KR20000006463A - 빙핵활성단백질을이용한Ｂ형간염바이러스표면항원과Ｃ형간염바이러스의코아(ｃｏｒｅ)항원의표면발현방법 - Google Patents
빙핵활성단백질을이용한Ｂ형간염바이러스표면항원과Ｃ형간염바이러스의코아(ｃｏｒｅ)항원의표면발현방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 미생물의 표면에 외래 단백질을 발현시키는 방법 및 그의 용도에 관한 것으로서, 상세하게는 빙핵활성 단백질 (ice-nucleation protein) 유전자를 이용하여 외래 단백질을 생산할 수 있는 표면 발현 벡터, 이를 이용하여 B형 간염 바이러스의 표면항원과 C형 간염바이러스의 코아 (core) 항원을 세포 표면에 발현시킨 대장균 또는 (살모넬라 타이피 Ty21a (Salmonella typhi Ty21a) 균주, 그들의
제조방법 및 백신으로서의 용도로 구성되며, 본 발명의 방법으로 생백신 균주 등의 표면에 병원체 유래의 항원 단백질을 발현시킴으로써 복합생백신이 개발될 수 있다.
Description
본 발명은 미생물의 표면에 외래 단백질을 발현시키는 방법 및 그의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 빙핵활성 단백질 (ice-nucleation protein) 유전자를 포함하는 표면 발현 벡터, 이를 이용하여 B형 간염 바이러스의 표면항원과 C형 간염바이러스의 코아(core) 항원을 세균 표면에 발현시킨 대장균 또는 살모넬라 타이피 Ty21a (Salmonella typhi Ty21a)균주, 그들의 제조방법 및 복합생백신으로 서의 용도에 관한 것이다.
최근 병원체의 항원 또는 항원 결정기를 유전공학적 방법을 이용하여 대량 생산이 가능한 세균에서 안정하게 발현시키고자 하는 연구가 많이 시도되었다. 특히 세포 표면에 외래 면역원을 발현시키는 과정으로 백신을 생산하려는 시도는 외래 단백질을 생산 및 분리·정제하는데 용이하고 그 면역원성도 높일 수 있어 새로운 백신의 개발에 유용하다.
지금까지 그람 음성 세균의 세포 표면 단백질이 외래 단백질의 생산에 주로 이용되어 왔다. 세포 표면 단백질의 유전자를 외래 유전자와 융합시켜 세포 내에 삽입하는 과정으로 세포 표면에 외래 단백질이 효과적으로 발현되는데, 주로 세균 외피 단백질인 Pho E, Lamb B 및 Omp A 단백질을 이용하여 외래 단백질 항원을 세포 표면에 발현시킨 연구가 보고되었다. 이외에도 그람 음성 세균의 표면에 존재하여 세균의 운동성이나 세포 부착 등에 관여하는 편모 (flagella), 필리 (pili) 및 핌브리아 (fimbriae) 등을 외래 단백질의 세포 표면 발현에 이용하고자 하는 시도가 있었다.
구체적으로, Pho E 단백질을 이용하여 구제역 바이러스의 VP1 단백질의 면역 부위를 발현시키고 이를 마우스에서 주입하여 중화 항체를 생성시킨 다음 그의 면역원성이 조사된 바 있었다 (Agterberg, et al., Vaccine, 8: 85-91, 1990). 또한, Lam B 단백질과 인간면역 결핍 바이러스 HIV gp110 에서 유래한 8가지의 펩타이드를 각각 연결하여 세포 표면에 발현시키고 상기와 동일한 과정으로 토끼에서 면역원성을 조사한 결과 1가지 펩타이드가 항체를 형성함을 확인하였다 (Charbit, et al., AIDS, 4: 545-551, 1990).
또한, 비병원성 살모넬라균을 이용하여 바이러스, 박테리아 또는 프로토조아 등의 항원을 발현시키고 직접 살모넬라균을 동물에서 주입하여 면역원성을 실험한 연구도 보고되었다. 이와 같이 약독화된 살모넬라균에서 발현된 면역원은 체액 면역뿐만 아니라 세포 면역 및 점막 면역도 유도할 수 있어 그 유용성이 높다. 실제로 인플루엔자 바이러스의 혈구응집소 에피토프 91-108 을 살모넬라 편모와 결합시켜 살모넬라 더블린 (Salmonella dublin) aro A 변이주에서 발현시킨 다음, 이 때 얻 은 생백신을 토끼에게 주입한 결과 항체가 형성될 뿐만 아니라 마우스에서는 50 % 의 방어능도 나타냄을 확인하였다 (McEwen, et al., Vaccine, 10: 405-411, 1992). 또한, HIV 의 env 유전자를 이용하여 18개 아미노산으로 구성된 에피토프를 살모넬라 편모 유전자와 결합시켜 살모넬라 더블린 (Salmonella dublin) SL5928 생백신주에서 발현시킨 다음 마우스에서 그 항체 형성능이 조사된 바 있었다 (Newton, et al., Res. Microbiol., 146: 203-216, 1995).
본 발명자들은 새로운 백신 등을 개발하기 위한 표면 발현 방법으로서, 슈도모나스 시링게 (Pseudomonas syringe : KCTC 1832 BP) 유래의 빙핵활성 단백
질을 새로운 표면 발현 모체로 이용한 표면 발현 벡터를 제작하고 이를 이용하여 B형 간염 바이러스의 표면항원과 C형 간염바이러스의 코아(core) 항원을 대장균 또는 살모넬라 타이피 Ty21a (Salmonella typhi Ty21a)균주의 표면에 발현시킨 다음 이들이 복합생백신으로서 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 복합생백신의 제조에 유용한 미생물의 표면에 외래 단백질을 발현시키는 방법을 제공함에 그 목적이 있다.
구체적으로, 본 발명은 빙핵활성 단백질 유전자를 이용한 표면 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하여 단백질의 발현을 유도함으로 유용한 외래 단백질을 발현시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 빙핵활성 단백질을 이용하여 세포 표면에 외래 단백질을 생산할 수 있는 표면 발현 벡터를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 외래 유전자를 삽입할 수 있는 표면 발현 벡터 pKIn 및 pKInc-1과 pKInc-2 및 그의 미생물 형질전환체를 제공한다.
본 발명은 병원체 유래의 항원 단백질로서 B형 간염 바이러스 표면항원 전체를 생산할 수 있는 표면 발현 벡터 pKIncWH 및 그의 미생물 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 병원체 유래의 항원 단백질로서 B형 간염 바이러스 표면항원의 주요 중화항체 형성 항원기를 생산할 수 있는 표면 발현 벡터 pKIncH, pKInHc, pKInH 및 이들로 형질전환된 미생물 형질전환체를 제공한다.
그리고, 본 발명은 병원체 유래의 항원 단백질로서 B형 간염 바이러스 표면항원의 주요 중화항체 형성 항원기와 C형 간염바이러스의 코아(core) 항원중 주요 항원기를 생산할 수 있는 표면 발현 벡터 pKInHcC 및 그들의 미생물 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 표면 발현 벡터는 다양한 미생물 균주에서 외래 단백질을 표면 발현할 수 있고, 이 때 사용하는 미생물로는 대장균, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이
피뮤리움, 비브리오 콜레라, 마이코박테리움 보비스, 시겔라, 락토바실러스, 리스테리아 모노싸이토제네스 등이 바람직하다.
구체적으로, 본 발명은 표면 발현 벡터인 pKInHc, pKIncH, pKIncWH, pKInH그리고 pKInHcC를 대장균에 형질전환시켜 얻은 형질전환체 및 표면 발현 벡터 pKInHc, pKIncH, pKIncWH, pKInH 그리고 pKInHcC를 살모넬라 타이피 Ty21a 균주에 형질전환시켜 얻은 형질전환체 살모넬라 타이피 Ty21a/pKInHc,
살모넬라 타이피 Ty21a/pKIncH, 살모넬라 타이피 Ty21a/pKIncWH, 살모넬라
타이피 Ty21a/pKInH 그리고 살모넬라 타이피 Ty21a/pKInHcC (수탁번호 :
KCTC 0471 BP, KCTC 0472 BP, KCTC 0473 BP, KCTC 0622 BP, KCTC 0619 BP)를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1998년 5 월 12일 및 1999년 5월 27일자로 기탁하였다.
본 발명은 상기 형질전환체를 이용하여 병원체 유래의 항원 단백질로서 B형 간염 바이러스 표면항원의 전체 또는 일부 그리고 C형 간염바이러스의 코아(core) 항원을 미생물의 표면에 발현시킨다.
본 발명의 방법으로 병원체 유래의 항원 단백질이 세포 표면에 발현된 미생물은 백신으로 사용될 수 있고, 이 때 미생물로서 생백신 균주를 사용하는 경우 복합생백신으로 개발될 수 있다.
도 1 은 본 발명의 표면 발현 벡터 pKInc-1 및 pKInc-2의 제작과정 및 그 구조를 나타낸 것이고,
도 2 는 본 발명의 표면 발현 벡터 pKIncH 및 pKIncWH의 제작과정 및 그 구조를 나타낸 것이고,
도 3 은 본 발명의 표면 발현 벡터 pKInHc의 제작과정 및 그 구조를 나타낸 것이고,
도 4 는 본 발명의 표면 발현 벡터 pKInH의 제작과정 및 그 구조를 나타낸 것이고,
도 5 는 본 발명의 표면 발현 벡터 pKIncC의 제작과정 및 그 구조를 나타낸 것이고,
도 6 의 A, B는 본 발명의 표면 발현 벡터로 형질전환 시킨 대장균과 살모넬라 타이피 Ty21a내에서 빙핵활성 단백질의 N-말단과 C-말단에 융합된 HBs 항원 단백질의 발현되는 양상을 S항원에 대한 특이적인 항체로 웨스턴 블러팅을 한 결과 나타낸 것이고 C는 HCV의 코아 항원 단백질의 발현을 하기의 순서로 이에 특이적인 항체로 웨스턴 블러팅한 결과를 나타낸 것으로 각 레인의 표면 발현 벡터는 하기와 같고,
(A) 및 (B)
레인 1 : pKInc-1
레인 2 : pKInH
레인 3 : pKInHc
레인 4 : pKIncH
레인 5 : pKInHcC
레인 6 : pKIncWH
(C)
레인 1 : pKInc-1
레인 2 : pKInHcC
도 7 은 여러 표면 발현 벡터로 형질전환시킨 대장균과 살모넬라 타이피 Ty21a의 표면에 빙핵활성 단백질의 N-말단과 C-말단을 매개로 HBs 항원의 표면발현을 S항원에 대한 특이 항체로 형광-활성 세포 선별 측정방법으로 측정한 결과이고,
도 8은 본 발명의 표면 발현 벡터로 형질전환시킨 살모넬라 타이피 Ty21a에서 항원의 발현이 확인된 일정량의 세균을 한 번(A) 또는 두 번(B) 투여한 마우스의 혈청의 S 항원에 대한 항체가를 나타낸 것으로, ?는 pKlnc-1, ▨는 pKlnH, ▧는 pKlnHc, ▩는 pKlncH, ▤는 pKlnHcC를 발현벡터로 이용한 것을 나타내고,
도 9는 본 발명의 표면 발현 벡터인 pKInHcC로 형질전환시킨 살모넬라 타이피 Ty21a에서 항원의 발현이 확인된 일정량의 세균을 한 번(▨) 또는 두 번(▧) 투여한 마우스의 혈청의 core 항원에 대한 항체가를 나타낸 것이고 ?는 표면발현 벡터 PKInc-1로 형질전환된 살모넬라 타이피 Ty21a의 세포에서 항원의 발현이 확인된 일정량의 세균을 투여한 마우스의 혈청을 core 항원에 대한 항체가를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 복합생백신 등을 개발하기 위하여, 병원체 유래의 항원 단백질을 미생물의 표면에 발현하는 방법을 제공한다.
우선 본 발명은 빙핵활성 단백질 (ice-nucleation protein)을 이용하여 외래 단백질을 융합 단백질 형태로 세포 표면에 발현할 수 있는 표면 발현 벡터를 제작한다.
빙핵활성 단백질은 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 어위니아 (Erwinia) 속,
잔토모나스 (Xanthomonas)속 등에 존재하는 세포 외막 단백질로서, 과냉각된 물에
존재할 경우 얼음의 형성을 촉진하는 기능을 가진다. 빙핵활성 단백질은 구조상으로 단백질의 중앙에 8개, 16개 또는 48개의 아미노산이 반복되는 서열이 있어 과냉각된 물 분자들이 얼음 입자를 잘 배열하게 하는 틀을 제공하고, 그의 N-말단과 C-말단에는 분비신호 및 표적신호가 있어 단백질이 세포 내막을 통과할 수 있게 한다. 구체적으로 빙핵활성 단백질은 총 1,200개의 아미노산으로 구성되는데, 상기 N-말단과 C-말단 사이에 존재하는 반복 서열은 빙핵 활성과 관련이 있고 그 길이가 조절될 수 있으며, N-말단은 단순히 세포 외막에 부착하는 기능을 가지고, C-말단은 단백질을 세포 외막까지 분비, 표적한다고 보고되어 있다 (Green, et al., Mol. Gen. Genet., 215: 165-172, 1988). 빙핵활성 단백질은 상기 특성으로 인하여 외래 단백질을 세포 표면에 발현시킬 수 있는 표면 발현 모체로서 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명은 빙핵활성 단백질을 이용한 표면 발현 벡터를 얻기 위하여, 슈도모나스 시링게의 빙핵활성 단백질 유전자가 클론된 기존의 플라스미드 벡터 pGINP21 (기탁번호 : KCTC 제 8608P호)을 이용하여 그의 중앙 반복구간 일부를 포함하는 N-말단과 C-말단을 암호화하는 유전자를 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭하였다. 다음 이 유전자를 기존의 발현 벡터 pKK223-3 에 삽입하여 빙핵활성 단백질의 중앙 반복구간 일부를 포함하는 부위와 세포 부착 부위 및 세포 외막으로의 분비 및 표적 기능을 가지는 부위를 포함하는 표면 발현 벡터를 제작한다. 상기 발현벡터 pKK223-3은 phamacia biotech의 상품으로 강한 tac 프로모터를 가지고 있으며 이는 lac 리프레서에 의해 조절이 되어 isopropyl-β-D-thiogalactoside[IPTG]을 배지에 첨가함으로서 발현이 유도가 되는 벡터이다. tac 프로모터의 아래로는 pUC8의 multicloning 부위가 있으며 뒤를 이어서 강한 rrnB 리보조말 터미네이터가 있다.
본 발명에 있어서는 상기 발현벡터 pKK223-3 이외에도 tac 프로모터를 이용한 다른 벡터를 이용할 수 있고 trc 프로모터를 이용한 플라스미드에 빙핵활성 단백 유전자를 삽입하고 외래유전자와 연결하여 외래 유전자의 표면 발현에 이용할 수 있다. 그외에도 T5 또는 T7 프로모터를 가진 벡터 들에 빙핵활성 단백질 유전자의 N-말단과 C-말단 그리고 B형 간염 바이러스의 표면 항원 유전자를 삽입한 후 대장균과 살모넬라 타이피 Ty21a에 형질전환시켜 배양함으로서 B 형 간염 바이러스 표면항원의 표면발현을 유도 확인할 수 있었다. 상기 tac프로모터를 이용한 벡터의 예로는 pDR540 벡터 (Pharmacia Biotech)가 특히 적합하고, trc 프로모터를 이용한 벡터의 예로는 pTrc99A 벡터 (Pharmacia Biotech)가 특히 적합하며, T7 프로모터를 이용한 벡터의 예로는 pET벡터 (Stratagene) 및 pGEMEX 벡터 (Promega)가 특히 적합하며, T5 프로모터를 이용한 벡터의 예로는 pQE 벡터 (Quagen)가 특히 적합하다.
이때 외래 유전자는 빙핵활성 단백질 유전자의 N-말단 끝에, N-말단과 C-말단 사이 또는 C-말단 끝에, 또는 양쪽 모두에 삽입될 수 있으며, 이로부터 융합 단백질이 세포 표면에 안정적으로 발현될 수 있다. 이외에도 빙핵활성 단백질의 반복구간의 길이를 조절하거나 각 삽입부위에 다양한 제한효소 인식부위를 삽입하여 다양한 표면 발현 벡터가 제조될 수 있다.
본 발명의 기본 표면 발현 벡터를 pKIn, pKInc-1과 pKInc-2라고 명명한다. (도 1참조) 구체적으로 본 발명은 상기 표면 발현 벡터가 외래 단백질을 세포 내에서 합성하고 세포 내막을 통과하여 안정적으로 세포 표면에 부착되는 것을 확인하기 위하여, 외래 유전자를 빙핵활성 단백질 유전자에 번역 코돈을 맞추어 접합하고 이를 미생물에 형질전환시켜 단백질의 발현을 유도한 다음 융합단백질이 미생물의 표면에 발현됨을 확인한다.
본 발명은 기본 표면 발현 벡터 pKIn, pKInc-1과 pKInc-2에 병원체 유래의 항원 단백질을 포함하여 다양한 외래 유전자를 삽입함으로써 복합생백신 등을 제조하는데 이용될 수 있는 재조합 표면 발현 벡터를 제조한다.
구체적으로, 본 발명은 상기 표면 발현 벡터 pKInc-2를 이용하여 빙핵활성 단백질의 C-말단에 B형 간염 바이러스의 전체 S 항원 유전자를 삽입한 표면 발현 벡터 pKIncWH를 제조한다. (도 2 참조)
먼저 B형 간염 바이러스의 S 항원 유전자가 클론되어 있는 벡터 (pUHB1)를 주형으로 이용한 중합효소 연쇄반응으로 전체 S 항원 유전자를 얻어 본 발명의 표면 발현 벡터 pKInc-2에 삽입한다. 상기 표면 발현 벡터 pKIncWH를 각각 대장균 및 살모넬라 타이피 Ty21a 균주 (장티푸스 예방백신주)등에 형질전환시켜 배양함으로써 B형 간염 바이러스 표면항원의 표면 발현을 유도한다.
상기 외래 단백질로서의 표면항원의 발현을 확인하기 위하여, 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(SDS-PAGE) 및 S 항원에 대한 항체로 웨스턴 블럿팅 (western immunoblotting)을 수행한다 이외에도 형광-활성 세포 선별방법 (FACScan)으로 세포의 표면에 단백질의 발현을 확인한다. 그 결과 S 항원 단백질이 세포 표면에 발현되고, 융합 단백질 (약 63 KDa) 분획이 S 항체에 특이적인 반응을 나타냄을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 기본 표면 발현 벡터 pKIn, pKInc-1과 pKInc-2를 이용하여 B형 간염 바이러스 S 항원중 주요 중화항체 형성 항원기 유전자를 삽입한 표면 발현 벡터 pKInH, pKInHc 및 pKIncH를 제작한다 (도 2, 3 및 4 참조).
먼저 B형 간염 바이러스의 S 항원 유전자가 클론되어 있는 벡터 (pUHB1)를 주형으로 이용한 중합효소 연쇄반응으로 중화항체를 생산하는 면역원 결정기에 해당하는 유전자를 증폭하여 상기와 같은 방법으로 기본 표면 발현 벡터 pKIn, pKInc-2과 pKInc-1, 즉 빙핵활성 단백질의 N-말단끝 혹은 C-말단끝과 빙핵활성 단백질의 N-말단과 C-말단 사이에 삽입한다.
상기 표면 발현 벡터 pKInH, pKIncH 또는 pKInHc를 각각 대장균 및 살모넬라 타이피 Ty21a 균주 등에 형질전환시켜 배양함으로써 B형 간염 바이러스 S 항원 결정기의 표면 발현을 유도한다. 또한, 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 S 항원에 대한 항체로 웨스턴 블럿팅을 수행하여 상기 항원의 발현을 확인한다. 그 결과 융합단백질 (pKInH: 약 29KDa, pKInHc: 약 37KDa, pKIncH: 약39KDa) 분획이 S 항체에 특이적인 반응을 나타냄을 확인하였다.
그리고, 본 발명은 상기 기본 표면 발현 벡터 pKInHc를 이용하여 C형 간염바이러스 코아(core) 항원중 주요 항원기 유전자를 삽입한 표면 발현 벡터 pKInHcC 를 제작한다. (제 5도 참조)
먼저 C형 간염 바이러스 구조단백질 유전자가 클론되어 있는 벡터 (p740)를 주형으로 이용한 중합효소 연쇄반응으로 중화항체를 생산하는 면역원 결정기에 해당하는 유전자를 증폭하여 상기와 같은 방법으로 기본 표면 발현 벡터 pKInHc에 삽입한다.
상기 표면 발현 벡터 pKInHcC를 각각 대장균 및 살모넬라 타이피 Ty21a 균주 등에 형질전환시켜 배양함으로써 B형 간염 바이러스 S 항원 결정기와 C형 간염 바이러스 코아(core) 항원중 주요 항원기의 표면 발현을 유도한다. 또한, 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 S 항원에 대한 항체와 HCV에 대한 항체로 웨스턴 블럿팅을 수행하여 상기 항원의 발현을 확인한다. 그 결과 융합단백질 (pKInHcC: 약 48KDa)분획이 S 항체와 HCV 항체에 특이적인 반응을 나타냄을 확인하였다.
본 발명에 있어서 pKIncH, pKInHc 및 pKInH에 삽입이 된 항원기 간의 차이점은 없으며 단지 항원기를 코딩하는 유전자 끝의 제한효소 부위가 다를 뿐이다. 이들을 이용하면 빙핵활성 단백질의 N-말단과 C-말단의 위치차이에 따른 항원기의 발현 효과의 차이와 더불어 C-말단을 제외한 N-말단만으로 항원기의 표면 발현을 알 수 있으며 또한, N-말단과 C-말단을 이용 두 종류 이상의 항원이 표면 발현되는지를 알 수 있다.
또한 본 발명은 상기 외래 단백질이 표면 발현된 미생물이 백신으로 사용될 수 있는지 확인하기 위하여, 이를 동물 체내에 주입하여 그의 면역원성을 조사한다. 구체적으로, 상기 표면 발현 벡터를 각각 대장균 또는 살모넬라 타이피 Ty21a 에 형질전환시켜 상기 항원의 발현이 확인된 균주를 마우스에 투여하고 일정 기일이 지난 다음 혈청을 취하여 혈청내 S 항원에 대한 항체와 코아 항원에 대한 항체의 생성을 엘리자 방법(ELISA, Enzyme-linked Immunosorbent assay)으로 확인하였다. 이 때 각각 동일한 세포 농도가 되도록 수확한 세포를 완충용액으로 여러 번 세척하고 세균을 마우스의 복강에 투여하였다.
상기 외래 단백질과 생백신의 제조에 사용된 균주는 빙핵활성 단백질을 이용한 표면 발현 및 이를 이용한 백신의 예로서 제시된 것이고 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 모든 종류의 외래 단백질 또는 균주도 표면 발현을 통하여 백신의 제조에 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다.
단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정이 되는 것은 아니다.
(실시예 1)표면 발현 벡터 pKIn, pKInc-1, pKInc-2의 제작
본 발명은 빙핵활성 단백질의 N-말단 혹은 N-말단과 C-말단을 이용한 표면 발현 벡터를 제작하기 위하여, 기존의 발현 플라즈미드 pGINP21(수탁번호 : KCTC 제 8608P호; 크기 7.1 kb)을 이용하였다. 우선 빙핵활성 단백질의 N-말단과 C-말단을 암호화하는 유전자를 얻기 위하여, 상기 발현 플라즈미드를 주형으로 사용하고 N-말단에는 서열 1 (5'-CGGAAGTCATGAATCTCGACAAGGCG -3') 및 서열 2 ( 5'-TCCCCCGGGAATTAGATCACTGTGGTT-3'), C-말단에는 서열 3 (5'-AAACTGCAGGCTGGTAAGAACCGTGTC-3') 및 서열 4 (5'-CCCAAGCTTCTTTACCTCTATCCAGTG-3') 그리고 서열 5 (5'-TCCCCCGGGGGCGGGCATGACTGCACC-3') 와 서열 6 (5'-AACTGCAGCTTTACCTCTATCCAGTG-3')의 염기서열을 가지는 올리고 뉴클레오타이드를 시발체로 이용한 중합 효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다.
N-말단에 대한 서열 1에는 발현벡터 pKK223-3에 존재하는 제한 효소 EcoRI 인식 부위가 존재하도록 구성하고, 서열 2의 시발체에도 역시 발현 벡터 pKK223-3에 존재하는 제한 효소 SmaI 인식 부위가 존재하도록 구성하였다. 또한, C-말단에 대한 서열 3의 시발체에는 발현벡터 pKK223-3에 존재하는 제한 효소 PstI 인식 부위가 존재하도록 구성하였고, 서열 4의 시발체에도 역시 발현벡터 pKK223-3에 존재하는 제한 효소 HindIII인식 부위가 존재하도록 구성하였으며, 서열 5의 시발체에도 발현벡터 pKK223-3에 존재하는 제한 효소 SmaI 인식 부위가 존재하도록 구성하였으며, 서열 6의 시발체에도 역시 발현벡터 pKK223-3에 존재하는 제한효소 PstI인식 부위가 존재하도록 구성하였다. 이때 증폭한 유전자 부위는 빙핵활성 단백질의 N-말단이 약 620bp, C-말단이 각각 약 240bp, 300bp의 크기를 갖는다.
상기 N-말단과 C-말단 유전자를 각각 제한효소인 EcoRI, SmaI 또는 PstI, HindIII 그리고 SmaI, PstI으로 절단 한 다음 제한 효소 EcoRI, SmaI 또는 PstI, HindIII 그리고 SmaI, PstI으로 절단된 발현 벡터 pKK223-3에 삽입하여 빙핵활성 단백질의 반복구간이 약간 포함된 N-말단만으로 구성이 된 약 4.7Kb 크기의 벡터와 N-말단과 C-말단 유전자로 구성된 약 5.0 Kb 크기의 발현 벡터를 제작하고 이를 기본 표면 발현 벡터 pKIn, pKInc-1과 pKInc-2로 명명하였다. 이때 표면 발현 벡터 pKInc-2는 Inpc 유전자 뒤에 링커 (linker GAT CAA CAA GGA GGA)와 외래 유전자의 삽입을 용이하게 하기 위해 여러 제한 효소인 BglII, NcoI, BamHI, EcoRI 절단 부위를 삽입하였다. 이렇게 제작된 표면 발현 벡터 pKIn, pKInc-1, pKIn-2 는 도 1 에 나타내었다.
(실시예 2)표면 발현 벡터 pKIncWH 의 제작
본 발명은 빙핵활성 단백질의 N-말단과 C-말단을 이용하여 B형 간염 바이러스의 전체 S 항원을 세균 표면에 발현할 수 있는 발현 벡터 pKIncWH를 제조하였다. 표면 발현 벡터 pKInc-2에 B형 간염 바이러스의 전체 S 항원 유전자를 도입하기 위하여, 범용 클로닝 벡터인 pUC8 (pUHB1)에 클론되어 있는 약 1.4 kb 의 B형 간염 바이러스 유전자를 주형으로 사용하고, 서열 7 (5'-CATGCCATGGA TGGAGAACATCACATA-3') 및 서열 8 (5'-CCGGAATTCTTAAATGTATAC ACCCAGA-3')의 염기 서열을 갖는 올리고 뉴클레오타이드를 시발체로 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하여 S 항원 유전자를 증폭시켰다. 이 때 증폭된 유전자 부위는 전체 S 항원 유전자인 약 680 bp 크기였다.
상기 서열 7 및 서열 8 의 시발체는 발현 벡터 pKK223-3에 존재하는 제한효소 NcoI, EcoRI 인식부위가 존재하도록 구성되었다. 상기 증폭된 B형 간염 바이러스의 S 항원 유전자를 제한효소 NcoI, EcoRI로 잘라 미리 준비된 발현 벡터 pKInc-2에 빙핵활성 단백질의 C-말단 유전자 부위에 번역코돈을 맞추어 연결하였다. 이렇게 제작된 표면 발현 벡터 pKIncWH는 도 2 에 나타내었다.
(실시예 3) B형 간염 바이러스의 전체 S 항원의 대장균 표면 발현
본 발명은 상기 표면 발현 벡터 pKIncWH를 이용한 세균에서 전체 S 항원의 표면 발현을 조사하기 위하여, 상기 발현 벡터를 대장균에 형질전환시킨 다음 항생제 암피실린 100 ㎎/L이 첨가된 50 ㎖의 엘비배지 (효모엑기스 5 g/L, 트립톤 10 g/L, 소금 5 g/L, pH 7.0)를 포함한 500 ㎖ 플라스크에서 증식시킴으로 표면 발현을 유도하였다.
빙핵활성 단백질의 N-말단과 C-말단과 융합된 S 항원의 세균 표면 발현은 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 S 항원에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅 (western immunoblotting)을 수행하여 확인하였다. 구체적으로 동일한 세포 농
도에서 얻은 단백질을 디네이쳐 (denature)시켜 시료를 준비하여 이를 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 분석한 다음 분획된 단백질들을 PVDF 멤브레인에 옮겼다. 단백질들이 옮겨진 PVDF 멤브레인을 블로킹 완충용액 (50 mM 트리스 염산, 5 % 스킴 밀크 (skim milk), pH 8.0)에서 1시간 동안 흔들어 블로킹시킨 다음 S 항원에 대한 염소 유래의 폴리클론 1차 항체를 블로킹 완충용액에 1000배 희석하여 16시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 멤브레인은 완충용액으로 세척하고 아비딘-바이오틴 (avidin-biotin)시약을 1시간 동안 반응시켜 다시 세척하였다. 세척된 멤브레인에 기질과 발색시약으로 H202와 DAB 용액을 첨가하여 발색시키고 S 항원에 대한 특이 항체와 상기 융합단백질간의 특이적인 결합을 확인하였다.(도 6 참조) 도면에서 보는 바와 같이, pKIncWH 플라즈미드에 의해서 약 63 KDa의 융합 단백질 밴드를 확인할 수 있었다.
또한 S 항원이 빙핵활성 단백질의 N-말단과 C-말단에 의해 대장균의 표면에 발현됨을 형광-활성 세포 선별 측정방법 (Fluorescence-activating cell sorting (FACS) flow cytometry)으로 확인하였다. 면역 형광 (immunofluorescence) 염색을 위하여 발현을 유도시킨 대장균을 동일한 세포 농도가 되도록 수확하고 세포를 완충용액 (PBS buffer, pH 7.4)으로 여러 번 세척한 다음, 1 % 소혈청 알부민을 함유하는 완충용액 1 ㎖에 부유시키고 S 항원에 대한 염소 유래의 폴리클론 1차 항체를 1000배 희석하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 세포들은 완충용액으로 여러 번 세척하고 1 % 소혈청 알부민을 함유하는 완충용액 1 ㎖ 에 부유시킨 다음 바이오틴이 결합되어 있는 2차 항체를 1000배 희석하여 4℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 다시 반응이 끝난 세포는 완충용액으로 여러 번 세척하고 1 % 소혈청 알부민이 들어있는 완충용액 0.1 ㎖ 에 부유시킨 다음 바이오틴에 특이적인 스트렙토아비딘-R-피코에리트린 (streptavidin-R-phycoerythrin) 염색시약을 1000배 희석하여 결합시켰다. 반응이 끝난 대장균을 여러 번 세척하고 형광-활성 세포 선별 측정방법으로 측정한 결과, 형질전환되지 않은 대장균과 비교되는 S 항원 단백질이 표면에 발현됨을 확인하였다.(도 7 참조) 도면에서 보는 바와 같이, 형질전환되지 않은 대장균과 살모넬라 타이피 Ty21a에 비교하여 여러 표면 발현 벡터에 의해 형질전환이 된 대장균과 살모넬라 타이피 Ty21a의 S 항원 표면 발현이 확인되었다.
(실시예 4) B형 간염 바이러스의 전체 S 항원의 살모넬라 표면 발현
본 발명은 상기 표면 발현 벡터 pKIncWH를 이용한 세균에서 전체 S 항원의표면 발현을 조사하기 위하여, 상기 발현 벡터를 살모넬라 타이피 Ty21a 균주에 형질 전환시킨 다음 항생제 암피실린 100 ㎎/L가 첨가된 50 ㎖ 의 트립틱 소이배지 (덱스트로즈 제외)를 포함하는 500 ㎖ 플라스크에서 증식시킴으로 표면 발현을 유도하였다.
실시예 3 과 동일한 과정으로 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 웨스턴 블럿팅 (도 6 참조) 그리고 형광-활성 세포 선별 측정방법으로 빙핵활성 단백질과 융합된 S 항원이 살모넬라 타이피 Ty21a 의 표면에 발현됨을 확인하였다. 면역 형광 염색을 위하여 발현을 유도시킨 살모넬라 타이피 Ty21a 를 S 항원에 대한 폴리클론 1차 항체, 바이오틴이 결합되어 있는 2차 항체, 바이오틴에 특이적인 스트렙토아비딘-R-피코에리트린 (streptavidin-R-phycoerythrin) 염색시약 등을 결합시켜 측정한 결과, 형질전환되지 않은 살모넬라 타이피 Ty21a 와 비교되는 S 항원이 표면에 발현됨이 확인되었다. (도 7 참조)
(실시예 5) 표면 발현 벡터 pKIncH 의 제작
본 발명에 의하여 빙핵활성 단백질의 N-말단과 C-말단을 이용하여 B형 간염 바이러스의 S 항원의 중화항체 형성 항원기를 세균 표면에 발현할 수 있는 표면 발현 벡터 pKIncH가 제작되었다. 구체적으로, 표면 발현 벡터 pKInc-2에 B형 간염 바이러스의 S 항원의 중화항체 형성 유전자를 도입하기 위하여 범용 클로닝 벡터인 pUC8 (pUHB1)에 클론되어 있는 B형 간염 바이러스 유전자를 주형으로 사용하고 서열 9 (5'-GGAAGATCTCAAGGTATGTTGCCCGTT-3') 및 서열 10 (5'-GGAAGATCTTTACCAGGACGATGGGA T-3')의 염기 서열을 가지는 올리고 뉴클레오타이드를시발체로 사용한 중합효소 연쇄반응을 수행하여 중화항체 형성 유전자를 증폭시켰다. 이 때 증폭된 유전자부위는 B형 간염 바이러스의 중화항체 형성 유전자 부위인 약 168bp 크기였다.
상기 서열 9 및 서열 10 의 시발체는 발현 벡터 pKK223-3에 존재하는 제한효소 BglII인식부위가 존재하도록 구성되었다. 상기 증폭된 B형 간염 바이러스의 중화항체 형성 유전자를 제한효소 BglII로 잘라 미리 준비된 발현 벡터 pKInc-2에 빙핵활성 단백질의 C-말단 유전자 부위에 번역코돈을 맞추어 연결하였다. 이렇게 제작된 표면 발현 벡터 pKIncH는 도 2에 나타내었다.
(실시예 6) B형 간염 바이러스의 중화항체 형성 항원기의 세포 표면 발현
본 발명은 상기 표면 발현 벡터 pKIncH를 이용한 세균에서의 표면 발현을 조사하기 위하여, 상기 발현 벡터를 각각 대장균과 살모넬라 타이피 Ty21a에 형질전환시키고 실시예 3 및 4 에서와 동일한 과정으로 단백질의 발현을 유도한 다음 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 S 항원에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블럿팅 (도 6 참조)을 수행하여 확인하였다. 도 6에서 보는 바와 같이 pKIncH 플라즈미드에 의해서 약 40KDa의 융합단백질 밴드를 확인 할 수 있었다. 또한, 형광-활성 세포 선별 측정방법으로 빙핵활성 단백질의 N-말단과 C-말단에 융합된 S 항원의 중화항체 형성 항원기가 발현되었음을 확인하였다. (도 7 참조)
(실시예 7) 표면 발현 벡터 pKInHc 의 제작
본 발명은 빙핵활성 단백질의 N-말단과 C-말단을 이용하여 B형 간염 바이러스의 S 항원 중 주요 중화항체 형성 항원기를 세포 표면에 발현할 수 있는 발현 벡터 pKInHc를 제작하였다. 구체적으로, 표면 발현 벡터 pKInc-1에 S 항원의 중화항체 형성 항원기 유전자를 도입하기 위해서 범용 클로닝 벡터인 pUC8 (pUHB1)에 클론되어 있는 B형 간염 바이러스 유전자를 주형으로 사용하고 서열 11 (5'-TCCCCCGGGCAAGGTATGTTGCCCGTT-3') 및 서열 12 (5'-GGTTC TGCAGCCAGGACGATGGGATGGG-3')의 염기 서열을 가지는 올리고 뉴클레오타이드를 시발체로 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하여 상기 중화항체 형성 항원기 유전자를 증폭하였다. 이 때 증폭된 유전자 부위는 B형 간염 바이러스의 중화항체 형성 항원기 유전자인 약 168bp 크기였다.
상기 서열 11의 시발체는 발현 벡터 pKK223-3 에 존재하는 제한효소 SmaI 인식부위 그리고 서열 12의 시발체는 제한효소 PstI 인식부위가 존재하도록 구성되었다. 상기 증폭된 B형 간염 바이러스의 중화항체 형성 항원기 유전자를 제한효소 SmaI 과 PstI 으로 잘라 준비된 발현 벡터 pKInc-1에 빙핵활성 단백질의 N-말단과 C-말단 사이에 번역 코돈을 맞추어 연결하였다. 이렇게 제작된 발현 벡터 pKInHc는 도3에 나타내었다.
(실시예 8) B형 간염 바이러스의 중화항체 형성 항원기의 표면 발현
본 발명은 상기 발현 벡터 pKInHc를 이용한 세균에서의 표면 발현을 조사하기 위하여, 상기 발현 벡터를 각각 대장균과 살모넬라 타이피 Ty21a 에 형질전환시키고 실시예 3 및 4 에서와 동일한 과정으로 발현을 유도한 다음 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 S 항원에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블럿팅을 수행하여 확인하였다. (도 6 참조)도면에서 보는 바와 같이 pKInHc 플라즈미드에 의해서 약37.7KDa의 융합단백질 밴드를 확인 할 수 있었다. 그리고 형광-활성 세포 선별 측정방법으로 빙핵활성 단백질과 융합된 S 항원의 중화항체 형성 항원기가 세균 표면에 발현되었음을 확인하였다. (도 7 참조)
(실시예 9) 표면 발현 벡터 pKInH의 제작
본 발명은 빙핵활성 단백질의 N-말단을 이용하여 B형 간염 바이러스의 S 항원중 주요 중화항체 형성 항원기를 세포 표면에 발현할 수 있는 발현 벡터 pKInH를 제작하였다. 구체적으로, 표면 발현 벡터 pKIn에 S 항원의 중화항체 형성 항원기 유전자를 도입하기 위해서 범용 클로닝 벡터인 pUC8 (pUHB1)에 클론되어 있는 B형 간염 바이러스 유전자를 주형으로 사용하고 서열 11 (5'-TCCCCCGGGCAAGGTATGTTGCCCGTT-3') 및 서열 13 (5'-CCCAAGC TTTTACCAGGACGATGGGAT-3')의 염기 서열을 가지는 올리고 뉴클레오타이드를 시발체로 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하여 상기 중화항체 형성 항원기 유전자를 증폭하였다. 이 때 증폭된 유전자 부위는 B형 간염 바이러스의 중화항체 형성 항원기 유전자인 약 168bp 크기였다.
상기 서열 11의 시발체는 발현 벡터 pKK223-3에 존재하는 제한효소 SmaI 인식부위 그리고 서열 13의 시발체는 제한효소 HindIIII 인식부위가 존재하도록 구성되었다. 상기 증폭된 B형 간염 바이러스의 중화항체 형성 항원기 유전자를 제한효소 SmaI 과 HindIII로 잘라 준비된 발현 벡터 pKIn에 빙핵활성 단백질의 N-말단 끝에 번역 코돈을 맞추어 연결하였다. 이렇게 제작된 발현 벡터 pKInH는 도 4에 나타내었다.
(실시예 10) B형 간염 바이러스의 중화항체 형성 항원기의 표면 발현
본 발명은 상기 발현 벡터 pKInH를 이용한 세균에서의 표면 발현을 조사하기 위하여, 상기 발현 벡터를 각각 대장균과 살모넬라 타이피 Ty21a 에 형질전환시키고 실시예 3 및 4 에서와 동일한 과정으로 발현을 유도한 다음 빙핵활성 단백질과 융합된 S 항원의 중화항체 형성 항원기가 세균 표면에 발현되었음을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 S 항원에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블럿팅을 수행하여 확인하였다. 도면에서 보는 바와 같이, pKInH 플라즈미드에 의해서 약 29KDa의 융합단백질 밴드를 확인 할 수 있었다. 그리고 형광-활성 세포 선별 측정방법으로 확인하였다. (도 7 참조)
(실시예 11) 표면 발현 벡터 pKInHcC의 제작
본 발명은 빙핵활성 단백질의 N-말단과 C-말단을 이용하여 B형 간염 바이러스의 S 항원중 주요 중화항체 형성 항원기와 C형 간염 바이러스의 코아 (core)항원중 주요 항원기를 세포 표면에 발현할 수 있는 발현 벡터 pKInHcC를 제작하였다. 구체적으로, 표면 발현 벡터 pKInHc에 C형 간염 바이러스의 코아 (core)항원중 주요 항원기 유전자를 도입하기 위해서 C형 간염 바이러스 구조유전자가 코딩된 p740을 주형으로 사용하고 서열 14 (5'-CCCAAGCTTGATCCAGG AAGCACAAATCCTAAA-3') 및 서열 15 (5'-CCCAAGCTTACCCAAATTAC GCGACCT-3')의 염기 서열을 가지는 올리고 뉴클레오타이드를 시발체로 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하여 상기 코아 항원기 유전자를 증폭하였다. 이 때 증폭된 유전자 부위는 C형 간염 바이러스의 코아 (core)항원중의 주요 항원기 유전자인 약 342bp 크기였다.
상기 서열 14의 시발체는 발현 벡터 pKK223-3에 존재하는 제한효소 HindIII인식부위 그리고 서열 15의 시발체는 제한효소 HindIII 인식부위가 존재하도록 구성되었다. 상기 증폭된 C형 간염 바이러스의 코아 (core)항원중의 주요 항원기 유전자를 제한효소 HindIII로 잘라 준비된 발현 벡터 pKInHc에 빙핵활성 단백질의 C-말단 끝에 번역 코돈을 맞추어 연결하였다. 이렇게 제작된 발현 벡터 pKInHcC는 도 5에 나타내었다.
(실시예 12)B형 간염 바이러스의 중화항체 형성 항원기와 C형 간염 바이러스의 코아 (core)항원중의 주요 항원기 표면 발현
본 발명은 상기 발현 벡터 pKInHcC를 이용한 세균에서의 표면 발현을 조사하기 위하여, 상기 발현 벡터를 각각 대장균과 살모넬라 타이피 Ty21a 에 형질전환시키고 실시예 3 및 4 에서와 동일한 과정으로 발현을 유도한 다음 빙핵활성 단백질과 융합된 S 항원의 중화항체 형성 항원기와 C형 간염 바이러스의 코아 (core)항원중의 주요 항원기가 세균 표면에 발현되었음을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 S 항원에 대한 항체와 코아 (core)항원에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블럿팅 (도 6 참조)을 수행하여 확인하였다. 도면에서 보는 바와 같이 pKInHcC 플라즈미드에 의해서 약 48KDa의 융합단백질 밴드를 확인 할 수 있었다. 그리고 형광-활성 세포 선별 측정방법으로 확인하였다. (도 7 참조)
(실시예 13) 복합생백신으로서의 유용성 조사
본 발명은 실시예 2, 5, 7, 9 그리고 11 에서 제작한 발현 벡터를 각각 살모넬라 타이피 Ty21a 에 형질전환시키고 실시예 3 및 4 에서와 같은 방법으로 항원의발현을 유도한 다음 빙핵활성 단백질과 융합된 B형 간염 바이러스의 전체 S 항원 또는 S 항원의 중화항체 형성 항원기 그리고 C형 간염 바이러스의 코아 (core)항원중의 주요 항원기의 항원성을 조사하였다. 구체적으로, 본 발명의 표면 발현 벡터 pKIncWH, pKIncH, pKInHc, pKInH 그리고 pKInHcC을 살모넬라 타이피 Ty21a 에 형질전환시켜 상기 항원의 발현이 확인된 일정 양의 세균을 BALB/c 마우스에 투여하고 일정 기일이 지난 다음 혈청을 취하여 혈청내 S 항원에 대한 항체와 코아 (core)항원에 대한 항체의 생성을 엘리자 방법 (ELISA, Enzyme-linked Immunosorbent assay)으로 확인하였다. 이 때 각각 동일한 세포 농도가 되도록 수확한 세포를 완충용액 (PBS buffer, pH 7.4)으로 여러 번 세척하고 2×109의 세균을 4-6주령의 BALB/c 마우스의 복강에 투여한 다음 BALB/c 마우스를 2군으로 나누어 첫 번째 군은 투여 2,3,5주 후에 혈청을 취하고, 두 번째 군은 투여 1주 후에 재차 투여한 다음 2,3,5주 후에 혈청을 취하였다. 그 결과 표면 발현 벡터인 pKIncWH, pKIncH, pKInHc, pKInH 그리고 pKInHcC로 형질전환 시킨 살모넬라를 투여한 각각의 BALB/c 마우스군의 혈청에서 엘리자 방법 (ELISA, Enzyme-linked Immunosorbent assay) 측정 결과, S항원에 대한 항체가와 core항원에 대한 항체가를 대조군과 비교시 양성의 결과를 나타냈다. (도 8, 9 참조)
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 미생물의 표면에 빙핵활성 단백질을 이용하여 병원체 유래의 항원 단백질 등을 효과적으로 발현시킴으로써 백신을 대량생산, 분리 및 정제하는데 유용하고, 미생물로 약독화된 생백신 균주 등을 사용하면 복합생백신으로도 개발될 수 있다. 이외에도 본 발명의 발현 벡터 및 방법은 각종 항원 및 항체의 스크리닝 및 효소의 표면 고정화 등이 용이하여 다양한 분야에 널리 이용될 수 있다.
(서 열 목 록)
서열번호 : 1
서열의 길이 : 26
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)
(서열 1)
5'-CGGAAGTCAT GAATCTCGAC AAGGCG-3'
(서 열 목 록)
서열번호 : 2
서열의 길이 : 27
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)
(서열 2)
5'-TCCCCCGGGA ATTAGATCAC TGTGGTT-3'
(서 열 목 록)
서열번호 : 3
서열의 길이 : 27
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)
(서열 3)
5'-AAACTGCAGG CTGGTAAGAA CCGTGTC-3'
(서 열 목 )
서열번호 : 4
서열의 길이 : 27
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)
(서열 4)
5'-CCCAAGCTTC TTTACCTCTA TCCAGTG-3'
(서 열 목 록)
서열번호 : 5
서열의 길이 : 27
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)
(서열 5)
5'-TCCCCCGGGG GCGGGCATGA CTGCACC-3'
(서 열 목 록)
서열번호 : 6
서열의 길이 : 26
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)
(서열 6)
5'-AACTGCAGCT TTACCTCTAT CCAGTG-3'
(서 열 목 록)
서열번호 : 7
서열의 길이 : 27
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)
(서열 7)
5'-CATGCCATGG ATGGAGAACA TCACATA-3'
(서 열 목 록)
서열번호 : 8
서열의 길이 : 26
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)
(서열 8)
5'-CCGGAATTCT TAAATGTATA CCCAGA-3'
(서 열 목 록)
서열번호 : 9
서열의 길이 : 27
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)
(서열 9)
5'-GGAAGATCTC AAGGTATGTT GCCCGTT-3'
(서 열 목 록)
서열번호 : 10
서열의 길이 : 26
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)
(서열 10)
5'-GGAAGATCTT TACCAGGACG ATGGGA T-3'
(서 열 목 록)
서열번호 : 11
서열의 길이 : 27
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)
(서열 11)
5'-TCCCCCGGGC AAGGTATGTT GCCCGTT-3'
(서 열 목 록)
서열번호 : 12
서열의 길이 : 28
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)
(서열 12)
5'-GGTTCTGCAG CCAGGACGAT GGGATGGG-3'
(서 열 목 록)
서열번호 : 13
서열의 길이 : 27
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)
(서열 13)
5'-CCCAAGCTTT TACCAGGACG ATGGGAT-3'
(서 열 목 록)
서열번호 : 14
서열의 길이 : 32
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)
(서열 14)
5'-CCCAAGCTTG ATCCAGGAAG CACAAATCCT AAA-3'
(서 열 목 록)
서열번호 : 15
서열의 길이 : 26
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)
(서열 15)
5'-CCCAAGCTTA CCCAAATTAC GCGACCT-3'
Claims (22)
- tac프로모터, trc프로모터, T7 프로모터 또는 T5 프로모터를 갖는 벡터에서 선택된 하나의 기본벡터에 빙핵활성 단백질 유전자를 삽입하여 빙핵활성 단백질의 중앙 반복구간 일부를 포함하는 부위, 세포 부착부위, 세포외막으로의 분비 및 표적기능을 갖는 부위를 포함하도록 제조된 것을 특징으로 하는 표면 발현 벡터.
- 제 1항에 있어서, tac 프로모터를 갖는 벡터는 pKK223-3 또는 pDR540인 것을 특징으로 하는 표면 발현벡터.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, tac 프로모터를 갖는 벡터는 pKK223-3 인 것을 특징으로 하는 표면발현벡터.
- 제 1항에 있어서, trc 프로모터를 갖는 벡터는 pTrc99A인 것을 특징으로 하는 표면발현벡터
- 제 1항에 있어서, T7 프로모터를 갖는 벡터는 pET 벡터 또는 pGEMEX 인 것을 특징으로 하는 표면발현벡터.
- 제 1항에 있어서, T5 프로모터를 갖는 벡터는 pQE 벡터인 것을 특징으로 하는 표면발현벡터.
- 제 1항에 있어서, 빙핵활성 단백질은 슈도모나스속, 어위니아속, 잔토모나스속에 속하는 균주의 단백질인 것을 특징으로 하는 표면발현벡터.
- 제 3항에 있어서 EcoR1 및 SmaI로 절단한 빙핵활성 단백질의 N 말단 유전자와 PstI 및 HindIII 로 절단한 빙핵활성 단백질의 C 말단 유전자를 EcoR1, SmaI, PstI 및 HindIII로 절단한 기본벡터 pKK223-3에 삽입하여 제조되는 것을 특징으로 하는 제 1도에 기재된 유전자 지도를 갖는 표면 발현 벡터 pKInc-1.
- 제 3항에 있어서, EcoR1 및 SmaI로 절단한 빙핵활성 단백질의 N 말단 유전자와 SmaI 및PstI로 절단한 빙핵활성 단백질의 C 말단 유전자를 EcoR1, SmaI 및 PstI로 절단한 기본벡터 pKK223-3에 삽입하여 제조되는 것을 특징으로 하는 제 1도에 기재된 유전자 지도를 갖는 표면 발현 벡터 pKInc-2.
- 제 9항의 표면 발현 벡터 pKInc-2에 삽입된 NcoI, EcoRI 절단 부위를 갖는 빙핵활성 단백질의 C-말단 유전자 부위에 제한효소 NcoI, EcoRI으로 절단한 B형 간염 바이러스의 전체 S 항원 유전자를 삽입한 것을 특징으로 하는 표면 발현 벡터 pKIncWH.
- 제 9항의 표면 발현 벡터 pKInc-2에 삽입된 BglII 절단 부위를 갖는 빙핵활성 단백질의 C-말단 유전자 부위에 제한효소 BglII로 절단한 B형 간염 바이러스의 S 항원 중 주요 중화항체 형성 유전자를 삽입한 것을 특징으로 하는 표면 발현 벡터 pKIncH.
- 제 8항의 표면 발현 벡터 pKInc-1에 삽입된 SmaI 및 PstI 절단부위를 갖는 빙핵활성 단백질의 C-말단 및 N-말단 사이 유전자 부위에 제한효소 SmaI 및 PstI로 절단한 B형 간염 바이러스의 S 항원 중 주요 중화항체 형성 유전자를 삽입한 것을 특징으로 하는 표면 발현 벡터 pKInHc.
- 제 3항의 표면 발현 벡터에 삽입된 SmaI 및 HindIII 절단부위를 갖는 빙핵활성 단백질의 N-말단 유전자 부위에 제한효소 SmaI 및 HindIII로 절단한 B형 간염 바이러스의 S 항원 중 주요 중화항체 형성 유전자를 삽입한 것을 특징으로 하는 표면 발현 벡터 pKInH.
- 제 12항의 표면 발현 벡터 pKInHc에 삽입된 HindIII 절단부위를 갖는 빙핵활성 단백질의 C-말단 유전자 부위에 제한효소 HindIII로 절단한 C형 간염 바이러스의 코아 항원 중 주요 항원기 유전자를 삽입한 것을 특징으로 하는 표면 발현 벡터 pKInHcC.
- 제 10항 내지 제 14항의 표면 발현 벡터중 하나의 벡터를 대장균, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이피뮤리움, 비브리오 콜레라, 마이코박테리움 보비스, 시겔라, 락토바실러스, 리스테리아 모노싸이토제네스로 구성된 미생물에서 선택된 하나의 미생물에 형질전환시킨 형질전환체.
- 제 15항에 있어서, 제 10항의 표면 발현 벡터 pKIncWH로 형질전환된 살모넬라 타이피 Ty21a /pKIncWH(KCTC 0473 BP).
- 제 15항에 있어서, 제 11항의 표면 발현 벡터 pKIncH로 형질전환된 살모넬라 타이피 Ty21a /pKIncH(KCTC 0472 BP).
- 제 15항에 있어서, 제 12항의 표면 발현 벡터 pKInHc로 형질전환된 살모넬라 타이피 Ty21a /pKInHc(KCTC 0471 BP).
- 제 15항에 있어서, 제 13항의 표면 발현 벡터 pKInH로 형질전환된 살모넬라 타이피 Ty21a /pKInH(KCTC 0622 BP).
- 제 15항에 있어서, 제 14항의 표면 발현 벡터 pKInHcC로 형질전환된 살모넬라 타이피 Ty21a /pKInHcC(KCTC 0619 BP).
- 제 16항 내지 제 20항의 어느 하나의 형질전환된 살모넬라 Ty21a를 배양하여 빙핵활성 단백질의 발현을 유도함으로서 병원체 유래의 항원 단백질을 포함한 외래 단백질을 미생물의 표면에 발현시키는 방법.
- 제 21항의 방법에 의하여 병원체 유래의 항원 단백질을 포함한 외래 단백질이 표면에 발현된 미생물을 이용한 백신.
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