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TECHNISCHES GEBIET
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Exprimieren eines
Zielproteins auf der Oberfläche eines Mikroorganismus unter
Verwendung von Bacillus anthracis-Exosporium-Protein. Spezieller
einen Expressionsvektor, der derart konstruiert ist, dass er das
bclA-Gen, das für das Exosporium-Protein BclA von Bacillus
anthracis codiert, oder Fragmente davon als ein Zelloberflächen-Verankerungsmotiv
umfasst, und das Protein auf der Oberfläche einer Zelle
in einer Form, fusioniert mit BclA oder Fragmenten davon, exprimiert werden
kann, wenn das Gen, das für das Zielprotein codiert, in
einer Wirtszelle exprimiert wird, sowie ein Verfahren zum Exprimieren
eines Zielproteins auf der Oberfläche eines Mikroorganismus
unter Verwendung des Vektors.
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TECHNISCHER HINTERGRUND
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Bakterien
haben eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der Biotechnologie
gespielt. Insbesondere sind seit der Entdeckung der Doppelhelix-Struktur
der DNA durch James Watson und Francis Crick DNA-Manipulationstechniken
für Mikroorganismen angewendet worden, um eine Vielzahl
von nützlichen Materialien herzustellen, und es ist somit
möglich geworden, Mikroorganismen in einem großen
Gebiet industrieller Anwendungen aufgrund von DNA-Manipulationstechniken
zu verwenden und Techniken zum effizienten Produzieren zahlreicher
nützlicher Materialien sind zusammen mit den DNA-Manipulationstechniken
entwickelt worden. Vor kurzem fand eine Erweiterung des Anwendungsgebiets
der Biotechnologie, die mit einer einfachen Proteinproduktion begonnen
hat, in zahlreichen Gebieten statt.
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Zu
den neu eingeführten Techniken, die auf der bemerkenswerten
Entwicklung der Biotechnologie basieren, zählt eine Technik
der Zelloberflächenpräsentation („cell
surface display technique"), die auf einer grundlegenden Kenntnis
der Molekularbiologie und einer Technik der Sekretion und Expression
von Proteinen basiert. Die Präsentation an der Zelloberfläche
bzw. Zelloberflächen-Display ist eine Technik, bei der
Proteine oder Peptide mit einem geeigneten Zelloberflächen-Verankerungsmotiv
zum Exprimieren auf der Oberfläche von Gram-positiven und
Gram-negativen Bakterien-, Pilz-, Hefe- und Tierzellen fusioniert
werden (Lee, S. Y. et al., Trends Biotechnol., 21: 4552,
2003). Die erste Zelloberflächen-Präsentationstechnik,
bei der Peptide oder kleine Proteine mit pIII eines filamentösen
Phagen fusioniert werden und die als Oberflächenexpressionssystem
bezeichnet wird, wurde von George P. Smith Mitte der 1980er Jahre
entwickelt. Seit damals wurde eine neue Weise der Zelloberflächen-Präsentation,
bei der gewünschte Proteine stabil auf der Oberfläche
eines Mikroorganismus exprimiert werden, ins Rampenlicht gebracht,
da viele Studien hinsichtlich Sekretionsmechanismen in Mikroorganismen
durchgeführt werden.
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Im
Stand der Technik wurden Studien hinsichtlich der Expression von
fremden Proteinen auf der Oberfläche von Phagen durchgeführt,
da die Oberfläche von Phagen einfacher ist als die von
Bakterien. Die Zelloberflächen-Präsentation unter
Verwendung von Phagen wurde bei der Durchmusterung von Antikörpern,
Epitopen, Liganden hoher Affinität usw. verwendet, sie
weist jedoch einen Nachteil dahingehend auf, dass die Größe
des Proteins, das auf der Oberfläche von Phagen exprimiert
werden kann, relativ begrenzt ist (Georgiou, G. et al.,
Nat. Biotechnol., 15: 29, 1997).
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Daher
wurden als eine der möglichen Alternativen Techniken zur
Präsentation an der Zelloberfläche entwickelt,
bei denen Zielproteine stabil auf der Oberfläche eines
Mikroorganismus exprimiert werden, und zwar unter Verwendung von
Oberflächenproteinen von Mikroorganismen, wie Bakterien
oder Hefen.
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Gram-negative
Bakterien weisen eine sehr spezielle Membranstruktur auf, wobei
diese aus einer inneren Zellmembran, dem periplasmatischen Raum
und der äußeren Zellmembran besteht. Um ein fremdes Protein
auf der Oberfläche eines Bakteriums, wie z. B. E. coli,
das die oben erwähnte Membranstruktur aufweist, zu exprimieren,
ist ein Zelloberflächen-Verankerungsmotiv, das dazu befähigt
ist, das zu exprimierende Protein stabil und wirksam an die Oberfläche
einer Zelle zu überbringen, erforderlich. Um ein fremdes
Protein auf der Oberfläche einer Zelle unter Verwendung
von Oberflächenproteinen von Bakterien zu exprimieren,
wird das fremde Protein mit einem geeigneten Oberflächenprotein
auf dem genomischen Level unter Biosynthese eines Fusionsproteins
fusioniert und das erhaltene Fusionsprotein sollte durch eine intrazelluläre
Membran passieren, um auf der Oberfläche einer Zelle anzuhaften
und erhalten zu bleiben. Dazu sollte ein Oberflächenprotein
mit den folgenden Eigenschaften ausgewählt und als Zelloberflächen-Verankerungsmotiv
verwendet werden, wobei die Eigenschaften wie im Folgenden beschrieben
sind.
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Das
Oberflächenprotein weist eine sehr effiziente Sekretionssignalsequenz
auf, die ein fremdes Protein beim Passieren durch eine innere Zellmembran,
um es an die Oberfläche einer Zelle zu überbringen,
unterstützt, und ein Targetierungssignal, das das fremde
Protein dabei unterstützt, stabil an der äußeren
Zellmembranoberfläche angeheftet zu werden. Gleichzeitig
ist es dazu befähigt, fremde Proteine hoher Größe
zu überbringen und eine große Menge der fremden
Proteine stabil zu exprimieren. Zelloberflächen-Ver ankerungsmotive,
die bis jetzt in E. coli verwendet wurden, waren Proteine, die auf
der äußeren Membran vorhanden sind, wie z. B.
LamB, PhoE (Agterberg, M. et al., Gene, 88: 37, 1990),
OmpA usw.
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Wenn
jedoch die oben genannten Proteine verwendet werden, besteht ein
Vorteil dahingehend, dass ein fremdes Protein in eine Schleife inseriert
werden kann, die aus der Oberfläche einer Zelle hervorragt,
um erfolgreich auf der Oberfläche der Zelle exprimiert
zu werden. Jedoch besteht ein Nachteil dahingehend, dass die Größe
des fremden Proteins, das inseriert werden kann, im Hinblick auf
ihre bzw. seine Struktur begrenzt ist (Georgiou, G. et al.,
Nat. Biotechnol., 15: 29, 1997).
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Da
auch das C-terminale Ende und das N-terminale Ende der inserierten
fremden Proteine dreidimensional nahe sein müssen, wenn
beide Enden beabstandet sind, die beiden Enden genetisch manipuliert
werden müssen, um nahe zueinander lokalisiert zu sein,
wobei ein Bindungspeptid verwendet wird. Wenn ein fremdes Protein
mit mehr als 50–60 Aminosäuren inseriert wird,
konnte tatsächlich im Falle vom LamB oder PhoE aufgrund
von strukturellen Beschränkungen kein stabiles Membranprotein
gebildet werden (Stahl, S. et al., Trends Biotechnol., 15:
185, 1997).
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Wenn
ein Zielprotein mit einem ausgewählten Oberflächen-Verankerungsmotiv
zur Expression auf der Oberfläche einer Zelle fusioniert
wird, sind bis jetzt drei allgemeine Fusionsverfahren zur Expression
auf der Oberfläche einer Zelle verwendet worden. Die Verfahren
sind wie folgt: ein Verfahren, bei dem ein zu exprimierendes Fremdprotein
mit dem C-terminalen Ende eines Oberflächen-Verankerungsmotivs
fusioniert wird, oder ein zu exprimierendes Fremdprotein wird direkt
mit einem Oberflächen-Verankerungsmotiv fusioniert, nachdem
das C-terminale Ende des Oberflächen-Verankerungsmotivs
deletiert wurde (C-terminale Deleti on/Fusion). In diesem Verfahren
können verwendet werden: INP, wobei Levansucrase zur Biokonversion
verwendet wird (Jung et al., Nat. Biotechnol., 16: 5142,
1999), ein „outer cell membrane Protein C" (OmpC)
mit Oberflächenexpression von Polyhistidin (Xu
und Lee, Appl. Environ. Microbiol., 65: 5142, 1999), FadL,
verwendet in Reaktionen, bei denen die Enantioselektivität
von Lipase gezeigt wird (Lee et al., Appl. Environ. Microbiol.,
70: 5074, 2004), und OprF (Lee et al., Appl. Environ.
Microbiol., 71: 8581, 2005).
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Im
Gegensatz zum obigen Verfahren besteht ein Verfahren, bei dem ein
zu exprimierendes Zielprotein mit dem N-terminalen Ende eines Oberflächen-Verankerungsmotivs
fusioniert wird. (Proteine von) Gram-positiven Bakterien, wie z.
B. Protein A von Staphylococcus aureus (Gunneriusson, E.
et al., J. Bacteriol, 178: 1341, 1996), Fibronectin-Bindungsprotein
B von Staphylococcus aureus (Stasuss, A. et al., Mol. Microbiol.,
21: 491, 1996), fibrilläres M-Protein von Staphylococcus
pyogenes (Pozzi, G. et al., Infect. Immun., 60: 1902, 1992),
können in diesem Verfahren verwendet werden. In diesem
Verfahren können keine Gram-negativen Bakterien, z. B.
E. coli, verwendet werden.
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Es
besteht auch ein Sandwich-Fusionsverfahren, bei dem ein fremdes
Protein, das auf der Oberfläche einer Zelle exprimiert
werden soll, zwischen den Proteinen, die als Oberflächen-Verankerungsmotiv
verwendet werden, fusioniert wird. Verschiedene Proteine, wie PhoE
(Agterverg, M. et al., Gene, 88: 37, 1990), FimH
(Pallesen, L., Microbiology, 141: 2839, 1995) und
PapA (Steidler, L. et al., J. Bacteriol., 175: 7639, 1993),
werden verwendet, um das Zielprotein auf der Oberfläche
von E. coli zu exprimieren. Dieses Verfahren konnte jedoch Nachteile
dahingehend, dass fremde Proteine nicht leicht zu fusionieren sind,
exprimierte fremde Proteine häufig inaktiviert) sind und
die Größe des fremden Proteins, das inseriert
werden kann, auf 60~70 Aminosäuren beschränkt
ist, nicht überwinden (Georgiou, G. et al., Nat.
Biotechnol., 15: 29, 1997; Stahl, S. et al., Trends Biotechnol.,
15: 185, 1997).
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Wie
oben beschrieben, ist das Anwendungsgebiet der Zelloberflächen-Präsentation
unter Einsatz bakterieller Expressionssysteme in der Biotechnologie
groß und es wird durch den Typ des Fremdproteins, das auf
der Oberfläche einer Zelle zu exprimieren ist, bestimmt.
Eine bakterielle Vakzine, die Epitope, die aus einem Pathogen stammen,
enthält, die auf der Zelloberfläche einer Zelle
exprimiert wird, kann bei Patienten angewendet werden, um eine stärkere
und nachhaltigere Immunreaktion zu induzieren als herkömmliche
Vakzine unter Verwendung von attenuierten bzw. abgeschwächten
pathogenen Mikroben oder Viren (Nguyen, T. N. et al., Gene,
128: 89, 1993). Leicht durchgeführt werden kann
die Durchmusterung von zahlreichen Peptiden oder Antikörpern,
wenn ein spezifisches Fab(-Fragment) oder ein Einzelkettenantikörper
sowie die oben genannten rekombinanten Lebendvakzine auf der Oberfläche
einer Zelle exprimiert werden (Francisco, J. A. R. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1: 10444, 1993). Darüber
hinaus ist diese Technik in hohem Maße wertvoll für
die Anwendung, wie z. B. Antikörperproduktion unter Verabreichung
von Bakterien, die ein spezifisches Antigen exprimieren, an Tiere
(Charbit, A. et al., Gene, 70: 181, 1988), Ganzzell-Absorbentien,
die zur Eliminierung von Schwermetallen oder zur Abwasserbehandlung
unter Verwendung von Mikroben, die Metall-absorbierende Proteine
auf der Zelloberfläche exprimieren, angewendet werden (Sousa,
C. et al., J. Bacteriol., 180: 2280, 1998) und Ganzzell-Biokonversion
unter Einsatz von Enzymen, die zur biologischen Konversion bzw. Umwandlung
verwendet werden, wobei diese stabil auf der Zelloberfläche
exprimiert und kontinuierlich ohne eine Abnahme der katalytischen
Aktivität verwendet werden (Richins, R. et al.,
Nat. Biotechnol., 15: 984, 1997).
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Es
besteht daher auf dem Fachgebiet ein dringender Bedarf an der Entwicklung
einer Zelloberflächen-Präsentationstechnik, die
in den zahlreichen Gebieten der Biotechnologie verwendbar ist, insbesondere der
Entwicklung eines Verfahrens, bei dem ein Zielprotein stabil und
effizient in großen Mengen auf der Oberfläche
von Bakterien exprimiert wird, einem neuen Oberflächen-Verankerungsmotiv
und einem Oberflächenexpressionsvektor, bei dem dieses
verwendet wird.
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Demgemäß haben
die bezeichneten Erfinder ausgiebige Anstrengungen unternommen,
um ein Oberflächen-Verankerungsmotiv zu entwickeln, das
ein fremdes Protein auf bzw. an der Oberfläche eines Mikroorganismus
effizient exprimieren, das exprimierte Protein an die Oberfläche
der Zelle überbringen und ein fremdes Protein mit hoher
Größe stabil überexprimieren kann, sowie
einen Vektor, der dieses verwendet. Als ein Ergebnis haben wir festgestellt,
dass, wenn ein rekombinanter Expressionsvektor unter Verwendung
des Exosporium-Proteins BclA, das aus Bacillus anthracis stammt,
als ein Zelloberflächen-Verankerungsmotiv konstruiert wird,
ein fremdes Protein in effizienter Weise auf der Oberfläche
einer Transformante überexprimiert wird, wodurch die vorliegende
Erfindung abgeschlossen wurde.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es demgemäß,
einen Oberflächenexpressionsvektor, umfassend das bclA-Gen,
das für Exosporium-BclA von Bacillus anthracis codiert,
als ein Zelloberflächen-Verankerungsmotiv, oder Fragmente
davon und ein Gen, das für ein Zielprotein codiert, sowie
einen Mikroorganismus, der mit dem Oberflächenexpressionsvektor
transformiert ist, bereitzustellen.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren
zum stabilen Exprimieren eines Zielproteins auf der Zelloberfläche
in großen Mengen durch Kultivieren des transformierten
Mikroorganismus bereitzustellen.
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Noch
eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren
zur Herstellung eines Proteinarrays bzw. einer Proteinanordnung,
ein Verfahren zum Produzieren eines Antikörpers, ein Biokonversionsverfahren
bereitzustellen, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist,
dass das gemäß dem obigen Verfahren oberflächenexprimierte
Zielprotein verwendet wird, und einen Ganzzell-Biosensor bereitzustellen, bei
dem die Wechselwirkung zwischen Biotin und einer Transformante,
die Streptavidin auf ihrer Oberfläche exprimiert, genutzt
wird.
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Um
die obigen Aufgaben zu erfüllen, stellt die vorliegende
Erfindung unter einem Aspekt einen Oberflächenexpressionsvektor
bereit, umfassend das bclA-Gen, das für das Exosporium-Protein
BclA von Bacillus anthracis codiert, als ein Zelloberflächen-Verankerungsmotiv,
oder die Fragmente davon und ein Gen, das für einen Promotor
und ein Zielprotein codiert, wobei der Expressionsvektor derart
konstruiert ist, dass das Zielprotein in einer Form, fusioniert
mit BclA oder einem Fragment davon, auf der Oberfläche
einer Zelle exprimiert wird, wenn ein Gen, das für das
Zielprotein codiert, in einer Wirtszelle exprimiert wird.
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Die
vorliegende Erfindung stellt unter einem weiteren Aspekt eine transformierten
Mikroorganismus bereit, der durch Einführen des Expressionsvektors
in eine Zelle, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend
aus Grampositiven Bakterien, Gram-negativen Bakterien, Actinomyces,
Hefe und Pilz, erhalten wird.
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Die
vorliegende Erfindung stellt unter noch einem weiteren Aspekt ein
Verfahren zum Exprimieren eines Zielproteins auf der Oberfläche
einer Zelle bereit, wobei das Verfahren die Stufen umfasst: Exprimieren des
Zielproteins auf der Zelloberfläche durch Kultivieren des
transformierten Mikroorganismus; und Gewinnen der Zelle, die das
Zielprotein auf ihrer Oberfläche exprimiert hat.
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Die
vorliegende Erfindung stellt unter noch einem weiteren Aspekt ein
Biokonversionsverfahren bereit, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet
ist, dass die Zellen verwendet werden, die mittels des obigen Verfahrens
hergestellt wurden und ein Zielprotein mit einer Enzymaktivität
auf ihrer Oberfläche exprimieren.
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Die
vorliegende Erfindung stellt unter noch einem weiteren Aspekt ein
Verfahren zur Herstellung eines Proteinarrays bzw. einer Proteinanordnung
bereit, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass die Zellen,
die mittels des obigen Verfahrens hergestellt wurden und das Zielprotein
exprimieren, exprimiert auf ihrer Oberfläche, an einem
Substrat angeheftet werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt unter einem weiteren Aspekt ferner
ein Verfahren zum Produzieren eines Antikörpers in Wirbeltieren
bereit, wobei das Verfahren die Stufen umfasst: (a) Induzieren einer
Immunreaktion durch Verabreichen der Zellen, die mittels des obigen
Verfahrens hergestellt wurden und ein Antigen auf ihrer Oberfläche
exprimieren, an ein Wirbeltier mit Ausnahme eines Menschen, und
(b) Gewinnen des Antikörpers, der durch die Immunreaktion
erzeugt wird.
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Die
vorliegende Erfindung stellt unter noch einem weiteren Aspekt ferner
ein Verfahren zur Herstellung bzw. zum Präparieren einer
chiralen Verbindung, wie chirale Ester, chirale organische Säuren
oder chirale Alkohole, bereit und zwar durch Durchführen
einer optischen Auftrennung bzw. Aufspaltung von racemischen Esterverbindungen
unter Verwendung von Lipase, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet
ist, dass die Lipase verwendet wird, die auf der Oberfläche
der Zelle exprimiert wird, hergestellt mittels des obigen Verfahrens.
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Die
vorliegende Erfindung stellt unter noch einem weiteren Aspekt ferner
einen Ganzzell-Biosensor bereit, der einen rekombinanten Mikroorganismus,
der mit einem Expressionsvektor, umfassend ein Gen, das für
Streptavidin codiert, und ein Gen für das Exosporium-Protein
BclA, abgeleitet bzw. stammend von Bacillus anthracis, als ein Zelloberflächen-Verankerungsmotiv,
transformiert ist, als einen wirksamen Bestandteil bzw. als ein
wirksames Ingrediens umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung stellt unter noch einem weiteren Aspekt ferner
ein Verfahren zur Verbesserung bzw. Optimierung eines Zielproteins
bereit, wobei das Verfahren die Stufen umfasst: (a) Etablieren einer mutanten
Bibliothek eines Gens, das für ein Zielprotein codiert;
(b) Konstruieren einer Genrekombinante bzw. eines rekombinanten
Gens („gene recombinant"), enthaltend die mutante Bibliothek
des Gens, das für das Zielprotein codiert, und das bclA-Gen;
(c) Transformieren einer Wirtszelle, die ausgewählt ist
aus der Gruppe, bestehend aus Gram-positiven Bakterien, Gram-negativen
Bakterien, Actinomyces, Hefe und Pilz, mit der Genrekombinante oder
einem Vektor, der die Genrekombinante enthält; (d) Exprimieren
der mutanten Bibliothek des Gens auf der Zelloberfläche
durch Kultivieren der transformierten Wirtszelle; und (e) Durchmusterung von
Zellen, auf denen das Zielprotein mit (einer) verbesserten Eigenschaft(en)
exprimiert wurde.
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Die
obigen und weitere Merkmale und Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung werden ausgehend von der folgenden detaillierten Beschreibung
und den angehängten Ansprüchen vollständiger
ersichtlich sein.
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KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
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1 zeigt
Strukturmerkmale, die aus einer Zelloberflächen-Präsentation
bzw. einem Zelloberflächen-Display unter Verwendung von
Exosporium(-Protein) BclA von Bacillus anthracis resultieren.
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2 bis 4 sind
genetische Karten der Expressionsvektoren pTJ1-BAN, pTJ1-BANC bzw. pTJ1-BAF.
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5 bis 7 sind
genetische Karten der Expressionsvektoren pTJ1-BAN-ScFv-SA, pTJ1-BANC-ScFv-SA
bzw. pTJ1-BAF-ScFv-SA.
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8 ist
eine Elektrophorese-Photographie, die das Analysenergebnis von Proteinen
der äußeren Zellmembran zeigt, die ausgehend von
einem rekombinanten E. coli, das mit den Expressionsvektoren pTJ1-BAN-Lip1,
pTJ1-BANC-Lip1 und pTJ1-BAF-Lip1 transformiert worden war, an einem
SDS-PAGE-Gel fraktioniert wurden.
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9 zeigt
die Analysenergebnisse von rekombinantem E. coli, transformiert
mit den Expressionsvektoren pTJ1-BAN-ScFv-SA, pTJ1-BANC-ScFv-SA
und pTJ1-BAF-ScFv-SA, wobei Durchflusscytometrie angewandt wurde.
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10 zeigt
die Analysenergebnisse von rekombinantem E. coli, transformiert
mit einem Expressionsvektor, pTJ1-BAF-EGFP, wobei Durchflusscytometrie
und konfokale Mikroskopie angewandt wurden.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG UND VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Unter
einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Oberflächenexpressionsvektor,
der das bclA-Gen, das für BclA, Exosporium-Protein von
Bacillus anthracis als ein Zelloberflächen-Verankerungsmotiv, codiert,
oder ein Fragment davon umfasst, der derart konstruiert ist, dass
das Zielprotein in einer Form, fusioniert mit BclA oder einem Fragment
davon, auf der Oberfläche einer Zelle exprimiert werden
kann, wenn ein Gen, das für das Zielprotein codiert, in
einer Wirtszelle exprimiert wird, einen Mikroorganismus, der mit
dem Expressionsvektor transformiert ist, und ein Verfahren zum Exprimieren
des Zielproteins auf der Oberfläche eines Mikroorganismus,
wobei dieser verwendet wird.
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In
der vorliegenden Erfindung ist ein Fragment des bclA-Gens vorzugsweise
das N-terminale Ende vom bclA-Gen von SEQ ID NO: 1, das N-terminale
Ende und das C-terminale Ende von SEQ ID NO: 2, worin der mittlere
Teil aus dem bclA-Gen deletiert ist, und SEQ ID NO: 3.
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In
der vorliegenden Erfindung ist der verwendete Promotor vorzugsweise
der tac-Promotor oder ein beliebiger anderer induzierbarer Promotor
und das Zielprotein ist vorzugsweise ein Protein, hergestellt durch Deletieren
eines Teils von Aminosäuresequenzen des Zielproteins oder
indem es einer ortsspezifischen Mutation unterworfen wird, um die
Oberflächenexpression des Zielproteins zu erleichtern bzw.
zu begünstigen.
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In
der vorliegenden Erfindung ist der für die Transformation
verwendete Mikroorganismus vorzugsweise ein Mikroorganismus, der
derart mutiert ist, dass eine intrazelluläre oder extrazelluläre
Protease, die das exprimierte Protein abbaut, nicht produziert werden
kann, um die Oberflächenexpression des Zielproteins zu begünstigen,
vorzugsweise handelt es sich um Escherichia coli.
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In
der vorliegenden Erfindung ist das Zielprotein vorzugsweise eines,
ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hor monen, Hormonanaloga,
Enzymen, Enzyminhibitoren, Signaltransduktionsproteinen oder ihren
Fragmenten, Antikörpern oder ihren Fragmenten, Einzelkettenantikörpern,
Bindungsproteinen, Bindungsdomänen, Peptiden, Antigenen,
adhärenten Proteinen, Strukturproteinen, regulatorischen
Proteinen, Toxinproteinen, Cytokinen, Transkriptionsfaktoren, Blutgerinnungsfaktoren
und Abwehr-induzierenden Pflanzenproteinen („plant defense-inducing
Protein"). Das Zielprotein ist vorzugsweise Streptavidin und das
Enzym ist vorzugsweise Lipase.
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Die
bezeichneten Erfinder wählten BclA, ein Exosporium-Protein,
das von Bacillus anthracis stammt, als Zelloberflächen-Verankerungsmotiv,
das eine in hohem Maße wirksame Sekretionssignalsequenz
und ein Targetierungssignal aufweist, was es ermöglicht,
ein Zielprotein stabil an der Oberfläche der äußeren
Zellmembran anzuheften, und es ist dazu befähigt, Zielproteine
hoher Größe zu überbringen und eine große
Menge an Zielproteinen stabil zu exprimieren, und zwar im Hinblick
auf eine erfolgreiche Präsentation an der Zelloberfläche.
Zusätzlich ist BclA gemäß der vorliegenden
Erfindung wirksam bzw. effektiv im Hinblick auf die Präsentation
an der Zelloberfläche und das stabile Exprimieren einer
großen Menge an Zielproteinen, im Hinblick auf eine erfolgreiche
Präsentation an der Zelloberfläche mit einer einzelnen
Einheit der Spore von Bacillus anthracis („cell surface
display single unit spore of Bacillus anthracis").
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1 ist
eine Schemadarstellung, die die charakteristische Struktur zeigt,
die aus einer Präsentation an der Zelloberfläche
unter Verwendung von BclA, Exosporium-Protein von Bacillus anthracis,
resultiert (Ptac: tac-Promotor, BA-N: das N-terminale Ende von BclA,
BA-RD: GXX-Aminosäure-Wiederholungsregion, BA-C: das C-terminale
Ende von BclA, Protein: rekombinantes fremdes Protein). Das heißt,
dass, wie in 1 gezeigt, in der Struktur von BclA,
Exosporium-Protein von Bacillus anthracis, das N-terminale Ende
und das C-terminale Ende identische Aminosäuresequenzen
besitzen, ungeachtet der Art von Bacillus anthracis, und dass drei
Aminosäuren ((GPT)1-8GDTGTT) wiederholt
in der Mitte des Proteins auftreten (Sylvestre et al., Mol. Microbiol.,
45: 169, 2002; Sylvestre et al., J. Bacteriol.,
185: 1555, 2003).
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BclA
ist ein Collagen-analoges Protein, dessen N-terminales Ende aus
40 Aminosäuren besteht und dessen C-terminales Ende aus
138 Aminosäuren besteht, und das insbesondere für
die Präsentation an der Zelloberfläche wirksam
ist, und zwar trotz des Fehlens einer spezifischen Sekretionssignalsequenz
am N-terminalen Ende (Sylvestre et al., Mol. Microbiol.,
45: 169, 2002; Sylvestre et al., J. Bacteriol.,
185: 1555, 2003).
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Dementsprechend
sagten die bezeichneten Erfinder die Struktur von BclA, Exosporium-Protein
von Bacillus anthracis, (als geeignet) zum Exprimieren eines Zielproteins
auf der Zelloberfläche unter Verwendung eines Oberflächen-Verankerungsmotivs,
das das vollständige oder einen Teil des Exosporium-Proteins
enthält, voraus.
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Um
das bclA-Gen zu erhalten, das für ein aus Bacillus anthracis
stammendes Exosporium-Protein codiert, wurde das bclA-Gen (NCBI
Eingangs-Nr. AJ516945) von Bacillus anthracis RA3 (NCBI Eingangs-Nr. CAD56878),
ausgehend von dem bclA-Gen, das von Blue Heron Biotechnology Co.
(Botell, WA, USA) vertrieben wird, synthetisiert, wobei eine de
novo-Synthese angewandt wurde. Ein so synthetisiertes 762 bp großes DNA-Fragment
mit EcoRI- und XbaI-Schnittstellen wurde in das Plasmid pTAC99A
(Park und Lee, Biotechnol. Tech., 12: 815: 1998)
zusammen mit einer Mehrfachklonierungsstelle eingefügt,
wobei PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion) verwendet wurde, um das Zielprotein
zu inserie ren. Somit wurde ein rekombinantes Plasmid, pTJ1-BA, hergestellt.
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In
dem hergestellten rekombinanten Plasmid, pTJ1-BA, wird das Exosporium-Protein
BclA von Bacillus anthracis mittels Induktion des tac-Promotors
exprimiert. Für ein Modellprotein, das auf der Oberfläche
einer Zelle exprimiert werden soll, wurde ein Gen in einer Form,
wobei ScFv (ein Einzelkettenantikörper gegen ein Oberflächenprotein
von Heptatitis B-Virus) mit cSA (Core-Streptavidin) fusioniert ist,
in die Schnittstellen von Restriktionsenzymen, XmaI und XhoI, die
im C-terminalen Ende des Exosporium-Proteins vorhanden sind, inseriert.
Somit wurde ein rekombinanter Expressionsvektor, pTJ1-BAF-ScFv-SA
(7), hergestellt. pTJ1-BAN-ScFv-SA und pTJ1-BANC-ScFv-SA
wurden ebenso mittels des oben beschriebenen Verfahrens hergestellt,
um zu untersuchen, ob das N-terminale Ende, aus dem die wiederholten
Aminosäuresequenzen, (GPT)1-8GDTGTT,
eliminiert worden waren, oder eine fusionierte Form des N-terminalen
Endes und des C-terminalen Endes auf der Oberfläche von
E. coli als ein Oberflächen-Verankerungsmotiv verwendet
werden können (5 und 6).
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Darüber
hinaus wurden pTJ1-BAN-Lip1 und pTJ1-BANC-Lip1 und pTJ1-BAF-Lip1,
eine Fusion mit Lipase, mittels des gleichen Verfahrens zur Herstellung
eines Fusionsprotein-Gens von einem Einzelkettenantikörper
und Streptavidin hergestellt.
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Die
hergestellten rekombinanten Expressionsvektoren, pTJ1-BAN-Lip1 und
pTJ1-BANC-Lip1 oder pTJ1-BAF-Lip1 wurden in E. coli, und zwar den
Stamm XL1-Blue, eingeführt, um die so erhaltene Transformante
zu kultivieren, und ein die Expression induzierender Faktor, zum
Beispiel IPTG (Isopropyl-β-thiogalactosid), wurde der Kulturbrühe
zugesetzt, um die Expression zu induzieren. Anschließend
wurde eine gewisse Menge der Kulturbrühe entnommen, um
Proteine der äu ßeren Zellmembran zu fraktionieren,
gefolgt vom Analysieren der fraktionierten Proteine unter Verwendung
von SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese).
Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass die fraktionierten
Proteine erfolgreich in BclA, Exosporium-Protein von Bacillus anthracis,
inseriert sind, so dass sie auf der Oberfläche der Zelle
exprimiert werden, und es wurde auch festgestellt, dass die Menge
an BclA, Exosporium-Protein von Bacillus anthracis, fusioniert mit
den gewünschten Proteinen, bezogen auf das gesamte Protein
der äußeren Zellmembran, 30%~45% betrug, was nahe
legt, dass der Anteil bzw. die Rate sehr hoch ist (8).
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Mittels
Protein-Ligand-Wechselwirkung unter Verwendung von Biotin-beschichteten
fluoreszierenden Kügelchen bzw. Beads wurde darüber
hinaus untersucht, ob Streptavidin (Zielprotein), das erfolgreich
auf der äußeren Zellmembran von E. coli exprimiert
wurde, nachdem dieses mit den hergestellten rekombinanten Expressionsvektoren
pTJ1-BAN-ScFv-SA, pTJ1-BANC-ScFv-SA oder pTJ1-BAF-ScFv-SA transformiert
wurde, Aktivität aufweist. Als ein Ergebnis wurde festgestellt,
dass, wenn ein mit BclA-ScFv-SA fusioniertes Protein auf der Oberfläche
der Zelle exprimiert wurde, Biotin erfolgreich an Streptavidin auf
der Oberfläche der Zelle gebunden wurde, wobei sehr hohe
Fluoreszenzniveaus resultierten (9). Das
Ergebnis legt nahe, dass alle Streptavidine (Zielproteine), exprimiert
auf der äußeren Zellmembran, an bzw. auf der äußeren
Oberfläche der Zelle exprimiert wurden. Insbesondere wurde
festgestellt, dass ein rekombinantes Protein von etwa 40 kDa, was
eine relativ hohe Größe ist, so inseriert wurde,
dass es erfolgreich auf der Zelloberfläche exprimiert wird, was
somit nahe legt, dass das erfindungsgemäße BclA,
Exosporium-Protein von Bacillus anthracis, ein sehr wirksames Oberflächen-Verankerungsmotiv
ist.
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In
der vorliegenden Erfindung kann, wenn das Zielprotein in einer Zelle
oder auf der Außenseite einer Zelle exprimiert wird, das
Zielprotein-Gen ein Gen sein oder ein Gen, das mehr als zweimal
wiederholt wird, oder das Zielprotein, das mehr als zweimal wiederholt
wird, kann für die gleichen Gene oder verschiedene Gene
stehen und das Zielprotein-Gen kann auch jede beliebige Kombination
der obigen sein.
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Für
den Fachmann auf dem Gebiet ist es offensichtlich, dass das mittels
des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellte
Gen unabhängig in einem Plasmid vorliegen oder in ein Chromosom
eines Wirtsbakteriums inseriert sein kann.
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Für
einen Fachmann auf dem Gebiet ist ebenso offensichtlich, dass eine
Induktion der Expression von Zielprotein durchgeführt werden
kann mittels eines Promotors, der zum Induzieren der Expression
in einer Wirtszelle befähigt ist, eines Promotors eines
Zielproteingens oder eines geeigneten anderen Promotors, der zur
Expression in einer Wirtszelle befähigt ist.
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Indessen
kann das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung
auf alle Proteine angewendet werden und es kann verwendet werden
zum Modifizieren und Oberflächen-Exprimieren von Proteinen,
wie Hormonen, Hormonanaloga, Enzymen, Enzyminhibitoren, Antikörpern,
Signaltransduktionsproteinen, Einzelkettenantikörpern,
Antigenen, Peptiden, Polypeptiden, Bindungsproteinen, Bindungsdomänen,
adhärenten Proteinen, Strukturproteinen, regulatorischen
Proteinen, Toxinproteinen, Cytokinen, zahlreichen regulatorischen Faktoren
und ihren Fragmenten.
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Es
gibt zahlreiche Verfahren, um zu beweisen, dass ein Zielprotein,
Oberflächen-exprimiert auf der äußeren
Zellmembran eines Mikroorganismus mittels des erfinderischen Expressionsverfahrens,
das oben beschrieben wurde, auf der Zelloberfläche vorliegt.
Die Verfahren sind wie folgt: ein Verfahren, bei dem Sporen fluoreszierend
gefärbt wurden durch Binden eines primären Antikörpers
an ein Zielprotein, das auf der äußeren Zellmembran
eines Mikroorganismus Oberflächen-exprimiert wurde, und
Umsetzung mit einem fluoreszierend markierten sekundären
Antikörper, um eine Beobachtung unter Fluoreszenzmikroskopie
oder eine Analyse unter Verwendung von Durchflusscytometrie durchzuführen.
Wenn hierin der sekundäre Antikörper mit Gold
markiert ist, kann das Zielprotein unter Verwendung eines Elektronenmikroskops
beobachtet bzw. festgestellt werden.
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Es
besteht ein Verfahren zum Untersuchen, ob die Enzymaktivität
verringert ist oder das Signal des Fluoreszenzmikroskops oder Durchflusscytometers
abgeschwächt ist aufgrund des Abbaus bzw. der Degradation
der Oberflächenexprimierten Proteine durch Protease, die
sich auf der Außenseite befindet.
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Und
es besteht ein Verfahren in dem bzw. für den Fall, bei
dem ein Zielprotein ein Enzym ist, wobei ein Polymermaterial als
Substrat verwendet wird, in dem die Existenz des Zielproteins mittels
der gemessenen Enzymaktivität, resultierend aus Enzymen,
die auf der Zelloberfläche exponiert sind, bewiesen werden
kann, da das Substrat, wenn die Enzymaktivität gemessen
wird, nicht zwischen den äußeren Oberflächenstrukturen von
Sporen hindurch passieren kann.
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Unter
einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Biokonversionsverfahren,
wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass die Zellen,
die mittels des obigen Verfahren hergestellt wurden und das Zielprotein
mit einer Enzymaktivität auf ihrer Oberfläche
exprimieren, verwendet werden.
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Unter
noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein
Verfahren zum Herstellen einer chiralen Ver bindung, wie chirale
Ester, chirale organische Säuren oder chirale Alkohole,
wobei eine optische Auftrennung von racemischen Esterverbindungen
unter Verwendung von Lipase durchgeführt wird, wobei das
Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass Lipase verwendet wird,
die auf der Oberfläche der Zellen, die mittels des obigen
Verfahrens hergestellt wurden, exprimiert wird bzw. ist.
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Unter
noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein
Verfahren zur Herstellung eines Proteinarrays bzw. einer Proteinanordnung,
wobei das Verfahren das Anheften von Zellen, die mittels des obigen
Verfahrens hergestellt wurden und das Zielprotein auf ihrer Oberfläche
exprimieren, an einem Substrat umfasst.
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Proteinarrays
stellen Mittel zum Analysieren der Expression oder Nicht-Expression
und des Expressionslevels eines Zielproteins in spezifischen Zellen
bereit, indem verschiedene Proteine, insbesondere Antikörper,
auf einer festen Oberfläche, wie z. B. DNA-Chips oder DNA-Arrays,
angeordnet werden. Zur Herstellung eines Proteinarrays werden anzuordnende
Proteine hergestellt und anschließend auf einer festen
Oberfläche immobilisiert. Da eine analytische Verfahrensweise,
bei der ein Proteinarray verwendet wird, eine Stufe der Bindung
an fixierte Proteine an einem Substrat und eine Stufe des Waschens,
die ungebundene Proteine unter verschiedenen Bedingungen von hoher
Temperatur, Salzkonzentration und pH-Änderung entfernt,
umfasst, benötigt sie daher eine stabile Immobilisierung
von Proteinen, um derart stringente Bedingungen zu überwinden
bzw. zu überstehen.
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Jedoch
erfordert die Verfahrensweise des Klonierens von tausenden und zehntausenden
von Proteingenen in einen Expressionsvektor, Exprimieren und Isolieren
des Proteingens, gefolgt von der Immobilisierung an der Oberfläche
eines Feststoffs, viele wiederholte Arbeitsschritte. Daher bedarf
die Verfahrensweise einer Durchführung auf eine einfache
und schnelle Weise.
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Das
Verfahren zum Herstellen eines Proteinarrays gemäß der
vorliegenden Erfindung liefert die Mittel zum Durchführen
der oben genannten Verfahrensweise auf einfachste Weise. Gemäß dem
erfinderischen Verfahren wird ein Zielprotein, das mittels des obigen
Verfahrens exprimiert wird, isoliert, um es auf der Oberfläche eines
Feststoffs zu immobilisieren. Für den Vorgang bzw. das
Verfahren der Herstellung eines Proteinarrays gemäß der
vorliegenden Erfindung können die herkömmlichen,
auf dem Fachgebiet verwendeten Verfahren verwendet werden (
WO 00/61806 ;
WO 00/54046 ;
US 5,807,754 ,
EP 0818467 ;
WO 97/42507 ;
US 5,114,674 ;
WO 96/35953 ). Die gemäß der
vorliegenden Erfindung hergestellten Proteinarrays können
für Detektionskits, die Analyse der Genexpression, die
Wechselwirkungsanalyse zwischen Proteinen oder zwischen Proteinen und
ihrer Liganden und zwischen Antikörpern und Antigenen,
die Analyse von Stoffwechselwegen, die Suche nach neuen Enzymen
oder verbesserten Enzymen, die kombinierte biologische Synthese
und für Biosensoren angewendet werden.
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Das
feste Substrat, das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden
kann, kann Gläser (z. B. Gläser mit exponierten
funktionellen Gruppen), Si, Ge, GaAs, GaP, SiO, SiN4,
modifiziertes Silikon Nitrocellulose, Polyvinylidenfluorid, Polystyrol,
Polytetrafluorethylen, Polycarbonat, Nylon, Faser(n) oder deren
Kombination umfassen. Das Substrat kann eine Fixierung mit Linkermolekülen
zur Proteinimmobilisierung aufweisen und der Rest der Fläche
ohne Aufbringung bzw. „Spotting" ist vorzugsweise blockiert.
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Unter
noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein
Verfahren zum Herstellen eines Antikörpers in Wirbeltieren,
wobei das Verfahren die Stufen umfasst: (a) Induzieren eines Immunreaktion durch
Verabreichen von Zellen, die mittels des obigen Verfahrens hergestellt
wurden und ein Antigen auf ihrer Oberfläche exprimiert
haben, an Wirbeltiere mit der Ausnahme von Menschen; und (b) Gewinnen
der Antikörper, die mittels der Immunreaktion produziert
wurden.
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Unter
noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen
Ganzzell-Biosensor, der einen rekombinanten Mikroorganismus, der
mit einem Expressionsvektor transformiert ist, enthaltend ein Gen, das
für das Exosporium-Protein BclA, stammend von Bacillus
anthracis, welches ein Zelloberflächen-Verankerungsmotiv
ist, und ein Gen, das für Streptavidin codiert, als einen
wirksamen Bestandteil bzw. effektives Ingrediens umfasst. In der
vorliegenden Erfindung ist der transformierte Mikroorganismus vorzugsweise
E. coli.
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Unter
noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein
Verfahren zur Verbesserung eines Zielproteins, wobei das Verfahren
die Stufen umfasst: (a) Etablieren einer mutanten Bibliothek eines Gens,
das für ein Zielprotein codiert; (b) Konstruieren einer
Genrekombinante bzw. eines rekombinanten Gens, enthaltend die mutante
Bibliothek des Gens, das für das Zielprotein codiert, und
bclA-Gen; (c) Transformieren einer Wirtszelle, die ausgewählt
ist aus der Gruppe, bestehend aus Gram-positiven Bakterien, Gram-negativen Bakterien,
Actinomyces, Hefe und Pilz, mit der Genrekombinante oder einem Vektor,
der die Genrekombinante enthält; (d) Exprimieren der mutanten
Bibliothek des Gens auf der Zelloberfläche durch Kultivieren
der transformierten Wirtszelle; und (e) Durchmusterung von bzw.
auf Zellen, auf denen das Zielprotein mit (einer) verbesserten Eigenschaft(en)
exprimiert wurde.
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In
der vorliegenden Erfindung nutzt die Stufe der Durchmusterung vorzugsweise
eine Aktivität des Zielproteins, ein Protein, erkennend
eine Substanz, mit der das Zielpro tein markiert ist, einen markierten
Liganden, der an das Zielprotein bindet, oder einen Antikörper,
der spezifisch an das Zielprotein bindet.
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Im
Verfahren zur Verbesserung eines Zielproteins gemäß der
vorliegenden Erfindung kann die Konstruktion einer Genbibliothek
durchgeführt werden, indem ein Wildtypgen eines Zielproteins
mutiert wird, und zwar unter Verwendung des DNA-Shuffling-Verfahrens
(Stemmer, Nature, 370: 389, 1994), des StEP-Verfahrens
(Zhao, H. et al., Nat. Biotechnol., 16: 258, 1998),
des RPR-Verfahrens (Shao, Z. et al., Nucleic Acids Res., 26:
681, 1998), des „Molecular-Breeding"-Verfahrens
(Ness, J. E. et al., Nat. Biotechnol. 17: 893, 1999),
des ITCHY-Verfahrens (Lutz, S. et al., Cur. Opi. Biotechnol.
11: 319, 2000), von Fehler-auslösender bzw. „Error-prone"-PCR
(Cadwell, R. C. et al., PCR Methods Appl., 2: 28, 1992),
von Punktmutation (Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), ist
jedoch nicht darauf eingeschränkt.
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Im
Verfahren zur Verbesserung eines Zielproteins gemäß der
vorliegenden Erfindung kann die Stufe der Durchmusterung rasch durchgeführt
werden, indem eine Proteinaktivität gemessen wird oder
mittels FACS-Analyse (Georgiou, G., Adv. Protein Chem.,
55: 293, 2000). In dem Falle, in dem die Proteinaktivität
verwendet wird, kann die Durchmusterung durchgeführt werden,
indem das Wachstum einer Wirtszelle, in der Proteine exprimiert
werden, oder die Reaktion hinsichtlich einer Farbentwicklung, die
durch Proteine katalysiert wird, gemessen wird. Darüber
hinaus kann in dem erfinderischen Verfahren zur Verbesserung eines
Zielproteins unter Verwendung von Sporenresistenz die Stufe der
Durchmusterung rasch durchgeführt werden, indem eine Proteinaktivität
oder Stabilität einer Proteinstruktur verwendet bzw. genutzt
wird.
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Wenn
das Verfahren zur Verbesserung von Proteinen gemäß der
vorliegenden Erfindung, das die oben genannten Merkmale aufweist,
verwendet wurde/würde, können Enzyme, katalysierend
eine biologisch nicht auftretende chemische Reaktion, die nicht
leicht mittels herkömmlichen Verfahren erhalten werden
kann (z. B. Diels-Alder-Kondensationsreaktion), Enzyme mit einer
Aktivität hinsichtlich nicht-natürlicher Stereoselektivität
oder Regioselektivität, Enzyme, die zum Katalysieren einer
Reaktion in einem organischen Lösungsmittel oder einer
wässrigen Lösung eines organischen Lösungsmittels
befähigt sind, Enzyme, katalysierend eine Reaktion unter
extremen Bedingungen, wie z. B. Hochdruck und hohe Temperatur, usw.,
die nicht leicht mittels herkömmlicher Verfahren erhalten
werden können, rasch ausgehend von Wildtyp-Enzymen erhalten werden.
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Das
erfinderische Verfahren zur Verbesserung von Proteinen kann auch
das Problem der Abnahme der Überlebensrate von Bakterien
bei Wiederanimpfen in einem Kulturmedium lösen, wenn eluiert
wird mittels einer dramatischen Änderung des pH-Werts oder
mittels Regulieren der Basenkonzentration zur Durchmusterung einer
Antikörpermutante mit einer erhöhten Bindungsfähigkeit.
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Da
unterdessen bestätigt wurde, dass ein Mikroorganismus,
transformiert mit einem Vektor, der so konstruiert ist, dass Streptavidin
als fremdes Protein exprimiert wird, unter Wechselwirkung mit Biotin
effektiv eine Protein-Ligand-Reaktion induziert, kann die vorliegende
Erfindung eingesetzt werden für einen Biosensor mit bzw. über
Protein-Ligand-Wechselwirkung, der eine Transformante, transformiert
mit einem Expressionsvektor, der derart konstruiert ist, dass sie
auf der Zelloberfläche in einer Form exprimiert, in der
Streptavidin mit BclA fusioniert ist, als einen wirksamen bzw. effektiven
Bestandteil enthält.
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Weiterhin
wurde die Expression einer fluoreszierenden Substanz auf einem rekombinanten
E. coli unter Verwendung von konfokaler Lasermikroskopie beobachtet,
nachdem Exosporium(-Protein) von Bacillus anthracis, BclA, mit einem
grün fluoreszierenden Protein fusioniert worden war (10).
Als Ergebnis wurde festgestellt, dass das grün fluoreszierende
Protein erfolgreich exprimiert wurde auf der Oberfläche
einer E. coli-JM109-Transformante mit einem rekombinanten Expressionsvektor,
die das grün fluoreszierende Protein, fusioniert mit BclA,
exprimiert, wobei ein Vergleich mit grün fluoreszierendem
Protein, das in Zellen exprimiert wurde, erfolgte. Daher kann das
rekombinante E. coli gemäß der vorliegenden Erfindung
als ein Biosensor, wobei Protein-Ligand-Wechselwirkung verwendet
wird, und ein fluoreszierender Sensor, wobei Proteine, die auf der
Zelloberfläche exprimiert werden, verwendet werden, verwendet
werden.
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Beispiele
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Die
vorliegende Erfindung wird hiernach durch Beispiele in weiteren
Details beschrieben werden. Es wird jedoch für einen Fachmann
auf dem Gebiet offensichtlich sein, dass diese Beispiele lediglich
zu Zwecken der Erläuterung gegeben werden und der Rahmen
der vorliegenden Erfindung nicht auf diese Beispiele eingeschränkt
ist.
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Als
fremdes Gen wird insbesondere nicht nur das Streptavidin-Gen, beschrieben
in den unten stehenden Beispielen, sondern können auch
zahlreiche Zielproteine oder Peptidgene in die erfindungsgemäßen
Expressionsvektoren pTJ1-BAN, pTJ1-BANC, pTJ1-BAF, die zu ihrer
Expression verwendet werden sollen, eingeführt werden.
Daher sollten die rekombinanten Expressionsvektoren pTJ1-BAN, pTJ1-BANC,
pTJ1-BAF mit Insertion verschiedener Arten von Genen auch als im
Rahmen der vorliegenden Erfindung liegend angesehen werden.
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Beispiel 1: Konstruktion des rekombinanten
Expressionsvektors pTJ1-BA
-
Um
das BclA-Gen, Bacillus anthracis-Exosporium, zu erhalten, wurde
das BclA-Gen von Bacillus anthracis RA3 (NCBI-Eingangsnr. CAD56878)
synthetisiert, um PCR unter Verwendung des synthetisierten Gens als
Matrize durchzuführen. Die PCR wurde unter den folgenden
Bedingungen durchgeführt: 30 Zyklen einer ersten Denaturierung
bei 94°C für 7 min, einer zweiten Denaturierung
bei 94°C für 1 min, einer Anlagerung bzw. Hybridisierung
bei 55°C für 1 min, einer Verlängerung
bei 72°C für 1 min und einer abschließenden
Verlängerung bei 72°C für 7 min, wobei
die Primer mit SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 verwendet wurden.
-
-
Ein
DNA-Fragment von 770 bp, das mittels der PCR erhalten wurde, wurde
unter Verwendung von Agarosegelelektrophorese isoliert und mit zwei
Restriktionsenzymen, EcoRI und XbaI, verdaut. Zur gleichen Zeit
wurde das Plasmid pTac99A (Park und Lee, Biotechnol. Techn.,
12: 815, 1998), das den induzierbaren und starken tac-Promotor
enthält, mit den zwei Restriktionsenzymen EcoRI und XbaI
verdaut und mit dem resultierenden DNA-Fragment gemischt und anschließend
mit T4-DNA-Ligase verknüpft bzw. ligiert, gefolgt von der
Transformation von E. coli XL1-Blue unter Verwendung von Elektroporation.
Der transformierte Stamm wurde auf LB-Agarmedium, das ein Antibiotikum,
Ampicillin (100 μg/ml), enthielt, durchmustert und so das
rekombinante Plasmid pTJ1-BA erhalten.
-
In
dem rekombinanten Plasmid pTJ1-BA, das wie oben hergestellt wurde,
kann das Gen für das Exosporium-Protein BclA, das als Oberflächen-Verankerungsmotiv
verwendet werden soll, durch den starken, induzierbaren tac-Promotor
exprimiert werden. Die Mehrfachklonierungsstelle des rekombinanten
Plasmids pTJ1-BA enthält die Schnittstellen für
die Restriktionsenzyme XmaI und XhoI, und ein Zielprotein, das auf
der Zelloberfläche exprimiert werden soll, wird in die
Schnittstellen inseriert.
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Beispiel 2: Konstruktion der rekombinanten
Vektoren pTJ1-BAN, pTJ1-BANC und pTJ1-BAF
-
BclA
(Bacillus anthracis-Exosporium), das als Zelloberflächen-Verankerungsmotiv
verwendet wird, weist eine wiederholte Aminosäuresequenz,
(GPT)1-8GDTGTT, zwischen dem N-terminalen
Ende und dem C-terminalen Ende auf (Sylvestre et al., Mol.
Microbiol., 45: 169, 2002).
-
2-1: Konstruktion des rekombinanten Expressionsvektors
pTJ1-BAN
-
Um
zu untersuchen, ob nur das N-terminale Ende als Zelloberflächen-Verankerungsmotiv
verwendet werden kann, wurde jedes Zelloberflächen-Verankerungsmotiv
derart gestaltet, dass es mit einem Zielprotein fusioniert werden
kann.
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Für
die Konstruktion eines Plasmids, bei dem das N-terminale Ende des
BclA-Gens als Zelloberflächen-Verankerungsmotiv verwendet
wird, wurde eine PCR unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
30 Zyklen einer ersten Denaturierung bei 94°C für
5 min, einer zweiten Denaturierung bei 94°C für
30 s, einer Anlagerung bei 56°C für 30 s, einer
Verlängerung bei 72°C für 30 s und mit
der abschließenden Verlängerung bei 72°C
für 7 min, wobei die Primer von SEQ ID NO: 4 von Beispiel
1 und von SEQ ID NO: 6 verwendet wurden:
-
Ein
DNA-Fragment von 90 bp, erhalten mittels der PCR, wurde unter Verwendung
von Agarosegelelektrophorese isoliert und mit zwei Restriktionsenzymen,
EcoRI und XbaI, verdaut. Zur gleichen Zeit wurde das Plasmid pTac99A
(Park und Lee, Biotechnol. Techn., 12: 815, 1998),
das den induzierbaren starken tac-Promotor enthält, mit
den zwei Restriktionsenzymen EcoRI und XbaI verdaut und mit dem
resultierenden DNA-Fragment gemischt und anschließend mit
T4-DNA-Ligase verknüpft, gefolgt von der Transformation
von E. coli XL1-Blue unter Verwendung von Elektroporation. Der transformierte
Stamm wurde auf LB-Agarmedium, das ein Antibiotikum, Ampicillin
(100 μg/ml) enthielt, durchmustert, wodurch so der rekombinante
pTJ1-BAN erhalten wurde.
-
In
dem rekombinanten Plasmid pTJ1-BAN, das wie oben beschrieben hergestellt
wurde, kann das N-terminale Ende des Exosporium-Protein BclA-Gens,
das als Oberflächen-Verankerungsmotiv verwendet werden
soll, durch den starken, induzierbaren tac-Promotor exprimiert werden.
Die Mehrfachklonierungsstelle des rekombinanten Plasmid pTJ1-BAN
enthält Schnittstellen für die Restriktionsenzyme
XmaI und XhoI, und ein Zielproteingen, das auf der Zelloberfläche
exprimiert werden soll, wird in die Schnittstellen inseriert. Die
genetische Karte des rekombinanten Expressionsvektors, der wie oben
beschrieben konstruiert wurde, ist in 2 dargestellt.
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2-2: Konstruktion des rekombinanten Expressionsvektors
pTJ1-BANC
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Um
zu untersuchen, ob nur das N-terminale Ende und das C-terminale
Ende von BclA, aus dem eine wiederholte Aminosäuresequenz,
(GPT)1-8GDTGTT deletiert ist, als ein Oberflächen-Verankerungsmotiv
verwendet werden können, wurde jedes Oberflächen-Verankerungsmotiv
so gestaltet, dass es mit einem Zielprotein fusioniert werden kann.
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Um
zu untersuchen, ob eine fusionierte Form aus dem N-terminalen Ende
und dem C-terminalen Ende des BclA-Gens als Oberflächen-Verankerungsmotiv
verwendet werden kann, wurde jedes Oberflächen-Verankerungsmotiv
so gestaltet, dass es/sie mit einem Zielprotein fusioniert werden
kann/können.
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Für
die Konstruktion eines Plasmids, bei dem das N-terminale Ende und
das C-terminale Ende des BclA-Gens als Oberflächen-Verankerungsmotiv
verwendet werden, wurde eine PCR durchgeführt. Ein Gen(abschnitt)
am N-terminalen Ende von BclA wurde amplifiziert unter Verwendung
der Primer von SEQ ID NO: 4 in Beispiel 1 und von SEQ ID NO: 7,
und ein Gen(abschnitt) am C-terminalen Ende von BclA wurde amplifiziert
unter Verwendung von SEQ ID NO: 5 in Beispiel 1 und SEQ ID NO: 8.
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-
Da
jede DNA aus dem N-terminalen Ende und aus dem C-terminalen Ende
von so amplifiziertem BclA eine überlappende Sequenz aufweist,
erfolgt eine erneute Amplifikation mittels PCR unter Verwendung
der Primer von SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5. Die PCR wurde unter
den folgenden Bedingungen durchgeführt: 30 Zyklen einer
ersten Denaturierung bei 94°C für 5 min, einer
zweiten Denaturierung bei 94°C für 45 s, einer Anlagerung
bei 56°C für 45 s, einer Verlängerung
bei 72°C für 40 s und der abschließenden
Verlängerung bei 72°C für 7 min.
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Ein
DNA-Fragment von 560 bp, das mittels der PCR erhalten wurde, wurde
unter Verwendung von Agarosegelelektrophorese isoliert und mit zwei
Restriktionsenzymen, EcoRI und XbaI, verdaut. Zur gleichen Zeit
wurde das Plasmid pTac99A (Park und Lee, Biotechnol. Techn.,
12: 815, 1998), das den induzierbaren und starken tac-Promotor
enthält, mit den zwei Restriktionsenzymen EcoRI und XbaI
verdaut und mit dem resultierenden DNA-Fragment gemischt und anschließend
mit T4-DNA-Ligase verknüpft, gefolgt von einer Transformation
von E. coli XL1-Blue unter Verwendung von Elektroporation. Der transformierte
Stamm wurde auf LB-Agarmedium, das ein Antibiotikum, Ampicillin
(100 μg/ml), enthielt, durchmustert, wodurch so der rekombinante
pTJ1-BANC erhalten wurde.
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In
dem rekombinanten Plasmid pTJ1-BANC, das wie oben beschrieben hergestellt
wurde, kann ein fusioniertes Gen aus dem N-terminalen Ende und dem
C-terminalen Ende des Gens für das Exosporium-Protein BclA,
das als Oberflächen-Verankerungsmotiv verwendet werden
soll, durch den starken, induzierbareren tac-Promotor exprimiert
werden. Die Mehrfachklonierungsstelle des rekombinanten Plasmids
pTJ1-BAN enthält Schnittstellen der Restriktionsenzyme
XmaI und XhoI, und ein Zielprotein, das auf der Zelloberfläche
exprimiert werden soll, wird in die Schnittstellen inseriert. Die
genetische Karte des rekombinanten Expressionsvektors, der wie oben
beschrieben konstruiert wurde, ist in 3 gezeigt.
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2-3: Konstruktion des rekombinanten Expressionsvektors
pTJ1-BAF
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Um
zu untersuchen, ob das N-terminale Ende, eine wiederholte Aminosäuresequenz ((GPT)1-8GDTGTT) und das C-terminale Ende von BclA
als Oberflächen-Verankerungsmotiv verwendet werden können,
wurde jedes Oberflächen-Verankerungsmotiv so gestaltet,
dass sie mit einem Zielprotein fusioniert werden können.
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Um
zu untersuchen, ob das BclA-Gen als Oberflächen-Verankerungsmotiv
verwendet werden kann, wurde jedes Oberflächen-Verankerungsmotiv
so gestaltet, dass sie mit einem Zielprotein fusioniert werden können.
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Für
die Konstruktion eines Plasmids, bei dem das BclA-Gen als Zelloberflächen-Verankerungsmotiv verwendet
wird, wurde das BclA-Gen mittels PCR unter den folgenden Bedingungen
amplifiziert: 30 Zyklen einer ersten Denaturierung bei 94°C
für 5 min, einer zweiten Denaturierung bei 94°C
für 45 s, einer Anlagerung bei 56°C für
45 s, einer Verlängerung bei 72°C für
1 min und der abschließenden Verlängerung bei
72°C für 7 min, wobei die Primer von SEQ ID NO:
4 und SEQ ID NO: 5 von Beispiel 1 verwendet wurden.
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Ein
DNA-Fragment von 780 bp, das mittels der PCR erhalten wurde, wurde
unter Verwendung von Agarosegelelektrophorese isoliert und mit zwei
Restriktionsenzymen, EcoRI und XbaI, verdaut. Zur gleichen Zeit
wurde das Plasmid pTac99A (Park und Lee, Biotechnol. Techn.,
12: 815, 1998), das den induzierbaren starken tac-Promotor
enthält, mit den zwei Restriktionsenzymen, EcoRI und XbaI,
verdaut und mit dem resultierenden DNA-Fragment gemischt und anschließend
mit T4-DNA-Ligase verknüpft, gefolgt von der Transformation
von E. coli XL1-Blue unter Verwendung von Elektroporation. Das transformierte
E. coli wurde auf LB-Agarmedium, das ein Antibiotikum, Ampicillin
(100 μg/ml), enthielt, durchmustert, wodurch so der rekombinante
pTJ1-BAF erhalten wurde.
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In
dem rekombinanten Plasmid pTJ1-BAF, das wie oben beschrieben hergestellt
wurde, kann das Gen für das Exosporium-Protein BclA, das
als Oberflächen-Verankerungsmotiv verwendet werden soll,
durch den starken, induzierbaren tac-Promotor exprimiert werden.
Die Mehrfachklonierungsstelle des rekombinanten Plasmids pTJ1-BAF
enthält die Schnittstellen der Restriktionsenzyme XmaI
und XhoI, und ein Zielprotein, das auf der Zelloberfläche
exprimiert werden soll, wird in die Schnittstellen inseriert. Die
genetische Karte des rekombinanten Expressionsvektors, der wie oben
beschrieben konstruiert wurde, ist in 4 dargestellt.
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Beispiel 3: Konstruktion der rekombinanten
Expressionsvektoren pTJ1-BAN-ScFv-SA, pTJ1-BANC-ScFv-SA und pTJ1-BAF-ScFv-SA
und pTJ1-BAN-Lip1, pTJ1-BANC-Lip1 und pTJ1-BAF-Lip1
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Für
ein auf der Zelloberfläche zu exprimierendes Modellprotein
wurden die rekombinanten Expressionsvektoren pTJ1-BAN-ScFv-SA, pTJ1-BANC-ScFv-SA
und pTJ1-BAF-ScFv-SA und pTJ1-BAN-Lip1, pTJ1-BANC-Lip1 und pTJ1-BAF-Lip1
konstruiert unter Verwendung eines Fusionsproteins aus einem Einzelkettenantikörper
und Streptavidin und Lipase.
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3-1 Konstruktion der rekombinanten Expressionsvektoren
pTJ1-BAN-ScFv-SA, pTJ1-BANC-ScFv-SA und pTJ1-BAF-ScFv-SA
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Um
ein Fusionsproteingen von einem Einzelkettenantikörper
und Streptavidin zu erhalten, wurde eine PCR unter den folgenden
Bedingungen durchgeführt: 30 Zyklen einer ersten Denaturierung
bei 94°C für 5 min, einer zweiten Denaturierung
bei 94°C für 30 s, einer Anlagerung bei 56°C
für 30 s, einer Verlängerung bei 72°C für
1 min 10 s und der abschließenden Verlängerung
bei 72°C für 7 min, wobei die Primer von SEQ ID
NO: 9 und SEQ ID NO: 10 verwendet wurden.
-
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Ein
DNA-Fragment von 1120 bp, das mittels der PCR erhalten wurde, wurde
unter Verwendung von Agarosegelelektrophorese isoliert. Da das Fusionsgen
aus Einzelkettenantikörper und Streptavidin eine XmaI-Schnittstelle
am 5'-Ende und XhoI- und NheI-Schnittstellen am 3'-Ende aufweist,
wurde das amplifizierte Produkt mit XmaI und XhoI verdaut. Das verdaute
DNA-Fragment wurde unter Verwendung von T4-DNA-Ligase in die gleiche
Position bei pTJ1-BAN, pTJ1-BANC und pTJ1-BAF, hergestellt in Beispiel
2, inseriert, gefolgt von einer Transformation von E. coli JM109
mittels Elektroporation. Der transformierte Stamm wurde auf LB-Agarmedium,
das ein Antibiotikum, Ampicillin (100 μg/ml), enthielt,
durchmustert, wodurch so die rekombinanten Vektoren pTJ1-BAN-ScFv-SA,
pTJ1-BANC-ScFv-SA und pTJ1-BAF-ScFv-SA (5 bis 7)
erhalten wurden.
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3-2: Konstruktion der rekombinanten Expressionsvektoren
pTJ1-BAN-Lip1, pTJ1-BANC-Lip1 und pTJ1-BAF-Lip1
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Im
Falle der Verwendung von Lipase wurden die rekombinanten Expressionsvektoren
pTJ1-BAN-Lip1, pTJ1-BANC-Lip1 und pTJ1-BAF-Lip1 konstruiert, wobei
das gleiche Verfahren wie das Verfahren zur Herstellung eines Fusionsgens
von einem Einzelkettenantikörper und Streptavidin verwendet
wurde. Eine PCR wurde unter Verwendung der Primer von SEQ ID NO:
11 und SEQ ID NO: 12 durchgeführt.
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Ein
DNA-Fragment von 1170 bp, das mittels der PCR erhalten wurde, wurde
unter Verwendung von Agarosegelelektrophorese isoliert und mit den
Restriktionsenzymen NheI und HindIII verdaut. Das verdaute Fragment
wurde an der gleichen Position wie die Position bei pTJ1-BAN, pTJ1-BANC
und pTJ1-BAF, hergestellt in Beispiel 2, unter Verwendung von T4-DNA-Ligase
inseriert, gefolgt von der Transformation von E. coli XL1-Blue mittels
Elektroporation. Der transformierte Stamm wurde auf LB-Agarmedium,
das Antibiotikum, Ampicillin (100 μg/ml), enthielt, durchmustert,
wodurch so die rekombinanten Vektoren pTJ1-BAN-Lip1, pTJ1-BANC-Lip1
und pTJ1-BAF-Lip1, mit denen Lipase exprimiert wird, erhalten wurden.
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Beispiel 4: Expression von BclA-Fusionsprotein
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Die
Expression von BclA (Bacillus anthracis-Exosporium), fusioniert
mit einem Modellprotein, aus Bacillus stammende Lipase, wurde in
E. coli XL1-Blue (SupE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi relA1 lac
F' (prBa+ lacIq lacZM15 Tn10 (tetr))), das mit den rekombinanten
Expressionsvektoren pTJ1-BAN-Lip1, pTJ1-BANC-Lip1 und pTJ1-BAF-Lip1,
die jeweils mittels des in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrens konstruiert
wurden, transformiert war, unter Verwendung des SDS-PAGE-Verfahrens
untersucht.
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Genauer
wurde, um die Expression des BclA-Lip1-Fusionsproteins zu untersuchen,
das rekombinante E. coli in einen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben, der
50 ml LB-Flüssigmedium enthielt, inokuliert und bei 37°C
kultiviert. Da die rekombinanten Expressionsvektoren den tac-Promotor
aufweisen, wurde die Expression induziert, indem IPTG (Isopropyl-β-thiogalactosid)
zugegeben wurde. Die Induktion der Genexpression wurde durchgeführt,
indem 1 mM IPTG zugegeben wurde, als die optische Dichte (OD) bei
600 nm 0,6 erreichte.
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4
Stunden nach der Induktion wurden jeweils 3 ml Kulturbrühe
entnommen und Proteine der äußeren Zellmembran
wurden fraktioniert. Genauer wurden 3 ml Kulturbrühe bei
4°C, 10.000 UpM, für 2 min unter Entfernung des Überstandes
zentrifugiert, mit 1 ml Na2HPO4-Pufferlösung
(pH 7,2) einmal gewaschen und wiederum bei 4°C, 13.000
UpM, für 2 min zentrifugiert, gefolgt von Suspendieren
in 0,2 ml Na2HPO4-Pufferlösung (pH
7,2). Die suspendierte Lösung wurde einer Ultraschallbehandlung
unterworfen, um alle Zellen in der Suspension aufzubrechen bzw.
aufzuschließen und sie wurde bei Raumtemperatur (10.000
UpM) für 2 min zentrifugiert, um so einen Überstand
zu erhalten, aus dem der Debris entfernt ist. Für die Proteinfraktionierung
der Zellmembran wurde der Überstand bei Raumtemperatur,
13.000 UpM, für 30 min zentrifugiert und in einer Pufferlösung,
enthaltend 0,5 ml 0,5% (G/V) Sarcosyl und 10 mM Na2HPO4 (pH 7,2), suspendiert. Die Zellmembranproteinlösung
wurde bei 37°C für 30 min umsetzen gelassen und
bei 4°C, 13.000 UpM, für 30 min zentrifugiert,
um die unlösliche Phase abzutrennen. Danach wurde die unlösliche
Fraktion mit 10 mM Na2HPO4-Pufferlösung
(pH 7,2) gewaschen und in 50 μl PBS (0,274 M NaCl, 0,041
M Na2HPO4, 0,047
M KH2PO4, 0,005
M KCl, pH 7,4) suspendiert, wodurch so eine Lösung von
fraktioniertem bzw. abgetrenntem Protein der äußeren Zellmembran
erhalten wurde (Puenete, J. L. et al., Gene, 156: 1, 1995).
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40 μl
der Proteine, die mittels des oben genannten Verfahrens erhalten
wurden, wurden mit 10 μl SDS-PAGE-Probenpufferlösung
(60 mM Tris-HCl; 25% Glycerin; 2% SDS; 14,4 mM 2-Mercaptoethanol;
0,1% Bromphenolblau) gemischt und das Gemisch wurde umsetzen gelassen,
indem es in einem kochenden Wasserbad für 10 min erhitzt
wurde, um dann eine SDS-PAGE-Gelelektrophorese an einem 12%igen
Trenngel durchzuführen. Nach der Elektrophorese wurde das
Gel durch Eingeben in eine Farbstofflösung (0,25 g/l Coomassie
Brilliant Blue R; 40% Methanol; 10% Essigsäure) für
mehr als 2 Stunden gefärbt und entfärbt, indem es
zweimal in eine Entfärbelösung (40% Methanol,
7% Essigsäure) für jeweils mehr als 2 Stunden
eingegeben wurde (8).
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Die
Spur SM (Größenmarker) in 8 ist eine
Größenkontrollgruppe, die einen Proteinmolekulargewichtsstandard
(250 kDa, 150 kDa, 100 kDa, 75 kDa, 50 kDA und 37 kDa) darstellt;
die erste Spur ist die Fraktion des Proteins der äußeren
Zellmembran aus Wildtyp-XL1-Blue (keine Expression von BclA-Lip1-Fusionsprotein),
die zweite bis vierte Spur sind die Fraktionierung des Proteins
der äußeren Zellmembran von E. coli XL1-Blue,
transformiert mit den Expressionsvektoren pTJ1-BAN-Lip1, pTJ1-BANC-Lip1
und pTJ1-BAF-Lip1, und zwar 4 Stunden nach IPTG-Induktion.
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Nach
der Elektrophorese, wie in 8 dargestellt,
wurde bestätigt, dass jedes Fusionsprotein, 45 kDa bei
BAN-Lip1, 61 kDa bei BANC-Lip1 und 66 kDa bei BAF-Lip1, auf der äußeren
Zellmembran von E. coli exprimiert vorlag, was nahe legt, dass Lipase
(Lip1) mit 43 kDa erfolgreich in das Exosporium-Protein BclA inseriert
und auf der äußeren Zellmembran von E. coli exprimiert
worden war.
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Zusätzlich
wurden die genannten SDS-PAGE-Ergebnisse verwendet, um Proteine
unter Verwendung von Densitometrie zu quantifizieren, um das Verhältnis
von Proteinen der äußeren Zellmembran, in die Lip1-Proteine
inseriert sind, zu Proteinen der äußeren Zellmembran
zu bestimmen. Hierin betrug das Verhältnis 30%~45%, was
darauf hindeutet, dass die Expressionsrate sehr hoch ist.
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Beispiel 5: Zelloberflächenpräsentation
von rekombinantem E. coli, enthaltend die rekombinanten Expressionsvektoren
pTJ1-BAN-ScFv-SA, pTJ1-BANC-ScFv-SA und pTJ1-BAF-ScFv-SA
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Wie
in 9 gezeigt, wurde eine FACS-Analyse durchgeführt,
um zu untersuchen, ob ein Zielprotein, das mit BclA fusioniert ist,
auf der Zelloberfläche exprimiert wird unter Verwendung
von rekombinantem E. coli mit den rekombinanten Expressionsvektoren
pTJ1-BAN-ScFv-SA, pTJ1-BANC-ScFv-SA und pTJ1-BAF-ScFv-SA, die in
Beispiel 3 konstruiert wurden.
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Unter
Verwendung der gleichen Bedingungen wie in Beispiel 4 beschrieben,
wurden Zellen, transformiert mit den rekombinanten Expressionsvektoren
pTJ1-BAN-ScFv-SA, pTJ1-BANC- ScFv-SA und pTJ1-BAF-ScFv-SA, kultiviert.
4 Stunden nach der Induktion der Expression wurde 1 ml Kulturbrühe
bei 4°C, 6000 UpM, für 5 min zentrifugiert, um
den Überstand zu entfernen, und es wurde zweimal mit PBS-Pufferlösung
gewaschen, anschließend in PBS-Pufferlösung suspendiert.
Eine Zell-Bead-Gemischlösung wurde mit einer Lösung
von Biotin, gebunden an ein fluoreszierendes Substrat, behandelt
und bei 37°C für 1 h umsetzen gelassen. Die resultierende
Reaktionslösung wurde bei Raumtemperatur, 10.000 UpM, für
10 min zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen und
es wurde dreimal mit PBS-Pufferlösung gewaschen und anschließend
in PBS-Pufferlösung resuspendiert. Darauf folgte die Analyse
mittels FACS („Fluorescent-Activated Cell Sorter", Beckton
Dickinson, Fullerton, CA, USA) (9). Die
Probe wurde bei 543 nm mittels eines Helium/Neon-Lasers angeregt
und das Bild wurde über einen 580 nm-Filter gefiltert.
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In 9 ist
(a) ein Analysenergebnis für Wildtyp-E. coli, XL1-Blue-Kontrolle,
(b) ist ein Ergebnis für E. coli XL1-Blue, transformiert
mit pTJ1-BAN-ScFv-SA, (c) ist das Ergebnis für E. coli
XL1-Blue, transformiert mit pTJ1-BANC-ScFv-SA, und (d) ist das Ergebnis
für E. coli XL1-Blue, transformiert mit pTJ1-BAF-ScFv-SA.
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Wie
in 9 gezeigt, wurde bestätigt, dass alle
drei Typen von BclA-Fusionsproteinen auf der äußeren Zellmembran
von E. coli exprimiert waren, wodurch die Fluoreszenzintensität
bei FACS erhöht wurde, was bedeutet, dass die Zielproteine,
die mit BclA, Exosporium-Protein von Bacillus anthracis, fusioniert
waren, erfolgreich auf der äußeren Zellmembran
von E. coli exprimiert wurden.
-
Ausgehend
vom Ergebnis der Experimente wurde bestätigt, dass ein
Einzelkettenantikörper-Streptavidin, fusioniert mit BclA,
erfolgreich auf der äußeren Zellmembran von E.
coli exprimiert wurde.
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Beispiel 6: Echtzeit-Analyse von rekombinantem
E. coli, das den rekombinanten Expressionsvektor p-TJ1-BA-EGFP enthält
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Nachdem
ein fluoreszierendes Protein, EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein),
an den rekombinanten Expressionsvektor pTJ1-BA, der in Beispiel
1 hergestellt wurde, gebunden worden war, wurde die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie
(Carl Zeiss LSM 410, Oberkochen, Deutschland) verwendet, um zu untersuchen
(10), ob grün fluoreszierende Proteine,
exprimiert im rekombinanten E. coli JM109 (F-ompT shdSB(rB-mB-)gal
dcm(DE3)), auf der Zelloberfläche exprimiert werden.
-
Die
Zellen wurden unter Verwendung der gleichen Bedingungen kultiviert,
wie in Beispiel 4 beschrieben. 4 Stunden nach der Induktion der
Expression wurden die Zellen mittels Zentrifugation gesammelt, mit
einem LB-Medium gewaschen, auf IPTG-freies LB-Medium überführt
und wiederum für 4 Stunden kultiviert, um das grün
fluoreszierende Protein, das während der Expression in
den Zellen bleibt, an die Oberfläche zu senden bzw. zu
führen. Wie in 10 gezeigt,
deckten als ein Ergebnis die Abbildung aus der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie
und FACS auf, dass sich die Lokalisierung von GFP (ohne Fusion mit
BclA), exprimiert in den Zellen, unterschied von der von GFP, das
mit BclA fusioniert war und auf der äußeren Zelloberfläche
exprimiert wurde.
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GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT
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Wie
es oben beschrieben und belegt wurde, stellt die vorliegende Erfindung
einen Expressionsvektor, der zum wirksamen Exprimieren eines Zielproteins
oder eines Peptids auf der Zelloberfläche unter Verwendung
von BclA, Exosporium-Protein von Bacillus anthracis, als Zelloberflächen- Verankerungsmotiv
befähigt ist, und einen Mikroorganismus, der mit dem Expressionsvektor
transformiert ist, und ein Verfahren zum stabilen Exprimieren des
Zielproteins in großen Mengen auf der Zelloberfläche
durch Kultivieren des transformierten Mikroorganismus bereit.
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Wenn
ein fremdes Protein auf der Zelloberfläche unter Verwendung
des neu entwickelten Oberflächen-Expressionsvektors exprimiert
wird, kann es in wirksamer Weise für Anwendungen im Hinblick
auf rekombinante Lebendvakzine, die eine stärkere und nachhaltigere
Immunreaktion in Abhängigkeit von den inserierten fremden
Genen zeigen als herkömmliche Vakzine unter Verwendung
attenuierter pathogener Mikroorganismen oder Viren, Ganzzell-Absorbentien
zur Durchmusterung verschiedener Peptide oder Antikörper, Schwermetalleliminierung
oder Abwasserbehandlung, und ein Ganzzell-Biokonversionsverfahren,
das kontinuierlich eingesetzt werden kann ohne eine Abnahme der
katalytischen Aktivität, indem ein Enzym, das bei der biologischen
Konversion verwendet wird, stabil auf der Zelloberfläche
exprimiert wird.
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Obgleich
die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf die spezifischen
Merkmale im Detail beschrieben worden ist, wird es für
Fachleute auf dem Gebiet ersichtlich sein, dass diese Beschreibung
nur für eine bevorzugte Ausführungsform steht
und den Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht beschränkt.
Somit wird der wesentliche Rahmen der vorliegenden Erfindung durch
die angehängten Patentansprüche und Äquivalente
davon definiert werden.
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ZUSAMMENFASSUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Exprimieren eines
Zielproteins auf der Oberfläche eines Mikroorganismus unter
Verwendung von Exosporium-Protein von Bacillus anthracis. Spezieller
einen Expressionsvektor, der derart konstruiert ist, dass er das
bclA-Gen, das für das Exosporium-Protein BclA von Bacillus
anthracis codiert, oder Fragmente davon als ein Zelloberflächen-Verankerungsmotiv
umfasst, und das Zielprotein kann auf der Oberfläche einer
Zelle in einer Form, fusioniert mit BclA oder einem Fragment davon, exprimiert
werden, wenn das Gen, das für das Zielprotein codiert,
in einer Wirtszelle exprimiert werden kann, sowie ein Verfahren
zum Exprimieren eines Zielproteins auf der Oberfläche eines
Mikroorganismus unter Verwendung des Vektors. Der Expressionsvektor
gemäß der vorliegenden Erfindung ist dazu in der
Lage, ein Zielprotein oder ein Peptid wirksam auf der Zelloberfläche
zu exprimieren, wobei BclA, Exosporium-Protein von Bacillus anthracis,
als ein Zelloberflächen-Verankerungsmotiv verwendet wird.
Da ein Zielprotein auf der Zelloberfläche in großen
Mengen durch Kultivieren eines Mikroorganismus, der mit dem Expressionsvektor
transformiert ist, exprimiert werden kann, wird somit eine wirksame
Verwendung für zahlreiche Zwecke von rekombinanten Lebendimpfstoffen,
Ganzzell-Absorbentien, Ganzzell-Biokonversion und dergleichen ermöglicht.
-
Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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