CN102212591B - 酵母展示脂肪酶催化合成蔗糖硬脂酸酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酵母展示脂肪酶催化合成蔗糖硬脂酸酯的方法，包括：将蔗糖和硬脂酸溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，于50～60℃反应10～14小时，分离、纯化制得蔗糖硬脂酸酯；将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS 115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；本发明通过将脂肪酶展示在细胞外，利用该酶制剂催化合成蔗糖硬脂酸酯，不仅提高了转化效率，而且缩短了反应时间，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种酵母展示脂肪酶催化合成蔗糖硬脂酸酯的方法。
背景技术
蔗糖酯(SE)是一类新型的非离子表面活性剂。具有良好的乳化、分散、润滑、去污、起泡、调节粘度、防止老化、防止析晶等作用，且对人体无害，易生物降解为人体易吸收的物质，因而广泛用于食品、制药、化妆品、洗涤等工业。
长期以来，蔗糖酯的化学制备多利用蔗糖直接酯化的方法，由于蔗糖有8个反应活性相近的羟基，所以酯化反应作用位点难以控制，欲得到指定结构的单一产物十分困难，往往需要冗长的保护和去保护的步骤。目前所有有关蔗糖硬脂酸酯制备的工艺研究仍然局限于纯化学法，着重于对酯化反应各有关因素(如温度、反应时间、原料初始摩尔比等)进行优化，故副反应问题始终无法解决。脂肪酶是目前蔗糖酯合成中使用最广泛的酶，但是生产成本高、固定化过程繁杂费时大大局限了其商业化应用。
发明内容
本发明提供了一种酵母展示脂肪酶催化合成蔗糖硬脂酸酯的方法，可显著降低蔗糖硬脂酸酯生产成本，同时达到较高的酯化反应效率和产率。
一种酵母展示脂肪酶催化合成蔗糖硬脂酸酯的方法，包括：
将蔗糖和硬脂酸溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，于50～60℃反应10～14小时，分离、纯化制得蔗糖硬脂酸酯。
优选的，所述的有机溶剂为叔丁醇。
优选的，每升有机溶剂中蔗糖、硬脂酸和酵母展示脂肪酶的加入量分别为20～100g、50～100g、1～2g。
所述反应置于水浴摇床中进行，水浴摇床转速为150～200转/分钟。
优选的，在分离纯化前加入分子筛，继续搅拌反应10～12h，锁住水分，促进酯化反应进一步进行。
所述的分离、纯化为：离心取上清液，旋转蒸发除去有机溶剂，水洗后溶于正己烷，重结晶。
所述的酵母展示脂肪酶通过如下方法制备：
将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；
所述的重组质粒由原始载体pPIC9K和依次插入原始载体pPIC9K中MFα1信号肽下游的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。
所述的脂肪酶基因可选用Genbank号为AF229435的序列，毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115为商业化产品，可从Invitrogen公司购得。它的细胞壁α凝集素基因序列的Genbank号为M28164。
载体pPIC9K为商业化产品(如Invitrogen公司)，它存在MFα1信号肽序列(Genbank号：M17301)，同时该载体内信号肽序列上游存在AOX1启动子(Genbank号：Z46233)。重组质粒线性化处理的目的是为了与胞内基因组发生同源重组，提高表达稳定性。
优选的，所述生物印迹所用配体为油酸，它可以诱导酶结构改变，提高转化率。
本发明通过将脂肪酶基因和细胞壁α凝集素基因导入毕赤酵母细胞GS115，毕赤酵母细胞诱导培养后，脂肪酶表达并分泌到胞外，同时利用细胞壁α凝集素将该脂肪酶固定在细胞表面。利用该酵母展示脂肪酶对酯化反应进行催化，可有效提高操作稳定性、耐热性以及重复性，由于酶反应的特异性该酶能大幅度抑制副反应的发生，酯化转化率在80％以上。
具体实施方式
实施例1制备酵母展示脂肪酶
通过人工合成的方法，合成米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶基因(Genbank号：AF229435)和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因(Genbank号为M28164)，同时在脂肪酶基因C端加上连接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS(linker)，连接后得到核苷酸序列pro-ROL-linker-α-agglutinin，同时在序列两端添加EcoR I和Not I酶切位点，其中pro-ROL为脂肪酶基因，α-agglutinin为细胞壁α凝集素基因。
以上述人工合成序列为模板，利用下述引物对，进行PCR扩增，
上游引物：5’-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3’；
下游引物：5’-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3’
PCR反应体系为：模板DNA为1μl，高保真DNA聚合酶0.5μl，dNTP(50mM)0.4μl，上下游引物各0.5μl，10×PCR缓冲液5μl，加水至50μl。
PCR运行条件为：94℃3分钟，35个循环(94℃30秒，60℃1分钟，72℃30秒)，72℃10分钟。
用EocR I和Not I同时酶切PCR产物和pPIC9K质粒，并在T4连接酶的作用下过夜连接形成pPIC9K-ROL质粒，通过电泳检验并回收质粒。为使目的基因与毕赤酵母GS115发生His 4单位点置换重组，用Sal I对pPIC9K-ROL质粒进行酶切线性化处理。将酶切线性化处理好的目的基因约15μl加入到事先准备好的毕赤酵母GS115感受态细胞中，转入电转杯中，冰浴15min，然后在1500V，400Ω，25uF条件下电击10ms，并加入约1ml预冷的山梨醇。将上述混匀的电转产物约400μl涂于MD平板上，筛选阳性转化子，然后将阳性转化子涂于不同浓度的G418平板上，根据阳性转化子对G418的抗性筛选出Mut表型的多拷贝阳性重组菌株。
将多拷贝阳性重组菌株接种在BMGY培养基中发酵培养30h，离心收集细胞；再将细胞置于含有0.5％(体积百分比)甲醇的BMMY培养基中诱导培养144h，离心收集细胞，用水冲洗后，接种至YGC培养基中30℃培养120h，然后3000g离心分钟收集菌体，蒸馏水洗涤后再用50mM pH7.0磷酸缓冲液洗涤，然后与2倍体积油酸混合，-80℃下预冻后再经德国Christ真空冷冻干燥机干燥24h，用己烷洗涤除去油酸，再进行再真空干燥去除己烷，即得到经生物印迹处理的酵母展示脂肪酶。
实施例2酵母展示脂肪酶催化合成蔗糖硬脂酸酯
实例1取蔗糖0.2g、硬脂酸0.5g，加入含有10mL叔丁醇的具塞三角瓶，混合、预热10min，然后加入酵母展示脂肪酶0.01g，置于水浴摇床开始反应，转速为200转/分钟，反应温度保持在50℃，反应12h后加入0.5g分子筛(孔径小于2nm)，继续反应12h后，离心沉淀除去酵母展示脂肪酶及分子筛，取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂，水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得蔗糖硬脂酸酯产品，烘干、粉碎即可。
实例2取蔗糖1g、硬脂酸1g，加入含有10mL叔丁醇的具塞三角瓶，混合、预热10min，然后加入酵母展示脂肪酶0.02g，置于水浴摇床开始反应，转速为180转/分钟，反应温度保持在55℃，反应12h后加入0.5g分子筛(孔径小于2nm)，继续反应12h后，离心沉淀除去酵母展示脂肪酶及分子筛，取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂，水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得蔗糖硬脂酸酯产品，烘干、粉碎即可。
实施例3采用传统化学法合成蔗糖硬脂酸酯
取蔗糖0.2g、硬脂酸0.5g，加入含有10mL叔丁醇的具塞三角瓶，混合、预热10min，置于水浴摇床开始反应，转速为200转/分钟，反应温度保持在50℃，反应12h后加入0.5g分子筛(孔径小于2nm)，继续反应12h后，离心沉淀除去分子筛，取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂，水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得蔗糖硬脂酸酯产品，烘干、粉碎即可。
实施例4测定转化产率和转化率
用硅胶G薄层板，于105℃活化1h，展开剂为氯仿∶甲醇∶醋酸＝4∶4∶3(v∶v)，以5％蒽酮溶液(溶剂为氯仿∶甲醇＝1∶1，v∶v)为显色剂，把喷有显色剂的硅胶板置于110℃加热10min。蔗糖酯显蓝紫色，蔗糖为兰色(原点)。用气相色谱定量分析其组成，气相色谱检测条件：色谱柱1m×3mm(T.D.)不锈钢柱；固定相7％SE-30CHROM0SRB.G.HP(100-200目)；检测器FID；柱温，初温120℃，恒温1min，以8℃/min升温至230℃，10℃/min升至280℃，恒温15min。进样口温度350℃；载气N2；载气速度70ml/min。
产率计算公式如下：
产率＝C ester×n
式中：C ester为气相色谱测定样品中蔗糖硬脂酸酯的浓度，n为样品稀释倍数。
酯化反应效率：转化率(％)＝C ester中硬脂酸当量/反应中所加入硬脂酸当量×100％
通过上述方法检测计算，实施例2中，实例1合成蔗糖硬脂酸酯的转化率达81.3％，实例2合成蔗糖硬脂酸酯的转化率达80.7％。而实施例3采用传统化学法合成蔗糖硬脂酸酯的大转化率仅为50％左右。
Claims (1)
1.一种酵母展示脂肪酶催化合成蔗糖硬脂酸酯的方法，包括：
人工合成米根霉（Rhizopus oryzae）的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因，同时在脂肪酶基因C端加上编码连接肽GSSGGSGGSGGSGGSGS的基因片段，连接后得到核苷酸序列pro-ROL-linker-α-agglutinin，其中pro-ROL为脂肪酶基因，Genbank号为AF229435，α-agglutinin为细胞壁α凝集素基因，Genbank号为M28164，linker为编码连接肽的基因片段；
以人工合成序列为模板，利用以下引物对，进行PCR扩增；
上游引物：5’-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3’；
下游引物：5’-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3’
用EocR I和Not I同时酶切PCR产物和pPIC9K质粒，并在T4连接酶的作用下过夜连接形成pPIC9K-ROL质粒，通过电泳检验并回收质粒，用Sal I对pPIC9K-ROL质粒进行酶切线性化处理；将酶切线性化处理好的目的基因约15μl加入毕赤酵母GS115感受态细胞中，转入电转杯中，冰浴15min，然后在1500V，400Ω，25uF条件下电击10ms，并加入1ml预冷的山梨醇；
将上述混匀的电转产物约400μl涂于MD平板上，筛选阳性转化子，然后将阳性转化子涂于不同浓度的G418平板上，根据阳性转化子对G418的抗性筛选出Mut表型的多拷贝阳性重组菌株；
将多拷贝阳性重组菌株接种在BMGY培养基中发酵培养30h，离心收集细胞；再将细胞置于含有体积百分比0.5%甲醇的BMMY培养基中诱导培养144h，离心收集细胞，用水冲洗后，接种至YGC培养基中30℃培养120h，然后3000g离心分钟收集菌体，蒸馏水洗涤后再用50mM pH7.0磷酸缓冲液洗涤，然后与2倍体积油酸混合，-80℃下预冻后再经真空冷冻干燥机干燥24h，用己烷洗涤除去油酸，再进行再真空干燥去除己烷，即得到经生物印迹处理的酵母展示脂肪酶；
取蔗糖0.2g、硬脂酸0.5g，加入含有10mL叔丁醇的具塞三角瓶，混合、预热10min，然后加入酵母展示脂肪酶0.01g，置于水浴摇床开始反应，转速为200转/分钟，反应温度保持在50℃，反应12h后加入0.5g分子筛，分子筛孔径小于2nm，继续反应12h后，离心沉淀除去酵母展示脂肪酶及分子筛，取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂，水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得蔗糖硬脂酸酯产品，烘干、粉碎。
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