CN102212593B - 酵母展示脂肪酶催化合成麦芽糖硬脂酸酯的方法 - Google Patents
酵母展示脂肪酶催化合成麦芽糖硬脂酸酯的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102212593B CN102212593B CN2011101103393A CN201110110339A CN102212593B CN 102212593 B CN102212593 B CN 102212593B CN 2011101103393 A CN2011101103393 A CN 2011101103393A CN 201110110339 A CN201110110339 A CN 201110110339A CN 102212593 B CN102212593 B CN 102212593B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- maltose
- lipase
- yeast display
- stearate
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 title claims abstract description 29
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 title claims abstract description 29
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 title claims abstract description 29
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 28
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 title claims abstract description 28
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 27
- 238000002818 protein evolution Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 238000007036 catalytic synthesis reaction Methods 0.000 title abstract 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 26
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 9
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 5
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 claims description 11
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 10
- 101710204899 Alpha-agglutinin Proteins 0.000 claims description 9
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 claims description 5
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 5
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 claims description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 5
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 244000285963 Kluyveromyces fragilis Species 0.000 claims description 4
- 235000014663 Kluyveromyces fragilis Nutrition 0.000 claims description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 240000005384 Rhizopus oryzae Species 0.000 claims description 4
- 235000013752 Rhizopus oryzae Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims description 4
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims description 4
- 230000005611 electricity Effects 0.000 claims description 4
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 4
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 4
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 3
- MEIRRNXMZYDVDW-MQQKCMAXSA-N (2E,4E)-2,4-hexadien-1-ol Chemical compound C\C=C\C=C\CO MEIRRNXMZYDVDW-MQQKCMAXSA-N 0.000 claims description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 2
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 claims description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims description 2
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 claims description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 abstract description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract 2
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 abstract 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 abstract 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 abstract 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 7
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- -1 Sucrose fatty acid ester Chemical class 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- KJFMBFZCATUALV-UHFFFAOYSA-N phenolphthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2C(=O)O1 KJFMBFZCATUALV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001007 puffing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种酵母展示脂肪酶催化合成麦芽糖硬脂酸酯的方法，包括：将麦芽糖和硬脂酸溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，于50～60℃反应10～14小时，分离、纯化制得麦芽糖硬脂酸酯；将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；本发明通过将脂肪酶展示在细胞外，利用该酶制剂催化合成麦芽糖硬脂酸酯，不仅提高了转化效率，而且缩短了反应时间，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种酵母展示脂肪酶催化合成麦芽糖硬脂酸酯的方法。
背景技术
脂肪酸糖酯是一类用可再生资源合成的、无毒、易生物降解的非离子型表面活性剂，具有良好的乳化性、稠化性和膨化性，应用于食品、化妆品、制药和洗涤产品，是近20年来发展较快的一类乳化剂，以蔗糖酯为主，麦芽糖硬脂酸酯是一种新型的糖酯类乳化剂。虽然目前对麦芽糖酯的研究报道不多，但其在食品、化妆品等领域具有广阔的应用潜力。
目前市售的糖酯产品基本上是化学合成的，产物为复杂的混合物，要得到高纯度的产品需进行繁杂的分离工作。而且，酯化反应作用位点难以控制，欲得到指定结构的单一产物十分困难，往往需要冗长的保护和去保护的步骤。脂肪酶是目前糖酯合成中使用最广泛的酶，但是生产成本高、固定化过程繁杂费时大大局限了其商业化应用。
发明内容
本发明提供了一种酵母展示脂肪酶催化合成麦芽糖硬脂酸酯的方法，可显著降低麦芽糖硬脂酸酯生产成本，同时达到较高的酯化反应效率和产率。
一种酵母展示脂肪酶催化合成麦芽糖硬脂酸酯的方法，包括：
将麦芽糖和硬脂酸溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，于50～60℃反应10～14小时，分离、纯化制得麦芽糖硬脂酸酯。
优选的，所述的有机溶剂为叔丁醇。
优选的，每升有机溶剂中麦芽糖、硬脂酸和酵母展示脂肪酶的加入量分另为20～100g、50～100g、1～2g。
所述反应置于水浴摇床中进行，水浴摇床转速为150～200转/分钟。
优选的，在分离纯化前加入分子筛，继续搅拌反应10～12h，锁住水分，促进酯化反应进一步进行。
所述的分离、纯化为：离心取上清液，旋转蒸发除去有机溶剂，水洗后溶于正己烷，重结晶。
所述的酵母展示脂肪酶通过如下方法制备：
将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；
所述的重组质粒由原始载体pPIC9K和依次插入原始载体pPIC9K中MFα1信号肽下游的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。
所述的脂肪酶基因可选用Genbank号为AF229435的序列，毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115为商业化产品，可从Invitrogen公司购得。它的细胞壁α凝集素基因序列的Genbank号为M28164。
载体pPIC9K为商业化产品(如Invitrogen公司)，它存在MFα1信号肽序列(Genbank号：M17301)，同时该载体内信号肽序列上游存在AOX1启动子(Genbank号：Z46233)。重组质粒线性化处理的目的是为了与胞内基因组发生同源重组，提高表达稳定性。
优选的，所述生物印迹所用配体为油酸，它可以诱导酶结构改变，提高转化率。
本发明通过将脂肪酶基因和细胞壁α凝集素基因导入毕赤酵母细胞GS115，毕赤酵母细胞诱导培养后，脂肪酶表达并分泌到胞外，同时利用细胞壁α凝集素将该脂肪酶固定在细胞表面。利用该酵母展示脂肪酶对酯化反应进行催化，可有效提高操作稳定性、耐热性以及重复性，由于酶反应的特异性该酶能大幅度抑制副反应的发生，酯化转化率在85％以上。
具体实施方式
实施例1制备酵母展示脂肪酶
通过人工合成的方法，合成米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶基因(Genbank号：AF229435)和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因(Genbank号为M28164)，同时在脂肪酶基因C端加上连接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS(linker)，连接后得到核苷酸序列pro-ROL-linker-α-agglutinin，同时在序列两端添加EcoR I和Not I酶切位点，其中pro-ROL为脂肪酶基因，α-agglutinin为细胞壁α凝集素基因。
以上述人工合成序列为模板，利用下述引物对，进行PCR扩增，
上游引物：5’-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3’；
下游引物：5’-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3’
PCR反应体系为：模板DNA为1μl，高保真DNA聚合酶0.5μl，dNTP(50mM)0.4μl，上下游引物各0.5μl，10×PCR缓冲液5μl，加水至50μl。
PCR运行条件为：94℃3分钟，35个循环(94℃30秒，60℃1分钟，72℃30秒)，72℃10分钟。
用EocR I和Not I同时酶切PCR产物和pPIC9K质粒，并在T4连接酶的作用下过夜连接形成pPIC9K-ROL质粒，通过电泳检验并回收质粒。为使目的基因与毕赤酵母GS115发生His 4单位点置换重组，用Sal I对pPIC9K-ROL质粒进行酶切线性化处理。将酶切线性化处理好的目的基因约15μl加入到事先准备好的毕赤酵母GS115感受态细胞中，转入电转杯中，冰浴15min，然后在1500V，400Ω，25uF条件下电击10ms，并加入约1ml预冷的山梨醇。将上述混匀的电转产物约400μl涂于MD平板上，筛选阳性转化子，然后将阳性转化子涂于不同浓度的G418平板上，根据阳性转化子对G418的抗性筛选出Mut表型的多拷贝阳性重组菌株。
将多拷贝阳性重组菌株接种在BMGY培养基中发酵培养30h，离心收集细胞；再将细胞置于含有0.5％(体积百分比)甲醇的BMMY培养基中诱导培养144h，离心收集细胞，用水冲洗后，接种至YGC培养基中30℃培养120h，然后3000g离心分钟收集菌体，蒸馏水洗涤后再用50mM pH7.0磷酸缓冲液洗涤，然后与2倍体积油酸混合，-80℃下预冻后再经德国Christ真空冷冻干燥机干燥24h，用己烷洗涤除去油酸，再进行再真空干燥去除己烷，即得到经生物印迹处理的酵母展示脂肪酶。
实施例2酵母展示脂肪酶催化合成麦芽糖硬脂酸酯
实例1 取麦芽糖0.2g、硬脂酸0.5g，加入含有10mL叔丁醇的具塞三角瓶，混合、预热10min，然后加入酵母展示脂肪酶0.01g，置于水浴摇床开始反应，转速为200转/分钟，反应温度保持在50℃，反应12h后加入0.5g分子筛(孔径小于2nm)，继续反应12h后，离心沉淀除去酵母展示脂肪酶及分子筛，取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂，水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得麦芽糖硬脂酸酯产品，烘干、粉碎即可。
实例2 取麦芽糖1g、硬脂酸1g，加入含有10mL叔丁醇的具塞三角瓶，混合、预热10min，然后加入酵母展示脂肪酶0.02g，置于水浴摇床开始反应，转速为180转/分钟，反应温度保持在55℃，反应12h后加入0.5g分子筛(孔径小于2nm)，继续反应12h后，离心沉淀除去酵母展示脂肪酶及分子筛，取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂，水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得麦芽糖硬脂酸酯产品，烘干、粉碎即可。
实施例3采用传统化学法合成麦芽糖硬脂酸酯
取麦芽糖0.2g、硬脂酸0.5g，加入含有10mL叔丁醇的具塞三角瓶，混合、预热10min，置于水浴摇床开始反应，转速为200转/分钟，反应温度保持在50℃，反应12h后加入0.5g分子筛(孔径小于2nm)，继续反应12h后，离心沉淀除去分子筛，取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂，水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得麦芽糖硬脂酸酯产品，烘干、粉碎即可。
实施例4测定反应转化率
反应完成后，离心沉淀除去酶制剂及分子筛，取一定量上清液，以两滴1％(v/v)酚酞为指示剂，用0.07mol/L的氢氧化钠溶液滴定反应体系剩余的脂肪酸，通过测定体系在反应前、后酸值的降低值确定酯化反应转化率。
酯化转化率计算公式如下：
转化率(％)＝(1-V2/V1)×100％
式中：V1-反应前的酸值，mgNaOH/g；V2-反应后的酸值，mgNaOH/g。
通过上述方法检测计算，实施例2中，实例1合成麦芽糖硬脂酸酯的转化率达81.7％，实例2合成麦芽糖硬脂酸酯的转化率达83.5％。而实施例3采用传统化学法合成麦芽糖硬脂酸酯的转化率仅为50％左右。
Claims (1)
1.一种酵母展示脂肪酶催化合成麦芽糖硬脂酸酯的方法，包括：
人工合成米根霉（Rhizopus oryzae）的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因，同时在脂肪酶基因C端加上编码连接肽GSSGGSGGSGGSGGSGS的基因片段，连接后得到核苷酸序列pro-ROL-linker-α-agglutinin，其中pro-ROL为脂肪酶基因，Genbank号为AF229435，α-agglutinin为细胞壁α凝集素基因，Genbank号为M28164，linker为编码连接肽的基因片段；
以人工合成序列为模板，利用以下引物对，进行PCR扩增；
上游引物：5’-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3’；
下游引物：5’-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3’
用EocR I和Not I同时酶切PCR产物和pPIC9K质粒，并在T4连接酶的作用下过夜连接形成pPIC9K-ROL质粒，通过电泳检验并回收质粒，用Sal I对pPIC9K-ROL质粒进行酶切线性化处理；将酶切线性化处理好的目的基因约15μl加入毕赤酵母GS115感受态细胞中，转入电转杯中，冰浴15min，然后在1500V，400Ω，25uF条件下电击10ms，并加入1ml预冷的山梨醇；
将上述混匀的电转产物约400μl涂于MD平板上，筛选阳性转化子，然后将阳性转化子涂于不同浓度的G418平板上，根据阳性转化子对G418的抗性筛选出Mut表型的多拷贝阳性重组菌株；
将多拷贝阳性重组菌株接种在BMGY培养基中发酵培养30h，离心收集细胞；再将细胞置于含有体积百分比0.5%甲醇的BMMY培养基中诱导培养144h，离心收集细胞，用水冲洗后，接种至YGC培养基中30℃培养120h，然后3000g离心分钟收集菌体，蒸馏水洗涤后再用50mM pH7.0磷酸缓冲液洗涤，然后与2倍体积油酸混合，-80℃下预冻后再经真空冷冻干燥机干燥24h，用己烷洗涤除去油酸，再进行再真空干燥去除己烷，即得到经生物印迹处理的酵母展示脂肪酶；
取麦芽糖0.2g、硬脂酸0.5g，加入含有10mL叔丁醇的具塞三角瓶，混合、预热10min，然后加入酵母展示脂肪酶0.01g，置于水浴摇床开始反应，转速为200转/分钟，反应温度保持在50℃，反应12h后加入0.5g分子筛，分子筛孔径小于2nm，继续反应12h后，离心沉淀除去酵母展示脂肪酶及分子筛，取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂，水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得麦芽糖硬脂酸酯产品，烘干、粉碎。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011101103393A CN102212593B (zh) | 2011-04-28 | 2011-04-28 | 酵母展示脂肪酶催化合成麦芽糖硬脂酸酯的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011101103393A CN102212593B (zh) | 2011-04-28 | 2011-04-28 | 酵母展示脂肪酶催化合成麦芽糖硬脂酸酯的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102212593A CN102212593A (zh) | 2011-10-12 |
| CN102212593B true CN102212593B (zh) | 2013-07-31 |
Family
ID=44744125
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2011101103393A Expired - Fee Related CN102212593B (zh) | 2011-04-28 | 2011-04-28 | 酵母展示脂肪酶催化合成麦芽糖硬脂酸酯的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102212593B (zh) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101285078A (zh) * | 2008-06-10 | 2008-10-15 | 华南理工大学 | 一种酵母展示脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法 |
-
2011
- 2011-04-28 CN CN2011101103393A patent/CN102212593B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102212593A (zh) | 2011-10-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102212601B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成维生素a棕榈酸酯的方法 | |
| CN102212593B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成麦芽糖硬脂酸酯的方法 | |
| CN102212586B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成十二烯基琥珀酸淀粉酯的方法 | |
| CN102212583B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成辛烯基琥珀酸淀粉酯的方法 | |
| CN102212580B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成葡萄糖月桂酸酯的方法 | |
| CN102212591B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成蔗糖硬脂酸酯的方法 | |
| CN102212584B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成淀粉醋酸酯的方法 | |
| CN102212592B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成麦芽糖月桂酸酯的方法 | |
| CN102212590B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成蔗糖棕榈酸酯的方法 | |
| CN102212578B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成果糖棕榈酸酯的方法 | |
| CN102296101B (zh) | 一种微胶囊包埋的紫菜降血压肽的制备方法 | |
| CN102212572B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成l-抗坏血酸油酸酯的方法 | |
| CN102212579B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成葡萄糖豆蔻酸酯的方法 | |
| CN102321598B (zh) | 一种酵母展示型果胶酶协同超声波破碎紫菜细胞的方法 | |
| CN102212585B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成淀粉磷酸酯的方法 | |
| CN102212575B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成l-抗坏血酸棕榈酸酯的方法 | |
| CN102226209B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成维生素e油酸酯的方法 | |
| CN102286110B (zh) | 酵母展示型聚半乳糖醛酸酶协同超声波处理提取紫菜多糖的方法 | |
| CN102212576B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成维生素e亚油酸酯的方法 | |
| CN102212577B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成维生素e琥珀酸酯的方法 | |
| CN102212588B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成淀粉磷酸单酯的方法 | |
| CN102321596B (zh) | 一种酵母展示型脂肪酶协同超声波破碎紫菜细胞的方法 | |
| CN102212602B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成维生素a乳酸酯的方法 | |
| CN102212574B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成l-抗坏血酸亚油酸酯的方法 | |
| CN102212573B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成l-抗坏血酸dha酯的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130731 Termination date: 20160428 |