CN114058526A - 一种细胞表面展示碱性脂肪酶的酿酒酵母工程菌及其制备方法和使用方法 - Google Patents

一种细胞表面展示碱性脂肪酶的酿酒酵母工程菌及其制备方法和使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及酶工程技术领域。本发明提供了一种细胞表面展示碱性脂肪酶的酿酒酵母工程菌及其制备方法和使用方法，所述酿酒酵母工程菌的保藏名称为酿酒酵母EBY‑BSR，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2021887。本发明利用酵母系统的细胞表面展示技术，所述碱性脂肪酶全细胞催化剂酶活力可到达79.4338U/g干细胞重，并表现出更好的温度稳定性、pH稳定性及有机溶剂耐受性，为酶的固定化技术探索和开拓了新的领域。

Description

一种细胞表面展示碱性脂肪酶的酿酒酵母工程菌及其制备方 法和使用方法
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域，尤其涉及一种细胞表面展示碱性脂肪酶的酿酒酵母工程菌及其制备方法和使用方法。
背景技术
脂肪酶又称三酰基甘油水解酶(EC 3.1.1.3)，是一类能在油水界面或非水相系统中催化酯类物质发生水解、酯化、酯交换以及合成等化学反应的生物催化剂，具有化学选择性、立体选择性和底物专一性等特点，是当代酶工业最受瞩目的酶种之一。自然界中的许多动物、植物、微生物均能产脂肪酶。其中，微生物脂肪酶催化反应条件温和，并且不会导致环境污染，且易于培养，可通过育种手段提高产酶量，且有比动植物脂肪酶更广的作用温度、作用pH和底物特异性，因而从微生物代谢产物中寻求脂肪酶成为科研工作者的研究热点。虽然目前国内也在致力于脂肪酶工程菌株的构建和改造，但大多数工程菌株为细胞内或分泌游离酶，其产酶效率低，分离纯化比较困难，因而造成产酶成本增加，不利于大规模生产和应用。
酶的固定化一般都是通过物理或化学的方法将游离酶固定于特殊的载体上，不仅增强酶的稳定性，同时又能使酶与作用底物分离，达到重复利用，降低成本的目的。但是，传统的物理或化学固定化方法，增加的酶固定化操作会导致酶活性和回收率的损失；另外，固定化需用特殊的载体材料，且对固定化技术要求比较高，因而增加了载体制作和固定化操作的成本费用，被固定的酶需要分离纯化同样增加了生产成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞表面展示碱性脂肪酶的酿酒酵母工程菌及其制备方法和使用方法，为酶的固定化技术探索和开拓了新的领域。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种细胞表面展示碱性脂肪酶的酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌的保藏名称为酿酒酵母EBY-BSR，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2021887。
本发明还提供了所述的酿酒酵母工程菌的制备方法，包括如下步骤：
(1)将碱性脂肪酶基因和质粒结合，得到重组质粒；
(2)将重组质粒转化至酿酒酵母中，获得酿酒酵母工程菌。
作为优选，所述碱性脂肪酶基因为碱性脂肪酶BSR，所述碱性脂肪酶BSR的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
作为优选，所述质粒为pYD-1质粒。
作为优选，所述酿酒酵母为酿酒酵母EBY100。
本发明还提供了所述的酿酒酵母工程菌的使用方法，将酿酒酵母工程菌在培养基中诱导32～40h后使用。
作为优选，所述培养基为SD-CAA培养基。
本发明还提供了所述的酿酒酵母工程菌在提高脂肪酶活力和稳定性中的应用。
本发明提供了一种细胞表面展示碱性脂肪酶的酿酒酵母工程菌及其制备方法和使用方法，所述酿酒酵母工程菌的保藏名称为酿酒酵母EBY-BSR，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2021887。本发明利用酵母系统的细胞表面展示技术，所述碱性脂肪酶全细胞催化剂酶活力可到达79.4338U/g干细胞重，并表现出更好的温度稳定性、pH稳定性及有机溶剂耐受性，为酶的固定化技术探索和开拓了新的领域。
附图说明
图1为实施例2中BSR的单克隆流式鉴定密度图；
图2为实施例2中BSR的单克隆流式鉴定柱状图；
图3为实施例2中空白对照的单克隆流式鉴定密度图；
图4为实施例2中空白对照单克隆流式鉴定柱状图；
图5为实施例4中诱导时间对脂肪酶BSR菌体OD值变化的影响；
图6为实施例4中诱导时间对脂肪酶BSR酶活力的影响；
图7为实施例5中固定化脂肪酶的最适温度；
图8为实施例5中固定化脂肪酶的温度稳定性；
图9为实施例5中固定化脂肪酶的最适反应pH值；
图10为实施例5中固定化脂肪酶的pH稳定性；
图11为实施例5中不同有机溶剂对酶活力的影响；
图12为实施例5中不同金属离子及蛋白抑制剂对酶活力的影响；
图13为实施例6中脂肪酶BSR的重复利用率结果。
保藏说明
酿酒酵母EBY-BSR，拉丁文为Saccharomyces cerevisiae EBY-BSR，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2021年7月15日，保藏编号为：CCTCC NO：M 2021887。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例所用到的试剂具体如下
5×YNB(Yeast Nitrogen Base without Amino Acids)溶液：称取6.7gYNB溶于ddH2O后定容至100mL，0.22μm滤膜过滤除菌。
100ng/mL氨苄西林溶液：称取1g的氨苄，溶解至10mLddH2O中，用0.22μm滤膜过滤除菌。
100ng/mL链霉素溶液：称取1g的链霉素溶解至10mLddH2O中，用0.22μm滤膜过滤除菌。
SD+CAA培养基：称取1.362g Na2HPO4·12H2O，0.962g NaH2PO4·2H2O 0.5gCasamino acids，加入ddH2O至75mL，蒸汽灭菌后加入20ml 5×YNB溶液，4mL 50％葡萄糖溶液，100μg/mL氨苄西林，100μg/m链霉素。
SG+CAA培养基：1.362g Na2HPO4·12H2O，0.962g NaH2PO4·2H2O,0.5g Casaminoacids，加入ddH2O至70ml，蒸汽灭菌后加入20mL5×YNB溶液，10ml20％半乳糖溶液，100μg/mL氨苄西林，100μg/m链霉素。
实施例1碱性脂肪酶基因BSR的获得及pYD-BSR重组质粒的构建
引物：
Primer1 CAGTGTGGTGGAATTATGAGTTTCCGTCGTCGTTTGTTGC
Primer2 TAGACTCGAGCGGCCTCAACGCTGCTTCGCGGC
反应条件：94℃变性1min，然后94℃变性40s，60℃复性40s,72℃延伸80s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，基因大小为1314bp。
质粒pYD-1的双酶切：挑取含有该质粒的大肠杆菌Top10单菌落，过夜培养。使用质粒提取试剂盒提取质粒，用EcoR I和Not I按以下体系双酶切，酶切时间1h。酶体系为：EcoRI 1μl，NotI 3μl，质粒DNA＜1μg，灭菌的双蒸水加至20μl。酶切回收得到经过双酶切的pYD-1载体。
上述双酶切使用的限制性内切酶为Takara公司生产的快速内切酶，酶切后的纯化回收使用核酸纯化回收试剂盒(OMEGA Gel ExtractionKit(200))，质粒提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司质粒小提试剂盒，操作方法按其使用说明书。
连接：将纯化后的BSR脂肪酶基因与双酶切后的pYD-1载体按1：2的摩尔比例进行连接，连接使用Takara宝日医生物技术(北京)有限公司的In-FusionHD Cloning Plus试剂盒，操作方法按其使用说明书。
转化及筛选：取10μl连接产物与100μl大肠杆菌Top10感受态细胞中，冰浴30min，与42℃水浴锅热激90s，冰浴90s后加入600μl SOD培养基，37℃200rpm培养45min。将培养物涂布于含100μl/ml氨苄的LB平板，培养过夜后挑选单菌落。单菌落于5mlLB培养基中过夜培养后提取质粒，进行双酶切验证，酶切片段与基因大小相同的即为阳性克隆。
基因核酸序列测序：将获得的正确阳性克隆送至上海英潍捷基贸易有限公司进行测序，测序结果与脂肪酶基因BSR核苷酸序列进行比对，结果完全正确后确认将脂肪酶基因BSR插入到pYD-1质粒的多克隆位点上，由此获得脂肪酶的重组质粒命名为pYD-BSR用于下一步实验。
实施例2获得酿酒酵母工程菌株
制备酵母EBY100感受态细胞：将已活化的酿酒酵母(S.cerevisiae)EBYl00菌株单菌落挑至5mLYPD液体培养基中，200r/min过夜培养至OD600nm达1.0左右。将过夜培养的菌液稀释到新的50mLYPD液体培养基中培养3h，至OD600nm约为1.0。
电转化：取质粒pYD-BSR100ng与100ul酵母感受态细胞混匀加入电转杯，静置5min后进行1次电击转化。转化产物转移至复苏液中培养1h。取10μL均匀涂布于1块200mm的SD-CAA平板上，于30℃培养4天，筛选转化子。
单克隆PCR、测序鉴定：从平板上挑取单菌落，稀释于20μL ddH20，100℃煮10min，置于冰上。然后向体系中加入Ex-Taq，10×Ex-Taq Buffer，dNTP及引物，进行PCR反应；利用0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
PCR鉴定引物：
NSF：5＇-GCAGCCCCATAAACACACAGTA-3＇
NSR：5＇-TTGTTATCAGATCAGCGGGTT-3＇
单克隆流式鉴定：将单克隆在SG-CAA培养基中，20℃、200rpm诱导表达24h。PBSA缓冲液洗涤；Anti-V5-tag antibody,1:200孵育一抗；PBSA再洗涤；Goat anti-Mouse IgG(H+L)SecondaryAntibody,DyLight 488，1:200孵育二抗。验证结果如图1和图2所示，显示质粒pYD-BSR成功转化入酵母EBY100菌株中，获得表面展示碱性脂肪酶的重组菌。
实施例3脂肪酶活力的测定
A液：用异丙醇配制16.5mmol/L的pNPP(对硝基苯棕榈酸酯)。
B液：含有2％(W/V)TritonX-100及0.1％(W/V)阿拉伯胶的0.05mol/LTris-HCl缓冲溶液(pH值为7.0)。
测定时先将A液与B液以1：9(体积比)比例混合，取50μL适量稀释的粗酶液加入450μL上述AB混合液中，置于37℃水浴锅中反应10min，立即加入500μL10％(W/V)的三氯乙酸终止反应，测定前需加入1mL0.5mol/L的Na2CO3溶液调整PH值达到碱性，离心1min后，取上清液体200μL于96孔酶标板中，用酶标仪测OD405。
酶活力单位的定义：酶活力单位用来表示酶活力单位的大小的单位，通常用酶量来表示，其单位为U,是指特定条件下(25℃、pH值、底物浓度，底物浓度采用饱和浓度)1min内能转化1μmol底物的酶量，或转化底物中1μmol有关基因的酶量。
实施例4：外源蛋白在酿酒酵母中的诱导表达
(1)挑单菌落于含有1mLSD-CAA培养基的指型瓶中，摇床培养，30℃，220r/min培养过夜。
(2)从指型瓶中取1mL上述培养液至SD-CAA增值培养基中，摇床培养，30℃，220rpm。当OD600达到1时，5000rpm,离心10min，收集菌体后重新加入SG-CAA表达培养基进行诱导表达。诱导条件，摇床培养，20℃，250rpm，12-48h。
(3)分别在0、4、8、12、24、28、32、36、48、52h取菌体，将所取的菌体以pNPP(对硝基苯棕榈酸酯)为底物，50℃反应，测定脂肪酶活力，以确定酿酒酵母重组菌株EBY-BSR的最佳诱导时间。脂肪酶表面展示的酶活力随着诱导时间的增长，酶活力越高。如图5和图6所示，诱导时间达到36h酶活力最高，而当36h之后，OD600增长趋于平缓，酶活力开始趋于下降。因此，确定酿酒酵母重组菌株EBY-BSR的最佳诱导时间为36h，酶活力达到79.4338U/g干细胞重。
实施例5全细胞催化剂脂肪酶特性研究
最适反应温度及稳定性的检测：
在不同的温度条件下(30-80℃)，测定全细胞催化剂的相对酶活力。结果表明，其在pH＝8.5时最适反应温度为50-55℃。将菌体分别于30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80℃下保藏1h后，测定残余酶活，并以未加入菌体为对照，分析全细胞催化剂的温度稳定性。如图7和图8所示，表面展示的脂肪酶BSR在70℃下处理1h，残余酶活60％，热稳定性较好。
最适反应pH及pH稳定性的检测：
以不同pH值(2.2-10.0)的缓冲液溶解底物pNPP，测定脂肪酶的相对活力，确定最适反应pH。结果表明，脂肪酶全细胞催化剂的最适pH为8.5。将菌体于pH值2.2-12.0的缓冲液中室内保藏24h后，测定残余酶活力，以未加缓冲液保藏的菌体为对照，分析表面展示脂肪酶的pH稳定性。如图9和图10所示，表面展示脂肪酶BSR在pH 10的环境下，室温保藏24h残余酶活70％，与未保藏的菌体酶活基本无变化，碱性条件下稳定性良好，适用于工业生产。
有机溶剂对酶活力的影响：
在以pH 7.5的Tis-HCl缓冲液保藏的菌体中分别加入正庚烷、正己烷、环己烷、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、丙酮、甲苯，使有机溶剂的终浓度为30％(v/v)，在室温保存1h后，测定脂肪酶的残余酶活，以未加有机溶剂的菌体为对照，分析有机溶剂对表面展示脂肪酶的影响。
如图11所示，甲醇、乙酸、乙酯对表面展示BSR不具备明显抑制酶活的作用，相对残余酶活分别为97.85％和96.47％。在30％(v/v)乙醇、异丙醇及正已烷中保存1小时后酶活力有着明显的变化(120.45％、127.95％、120.49％)，有一定的促进作用。而正庚烷、环已烷和甲苯三种有机溶剂对展示脂肪酶BSR有一定的抑制作用。
金属离子与蛋白抑制剂对酶活力的影响：
在以pH 7.5的Tis-HCl缓冲液保藏的菌体中分别加入终浓度为10mmol的各种金属离子及巯基乙醇、EDTA、SDS、DTT中，在室温保存1h后，测定脂肪酶的残余酶活，以未加金属离子及蛋白抑制剂的菌体为对照，分析金属离子与蛋白抑制剂对表面展示脂肪酶的影响。
如图12所示，Na+离子、β-巯基乙醇对表面展示的脂肪酶活性基本没有影响，10mmol保存1h后，酶活力仍达到90％以上。Ca2+离子对表面展示的脂肪酶有促进作用，残余酶活可达到110％。
实施例6全细胞催化剂脂肪酶的重复利用率研究
取适量重组菌体，在最优条件下测定脂肪酶活力，重复多次，比较残留酶活力。
如图13所示，可以看出脂肪酶全细胞催化剂在重复利用10次之后，酶活力残余30％以上，这在工业应用上，大大降低了成本。
由以上实施例可知，本发明提供了一种细胞表面展示碱性脂肪酶的酿酒酵母工程菌及其制备方法和使用方法，所述酿酒酵母工程菌的保藏名称为EBY-BSR，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCC NO：M 2021887。本发明利用酵母系统的细胞表面展示技术，所述碱性脂肪酶全细胞催化剂酶活力可到达79.4338U/g干细胞重，并表现出更好的温度稳定性、pH稳定性及有机溶剂耐受性，为酶的固定化技术探索和开拓了新的领域。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广西科学院
<120> 一种细胞表面展示碱性脂肪酶的酿酒酵母工程菌及其制备方法和使用方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1278
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagtttcc gtcgtcgttt gttgccggcc gtggtcggcg gtcttgcgtt gtggtgggct 60
ggcgcggcaa gcgccgcgga tggggaggca tcgcgctggg tggcggcctg ggccaccgcg 120
ctgcagccga ttcctgaaat ggcttctccg cctcctctat atagaacgcc tgaggtcgcg 180
ggtcggacgc tgcgtgagat cgtctatccg agtgcggccg gcgacaaggt cagggtgcgg 240
atcagcaacg cctatgggcg agcgccgttg tcgatcggat cggcgcggat cgcgcgttcc 300
gcggggacgg ccgcggtgcg gggcgacatc gccgcgcagc tgagcttcgg tgggcggcgc 360
gatgtcgtgc tggcgccggg agaggagcgc gacagcgatc cggtctcgct gccggtggag 420
gccggcgagc cgtacgcgat cagcctgttc gtccatggcg agcagaagct gacggcctgg 480
catcgcgtct cgaaccagat caactatgtc tcgacaccgg gcgaccatgc cgcggatacg 540
agcggggacg cctataaggt tcggatcacc cagtcagcct gggtcagcga actggcggtc 600
gaagccgggc ctaacgcggt gggtgcgatt gcggcggttg gcgactcgat caccgatggc 660
atgcgttcga gtctgaatcg caaccggcgc tggccggacg ggctcgatcg ccggctcgac 720
gcggccggcg cgcgccaatg gggcgttgtc aatctcggga tcagcgggaa tcgcttgctg 780
agcgactcgg cctgttatgg cgtcgcactc gagcgcaggt tcgagcgcga cgtccttgcc 840
cgctcggggg tgaaggcggc cgtgctgctg gtcgggatca acgacatcaa tttccaggcg 900
atgccgccac gcgccggcct cgactgcgat gcgccgcata cgaaggtcga tgcgcgggcg 960
ttgatccagg gatatcgccg cctgatcgcg agcgcccacg cgaaaggaat tgccttgttt 1020
ggtgcgacgc tgacgccggc gtccttgcct gcggagcgtg aggcgattcg tgtcgaggtg 1080
aatcactgga tccgcacctc gggggcgttc gatggcgtgg tcgatttcga tgccgcgctg 1140
cgcgacccgt cgcgaccgca gatcatgcaa cgtcgttacg acagtgggga caacatccat 1200
ccgagcgacg caggttatgc ggccatggcg gatgcggtgt cgatcgacaa gctgctggag 1260
gccgcgaagc agcgttga 1278

Claims (8)

1.一种细胞表面展示碱性脂肪酶的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌的保藏名称为酿酒酵母EBY-BSR，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO：M 2021887。
2.权利要求1所述的酿酒酵母工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将碱性脂肪酶基因和质粒结合，得到重组质粒；
(2)将重组质粒转化至酿酒酵母中，获得酿酒酵母工程菌。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述碱性脂肪酶基因为碱性脂肪酶BSR，所述碱性脂肪酶BSR的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述质粒为pYD-1质粒。
5.根据权利要求2～4任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述酿酒酵母为酿酒酵母EBY100。
6.权利要求1所述的酿酒酵母工程菌的使用方法，其特征在于，将酿酒酵母工程菌在培养基中诱导32～40h后使用。
7.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于，所述培养基为SD-CAA培养基。
8.权利要求1所述的酿酒酵母工程菌在提高脂肪酶活力和稳定性中的应用。
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