI酶切位点，下游引物为5’ATTAGCGGCCGCTTAGAATAGCAGGTACGACAAAAG 3’，引入Not I酶切位点。以含有α凝集素的重组质粒为模板进行α凝集素的PCR扩增。PCR程序如下：94℃预变性5min，以94℃1min、58℃1min、72℃1min进行30个循环，72℃延伸10min。
上述两种PCR产物分别取1μL作为模板加入新的PCR体系扩增CALB-NS融合基因片段(上游引物采用扩增CALB的上游引物：5’TGTAGAATTCCTGCCTTCCGGTTCGGACCCTG 3’，下游引物采用扩增α凝集素的下游引物：5’ATTAGCGGCCGCTTAGAATAGCAGGTACGACAAAAG 3’)。PCR程序如下：94℃预变性5min，95℃1min、55℃1.5min、72℃2min进行30个循环，72℃延伸10min。融合基因产物纯化后经Eco RI和Not I酶切，同时把20μL质粒pPIC9K经Eco RI和Not I酶切，纯化后用T4DNA连接酶连接，转化E.coli Top10，筛选阳性转化子。
验证的重组质粒pKNS-CALB经Sac I线性化后用电转移的方转化P.pastoris GS115。涂转化物涂布于G418梯度平板，30℃培养2d。挑取部分抗高浓度G418的转化子接种于5ml YPD培养液，30℃，250r/min培养过夜，碱滴定法检测脂肪酶活力，得到表面展示CALB的毕赤酵母工程菌菌株(Pichia pastoris GS115/pKNS-CALB)，该菌株于2009年9月30日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC NO：M 209217，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学(邮编430072)。毕赤酵母工程菌菌株先经YPD种子液培养，经BMGY扩大培养24h后；6000g室温离心收集菌体。再用同体积的BMMY诱导培养，每隔24h添加甲醇至终浓度为1％。30℃、250rpm摇床培养4d。7000rpm、4℃离心10分钟，弃上清，用去离子水洗涤菌体三次，重悬菌体经真空冷冻干燥24h，得菌体冻干粉。
实施例2
以乙酸和乙醇为底物，全细胞酶制剂催化非水相酯化反应制备乙酸乙酯。
试剂都预先用
分子筛充分除水。将无水乙醇和冰醋酸加入正庚烷中。加入后，无水乙醇的浓度为0.5mol/L，冰醋酸的浓度为0.4mol/L。取10mL底物(其中冰醋酸288.6μL，无水乙醇291.2μL，正庚烷9420.2μL，酸醇摩尔比为1∶1.25)混合物于50mL具塞三角瓶中，加入含量为30g/L的实施例1制备的菌体冻干粉，反应温度40℃，然后于200rpm下振荡反应，0.5h后加入0.6g分子筛，反应3h，乙酸的转化率能达到92.1％，反应时间仅为产率接近的报道的1/26。
实施例3
以丁酸和异戊醇为底物，全细胞酶制剂催化非水相酯化反应制备丁酸异戊酯。
试剂都预先用
分子筛充分除水。将异戊醇和丁酸加入正庚烷中。加入后，异戊醇的浓度为0.88mol/L，丁酸的浓度为0.8mol/L。取10mL底物(其中丁酸734.3μL，异戊醇957.7μL，正庚烷8308μL，酸醇摩尔比为1∶1.1)混合物于50mL具塞三角瓶中，加入含量为20g/L的实施例1制备的菌体冻干粉，反应温度50℃，然后于200rpm下振荡反应，0.5h后加入0.6g分子筛，反应3h，丁酸的转化率能达到97％，同杨本宏报道的(杨本宏.非水相脂肪酶催化合成丁酸异戊酯.中国食品添加剂，2005，5：74-79)的根霉PW358经固态发酵生产的脂肪酶催化丁酸异戊酯的合成相比，反应时间缩短了2h。
实施例4
以己酸与乙醇为底物，全细胞酶制剂催化非水相酯化反应制备己酸乙酯。
试剂都预先用
分子筛充分除水。将无水乙醇和正己酸加入正庚烷中。加入后，无水乙醇的浓度为1.1mol/L，正己酸的浓度为1mol/L。取10mL底物(其中正己酸1000μL，无水乙醇512.4μL，正庚烷8487.6μL，酸醇摩尔比为1∶1.1)混合物于50mL具塞三角瓶中，加入含量为20g/L的实施例1制备的菌体冻干粉，反应温度55℃，然后于200rpm下振荡反应，0.5h后加入0.6g分子筛，反应1.5h，己酸的转化率能达到97.97％。产率接近目前文献报道的最高产率(98％)，反应时间缩短为报道的全细胞催化反应时间的1/8(报道的最高水平为12h，产率98％，Shuang-yan Han，et al.Highly efficient synthesis of ethylhexanoate catalyzed by CALB-displaying Saccharomyces cerevisiae whole-cells in non-aqueousphaseJournal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2009，59：168-172)。在上述条件下反应后，离心回收菌体，经溶剂正庚烷洗涤，去除产物和残余的微量底物，再加入到含有新鲜底物的反应体系中催化酯化反应，经过10批次的连续使用，毕赤酵母展示CALB仍然在每批次中使己酸的转化率保持在90％以上。
实施例5
以己酸与丁醇为底物，全细胞酶制剂催化非水相酯化反应制备己酸丁酯。
试剂都预先用分子筛充分除水。将正丁醇和正己酸加入正庚烷中。加入后，正丁醇的浓度为0.88mol/L，正己酸的浓度为0.8mol/L。取10mL底物(其中正己酸1000μL，正丁醇805.3μL，正庚烷8194.7μL，酸醇摩尔比为1∶1.1)混合物于50mL具塞三角瓶中，加入含量为20g/L的实施例1制备的菌体冻干粉，反应温度55℃，然后于200rpm下振荡反应，0.5h后加入0.6g分子筛，反应3h，己酸的转化率能达到97.07％。
实施例6
以丙酸与乙醇为底物，全细胞酶制剂催化非水相酯化反应制备丙酸乙酯。
试剂都预先用
分子筛充分除水。将无水乙醇和丙酸加入正庚烷中。加入后，无水乙醇的浓度为0.75mol/L，丙酸的浓度为0.6mol/L。取10mL底物(其中丙酸448.1μL，无水乙醇436.7μL，正庚烷9115.2μL，酸醇摩尔比为1∶1.25)混合物于50mL具塞三角瓶中，加入含量为20g/L的实施例1制备的菌体冻干粉，反应温度50℃，然后于200rpm下振荡反应，0.5h后加入0.6g分子筛，反应3h，丙酸的转化率能达到96.19％。比报道的(葛清秀等.碱性脂肪酶催化合成丙酸乙酯的研究.泉州师范学院学报，2004，22(6)：987-101)利用扩展青霉碱性脂肪酶催化丙酸乙酯合成时，丙酸为0.2mol/L，酸∶醇＝1∶1.25的条件下，48h丙酸转化率为75.7％的反应时间缩短为1/8，产率提高到96％以上。
实施例7
以冰醋酸和异戊醇为底物，全细胞酶制剂催化非水相酯化反应制备乙酸异戊酯。
试剂都预先用
分子筛充分除水。将异戊醇和冰醋酸加入正庚烷中。加入后，异戊醇的浓度为0.5mol/L，冰醋酸的浓度为0.4mol/L。取10mL底物(其中冰醋酸288.6μL，异戊醇544.1μL，正庚烷9167.3μL，酸醇摩尔比为1∶1.25)混合物于50mL具塞三角瓶中，加入含量为30g/L的实施例1制备的菌体冻干粉，反应温度40℃，然后于200rpm下振荡反应，0.5h后加入0.6g分子筛，反应3h，冰醋酸的转化率能达到96.30％。产率接近现有技术(杨本宏.非水溶剂中Rhizopus arrhizus脂肪酶催化合成三种酯的最佳条件.中国生物化学与分子生物学报，2003，19(5)：572-575)报道的97％的同时，底物浓度提高1倍，而反应时间缩短了三分之二。
实施例8
以丁酸和乙醇为底物，全细胞酶制剂催化非水相酯化反应制备丁酸乙酯。
试剂都预先用
分子筛充分除水。将无水乙醇和正丁酸加入正庚烷中。加入后，无水乙醇的浓度为0.88mol/L，正丁酸的浓度为0.8mol/L。取10mL底物(其中正丁酸734.3μL，无水乙醇512.4μL，正庚烷8753.3μL，酸醇摩尔比为1∶1.1)混合物于50mL具塞三角瓶中，加入含量为20g/L的实施例1制备的菌体冻干粉，反应温度55℃，然后于200rpm下振荡反应，0.5h后加入0.6g分子筛，反应3h，正丁酸的转化率能达到97.44％。
实施例9
以己酸和己醇为底物，全细胞酶制剂催化非水相酯化反应制备己酸己酯。
试剂都预先用
分子筛充分除水。将正己醇和正己酸加入正庚烷中。加入后，正己醇的浓度为0.88mol/L，正己酸的浓度为0.8mol/L。取10mL底物(其中正己酸1000μL，正己醇1102.9μL，正庚烷7897.1μL，酸醇摩尔比为1∶1.1)混合物于50mL具塞三角瓶中，加入含量为30g/L的实施例1制备的菌体冻干粉，反应温度55℃，然后于200rpm下振荡反应，0.5h后加入0.6g分子筛，反应3h，正己酸的转化率能达到98.01％。
实施例10
以正己酸和正辛醇己醇为底物，全细胞酶制剂催化非水相酯化反应制备己酸辛酯。
试剂都预先用
分子筛充分除水。将正辛醇和正己酸加入正庚烷中。加入后，正辛醇的浓度为0.88mol/L，正己酸的浓度为0.8mol/L。取10mL底物(其中正己酸1000μL，正辛醇1383.3μL，正庚烷7616.7μL，酸醇摩尔比为1∶1.1)混合物于50mL具塞三角瓶中，加入含量为30g/L的实施例1制备的菌体冻干粉，反应温度55℃，然后于200rpm下振荡反应，0.5h后加入0.6g分子筛，反应3h，正己酸的转化率能达到97.85％。
实施例11
以庚酸和乙醇为底物，全细胞酶制剂催化非水相酯化反应制备庚酸乙酯。
试剂都预先用
分子筛充分除水。将无水乙醇和正庚酸加入正庚烷中。加入后，无水乙醇的浓度为0.88mol/L，正庚酸的浓度为0.8mol/L。取10mL底物(其中正庚酸1142.9μL，无水乙醇512.4μL，正庚烷8344.7μL，酸醇摩尔比为1∶1.1)混合物于50mL具塞三角瓶中，加入含量为20g/L的实施例1制备的菌体冻干粉，反应温度55℃，然后于200rpm下振荡反应，0.5h后加入0.6g分子筛，反应3h，正庚酸的转化率能达到96.25％。
实施例12
以正辛酸和乙醇为底物，全细胞酶制剂催化非水相酯化反应制备辛酸乙酯。
试剂都预先用分子筛充分除水。将无水乙醇和正辛酸加入正庚烷中。加入后，无水乙醇的浓度为0.66mol/L，正辛酸的浓度为0.6mol/L。取10mL底物(其中正辛酸950.8μL，无水乙醇384.3μL，正庚烷8664.9μL，酸醇摩尔比为1∶1.1)混合物于50mL具塞三角瓶中，加入含量为20g/L的实施例1制备的菌体冻干粉，反应温度55℃，然后干200rpm下振荡反应，0.5h后加入0.6g分子筛，反应3h，正辛酸的转化率能达到94.21％。
实施例13
以正癸酸和乙醇为底物，全细胞酶制剂催化非水相酯化反应制备癸酸乙酯。
试剂都预先用
分子筛充分除水。将无水乙醇和正癸酸加入正庚烷中。加入后，无水乙醇的浓度为0.66mol/L，正癸酸的浓度为0.6mol/L。取10mL底物(其中正癸酸1161.3μL，无水乙醇384.3μL，正庚烷8454.4μL，酸醇摩尔比为1∶1.1)混合物于50mL具塞三角瓶中，加入含量为30g/L的实施例1制备的菌体冻干粉，反应温度55℃，然后于200rpm下振荡反应，0.5h后加入0.6g分子筛，反应3h，正癸酸的转化率能达到90.35％。
如上所述即可较好实施本发明。
序列表
<110>华南理工大学
<120>表面展示CALB的毕赤酵母工程菌及催化合成短链芳香酯的方法
<130>5
<160>4
<170>PatentIn version 3.
<210>1
<211>32
<212>核苷酸
<213>人工序列
<400>1
tgtagaattc ctgccttccg gttcggaccc tg 32
<210>1
<211>47
<212>核苷酸
<213>人工序列
<400>2
gaggccgtag cagtggggat gcgcatagag ctcaggtcct ccacgag 47
<210>3
<211>47
<212>核苷酸
<213>人工序列
<400>3
ctccggcatc gtcaccccta cgcgtatctc gagtccagga ggtgctc 47
<210>4
<211>36
<212>核苷酸
<213>人工序列
<400>4
attagcggcc gcttagaata gcaggtacga caaaag 36
Claims (5)
1.一种表面展示CALB的毕赤酵母工程菌菌株，其特征在于包藏号为CCTCC M 209217。
2.应用权利要求1所述的表面展示CALB的毕赤酵母工程菌催化合成短链芳香酯的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将所述表面展示CALB的毕赤酵母工程菌菌株经摇瓶发酵，收获菌体，真空冷冻干燥24h以上，制成全细胞酶制剂；
(2)短链芳香酯的合成：采用短链酸和短链醇为原料，以所述全细胞酶制剂为催化剂，以能够溶解短链酸和短链醇的液态物质为溶剂，进行酯化反应，得到短链芳香酯产品；底物中所述短链酸含量为0.2mol/L～1mol/L，短链酸和短链醇的摩尔比为1∶0.75～1∶2，酯化反应温度为20-60℃；反应物中全细胞酶制剂在反应体系中的浓度为10-40g/L，反应时间1-6h；
所述的溶剂选自正己烷、正庚烷、异辛烷中的一种或多种；
所述短链酸为C链长度C2～C10的直链酸；
所述C链长度为C2-C10的直链或支链醇。
3.根据权利要求2所述的应用表面展示CALB的毕赤酵母工程菌催化合成短链芳香酯的方法，其特征在于：所述的C链长度为C2-C10的直链或支链醇为乙醇、丁醇、辛醇、己醇或异戊醇。
4.根据权利要求2所述的应用表面展示CALB的毕赤酵母工程菌催化合成短链芳香酯的方法，其特征在于：所述的C链长度C2-C10的直链酸为乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、辛酸、癸酸。
5.根据权利要求2所述的应用表面展示CALB的毕赤酵母工程菌催化合成短链芳香酯的方法，其特征在于：所述的全细胞酶制剂为表面展示CALB的毕赤酵母工程菌菌体冻干粉。
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