CN102120991B - 脂肪酶 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脂肪酶，其由SEQ ID NO：1的氨基酸序列构成。还公开了编码该脂肪酶的多核苷酸，含有该多核苷酸的表达载体、转化体，以及制备该脂肪酶的方法。根据本发明的实施例的脂肪酶具有显著大于现有脂肪酶的活性，根据本发明的实施例的脂肪酶的制备方法具有较高的产率。
Description
技术领域
本发明涉及生物化工领域，特别地涉及脂肪酶，编码该脂肪酶的多核苷酸，含有该多核苷酸的表达载体、转化体，以及制备该脂肪酶的方法。
背景技术
脂肪酶是指水解羧酸甘油三酯中酯键的脂肪酶，它主要是催化甘油三酯为甘油二酯、单甘酯、脂肪酸和甘油。从1834年发现兔胰脂肪酶到现在已经100多年。脂肪酶具有催化疏水性的油脂变成水溶性的脂肪酸和甘油的生物功能，在无机溶剂中的保持高催化活力和极强稳定性，以及脂肪酶对底物的广谱性/特殊专一性，赋予了脂肪酶在食品油脂加工工业、洗涤剂工业、酯键化合物的合成和手性药物合成等工业的巨大应用价值。文献报道2004年全球商业用酶的规模约为20亿美元，并预计以3.3％的年增长速率到2009年市场规模达23.5亿美元市场规模。脂肪酶已经成为蛋白酶、淀粉酶之后的第三大工业用酶。
然而，目前脂肪酶的生产效率仍然较低和生产成本也较高。因而现有的脂肪酶生产技术仍有待改进。
发明内容
本发明的目的旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明需要提供一种新型的脂肪酶。
在本发明的一个方面中，根据本发明的实施例，提供了一种脂肪酶，其由下列氨基酸序列构成：AASPRANDAP IVLLHGFTGW GREEMLGFKY WGGVRGDIEQWLNDNGYRTY TLAVGPLSSN WDRACEAYAQ LVGGTVDYGA AHAAKHGHARFGRTYPGLLP ELKRGGRVHI IAHSQGGQTA RMLVSLLENG SQEEREYAKAHNVSLSPLFE GGHHFVLSVT TIATPHDGTT LVNMVDFTDR FFDLQKAVLKAAAVASNVPY TSQVYDFKLD QWGLRRQPGE SFDHYFERLK RSPVWTSTDTARYDLSIPGA EKLNQWVQAS PNTYYLSFST ERTHRGALTG NYYPELGMNAFSAVVCAPFL GSYRNEALGI DDRWLENDGI VNTVSMNGPK RGSSDRIVPYDGTLKKGVWN DMGTCNVDHL EVIGVDPNPS FDIRAFYLRL AEQLASLRP(SEQ IDNO：1)。
另外，在本发明的另一个方面中，根据本发明的实施例，还提供了一种编码上述脂肪酶的多核苷酸，其包含下列核苷酸序列：
GCG GCA TCC CCG CGC GCC AAT GAT GCA CCG ATCGTG CTG CTG CAT GGT TTT ACG GGC TGG GGT CGT GAAGAA ATG CTG GGC TTC AAA TAT TGG GGC GGC GTG CGTGGC GAT ATC GAA CAG TGG CTG AAC GAT AAC GGC TATCGT ACG TAT ACG CTG GCG GTG GGC CCG CTG TCG AGCAAC TGG GAT CGC GCG TGT GAA GCG TAC GCC CAG CTGGTG GGC GGC ACG GTG GAT TAT GGC GCG GCC CAT GCGGCG AAA CAC GGT CAT GCG CGC TTT GGC CGC ACG TATCCG GGC TTG CTG CCG GAA TTG AAA AGA GGC GGC CGCGTG CAT ATC ATC GCG CAT AGC CAG GGC GGC CAG ACGGCC CGC ATG CTG GTG TCT CTG CTA GAA AAC GGC AGCCAG GAA GAA CGC GAA TAC GCC AAA GCG CAT AAC GTGTCG TTG TCG CCG TTG TTT GAA GGC GGC CAT CAT TTTGTG TTG AGT GTG ACG ACC ATT GCC ACG CCG CAT GATGGT ACG ACG CTG GTG AAT ATG GTG GAT TTC ACG GATCGC TTC TTT GAT CTG CAG AAA GCG GTG TTG AAA GCGGCG GCG GTG GCC AGC AAT GTG CCG TAC ACG AGT CAGGTT TAC GAT TTT AAA CTG GAT CAG TGG GGT CTG CGCCGC CAG CCG GGT GAA TCG TTC GAT CAT TAT TTT GAACGC CTG AAA CGT TCC CCG GTT TGG ACG TCG ACGGAT ACG GCC CGC TAC GAT TTA TCC ATT CCG GGC GCGGAA AAA TTG AAT CAG TGG GTG CAG GCC AGC CCG AATACG TAT TAT TTG AGC TTT TCC ACC GAA CGC ACG CACCGC GGC GCG CTG ACC GGC AAC TAT TAT CCG GAA CTGGGC ATG AAT GCA TTC AGC GCG GTG GTT TGC GCC CCGTTT CTG GGC TCG TAC CGC AAT GAA GCG CTG GGC ATTGAT GAT CGC TGG CTG GAA AAC GAT GGC ATC GTG AACACG GTT TCG ATG AAC GGT CCG AAA CGT GGC TCG AGCGAT CGC ATC GTG CCG TAT GAT GGT ACG TTG AAAAAA GGC GTT TGG AAT GAT ATG GGT ACG TGC AACGTG GAT CAT TTG GAA GTG ATC GGC GTT GAT CCGAAT CCG TCG TTT GAT ATC CGC GCC TTT TAT TTGCGT CTG GCC GAA CAG TTG GCG AGT TTG CGC CCG TAA(SEQ ID NO：2)。根据本发明进一步的实施例，上述多核苷酸为DNA序列。
在本发明的又一方面中，根据本发明的实施例，提供了一种表达载体，其包含上述的多核苷酸序列。
在本发明的另外一方面中，根据本发明的实施例，提供了一种转化体，该转化体是通过利用上述的表达载体转化宿主细胞获得的。在本发明进一步的实施例中，所述宿主细胞选自大肠杆菌(E.coli)、酵母和曲霉。
根据本发明的又一方面，还提供了一种制备脂肪酶的方法，其包括下列步骤：
a)在适于脂肪酶表达的条件下培养前述的转化体，以便表达脂肪酶；以及
b)分离所述脂肪酶。
根据本发明的进一步的实施例，所述步骤a)中包括添加诱导剂。根据本发明的进一步的实施例，所述诱导剂为选自乳糖和IPTG的至少一种。根据本发明的又一实施例，所述步骤b)包括：b-1)超声破碎转化体获得裂解液；和b-2)从所述裂解液分离纯化所述脂肪酶。
根据本发明的实施例，所获得的脂肪酶具有高酶促活性，并且利用根据本发明实施例的制备方法能够以高生产效率制备脂肪酶。
本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示pEASY-BTL2-MBL21(DE3)培养物的SDS-PAGE结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。所描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。
下文的公开提供了许多不同的实施例或例子用来实现本发明的不同实施方式。为了简化本发明的公开，下文中对特定实施例或示例进行描述。当然，它们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明提供了的各种特定工艺和材料的例子，本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的可应用性和/或其他材料的使用。除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，核酸以5’至3’的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。
本发明是基于下列事实完成的：将现有来自Bacillus thermocatenulatus的脂肪酶基因2(简称为BTL2，其序列参见SEQ ID NO：3)中5’端部分序列切除后获得的蛋白质具有高脂肪酶活性，另外申请人惊奇地发现在将编码脂肪酶的基因中进行若干突变后，其表达脂肪酶的效率得到显著提高。
脂肪酶
在本文中所使用的术语“脂肪酶”是指具有催化甘油三酯为甘油二酯、单甘酯、脂肪酸和甘油活性的蛋白质(多肽)。在本文中所使用的术语“蛋白质”和“多肽”是可以互换的，其是指若干个氨基酸残基通过肽键连接所形成的寡聚物或者高聚物。通常而言，蛋白质或多肽的序列可以由三字母或者单字母缩写表示的氨基酸序列来表征。在本发明中采用了单字母来作为氨基酸的缩写，其含义是本领域技术人员所公知的。
根据本发明的一个实施例，提供了一种脂肪酶，其具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列。与Bacillus thermocatenulatus的脂肪酶基因2(BTL2基因，SEQ ID NO：3)所编码的脂肪酶(BTL2)相比，本发明的脂肪酶的N末端被截短28个氨基酸。本发明的脂肪酶可以由将BTL2基因的5’端部分序列(下面SEQ ID NO：3中下划线的84个碱基)切除后而获得的多核苷酸序列编码：
ATG ATG AAA GGC TGC CGG GTG ATG GTT GTG TTG CTT GGA TTA TGG TTT GTG TTC GGC CTG TCG GTC CCG GGA GGG CGG ACG GAA GCG GCA TCC CCA CGC GCCAAT GAT GCA CCC ATC GTG CTT CTC CAT GGG TTT ACAGGA TGG GGG CGA GAG GAA ATG CTT GGA TTC AAA TATTGG GGC GGC GTG CGT GGC GAT ATC GAA CAA TGG CTGAAC GAC AAC GGA TAT CGT ACG TAT ACG CTG GCG GTCGGA CCG CTC TCG AGC AAC TGG GAC CGG GCG TGT GAAGCG TAC GCC CAG CTT GTC GGC GGA ACG GTC GAT TATGGC GCG GCC CAT GCG GCG AAG CAC GGT CAT GCG CGGTTT GGC CGC ACG TAT CCG GGC TTG CTG CCG GAA TTGAAA AGA GGC GGC CGC GTC CAT ATC ATC GCT CAT AGCCAA GGA GGA CAG ACG GCC CGC ATG CTT GTG TCT CTCCTA GAG AAC GGA AGC CAA GAA GAG CGG GAG TAC GCCAAG GCG CAT AAC GTG TCG TTG TCG CCG TTG TTT GAAGGC GGA CAT CAT TTT GTG TTG AGT GTG ACA ACC ATTGCC ACT CCT CAT GAC GGG ACG ACA CTT GTC AAT ATGGTC GAT TTC ACT GAT CGC TTC TTT GAC CTG CAA AAAGCG GTG TTG AAA GCG GCG GCT GTC GCC AGC AAT GTGCCG TAC ACG AGT CAA GTA TAC GAT TTT AAG CTC GACCAA TGG GGG CTG CGC CGC CAG CCG GGT GAA TCGTTC GAC CAT TAT TTT GAA CGG CTC AAA CGA TCCCCT GTT TGG ACG TCG ACG GAT ACT GCC CGC TAC GATTTA TCC ATT CCC GGA GCT GAG AAG TTG AAT CAA TGGGTG CAA GCC AGC CCG AAT ACG TAT TAT TTG AGC TTTTCC ACC GAA CGG ACG CAC CGC GGA GCG CTC ACC GGCAAC TAT TAT CCC GAA CTC GGA ATG AAT GCA TTC AGCGCG GTC GTA TGC GCC CCG TTT CTC GGC TCG TAC CGCAAT GAG GCG CTC GGC ATT GAC GAC CGC TGG CTG GAGAAC GAT GGC ATC GTC AAC ACG GTT TCG ATG AAC GGTCCA AAG CGT GGA TCA AGC GAT CGG ATC GTG CCGTAT GAC GGG ACG TTG AAA AAA GGA GTT TGG AATGAT ATG GGG ACG TGC AAC GTC GAC CAT TTG GAAGTG ATC GGC GTT GAC CCG AAT CCG TCA TTT GATATC CGC GCC TTT TAT TTG CGA CTT GCC GAG CAGTTG GCG AGT TTG CGG CCT TAA(SEQ ID NO：3，BTL2基因序列)。
申请人发现在将BTL2的N端截短28个氨基酸后获得的脂肪酶(即本发明的脂肪酶)与BTL2脂肪酶相比，具有更高的脂肪酶活性。
根据本发明的实施例，从多核苷酸序列中除去预定部分序列的方法不受特别限制，例如可以采用PCR方法。另外，在本发明的实施例中，可以通过任何已知的方法鉴定所表达蛋白质的脂肪酶活性。
多核苷酸
在本文中所使用的术语“多核苷酸”可以包括DNA或者RNA，它们可以是单链或者多链的。本领域技术人员能够理解，作为遗传密码简并性的结果，许多不同的多核苷酸能够编码相同的多肽。另外，应当理解，本领域技术人员能够使用常规的技术进行核苷酸取代，所述取代不会影响本发明中所使用的多核苷酸编码的多肽序列。另外，还可以使用本领域中的已知的方法对多核苷酸进行修饰，以增强本发明多核苷酸在体内的活性或者存活期。
根据本发明的实施例，提供了一种多核苷酸，其可以编码一种蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
本领域技术人员可以根据遗传密码表，基于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，设计多种多核苷酸，进而获得氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示、具有脂肪酶活性的蛋白质。
在本发明的一些实施例中，提供了一种编码脂肪酶的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。该多核苷酸所编码的脂肪酶与BTL2脂肪酶相比缺失N末端的28个氨基酸。在本文中，将SEQ ID NO：1所示的脂肪酶基因命名为BTL2-M。申请人惊奇地发现利用BTL2-M能够以比其它核苷酸序列高得多的产率表达脂肪酶蛋白。SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列与BTL2脂肪酶基因的序列(SEQ ID NO：3)相比，缺失了5’端的84个碱基，并且在108个核苷酸位点存在核苷酸碱基突变。BTL2-M与BTL-O(对应BTL2脂肪酶基因切除5’末端84个碱基的多核苷酸序列)的比对结果如下所示：
B T L 2-M 1 G C G G C A T C C C C G C G C G C C A A T G A T G C A C C G A T C G T G C T G C T G C A T G G T T T T A C G G G C T G G 60
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#
如上所示，在BTL2-M与BTL2-O之间存在108处核苷酸碱基差异(阴影标记的位点表示密码子改变的氨基酸残基)。申请人从大量多核苷酸中，筛选发现BTL2-M能够以比其它核苷酸序列高得多的产率在宿主细胞中表达脂肪酶蛋白。
需要说明的是，在本文中均采用DNA序列的形式显示多核苷酸，但可以理解的是，只需要将DNA中的T更换为U，即可获得对应的RNA序列，在此，不再重复描述。
表达载体
本文中所使用的术语“表达载体”是指含有有效连接到控制元件的多核苷酸的构建体。所述控制元件能够影响多核苷酸在适当宿主中的表达。这类所述的控制元件包括影响转录的启动子，控制转录的可选操纵子序列，编码适当的mRNA核糖体结合位点的序列，以及控制转录和翻译终止的序列。根据本发明的实施例，本发明的表达载体包括质粒、基因组、线粒体DNA、病毒或核酸片段。根据本发明的一个具体实施例，采用质粒作为表达载体，例如采用T7启动子的pEASY-E2载体，由此，可以方便地将本发明实施例的多核苷酸整合到表达载体上，并且便于在宿主例如大肠杆菌中表达期望的蛋白质(脂肪酶)。此处所使用的术语“质粒”通常指一种环状双链(ds)DNA构建体，其在许多细菌和真核细胞中都能够形成染色体外自主复制遗传元件。
根据本发明的实施例，提供了一种表达载体，其包含根据本发明实施例的编码脂肪酶的多核苷酸，其中所编码的脂肪酶具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。在本发明的一个具体实施例中，所述载体包含SEQ ID NO：2所示的多核苷酸，即BTL2-M。当然，本发明的表达载体也可以包含其它编码脂肪酶的多核苷酸，例如包含BTL-O。根据本发明的实施例，所述载体还可以包含“编码可选择标记的多核苷酸序列”，即这样一种多核苷酸序列，其能够在宿主细胞中表达，并且所编码的可选择标记赋予含有该质粒的细胞在存在相关选择性试剂时或缺乏基本营养物时生长的能力。根据本发明的实施例，可选择标记的例子包括但不限于抗生素抗性，例如卡那霉素抗性、红霉素抗性、放线霉素抗性、氯霉素抗性和四环素抗性，可以通过在培养基中添加上述抗生素来筛选包含所述表达载体的宿主细胞。。
转化体
在本文中，所采用的术语“转化体”是指接受了外源遗传物质(多核苷酸，如质粒等)使遗传特性发生了改变的宿主细胞。根据本发明的实施例，提供了一种转化体，其是通过用前述表达载体转化宿主细胞而获得的。根据本发明实施例的转化体，其能够表达具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的脂肪酶。根据本发明的一个具体实施例，提供了一种转化体，其是通过用这样的一种表达载体转化宿主细胞而获得的，在该表达载体上含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，由此，能够高效率地表达具有SEQ IDNO：1所示氨基酸序列的脂肪酶。
根据本发明的实施例，宿主细胞的类型不受特别限制。根据本发明的一些具体实施例，采用原核细胞微生物如大肠杆菌，也可以采用真核细胞微生物，例如酵母和霉菌(如曲霉)。在本发明的一个具体示例中，采用大肠杆菌作为宿主细胞，这样便于转化宿主细胞，以及方便回收和纯化所表达的脂肪酶。
在本发明中使用的术语“转化”应作广义理解，可以是指任何能够使得宿主细胞表达外源基因的方法。可以采用任何传统的方法，将表达载体导入宿主细胞中，例如通过化学法，也可以通过电穿孔法、病毒感染等。经过转化体转化的宿主细胞中的表达载体可以以游离地形式存在，即表达脂肪酶的多核苷酸在表达载体上主要由表达载体上携带的表达控制元件进行表达脂肪酶。根据本发明的实施例，表达脂肪酶的多核苷酸也可以整合到宿主细胞的基因组中，由宿主细胞的基因组控制其表达。在宿主细胞中，表达脂肪酶的多核苷酸的拷贝数不受特别限制，根据本发明的一些实施例，宿主细胞中含有多拷贝的游离型的表达载体，例如，拷贝数为5-200个质粒/细胞，优选10-50个质粒/细胞。由此，能够进一步提高脂肪酶的表达效率。另外，根据本发明的实施例的转化体所表达的脂肪酶蛋白是水溶性的，因而易于后续分离纯化脂肪酶。并且根据本发明的实施例证明，根据本发明实施例的转化体既适合摇瓶培养制备脂肪酶，同时也适合发酵罐(例如5升发酵罐)发酵制备脂肪酶。
制备脂肪酶的方法
根据本发明的又一方面，提供了一种制备脂肪酶的方法。该方法包括下列步骤：a)在适于脂肪酶表达的条件下培养前述的转化体，以便表达脂肪酶；以及c)分离所述脂肪酶，从而获得脂肪酶。根据本发明的实施例，脂肪酶基因表达的控制方法不受特别限制，可以是化学法诱导，也可以是其它能够使外源基因表达的方法，例如通过pH值变动，或者温度变动等来诱导。在本发明的一个实施例中，采用诱导剂例如IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)和乳糖的至少一种来启动脂肪酶基因的表达，在一个具体示例中，添加IPTG的终浓度为0.1-2mM，优选为0.4mM-1mM，由此能够提高脂肪酶的生产效率，并且便于诱导脂肪酶的表达。在本发明的实施例中，IPTG的添加时机不受特别限制。根据本发明的实施例，可以在转化体生长至OD600nm值(600nm处的光密度)为0.5至100时添加诱导剂IPTG。在本发明一个具体实施利中，在OD600nm(600nm处的光密度)值为0.5～1时，添加IPTG，由此适合摇瓶制备脂肪酶。在本发明的另一个具体示例中，OD600nm(600nm处的光密度)值为10-80时，添加IPTG，由此适合发酵罐制备脂肪酶。在表达脂肪酶后，可以通过任何已知的方法分离脂肪酶。例如在本发明的一个实施例中，首先，超声破碎转化体获得裂解液，使所表达的脂肪酶被释放到裂解液中；然后，通常常规的纯化方法从所述裂解液分离纯化所述脂肪酶。需要说明的，并不一定要在破碎宿主细胞后纯化脂肪酶，在某些情况下可以直接将转化体的培养物作为具有脂肪酶活性的材料进行使用。在本发明的一个具体示例中，离心发酵液收集转化体细胞并低温干燥处理，发明人惊奇地发现干燥后的转化体细胞(未破菌)的水解活力是相同浓度下已经超声波破碎脂肪酶细胞的水解活力的90％。在进一步的实施方式中，将低温干燥处理的转化体细胞进行低温丙醇处理如10分钟，由此能够提高菌体的通透性，进一步提未经破碎的细菌的水解活性。
下面通过说明性的具体实施例对本发明进行描述，这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。
材料
在后面实施例中所涉及到的实验试剂材料均是实验室常用试剂，其中发酵罐是Satoris公司销售的5升自动发酵罐。
所使用的宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)。
LB培养基(1L)：蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母提取物5g。
LB固体培养基(1L)：蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母提取物5g，琼脂粉10g。
发酵培养基(1L)：
组分 含量
硫酸铵 12g
磷酸氢二钾 3g
磷酸二氢钾 2g
硫酸镁 0.3g
酵母粉 1.5g
甘油 25g
微量元素组合物溶液 1.0mL
其中，所述微量元素组合物溶液的组成(1L)如下：
组分 含量
硫酸锰 100mg
氯化锌 70mg
钼酸钠 35mg
硼酸 60mg
氯化钴 200mg
硫酸铜 29.28mg
氯化镍 25mg
浓盐酸(37％HCl) 0.9mL。
流加培养基(1L)：
组分 含量
甘油 500g
硫酸镁 20g
氨水50％ 100g。
脂肪酶活力测定方法
将待测发酵液稀释至OD600小于3，干燥细胞则准确称量细胞干粉并用去离子水充分溶解至2g/L。把上述酶样品转入10mL小试管中，用超声波细胞粉碎机进行细胞破碎，用冰水混合物维持低温状态，参数：200W，工作3秒，间歇7秒，90次循环，破碎后酶样品待测。
取4mL 200mM Tris-HCl pH8.0缓冲液于带塞三角瓶中，加1mL三丁酸甘油酯，于60℃摇床200rpm至少预热5min，然后加100uL上述破碎后细胞溶液，摇床60℃200rpm反应5min，立即取出加20mL无水乙醇终止反应，加4滴酚酞试剂(10g/L乙醇)，0.1mol/LNaOH溶液滴定。同时三瓶平行对照。空白实验在加入酶样品后立即加入20mL无水乙醇终止反应。酶活计算公式如下：
计算公式：细胞胞内酶活(μmol/mL.min)＝(V1-V2)Xc/(mXt)
式中：
V1-试样所消耗的NaOH溶液的体积，mL；
V2-空白实验所消耗的NaOH溶液的体积，mL；
c-NaOH溶液的浓度，mmol·L-1；
m-所取的酶液体积，mL；
t-反应时间，min。
酶活力单位的定义：在60℃，200mM Tris-HCl pH8.0，20％底物浓度下，每分钟催化丁酸甘油三酯水解生成1μmoL脂肪酸的酶量，定义为1个酶活力单位。
SDS-PAGE蛋白电泳
制备SDS-PAGE：依照表1分离胶的组成，加入蛋白电泳槽，胶充分凝固后；再依照X浓缩胶的组成，加在蛋白电泳槽中分离胶上部，放置使胶充分凝固。
样品制备：取适量样品与等体积2×上样缓冲液混合，沸水浴5min，12000rpm离心3min，取20微升上清液进行电泳。
电泳条件：浓缩胶80V；分离胶120V，溴酚蓝移至分离胶底部时结束电泳，加入考马斯亮蓝染色液在摇床上缓慢振荡半小时，用脱色液脱色至呈现清晰条带，记录并扫描胶片。
表1分离胶和浓缩胶的组成
| 10％分离胶/mL | 浓缩胶/mL | |
| 水 | 1.9 | 0.68 |
| 30％Acr-bis | 1.7 | 0.17 |
| 1.5M Tris-HCl | 1.3 | |
| 1.0M Tris-HCl | 0.13 | |
| 10％过硫酸盐 | 0.05 | 0..01 |
| 10％SDS | 0.05 | 0.01 |
| TEMED | 0.02 | 0.001 |
实施例1：表达载体pEASY-BTL2-MBL21(DE3)的构建以及大肠杆菌转化体的获得
BTL2-M基因由上海旭冠生物科技发展有限公司按照SEQ ID NO：2核苷酸序列进行全人工合成。
之后，使用上游引物BTL2-M_F：5’-GCGGCATCCCCGCGCGCCA-3’(SEQ ID NO：4)和下游引物BTL2-M_R：5’-TTACGGGCGCAAACTCGCCA-3’(SEQ ID NO：5)，以人工合成的BTL2-M进行链式聚合反应，以扩增BTL2-M基因。在琼脂糖核酸电泳分离纯化PCR扩增产物之后，与全式金公司的pEASY-E2表达载体进行TA克隆。将1微升pEASY-E2(携带青霉素抗性标记)和3微升PCR产物在室温下连接反应15分钟后，转入50微升大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，静置冰浴20分钟，迅速转入42摄氏度水浴热击60秒，再在冰上放置3分钟，添加900微升LB培养基，在37摄氏度下，摇床培养1小时后，离心收集菌体后使用100微升LB培养基重悬，涂布在含有100微克/mL氨苄青霉素的LB平板上，37摄氏度静置过夜培养。第二天对单克隆菌落进行PCR鉴定(使用表达载体克隆位点的上游引物和脂肪酶基因的下游引物)，有近似脂肪酶基因大小的亮带的克隆即为阳性克隆，命名为pEASY-BTL2-M，并由生物测序公司进行进一步测序鉴定。确认阳性克隆转入大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，命名为pEASY-BTL2-MBL21(DE3)。
实施例2：pEASY-BTL2-OBL21(DE3)重组载体的构建以及大肠杆菌转化体的获得
BTL2-O基因由上海旭冠生物科技发展有限公司进行全人工合成BTL2-O基因。使用上游引物BTL2-O_F：5’-GCGGCATCCCCACGCGCCA-3’(SEQ ID NO：6)和下游引物BTL2-O R：5’-TTAAGGCCGCAAACTCGCC-3’(SEQ ID NO：7)以人工合成的BTL2-O基因进行链式聚合反应扩增BTL2-O基因。在琼脂糖核酸电泳分离纯化PCR扩增产物之后，与全式金公司的pEASY-EV2表达载体(携带青霉素抗性标记)进行TA克隆。将1微升pEASY-EV2和3微升PCR产物在室温下连接反应15分钟后，转入50微升大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，静置冰浴20分钟，迅速转入42摄氏度水浴热击60秒，再在冰上放置3分钟，添加900微升LB培养基，在37摄氏度下，摇床培养1小时后，离心收集菌体后使用100微升培养基重悬菌体，涂布在含有100微克/mL氨苄抗生素的LB平板上，37摄氏度静置过夜培养。第二天对单克隆菌落进行PCR鉴定(使用表达载体克隆位点的上游引物和脂肪酶基因的下游引物)，有近似脂肪酶基因大小的亮带的克隆即为阳性克隆，命名为pEASY-BTL2-O，并由生物测序公司进行进一步测序鉴定。确认阳的性克隆转入BL21(DE3)感受态细胞，命名为pEASY-BTL2-OBL21(DE3)。
实施例3：pEASY-BTL2-MBL21(DE3)摇瓶表达脂肪酶
将pEASY-BTL2-MBL21(DE3)接种到含有5mL LB培养基试管，在37摄氏度下、200转/分钟的摇床中过夜培养。然后，将1毫升的培养液转接到含有100毫升LB培养基的250毫升摇瓶里面，在37摄氏度下、200转/分钟的摇床中培养约2小时，至OD600nm＝0.6，添加IPTG至终浓度为0.4mM以诱导BTL2-M基因表达。诱导后6小时取样超声波破碎，进行脂肪酶活性测定，脂肪酶水解丁酸甘油三酯的酶活力为300U/mL。
实施例4：pEASY-BTL2-OBL21(DE3)和pEASY-BTL2-MBL21(DE3)摇瓶表达脂肪酶对比实验
将pEASY-BTL2-OBL21(DE3)和pEASY-BTL2-MBL21(DE3)分别接种到含有5毫升LB培养基的试管里面，在37摄氏度、200转/分钟的摇床中过夜培养。然后，将1ml培养物转接到含有100mL LB培养基的250mL摇瓶里面，在37摄氏度、200转/分钟的摇床里面培养，约3小时后OD600nm＝0.6时，添加IPTG至终浓度为0.4mM诱导基因表达。诱导后4小时和6小时，取样测定生物量OD600nm和进行超声破菌后测定脂肪酶活性的测定，结果如下：
(a)4小时后pEASY-BTL2-OBL21(DE3)的OD600nm＝2.44，酶活40.21U/mL，单位细胞的比活力16.48U/mL.OD；pEASY-BTL2-MBL21(DE3)OD600nm＝3.11，酶活261.61U/mL，单位细胞的比活力84.12U/ml。pEASY-BTL2-MBL21(DE3)的比酶活力是pEASY-BTL2-OBL21(DE3)的5.1倍。
(b)6小时后，pEASY-BTL2-OBL21(DE3)的OD600nm＝2.49，酶活41.11U/mL，单位OD细胞的比活力16.51U/mL.OD；pEASY-BTL2-MBL21(DE3)OD600nm＝3.11，酶活369.21U/mL，单位OD细胞的比活力118.72U/mL。pEASY-BTL2-MBL21(DE3)的比酶活力是pEASY-BTL2-OBL21(DE3)的7.2倍。
实施例5：pEASY-BTL2-MBL21(DE3)5L发酵罐实验
将pEASY-BTL2-MBL21(DE3)接种到含有100mL发酵培养基250mL摇瓶中，在37摄氏度、200转/分钟摇床中过夜培养。然后，将30ml培养物转接到含有3L发酵培养基的5L发酵罐里面，在37摄氏度、pH6.8条件下进行好氧发酵，发酵液溶氧的饱和溶解度设定20％以上。以溶氧突然上升为标志开始补加流加培养基。在OD600nm＝15时候，添加IPTG至终浓度为0.4mM诱导基因表达。诱导后每一小时取样，进行生物量测定和超声破菌后脂肪酶水解酶活测定，6小时左右脂肪酶水解酶活达到最高，约3000U/mL。
实施例6：pEASY-BTL2-MBL21(DE3)5L发酵罐发酵脂肪酶
将pEASY-BTL2-MBL21(DE3)接种到含有100mL发酵培养基250mL摇瓶中，在37摄氏度、200转/分钟摇床中过夜培养。然后，将30ml培养物转接到含有3L发酵培养基的5L发酵罐里面，在37摄氏度、pH6.8条件下进行好氧发酵，发酵液溶氧的饱和溶解度设定20％以上。以溶氧突然上升为标志开始补加流加培养基。10小时后OD600nm＝50时候，添加IPTG至终浓度为0.4mM诱导基因表达。诱导后定时取样进行生物量测定和破菌后测定脂肪酶活性。发酵7小时左右脂肪酶水解酶活达到最高，约22470U/mL。该脂肪酶酶活水平是所有使用重组大肠杆菌法发酵脂肪酶报道中最高的
实施例7：pEASY-BTL2-MBL21(DE3)表达脂肪酶蛋白可溶性实验
将pEASY-BTL2-MBL21(DE3)接种到含有5mL LB培养基试管，在37摄氏度、200转/分钟摇床中过夜培养。然后，将1ml培养物转接到含有100mL LB培养基的250mL摇瓶里面，在37摄氏度、200转/分钟摇床中培养约2小时至OD600nm＝0.6，添加IPTG至终浓度为0.4mM诱导基因表达。诱导后6小时取样添加上样缓冲液制备SDS样品；同时取样超声波破碎，参数：200W，工作3秒，间歇7秒，90次循环。100μl破碎后样品15000g离心10分钟，上清液(约96μl)添加上样缓冲液制备SDS样品，同时添加95微升去离子水重悬沉淀并添加上样缓冲液制备SDS样品。电泳结果示于图1中。在图1中，M为蛋白质标记物，从上到下分子量为(kD)：116，66，45，35，35，18，14。泳道1为诱导前样品；泳道2为诱导后样品；泳道3为诱导破菌上清样品；泳道4为诱导破菌沉淀样品，箭头表示为脂肪酶蛋白。结果显示在pEASY-BTL2-MBL21(DE3)培养物的上清液和菌体内均表达大量脂肪酶蛋白，并且表示pEASY-BTL2-MBL21(DE3)表达的大部分BTL2脂肪酶蛋白是可溶的，从而脂肪酶蛋白容易分离和纯化，并且不会由于分离纯化而导致活性的丧失。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同限定。
Claims (9)
1.一种编码脂肪酶的多核苷酸，其中，所述脂肪酶由SEQ ID NO：1的氨基酸序列构成，所述多核苷酸由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列构成。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其为DNA序列。
3.一种表达载体，其包含权利要求1所述的多核苷酸。
4.一种转化体，其是通过利用权利要求3所述的表达载体转化宿主细胞获得的。
5.根据权利要求4所述的转化体，其中，所述宿主细胞选自大肠杆菌、酵母和曲霉。
6.一种制备脂肪酶的方法，其包括下列步骤：
a)在适于脂肪酶表达的条件下培养权利要求4或5所述的转化体；以及
b)分离所述脂肪酶。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述步骤a)中包括添加诱导剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述诱导剂为选自乳糖和IPTG的至少一种。
9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述步骤b)包括：
b-1)超声破碎转化体获得裂解液；和
b-2)从所述裂解液分离纯化所述脂肪酶。
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| pez‡ |
| sar Carrasco-Lo´ |
| Schmidt-Dannert,C., et al..triacylglycerol lipase [Geobacillus thermocatenulatus]..《GenBank: CAA64621.1》.2005, * |
| 丁军涛等.Tsol18基因密码子优化对其表达及重组蛋白免疫效果的影响.《畜牧兽医学报》.2009,第40卷(第3期),409-415. * |
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| Publication number | Publication date |
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| CN102120991A (zh) | 2011-07-13 |
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