CN102212587B - 酵母展示脂肪酶催化合成淀粉黄原酸酯的方法 - Google Patents
酵母展示脂肪酶催化合成淀粉黄原酸酯的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102212587B CN102212587B CN201110110789.2A CN201110110789A CN102212587B CN 102212587 B CN102212587 B CN 102212587B CN 201110110789 A CN201110110789 A CN 201110110789A CN 102212587 B CN102212587 B CN 102212587B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lipase
- yeast display
- water
- add
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 title claims abstract description 36
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 title claims abstract description 36
- 239000008107 starch Substances 0.000 title claims abstract description 35
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 title claims abstract description 29
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 title claims abstract description 28
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 title claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 238000002818 protein evolution Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 239000012991 xanthate Substances 0.000 title claims abstract description 17
- ZOOODBUHSVUZEM-UHFFFAOYSA-N ethoxymethanedithioic acid Chemical compound CCOC(S)=S ZOOODBUHSVUZEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 16
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 title abstract 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 11
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 claims abstract description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 22
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 11
- 101710204899 Alpha-agglutinin Proteins 0.000 claims description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 9
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 8
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 8
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims description 6
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 claims description 5
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 claims description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 5
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 240000005384 Rhizopus oryzae Species 0.000 claims description 4
- 235000013752 Rhizopus oryzae Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 4
- 230000005611 electricity Effects 0.000 claims description 4
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 claims description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 4
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 3
- MEIRRNXMZYDVDW-MQQKCMAXSA-N (2E,4E)-2,4-hexadien-1-ol Chemical compound C\C=C\C=C\CO MEIRRNXMZYDVDW-MQQKCMAXSA-N 0.000 claims description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 2
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 claims description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 3
- 238000005213 imbibition Methods 0.000 abstract description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 abstract 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract 1
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000005864 Sulphur Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 3
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 3
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 3
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 2
- ZYECOAILUNWEAL-NUDFZHEQSA-N (4z)-4-[[2-methoxy-5-(phenylcarbamoyl)phenyl]hydrazinylidene]-n-(3-nitrophenyl)-3-oxonaphthalene-2-carboxamide Chemical compound COC1=CC=C(C(=O)NC=2C=CC=CC=2)C=C1N\N=C(C1=CC=CC=C1C=1)/C(=O)C=1C(=O)NC1=CC=CC([N+]([O-])=O)=C1 ZYECOAILUNWEAL-NUDFZHEQSA-N 0.000 description 1
- RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 3,7-bis(dimethylamino)phenothiazin-5-ium Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GJCOSYZMQJWQCA-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthene Chemical compound C1=CC=C2CC3=CC=CC=C3OC2=C1 GJCOSYZMQJWQCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 1
- 241001411320 Eriogonum inflatum Species 0.000 description 1
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 229920000881 Modified starch Polymers 0.000 description 1
- MKRNVBXERAPZOP-UHFFFAOYSA-N Starch acetate Chemical compound O1C(CO)C(OC)C(O)C(O)C1OCC1C(OC2C(C(O)C(OC)C(CO)O2)OC(C)=O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(C)C(O)C2O)CO)O1 MKRNVBXERAPZOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005815 base catalysis Methods 0.000 description 1
- NNBFNNNWANBMTI-UHFFFAOYSA-M brilliant green Chemical compound OS([O-])(=O)=O.C1=CC(N(CC)CC)=CC=C1C(C=1C=CC=CC=1)=C1C=CC(=[N+](CC)CC)C=C1 NNBFNNNWANBMTI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 1
- 238000002485 combustion reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009713 electroplating Methods 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000010808 liquid waste Substances 0.000 description 1
- CEQFOVLGLXCDCX-WUKNDPDISA-N methyl red Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1\N=N\C1=CC=CC=C1C(O)=O CEQFOVLGLXCDCX-WUKNDPDISA-N 0.000 description 1
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 235000019426 modified starch Nutrition 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 229920001285 xanthan gum Polymers 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种酵母展示脂肪酶催化合成淀粉黄原酸酯的方法，包括：将谷物淀粉溶于水，吸涨后加入CS2和酵母展示脂肪酶，在45～55℃下搅拌反应1～1.5小时，分离、纯化制得淀粉黄原酸酯；所述酵母展示脂肪酶通过如下方法制备：将线性化的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶。本发明通过将脂肪酶展现在细胞外，利用该酶制剂催化合成淀粉黄原酸酯，不仅提高了转化效率，而且缩短了反应时间，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种酵母展示脂肪酶催化合成淀粉黄原酸酯的方法。
背景技术
淀粉黄原酸酯是淀粉与CS2在碱性条件下进行黄原酸化反应而制得的一种淀粉衍生物。可在酸性条件下吸附废水中的各种重金属离子，常用于电镀废水的重金属离子回收，淀粉黄原酸酯作为一种传统净化废水的方法不仅能耗低、功效高、反应迅速、操作简便，而且能有效回收重金属，在取得环境效益的同时，还能获得经济效益和社会效益。
相较于化学法合成淀粉黄原酸酯，生物酶法可以在较短时间内获得高取代度的反应产物。就相同反应体系而言，生物酶法相比化学法显著提升反应效率和产率，均一度和稳定度也有显著提高。同时，采用生物酶法避免了化学法反应条件苛刻(强酸、碱催化、高温高压)、无特异性、产物复杂、副产物多、分离难、安全性差等弊端。
脂肪酶是目前酯化合成中使用最广泛的酶，但是生产成本高、固定化过程繁杂费时大大局限了其商业化应用。本发明通过展示技术使脂肪酶固定于酵母细胞表面并成为酵母细胞活体组成部分，构建成酵母全细胞脂肪酶生物催化剂，用于高效催化合成淀粉黄原酸酯。
发明内容
本发明提供了一种酵母展示脂肪酶催化合成淀粉黄原酸酯的方法，可显著提高酯化反应效率和产率，降低成本。
一种酵母展示脂肪酶催化合成淀粉黄原酸酯的方法，包括：
将谷物淀粉溶于水，吸涨后加入CS2和酵母展示脂肪酶，在45～55℃下搅拌反应1～1.5小时，分离、纯化制得淀粉黄原酸酯；
以重量份计，反应各原料配比可以如下：水100份、谷物淀粉35～40份、CS21～2份、酵母展示脂肪酶1～2份。
所述的搅拌速率为100～200转/分钟。
优选的，所述的分离、纯化方法为：将反应液pH值调节至5～6进行沉淀，沉淀经洗涤，抽滤，干燥制得淀粉黄原酸酯。
所述酵母展示脂肪酶通过如下方法制备：
将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；
所述的重组质粒由原始载体pPIC9K和依次插入原始载体pPIC9K中MFα1信号肽下游的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。
所述的脂肪酶基因可选用Genbank号为AF229435的序列，毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115为商业化产品，可从Invitrogen公司购得。它的细胞壁α凝集素基因序列的Genbank号为M28164。
载体pPIC9K为商业化产品(如Invitrogen公司)，它存在MFα1信号肽序列(Genbank号：M17301)，同时该载体内信号肽序列上游存在AOX1启动子(Genbank号：Z46233)。重组质粒线性化处理的目的是为了与胞内基因组发生同源重组，提高表达稳定性。
优选的，所述生物印迹所用配体为油酸，它可以诱导酶结构改变，提高转化率。
本发明通过将脂肪酶基因和细胞壁α凝集素基因导入毕赤酵母细胞GS115，毕赤酵母细胞诱导培养后，脂肪酶表达并分泌到胞外，同时利用细胞壁α凝集素将该脂肪酶固定在细胞表面。利用该酵母展现脂肪酶对酯化反应进行催化，不仅提高了操作稳定性、耐热性以及重复性，反应时间也大大缩短，从原来的15小时下降到2～3小时，另外该酵母展现脂肪酶生物催化剂生产成本低，催化合成转化效率高。
具体实施方式
实施例1制备酵母展示脂肪酶
通过人工合成的方法，合成米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶基因(Genbank号：AF229435)和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因(Genbank号为M28164)，同时在脂肪酶基因C端加上连接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS(linker)，连接后得到核苷酸序列pro-ROL-linker-α-agglutinin，同时在序列两端添加EcoR I和Not I酶切位点，其中pro-ROL为脂肪酶基因，α-agglutinin为细胞壁α凝集素基因。
以上述人工合成序列为模板，利用下述引物对，进行PCR扩增，
上游引物：5’-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3’；
下游引物：5’-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3’
PCR反应体系为：模板DNA为1μl，高保真DNA聚合酶0.5μl，dNTP(50mM)0.4μl，上下游引物各0.5μl，10×PCR缓冲液5μl，加水至50μl。
PCR运行条件为：94℃3分钟，35个循环(94℃30秒，60℃1分钟，72℃30秒)，72℃10分钟。
用EocR I和Not I同时酶切PCR产物和pPIC9K质粒，并在T4连接酶的作用下过夜连接形成pPIC9K-ROL质粒，通过电泳检验并回收质粒。为使目的基因与毕赤酵母GS115发生His 4单位点置换重组，用Sal I对pPIC9K-ROL质粒进行酶切线性化处理。将酶切线性化处理好的目的基因约15μl加入到事先准备好的毕赤酵母GS115感受态细胞中，转入电转杯中，冰浴15min，然后在1500V，400Ω，25uF条件下电击10ms，并加入约1ml预冷的山梨醇。将上述混匀的电转产物约400μl涂于MD平板上，筛选阳性转化子，然后将阳性转化子涂于不同浓度的G418平板上，根据阳性转化子对G418的抗性筛选出Mut表型的多拷贝阳性重组菌株。
将多拷贝阳性重组菌株接种在BMGY培养基中发酵培养30h，离心收集细胞；再将细胞置于含有0.5％(体积百分比)甲醇的BMMY培养基中诱导培养144h，离心收集细胞，用水冲洗后，接种至YGC培养基中30℃培养120h，然后3000g离心分钟收集菌体，蒸馏水洗涤后再用50mM pH7.0磷酸缓冲液洗涤，然后与2倍体积油酸混合，-80℃下预冻后再经德国Christ真空冷冻干燥机干燥24h，用己烷洗涤除去油酸，再进行再真空干燥去除己烷，即得到经生物印迹处理的酵母展示脂肪酶。
实施例2酵母展示脂肪酶催化合成淀粉黄原酸酯
实例1取350g谷物淀粉用水配制成35％淀粉乳(淀粉干基)、于65℃下吸水处理15min使淀粉乳吸水膨胀，冷却后加入1g上述制备的酵母展示脂肪酶，然后分批加入10g CS2，置于85-1型磁力搅拌器中搅拌开始反应，转速为200转/分钟，反应温度保持在46℃，反应1h后停止搅拌，离心取沉淀，用水多次洗涤沉淀，洗去未反应的醋酸酐，然后将沉淀干燥、粉碎即为成品。
实例2取400g谷物淀粉用水配制成40％淀粉乳(淀粉干基)、于65℃下吸水处理15min使淀粉乳吸水膨胀，冷却后加入2g上述制备的酵母展示脂肪酶，然后分批加入15g CS2，置于85-1型磁力搅拌器中搅拌开始反应，转速为250转/分钟，反应温度保持在49℃，反应1.5h后停止搅拌，离心取沉淀，用水多次洗涤沉淀，洗去未反应的醋酸酐，然后将沉淀干燥、粉碎即为成品。
实施例3采用传统化学法合成淀粉黄原酸酯
取350g谷物淀粉用水配制成35％淀粉乳(淀粉干基)、于65℃下吸水处理15min使淀粉乳吸水膨胀，然后分批加入10g CS2，置于85-1型磁力搅拌器中搅拌开始反应，转速为200转/分钟，反应温度保持在46℃，反应1h后停止搅拌，离心取沉淀，用水多次洗涤沉淀，洗去未反应的醋酸酐，然后将沉淀干燥、粉碎即为成品。
实施例4测定取代度和乙酰基含量
称取0.01～0.05g待测样品于一张剪成特定形状的定量滤纸的中央并包折妥当，然后将其紧夹于连在燃烧瓶塞上的铂丝中间，滤纸尾部朝下斜方向悬在空中。在燃烧瓶中加入0.36mol/L H2O2吸收液15mL，通氧气1min(以便充分置换燃烧瓶中的空气)，即刻点燃滤纸尾部并将其小心塞入瓶中燃烧。当燃烧完毕后，不断震荡直至白烟完全消失被吸收。打开瓶塞，并煮沸吸收液1～2min，稍冷却后，加3滴混合指示剂(甲基红0.2％乙醇溶液∶亚甲基蓝0.1％乙醇溶液＝3∶1)，用0.0250mol/L硼砂标准溶液滴定至溶液由红紫色变成翠绿色。
S＝(NV×32.06/2)/(W×1000)×100％
式中：S为硫含量，％；N为硼砂标准溶液，0.0250mol/L；V为滴定中所消耗的硼砂标准溶液的体积，mL；32.06为硫原子量；W为样品质量，g。
反应效率＝S/所加入CS2中S含量×100％
根据上述方法对制得的淀粉醋酸酯样品进行检测，实施例2中，实例1产品的硫含量和反应效率分别为7.5％和89％，实例2产品的硫含量和反应效率分别为7.7％和90％。而实施例3产品的硫含量和反应效率仅为5.5％和80％。
Claims (1)
1.一种酵母展示脂肪酶催化合成淀粉黄原酸酯的方法，包括：
人工合成米根霉（Rhizopus oryzae）的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因，接着在脂肪酶基因C端加上编码连接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS的基因片段，连接得到核苷酸序列pro-ROL-linker-α-agglutinin，同时在序列两端添加EcoR I和Not I酶切位点，pro-ROL代表脂肪酶基因，Genbank号为：AF229435，α-agglutinin代表细胞壁α凝集素基因，Genbank号为：M28164，linker代表编码连接肽的基因片段；
以人工合成序列为模板，利用下述引物对，进行PCR扩增，使得在序列两端添加EcoR I和Not I酶切位点；
上游引物：5’-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3’；
下游引物：5’-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3’；
PCR反应体系为：模板DNA为1μL，DNA聚合酶0.5μL，50mM的dNTP0.4μL，上下游引物各0.5μL，10×PCR缓冲液5μL，加水至50μL；
PCR运行条件为：94℃3分钟；35个循环，每个循环为：94℃30秒，60℃1分钟，72℃30秒；72℃10分钟；
用EocR I和Not I同时酶切PCR产物和pPIC9K质粒，并在T4连接酶的作用下过夜连接形成pPIC9K-ROL质粒，通过电泳检验并回收质粒；用Sal I对pPIC9K-ROL质粒进行酶切线性化处理，将酶切线性化处理好的目的基因15μL加入到事先准备好的毕赤酵母GS115感受态细胞中，转入电转杯中，冰浴15min，然后在1500V，400Ω，25μF条件下电击10ms，并加入1mL预冷的山梨醇；
将混匀的电转产物400μL涂于MD平板上，筛选阳性转化子，然后将阳性转化子涂于不同浓度的G418平板上，根据阳性转化子对G418的抗性筛选出Mut表型的多拷贝阳性重组菌株；
将多拷贝阳性重组菌株接种在BMGY培养基中发酵培养30h，离心收集细胞；再将细胞置于含有体积百分比0.5%甲醇的BMMY培养基中诱导培养144h，离心收集细胞，用水冲洗后，接种至YGC培养基中30℃培养120h，然后3000g离心收集菌体，蒸馏水洗涤后再用50mM pH7.0磷酸缓冲液洗涤，然后与2倍体积油酸混合，-80℃下预冻后再经德国Christ真空冷冻干燥机干燥24h，用己烷洗涤除去油酸，即得到经生物印迹处理的酵母展示脂肪酶；
取400g谷物淀粉用水配制成40%淀粉乳、于65℃下吸水处理15min使淀粉乳吸水膨胀，冷却后加入2g上述制备的酵母展示脂肪酶，然后分批加入15g CS2，置于85-1型磁力搅拌器中搅拌开始反应，转速为250转/分钟，反应温度保持在49℃，反应1.5h后停止搅拌，离心取沉淀，用水多次洗涤沉淀，洗去未反应的CS2，然后将沉淀干燥、粉碎。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110110789.2A CN102212587B (zh) | 2011-04-28 | 2011-04-28 | 酵母展示脂肪酶催化合成淀粉黄原酸酯的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110110789.2A CN102212587B (zh) | 2011-04-28 | 2011-04-28 | 酵母展示脂肪酶催化合成淀粉黄原酸酯的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102212587A CN102212587A (zh) | 2011-10-12 |
| CN102212587B true CN102212587B (zh) | 2014-07-16 |
Family
ID=44744119
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110110789.2A Expired - Fee Related CN102212587B (zh) | 2011-04-28 | 2011-04-28 | 酵母展示脂肪酶催化合成淀粉黄原酸酯的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102212587B (zh) |
-
2011
- 2011-04-28 CN CN201110110789.2A patent/CN102212587B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Display of Candida Antarctica lipase B on Pichia pastoris and its application to flavor esteer syntehsis;Guo-Dong Su et al;《Appl Microbiol Biotechnol》;20091224;1493-1501 * |
| Guo-Dong Su et al.Display of Candida Antarctica lipase B on Pichia pastoris and its application to flavor esteer syntehsis.《Appl Microbiol Biotechnol》.2009,1493-1501. |
| 不溶性淀粉黄原酸酯的制备及其性能研究;孙阿惠 等;《杭州化工》;20111231;14-16 * |
| 全细胞脂肪酶生物催化剂构建及其在生物转化中的应用;阮晖 等;《中国食品科学技术学会第七届年会论文摘要集》;20101104;127-128页第1002篇摘要部分 * |
| 孙阿惠 等.不溶性淀粉黄原酸酯的制备及其性能研究.《杭州化工》.2011,14-16. |
| 阮晖 等.全细胞脂肪酶生物催化剂构建及其在生物转化中的应用.《中国食品科学技术学会第七届年会论文摘要集》.2010,127-128页第1002篇摘要部分. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102212587A (zh) | 2011-10-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105002247A (zh) | 一种小分子核桃肽及其制备方法 | |
| CN103554250B (zh) | 一种提取藻蓝蛋白的方法 | |
| CN102212601B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成维生素a棕榈酸酯的方法 | |
| CN102212586B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成十二烯基琥珀酸淀粉酯的方法 | |
| CN102212587B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成淀粉黄原酸酯的方法 | |
| CN105063016A (zh) | 一种从黄酒麦曲中提取微生物总dna的方法 | |
| CN102212584B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成淀粉醋酸酯的方法 | |
| CN102154107B (zh) | 一种高品质生物培养基用酵母浸粉及其制备方法 | |
| CN102212583B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成辛烯基琥珀酸淀粉酯的方法 | |
| CN102492052A (zh) | 一种从啤酒酵母废渣中提取甘露聚糖的方法 | |
| CN105296470A (zh) | 一种阿胶及其衍生产品高纯度dna的提取试剂盒及其提取方法 | |
| CN102212588B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成淀粉磷酸单酯的方法 | |
| CN102212585B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成淀粉磷酸酯的方法 | |
| CN102296101B (zh) | 一种微胶囊包埋的紫菜降血压肽的制备方法 | |
| CN102212578B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成果糖棕榈酸酯的方法 | |
| CN102212575B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成l-抗坏血酸棕榈酸酯的方法 | |
| CN102321598B (zh) | 一种酵母展示型果胶酶协同超声波破碎紫菜细胞的方法 | |
| CN103555695A (zh) | 一种从植物榨汁提取蛋白酶的方法 | |
| CN118620100A (zh) | 一种回收玉米淀粉加工废水中多糖的方法 | |
| CN102212591B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成蔗糖硬脂酸酯的方法 | |
| CN102212576B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成维生素e亚油酸酯的方法 | |
| CN102212577B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成维生素e琥珀酸酯的方法 | |
| CN102226209B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成维生素e油酸酯的方法 | |
| CN102212590B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成蔗糖棕榈酸酯的方法 | |
| CN102212592B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成麦芽糖月桂酸酯的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140716 Termination date: 20160428 |