CN102212573B - 酵母展示脂肪酶催化合成l-抗坏血酸dha酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酵母展示脂肪酶催化合成L-抗坏血酸DHA酯的方法，包括：将L-抗坏血酸和DHA溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，无氧条件下于50～60℃反应4～8小时，分离、纯化制得L-抗坏血酸DHA酯；将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；本发明通过将脂肪酶展示在细胞外，利用该酶制剂催化合成L-抗坏血酸DHA酯，不仅提高了转化效率，而且缩短了反应时间，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种酵母展示脂肪酶催化合成L-抗坏血酸DHA酯的方法。
背景技术
BHA、BHT、PG、TBHQ等合成抗氧化剂广泛用于食品工业，但是由于存在致癌，体内消化后有毒性等安全隐患，其食用越来越受质疑，天然抗氧化剂也因此备受青睐。L-抗坏血酸(维生素C)是目前使用最多的天然抗氧化剂之一，随着两步发酵法生产维生素C技术的不断成熟，我国生产维生素C产量已居世界之首，生产成本也相对较低。然而，维生素C是水溶性的天然抗氧化剂，只能在水相体系发挥作用，但食品体系往往是油相或者是多相的，这就大大局限了维生素C的使用范围。将合适的亲油性基团“嫁接”到维生素C上合成脂溶性衍生物，从而改变其亲水性及溶解性可有效解决这一问题。L-抗坏血酸DHA酯是维生素C上“嫁接”DHA的衍生物，DHA(二十二碳六烯酸)属于ε-3系列多不饱和脂肪酸，具有增强免疫、抗癌、抗炎、降血脂、降血压、抗动脉粥样硬化及健脑益智、提高视力等生理功效，但是DHA自身不稳定，容易被氧化或发生自动氧化，从而降低其营养保健价值。通过与维生素C酯化不仅可以提高DHA的稳定性，还可获得集抗氧化、营养性、保健性、乳化性等多种特性为一体，具有很大的市场潜力的新型产品。
目前实现这一“嫁接”有化学法和生物酶法，由于化学法存在转化条件苛刻(强酸、碱催化、高温高压)、无特异性、产物复杂、副产物多、分离难、安全性差等弊端，生物酶法越来越受青睐。脂肪酶是目前维生素酯合成中使用最广泛的酶，但是生产成本高、固定化过程繁杂费时大大局限了其商业化应用。
发明内容
本发明提供了一种酵母展示脂肪酶催化合成L-抗坏血酸DHA酯的方法，可显著降低L-抗坏血酸DHA酯生产成本，同时达到较高的酯化反应效率和产率。
一种酵母展示脂肪酶催化合成L-抗坏血酸DHA酯的方法，包括：
将L-抗坏血酸和DHA溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，无氧条件下于50～60℃反应4～8小时，分离、纯化制得L-抗坏血酸DHA酯。
优选的，所述的有机溶剂为正己烷和四氢呋喃的混合物，体积比优选为1∶1。
优选的，每升有机溶剂中L-抗坏血酸、DHA和酵母展示脂肪酶的加入量分别为15～35g、150～350g、50～100g。
搅拌速率为150～250转/分钟。
优选的，在分离纯化前加入分子筛，继续搅拌反应10～12h，锁住水分，促进酯化反应进一步进行。
所述的分离、纯化为：离心取上清液，旋转蒸发除去有机溶剂，水洗后溶于正己烷，重结晶。
所述的酵母展示脂肪酶通过如下方法制备：
将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；
所述的重组质粒由原始载体pPIC9K和依次插入原始载体pPIC9K中MFα1信号肽下游的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。
所述的脂肪酶基因可选用Genbank号为AF229435的序列，毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115为商业化产品，可从Invitrogen公司购得。它的细胞壁α凝集素基因序列的Genbank号为M28164。
载体pPIC9K为商业化产品(如Invitrogen公司)，它存在MFα1信号肽序列(Genbank号：M17301)，同时该载体内信号肽序列上游存在AOX1启动子(Genbank号：Z46233)。重组质粒线性化处理的目的是为了与胞内基因组发生同源重组，提高表达稳定性。
优选的，所述生物印迹所用配体为油酸，它可以诱导酶结构改变，提高转化率。
本发明通过将脂肪酶基因和细胞壁α凝集素基因导入毕赤酵母细胞GS115，毕赤酵母细胞诱导培养后，脂肪酶表达并分泌到胞外，同时利用细胞壁α凝集素将该脂肪酶固定在细胞表面。利用该酵母展现脂肪酶对酯化反应进行催化，不仅提高了操作稳定性、耐热性以及重复性，而且反应产物单一(为L-抗坏血酸DHA酯)，转化率(以L-抗坏血酸计)在60％以上，产率高达58-60％。
具体实施方式
实施例1制备酵母展示脂肪酶
通过人工合成的方法，合成米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶基因(Genbank号：AF229435)和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因(Genbank号为M28164)，同时在脂肪酶基因C端加上连接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS(linker)，连接后得到核苷酸序列pro-ROL-linker-α-agglutinin，同时在序列两端添加EcoR I和Not I酶切位点，其中pro-ROL为脂肪酶基因，α-agglutinin为细胞壁α凝集素基因。
以上述人工合成序列为模板，利用下述引物对，进行PCR扩增，
上游引物：5’-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3’；
下游引物：5’-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3’
PCR反应体系为：模板DNA为1μl，高保真DNA聚合酶0.5μl，dNTP(50mM)0.4μl，上下游引物各0.5μl，10×PCR缓冲液5μl，加水至50μl。
PCR运行条件为：94℃3分钟，35个循环(94℃30秒，60℃1分钟，72℃30秒)，72℃10分钟。
用EocR I和Not I同时酶切PCR产物和pPIC9K质粒，并在T4连接酶的作用下过夜连接形成pPIC9K-ROL质粒，通过电泳检验并回收质粒。为使目的基因与毕赤酵母GS115发生His 4单位点置换重组，用Sal I对pPIC9K-ROL质粒进行酶切线性化处理。将酶切线性化处理好的目的基因约15μl加入到事先准备好的毕赤酵母GS115感受态细胞中，转入电转杯中，冰浴15min，然后在1500V，400Ω，25uF条件下电击10ms，并加入约1ml预冷的山梨醇。将上述混匀的电转产物约400μl涂于MD平板上，筛选阳性转化子，然后将阳性转化子涂于不同浓度的G418平板上，根据阳性转化子对G418的抗性筛选出Mut表型的多拷贝阳性重组菌株。
将多拷贝阳性重组菌株接种在BMGY培养基中发酵培养30h，离心收集细胞；再将细胞置于含有0.5％(体积百分比)甲醇的BMMY培养基中诱导培养144h，离心收集细胞，用水冲洗后，接种至YGC培养基中30℃培养120h，然后3000g离心分钟收集菌体，蒸馏水洗涤后再用50mM pH7.0磷酸缓冲液洗涤，然后与2倍体积油酸混合，-80℃下预冻后再经德国Christ真空冷冻干燥机干燥24h，用己烷洗涤除去油酸，再进行再真空干燥去除己烷，即得到经生物印迹处理的酵母展示脂肪酶。
实施例2酵母展示脂肪酶催化合成L-抗坏血酸DHA酯
实例1取L-抗坏血酸0.176g、DHA 1.64g，加入含有5mL正己烷和5mL四氢呋喃的磨口三角瓶，混合、预热10min，然后加入酵母展示脂肪酶0.5g，充N2密封，置于85-1型磁力搅拌器中搅拌开始反应，转速为250转/分钟，反应温度保持在45℃，反应6h后加入0.5g分子筛(孔径小于2nm)，继续反应12h后停止搅拌，离心沉淀除去酵母展示脂肪酶及分子筛，取上清液进行旋转蒸发除去四氢呋喃，水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得L-抗坏血酸DHA酯产品，烘干、粉碎即可。
实例2取L-抗坏血酸0.352g、DHA 3.28g加入含有5mL正己烷和5mL四氢呋喃的磨口三角瓶，混合、预热10min，然后加入酵母展示脂肪酶1g，充N2密封，置于85-1型磁力搅拌器中搅拌开始反应，转速为200转/分钟，反应温度保持在50℃，反应6h后加入1.5g分子筛(孔径小于2nm)，继续反应12h后停止搅拌，离心沉淀除去酵母展示脂肪酶及分子筛，取上清液进行旋转蒸发除去四氢呋喃，水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得L-抗坏血酸DHA酯产品，烘干、粉碎即可。
实施例3采用传统化学法合成L-抗坏血酸DHA酯
取L-抗坏血酸0.176g、DHA 1.64g，加入含有5mL正己烷和5mL四氢呋喃的磨口三角瓶，混合、预热10min，充N2密封，置于85-1型磁力搅拌器中搅拌开始反应，转速为250转/分钟，反应温度保持在45℃，反应6h后加入1.5g分子筛(孔径小于2nm)，继续反应12h后停止搅拌，离心沉淀除去分子筛，取上清液进行旋转蒸发除去四氢呋喃，水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得L-抗坏血酸DHA酯产品，烘干、粉碎即可。
实施例4测定转化产率和转化率
取1mL未分离的反应产物，离心去除催化剂和分子筛，旋转蒸发溶剂，用100％甲醇准确定容至10mL，该溶液经0.22μm有机滤膜过滤后用高效液相色谱(HPLC)测定溶液各组分浓度。HPLC条件如下：AgilentTechnologies 1200系列高效液相色谱液，色谱柱：Grace Prevail Organic Acid5u 150mm×4.6mm，柱温：40℃，流动相：甲醇/水/磷酸(85/15/0.1)，流速：1mL/min，进样量：10μL，检测波长：254nm。
产率计算公式如下：
产率＝C ester/(C L-ascorbic acid+C ester)，
式中：C ester为HPLC测定样品中L-抗坏血酸DHA酯浓度，CL-ascorbic acid为样品中L-抗坏血酸的浓度。
酯化反应效率：转化率＝C L-ascorbic acid(反应后)/C L-ascorbic acid(反应前)×100％。
通过上述方法检测计算，实施例2中，实例1合成L-抗坏血酸DHA酯的产率和反应效率分别为58％和60％，实例2合成L-抗坏血酸DHA酯的产率和反应效率分别为60％和64％。而实施例3采用传统化学法合成L-抗坏血酸DHA酯获得的产率和转化效率分别仅为27％和30％。
Claims (1)
1.一种酵母展示脂肪酶催化合成L-抗坏血酸DHA酯的方法，包括：
人工合成米根霉（Rhizopus oryzae）的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因，接着在脂肪酶基因C端加上编码连接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS的基因片段，连接得到核苷酸序列pro-ROL-linker-α-agglutinin，pro-ROL代表脂肪酶基因，Genbank号为：AF229435，α-agglutinin代表细胞壁α凝集素基因，Genbank号为：M28164，linker代表编码连接肽的基因片段；
以人工合成序列为模板，利用以下引物对，进行PCR扩增；
上游引物：5’-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3’；
下游引物：5’-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3’；
PCR反应体系为：模板DNA为1μl，高保真DNA聚合酶0.5μl，50mM的dNTP0.4μl，上下游引物各0.5μl，10×PCR缓冲液5μl，加水至50μl；
PCR运行条件为：94℃3分钟；35个循环，每个循环为：94℃30秒，60℃1分钟，72℃30秒；72℃10分钟；
用EocR I和Not I同时酶切PCR产物和pPIC9K质粒，并在T4连接酶的作用下过夜连接形成pPIC9K-ROL质粒，用Sal I对pPIC9K-ROL质粒进行酶切线性化处理，将酶切线性化处理好的目的基因15μl加入到毕赤酵母GS115感受态细胞中，转入电转杯中，冰浴15min，然后在1500V，400Ω，25uF条件下电击10ms，并加入1mL预冷的山梨醇；
将混匀的电转产物400μl涂于MD平板上，筛选阳性转化子，然后将阳性转化子涂于不同浓度的G418平板上，根据阳性转化子对G418的抗性筛选出Mut表型的多拷贝阳性重组菌株；
将多拷贝阳性重组菌株接种在BMGY培养基中发酵培养30h，离心收集细胞；再将细胞置于含有体积百分比0.5%甲醇的BMMY培养基中诱导培养144h，离心收集细胞，用水冲洗后，接种至YGC培养基中30℃培养120h，然后3000g离心分钟收集菌体，蒸馏水洗涤后再用50mM pH7.0磷酸缓冲液洗涤，然后与2倍体积油酸混合，-80℃下预冻后再经冷冻干燥机干燥24h，用己烷洗涤除去油酸，再进行再真空干燥去除己烷，即得到经生物印迹处理的酵母展示脂肪酶；
取L-抗坏血酸0.352g、DHA3.28g，加入含有5mL正己烷和5mL四氢呋喃的磨口三角瓶，混合、预热10min，然后加入酵母展示脂肪酶1g，充N2密封，置于85-1型磁力搅拌器中搅拌开始反应，转速为200转/分钟，反应温度保持在50℃，反应6h后加入1.5g分子筛，分子筛的孔径小于2nm，继续反应12h后停止搅拌，离心沉淀除去酵母展示脂肪酶及分子筛，取上清液进行旋转蒸发除去四氢呋喃，水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得L-抗坏血酸DHA酯产品，烘干、粉碎。
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