KR0185335B1 - 표면 발현 벡터 및 이를 이용한 단백질의 미생물 표면 발현 방법 - Google Patents

표면 발현 벡터 및 이를 이용한 단백질의 미생물 표면 발현 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 그람음성 세균인 슈도모나스 시링계(Pseudomonas syringae)에서 유래한 세포외막 단백질인 빙핵활성 단백질(Ice Nucleation Protein, INP)을 이용하여, 외래 단백질을 세포 표면에 안정적으로 발현시키는 새로운 벡터, 세균의 표면에 외래단백질을 다량 발현시키는 제조방법 및 표면 발현된 외래단백질을 사용하는 용도를 제공함에 관한 것이다.

Description

표면 발현 벡터 및 이를 이용한 단백질의 미생물 표면 발현 방법
제1도는 빙핵활성 단백질 유전자와 그의 C-말단에 제한효소 부위를 포함하는 표면 발현 벡터, pGINP21M의 유전자 지도를 나타낸다.
제2도는 빙핵활성 단백질 유전자와 카복시메칠셀룰라제 유전자를 포함하는 표면 발현 전환벡터 pASCM1의 유전자 지도를 나타낸다.
제3도는 표면 발현된 카복시메칠셀룰라아제의 활성을 세척된 세포, 배양액 및 파쇄된 세포액에서 비교하여 나타낸다.
제4도는 표면 발현된 리파제의 활성을 이상계에서의 지질 분해 정도로 나타낸다.
제5도는 표면 발현된 단선항체와 이에 대한 항원의 결합 정도를 엘리자 방법으로 측정하여 나타낸다.
[발명의 이용분야]
본 발명은 빙핵활성 단백질을 이용하여 외래 단백질을 세균의 표면에 효과적으로 발현시키는 새로운 벡터에 관한 것이다.
또한 본 발명은 빙핵활성 단백질을 이용하여 외래단백질을 세균의 표면에 발현시키는 단백질의 제조방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 표면 발현 방법을 사용하여 제조한 외래단백질을 이용하는 용도에 관한 것이다.
더욱 상세하게는 본 발명은 그람음성 세균인 슈도모나스 시링게 (Peseudomonas syringae)에서 유래한 세포외막 단백질인 빙핵활성 단백질(Ice Nucleation Protein, INP)을 이용하여, 외래 단백질을 세포 표면에 안정적으로 발현시키는 새로운 벡터, 세포의 표면에 외래단백질을 다량 발현시키는 제조방법 및 표면 발현된 외래단백질을 사용하는 용도를 제공함에 관한 것이다.
[발명의 배경]
최근 몇 년간 박테리오파아지를 포함한 세균과 효모 등의 단세포 생물의 세포 표면에 필요한 외래단백질을 발현시키려는 연구가 진행되어 새로운 백신의 생산, 각종 항원과 항체의 스크리닝, 유용한 효소의 세포표면으로의 고정화 등에 널리 이용되고 있다.
세균의 표면에 단백질을 발현시키려는 시도는 백신을 안정적으로 생산하기 위해 항원성을 지닌 펩타이드 부위를 세포 표면에 발현시키는 것으로 처음 시작되었다. 종래에는 백신의 생산을 위해 병원균을 무작위로 돌연변이시켜 안정하고 지속적으로 역가를 보인 세균을 찾아 사용하였다. 그러나 이러한 방법은 실제로 동물 또는 인간에 경구 투여할 경우 그 활성을 쉽게 잃어버리는 단점이 있으므로 이를 극복하고자 많은 시도가 이루어졌다.
먼저 그람음성 세균에서 세포 표면단백질을 이용하여 그 유전자를 항원으로 작용할 수 있는 단백질 유전자와 융합하고 이를 적당한 세균에 도입하여 융합단백질(fusion protein)을 효과적으로 세포 표면에 발현시키는 시도가 이루어졌다. 이렇게 제조된 단백질은 안정하게 세포 표면에 돌출하므로 효과적인 항원으로 작용할 수 있다. 특히 그람음성 세균인 경우 세포외막의 지질탄수화물(lipopolysaccharide, LPS)이 표면 발현된 단백질의 항원성(antigenicity)을 증가시키는 작용을 하므로 매우 효과적이다.
세균의 표면에 단백질을 발현하고자 하면 세포내에서 생합성된 단백질이 세포막을 통과할 수 있는 분비신호를 단백질 일차 서열상에 갖고 있어야 한다. 또한 그람음성 세균인 경우는 세포내막과 세포막공간을 통과하여 세포외막에 삽입부착되어 막 외부로 돌출되게 안착되어야 한다. 세균의 경우 이러한 분비신호(secretion signal)와 세포 표면에 안착하게 하는 표적신호(targeting signal)를 갖고 있는 단백질로는 표면단백질, 특수한 효소와 독소단백질을 들 수 있다. 실제로 이들 단백질이 갖는 분비신호와 표적신호 등을 적당한 프로모터와 함께 사용하면 세균의 표면에 단백질을 성공적으로 발현시킬 수 있다.
현재까지 주로 그람음성 세균에 존재하는 표면단백질을 이용하여 필요한 외래단백질을 세균의 표면에 발현시키려는 시도가 이루어졌다. 지금까지 외래 단백질의 표면 발현에 사용된 세균의 표면단백질은 세포외막 단백질, 지질단백질(lipoprotein), 분비단백질, 세포 표면기관 단백질 등 크게 4가지로 나눌 수 있다. 지금까지 표면발현에 사용된 그람음성 세균의 세포외막 단백질로는 LamB, PhoE, OmpA 등을 들 수 있는데, 이들 단백질을 이용한 경우 외래단백질을 세포표면에 돌출한 루프(loop)에 삽입시키므로 구조적으로 삽입할 수 있는 단백질의 크기가 제한되어 있다. 또한 삽입될 외래단백질의 C-말단과 N-말단이 입체적으로 가깝게 위치하여야 하므로, 그 거리가 멀 경우에는 연결 펩타이드로 두 말단 사이를 가깝게 하여야 한다.
실제로 LamB 나 PhoE를 이용한 경우 50 -60개 이상의 아미노산으로 이루어진 외래 폴리펩타이드를 삽입하면 구조적 제한을 가져와 안정한 막단백질을 형성하지 못하였다 [Charbit et al., J. Immunol., 139: 1658-1664 (1987) ; Agterberg et al., Vaccine, 8: 85-91 (1990)]. OmpA를 사용하여 외래단백질을 돌출된 루프에 삽입한 경우도 있지만 구조적 제한을 극복하기 위하여 세포의막에 안착하게 할 수 있는 최소한의 표적신호를 포함하는 일부 OmpA 단편만을 사용하였다. 이러한 방법으로 베타락타머제(β-lactamase)를 OmpA 표적신호 C-말단에 연결하여 세포표면에 발현시켰다. 이 경우에 있어서, 대장균의 세포외막에 안정적으로 발현되어 표면부착되는 것은 OmpA 단편에 의해, 세포질에서부터 세포외막까지의 이동은 대장균의 지질단백질 Lpp의 분비신호 (signal sequence)를 암호하고 있는 아미노산을 OmpA의 N-말단에 융합함에 의하여 이루어졌다 [Francisco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 489: 2713-2717 (1992)].
이상과 같이 세균의 세포외막 단백질을 이용하여 외래단백질을 세포 표면에 발현시키기 위해서는 적당한 세포외막 단백질과 외래단백질을 유전자 수준에서 서로 연결하여 융합단백질이 생합성되도록 유도하고, 이들이 안정하게 세포내막을 통과하여 세포외막에 부착되어 유지되도록 해야 한다. 이를 위해서는 다음과 같은 요구조건을 갖는 세포외막 단백질을 선정하여 표면 발현의 모체로 사용해야 할 것이다. 먼저 세포내막을 통과할 수 있는 분비신호를 갖고, 둘째 세포외막에 안정되게 부착될 표적신호를 갖으며, 셋째 세포 표면에 다량으로 발현되면서, 넷째 단백질의 크기에 관계없이 안정적으로 발현되어야 한다. 하지만 위의 조건을 모두 만족시키는 표면발현 모체는 아직까지 개발되지 않은 상태이고 현재까지는 상기한 경우의 단점을 보완하는 수준이다.
지질단백질도 표면단백질로서 표면 발현에 이용되어 왔으며, 특히 대장균의 지질단백질은 그 N-말단에 분비신호를 갖고 세포내막을 통과할 수 있으며, 말단의 시스테인(L-cysteine)이 공유결합으로 세포외막 지질 또는 세포내막 지질과 직접 부착되어 있다. 특히 주 지질단백질인 Lpp는 N-말단은 세포외막에 C-말단은 세포벽(peptidoglycan, PG)에 결합되어 있어 세포외막 단백질 OmpA 단편과 연결될 경우 안정적으로 외래단백질을 세포외막까지 분비하여 표면 발현할 수 있다 [Francisco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 489: 2713-2717 (1992)]. 또 다른 지질단백질인 TraT는 지질단백질의 이러한 특성을 이용하여 폴리오바이러스의 C3 에피톱과 같은 펩타이드를 표면발현하는데 사용되었다 [Felici et al., J. Mol. Biol., 222: 301-310 (1991)]. 또한 아직 정확한 기능은 밝혀지지 않은 세포벽 부착형 지질단백질(Peptidoglycan-associated lipoprotein, PAL)도 재조합 항체의 표면발현에 사용되었다 [Fuchs et al., Bio/Technology, 9: 1369-1372 (1991)]. 이 경우 PAL의 C-말단은 세포벽에 연결되고 N-말단은 재조합 항체에 연결되어 융합단백질이 표면 발현되었다.
세포외막을 통과하는 분비단백질도 표면단백질로서 이용될 수 있으나 그람음성 세균의 경우 분비단백질이 발달되어 있지 않으며, 몇몇 분비단백질의 경우만 그 특유의 분비기작에 관여하는 단백질들이 존재하여 세포외막 통과를 돕고 있다. 예를 들어 클랩시엘라 (Klebsiella) 속 풀룰란아제(pullulanase)는 지질단백질로 그의 N-말단이 지방질로 치환되어 세포외막에 부착되어 있다가 완전히 세포 배양액 중으로 분비된다. 코낵커(Kornacker)등이 풀룰란아제의 N-말단 단편을 이용하여 베타락타머제를 세포 표면에 발현시켰으나 발현된 풀룰란아제-베타락타머제 융합단백질은 잠시 세포 표면에 부착되어 있다가 세포 배양액 중으로 유리되는 단점이 있었다. 또한 이를 이용하여 세포막 공간(periplasmic space) 단백질인 알칼린 포스파타제(alkaline phosphatase)를 발현시킨 경우 이의 분비를 위해서는 적어도 14개 이상의 단백질이 관련되므로 안정적으로 표면 발현되지 않앗다 [Kornacker et al., Mol. Microl., 4: 1101-1109 (1990)].
독특한 분비체계를 갖고 있는 병원 미생물 나이세리아(Neisseria) 유래의 IgA 프로테아제는 C-말단에 존재하는 β-단편에 N-말단에 존재하는 프로테아제를 세포외막에 안착하게 하는 신호를 갖고 있다. 일단 세포외막에 도달하여 세포 표면에 돌출한 프로테아제는 자신의 가수분해능에 의해 세포 배양액으로 분비된다. 크라우저(Klauser) 등은 이 IgA 프로테아제 β-단편을 이용하여 약 12kDa의 콜레라 독소 B 소단위를 안정적으로 세포 표면에 발현시켰다 [Klauser et al., EMBO J., 9: 1991-1999 (1990)]. 그러나 분비과정중 세포막 공간에서 일어난 단백질의 접힘(protein folding)에 의해 융합단백질의 분비는 억제되었다.
이외에도 그람음성 세균의 경우 세포 표면에 존재하여 표면 발현에 응용할 수 있는 세포기관으로는 편모(Flagella), 필리(Pili) 및 핌브리아(Fimbriae) 등이 있다. 편모의 구성 소단위인 편모단백질 (Flagellin)을 이용하여 콜레라 독소 B소단위와 B형 간염 바이러스로부터 유래한 펩타이드가 안정적으로 발현되었으며 이들은 그에 대한 항체와 강력하게 반응하였다 [Newton et al., Science, 244: 70-72 (1989)]. 세포 표면에 실처럼 생긴 핌브리아의 구성단백질인 핌브린(fimbrilin)을 이용하여 외래 펩타이드의 발현을 시도한 결과 작은 펩타이드의 경우만 성공적으로 발현되었다 [Hedegaard et al., Gene, 85: 115-124 (1989)].
위와 같은 그람음성 세균의 표면단백질에 의한 표면 발현 시도외에 그람양성세균의 표면단백질을 이용한 표면 발현이 최근에 시도되었다 [Samuelson et al., J. Bacteriol., 177: 1470-1476 (1995)]. 이 경우도 세포내막을 통과할 수 있는 분비신호와 세포막에 부착되는 표면발현 모체를 필요로 한다. 실제로 스타필로코 히쿠스 (Staphylococcus hyicus) 유래의 리파제를 분비신호로 사용하고, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 유래의 프로테인 A를 막 부착 모체로 사용하여 80개 아미노산으로 이루어진 말라리아 항원(malaria blood stage antigen)과 스트렙토코쿠스 단백질 G 유래의 알부민 부착 단백질을 효과적으로 그람양성 세균의 표면에 발현하였다.
상기한 그람음성 및 양성 세균의 표면 발현에 대한 연구를 통해 많은 유용한 단백질 발현 시스템이 개발되어 미국, 유럽과 일본 등에서 특허화되어 최근 3년동안 8건이 등록되었다. 이중에서 특히 그람음성 세균의 세포외막 단백질을 이용한 경우가 가장 많아 5건(WO9504069, WO9324636, WO9310214, EP603672, US5356797)이 보고되었고, 세포표면 기관인 필리(pili)를 이용한 경우가 한건(WO9410330)이 있으며, 또한 세포표면 지질단백질(lipoprotein)을 이용한 경우도 한건(WO9504079)이 보고되었다.
이와 같은 배경에서, 본 발명자들은 슈도모나스 시링게 KCTC 1832 유래의 표면단백질인 빙핵활성 단백질(Ice Nucleation Protein)을 새로운 표면발현 모체로 이용하여, 외래단백질을 세균의 표면에 효과적으로 발현시키는 새로운 벡터, 세균의 표면에 외래단백질을 다량 발현시키는 방법 및 표면 발현된 외래단백질의 용도를 개발하였다.
[발명의 요약]
본 발명은 빙핵활성 단백질의 특성을 이용하여 외래단백질을 세균의 표면에 발현할 수 있는 유용한 벡터를 제공하는데 그 목적이 있다. 특히, 본 발명의 벡터는 빙핵활성 단백질의 일차 서열상에 갖고 있는 분비신호와 표적신호를 포함한다.
또한 본 발명은 빙핵활성 단백질의 특성을 이용한 표면 발현 벡터를 사용하여 외래단백질을 세포 표면에 발현시키는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
특히, 본 발명은 외래단백질을 세포의 표면에 발현시킴으로 세포의 파쇄 또는 단백질의 분리·정제 과정을 거치지 않고 효율적으로 외래단백질을 이용할 수 있는 제조방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 표면 발현 방법으로 생산된 외래단백질을 다양한 용도에 제공할 수 있다. 본 용도에는 항체 및 효소의 효과적인 생산이 있으며, 이외에도 항원, 부착 또는 흡착 단백질 및 새로운 생리 활성 물질을 스크리닝하기 위한 펩티드 라이브러리의 생산 등이 포함된다.
슈도모나스 시링게 KCTC 1832에서 유래한 빙핵활성 단백질 유전자를 포함한 모든 종류의 빙핵활성 단백질 유전자를 이용한 표면 발현 벡터는 모두 본 발명의 범위에 포함된다.
또한 본 발명의 빙핵활성 단백질을 이용한 표면 발현 벡터는 외래단백질을 세균의 표면에 발현하기 위해 모든 균주에 적용할 수 있고, 바람직하게는 그람 음성 세균, 더욱 바람직하게는 대장균, 초산균, 슈도모나스 속, 잔토모나스 속, 어위니아 속, 자이모모나스속에 속하는 균주에 적용할 수 있다. 본 균주를 이용한 모든 외래단백질의 제조방법은 본 발명의 범위에 포함된다.
구체적으로 본 발명은 슈도모나스 시링게 KCTC 1832에서 유래한 빙핵활성 단백질을 암호하는 유전자를 포함하고, 그 유전자의 C-말단에 제한효소 인식 부위를 삽입하여 다양한 외래단백질 유전자를 손쉽게 클로닝할 수 있는 표면 발현 벡터 pGINP21M (수탁번호: KCTC 0239 BP)을 제공한다.
이외에도 빙핵활성 단밸질의 C-말단에 모든 또는 일부 제한 효소의 다양한 인식 부위를 삽입할 수 있고, 이들 제한 효소 부위를 갖는 표면 발현 벡터는 모두 본 발명의 범위에 포함된다.
또한 본 발명은 빙핵활성 단백질을 암호하는 유전자를 포함하고 그 유전자의 C-말단에 카복시메칠셀룰라제(carboxymethylcellulase, CMCase)유전자의 N-말단을 연결하여 카복시메칠셀루라제를 융합단백질 형태로 표면 발현할 수 있는 표면 발현 전환벡터 pASCM1(수탁번호 : KCTC 0237 BP)를 제공한다.
또한 본 발명은 빙핵활성 단백질을 암호하는 유전자를 포함하고 그 유전자의 C-말단에 카복시메칠세룰라제 (carboxymethylcellulase, CMCase)유전자 대신 리파제(lipase)유전자를 연결하여 리파제를 융합단백질 형태로 표면 발현할 수 있는 표면 발현 전환벡터 pASLP1를 제공한다.
또한 본 발명은 빙핵활성 단백질을 암호하는 유전자를 포함하고 그 유전자의 C-말단에 카복시메칠셀룰라제 (carboxymethylcellulase, CMCase)유전자 대신 단선 항체(single chain Fv antibody)유전자를 연결하여 단선항체를 융합단백질 형태로 표면 발현할 수 있는 표면 발현 전환벡터 pASIg1를 제공한다.
[발명의 상세한 설명]
빙핵활성 단백질은 슈도모나스(Pseudomonas)속, 어위니아(Erwinia)속, 잔토모나스(Xanthomonas)속 등에 존재하는 세포외막 단백질로서 과냉각된 물에 존재할 경우 얼음 형성을 촉진하는 기능을 지니는 특수한 단백질이다.
여러 세균으로부터 분리된 빙핵활성 단백질의 구조를 유전자의 서열을 통해 살펴보면 특이하게도 단백질 중앙에 8개의 아미노산이 반복되어 나타나는데 이는 과냉각된 물분자들이 얼음입자처럼 잘 배열할 수 있는 틀을 제공하는 것으로 예상된다 [Green et al., Nature, 317: 645-648 (1985)]. 또한 N-말단과 C-말단에 특이한 아미노산 서열을 갖고 있어서 이들이 세포내막을 통과할 수 있는 분비신호 및 표적신호를 암호하는 것으로 보이는데, 특히 N-말단은 세포외막에 부착되는 기능을 수행한다.
총 1200개의 아미노산으로 이루어진 빙핵활성 단백질은 총 분자량이 약 118kDa으로 일차 아미노산 서열을 관찰해 보면 특이한 175개의 아미노산(1번 아미노산-175번 아미노산, 총 단백질의 15%)이 N-말단을 구성하고, 1152번부터 1200번까지의 32개 아미노산 (총 단백질의 4%)은 C-말단을 이루며 이들 사이를 8개의 아미노산이 정확하게 122번 반복된 967개의 아미노산 (총 단백질의 81%) 반복구간이 나타난다.
그린(Green) 등은 빙핵활성 단백질 유전자의 생리적 기능을 결손변이를 이용하여 세 가지 다른 구간에서 살펴보았다 [Green et al., Mol. Gen. Genet., 215: 165-172 (1988)]. 빙핵활성 단백질의 중앙에 존재하는 반복구간은 그 반복성이 없어지면 빙핵활성이 낮아지거나 없어지고, 반복성은 유지되나 길이가 줄어든 경우는 빙핵활성을 그대로 유지한다. 따라서 반복구간은 단백질의 분비나 표적에는 무관하고 단백질과 접하고 있는 과냉각된 물분자를 잘 배열하여 얼음입자 구조를 이루도록 촉진하는 기능을 갖는 것으로 보인다. 빙핵활성 단백질의 N-말단을 완전히 없애면 빙핵활성이 남아있는 것으로 보아 N-말단은 단지 세포외 막에 부착하는 기능을 갖고 있으리라 추측된다. 그러나 C-말단을 절단하면 빙핵활성이 완전히 없어지므로 C-말단은 빙핵활성 단백질을 세포외막까지 분비하여 표적할 수 있는 기능을 수행한다고 볼 수 있다.
빙핵활성 단백질은 그의 아미노산 일차 서열 구조와 특성상 외래단백질을 세포 표면에 발현시키는 표면발현 모체로서 많은 장점이 있다. 첫째, 빙핵활성 단백질은 세포 표면에 다량 발현될 수 있고, 둘째, 발현된 빙핵활성 단백질은 세포 주기상 휴지기에서도 안정하게 유지되며, 셋째, 구조적으로 세포 표면에 돌출되어 있으며, 넷째, 단백질 중앙에 존재하는 반복된 구간은 필요에 따라 길이를 조절할 수 있어 표면 발현될 외래 단백질과 세포 표면과의 사이의 길이를 임의로 조정할 수 있고, 다섯째로는 빙핵활성 단백질은 다양한 그람음성 세균에서 안정되게 발현될 수 있어 다양한 그람음성 세균의 표면에 발현시킬 수 있다는 점이다.
빙핵활성 단백질을 이용한 표면 발현 벡터를 제조하기 위하여 본 유전자가 클론된 플라스미드 pGINP21(수탁번호 : KCTC 86089)을 이용하여, 빙핵활성 단백질 C-말단을 암호하고 있는 유전자의 끝에 존재하는 번역 끝 코돈을 없애고 외래단백질 유전자를 삽입할 수 있는 새로운 3가지 제한효소 인식부위인, BamH I, Sma I, EcoR I 부위를 피시알증폭 기술(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 이용하여 삽입한다. 외래 단백질 유전자를 유전자 조작을 통해 번역코돈이 맞게 위에 나열한 제한 효소의 어떠한 위치에도 삽입할 수 있는 새로운 표면 발현 벡터를 pGINP21M (수탁번호 : 0239 BP)이라 명명한다(제1도 참조).
이외에도 빙핵활성 단백질의 C-말단에 모든 또는 일부 제한 효소의 다양한 인식 부위를 포함하는 다양한 벡터를 제조할 수 있다.
이렇게 제조한 표면 발현 벡터는 원래의 빙핵활성 단백질 유전자 서열을 갖고 빙핵활성 단백질을 발현하며 외래단백질 유전자가 번역 코돈이 틀리지 않게 연결되면 세균의 표면에 안정적으로 부착할 수 있는 융합단백질을 발현한다.
본 발명에서는 이렇게 제작한 표면 발현 벡터가 외래단백질을 세포내에서 합성하고 세포내막을 통과하여 안정적으로 세포 표면에 부착하는 것을 확인하기 위해, 외래단백질 유전자들을 빙핵활성 단백질 유전자에 번역 코돈이 맞게 접합하여 세균을 형질전환하고 발현을 유도한 다음 이들 융합단백질이 표면에 발현되었는지를 확인한다.
앞서 제조한 표면 발현 벡터 pGINP21M을 이용하여 그람양성 세균인 바실러스(Bacillus) 속 유래의 카복시메칠셀룰라제 (carboxy-methylcellulase, CMCase)를 표면 발현할 수 있는 전환벡터 pASCM1(수탁번호 : 0237 BP)을 제조한다. 먼저 카복시메칠셀룰라제의 N-말단 유전자는 390bp 크기로 pUC19에 클론되어 있는 플라스미드로부터 서브클론하여 [Park et. al., Enzyme Microb. Techonol., 8(12): 725-728 (1986)] pGINP21M 벡터에 삽입하고, 다시 C-말단 유전자도 다른 pUC19에 클론된 플라스미드로부터 얻어 상기에서 제조한 벡터에 삽입함으로써 전환벡터 pASCM1을 제조한다(제2도 참조).
카복시메칠셀룰라제를 표면 발현하기 위하여, 대장균을 pASCM1으로 형질전환하고 배양하여 표면 발현을 유도한다. 이 때 효소의 활성은 기질로 카복시메칠셀루로즈를 사용하여 측정한다. 그 결과 본 효소의 합성은 효소원으로 세척된 대장균 전체를 사용한 경우와 대장균을 파쇄하여 사용한 경우에 있어서 비슷하게 나타났다. 따라서 전체 효소활성은 표면에 돌출되어 발현된 카복시메칠셀룰라제에 의한 것으로 보인다. 카복시메칠셀룰라제의 기질인 카복시메칠셀룰로즈는 고분자 물질이므로 세포외막을 통과하여 세포내로 투과할 수 없으므로 상기 효소가 표면 발현된 세포 전체를 효소원으로 사용할 경우 효소 활성은 세포 표면과 기질용액에 용해된 카복시메칠셀룰로즈와 접촉하여 이루어진다고 할 수 있다. 배양액 중에는 효소 활성이 거의 나타나지 않으므로 이는 효소가 세포 표면에서 효소가 거의 유리되지 않은 상태에서 제한적으로 활성을 나타내는 것을 보여준다(제3도 참조).
또한 빙핵활성 단백질을 이용하여 그람음성 세균 슈도모나스 (Pseudomonas) 속 유래의 리파제(lipase)를 표면 발현할 수 있는 전환벡터 pASLP1을 제조한다. 먼저 리파제 유전자를 포함하는 플라스미드 pJH92(정국훈, 한국과학기술원 생물과학과, 박사학위논문, 1990)로부터 PCR 서브클로닝에 의해 리파제 유전자를 얻어 BamH I과 EcoR I으로 절단한 pASCM1과 연결시켜 빙핵활성 단백질과 리파제 융합단백질을 생산하는 전환벡터 pASLP1을 제조한다.
리파제의 표면 발현을 확인하기 위하여, 대장균을 pASLP1으로 형질전환하고 배양하여 표면 발현을 유도한다. 이때 리파제 효소의 활성을 큐프릭 아세테이트 방법으로 측정한다. 리파제가 발현되지 않은 숙주세포에 비해 리파제가 표면 발현된 대장균에서의 효소 활성이 높게 나타내므로 리파제가 표면 발현되면 직접 이중상 지질분해에 사용할 수 있다(제4도 참조).
또한 빙핵활성 단백질을 이용하여 인간화된 단선항체(single chain Fv antibody)를 표면 발현할 수 있는 전환벡터 pASIg1을 제조한다. 단선항체 유전자를 대장균에서 분비단백질로 단선항체를 생산할 수 있는 플라스미드 pLUV2로부터 얻고 앞서와 같은 방법으로 pASIg1을 제조한다.
단선항체의 표면 발현을 위하여, 대장균을 전환벡터 pASIg1으로 이용환하여 배양하고 표면 발현을 유도한다. 이 때 단선항체의 발현을 엘리자 방법으로 항원과의 결합 정도를 측정하여 확인한다(제5도 참조).
이와 같이 본 발명의 표면 발현 방법은 유용한 효소 및 항체의 생산에 매우 효과적이다. 위에 예시된 외래단백질은 빙핵활성 단백질을 이용한 표면 발현을 예시하는 것으로 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 본 발명의 표면 발현 방법을 통해 어떠한 외래단백질도 빙핵활성 단백질과 연결하여 표면 발현시킬수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.
하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
(표면발현 벡터 pGINP21M의 제조)
빙핵활성 단백질을 이용한 표면 발현 벡터를 제조하기 위하여, 본 유전자가 클론된 플라스미드 pGINP21(크기 7.1kb)을 이용하였다 (기탁기관 : 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행, 수탁번호 :KCTC 86089, 기탁일자 : 1994년 7월 13일). 여기에 외래단백질 유전자를 삽입할 수 있는 부위를 제공하기 위하여 피시알증폭 기술을 이용하여 새로운 세가지 제한효소 인식부위를 삽입하였다. 이때 피시알증폭 기기를 이용하여 증폭한 유전자 부위는 빙핵활성 단백질 유전자의 Kpn I 부위부터 빙핵활성 단백질 C-말단까지 약 1.7kb의 크기였다.
이 때 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머를 사용하였다. 서열번호 1의 프라이머에는 이미 빙핵활성 단백질 유전자에 존재하는 하나의 제한효소 Kpn I 인식 부위가 존재하고, 서열번호 2의 프라이머에는 새롭게 첨가할 세개의 제한효소 BamH I, Sma I, 및 EcoRI의 절단 부위가 순서대로 존재하도록 구성하였다. 삽입된 제한효소 부위는 유전자 증폭후에 빙핵활성 단백질의 서브클로닝을 쉽게하였다. 피시알 기기에 의해 증폭된 유전자를 제한효소 KpnI과 EcoRI으로 절단하고 이미 Kpn I과 EcoRI에 의해 절단된 pGINP21에 삽입하여 빙핵활성 단백질 유전자에 번역 끝 코돈이 없고 새로운 제한효소 인식부위가 첨가된 새로운 약 7.1kb 크기의 벡터를 제조하고 이를 pGINP21M이라 명명하였다(제1도 참조). 본 표면 발현 벡터로 대장균을 형질전환하고, pGINP21M을 함유하는 대장균을 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1996년 3월 27일에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 0239 BP).
[실시예 2]
(전환벡터 pASCM1의 제조)
빙핵활성 단백질을 이용하여 카복시메칠셀룰라제를 표면 발현할 수 있는 전환벡터 pASCM1을 제조하였다.
표면 발현 벡터 pGINP21M에 카복시메칠셀룰라제 유전자를 도입하기 위하여, BamHI과 EcoRI으로 잘라 백터를 준비하고 범용 클로닝 백터인 pUC19에 클론되어 있는 390bp크기의 카복시메칠셀롤라제의 N-말단을 암호하고 있는 유전자를 역시 BamHI과 EcoRI으로 절단하여 먼저 준비된 표면 발현 벡터 pGINP21M에 핵산 리가제(DNA ligase)로 연결하여 플라스미드 pGINP21CM1을 제조하였다. 카복시메칠셀룰라아제의 C-말단을 암호하고 있는 유전자는 또 다른 플라스미드 pUC19의 EcoRI 부위에 클론되어 있어 이를 EcoRI으로 잘라내어 카복시메칠셀룰라아제 N-말단이 클론된 플라스미드 pGINP21CM1의 EcoRI 부위에 삽입하여 완전한 카복시메칠셀룰라제 유전자를 빙핵활성 단백질 유전자의 C-말단 부위에 연결하였다. 이렇게 제조된 전환벡터 pASCM1을 제2도에 나타내었다. 본 표면 발현 전환벡터로 대장균을 형질전환하고, pASCM1을 함유하는 대장균을 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1996년 3월 22일에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 0237 BP).
[실시예 3]
(카복시메칠셀룰라제의 표면발현)
전환벡터 pASCM1을 대장균에 도입하여 형질전환하고 항생제 앰피실린 100mg/l이 첨가된 100ml 엘비배지(효모엑기스 5g/l, 트립톤 10g/l, 소금 5g/l, pH 7.0)를 포함한 500ml 삼각플라스크에서 증식하여 표면발현을 유도하였다.
카복시메칠셀룰라제 활성은 카복시메칠셀룰로즈를 기질로 사용하여 다음과 같은 디엔에스(DNS) 방법으로 측정하였다. 구체적으로 1%(w/v) 카복시메칠셀룰로즈 기질 용액을 50mM 시트로산 완충용액(citrate buffer, pH5.5)으로 제조하였다. 본 기질 용액을 0.5ml 취하여 효소 용액 0.5ml과 잘 혼합하고 물을 중탕하여 60℃에서 30분간 반응시켰다. 이 때 2,5-디니트로살리실산 7.5g, NaOH 14.0g, 로첼염 216.1g, 페놀 5.4g, Na2S2O55.9g을 순서대로 1L 순수한 물에 용해하여 제조한 디엔에스 용액을 3ml 첨가하고 끓는 물에 5분 동안 반응시켜 찬물에 냉각시켰다. 상온으로 냉각되면 파장 550nm에서 흡광도를 측정하였고 유리된 환원당을 포도당 표준곡선과 비교하여 환산하였다. 효소 1단위는 1분 동안 1μM의 포도당을 유리시키는 효소의 양을 나타내는 것이다.
이 때 세척된 대장균 전체를 효소원으로 사용한 경우와 대장균을 회수한 다음 파쇄하여 사용한 경우를 비교하면 양 경우에 있어서와 활성이 비슷하였다.
[실시예 4]
(전환벡터 pASLP1의 제조)
빙핵활성 단백질을 이용하여 리파제를 표면발현할 수 있는 전환벡터 pASLP1를 제조하였다.
상기 실시예2에서 제조한 pASCM1를 BamHI과 EcoRI으로 절단하고 카복시메칠셀룰라제 유전자를 제거하여 연결할 표면 발현 벡터를 준비하였다. 또한 리파제 유전자를 포함하고 있는 플라스미드 pJH92를 얻어 여기에 피시알 증폭기술을 이용하여 BamHI과 EcoRI 인식부위를 삽입하고 여기에서 BamHI과 EcoRI으로 자른 리파제 유전자를 얻어 이미 준비된 표면발현 벡터에 연결하여 빙핵활성 단백질과 리파제를 융합단백질 형태로 표면 발현할 수 있는 전환벡터 pASLP1를 제조하였다.
[실시예 5]
(리파제의 표면발현)
전환벡터 pASLP1을 대장균에 칼슘클로라이드 방법으로 도입하여 형질전환하고 실시예 3과 같이 배양하고 대장균을 증식하여 표면발현을 유도하였다. 이때 표면 발현된 리파제 효소활성은 큐프릭 아세테이트 방법을 따라 다음과 같이 측정하였다. 대장균 배양액 5ml을 취하여 5% 올리브 오일 기질이 녹아있는 이소옥탄 5ml과 혼합한뒤 40℃로 유지하며 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 수용액층과 오일층의 현탁액 3ml을 1ml 큐프릭 아세테이트 시약을 처리한 뒤 심하게 혼합하고 715nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 흡광도가 높을수록 리파제 효소 활성이 높은 것을 나타내는데, 이는 많은 오일이 분해되어 지질산이 많이 생성되기 때문이다. 표면 발현된 리파제의 활성을 제4도에 측정하여 나타내었다.
[실시예 5]
(전환벡터 pASIg1의 제조)
빙핵활성 단백질을 이용하여 인간화된 단선항체를 표면 발현할 수 있는 전환벡터 pASIg1의 제조하였다.
대장균에서 분비단백질로 생산할 수 있는 단선항체의 유전자를 포함하는 플라스미드 pLUV2를 SalI과 EcoRI으로 절단하고 SalI 부이에 BglII 부위를 새롭게 첨가할 수 있는 합성 올리고 DNA를 연결하였다. 표면 발현 벡터는 실시예 2에서 준비된 표면 발현 전환벡터 pASCM1을 EcoRI과 BamHI으로 카복시메칠셀룰라제의 유전자를 제거하여 준비하고, 이를 BglII와 EcoR I으로 자른 단선항체의 유전자와 연결하였다. 그 결과 빙핵활성 단백질과 단선항체를 융합단백질 형태로 표면 발현할 수 있는 전환벡터 pASIg1을 제조하였다.
[실시예 6]
(단선항체의 표면 발현)
전환벡터 pASIg1을 도입한 대장균을 실시예 3에서와 동일하게 표면 발현을 유도하고, 발현된 단선항체의 활성을 엘리자 방법(ELISA, Enzyme-linked Immunoassay)으로 단선항체와 이에 대한 항원과의 결합 정도를 측정하여 그 활성을 확인하였다. 항체가 발현된 세포와 발현벡터만 존재하는 세포간의 항원과의 결합을 비교하였다.
각각 동일한 세포 농도가 되도록 수확한 세포를 피비에스 완충용액(PBS buffer, pH 7.4)으로 씻고 다시 같은 완충용액 1.4ml로 현탁하였다. 이 세포 현탁액을 25, 50, 100, 200, 250 μl로 나누어서 항체(H69k) 결합의 한계 농도의 항원 pre-S2와 혼합하여 2시간 동안 방치하여 결합시켰다. 이를 상온에서 2분간 원심분리하고 상등액을 엘리자 판에 첨가하여 밤새 코팅하였다. 이때 코팅된 항원의 양을 미리 계산된 항체 H69k을 첨가하여 엘리자 방법으로 측정하였다. 밤새 코팅된 판은 2% 소혈청 알부민이 들어 있는 TBS-T 완충용액[0.05%(v/v) Tween-20, 10mM Tris pH7.4, 0.15M NaCl]으로 2시간 동안 블록킹시키고 TBS-T 완충용액으로 세척한 다음 1차 항원 H69k 10ng을 첨가하여 상온에서 2시간 결합시키고 결합되지 않은 항체는 동일한 완충용액으로 세척하여 제거하고 2차 홀스-래디쉬 퍼록시다제(horse-radish peroxidase)가 붙어 있는 2차 항체를 완충용액에 1000배 희석하여 결합시켰다. 퍼록시다제의 기질과 발색시약으로 H2O2와 OPD를 첨가하여 발색시키고 황산으로 반응을 정지시킨 다음 492nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정한 흡광도를 세포가 포함되지 않은 것을 100%로 하여 세포에 의한 항원의 결합을 동일 세포농도의 대조구 세포와 비교하여 제5도에 나타내었다.
본 발명에서 제조한 벡터 pGINP21M은 카복시메칠셀룰라제, 리파제 및 인간화된 단선항체를 대장균의 표면에 매우 효과적으로 발현하였다. 이는 세포의 표면에 집중적으로 발현되므로 단백질이 희석될 염려가 없으며 또한 발현을 단순히 세포를 세척하므로도 확인할 수 있어서 세포의 파쇄나 단백질의 분리·정제 과정을 거치지 않아도 매우 용이하게 이용할 수 있다.
또한 빙핵활성 단백질의 특성을 이용한 본 발명의 벡터는 외래단백질을 클로닝함에 있어서, 빙핵활성 단백질의 일차 서열상의 분비신호와 표적신호를 제외한 중앙에 반복된 구간을 필요에 따라 길이를 조절할 수 있으므로 외래단백질의 크기에 따라 또는 특정한 목적으로 외래단백질과 세포 표면간의 길이를 임의로 조장할 수 있는 탁월한 잇점이 있다.
또한 빙핵활성 단백질의 특성을 이용한 본 발명의 단백질 제조방법은 세포주기에 상관없이 빙핵활성 단백질과 함께 외래단백질이 안정적으로 발현되고 유지되며 다양한 세균 전부에 그 적용이 가능하다. 또한 이 방법은 외래단백질을 세균의 표면에 다량 발현하므로 그 확인이 용이하다.
상기와 같은 표면 발현 시스템을 이용하여 효율적인 생산할 수 있는 재조합 외래단백질로는 다양한 항원, 재조합 항체, 재조합 효소, 부착 또는 흡착 단백질(binding protein 또는 absorbent), 새로운 생리활성 물질을 스크링 하기위한 펩타이드 라이브러리(peptide library) 등을 들 수 있다. 또한 이는 그 응용성이 넓으므로 새로운 백신의 생산, 새로운 항펩타이드 항체 생산, 생물분리에 사용될 새로운 흡착제의 효과적인 생산, 세포표면에 고정화된 효소의 생산 등에 광범위하게 사용될 수 있다.
[서열표]
서열번호 : 1
서열의 길이 : 25
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)
서열
AAGTACAGGTACCGCAGGTCACGAG
[서열표]
서열번호 : 2
서열의 길이 : 34
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)
서열
GGAGTGCTTGAATTCCCCGGGATCCTTTACCTCT

Claims (14)

1) 빙핵활성 단백질의 N-말단 분비신호와 C-말단 표적신호를 암호하는 유전자를 포함하고 C-말단 유전자의 외래 유전자를 삽입할 수 있는 제한 효소 부위를 포함하는 표면 발현벡터에 외래유전자를 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계; 2) 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 얻는 단계; 3) 상기 형질전환체를 배양하는 단계;로 이루어지는 숙주세포의 표면에 외래단백질을 발현시키는 외래단백질의 발현방법.
제1항에 있어서, 빙핵활성 단백질은 슈도모나스 시링게(Pseudomonas syringae) KCTC 1832에서 유래한 것을 특징으로 하는 외래단백질의 발현방법.
제2항에 있어서, 표면발현벡터는 빙핵활성 단백질의 [N-말단 특이서열]-[C-말단 특이서열] 또는 [N-말단 특이서열]-[중간 반복구간 유전자]-[C-말단 특이서열]을 포함하는 것을 특징으로 하는 외래단백질의 발현방법.
제3항에 있어서, 빙핵활성 단백질 유전자의 중간반복구간의 길이를 조절함에 의해 외래단백질의 크기에 제한받지 않는 것을 특징으로 하는 외래단백질의 발현방법.
제1항에 있어서, 표면 발현 벡터는 pGINP21M인 것을 특징으로 하는 외래단백질의 발현방법.
제5항의 벡터 pGINP21M으로 대장균을 형질전환하여 얻은 형질전환체 (수탁번호 : 0239 BP).
제1항에 있어서, 재조합 벡터는 카복시메칠셀룰라제 유전자를 포함하는 pASCM1인 것을 특징으로 하는 외래단백질의 발현방법.
제1항에 있어서, 재조합 벡터는 리파제 유전자를 포함하는 pASLP1인 것을 특징으로 하는 외래단백질의 발현방법.
제1항에 있어서, 재조합 벡터는 인간화된 단선항체 유전자를 포함하는 pASIgl인 것을 특징으로 하는 외래 단백질의 발현방법
제1항에 있어서, 숙주세포는 대장균, 초산균, 슈도모나스속 균주, 잔토모나스속 균주, 어워니아속 균주 또는 자이모모나스속 균주에서 선택되는 것을 특징으로 하는 외래 단백질의 발현방법.
제1항에 있어서, 형질전환체는 제9항의 벡터 pASCM1으로 대장균을 형질 전환하여 얻은 대장균 형질전환체(수탁번호 : KCTC 0237 BP)인 것을 특징으로 하는 외래단백질의 발현방법.
제1항에 있어서, 형질전환체는 제8항의 벡터 pASLP1으로 대장균을 형질전환하여 얻은 대장균 형질전환체인 것을 특징으로 하는 외래단백질의 발현방법.
제1항에 있어서, 형질전환체는 제9항의 벡터 pASIg1으로 대장균을 형질전환하여 얻은 대장균 형질전환체인 것을 특징으로 하는 외래단백질의 발현방법.
제1항의 방법으로 발현한 외래단백질을 항체, 효소, 항원, 부착 단백질, 흡착 단백질 및 펩티드 라이브러리로 사용하는 용도.
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