CN103756866B - 酵母展示脂肪酶生产乳香富硒蓝莓醋的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酵母展示脂肪酶生产乳香富硒蓝莓醋的方法，一方面将稻米脂肪酶展示在毕赤酵母表面，扩增培养48~96h，使稻米脂肪酶随酵母产量大幅增加，以重量计将该展示了稻米脂肪酶的酵母菌1~4份（湿重）加入200-300份乳脂液中于35~55℃进行酯解反应2~6h后，过滤得到增香的乳液；另一方面以富硒蓝莓和富硒酵母为基本原料采用半固态法生产出富含有机硒的蓝莓醋，在此基础上将增香乳和富硒蓝莓醋按1：9~3：7（w/w）的比例混合制成受消费者喜爱的乳香富硒蓝莓醋保健饮料；不但方便消费者安全高效补充人体必需微量元素硒，而且发挥了蓝莓醋明目、美肤、抗衰老的保健作用。

Description

酵母展示脂肪酶生产乳香富硒蓝莓醋的方法

技术领域

本发明涉及食品加工技术领域，尤其涉及一种利用酵母表面展示脂肪酶使脂肪酯解增香及富硒酵母生产出乳香富硒蓝莓醋的方法。

背景技术

水果醋兼有水果和食醋的营养保健功能，是集营养、保健、食疗等功能为一体的深受消费者喜爱的饮品；而蓝莓被誉为“水果皇后”，近年来也出现了如公布号为CN2475343A的中国专利所公开的具有消除眼睛疲劳、营养皮肤、延缓衰老的蓝莓醋。

硒是人体必需的微量元素，我国有72%地区属缺硒或低硒地区，严重威胁着人们的身体健康，开发具丰富乳香和安全补充有机硒的蓝莓醋饮料可有效缓解这种现象，而脂肪酶酯解脂肪及蓝莓富硒、酵母富硒分别是增香富硒的有效手段。

目前，一方面脂肪酶由于稳定性差、价格偏高，在我国主要依赖进口，而限制了脂肪酶的大规模使用，另一方面在稻米加工过程中，对脂肪酯解成中短链脂肪酸具有特异优势的稻米脂肪酶很难从稻米中分离出来，一直未能实际应用而被当作有害物遭灭酶钝化而被废弃。

近几年，现代生物技术的飞速发展使得脂肪酶的开发利用达到一个新的水平阶段，如博士论文（刘文山.脂肪酶在酿酒酵母中的表面展示研究[D]武汉，华中科技大学，2010）所述，酵母菌表面展示脂肪酶具有可提高脂肪酶的产量，在使用过程中不用分离纯化等优点，但并不能保证所有脂肪酶均能展示成功且具酶活性，也尚未见酵母成功展示稻米脂肪酶及其应用的报道。

发明内容

目前，尚无利用毕赤酵母固定稻米脂肪酶酯解乳脂增香并利用富硒蓝莓和富硒酵母制造乳香富硒蓝莓醋的报道，本发明填补了该项空白。

本发明将一种对脂肪酯解成中短链脂肪酸具有特异优势的稻米脂肪酶DNA序列，综合其它信息进行序列组合设计得序列SEQ NO1（如后附序列表），委托生物公司进行序列合成和多个相关基因工程菌构建，然后通过验证实验，选定了巴斯德毕赤酵母壁蛋白为锚定蛋白展示该稻米脂肪酶，将合成得到的基因克隆在pUC57载体上，进一步亚克隆到pPIC9K载体中，再转化到酵母中在葡萄糖培养基中扩增培养，最后通过检测筛选，将扩增得到的表面展示有稻米脂肪酶的酵母液离心过滤后加入乳脂液中，使其发生酯解反应生成中短链脂肪酸，然后与富硒蓝莓醋混合，在饮料调配和热杀菌过程中进一步生成丰富的乳香并提高饮料的口感，同时又使无机硒通过蓝莓或酵母转化为能被人体安全利用的有机硒。

附图说明

图1 为琼脂糖凝胶电泳鉴定图1。

图2 为琼脂糖凝胶电泳鉴定图2。

图3 为本发明生产工艺示意图。

实施例1 

一、毕赤酵母展示稻米脂肪酶

1、Rlipase基因合成委托生物公司（本例由南京金斯瑞生物科技有限公司）完成，基因克隆在pUC57载体上（pUC57-Rlipase），DNA序列如SEQ1所示。

2、Rlipase亚克隆到pPIC9K载体中

分别将pUC57-Rlipase和pPIC9K载体进行Eco RI和Not I双酶切， 酶切反应体系分别如下：

pUC57-Rlipase质粒               34 ml

10* buffer                             4 ml

Eco RI                                 1 ml

Not I                                   1 ml

总共40ml体系，

pPIC9K质粒                         6 ml

10* buffer                             2 ml

Eco RI                                 1 ml

Not I                                   1 ml

ddH₂O                               10 ml

总共20 ml体系，

分别混匀后放在37℃水浴锅中反应4 h，之后用1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示。

3、采用胶回收试剂盒回收目的基因片断Rlipase和pPIC9K载体片断，分别用20 ml水洗脱，

之后用T4 DNA Ligase进行连接反应，反应体系如下：

Rlipase片段                           3 ml

pPIC9K片段                          1 ml

10* T4 Ligase buffer                 2 ml

T4 Ligase                               1 ml

ddH₂O                                 13 ml

总共20 ml体系；22℃过夜连接，之后转化到DH5a感受态细胞中，涂布在含有amp和kana抗性的LB（Miller broth (1%NaCl)：1% peptone, 0.5% yeast extract, and 1% NaCl）固体培养基上进行37℃过夜培养；挑取克隆进行摇菌，质粒抽提，并进行Eco RI和Not I双酶切鉴定。酶切反应体系如下：

pPIC9K- Rlipase                     8 ml

10* buffer                             2 ml

Eco RI                                 1 ml

Not I                                    1 ml

ddH2O                                 8 ml

总共20 ml体系，

混匀后放在37℃水浴锅反应4 h，之后用1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，成功构建了pPIC9K-Rlipase载体，电泳图如图2所示。

4、pPIC9K-Rlipase转化到毕氏酵母GS115中

1）、 试剂 

（1） 1M LiCl：用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；

（2） 50% PEG3350 ：Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装； 

（3） 2 mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存； 注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用。 

2）、毕氏酵母的转化 

（1）煮沸1 ml鲑鱼精DNA 5 min，迅速冰浴以制备单链担体DNA； 

（2）将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液； 

（3）对于每一个转化，按以下顺序加入：           

50% PEG3350                          240 ml           

1 M LiCl                                36 ml           

2 mg/ml 单链Salmon sperm DNA           25 ml           

5～10 mg/50ul H₂O 质粒DNA              50 ml 

（4）剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1 min）；

（5）30℃水浴孵育30 min； （6）42℃水浴热休克20～25 min； 

（7）6000～8000 rpm离心收集酵母菌体； 

（8）重悬酵母于1ml YPD培养基（1%酵母膏，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖），30℃摇床孵育； 

（9）1～4 h后，取25～100 ml菌液铺YD选择性培养基平板(1.67%YNB+2%葡萄糖+1%琼脂粉)，于30℃培养2～3天鉴定（将表达菌株和对照菌株在固体培养基平板，30℃培养至转化子出现）。

3）备注：

（1）YNB从化学试剂商店订购，其配方为：YNB 1L含：维生素：生物素类：2 mg，尼克酸：400 mg，盐酸硫铵：400 mg，叶酸：2 mg，肌醇：2000 mg，对氨基苯甲酸：200 mg，核黄素：200 mg，泛酸钙：400 mg，盐酸吡哆醇：400 mg；微量元素：括号内表示所含微量元素，硼酸（B）：500 mg，硫酸铜（Cu）：40 mg，碘化钾：100 mg，氯化铁(Fe)：200 mg，硫酸锰(Mn)：400 mg，钼酸钠(Mo)：200 mg，硫酸锌：400 mg；大量元素：括号内表示所含大量元素，硫酸镁（Mg）：0.5 g，氯化钠(Na)：0.1g，磷酸二氢钾(K)：1g；硫酸铵（N）：5g，可溶性氯化钙：0.1g；

（2）GS115是组氨酸缺陷性菌，因此在YD培养基上不能生长，只有成功转化了pPIC9K的GS115菌才能在YD培养基上生长。

4）扩增培养：

（1）、从平板中挑取单菌落，接种于YPD培养基中，30℃，250 rpm培养过夜；

（2）测OD₆₀₀，取适量菌液，离心，弃净上清，沉淀物用无菌水洗涤一次，然后转接于25 mL 葡萄糖培养基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB（amino free），10 mL/100 mL 1 M磷酸盐缓冲液，2%葡萄糖），使初始OD₆₀₀约为1，30℃，250 rpm发酵96 h，每隔24 h取样，于第24 h和48 h补加葡萄糖混合液500 μL（该混合液由葡萄糖和1 M K₂HPO₄混合组成，甘油和1MK₂HPO₄各占50%（v/v），115℃高压灭菌20 min）；然后转接到发酵罐5 L全自动发酵罐扩大培养即可。

二、富硒蓝莓醋的制作

1、原料处理：富硒蓝莓（含硒29 ng/g）经自来水洗净后，放入榨汁机中榨碎，所得浆液收集，加入0.2％的果胶酶制剂，混匀，在48℃条件下酶解3 h，用蔗糖调整糖度至11.5%，煮沸灭菌15 min，室温下密封保存备用。

2、酒精发酵：将酿酒干酵母以10%的浓度加入5%的蔗糖溶液中，搅拌均匀，放入恒温培养箱中活化，温度控制在28℃，时间为2 h；将活化的富硒酵母（含硒2 mg/g）接种到果浆中，接种量为10％，发酵温度28－30℃，时间120-144 h，酒精度大约达到7.5%左右，可进入醋酸发酵阶段。

3、醋酸发酵：用富硒酵母膏（含硒2 mg/g），碳酸钙，琼脂，葡萄糖制成的培养基对醋酸菌进行接种，在28-30℃下培养48h，再移入三角瓶中振荡扩培；将经过酒精发酵后果浆接入醋酸菌培养液，在发酵罐中进行醋酸发酵，醋酸菌接种量为7%-11%，温度是26-34℃，酒精度控制在6.5~8.5%之间，发酵时间132~156 h。

4、加盐后熟：经醋酸发酵后，加入适量（2~3%）食盐。

5、过滤：200目筛网过滤杂质，即得富硒蓝莓醋（含硒18.22 ng/g）。

三、乳香富硒蓝莓醋的调配                               

如图3所示按重量将10%的增香乳液和90%的富硒蓝莓醋→配兑调整→在醋液中加入0.1％的苯甲酸钠→包装灭菌→即得成品醋。

实施例2 乳香富硒蓝莓醋的调配

一、毕赤酵母展示稻米脂肪酶：同实施例1。

二、富硒蓝莓醋的制作：同实施例1。

三、 乳香富硒蓝莓醋的调配

如图3所示按重量将20%的增香乳液和80%的富硒蓝莓醋→配兑调整→在醋液中加入0.1％的苯甲酸钠→包装灭菌→即得成品醋。

实施例3 乳香富硒蓝莓醋的调配

一、毕赤酵母展示稻米脂肪酶：同实施例1。

二、富硒蓝莓醋的制作：同实施例1。

三、乳香富硒蓝莓醋的调配

如图3所示按重量将30%的增香乳液和70%的富硒蓝莓醋→配兑调整→在醋液中加入0.1％的苯甲酸钠→包装灭菌→即得成品醋。

序列表

<110>长沙理工大学

<120>酵母展示脂肪酶生产乳香富硒蓝莓醋的方法

<130>

<160>13

<170>Patent In Version 3.3

<210>1

<211>1238

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gaattcgcttactctaacgtaacttacacttacgagactaccatcaccgatgttgtcaccgagctcaccacttactgcccagagccaaccaccttcgttcacaagaacaagaccatcactgtgaccgccccaaccactttgaccatcactgactgtccttgcaccatctccaagaccaccaagatcaccactgatgttccaccaaccacccactccaccccacacaccaccaccactcacgtgccatctacctctaccccagctccaacccactctgtttctaccatctctcacggtggtgctgctaaggctggtgttgctggtttggccggtgttgctgctgccgctgcttacttcttgatggccacaccgcaactgctgctacgccgcgccttctcctcctccttcctctcctccccattccgccgcccgccactccaccccgcccgctccttcgttcccccccgcgccgccatggcatcctccgccgcgccgttccacatggtccagatccagcgcgacgacacgacttttgatgcctatgttgttggaaaagagaatgctcctggaattgttgttttgcaagagtggtggggggttgactatgagatcaagaatcatgctgtccacatttcccaaattggtgaaggatacagagctctcattccagatttgtatcgtggtaaggttgctcttgatgtagcggaagctcagcatctgatggaaggtctagactggccgggtgcggtcaaggatattcaggcttcagttaaatggctcaaggcaaatggatcacccaaggttggtgttactggatattgcatgggaggcgctttgtcaattgcaagtggagtttcagtcccagaggttgatgctgttgtggctttctatgggacaccaccttctgagcttgccgatgcttccaaggcccaggctcccatccaggctcattttggggagcttgacagttttgttggatttgcagatgtcacggcagccaagtcgctggaggagaagctcaagtcatctggcgtgccacatgaagtccacatctaccctggctgctcgcatgcttttatgaacacatcacctgaggccgtcaagaggaggaaggagatgggtctgactgatgagaaccaggcagcaattgacctggcctggtctcgcttctcgacttggatgggtcgtttccttggatcggcgctcgagcaccaccaccaccaccactgagcggccgc

 

Claims (2)

1.一种酵母展示脂肪酶生产乳香富硒蓝莓醋的方法，其特征在于：以重量计将增香乳与富硒蓝莓醋以1:9~3:7的比例混合制成；其中，增香乳由展示了稻米脂肪酶的毕赤酵母菌按湿重计1~4 份加入100-300 份按重量计含脂肪20~40%的乳脂液中于35~55℃下对脂肪进行酯解反应2~6 h后过滤制成，富硒蓝莓醋由富硒蓝莓和富硒酵母经半固态发酵法制得；而展示了稻米脂肪酶的毕赤酵母菌是这样制作的：将稻米脂肪酶的组合序列SEQ NO1人工合成，然后将合成得到的基因克隆在pUC57载体上，进一步亚克隆到pPIC9K载体中，再转化到毕赤酵母（Pichia Pastoris）GS115，得到展示了稻米脂肪酶的毕赤酵母，然后在葡萄糖培养基中扩增培养48~96 h，使稻米脂肪酶产量随酵母菌的增殖大幅增加。

2.一种如权利要求1所述的酵母展示脂肪酶生产乳香富硒蓝莓醋的方法，其特征在于：加入乳脂液增香的表面展示有稻米脂肪酶的毕赤酵母菌在酯解反应后，其酵母展示脂肪酶经过滤和冲洗后可重复使用。

3. 根据权利要求1所述的酵母展示脂肪酶生产乳香富硒蓝莓醋的方法，其特征在于，将其制成口服液。