DE102013013609A1

DE102013013609A1 - Autodisplay einer aktiven Lipase aus Burkholderia cepacia auf Mikroorganismen

Info

Publication number: DE102013013609A1
Application number: DE102013013609.1A
Authority: DE
Inventors: Joachim José; Eva Kranen; Christian Detzel
Original assignee: Zyrus Beteiligungs GmbH and Co Patente I KG
Current assignee: Zyrus Beteiligungs GmbH and Co Patente I KG
Priority date: 2013-08-09
Filing date: 2013-08-09
Publication date: 2015-03-05

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Mikroorganismen, die aktive Lipasen auf ihrer Oberfläche präsentieren. Die Mikroorganismen wurden mit Hilfe von entsprechenden Plasmiden hergestellt, die Abschnitte umfassen, die für ein Signalpeptid, eine Lipase oder Foldase, optional eine Proteaseerkennungsstelle, einen Transmembranlinker sowie eine Transporterdomäne eines Autotransporters oder eine Variante davon codieren. Die Mikroorganismen weisen mit der Transporterdomäne eines Autotransporters verbundene Lipasen und für die korrekte Faltung der Lipase erforderliche Foldasen auf, die ebenfalls mit einer von der Lipase unabhängigen Transporterdomäne eines Autotransporters verbunden sind. Solche Mikroorganismen können beispielsweise vorteilhaft bei der Umsetzung von Triglyceriden in Glycerin und Fettsäuren eingesetzt und aus einer Reaktionsmischung zurückgewonnen werden.

Description

Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft Mikroorganismen, die auf ihrer dem extracellulären Medium entgegen gerichteten Zelloberfläche eine Lipase und eine für die Lipase spezifische Foldase aufweisen. Beide Proteine sind Fusionsproteine mit Autotransportern, mit deren Hilfe die Proteine an die Zelloberfläche gebracht und dort verankert werden.
Hintergrund der Erfindung
Lipasen, einschließlich der Lipase aus Burkholderia cepacia, sind seit vielen Jahren Gegenstand intensiver biologischer Forschung, da sie ein großes Potential für Anwendungen in industriellen Prozessen bieten. Der Einsatz von Lipasen, insbesondere solchen Lipasen, die eine korrekte Faltung erfordern um ihre katalytische Aktivität ausbilden zu können, ist für derartige Prozesse mit großen Schwierigkeiten verbunden, da die Lipase für die Faltung ein Chaperon benötigt. Dieses Chaperon wird auch als Lipase-spezifische Foldase bezeichnet.
Das Autodisplay ist ein in jüngerer Vergangenheit entwickeltes Verfahren zur Expression einer Vielzahl von Passagierproteinen an der Oberfläche von E. coli. Mit diesem Verfahren können anschließende Reinigungsschritte, die zur Isolation des gewünschten Proteins erforderlich sind, entfallen. Wenn die gewünschten Enzyme als Passagiere verwendet werden, können die entsprechenden Zellen einfach als Ganzellbiokatalysatoren eingesetzt werden. Enzyme, die über ein Oberflächendisplay erzeugt werden, werden häufig durch die Verankerung in der äußeren Membran von beispielsweise E. coli stabilisiert.
Lipolytische Enzyme sind attraktive biotechnologische Werkzeuge. Unter diesen haben Lipasen (Triacylglycerolacylhydrolasen EC 3.1.1.3) die die Hydrolyse von Triglyceriden in wässrigem Medium unter Freisetzung von Fettsäuren und Glycerol oder die umgekehrte Reaktion in organischen Lösungsmitteln katalysieren besonderes Interesse geweckt, da diese Enzyme meistens auch eine hohe Enantio- und/oder Regioselektivität aufweisen. Weitere Reaktionen, die mit Hilfe von Lipasen katalysiert werden können sind Acidolysen, Alkoholysen, Glycerolysen und Umesterungen. Der Vorteil der Verwendung von Lipasen für diese Umsetzungen besteht einerseits in der hohen katalytischen Aktivität der Proteine und andererseits in deren Stabilität gegenüber Temperaturschwankungen in organischen Lösungsmitteln.
Interessanterweise hängt die Aktivität von Lipasen häufig von einer Lipidwassergrenzfläche ab. In einem enzymatisch inaktiven Stadium bedeckt ein Deckel das aktive Zentrum der Lipase. Bei Kontakt mit einer Lipidwassergrenzfläche öffnet sich dieser Deckel, so dass das Substrat das aktive Zentrum erreichen kann.
Lipasen kommen heute in zahlreichen industriellen Anwendungen zu Einsatz, wie beispielsweise der Lebensmittelindustrie, der Herstellung von Papier, der Herstellung von Pharmazeutika oder der Waschmittelindustrie. Zudem wurden Lipasen zur Hydrolyse von Pflanzenfetten für die Herstellung von Biodiesel erfolgreich getestet. Trotz der vielfältig vorhandenen Anwendungen sind bisher nicht mehr als 20 Lipasen eingesetzt worden. Dies ist in den erforderlichen teilweise sehr zeitaufwändigen Reinigungsverfahren zur Herstellung reiner Enzympräparate begründet. Die Herstellung der Lipasen stellt daher für deren Verwendung in industriellen Prozessen ein erhebliches Hindernis dar.
Viele Lipasen, insbesondere solche aus Burkholderia und Pseudomonas-Spezies, weisen in ihrer aktiven Form vorteilhafte Eigenschaften in Bezug auf ihre thermische Stabilität, ihre pH-Toleranz in basischen Medien und ihre hohe Substratspezifität auf. Diese Eigenschaften machen solche Lipasen zu interessanten Zielen für Biokatalysatoren.
Diese erwähnten Lipasen benötigen Lipase-spezifischen Foldasen, um eine Korrekte Faltung der Lipase zu gewährleisten. In Abwesenheit solcher Foldasen werden beispielsweise bei der die heterologen Expression von Burkholderia cepacia Lipase in E. coli nur geringe Mengen an aktiver löslicher Lipase erhalten, während der überwiegende Anteil des Enzyms in Form von unlöslichen Einschlusskörperchen (inclusion bodies) exprimiert wird. Signifikante Anteile von aktiver Lipase konnten nur mit Hilfe eines zusätzlichen in-vitro-Rückfaltungsprotokolls erhalten werden (Quyen (1999)).
Ein innovativer Weg zur Zugänglichmachung des synthetischen Potentials von Lipasen ist das Display der Enzyme auf der Oberfläche von lebenden Zellen, insbesondere auf E. coli-Zellen. Da das Enzym gegenüber seinem Substrat direkt zugänglich ist, können mit Hilfe dieser Technologie kostenaufwändige Reinigungen vermieden werden. Wilhelm et al. (2007) konnte das LipH-Chaperon von P. aeruginosa in aktiver Form auf der Oberfläche von E. coli exprimieren, wobei als Autotransporter EstA verwendet wurde. Mit Hilfe dieser mit Lipasespezifischer Foldase besetzten Zellen konnten gereinigte, aber denaturierte Lipasen in die aktive Form gefaltet werden. Yang et al. (2010) konnte mit Hilfe von Autotransportern aktive P. aeruginosa und B. cepacia-Lipasen auf der Oberfläche von E. coli verankern. Die Lipase konnte mit Hilfe einer spezifischen Foldase, die ebenfalls in den Zellen exprimiert wurde, gefaltet und die Aktivität der Lipase auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden.
Mit Hilfe der Autodisplay-Technology war es möglich, aktive menschliche Hyaluronidasen in E. coli zu exprimieren. Diese Enzyme sind dafür bekannt, dass sie bei der Expression mit Hilfe von anderen Techniken ”inclusion bodies” bilden.
Eine der herausragenden Eigenschaften des Autodisplaysystems ist die Mobilität des β-Barrels, das als Anker in der äußeren Membran dient. Dieser Anker ermöglicht eine selbstgetriebene Dimerisierung oder Multimerisierung von Einheiten zu aktiven oder funktionellen Enzymen auf der Oberfläche von E. coli, selbst wenn diese als Monomere exprimiert werden. Beispiele von selbstgetriebener Dimerisierung oder Multimerisierung von Passagierproteinen auf der Zelloberfläche sind das Display von aktiven dimerisierten Adrenodoxinen (lose (2002)) oder multimeren Nitrilasen (Detzel (2011)).
Bisher ist kein Beispiel bekannt, in dem mit Hilfe der Autodisplay-Technology verschiedene Enzyme auf der Zelloberfläche exprimiert werden konnten die funktionell zusammenwirken, insbesondere in einer Form, in der eines der oberflächenverankerten Enzyme eine korrekte Faltung eines anderen oberflächenverankerten Enzyms bewirkt. Die bisherigen Ansätze zur Expression von Lipasen auf E. coli befassen sich mit der Expression von entweder der Lipase oder der spezifischen Foldase auf dem E. coli-Trägersystem. Der zweite Proteinbestandteil wird anschließend der Mischung zugegeben. Selbst wenn mit dieser Technologie die Herstellung eines der Enzyme vereinfacht werden kann, besteht für die Herstellung des zweiten Enzym immer noch ein erheblicher Aufwand. Alternativ konnte das Foldaseenzym für eine spezielle Lipase in E. coli exprimiert und auf der Zelloberfläche eine aktive Lipase erzeugt werden. Es ist jedoch unklar, ob sich diese Ergebnisse auf andere Lipasen übertragen lassen, da die korrekte Faltungsinformation über die Zellwand transportiert werden muss. Das dies möglich ist erscheint für eine Vielzahl von Lipasen unwahrscheinlich.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand daher darin, ein System zu schaffen, mit dessen Hilfe sowohl die Foldase als auch die Lipase auf der Oberfläche von Zellen exprimiert werden kann, um auf der Zelloberfläche eine aktive Lipase zu generieren. Entsprechende Zellen lassen sich einfach vervielfältigen und erfordern keinerlei zusätzliche Schritte für die Aktivierung der Lipase. Zudem können, abhängig vom Verwendungszweck, die Mikroorganismen ebenso beispielsweise durch einfache Filtration aus dem Reaktionsmedium zurückgewonnen werden, was einen weiteren Vorteil darstellt.
Bisher werden Mikroorganismen, die sowohl mit Hilfe eines Autotransportersystems auf die Zelloberfläche aufgebrachte Lipasen als auch durch ähnliche oder gleiche Autotransportersysteme auf die Zelloberfläche aufgebrachte spezifische Foldasen aufweisen, im Stand der Technik weder beschrieben noch vorgeschlagen.
Darstellung der Erfindung
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen können den abhängigen Ansprüchen entnommen werden.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird gemäß einem ersten Aspekt durch ein Nucleinsäuremolekül gelöst, dass die folgenden Bestandteile umfasst:

(1) einen Abschnitt, der ein Signalpeptid codiert,
(2) einen Abschnitt, der eine Lipase oder Foldase codiert,
(3) optional einen Abschnitt, der eine Protease-Erkennungsstelle codiert,
(4) einen Abschnitt, der einen Transmembranlinker codiert, und
(5) einen Abschnitt, der eine Transporterdomäne eines Autotransporters oder einer Variante davon codiert, wobei das Signalpeptid, wenn Abschnitt (2) eine Lipase codiert, gegenüber der Lipase heterolog ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Nukleinsäuremolekül Teil eines rekombinanten Plasmids.
Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung betreffen Proteine bzw. Polypeptide, die durch Transkription der entsprechenden Nukleinsäuremoleküle erhältlich sind, sowie Mikroorganismen, die sowohl ein Polypeptid in Form einer Lipase als auch ein Polypeptid in Form einer für die Lipase spezifischen Foldase, die aus einem der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuremoleküle erhältlich sind, exprimiert oder unter Verwendung einer entsprechenden Kombination von Nucleinsäuremolekülen transformiert worden ist. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Membranpräparat solcher Mikroorganismen. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hydrolyse von Lipiden mit Hilfe einer Lipase, das die Schritte (i) Bereitstellen eines Mikroorganismus', wie vorstehend beschrieben, oder eines Membranpräparats, wie vorstehend beschrieben, und (ii) Inkontaktbringen des Mikroorganismus und/oder des Membranpräparates mit einem oder mehreren Lipasesubstraten unter Bedingungen, die mit der Lipaseaktivität kompatibel sind, umfasst.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung entsprechender Mikroorganismen und Membranpräparate.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Nukleinsäuremolekül mit einer Sequenz zur Expressionsregulation funktionell verbunden. In einer bevorzugten Ausführungsform verweist der Begriff ”Sequenz zur Expressionsregulation”, wie hier gebraucht, auf eine Nukleinsäuresequenz, welche die Expression eines Nukleinsäuremoleküls, vorzugsweise strangabwärts von der Sequenz zur Expressionsregulation, regulieren kann. Die Sequenz zur Expressionsregulation kann beispielsweise ein Promotor sein. Der Fachmann ist mit zur Expressionsregulation geeigneten Sequenzen und Verfahren zum funktionellen Verbinden dieser Sequenzen mit einem Nukleinsäuremolekül vertraut. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind insbesondere Expressionsregulationssequenzen bevorzugt, die für Expressionsregulatoren kodieren, die sich mit Hilfe der Induktoren Isopropylthioglucopyranosid (IPTG) oder Arabinose, insbesondere IPTG, aktivieren lassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verweist der Begriff ”heterolog”, wie hier gebraucht, auf ein Nukleinsäuremolekül, das unter Verwendung gentechnischer Verfahren konstruiert wurde, beispielsweise durch Zusammenfügen einer Sequenz zur Expressionsregulation und einer zu exprimierenden Sequenz, die normalerweise nicht dieser Sequenz zur Expressionsregulation untersteht, oder durch Verwenden einer Sequenz, die bezüglich der ursprünglichen Sequenz eine Punktmutation aufweist. Wenn auch nur ein Abschnitt eines Konstrukts als heterolog bezeichnet wird, impliziert das folglich, dass das gesamte Konstrukt heterolog ist. Der Fachmann ist mit gentechnischen Verfahren vertraut.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform verweist der Begriff ”heterolog”, wie hier gebraucht, auf ein Polypeptid codierendes Nukleinsäuremolekül, das mit einer Sequenz zur Expressionsregulation zusammengefügt ist, und/oder eine fusionierte Sequenz, die von einem anderen Organismus als die Sequenz zur Expressionsregulation stammt und zu exprimieren ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”heterolog”, wenn er im Zusammenhang mit einem Signalpeptid in Bezug auf eine Lipase gebraucht wird, dass der Abschnitt des Nukleinsäuremoleküls, das das Signalpeptid codiert, von einem anderen Organismus als der Abschnitt, der die Lipase codiert, gewonnen oder genommen wurde. Beispielsweise ist das Signalpeptid gegenüber der Lipase heterolog, wenn es aus E. coli stammt, die Sequenz der Lipase aber von B. cepacia gewonnen wurde. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”heterolog”, wie hier gebraucht, dass die als heterolog bezeichnete Nukleinsäuresequenz von einem Organismus stammt, der von dem Wirt oder vorgesehenen Wirt, der zur Expression oder Vermehrung dieser Nukleinsäuresequenz verwendet wird, verschieden ist.
Der Begriff ”Lipase” verweist auf ein Enzym der Klasse EC 3.1.1.3. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Abschnitt, der eine Lipase codiert, um einen Abschnitt, der eine Lipase aus Burkholderia cepacia codiert, besonders bevorzugt eine Lipase aus Burkholderia cepacia ATCC 21808. Die vollständige Sequenz der Lipase aus B. cepacia ist in der Gene Bank unter FJ638612 hinterlegt. Im Rahmen der hier beschriebenen Untersuchungen wurde bei der Analyse der Gesamtsequenz dieses Peptids festgestellt, dass es ein klassisches Signalpeptid an seinem N-Terminus aufweist. Da dieses Signalpeptid mit dem im Autodisplay verwendeten Signalpeptid wechselwirkt und den Transport über die Zellmembran stören kann, wurden die ersten 120 Basenpaare der Lipasepeptidsequenz entfernt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Abschnitt, der eine Lipase codiert, daher gegenüber der natürlichen Sequenz verkürzt, besonders bevorzugt um etwa 120 Basenpaare. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform weist der Abschnitt (2) eine Sequenz gemäß SEQ ID No. 1 auf. Bei der Lipase, für die der Anschnitt (2) des Nukleinsäuremoleküls codiert, handelt es sich vorzugsweise um eine Lipase gemäß SEQ ID No. 2.
Bei einer ”Foldase” handelt es sich um ein Protein, das die korrekte Faltung eines Enzyms gewährleistet. Die Foldase, für die der Anschnitt (2) im vorstehend beschriebenen Nukleinsäuremolekül codiert, ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorzugsweise eine Foldase aus Burkholderia cepacia, besonders bevorzugt eine für die korrekte Faltung der Burkholderia cepacia Lipase spezifische Foldase. Ganz besonders bevorzugt weist der die Foldase codierende Abschnitt (2) an seinem 5'-Ende eine Verkürzung auf, insbesondere eine Verkürzung um etwa 200 bis 210 Basenpaare. Zum Beispiel weist die Lipase spezifische Foldase aus B. cepacia einen N-terminalen Membrananker von 70 Aminosäuren auf. Dieser wird, um ein korrektes Oberflächendisplay zu erleichtern, im entsprechenden Nukleinsäuremolekül entfernt. Bei der Foldase, für die der Anschnitt (2) des Nukleinsäuremoleküls codiert, handelt es sich vorzugsweise um eine Foldase gemäß SEQ ID No. 3.
Wenn im Vorstehenden ausgeführt wurde, dass das Nucleinsäuremolekül eine Lipase oder Foldase codiert, so ist ”oder” ausschließlich zu verstehen, dass d. h., das Nukleinsäuremolekül enthält entweder einen für eine Lipase oder eine Foldase codierenden Abschnitt.
Vorzugsweise ist die Foldase oder Lipase mit einer Transporterdomäne eines Autotransporters fusioniert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verweist der Begriff ”Signalpeptid”, wie hier gebraucht, auf eine Sequenz von Aminosäuren, vorzugsweise am N-Terminus eines Polypeptids, die bewirkt, dass das Polypeptid, wenn es im Zytosol einer Wirtszelle exprimiert wird, zu einem bestimmten Kompartiment der Zelle, vorzugsweise einem vom Zytosol verschiedenen Kompartiment, transloziert wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine gramnegative Bakterienzelle, insbesondere E. coli, und das Signalpeptid bewirkt, dass das entstehende oder fertige Polypeptid in das Periplasma oder die äußere Membran der gramnegativen Bakterienzelle transloziert wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verweist der Begriff ”Protease-Erkennungsstelle”, wie hier gebraucht, auf ein bestimmtes Aminosäurensequenzmotiv in einem Polypeptid, wobei dieses Sequenzmotiv von besagter Protease in spezifischer Weise derart erkannt wird, dass sie anbindet und das Polypeptid spaltet.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es ebenso bevorzugt, wenn der Begriff ”Transmembranlinker”, wie hier gebraucht, auf einen flexiblen Polypeptidabschnitt verweist, der zur Verbindung der Autotransporterdomäne mit der Lipase oder Foldase dient, jedoch flexibel genug ist, um ein unabhängiges Falten und/oder Transportieren der Lipase oder Foldase zu ermöglichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verweist der Begriff ”Transporterdomäne eines Autotransporters” auf eine Domäne, die verwendet werden kann, um das Expressionsprodukt des Nukleinsäuremoleküls zu erhalten, wenn es im Inneren der Zelle, vorzugsweise im bakteriellen Zytoplasma, ribosomal synthetisiert und zu der äußeren Membran der Zelle, vorzugsweise zu der Seite der äußeren Membran, die der Zellumgebung ausgesetzt ist, transloziert wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bewirkt die Transporterdomäne, dass sich das besagte Expressionsprodukt an der Außenfläche der äußeren Membran befindet. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Transporterdomäne eines Autotransporters ein Protein, dass sich an der äußeren Membran der Zelle befindet, und der eine Lipase oder Foldase codierende Abschnitt ist Teil einer Domäne, Schleife oder eines anderen Teils der Transporterdomäne oder damit fusioniert, so dass die Lipase oder Foldase an der Oberfläche der Zelle präsentiert wird. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Transporterdomäne eines Autotransporters ein Protein eines Systems, das verwendet werden kann, um Polypeptide an der Oberfläche einer Zelle zu präsentieren.
Der Ausdruck ”präsentiert” ist in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung so zu verstehen, dass die Lipase in das den Mikroorganismus oder die Mikroorganismen umgebende Medium hineinragt.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind Varianten von Aminosäuren oder Nukleinsäuresequenzen, auf die in der vorliegenden Anmeldung explizit, beispielsweise durch den Namen oder die Hinterlegungsnummer oder gar durch den Begriff ”Variante von”, oder implizit verwiesen wird, beispielsweise durch eine Beschreibung der Funktion, von der vorliegenden Erfindung umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Begriff ”Variante”, wie hier gebraucht, Aminosäure- bzw. Nukleinsäuresequenzen, die zu 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 oder 99% mit der als Referenz dienenden Aminosäure identisch sind und unter vergleichbaren Bedingungen eine ähnliche Aktivität aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Begriff ”Variante” im Hinblick auf eine Aminosäuresequenz solche Aminosäuresequenzen, die einen konservativen Aminosäureaustausch oder mehrere konservative Aminosäurenaustausche in Bezug auf die Referenzsequenz aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Begriffe ”Varianten” einer Aminosäuresequenz oder Nukleinsäuresequenz aktive Abschnitte und/oder Fragmente der Aminosäuresequenz bzw. Nukleinsäuresequenz. In einer bevorzugten Ausführungsform verweist der Begriff ”aktiver Abschnitt”, wie hier gebraucht, auf eine Aminosäuresequenz oder eine Nukleinsäuresequenz, die kürzer als die Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenz voller Länge ist, jedoch zumindest einen Teil ihrer wesentlichen biologischen Aktivität, z. B. als eine Lipase, bewahrt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Begriff ”Variante” einer Nukleinsäure die Nukleinsäuren des komplementären Strangs, die – vorzugsweise unter stringenten Bedingungen – mit der Referenznukleinsäure hybridisieren. Die Stringenz von Hybridisierungsreaktionen ist von einem Durchschnittsfachmann ohne Weiteres bestimmbar und ist üblicherweise eine empirische Berechnung in Abhängigkeit von der Sondenlänge, der Waschtemperatur und der Salzkonzentration. Im Allgemeinen erfordern längere Sonden höhere Temperaturen für ein einwandfreies Annealing, während kürzere Sonden niedrigere Temperaturen benötigen. Die Hybridisierung hängt im Allgemeinen von der Fähigkeit der denaturierten DNA zur Renaturierung ab, wenn komplementäre Stränge in einer Umgebung vorliegen, deren Temperatur niedriger als die Schmelztemperatur der Stränge ist. Je höher der Grad der angestrebten Homologie zwischen der Sonde und einer hybridisierbaren Sequenz ist, desto höher ist die relative Temperatur, die angewandt werden kann. Dadurch ergibt sich, dass höhere relative Temperaturen tendenziell die Reaktionsbedingungen stringenter machen, während niedrigere Temperaturen diese Stringenz verringern. Weitere Einzelheiten und eine Erläuterung der Stringenz von Hybridisierungsreaktionen können Ausubel et al. (1995) entnommen werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform verweist der Begriff ”Variante” einer Nukleinsäure oder Aminosäure auf eine Nukleinsäure bzw. Aminosäure, die, zumindest bis zu einem gewissen Grade, die gleiche biologische Aktivität und/oder Funktion wie die Referenz-Nukleinsäure oder -Aminosäure hat. In einer bevorzugten Ausführungsform verweist der Begriff ”Variante” einer Nukleinsäuresequenz, wie hier gebraucht, auf eine andere Nukleinsäuresequenz, welche eine der Referenz-Aminosäuresequenz gleichende Aminosäuresequenz codiert.
Die Transporterdomäne des Autotransporters gemäß der Erfindung kann eine beliebige Transporterdomäne eines Autotransporters sein und ist vorzugsweise imstande, eine β-Barrel-Struktur zu bilden. Eine ausführliche Beschreibung von β-Barrel-Strukturen und bevorzugte Beispiele für β-Barrel-Autotransporter sind in WO 97/35 022 offenbart und durch die Bezugnahme Bestandteil der vorliegenden Beschreibung. Henderson et al. (2004) beschreiben Autotransporterproteine mit geeigneten Autotransporterdomänen (eine Zusammenfassung kann der Tabelle 1 von Henderson et al., 2004, entnommen werden). Die Offenbarung von Henderson et al. (2004) ist durch die Bezugnahme Bestandteil der vorliegenden Beschreibung. Beispielsweise kann die Transporterdomäne des Autotransporters ausgewählt werden aus: Ssp (P09489, S. marcescens), Ssp-h1 (BAA33455, S. marcescens), Ssp-h2 (BAA11383, S. marcescens), PspA (BAA36466, P. fluorescens), PspB (BAA36467, P. fluorescens), Ssa1 (AAA80490, P. haemolytica), SphB1 (CAC44081, B. Pertussis), AspA/NalP (AAN71715, N. meningitidis), VacA (Q48247, H. pylori), AIDA-I (Q03155, E. coli), IcsA (AAA26547, S. flexneri), MisL (AAD16954, S. enterica), TibA (AAD41751, E. coli), Ag43 (P39180, E. coli), ShdA (AAD25110, S. enterica), AutA (CAB89117, N. meningitidis), Tsh (I54632, E. coli), SepA (CAC05786, S. flexneri), EspC (AAC44731, E. coli), EspP (CAA66144, E. coli), Pet (AAC26634, E. coli), Pic (AAD23953, E. coli), SigA (AAF67320, S. flexneri), Sat (AAG30168, E. coli), Vat (AAO21903, E. coli), EpeA (AAL18821, E. coli), EatA (AAO17297, E coli), EspI (CAC39286, E. coli), EaaA (AAF63237, E. coli), EaaC (AAF63038, E. coli), Pertactin (P14283, B. Pertussis), BrkA (AAA51646, B. Pertussis), Tef (AAQ82668, B. Pertussis), Vag8 (AAC31247, B. Pertussis), PmpD (O84818, C. trachomatis), Pmp20 (Q9Z812, C. pneumoniae), Pmp21 (Q9Z6U5, C. pneumoniae), IgA1 protease (NP_283693, N. meningitidis), App (CAC14670, N. meningitidis), IgA1 protease (P45386, H. influenzae), Hap (P45387, H. influenzae), rOmpA (P15921, R. rickettsii), rompB (Q53047, R. rickettsii), ApeE (AAC38796, S. enterica), EstA (AAB61674, P. aeruginosa), Lip-1 (P40601, X. luminescens), McaP (AAP97134, M. catarrhalis), BabA (AAC38081, H. pylori), SabA (AAD06240, H. pylori), AlpA (CAB05386, H. pylori), Aae (AAP21063, A. actinomycetem-comitans), NanB (AAG35309, P. haemolytica) und Varianten dieser Autotransporter. Für jedes der beispielhaften Autotransporterproteine sind in Klammern Beispiele für geeignete Genbank-Hinterlegungsnummern und Spezies angegeben, von denen der Autotransporter erhalten werden kann. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die Transporterdomäne des Autotransporters vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Ssp, Ssp-h1, Ssp-h2, PspA, PspB, Ssa1, SphB1, AspA/NalP, VacA, AIDA-I, IcsA, MisL, TibA, Ag43, ShdA, AutA, Tsh, SepA, EspC, EspP, Pet, Pic, SigA, Sat, Vat, EpeA, EatA, EspI, EaaA, EaaC, Pertactin, BrkA, Tef, Vag8, PmpD, Pmp20, Pmp21, AgA1 Protease, App, Hap, rOmpA, rOmpB, ApeE, EstA, Lip-1, McaP, BabA, SabA, AlpA, Aae, NanB und Varianten davon. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Transporterdomäne eine Transporterdomäne des Autodisplay-Systems, auch als Autotransporter-Weg bezeichnet, des AIDA-I-Typs gramnegativer Bakterienzellen, insbesondere von E. coli oder eine Variante davon, wie beispielsweise jene, die von Niewert et al. (2001) beschrieben wurden.
Varianten der oben angegebenen Autotransportersequenzen können beispielsweise durch Verändern der Aminosäuresequenz in den Schleifenstrukturen des β-Barrels, die nicht zu den Transmembranabschnitten gehören, erhalten werden. Optional können die für die Oberflächenschleifen codierenden Nukleinsäuren vollständig deletiert werden. Außerdem können innerhalb der amphipathischen β-Faltblattstrukturen konservative Aminosäurenaustausche, d. h. einen Austausch einer hydrophilen gegen eine andere hydrophile Aminosäure und/oder den Austausch einer hydrophoben gegen eine andere hydrophobe Aminosäure, vorgenommen werden. Vorzugsweise hat eine Variante auf Aminosäureebene eine Sequenzidentität von mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95% oder mindestens 98% mit der entsprechenden natürlich vorkommenden Sequenz der Autotransporterdomäne, insbesondere im Bereich der β-Faltblattstrukturen.
Weiterhin ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wenn das Nukleinsäuremolekül, wie vorstehend beschrieben, zusätzlich einen Abschnitt umfasst, der für eine Expressionkontrollsequenz, vorzugsweise eine durch IPGT aktivierte Expressionkontrollsequenz, codiert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Polypeptide, die durch die vorstehend beschriebenen Nukleinsäuremoleküle codiert werden. Bevorzugte Polypeptide enthalten eine Peptidsequenz gemäß der SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No. 3.
Wie vorstehend beschrieben, wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung in einem Aspekt durch einen Mikroorganismus gelöst, der an seiner Oberfläche ein Polypeptid, wie vorstehend beschrieben, das eine Lipase umfasst, sowie ein Polpeptid, wie vorstehend beschrieben, das eine Foldase umfasst, exprimiert, oder unter Verwendung einer entsprechenden Kombination von Nukleinsäuremolekülen, wie vorstehend beschrieben, transformiert worden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform verweist der Begriff ”Mikroorganismus”, der hier austauschbar gegen den Begriff ”Wirtszelle” gebraucht wird, auf einen Mikroorganismus, der imstande ist, ein Polypeptid zu exprimieren. Ein solcher Mikroorganismus kann auch als ”Ganzzell-Katalysator oder -Biokatalysator” bezeichnet werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Mikroorganismus oder die Wirtszelle eine prokaryotische Zelle, vorzugsweise eine gramnegative Bakterienzelle, ganz besonders bevorzugt eine E. coli-Zelle. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Mikroorganismus oder die Wirtszelle eine eukaryotische Zelle oder eine Spore eines Prokaryoten.
Eine Bakterienzelle umfasst eine Reihe von Kompartimenten, die durch hydrophobe Membranen voneinander getrennt sind. Eine grampositive Bakterienzelle weist eine Plasmamembran auf, die das Zytosol, das Innere der Zelle, begrenzt. Die Plasmamembran ist von einer Peptidoglykanschicht umgeben. Gramnegative Bakterien hingegen besitzen zusätzlich zu der Plasmamembran eine weitere Membran, die als äußere Membran bezeichnet wird. Der Begriff ”Oberfläche”, wie hier gebraucht, verweist vorzugsweise auf eine Schicht des Mikroorganismus, die der Umgebung ausgesetzt ist, wobei die Umgebung beispielsweise das flüssige Kulturmedium ist, das zum Züchten des Mikroorganismus von Interesse verwendet wird. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung an der Außenseite der äußeren Membran einer gramnegativen Bakterienzelle exprimiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung an der Innenseite der äußeren Membran einer gramnegativen Bakterienzelle exprimiert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Polypeptid an der Außenseite eines Sphäroplasten exprimiert, wobei es sich um eine gramnegative Bakterienzelle handelt, bei der die äußere Membran entfernt worden ist. Der Fachmann ist mit Verfahren vertraut, die verwendet werden können, um Sphäroplasten herzustellen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Polypeptid an der Außenseite einer grampositiven Bakterienzelle exprimiert. So, wie die Begriffe ”an der Oberfläche präsentiert” und ”an der Oberfläche exprimiert” hier gebraucht werden, sind sie synonym.
Gemäß einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch eine Membranfraktion gelöst, die aus dem Mikroorganismus gemäß dem vorstehenden Aspekt der vorliegenden Erfindung gewonnen werden kann. In dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Membranfraktion oder das Membranpräparat, wobei die beiden Begriffe austauschbar gebraucht werden, sowohl eine Lipase gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung, als auch eine Foldase gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung, vorzugsweise jeweils in einem katalytisch aktiven Zustand. Die Begriffe ”Membranfraktion” und ”Membranpräparat”, wie gebraucht, verweisen vorzugsweise auf ein Produkt, das sich in Membranbestandteilen anreichert, vorzugsweise Bestandteilen der äußeren Membran einer gramnegativen Bakterie. Der Fachmann ist mit Methoden, Vorschriften und Verfahren vertraut, die verwendet werden können, um Membranpräparate herzustellen. Zum Beispiel können Bakterienzellen von einer Kultur geerntet und einer Lyse unterzogen werden, beispielsweise durch Gefrier-Auftau-Zyklen, Ultrschall, Resuspension in Lysepuffer oder dergleichen, gefolgt von einer Differentialzentrifugation, um Membranfraktionen der Zellen zu isolieren. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Membranpräparat ein Präparat der äußeren Membran, d. h. ein Präparat, bei dem die Bestandteile der äußeren Membran, verglichen mit den Bestandteilen anderer Membranen und Kompartimente, wie etwa des Zytosols, der inneren Membran und des Periplasmas, angereichert sind. Der Fachmann ist mit Methodenvorschriften und Verfahren vertraut, die verwendet werden können, um die äußere Membran oder Bestandteile davon zu isolieren oder anzureichern, wie beispielsweise eine Lysozymbehandlung von Bakterienzellen und nachfolgende Zentrifugationsschritte. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Membranfraktion eine behandelte Membranfraktion sein, d. h. dass der Gehalt oder die Eigenschaften der Membranfraktion verändert worden sind, beispielsweise durch Aufreinigen eines Proteinbestandteils der Membranfraktion oder durch Solubilisieren der Membranfraktionen und/oder Aufnahme von Bestandteilen der Membranfraktion in Vesikel. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Membranfraktion immobilisiert sein – beispielsweise an der Oberfläche eines Gefäßes oder einer Säule.
Im Rahmen der nachstehend geschilderten Untersuchungen hat es sich gezeigt, dass Membranfraktionen die aus einer Mischung von Mikroorganismen, von denen einer nur eine oberflächenpräsentierte Lipase und ein anderer nur eine oberflächenpräsentierte für diese Lipase spezifische Foldase aufweist, nicht oder nur in sehr geringem Umfang Lipase Aktivität zeigen. Es ist daher für die erfindungsgemäßen Membranfraktionen wesentlich, dass sie aus Mikroorganismen gewonnen werden, die sowohl mit Lipasen als auch mit für diese Lipasen spezifischen Foldasen transformiert wurden.
In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung gelöst durch ein Verfahren zur Hydrolyse von Lipiden mit Hilfe einer Lipase, das die folgenden Schritte umfasst:

(i) Bereitstellen eines eines wie vorstehend beschriebenen Mikroorganismus oder eines wie vorstehend beschriebenen Membranpräparats, und
(ii) Inkontaktbringen des Mikroorganismus und/oder des Membranpräparats mit ein oder mehreren Lipase Substraten unter Bedingungen, die mit der Lipase Aktivität kompatibel sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich besonders vorteilhaft ausgestalten, indem das Produkt der durch die Lipase katalysierten Reaktion Glycerin und Fettsäuren sind. Als Rohmaterial für das Verfahren können jegliche Triglyceride eingesetzt werden. Die erhaltenen Fettsäuren können zum Beispiel als Rohmaterial für Seifen verwendet werden. Glycerin findet als Rohmaterial ebenfalls vielfältige Verwendung, kann jedoch auch beispielsweise durch Umsetzung mit Ameisensäure zu Folgeprodukten, wie Allylalkohol, umgesetzt werden.
In Alternativen zu dem vorstehend beschriebenen Verfahren zur Hydrolyse von Lipiden kann es sich bei dem Verfahren auch um ein Verfahren zur Acidolyse, Alkoholyse, Glycerolyse oder Umesterung handeln. Hierbei sind entsprechende Substrate für die Lipase einzubeziehen, die der Fachmann anhand seines Fachwissens ohne weiteres bestimmen kann.
Weiterhin lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren dadurch weiter ausgestalten, dass es einen Schritt (iii) des Zurückgewinnens des in Schritt (ii) verwendeten Mikroorganismus' umfasst. Das Zurückgewinnen kann beispielsweise durch Abzentrifugieren der Zellen von der Reaktionsmischung erfolgen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat es sich gezeigt, dass der Schritt (ii) vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 80°C, vorzugsweise im Bereich von 30 bis 60°C, durchgeführt werden kann. In diesem Temperaturbereich weisen die Lipasen besonders günstige Aktivitäten auf. Als Rohmaterial für das Verfahren können jegliche Triglyceride eingesetzt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch ein Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus gelöst, der auf seiner Oberfläche eine rekombinante Lipase und eine rekombinante Foldase präsentiert, und das die Schritte: a) Einbringen einer für eine Lipase kodierenden Nukleinsäuresequenz, wie vorstehend beschrieben, in den Mikroorganismus, b) Einbringen einer Nukleinsäuresequenz, für die Lipase spezifische Foldase kodiert, wie vorstehend beschrieben, in den Mikroorganismus, und c) optional Behandeln des Mikroorganismus mit einer Substanz, die eine Expressionskontrollsequenz aktiviert, umfasst. Ebenso wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch ein Verfahren zur Herstellung eines Membranpräparats gelöst, das einen den vorstehend beschriebenen Schritten (a) bis (c) einen daran angeschlossenen Schritt des Gewinnens des Membranpräparats aus dem Mikroorganismus umfasst. Die für diesen Schritt erforderlichen Maßnahmen entsprechen dem im Vorstehenden geschilderten.
Die vorliegende Erfindung wird darüber hinaus veranschaulicht durch die folgenden Figuren, die nicht einschränkend zu verstehenden Beispiele, deren weitere Merkmale, Ausführungsformen, Gesichtspunkte und Vorteile der Erfindung entnommen werden können.
Kurze Beschreibung der Figuren:
1: Passagiertransport über zwei Membranen mit Hilfe von Autodisplay

A: Das N-terminale Signalpeptid ermöglicht den Transport über die innere Membran über den sogenannten SEC Pathway und wird dann durch periplasmische Signalpeptidasen abgeschnitten. Der C-terminale Teil bildet eine Porin-ähnliche β-Barrelstruktur innerhalb der äußeren Membran, durch die das Passagierpeptid mit Hilfe des Linkers über die Membran transloziert werden kann.
B und C: Die Struktur der Vorläuferproteine für LipBc-Fp und FoldBc-Fp wird schematisch dargestellt. Das gereifte Fusionsprotein, das an der Innenseite der äußeren Membran verankert ist, bestehend nur aus dem Passagier (der in Form einer Lipase oder Foldase vorliegt und in Hellgrau eingezeichnet ist) und der Autotransporterstruktur (Linker (weiß) und β-Barrel (schwarz)). Die Gene für die Lipase und Foldase wurden über das Plasmid pHES8 amplifiziert, das die vollständige Sequenz von B. cepacia Lipase (Gene Bank: FJ638612) enthält und über die Restriktionsposition XholI (5'-Ende) und KpnI (3'-Ende) in entsprechenden Autodisplayvektoren kloniert.

2: Expression des Lipasefusionsproteins sowie Expression und Oberflächendisplay des Foldasefusionsproteins

A: SDS-PAGE der Außenmembranproteinisolate von E. coli BL21(DE3)pAT-LipBc. Die Spur 1 zeigt eine Außenmembranpräparation von E. coli BL21(DE3), die als Kontrolle verwendet wurde. Die Spuren 2 und 3 zeigen äußere Membranpräparationen von E. coli BL21(DE3)pAT-LipBc.
B: SDS-PAGE der äußeren Membranproteinpräparationen von E. coli BL21(DE3)pAT-FoldBc. Molekulargewichtsmarker sind auf der linken Seite gezeigt. M: Proteinmarker; IPTG: die Proteinexpression wurde durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration: 1 mM) induziert; Proteinase K: ganze Zellen wurden mit Proteinase K behandelt; die Konzentrationen sind in mg mL^–1 angegeben. Die Lipase und Foldase-Fusionsproteine sind mit schwarzen Pfeilen angezeigt. OmpA/OmpF: native Außenmembranproteine von E. coli (ebenfalls mit schwarzen Pfeilen angezeigt).

3: Coexpression und Oberflächendisplay von Lipase und Foldasefusionsproteinen

SDS-PAGE von Membranpräparationen von E. coli BL21(DE3)pAT-LiFoBc, die die Lipase und Foldasefusionsproteine coexprimieren. Die Molekulargewichtsmarker sind auf der linken Seite gezeigt. Die Spur 1 zeigt eine Membranpräparation von E. coli BL21(DE3), die als Kontrolle verwendet wurde. Die Spuren 2 bis 5 zeigen Außenmembranpräparationen von E. coll BL21(DE3)pAT-LiFoBc. M: Proteinmarker; IPTG: die Proteinexpression wurde durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration: 1 mM) induziert; Proteinase K: ganze Zellen wurden mit Proteinase K behandelt, die Konzentrationen sind in mg/mL^–1 angegeben; OmpA/OmpF: Native E. coli-Außenmembranproteine. Die Foldase und Lipasefusionsproteine sind mit schwarzen Pfeilen angezeigt.
4: Lipaseaktivität von ganzen Zellen

p-Nitrophenylpalmitat wurde als Substrat verwendet und die Zunahme der Absorption bei 405 nm wurde photochemisch gemessen. Die Zunahme der Absorption wird durch das Nitrophenolatanion verursacht, das nach lipolytischer Spaltung der Esterbindung durch die Oberflächen präsentierte Lipase entsteht:

= E. coli BL21DE3pAT-LiFoBc, das sowohl die Base als auch Foldase coexprimiert,
* = E. coli BL21(DE3)pAT-LipBc und E. coli BL21(DE3)pAT-FoldBc, die gemischt und für eine Stunde präinkubiert wurden,
❚ = E. coli BL21(DE3), der als Kontrolle verwendet wurde,
♦ = Substratlösung in Puffer.
5: Lipaseaktivität von äußeren Membranpräparationen.
Äußere Membranen wurden wie vorstehend beschrieben präpariert und dann analog den photometrischen Aktivitätsessay mit ganzen Zellen untersucht.
äußere Membranpräparation von E. coli BL21(DE3)pAT-LiFoBc, die Lipase und Foldase coexprimieren, * = Außenmembranpräparationen von E. coli BL21(DE3)pAT-LipBc und E. coli BL21(DE3)pAT-FoldBc, die gemischt und für eine Stunde präinkubiert wurden, ❚ Außenmembranpräparation von E. coli BL21(DE3), die als Kontrolle verwendet wurden, ♦ = Substratlösung im Puffer.
Beispiele
Autodisplay einer Lipase aus Burkholderia cepacia
Allgemeines
Die unter GenBank: F3638612 hinterlegte Sequenz für die Burkholderia cepacia Lipase wurde vor Beginn der Klonierung mit Hilfe des SignalP-Servers der TU Denmark auf eine eventuell vorhandene Signalsequenz hin untersucht. Das Autodisplay-System codiert für ein Signalpeptid, so dass eine weitere nachgeschaltete Signalsequenz im Passagier für die Expression hinderlich wäre. Die Untersuchung mit SignalP ergab eine Signalpeptidaseschnittstelle nach den ersten 40 Aminosäuren der Lipase-Sequenz. Für die PCR wurde daher der Startpunkt zur Amplifizierung der Lipase nach den ersten 120 Basenpaaren der hinterlegten Sequenz gesetzt.
Die PCR wurde mit den Primern gemäß SEQ ID No: 6 und SEQ ID No: 7 und dem Vektor pHES8 als Templat durchgeführt. pHES8 ähnelt dem Vektor pHES12 aus Quyen (1999), der das vollständige B. cepacia Lipase Operon (d. h. die Lipase und die dazu korrespondierende Foldase) für die intracellulare Expression in E. coli kodiert. Während der PCR-Reaktion wurden der Lipase die Restriktionsendonukleaseschnittstellen für XhoI und KpnI angehängt. Das so erhaltene PCR-Produkt wurde zunächst in den Vektor PCR^®-4-TOPO^® der Firma Invitrogen zwischenkloniert. Das entstandene Konstrukt wurde mit den Restriktionsendonukleasen XhoI und KpnI verdaut, aufgetrennt und das für die Lipase kodierende Fragment wurde aus dem Agarosegel aufgereinigt und in den ebenso geschnittenen und aufgereinigten Vektor pCD003 (vgl. Detzel (2011)) ligiert. Der Vektor pCD003 trägt eine Carbenicillin-Resistenz als Selektionsmarker und kann so in folgenden Experimenten mit dem für die Foldase kodierenden Plasmid pAT-FoldBc kombiniert werden. Das resultierende Plasmid mit der Sequenz gemäß SEQ ID No: 4 (im Folgenden pAT-LipBc genannt) wurde in E. coli BL21(DE3) transformiert.
Expression der Lipase
Für den Nachweis der Expression wurde E. coli BL21(DE3) in LB-Flüssigmedium (50 mg/L Carbenicillin, 10 mM Mercaptoethanol) bis zu einer OD₅₇₈ von 0,5 kultiviert. Die Kultur wurde aufgeteilt, der einen Hälfte wurden 1 mM IPTG zugegeben und beide Ansätze wurden eine weitere Stunde bei 30°C und 200 rpm inkubiert. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugation sedimentiert und die Außenmembranproteine über eine differenezierte Zellfraktionierung isoliert und mittels SDS-PAGE untersucht. Das Fusionsprotein aus der Lipase und der Autotransportereinheit (LipFP) hat eine errechnete Größe von 87,5 kDa.
Oberflächenbeständigkeit der Lipase
Der Nachweis der Oberflächenständigkeit erfolgte mit einem gegen die Lipase gerichteten Rabbit-Antikörper mit Hilfe der Durchflusszytometrie. Zu diesem Zweck wurde E. coli BL21(DE3) pAT-LipBc in Flüssigkultur (LB, Carbenicillin 50 mg/l, 10 mM Mercaptoethanol) angezogen. Bei einer OD₅₇₈ von 0,5 wurde durch Zugabe von IPTG in einer Hälfte der Kultur die Proteinexpression induziert. Die Zellen wurden während der Induktion für eine weitere Stunde bei 30°C und 200 rpm inkubiert. Als Kontrollen wurden der reine Stamm E. coli BL21(DE3) und E. coli BL21(DE3) pAT-NOX (enthält NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis, vgl. WO 2012/025628 A1 ) auf die gleiche Art kultiviert und behandelt. Nach der Induktion wurden die Zellen in allen Ansätzen durch Zentrifugation sedimentiert und zwei Mal mit partikelfreiem PBS (pH 7,4) gewaschen. Anschließend wurden die Zellen so resuspendiert, dass in einem Volumen von 1 ml eine OD₅₇₈ von 0,25 vorlag. Diese Proben wurden jeweils mit 500 μl PBS + 3% BSA (partikelfrei) versetzt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Danach wurden die Zellen für 60 Sekunden bei 13400 rpm zentrifugiert. Alle Sedimente wurden in 100 μl einer 1:50-Verdünnung des primären Antikörpers resuspendiert und die Suspensionen 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss wurden die Zellen zwei Mal mit 500 μl PBS (partikelfrei) gewaschen. Die Sedimentation erfolgte auch hier wieder durch Zentrifugation (60 Sekunden, 13400 rpm). Die Zellsedimente wurden dann in 100 μl einer 1:25-Verdünnung des sekundären Antikörpers (goat-anti-rabbit, DyLightTM 633 markiert (Fa. Thermo)) suspendiert und weitere 30 Minuten unter Lichtausschluss bei Raumtemperatur inkubiert. Die so markierten Proben wurden erneut zwei Mal mit 500 μl PBS (partikelfrei) gewaschen, in 1,5 ml partikelfreiem PBS resuspendiert und im Durchflusszytometer (Cyflow Space, Fa. Partec) vermessen.
In allen fünf untersuchten Zellproben war eine Population vorhanden. Allerdings zeigten nur zwei Proben höhere mittlere Fluoreszenzwerte. Bei diesen Proben handelt es sich um E. coli BL21(DE3) pAT-LipBc. Das bedeutet, dass die Zellen mit dem Lipase-Antikörper markiert sind, die Lipase also oberflächenständig sein muss. Die erste der Proben stellt Zellen dar, in denen die Proteinexpression nicht induziert worden war, dennoch ist der Fluoreszenzwert höher als in den weiteren Kontrollen. Daraus lässt sich schließen, dass es auch ohne die Induktion mit IPTG bereits zu einer Expression des Enzyms in den E. coli Zellen kommt. Dies ist auf die „leakiness” des Promotors zurückzuführen.
Autodisplay einer Foldase
Die Foldase aus Burkholderia cepacia wurde mittels Autodisplay auf E. coli oberflächenexprimiert. Die Foldase ist notwendig für die Faltung der Lipase in die aktive Form. Laut Quyen et al. (1999) kodieren die ersten 210 Basen am 5'-Ende für einen Membrananker. Da dieser Membrananker für eine erfolgreiche Oberflächenexpression hinderlich sein könnte, eine Verkürzung der Sequenz aber keinerlei Einfluss auf die Foldaseaktivität hatte (Quyen et al., 1999), wurden die Primer so designed, dass das Amplikon um diese Basen verkürzt vorlag. Die PCR wurde mit den Primern SEQ ID No: 8 und SEQ ID No: 9 durchgeführt. Durch die PCR wurde dem Amplikon Restriktionsendonukleaseschnittstellen angefügt (5'-XhoI und 3'-KpnI), um eine Ligation mit definierten Enden zu gewährleisten. Das Amplikon wurde mit Hilfe des TOPO TA Cloning Kit for sequencing (Invitrogen) in den pCR4-TOPO Vektor zwischenkloniert. Das zwischenklonierte PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsendonukleasen XhoI und KpnI verdaut, durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und aufgereinigt. In den ebenfalls mit XhoI und KpnI doppelverdauten Vektor pBL001 wurde das PCR-Produkt ligiert Der Vektor pBL001 ist ein pCOLA Duet^TM Derivat und enthält als Selektionsmarker eine Kanamycin-Resistenz, um eine spätere Coexpression mit dem Lipase-Vektor zu ermöglichen. Des Weiteren enthält der Vektor pBL001 alle für das Autodisplay benötigten Strukturelemente. Das entstandene Plasmid, im folgenden pAT-FoldBc (SEQ IN No. 5) genannt, wurde in den Stamm E. coli UT5600(DE3) transformiert. Aus den gewonnenen Transformanden wurden vier ausgewählt und in 100 ml LBMedium mit 50 mg/L Carbenicillin und 10 mM Mercaptoethanol bei 37°C und 200 rpm kultiviert. Nach Erreichen einer optischen Dichte OD₅₇₈ von 0,5 wurde einem Teil der Probe die Proteinbiosynthese durch Zugabe von 1 mM IPTG gestartet. Danach wurden die Proben für eine weitere Stunde bei 30°C und 200 rpm inkubiert. Im Anschluss wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und eine differenzierte Zellfraktionierung durchgeführt.
Bei allen untersuchten Klonen kann das Erscheinen einer prominenten Bande im SDS-Gel zwischen 70 und 85 kDa nach Zugabe von IPTG beobachtet werden. Dies ist in guter Übereinstimmung mit dem berechneten Molekulargewicht für die FoldBc von 79,5 kDa. Somit konnte die Membranständigkeit des Fusionsproteins FoldBc (FoldBc-Fp) bewiesen werden. Die Oberflächenständigkeit wurde mit einem Protease-Zugänglichkeitstest überprüft. Über die Inkubation der Bakterien mit der Serinprotease Trypsin oder Proteinase K und anschließender Präparation der bakteriellen Außenmembran ist es möglich, die Oberflächenständigkeit eines Passagiers, in diesem Fall der Foldase, nachzuweisen. Da Trypsin oder Proteinase K aufgrund ihrer Größe nicht in der Lage sind, die äußere Membran von E. coli zu überwinden, resultiert die Inkubation ganzer Zellen mit diesen Protease lediglich im Verdau von Proteinen, die sich an der Oberfläche der Außenmembran befinden. Ein Passagier, der sich an der Oberfläche befindet, wird verdaut, während in die Membran integrierte Proteinanteile vor dem Angriff des Enzyms geschützt sind und erhalten bleiben, was mit SDS-PAGE nachgewiesen werden kann (2B). Zu diesem Zweck wurde Klon 4 in LB-Medium (50 mg/L Carbenicillin, 10 mM Mercaptoethanol) kultiviert und ein Teil der Probe wurde nach Erreichen einer OD₅₇₈ von 0,5 mit 1 mM IPTG inkubiert. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und ein Teil der Proben mit Proteinase K-Lösung versetzt und eine Stunde bei 37°C auf dem Wasserbad inkubiert. In 2B ist das SDS-Gel der Außenmembranisolate dargestellt. Wie in der ersten Spur zu erkennen, wird in nicht induzierten Zellen keine Foldase gebildet. Die typische Bande für die Foldase bei ca. 79 kDa fehlt. In induzierten Zellen wird das Protein gebildet. Deutlich zu erkennen durch die auftretende Bande (Spur 2). Die Proteinbande des Fusionsproteins FoldBc wird durch Zugabe von Proteinase-K eindeutig schwächer (Spur 3 und 4). Da das Fusionsprotein für die Proteinase K zugänglich war, kann davon ausgegangen werden, dass der Passagier in den Extrazellulärraum gerichtet und somit oberflächenständig ist.
Coexpression von Lipase und Foldase
Um das die Lipase und das die Foldase tragende Plasmid in einem Stamm vereinen zu können, mussten zunächst sogenannte elektrokompetente Zellen hergestellt werden, die eines der beiden Plasmide enthielten. E. coli BL21(DE3) pAT-LipBc wurde in 12 ml LB (Carbenicillin 50 mg/l) über Nacht kultiviert. Am nächsten Morgen wurde diese Kultur zwei Mal mit LB-Medium gewaschen und als Inokulum für 250 ml VT-Medium verwendet. Aus dieser Kultur wurden nach einem modifizierten Protokoll nach Sambrook et al. (1989) elektrokompetente Zellen hergestellt. In ein Aliquot dieser Zellen wurde das Plasmid pAT-FoldBc mittels Elektroporation transformiert. Die so transformierten Zellen wurden eine Stunde bei 37°C und 200 rpm in SOC-Medium inkubiert und anschließend wurden 1, 5 und 20 μl dieser Kultur auf Agarplatten ausplattiert. Da die Zellen nun beide Plasmide beinhalten sollten und somit zwei verschiedene Antibiotikaresistenzen als Selektionsmarker trugen, wurden Agarplatten mit Carbenicillin (50 mg/l) und Kanamycin (30 mg/l) verwendet. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C bebrütet. Am nächsten Tag wurden die Platten auf Bewuchs untersucht und zwei Klone von E. coli BL21(DE3) pAT-LiFoBc zum Animpfen einer Übernachtkultur (LB-Medium, Carbenicillin 50 mg/l, Kanamycin 30 mg/l) ausgewählt. Aus 2 ml dieser Übernachtkulturen wurde am nächsten Tag eine Plasmidisolierung nach Birnboim und Doly (1979) vorgenommen. Diese Isolate wurden einem Restriktionsverdau unterworfen, um zu überprüfen, ob sie wirklich beide Plasmide enthielten. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in 3 dargestellt.
Untersuchung des coexprimierten Ganzzellbiokatalysators auf Lipaseaktivität
Coexpression
20 ml LB-Medium (Carbenicillin 50 mg/l, Kanamycin 30 mg/l) wurden mit 20 μl einer Glycerinkultur des zuvor ausgesuchten Klones von E. coli BL21(DE3)pAT-LiFoBc angeimpft. Am nächsten Tag wurde 1 ml dieser Kultur zwei Mal mit LB gewaschen und dann als Inokulum für eine Hauptkultur (100 ml LB, o. g. Antibiotika) verwendet. Diese Hauptkultur wurde bis zu einer OD₅₇₈ = 0,5 kultiviert, dann wurde durch Zugabe von 1 mM IPTG die Proteinexpression induziert. Die Kultur wurde zu diesem Zweck eine weitere Stunde bei 30°C und 200 rpm inkubiert. Im Anschluss wurden die Zellen durch Zentrifugation sedimentiert, zwei Mal mit Kaliumphosphatpuffer 0,05 M, pH 7,4 gewaschen und dann in diesem Puffer zu einer OD₅₇₈ von 10 resuspendiert. Bis zur weiteren Verwendung wurden die Zellen auf Eis gelagert. Als Negativkontrolle wurden der reine Stamm E. coli BL21(DE3) und E. coli BL21(DE3)pAP-NitAf (enthält das Nitrilase-Gen aus Alcanigenes faecalis ATCC 8750, vgl. WO 2011/057820 A2 ) auf die gleiche Art angesetzt und weiter behandelt.
Kultivierung der Mischkultur
Jeweils 20 ml LB-Medium (Carbenicillin 50 mg/l bzw. Kanamycin 30 mg/l) wurden mit 20 μl einer Glycerinkultur von E. coli BL21(DE3)PAT-LipBc bzw. BL21(DE3)pAT-FoldBc angeimpft. Am nächsten Tag wurde je 1 ml dieser Kulturen zwei Mal mit LB gewaschen und dann als Inokulum für Hauptkulturen (100 ml LB, o. g. Antibiotika) verwendet. Diese Hauptkulturen wurde bis zu einer OD₅₇₈ = 0,5 kultiviert, dann wurde durch Zugabe von 1 mM IPTG die Proteinexpression induziert. Die Kulturen wurden zu diesem Zweck eine weitere Stunde bei 30°C und 200 rpm inkubiert. Im Anschluss wurden die Zellen durch Zentrifugation sedimentiert, zwei Mal mit Kaliumphosphatpuffer 0,05 M, pH 7,4 gewaschen und dann in diesem Puffer zu einer OD₅₇₈ von 10 resuspendiert. Gleiche Volumina dieser beiden Zellsuspensionen wurden zusammen in einen Kulturkolben gegeben und eine bzw. 24 weitere Stunden bei 20°C und 200 rpm zusammen inkubiert.
Die so vorbereiteten Zellen wurden dann entweder unmittelbar in einem Aktivitätsassay eingesetzt, oder für eine Präparation der Außenmembranproteine weiter verwendet.
Aktivitätsassay für die Lipase
Für den Assay wurde zunächst 7,8 mM p-Nitrophenylpalmitat-Stammlösung (p-NPP) in Ethanol (reinst) hergestellt. Diese Lösung ist bei Lagerung im Kühlschrank bis zu zwei Wochen haltbar. Ausfällungen können durch Inkubation bei 25°C gelöst werden. Für die Substrat-Arbeitslösung wurden 80 ml Leitungswasser vorgelegt, 3,33 ml der Stammlösung zugegeben und mit Leitungswasser auf 100 ml aufgefüllt. Es entsteht eine feine, leicht trübe Suspension. Die Arbeitslösung wird sofort verwendet um einem Auskristallisieren des p-NPP während der Aktivitätsmessung vorzubeugen. Allerdings empfiehlt es sich, die Substratarbeitslösung im Assay mit zu vermessen und ein Aliquot zu beobachten, um zu vermeiden, dass das p-NPP auch schon ohne äußere Einflüsse gespalten wird und sich eine Gelbfärbung zeigt. Zur Positivkontrolle wurde eine 1:500-Verdünnung der aufgereinigten Lipase in Brij-Verdünnungspuffer (225 mg Brij^® 35 und 1,323 g Calciumchlorid-Dihydrat in Millipore) angesetzt. Im Assay wurde die Enzymlösung im Verhältnis 1:50 zur Substratlösung gegeben. Für die Aktivitätsmessung wurden 9 Teile Arbeitslösung vorgelegt und ein Teil Zellen hinzugegeben. Um die Umsetzung optisch mitverfolgen zu können, wurde der Assay simultan im 10 ml-Maßstab und im Mikrotiterplattenmaßstab (Volumen pro well = 200 μl) durchgeführt. Die Beobachtung der Gelbfärbung erfolgte im 10 ml-Maßstab rein optisch, die Lösung wurde während des Tests permanent gerührt. Im Plattenreader wurde über insgesamt zwei bis drei Stunden alle 15 min die Absorption bei 405 nm gemessen, in den Zeiten zwischen den Messungen wurde die Platte geschüttelt, um eine Sedimentation von Zellen und ggf. Substrat zu vermeiden. Schon mit bloßem Auge ist in den Assayansätzen mit dem Lipase-Ganzzellbiokatalysator eine Gelbfärbung, sprich eine Umsetzung des Substrates zu beobachten. Durch die Coexpression von Lipase und Foldase ist es also gelungen einen aktiven Ganzzellbiokatalysator herzustellen.
Assay im Mikrotiterplattenmaßstab
Die Ergebnisse der Absorptionsentwicklung bei 405 nm über die Zeit sind in der 4 dargestellt.
Im Mikrotiterplattenmaßstab bestätigt sich die rein optische Beobachtung – allein durch den Ganzzellbiokatalysator, der beide Enzyme coexprimiert (E. coli BL21(DE3)pAT-LiFoBc), wird das Substrat umgesetzt. Für E. coli BL21(DE3)pAT-LiFoBc lässt sich eine enzymatische Aktivität von 0,74 mU mL^–1 bestimmen. Dabei ist eine Einheit definiert als die Enzymmenge, die die Freisetzung von 1 μmol p-nitrophenol per Minute ermöglicht. Eine über 1 bzw. 24 Stunden inkubierte Mischkultur des Stammes, der die Lipase exprimiert (E. coli BL21(DE3)pAT-LipBc) mit dem Stamm, der die Foldase exprimiert (E. coli BL21(DE3)pAT-FoldBc), zeigte im Assay wiederum keine Aktivität. Auch durch die als Negativkontrollen eingesetzten Zellen wird das Substrat nicht umgesetzt. Die Reaktion ist also spezifisch durch die Lipase bedingt. Die Coexpression beider Enzyme in einem E. coli-Stamm mittels Autodisplay bietet also eine sehr elegante Methode Enzyme, die ein solches Chaperon wie die Foldase benötigen, aktiv auf die Zelloberfläche zu bringen.
Untersuchung von Außenmembranpräparaten auf Lipaseaktivität
1. Präparation der Außenmembranproteine und Assay
Da der Assay nach dem ursprünglichen Protokoll in einem Emulgatorpuffer (2,7 g Natriumdesoxycholat, 1,4 g a-Olefinsulfonat, 12,1 g Tris in 11 Millipore Wasser, pH = 8,0) durchgeführt werden sollte und die ganzen Zellen in diesem Puffer ihre Membranintegrität verlieren und lysieren, sollte der Assay auch mit Präparationen der Außenmembranproteinfraktion durchgeführt werden. Für die Präparation der Außenmembranproteine wurden die gleichen Zellen ebenso kultiviert wie für den Zellassay weiter oben beschrieben wurde. Die Präparation der Außenmembranproteine erfolgte nach einem modifizierten Protokoll nach Hantke (1981) und Schultheiss et al. (2002). Die gewonnenen Proteine wurden nach dem letzten Waschschritt in 1 ml Millipore Wasser resuspendiert und so für den Assay verwendet. Für den Assay mit den Außenmembranproteinpräparaten wurden wiederum 9 Teile der Substratarbeitslösung vorgelegt und ein Teil der Proteinpräparation hinzupipettiert. Die Assays wurden sowohl im 1 ml-Maßstab im ERG, als auch in der Mikrotiterplatte (200 μl/well) durchgeführt. Die Bedingungen wurden analog der Bedingungen im Zellassay gewählt. Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in 5 dargestellt.
Auch die Proteinpräparate zeigen in der Aktivitätsbestimmung das gleiche Bild wie die Zellen. Präparationen aus Zellen, die beide Enzyme coexprimieren zeigen eine eindeutige Umsetzung des Substrats. Für das membranpräparat aus E. coli BL21(DE3)pAT-LiFoBc lässt sich so eine enzymatische Aktivität von 0,29 mU mL^–1 bestimmen. Alle anderen Ansätze – sowohl Präparationen aus den Mischkulturen, als auch die Negativkontrolle – zeigen hingegen keine Aktivität. Auch bei den Proteinassays lässt sich rein optisch die Aktivität beobachten. In den aktiven Proben (sowohl im 1 ml-Maßstab, als auch in der Mikrotiterplatte) lässt sich eine Gelbfärbung beobachten.
Literatur:

Ausubel et al. (1995), Current protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers.
Birnboim, J. Doly (1979), Nucleic Acids Res., 7(6), S. 1513–23.
Detzel et al. (2011) ChemCatChem, 3, 719–725.
Handke, K. (1981), Mol. Gen. Genet. 182(2), 288–292.
Henderson et al. (2004) Microbiol. and Molecular Biology Reviews, 68(4), 692–744.
Jose et al (2002), J. Biotechnol., 95, 257–268.
Niewert et al. (2001) Diarrea. Clin. Diagn. Lab. Immunol. (1): 143–149.
Quyen et al. (1999), Appl. Environ. Microbiol. (65), 787–794
Sambrook et al. (1989), Molecular cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Press.
Schultheiss et al. (2002) J. Mol. Catalysys B. Enzymatic, 18, 89–97.
Wilhelm et al. (2007), ChemBioChem, 8, 55–60.
Yang et al. (2010) J. Biotechnol., 146, 126–129.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 97/35022 [0034]
WO 2012/025628 A1 [0058]
WO 2011/057820 A2 [0064]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Quyen (1999) [0008]
Wilhelm et al. (2007) [0009]
Yang et al. (2010) [0009]
Detzel (2011) [0011]
Ausubel et al. (1995) [0033]
Henderson et al. (2004) [0034]
Henderson et al., 2004 [0034]
Henderson et al. (2004) [0034]
Niewert et al. (2001) [0034]
Quyen (1999) [0056]
Detzel (2011) [0056]
Laut Quyen et al. (1999) [0061]
Quyen et al., 1999 [0061]
Sambrook et al. (1989) [0063]
Birnboim und Doly (1979) [0063]
Hantke (1981) [0070]
Schultheiss et al. (2002) [0070]

Claims

Nukleinsäuremolekül, umfassend die folgenden Bestandteile: (1) einen Abschnitt, der ein Signalpeptid codiert, (2) einen Abschnitt, der eine Lipase oder Foldase codiert, (3) optional einen Abschnitt, der eine Protease-Erkennungsstelle codiert, (4) einen Abschnitt, der einen Transmembranlinker codiert, und (5) einen Abschnitt, der eine Transporterdomäne eines Autotransporters oder einer Variante davon codiert, wobei das Signalpeptid, wenn Abschnitt (2) eine Lipase codiert, gegenüber der Lipase heterolog ist.
Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Abschnit (2) für eine Burkholderia cepacia Lipase, vorzugsweise die Burkholderia cepacia ATCC 21808 Lipase, codiert und besonders bevorzugt in Form der SEQ ID No. 1 vorliegt.
Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Foldase eine Burkholderia cepacia Foldase, vorzugsweise eine am 5'-Ende verkürzte Burkholderia cepacia Foldase, und besonders bevorzugt eine am 5'-Ende um etwa 200 bis 210 Basen verkürzte Burkholderia cepacia Foldase ist.
Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Transporterdomäne eines Autotransporters ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Ssp, Ssp-h1, Ssp-h2, PspA, PspB, Ssa1, SphB1, AspA/NalP, VacA, AIDA-I, IcsA, MisL, TibA, Ag43, ShdA, AutA, Tsh, SepA, EspC, EspP, Pet, Pic, SigA, Sat, Vat, EpeA, EatA, EspI, EaaA, EaaC, Pertactin, BrkA, Tef, Vag8, PmpD, Pmp20, Pmp21, AgA1 Protease, App, Hap, rOmpA, rOmpB, ApeE, EstA, Lip-1, McaP, BabA, SabA, AlpA, Aae, NanB und Varianten davon.
Nukleinsäuremolekül nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich einen Abschnitt umfasst, der für eine Expressionskontrollsequenz, vorzugsweise eine durch IPGT aktivierte Expressionskontrollsequenz, codiert.
Polypeptid, codiert durch ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Polypeptid nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es die Sequenz SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No. 3 umfasst.
Mikroorganismus, der ein Polypeptid nach Anspruch 7 in Form einer Lipase und ein Polypeptid nach Anspruch 7 in Form einer für die Lipase spezifischen Foldase exprimiert oder unter Verwendung einer entsprechenden Kombination von Nukleinsäuremolekülen nach einem der Ansprüche 1 bis 6 transformiert worden ist.
Mikroorganismus nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass er auf einem Gram-negativen Mikroorganismus, vorzugsweise Escherichia coli beruht.
Membranfraktion, erhältlich von einem Mikroorganismus nach Anspruch 8 oder 9.
Verfahren zur Hydrolyse von Lipiden mit Hilfe einer Lipase, umfassend die folgenden Schritte: (i) Bereitstellen eines Mikroorganismus nach Anspruch 8 oder 9 oder eines Membranpräparats nach Anspruch 10, und (ii) Inkontaktbringen des Mikroorganismus und/oder des Membranpräparats mit ein oder mehreren Lipase Substraten unter Bedingungen, die mit der Lipase Aktivität kompatibel sind.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Produkte der durch die Lipase katalysierten Reaktion Glycerin und Fettsäuren sind.
Verfahren zur Acidolyse, Alkoholyse, Glycolyse oder Umesterung mit Hilfe einer Lipase, umfassend die folgenden Schritte: (i) Bereitstellen eines Mikroorganismus nach Anspruch 8 oder 9 oder eines Membranpräparats nach Anspruch 10, und (ii) Inkontaktbringen des Mikroorganismus und/oder des Membranpräparats mit ein oder mehreren Lipase Substraten unter Bedingungen, die mit der Lipase Aktivität kompatibel sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt (ii) bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 80°C, vorzugsweise im Bereich von 30 bis 60°C durchgeführt wird.
Verfahren zum Herstellen eines Mikroorganismus, der an seiner Oberfläche eine rekombinante Lipase und eine für die Lipase spezifische rekombinante Foldase präsentiert, umfassend a) das Einbringen einer für eine Lipase kodierenden Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 in den Mikroorganismus, b) das Einbringen einer für eine für die Lipase spezifische Foldase kodierenden Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 in den Mikroorganismus, und c) optional das Behandeln des Mikroorganismus mit einer Substanz, die eine Expressionskontrollsequenz aktiviert.