CN102226209B - 酵母展示脂肪酶催化合成维生素e油酸酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酵母展示脂肪酶催化合成维生素E油酸酯的方法，包括：将维生素E和油酸溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，无氧条件下于50～60℃反应10～14小时，分离、纯化制得维生素E油酸酯；将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；本发明通过将脂肪酶展示在细胞外，利用该酶制剂催化合成维生素E油酸酯，不仅提高了转化效率，而且缩短了反应时间，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种酵母展示脂肪酶催化合成维生素E油酸酯的方法。
背景技术
天然维生素E(生育酚)，是人体内具有多种生理功能的重要脂溶性维生素和天然抗氧化剂，它具有显著的抗氧化、消除体内自由基、消除性障碍、促进血液循环、防止早衰、预防癌症发生、提高机体免疫力等功能，是一种极其重要的医药和保健原料。然而天然维生素E很容易被氧化，市场上的维生素E产品大多是经过酯化的稳定衍生物。油酸是目前公认的必需脂肪酸，具有特殊的营养价值。维生素E油酸酯(vitamin E oleate)是维生素E的一种衍生物，它除了具有维生素E显著的抗氧化、消除体内自由基、消除性障碍、促进血液循环、防止早衰、预防癌症、提高机体免疫力等功能；还具油酸的营养保健作用，是一种重要的医药和保健原料，被广泛应用于医药、食品、化妆品等领域。目前合成维生素E油酸酯有化学法和生物酶法，由于化学法存在转化条件苛刻(强酸、碱催化、高温高压)、无特异性、产物复杂、副产物多、分离难、安全性差等弊端，生物酶法越来越受青睐。脂肪酶是目前维生素酯合成中使用最广泛的酶，但是生产成本高、固定化过程繁杂费时大大局限了其商业化应用。
发明内容
本发明提供了一种酵母展示脂肪酶催化合成维生素E油酸酯的方法，可显著降低维生素E油酸酯生产成本，同时达到较高的酯化反应效率和产率。
一种酵母展示脂肪酶催化合成维生素E油酸酯的方法，包括：
将维生素E和油酸溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，无氧条件下于50～60℃反应10～14小时，分离、纯化制得维生素E油酸酯。
优选的，所述的有机溶剂为正己烷。
优选的，每升有机溶剂中维生素E、油酸和酵母展示脂肪酶的加入量分别为20～100g、100～300g、50～100g。
搅拌速率为200～250转/分钟。
所述的分离、纯化为：将反应液离心，取上清液，旋转蒸发除去有机溶剂，水洗后溶于正己烷，重结晶。
所述的酵母展示脂肪酶通过如下方法制备：
将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；
所述的重组质粒由原始载体pPIC9K和依次插入原始载体pPIC9K中MFα1信号肽下游的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。
所述的脂肪酶基因可选用Genbank号为AF229435的序列，毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115为商业化产品，可从Invitrogen公司购得。它的细胞壁α凝集素基因序列的Genbank号为M28164。
载体pPIC9K为商业化产品(如Invitrogen公司)，它存在MFα1信号肽序列(Genbank号：M17301)，同时该载体内信号肽序列上游存在AOX1启动子(Genbank号：Z46233)。重组质粒线性化处理的目的是为了与胞内基因组发生同源重组，提高表达稳定性。
优选的，所述生物印迹所用配体为油酸，它可以诱导酶结构改变，提高转化率。
本发明通过将脂肪酶基因和细胞壁α凝集素基因导入毕赤酵母细胞GS115，毕赤酵母细胞诱导培养后，脂肪酶表达并分泌到胞外，同时利用细胞壁α凝集素将该脂肪酶固定在细胞表面。利用该酵母展示脂肪酶对酯化反应进行催化，可有效提高操作稳定性、耐热性以及重复性，由于酶反应的特异性该酶能大幅度抑制副反应的发生，终转化率(以维生素E计)在85％以上。
具体实施方式
实施例1制备酵母展示脂肪酶
通过人工合成的方法，合成米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶基因(Genbank号：AF229435)和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因(Genbank号为M28164)，同时在脂肪酶基因C端加上连接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS(linker)，连接后得到核苷酸序列pro-ROL-linker-α-agglutinin，同时在序列两端添加EcoR I和Not I酶切位点，其中pro-ROL为脂肪酶基因，α-agglutinin为细胞壁α凝集素基因。
以上述人工合成序列为模板，利用下述引物对，进行PCR扩增，
上游引物：5’-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3’；
下游引物：5’-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3’
PCR反应体系为：模板DNA为1μl，高保真DNA聚合酶0.5μl，dNTP(50mM)0.4μl，上下游引物各0.5μl，10×PCR缓冲液5μl，加水至50μl。
PCR运行条件为：94℃ 3分钟，35个循环(94℃ 30秒，60℃ 1分钟，72℃ 30秒)，72℃ 10分钟。
用EocR I和Not I同时酶切PCR产物和pPIC9K质粒，并在T4连接酶的作用下过夜连接形成pPIC9K-ROL质粒，通过电泳检验并回收质粒。为使目的基因与毕赤酵母GS115发生His 4单位点置换重组，用Sal I对pPIC9K-ROL质粒进行酶切线性化处理。将酶切线性化处理好的目的基因约15μl加入到事先准备好的毕赤酵母GS115感受态细胞中，转入电转杯中，冰浴15min，然后在1500V，400Ω，25uF条件下电击10ms，并加入约1ml预冷的山梨醇。将上述混匀的电转产物约400μl涂于MD平板上，筛选阳性转化子，然后将阳性转化子涂于不同浓度的G418平板上，根据阳性转化子对G418的抗性筛选出Mut表型的多拷贝阳性重组菌株。
将多拷贝阳性重组菌株接种在BMGY培养基中发酵培养30h，离心收集细胞；再将细胞置于含有0.5％(体积百分比)甲醇的BMMY培养基中诱导培养144h，离心收集细胞，用水冲洗后，接种至YGC培养基中30℃培养120h，然后3000g离心分钟收集菌体，蒸馏水洗涤后再用50mM pH7.0磷酸缓冲液洗涤，然后与2倍体积油酸混合，-80℃下预冻后再经德国Christ真空冷冻干燥机干燥24h，用己烷洗涤除去油酸，再进行再真空干燥去除己烷，即得到经生物印迹处理的酵母展示脂肪酶。
实施例2酵母展示脂肪酶催化合成维生素E油酸酯
实例1取维生素E 0.472g、油酸1.412g，加入含有10mL正己烷的磨口三角瓶，混合、预热10min，然后加入酵母展示脂肪酶0.5g，充N2密封，置于85-1型磁力搅拌器中搅拌开始反应，转速为250转/分钟，反应温度保持在45℃，反应12h后停止搅拌，离心沉淀除去酵母展示脂肪酶，取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂，水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得维生素E油酸酯产品，烘干、粉碎即可。
实例2取维生素E 0.944g、油酸2.824g，加入含有10mL正己烷的磨口三角瓶，混合、预热10min，然后加入酵母展示脂肪酶1g，充N2密封，置于85-1型磁力搅拌器中搅拌开始反应，转速为200转/分钟，反应温度保持在50℃，反应12h后停止搅拌，离心沉淀除去酵母展示脂肪酶，取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂，水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得维生素E油酸酯产品，烘干、粉碎即可。
实施例3采用传统化学法合成维生素E油酸酯
实例1取维生素E 0.472g、油酸1.412g，加入含有10mL正己烷的磨口三角瓶，混合、预热10min，充N2密封，置于85-1型磁力搅拌器中搅拌开始反应，转速为250转/分钟，反应温度保持在45℃，反应12h后停止搅拌，取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂，水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得维生素E油酸酯产品，烘干、粉碎即可。
实施例4测定转化产率和转化率
取1mL未分离的反应产物，离心去除催化剂，旋转蒸发溶剂，用100％甲醇准确定容至10mL，该溶液经0.22μm有机滤膜过滤后用高效液相色谱(HPLC)测定溶液各组分浓度。HPLC条件如下：Agilent Technologies 1200系列高效液相色谱液，色谱柱：Grace Prevail Organic Acid 5u150mm×4.6mm，柱温：40℃，流动相：甲醇/水/磷酸(85/15/0.1)，流速：1mL/min，进样量：10μL，检测波长：280nm。
转化率计算公式如下：
转化率＝C vitamin E-C ester/C vitamin E×100％。
式中：C ester为HPLC测定样品中维生素E油酸酯的浓度，C vitaminE为反应前样品中维生素E的浓度。
通过上述方法检测计算，实施例2中，实例1合成维生素E油酸酯的转化率达85％，实例2合成维生素E油酸酯的转化率达84％。而实施例3采用传统化学法合成维生素E油酸酯的转化率仅为66％。
Claims (1)
1.一种酵母展示脂肪酶催化合成维生素E油酸酯的方法，包括：
人工合成米根霉（Rhizopus oryzae）的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因，接着在脂肪酶基因C端加上编码连接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS的基因片段，连接得到核苷酸序列pro-ROL-linker-α-agglutinin，pro-ROL代表脂肪酶基因，Genbank号为：AF229435，α-agglutinin代表细胞壁α凝集素基因，Genbank号为：M28164，linker代表编码连接肽的基因片段；
以人工合成序列为模板，利用以下引物对，进行PCR扩增；
上游引物：5’-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3’；
下游引物：5’-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3’；
PCR反应体系为：模板DNA为1μl，高保真DNA聚合酶0.5μl，50mM的dNTP0.4μl，上下游引物各0.5μl，10×PCR缓冲液5μl，加水至50μl；
PCR运行条件为：94℃3分钟；35个循环，每个循环为：94℃30秒，60℃1分钟，72℃30秒；72℃10分钟；
用EocR I和Not I同时酶切PCR产物和pPIC9K质粒，并在T4连接酶的作用下过夜连接形成pPIC9K-ROL质粒，用Sal I对pPIC9K-ROL质粒进行酶切线性化处理，将酶切线性化处理好的目的基因15μl加入到毕赤酵母GS115感受态细胞中，转入电转杯中，冰浴15min，然后在1500V，400Ω，25uF条件下电击10ms，并加入1mL预冷的山梨醇；
将混匀的电转产物400μl涂于MD平板上，筛选阳性转化子，然后将阳性转化子涂于不同浓度的G418平板上，根据阳性转化子对G418的抗性筛选出Mut表型的多拷贝阳性重组菌株；
将多拷贝阳性重组菌株接种在BMGY培养基中发酵培养30h，离心收集细胞；再将细胞置于含有体积百分比0.5%甲醇的BMMY培养基中诱导培养144h，离心收集细胞，用水冲洗后，接种至YGC培养基中30℃培养120h，然后3000g离心分钟收集菌体，蒸馏水洗涤后再用50mM pH7.0磷酸缓冲液洗涤，然后与2倍体积油酸混合，-80℃下预冻后再经冷冻干燥机干燥24h，用己烷洗涤除去油酸，再进行再真空干燥去除己烷，即得到经生物印迹处理的酵母展示脂肪酶；
取维生素E0.472g、油酸1.412g，加入含有10mL正己烷的磨口三角瓶，混合、预热10min，然后加入酵母展示脂肪酶0.5g，充N2密封，置于85-1型磁力搅拌器中搅拌开始反应，转速为250转/分钟，反应温度保持在45℃，反应12h后停止搅拌，离心沉淀除去酵母展示脂肪酶，取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂，水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得维生素E油酸酯产品，烘干、粉碎。
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