DE10314413A1

DE10314413A1 - Verfahren zum Nachweis der Expression rekombinanter Proteine an einer Zelloberfläche und zur Immobilisierung und Aufreinigung von Zellen und Proteinen

Info

Publication number: DE10314413A1
Application number: DE2003114413
Authority: DE
Inventors: Joachim Jose; Steffen Handel
Original assignee: Universitaet des Saarlandes
Current assignee: Zyrus Beteiligungs GmbH and Co Patente I KG
Priority date: 2003-03-28
Filing date: 2003-03-28
Publication date: 2004-12-09
Anticipated expiration: 2023-03-29
Also published as: WO2004088307A2; WO2004088307A3; DE10314413B4

Abstract

Das Verfahren zum Nachweis der Expression eines rekombinanten Polypeptids in/an/auf der Zelloberfläche seiner Wirtszelle zeichnet sich dadurch aus, dass man (a) das rekombinante Polypeptid derart konstruiert, dass es in einem dem äußeren Medium der Wirtszelle zugänglichen Abschnitt wenigstens einmal die Aminosäure Cystein aufweist, dass man (b) die Wirtszelle einem äußeren Medium aussetzt, welches eine Markersubstanz enthält, die spezifisch an Cystein bindet, dass man (c) die Bindungsreaktion zwischen Cystein und der Markersubstanz herbeiführt, und dass man (d) die Wirtszelle anschließend einem Prozess zur Detektion der Cystein-Marker-Verbindungen unterwirft.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Expression eines durch Rekombination erzeugten Polypeptids in einer demgemäß transformierten Wirtszelle, wobei das rekombinante Polypeptid in oder an der die Wirtszelle gegen das sie umgebende äußeren Medium abgrenzenden Zelloberfläche repräsentiert wird und wenigstens einen von dem äußeren Medium aus zugänglichen Abschnitt aufweist.

Die Darstellung eines Proteins mit einer bestimmten, gewünschten Funktion in großer Zahl an der Oberfläche einer lebenden Zelle ist eine herausfordernde Aufgabe mit zunehmender Bedeutung für viele Bereiche der Biochemie und Biotechnologie^[1]. Durch die Darstellung von Enzymen werden ganze Zellbiofabriken erhalten, die für die betreffenden Substrate ohne Einschränkung zugänglich sind, und die in den meisten Fällen in industriellen Verfahren leichter zu handhaben, zu immobilisieren und zu stabilisieren sind als das freie Enzymmolekül^[2]. Ein reiner Biokatalysator kann durch einen einfachen Zentrifugationsschritt erhalten werden^[3]. Die Darstellung bestimmter, mittels Rekombination erzeugter Proteine an der Oberfläche der Wirtszelle, das sogenannte "zelluläre Surface-Display" hat einen weiteren signifikanten Vorteil bei der Erstellung und Durchmusterung von Peptid- oder Proteinbanken für die Durchführung einer Laborevolution^[4]. Durch die Wahl der richtigen an der Oberfläche exprimierten Struktur wird die Zelle mit dem entsprechenden Gen, das als intrinsische Markierung dient, co-selektiert und kann in weiteren Studien und Anwendungen verwendet werden. Erst kürzlich hat das zelluläre Surface-Display zu einem vielversprechenden Fortschritt in dem Bereich oraler Impfstoffe^[5] und in der Entwicklung biologischer Umweltadsorptionsstoffe geführt^[6].

Vor diesem Hintergrund ist es offensichtlich, dass Systeme für das Surface-Display eines breiten Spektrums von Molekülen benötigt werden sowie Werkzeuge, welche die Analyse und Auswertung dieser Systeme hinsichtlich ihrer Effizienz erlauben. Die betreffenden Techniken müssen für automatisierte Prozesse geeignet sein, um einen hohen Durchsatz zu ermöglichen. Bisher ist jedoch in allen Fällen die Erfassung des Surface-Displays von besonderen Eigenschaften des darzustellenden Moleküls abhängig gewesen, nämlich entweder von dessen Affinität zu einem Antikörper oder von einer bestimmten katalytischen Aktivität. Dies hat die vielversprechende Strategie des zellulären Surface-Displays bisher auf eine begrenzte Zahl von Kandidatenmolekülen eingeschränkt.

Der vorliegenden Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren aufzuzeigen, welches eine Verifizierung und Quantifizierung des zellulären Surface-Displays unabhängig von den antigenen oder katalytischen Eigenschaften des angezeigten dargestellten Moleküls ermöglicht.

Eine Lösung dieser Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens der eingangs genannten Art, das sich dadurch auszeichnet, daß man (a) das rekombinante Polypeptid derart konstruiert, daß es in dem zugänglichen Abschnitt wenigstens einmal die Aminosäure Cystein aufweist, daß man (b) die Wirtszelle einem äußeren Medium aussetzt, welches eine Markersubstanz enthält, die spezifisch an Cystein bindet, daß man (c) die Bindungsreaktion zwischen Cystein und der Markersubstanz herbeiführt, und daß man (d) die Wirtszelle anschließend einem Prozess zur Detektion der Cystein-Marker-Verbindungen unterwirft.

Unter Zelloberfläche wird im folgenden diejenige Hülle einer Zelle verstanden, die in Kontakt mit dem äußeren Medium steht. Der Begriff Zelloberfläche umfaßt infolgedessen insbesondere die sogenannte "äußere Membran"/"Außenmembran" von Gram negativen Bakterien, den Mureinsacculus von Gram positiven Bakterien, die Zellwand von Hefepilzen, die Zellwand von Pflanzenzellen und die Cytoplasmamembran tierischer Zellen.

Das gewünschte Polypeptid bzw. Protein, daß mittels Rekombination in, an oder auf der Zelloberfläche der Wirtszelle erzeugt wird, wird im folgenden mit "Zielpolypeptid" bezeichnet Die Erfindung beruht auf der Kombination von zwei beobachteten Phänomenen: Erstens enthalten die in der Natur vorkommenden Oberflächenproteine (= Zellhüllproteine = Proteine der Außenmembran) der Gram-negativen Bakterien, insbesondere Escherichia coli, faktisch keine Cysteine, die an der Oberfläche zugänglich sind^[7]. Zweitens gibt es spezifische Markierungsverfahren für Cysteine, insbesondere die Michael-Addition von Cystein an die Doppelbindung von Maleinimid und seinen Derivaten^[8] ^[9] (1), Die erfindungsgemäße Markierung ermöglicht zum einen die Beobachtung, Kontrolle und den Nachweis des Surface-Displays von Zielpolypeptiden mit verschiedenen Methoden, einschließlich der Durchflusszytometrie, und zum anderen können einzelne Zellen mit cysteinhaltigen Proteinen an ihrer Oberfläche mittels FACS selektiert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht ein Monitoring (d.h. die Beobachtung, Kontrolle und den Nachweis) des Surface-Displays rekombinanter Proteine und damit der darin enthaltenen Zielpolypeptide, ohne dafür spezifische Antikörper oder enzymatische Reaktionen verwenden zu müssen. Das Verfahren ist leicht durchzuführen und kann ohne Aufwand in Kombination mit verschiedenen analytischen Verfahren, einschließlich des Western-Blots, der Spektralphotometrie und Durchflusszytometrie, angewendet werden. Deshalb ist dieses Verfahren nicht nur beim Monitoring der Expression und Repräsentation rekombinanter Proteine an der Zelloberfläche der Wirtszelle von Vorteil, sondern ebenso als Werkzeug für analytische Zwecke und Selektionszwecke, insbesondere solche mit hohem Durchsatz, die auf Durchflusszytometrie basieren. Einzelne Zellen, die ein bestimmtes Polypeptid bzw. Protein an ihrer Oberfläche tragen, welches unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens markiert wurde, können mittels Zellsortierung im Durchflußzytometer (= FACS = Fluorescence Activated Cell Sorting) selektiert werden.

Das erfindungsgemäß Verfahren kann auch zur Proteinreinigung oder Reinigung von Zellen verwendet werden, die ein bestimmtes, rekombinantes Polypeptid bzw. Protein, welches das Zielpolypeptid enthält, exprimieren. Durch Markierung mit beispielsweise Biotin-Maleinimid können ganze Zellen, die ein einziges Cystein an ihrer Oberfläche exprimieren, an Streptavidin-überzogene Kügelchen, Streptavidin-Agarose, oder jede andere Streptavidin-modifizierte Matrix gekoppelt werden, z.B. in Flüssigchromatographiesäulen. Auf diese Weise können die Zellen, die das gewünschte rekombinante Polypeptid bzw. Protein mit einem oder mehrere exponierten Cysteinen an ihrer Oberfläche exprimieren, aus einer Mischung von Zellen angereichert werden, die dieses Polypeptid/Protein und damit das Zielpolypeptid nicht exprimieren. Ferner können mit dem erfindungsgemäß Verfahren Zellen, die ein Enzym, einen Antikörper oder ein anderes funktionales Protein an der Oberfläche exprimieren, immobilisiert werden, um in kontinuierlichen Reaktionen verwendet zu werden. Auf ähnliche Weise können Zellen an Membranen fixiert werden, um z.B. für Oberflächenplasmon-Resonanzexperimente verwendet zu werden. Wenn das erfindungsgemäß mit einem oder mehreren Cysteinen versehene rekombinante Polypeptid bzw. Protein in den Überstand freigesetzt wird, z.B. durch eine ortsspezifische Protease, kann es in einem einzigen Schritt unter Nutzung der Affinität für Streptavidin gereinigt werden.

Ein großer Vorteil der erfindungsgemäß Verfahrens besteht darin, dass eine einzige Aminosäure, nämlich ein einziges Cystein, zum Nachweis des rekombinanten Polypeptids bzw. des Zielpolypeptids ausreicht. Inhärente Cysteine können für die Markierung und Reinigung verwendet werden oder, wenn das Protein frei von Cysteinen ist, kann ein einziges Cystein hinzugefügt werden. Das Hinzufügen eines einzelnen Cysteins stört die natürliche Struktur und das Faltverhalten des Proteins weit weniger als die mindestens 5-8 Aminosäuren, die für die im Stand der Technik bisher eingesetzte "Epitop-Kennzeichnungsstrategie" = "Epitop-Tagging" notwendig sind^[21], oder die 4-6 Aminosäuren, die für die bekannte "His-Kennzeichnungsstrategie" = "His-Tagging" notwendig sind^[6]. (Bei diesen beiden Strategien wird das lineare Epitop eines monoklonalen Antikörpers mit dem rekombinanten Protein verbunden und die Oberflächentranslokation kann mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers in Western-Blots, indirekten Immunofluoreszenz- oder ELISA-artigen Experimenten verfolgt werden.)

sDas rekombinante Polypeptid wird vorzugsweise derart konstruiert, daß man (a) eine Nukleinsäure bereit stellt, die die für das rekombinante Polypeptid und dessen Repräsentation an der Zelloberfläche kodierende Nukleotidsequenz umfaßt, wobei diese Nukleotidsequenz in ihrem für den zugänglichen Abschnitt des Polypeptids kodierenden Bereich wenigstens ein Cystein-Codon (TGT, TGC) aufweist, welches entweder natürlicherweise in dem für den zugänglichen Abschnitt kodierenden Bereich der Nukleotidsequenz enthalten ist oder artifiziell in diesen Bereich eingeführt bzw. eingebaut wird, daß man (b) diese Nukleinsäure in eine Wirtszelle einschleust, und daß man (c) die Expression dieser Nukleinsäure in der Wirtszelle herbeiführt.

Der Einbau des Cystein-Codons kann entweder als Insertion oder als Substitution durchgeführt werden und prinzipiell an jeder beliebigen Stelle der Nukleotidsequenz erfolgen, vorausgesetzt diese Stelle kodiert den zugänglichen Abschnitt des rekombinanten Polypeptids zumindest derart mit, daß das Cystein in diesem zugänglichen Abschnitt enthalten ist.

Die Nukieinsäure, die die für das rekombinante Polypeptid und dessen Repräsentation an der Zelloberfläche kodierende Nukleotidsequenz umfaßt, kann insbesondere derart konstruiert sein, daß sie für ein Fusionsprotein kodiert, welches aus dem in/an/auf der Zelloberfläche repräsentierten Zielpolypeptid und einem für dessen Expression und Repräsentation notwendigen Helfer-Polypeptid besteht, und daß sie folglich sowohl die für Zielpolypeptid als auch die für das Helfer-Polypeptid kodierende Nukleotidsequenz umfaßt.

Das wenigstens eine Cystein kann in diesem Fall entweder für das Zielpolypeptid oder in der für das Helfer-Polypeptid kodierenden Nukleotidsequenz vorhanden sein bzw. eingebaut werden, vorausgesetzt es wird in dem zugänglichen Abschnitt des rekombinanten Polypeptids/Proteins exprimiert.

Eine in der Praxis bewährte Ausführungsform der Nukleinsäure kodiert für ein Fusionsprotein, welches aus einem N-terminalen Signalpeptid, dem Zielpolypeptid (hier auch "Passagierpolypeptid"), einem Linker-Polypeptid und einer C-terminalen Transportdomäne eines Autotransporters besteht.

Bei dieser Ausführungsform wird das (gegebenenfalls einzige) Cystein vorzugsweise in die Linkerregion eingesetzt (3).

In der Linkerregion kann außerdem eine Protease-Bindungsstelle vorhanden bzw. eingebaut sein, insbesondere eine, die selektiv für IgA-Protease ist.

Die Transportdomäne eines Autotransporters ist im Prinzip beliebige wählbar, vorzugsweise wird jedoch eine solche Transportdomäne eingesetzt, die eine β-Fassstruktur ausbilden kann. Eine detaillierte Beschreibung solcher Transportdomänen eines Autotransporters ist in der WO 97/35022 offenbart, auf die hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird. Bevorzugte Transportdomänen eines Autotransportes sind ausgewählt aus der Gruppe: E. coli AIDA I Protein, Shigella flexneri SepA Protein, Shigella flexneri IcsA Protein, E. coli Tsh Protein, Serratia marcescens Ssp Protein, Helicobacter mustelae Hsr Protein, Bordetella ssp. Prn Protein, Haemophilus influenzae Hap Protein, Bordetella pertussis BrkA Protein, Helicobater pylori VacA Protein, Oberflächenprotein SpaP oder rOmpB oder SlpT von Rickettsia, IgA Protease von Neisseria oder Haemophilus und Varianten davon.

Die Nukleinsäure kann als Vektor realisiert sein, der Elemente für die Replikation, die Klonierung und das Surface Display des rekombinanten Polypeptids umfaßt. Ein bevorzugter Vektor ist das Plasmid pET-SH4 mit einem Autotransporter-Konstrukt und den XbaI, XhoI und Bg/II Schnittstellen (3). Wenn die kodierende Region eines Cystein-freien Zielpolypeptids an diesen Schnittstellen in das Plasmid eingefügt wird, liefert das Plasmid das für die erfindungsgemäße Markierung notwendige Cystein in dem zugänglichen Abschnitt des rekombinanten Polypeptids bzw. Proteins.

Das Einschleusen der Nukleinsäure in eine Wirtszelle kann mit den im Stand der Technik bekannten und geläufigen Methoden wie z.B. Elektroporation durchgeführt werden.

Als in dem erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzende Wirtszellen eignen sich vor allem Bakterienzellen, insbesondere Gram-negative Bakterienzellen, und unter diesen vorzugsweise Enterobakterienzellen.

Besonders geeignet sind Bakterienzellen, die aus der Gruppe Escherichia coli, Shigella flexneri, Serratia marcescens, Helicobacter mustelae, Bordetella pertussis, Haemophilus influenza, Helicobacter pylori, Rickettsia sp. und Neisseria sp. ist ausgewählt sind.

In der Praxis hat sich vor allem die Bakteriengattung E. coli bewährt, und hierunter ganz besonders der Stamm E. coli JK321 (DSM 8860), der in der US 6,040,141 detailliert beschrieben ist. Auf den Inhalt dieser Patentschrift wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen.

Die Expression der Nukleinsäure in der Wirtszelle kann unter der Kontrolle eines allgemein bekannten Promotors erfolgen. Im Fall der Verwendung von Gram-negativen Bakterien als Wirtszellen wird der Einsatz des T7/lacZ Promotors oder des Promotors von pJM1013 vorgeschlagen.

Als Markersubstanz in dem erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise Maleinimid und/oder ein Maleinimidderivat eingesetzt, wobei die Bindungsreaktion mit dem Cystein eine Michael-Additions-Reaktion ist, d.h. eine Michael-Addition von Cystein an die Doppelbindung verschiedener Maleinimid-Derivate. Die Maleinimid-Reaktion mit Sulfhydryl-Gruppen wurde bereits in makromolekularen Prodrug-Konzepten erfolgreich angewendet^[16], und ebendo in der Verlängerung der in-vivo Halbwertzeit von therapeutischen Antikörperfragmenten^[17] und in Untersuchungen der Struktur bakterieller Rezeptoren^{[7, 18]}.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden zwei Formen von Maleinimid-Derivaten bevorzugt angewendet, nämlich biotinyliertes Maleinimid und Fluoreszein-Maleinimid. Biotinyliertes Maleinimid eignet sich besonders gut für die photometrischen Detektion und Filterdetektion im Anschluß an ein Western-Blotting. Fluoreszein-Maleinimid wird als bevorzugter Marker für eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung und Durchflusszytometer-Analyse (FACS-Prozesse) vorgeschlagen.

Im Verlauf der Entstehung vorliegender Erfindung hat sich erwiesen, daß ein einziges Cystein in dem an der Zelloberfläche präsentierten (Abschnitt des) rekombinanten Proteins) ausreicht, um eine effiziente und nachweisbare Markierung durch beide Maleinimid-Derivate zu erhalten.

Als Alternative zu der Maleinimid-/Maleinimid-Derivat-Markierung wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, die spezifische Markierung der Sulfhydrylgruppe von Cysteinen durch Alkylierung mittels Holoacetyl-Derivaten oder durch Behandlung mit Pyridyl-disulfid-Derivaten durchzuführen.

Beide Markierungsverfahren sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt und geläufig^[9] ^[27].

Eine bedeutsamer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahren besteht nicht zuletzt darin, daß das Verfahren an lebenden Zellen anwendbar ist.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen mit dazugehörigen Figuren näher erläutert. Die dargestellten Daten wurden mit Autodisplay, einem im Stand der Technik bekannt und geläufigen Surface-Display-System erhalten, das auf dem Autotransporter-Sekretionsmechanismus beruht^{[10, 11]}. Das erfindungsgemäße Verfahren kann aber selbstverständlich auch in Kombination mit anderen Surface-Display-Systemen ^[22] ^[23] ^[4] ^[24] angewendet werden. Es zeigen
1: die Michael-Addition einer Sulfhydryl-Gruppe an die Doppelbindung einer Maleinimid-Gruppe.
2: die Struktur (A) und den Sekretionsmechanismus (B) der Autotransporterfamilie sezernierter Proteine. Durch die Verwendung eines typischen Signalpeptids wird ein Vorläuferprotein über die Innenmembran transloziert. Sobald es am Periplasma eintrifft, faltet sich der C-terminale Teil des Vorläufers wie eine porinartige Struktur als sogenanntes β-Fass in die Außenmembranen, und das Zielpeptid (der Passagier) wird zu der Zelloberfläche transloziert. Für Autodisplays wird das Signalpeptid der Cholera-Toxin β-Untereinheit und das β-Fass sowie die Linkerregion des Adhesins AIDA-I von E. coli verwendet, wie in Maurer et al. beschrieben ist^[10].
SP = Signalpeptid; IM = Innenmembran; PP = Periplasma; OM = Außenmembran
3: die Struktur der Autotransporter-Fusionproteine, für die verschiedene der verwendeten Plasmide kodieren. Die Umgebungen der Zielpeptid-Insertionsstelle, die notwendig ist, um eine Oberflächentranslokation zu erhalten, sind als Sequenzen angegeben. Restriktionsendonuklease-Spaltungsstellen sind unterstrichen. Die Signalpeptidase-Spaltungsstelle ist durch einen Pfeil gekennzeichnet. Die ortsspezifische Spaltungsstelle für IgA1-Protease in dem erhaltenen Fusionsprotein ist kursiv gedruckt und das lineare Epitop für einen monoklonalen Maus-Antikörper, das als interne Kontrolle verwendet wurde, ist fett gedruckt. Das einzelne Cystein, das für die Markierung und Detektion verwendet wurde, ist schwarz hinterlegt.
p = Plasmid, FP = Fusionsprotein; ET = epitophaltig, CT = Cystein enthaltendes "Cystop";
FP-CT enthält vier Aminosäuren mehr als FP-ET, daher ist das Molekulargewicht etwas höher. Die CpoI Restriktionsstelle (nicht dargestellt), die für Klonierungszwecke verwendet wurde, befindet sich 155 bp stromabwärts der unterstrichenen BglII Restriktionsstelle.
4: die Oberflächentranslokation und Zugänglichkeit von FP-ET und FP-CT. Von E. coli JK321 pJM1013 (FP-ET) und JK321 pSH4 (FP-CT) wurden die Außenmembranen präpariert und einer SDS Gelelektrophorese auf einem 12,5 % PA-Gel unterworfen, gefolgt von einer Coomassie- Brillantblau-Färbung. (A). Nach der Übertragung auf eine PVDF-Filtermembran wurden Proteine durch den epitopspezifischen monoklonalen Maus-Antikörper (B) oder durch Biotin-Maleinimid-Kopplung, gefolgt von der Zugabe von Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat (C) nachgewiesen. Das Molekulargewicht von Markerproteinen ist links in kDa angegeben.
Trypsin +/–: Ganze Zellen wurden mit Trypsin behandelt, bevor die Außenmembranen präpariert wurden (+), oder nicht (–).
Natürliche Außenmembranproteine OmpF/C und OmpA sind durch Pfeile gekennzeichnet.
T = trypsinbeständiger, in Membran eingebetteter Autotransporter-Kern (siehe 2).
5: ein induzierbares Surface-Display und dessen Detektion durch cysteinspezifische Markierung mit Biotin-Maleinimid: Außenmembranen von E. coli BL21 (DE3) pLysS pET-SH4 wurden vor (–) und 30 Minuten nach der Induktion mit IPTG (+) präpariert und einer SDS-Gelelektrophorese auf einem 12,5 % PA Gel mit anschließender Coomassie-Brillantblau-Färbung unterworfen (A). Nach der Übertragung auf einen PVDF-Membranfilter wurden die Proteine entweder durch epitopspezifischen monoklonalen Maus-Antikörper Dü142 (B) oder durch Biotin-Maleinimid-Kopplung, gefolgt von der Zugabe eines Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugats (C) nachgewiesen. Die Molekulargewichte der Markerproteine sind links in kDa angegeben. Natürliche Außenmembranproteine OmpF/C und OmpA sind durch Pfeile gekennzeichnet.
6: eine durchflusszytometrische Analyse ganzer Zellen von E. coli, die FP-ET (A) und FP-CT (B) exprimieren. E. coli BL21 (DE3) pLysS, enthaltend pET-SH3 (FP-ET) und BL21 (DE3) pLysS, enthaltend pET-SH4 (FP-CT), wurden 30 Minuten nach der Induktion mittels IPTG mit Fluoreszein-Maleinimid markiert und einer Durchflusszytometrie unterworfen. Für jede Probe wurden 10 000 Zellen analysiert. Die Fluoreszenz der Zellen ist als Histrogrammkurve dargestellt, 30 Minuten nach der Induktion mit IPTG. Der Mittelwert der Fluoreszenz von E. coli Zellen, die FP-CT (328, B) exprimieren, ist fast 11 mal höher als der Mittelwert der Fluoreszenz von Zellen, die FP-ET (30, A) exprimieren.
7: den Zeitverlauf des induzierten Surface-Displays, überwacht durch Fluoreszein-Maleinimid Markierung und Durchflusszytometrie. Zellen, die FP-CT exprimieren (E. coli BL21 (DE3) pLysS pET-SH4 – schwarze Quadrate), und Zellen, die FP-ET exprimieren (E. coli BL21 (DE3) pLysS pET-SH3 – offene Kreise), wurden mit IPTG induziert. Zu den angegeben Zeitpunkten wurden Proben genommen und mit Fluoreszein-Maleinimid markiert. Für jede Probe wurde der Mittelwert der Fluoreszenz für 10 000 Zellen mittels Durchflusszytometrie bestimmt und gegen die Zeit nach der Induktion aufgetragen.
8: die Zellsortierung im Durchflußzytometer (FACS) von E. coli Zellen, die FP-CT exprimieren, nach der Markierung mit Fluoreszein-Maleinimid.

(A) Mittlere Fluoreszenz von Zellen, die FP-ET (E. coli BL21 (DE3) pLysS pET-SH3) exprimieren, markiert mit Fluoreszein-Maleinimid.
(B) Mittlere Fluoreszenz von Zellen, die FP-CT (E. coli BL21 (DE3) pLysS pET-SH4) exprimieren, markiert mit Fluoreszein-Maleinimid.
(C) Mittlere Fluoreszenz einer 1:1 Mischung von Zellen, die FP-ET exprimieren, und Zellen, die FP-CT exprimieren, nach der Markierung mit Fluoreszein-Maleinimid. Das Sortierungsfenster, das für die Selektion stark fluoreszenter Zellen verwendet wurde, ist als schwarzer Balken dargestellt.
(D) Mittlere Fluoreszenz von Zellen nach der FACS in dem in (C) beschriebene Sortierfenster. Für jede Messung wurden 10 000 Zellen analysiert.

9: die durchflusszytometrische Analyse des Surface-Displays von bovinem Adenodoxin (Adx), einem von Natur aus cysteinhaltigen Protein. E. coli Zellen BL 21 (DE3), die das Plasmid pET-SH3 enthalten, welches die für Adx kodierende und durch die XbaI/BglII Restriktionsstellen eingesetzte DNA enthält, wurden mit Fluorescin-Maleinimid markiert und mittels Durchflusszytometrie analysiert [B]. Die mittlere Fluoreszenz dieser Zellen (271) war im Vergleich zu dem Mittelwert der Fluoreszenz von Zellen, die FP-ET (39) (E. coli BL 21 (DE3) pET-SH3) exprimieren und als Kontrolle verwendet wurden, signifikant erhöht [A].
Verwendete Materialien und Methoden:
Bakterielle Stämme, Plasmide und Kulturbedingungen:
Der E. coli Stamm JK321 (ΔompT proC leu-6 trpE38 entA zih12::Tn10 dsbA::kan), der zur konstitutiven Expression von Fusionsproteinen im Autodisplay verwendet wurde, ist im Stand der Technik bekannt^[14].
Der E. coli Stamm BL21 (DE3) pLysS (F^– ompT hsdS_A (r_A ^– m_B ^–) gal dcm (DE3) pLysS (Cm^R), der für die induzierbare Expression verwendet wurde, ist kommerziell erhältlich, beispielsweise bei Stratagene (La Jolla, USA).
Für die induzierbare Expression wurde der Vektor pET11d verwendet, der kommerziell erhältlich ist, beispielsweise von Novagen, Madison, USA.
Für die Klonierung von PCR-Produkten wurden E. coli TOP10 (F^– mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 deoR recAI araD139 Δ(ara-leu) 7697 galU galK rpsL (Str^R) endA1 nupG) und der Vektor pCR2.1-TOPO verwendet, die beide kommerziell erhältlich sind, beispielsweise bei Invitrogen, Groningen, Niederlande.
Die Züchtung der Bakterien erfolgte routinemäßig bei 37 °C in Luria-Bertani (LB) Nährmedium, das 100 mg Ampicillin pro Liter enthielt. Für Expressionsstudien wurde Ethylendiamintetraacetat (EDTA) zu einer Endkonzentration von 10 μM zugegeben, und β-Mercaptoethanol wurde zu einer Endkonzentration von 10 mM zugegeben.
Rekombinante DNA Techniken:
Das Plasmid pJM1013 wurde in früheren Studien beschrieben und charakterisiert^[13]. Es lenkt das Epitop eines monoklonalen Maus-Antikörpers an die Zelloberfläche, wo dieses Epitop durch eine spezifische IgA1-Protease-Spaltungsstelle freigesetzt werden kann, sofern den Zellen extern die Protease zugefügt wird (3). Die Expression des Autotransporter-Fusionsproteins in pJM1013 steht unter der Kontrolle des starken konstitutiven Promotors P_TK ^[13].
Zur Konstruktion von pSH4, das ein einziges Cystein enthält, wurde das Gen der Autotransporter-Domänen des Plasmids pJM1013 mittesl PCR unter Verwendung der Oligonukleotid-Primer sh017 (5'-tct aga ctc gag aga tct tgc cct gaa tat ttc aaa gg-3') und sh002 (5'-cac cac cag acg gtc cgt aag tg-3') amplifiziert. Der Primer sh017 fügt das Codon für ein einziges Cystein hinzu (fett gedruckt) und enthält eine Xho I Restriktionsschnittstelle, die für Kontrolldigestionen verwendet werden kann. Das Fragment, das mittels PCR erhalten wurde, wurde in den Vektor pCR2.1-TOPO eingesetzt und erneut mit XbaI und CpoI gespalten. Das Plasmid pJM1013 wurde ebenfalls mit XbaI und CpoI aufgeschlossen und das mittels PCR erhaltene XbaI/CpoI-Fragment wurde eingefügt. Daraus resultierte das Plasmid pSH4, wie in 3 dargestellt. Die mittels PCR eingeführte XhoI-Schnittstelle wurde zur Differenzierung zwischen pJM1013 und pSH4 verwendet.
Für die induzierbar Expression wurde das im Handel erhältliche pET11d Vektor-Backbone von Novagen (Madison, USA) verwendet. Für die anschließenden Klonierungsvorgänge wurden in einem ersten Konstruktionsschritt alle XbaI und Bg/II Restriktionsstellen des Vektors deletiert. Zu diesem Zweck wurde eine PCR mit Oligonukleotid-Primern sh023 (5'-cct agg ggg gaa ttg tta tcc gc-3') und sh024 (5'-tga tca cga tcc cgc gaa att aat acg-3') und dem Plasmid pET11d als Matrize durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde in den Vektor pCR2.1-TOPO eingesetzt, erneut mit AvrII und BclI gespalten, und in den XbaI- und BglII-eingeschränkten Vektor pET11d ligiert, was zu pET11-SH2 führte. Dieser neue Vektor, der durch das vollständige Fehlen von XbaI und BglII Restriktionsstellen charakterisier ist, wurde mit NcoI und BamHI gespalten. Die Autotransporter-Domänen, die Signalpeptid, lineares Epitop, Linkerregion und β-Fass kodierende Regionen enthielten, wurden mittels PCR unter Verwendung von pJM1013 als Matrize und der Oligonukleotide sh015 (5'-cca tgg tta aat taa aat ttg gtg ttt ttt tta cag-3') und sh016 (5'-tga tca tta tca gaa gct gta ttt tat ccc c-3') als Primer amplifiziert. Das erhaltene PCR-Fragment wurde in pCR2.1 TOPO ligiert. Nach der Spaltung mit NcoI und BclI wurde das Fragment in den Vektor pET11-SH22 eingesetzt. Daraus resultierte das Plasmid pET-SH3, das wie für pJM1013 beschrieben die Expression des identischen Autotransporter-Fusionsproteins ermöglicht, jedoch unter der Kontrolle eines induzierbaren T7/Lac-Promotors. Der BclI-Schnitt führt zu klebrigen Enden, die mit jenen kompatibel sind, die durch BamHI erzeugt werden. Plasmid pET-SH4 wurde durch Ersetzen des 200 bp NdeI/CpoI-Fragments in pET-SH3 durch das entsprechende Fragment erhalten, das das einzige Cystein enthielt, das durch Spaltung von pSH4 mit NdeI und CpoI erhalten wurde.
Außenmembranherstellung:
E. coli Zellen wurden über Nacht gezüchtet und die Kultur (1 mL) wurde zum Beimpfen von LB Medium (20 mL) verwendet. Die Zellen wurden bei 37°C unter Schütteln (200 Upm) etwa 5 Stunden gezüchtet, bis eine OD₅₇₈ von 0,7 erreicht war. Nach der Ernte und dem Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) wurden Außenmembranen nach der schnellen Isolierungsmethode von Hantke präpariert^[25]. Für die Proteasebehandlung ganzer Zellen wurden E. coli Zellen geerntet, gewaschen und in PBS (5 mL) resuspendiert. Trypsin wurde bis zu einer Endkonzentration von 50 mgL^–1 zugegeben und die Zellen wurden 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Digestion wurde durch dreimaliges Waschen der Zellen mit PBS, das 10 % fötales Kälberserum (FCS) enthielt, gestoppt, und die Außenmembranen wurden wie zuvor beschrieben präpariert.
Für die induzierbare Expression wurde der Stamm BL21 (DE3) pLysS, der eines der beschriebenen Plasmide (pET-SH3 oder pET-SH4) enthält, über Nacht in LB Medium mit einem Gehalt von 50 μg mL^–1 Ampicillin und 34 μg mL^–1 Chloramphenicol gezüchtet. Chloramphenicol wurde eingesetzt, um die pLysS-Funktion aufrechtzuerhalten und damit eine strengere Kontrolle zu erreichen 1 mL dieser Übernacht-Kultur wurde zum Beimpfen von LB Medium (20 mL) verwendet. Die Zellen wurden bei 37°C unter Schütteln (200 Upm) etwa 3 Stunden gezüchtet, bis eine OD₅₇₈ von 0,6 erreicht war. 1 mM IPTG (Roth, Karlsruhe, Deutschland) wurde für die Induktion hinzugefügt. Nach 30 Minuten (wenn nicht anders angegeben) wurden die Zellen geerntet und die Außenmembranen wurden wie zuvor beschrieben präpariert.
SDS-PAGE und Western-Blot-Analyse:
Außenmembranpräparate wurden mit Probenpuffer (100 mM Tris/HCl (pH 6,8), der 4 % SDS, 0,2 % Bromophenolblau, und 20 % Glycerol enthielt, im Verhältnis 1:2 verdünnt. Die Proben wurden 10 Minuten bei 95°C gekocht und auf einem 12,5 % SDS-PA-Gel analysiert. Proteine wurden durch Coomassie-Brillantblau-Färbung sichtbar gemacht. Vorgefärbte Molekulargewichtsmarker (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) wurden zur Berechnung des scheinbaren Molekulargewichts der Außenmembranproteine verwendet. Für die Western-Blot-Analyse wurden Gele auf Polyvinyliden-Difluorid (PVDF)-Membranen unter Verwendung eines Mini Trans-Blot-Apparates von Bio-Rad Laboratories (München, BRD) elektrogeblottet und die geblotteten Membranen wurden in TBS mit 3 % FCS über Nacht blockiert.
Biotin-Maleinimid-Markierung von ganzen Zellen vor der Präparation der Außenmembran und dem Western-Blotting:
Nach der Ernte wurden die ganzen Zellen drei Mal mit 1 mL eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (10 mM Natriumphosphat, 0,9 % NaCl, 1 mM MgCl₂ [pH 7,4]), gewaschen, mit 2 % β-Mercaptoethanol 30 Minuten inkubiert und fünf Mal mit eiskalter PBS gewaschen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und das Pellet wurde in 5 ml Biotin-Maleinimid (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) (100 μM in PBS, enthaltend 1 % Dimethylformamid) resuspendiert^[7]. Nach einer Inkubation über 15 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Zellen dreimal mit PBS wie zuvor beschrieben gewaschen. Zellen, die nach diesem Protokoll markiert waren, wurden für die Außenmembranherstellung und anschließendes Western-Blotting aufgebrochen. Nach dem Blotten wurden die Membranen in PBS mit 3 % FCS 1 Stunde blockiert, dann mit Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat (Gibco BRL, Gaithersburg, USA), 1:10 000 verdünnt in PBS mit 3 % FCS, 45 Minuten inkubiert, und vier Mal mit PBS gewaschen^[26]. Durch Zugabe von 10 mL Inkubationspuffer (100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 100 mM Tris-HCl, pH 9,5), der 66 μL Nitroblautetrazoliumchlorid (50 mg mL^–1 in 70 % Dimethylformamid) und 33 μL 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat-Dinatriumsalz (20 mg mL^–1 in H₂O) enthielt, wurde eine Farbreaktion erhalten.
Immunodetektion des linearen Peptidepitops PEYFK, das als Kontrolle verwendet wird:
Zur Immunodetektion wurden Membrane 3 Stunden mit Anti-PEYFK-Antikörper Dü 142 ^[13] im Verhältnis 1:35 verdünnt in TBS mit 3 % FCS, inkubiert. Vor der Zugabe des sekundären Antikörpers wurden Immunoblots dreimal mit TBS gewaschen, das 0,1 % Tween 20 enthielt. Antigen-Antikörper-Konjugate wurden durch die Reaktion mit alkalische Phosphatase-gebundenem, sekundären Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper (KPL, Gaithersburg, USA), 1:10 000 verdünnt in TBS, das 3 % FCS enthielt, sichtbar gemacht. Eine Farbreaktion wurde durch Zugabe von 10 mL Inkubationspuffer (100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 100 mM Tris-HCl, pH 9,5) erreicht, der 66 μL Nitroblautetrazoliumchlorid (50 mg mL^–1 in 70 % Dimethylformamid) und 33 μL 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphate-Dinatriumsalz (20 mg mL^–1 in H₂O) enthielt.
Biotin-Maleinimid-Markierung von ganzen Zellen und photometrische Analyse:
1 ml einer Übernacht-Kultur wurde zu 20 ml LB-Medium zugegeben, das 100 μg mL^–1 Ampicillin enthielt. Die Zellen wurden bei 37 °C unter Schütteln bei 200 Upm gezüchtet, bis eine OD₅ ₇ ₈= 3 erreicht war. 1 × 10⁹ Zellen wurden durch Zentrifugation bei 14 000 × g über 2 Minuten bei 4 °C geerntet. Alle Schritte wurden in 2 ml Eppendorf-Reaktionsröhrchen durchgeführt. Nach dreimaligem Waschen mit 1 ml eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) wurden die Zellen in 1 ml PBS mit einem Gehalt an 2 % β-Mercaptoethanol 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, wonach fünf Waschschritte mit 1 ml eiskalter PBS folgten. Die Zellen wurden bei 30 °C in 1 ml 500 μM Biotin-Maleinimid (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO), aufgelöst in PBS mit einem Gehalt an 1 % Dimethylsulfoxid 25 Minuten inkubiert^[7]. Nach dreimaligem Waschen mit eiskalter 3 % BSA haltiger PBS wurden die Zellen in 1 ml 3 % BSA haltiger PBS 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, wonach eine Zentrifugation folgte. Danach wurden die Zellen in Streptavidin-β-Galactosidase-Lösung (6,5 μg mL^–1 in PBS mit 2 % BSA) resuspendiert und 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, wonach vier Waschschritte mit eiskalter PBS folgten. Schließlich wurden die Zellen in 2 ml 0,1 M Natriumphosphat-Puffer resuspendiert und die OD₅₇₈ wurde bestimmt. 1 ml dieser Lösung wurde zu 200 μl o-Nitrophenyl-β-D-Galactosid (ONPG, 4 mg/ml in PBS, pH 7,0) zugegeben und bei 28 °C 5 Minuten inkubiert. Nach der Zugabe von 500 μl 1 Na₂CO₃ wurden die Zellen durch Zentrifugation (10 Minuten, 5000 × g, 4 °C) pelletiert und die Absorption des Überstandes wurde bei 405 nm bestimmt. Die β-Galactosidase-Aktivität, die den Cystein-Molekülen entspricht, die an der Zelloberfläche zugänglich sind, wurde in Miller-Einheiten nach Giacomini berechnet^[15]. Reaktionszeit (5 Minuten) und Reaktionsvolumen (1 ml) wurden während der gesamten Messung konstant gehalten.
Fluoreszein-Maleinimid-Markierung ganzer Zellen und durchflusszytometrische Analyse:
1 ml einer Übernacht-Kultur wurde zu 20 ml LB-Medium hinzugefügt, das 100 μg ml^–1 Ampicillin enthielt. Die Zellen wurden bei 37°C unter Schütteln bei 200 Upm gezüchtet, bis eine OD₅₇₈ = 3 erreicht war. 1 × 10⁹ Zellen wurden durch Zentrifugation bei l4 000 × g über 2 Minuten bei 4 °C geerntet. Alle Schritte wurden in 2 ml Eppendorf-Reaktionsröhrchen durchgeführt. Die Zellen wurden drei Mal mit eiskalter, sterilfiltrierter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, in 1 ml 10 μM Fluoreszein-5-Maleinimid (F-M) (Molecular Probes Europe, Leiden, Niederlande), aufgelöst in PBS mit einem gehalt an 1 % Dimethylformamid, suspendiert und im Dunkeln bei 30 °C 10 Minuten inkubiert, wonach die Reaktion durch die Zugabe von 20 mM DTT gestoppt wurde. Überschüssiges Fluoreszein-Maleinimid wurde durch fünfmaliges Waschen der Zellen mit 1 ml PBS entfernt. Die Zellen wurden in 1 ml PBS resuspendiert und auf eine End-OD₅₇₈ von 0,05 für die anschließende FACS-Analyse verdünnt. Die Fluoreszenz wurde in einem Durchflusszytometer (FACSCalibur, Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 530 nm bestimmt. In den Figuren ist der Mittelwert der Fluoreszenz von 10 000 gemessenen Zellen angegeben.
Surfase-Display
Die in den Beispielen genannten Daten zum Surfase-Display eines rekombinanten Proteins wurden mit Hilfe von "Autodisplay", einem im Stand der Technik bekannten, effizienten Surfase-Display-System erhalten, das für E. coli etabliert. Einzelheiten dieses Surfase-Display-Systems sind von J. Maurer, J. Jose, T. F. und Meyer, in J Bacteriol 1997, 179, 794^[10] und von J. Jose, F. Hannemann und R. Bernhardt in ChemBioChem 2001, 2, 695^[11] beschrieben. Auf den Inhalt dieser Publikationen wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen. Dieses Surfase-Display mittels Autodisplay basiert auf dem Autotransporter-Sekretionsmechanismus^[12].
Anstelle von Autodisplay sind aber auch andere Systeme für die Analyse des Surface-Displays rekombinanter Proteine vostellbar, insbesondere unter Verwendung anderer Wirtszellen als E. coli.
Beispiel 1: Konstruktion eines Zielpeptids (Passengers) mit einem einzigen Cystein
Das Surfase-Display eines in einem rekombinanten Protein enthaltenen Zielpeptids, eines sogenannten Passengers, mittels Autodisplay in E. coli beruht auf dem Autotransporter-Sekretionspfad^[12] und erfordert die Integration des Zielpeptids in einen Polyproteinvorläufer mit definierter Struktur (2). Für diesen Zweck muss ein künstliches Gen durch PCR konstruiert werden, das für ein N-terminales Signalpeptid (SP), für das Zielpeptid bzw. den Passenger, für ein sogenanntes Linkerpeptid und für den C-terminalen β-Kern kodiert. Mit Hilfe des SP wird der Vorläufer über die Innenmembran transloziert und die Außenmembran-Translokation wird durch das β-Fass ("β-core") erleichtert, das bzw. der eine porinartige Struktur bildet. Um die vollständige Oberflächenexposition des Zielpeptids/Passenger-Proteins zu erhalten, ist ein Linkerpeptid notwendig^[10] ^[11] (2).
In den vorliegenden Beispielen wurde das im Stand der Technik bekannte Plasmid pJM 1013^[13] verwendet, um das Gen für ein Zielpeptid/Passenger-Protein mit einem einzigen Cystein zu konstruieren. Das Plasmid pJM1013 ist von J. Maurer et al. in J Bacteriol 1999, 181, 7014 ausführlich beschrieben, und auf den Inhalt dieser Publikation wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen. Das Plasmid pJM 1013 kodiert für ein Vorläuferprotein, das ein effizientes Surface-Display eines Epitops für den monoklonalen Maus-Antikörper Dü 142 unter der Kontrolle des konstitutiven Promotors P_TK erleichtert ^[13]. Durch PCR-Mutagenese wurde in das Plasmid pJM1013 das Codon für ein einziges Cystein und zusätzlich eine XhoI-Restriktionsstelle eingefügt, wodurch das Plasmid pSH4 erhalten wurde (3). Aufgrund dieser Einfügungen unterschieden sich die Proteine, für die pJM1013 (epitophaltiges Fusionsprotein, FP-EP) und pSH4 (cystein- und epitophaltiges Fusionsprotein, FP-CP) kodieren, geringfügig in der Größe. Beide Plasmide wurden in E. coli JK 321 transformiert, einen an das Autodisplay fremder Zielpeptide/Passenger-Proteine gut angepassten Stamm^[14], und der Transport zu der Zelloberfläche wurde analysiert.
Beispiel 2: Sondierung des Surface-Displays von FP-EP, exprimiert von Plasmid pJM1013, und FP-CT, exprimiert von Plasmid pSH4:
Im bisherigen Stand der Technik war die differentielle Zellfraktionierung ein geeignetes Werkzeug, um herauszufinden, ob ein Zielpeptid/Passenger zu der Zelloberfläche transportiert wird ^[10] ^[11] ^[2] ^[3]. Wie aus 4A hervorgeht, war es mit dieser Methode möglich, ein Protein korrekter Größe in der Außenmembranfraktion von E. coli JK321, die Plasmid pSH4 enthält, wie auch in JK321 mit Plasmid pJM1013 nachzuweisen. In beiden Fällen war die Expression annähernd so hoch wie bei den natürlichen Außenmembranproteinen OmpA und OmpF/C. Ein ähnliches Protein war weder in der Cytoplasmafraktion noch in der Innenmembranfraktion (nicht dargestellt) nachweisbar. Durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers Dü 142 zum Nachweis des von pJM1013 kodierten Zielpeptids/Passengers ergaben beide Proteinbanden ein Signal (4B), das ihre Identität als FP-CT (Bahn 1) bzw. FP-ET (Bahn 3) anzeigte.
Als nächstes war zu zeigen, dass die Zielpeptid/Passenger-Domäne von FP-CT und FP-ET tatsächlich an der Zelloberfläche exponiert sind. Für diesen Zweck wurden ganze Zellen, die pJM1013 und pSH4 exprimieren, mit Trypsin behandelt, bevor die Außenmembranfraktionen präpariert wurden. Trypsin ist ein zu großes Molekül, um durch die Außenmembran hindurchzugehen. Daher ist die Degradation der Zielpeptid/Passenger-Domäne durch Trypsin, das den ganzen Zellen zugefügt wird, ein klarer Hinweis auf seine Oberflächenzugänglichkeit. Wie aus 4A und 4B hervorgeht, führte die externe Trypsinzugabe zu der Degradation von FP-CP (Bahn 2) und FP-EP (Bahn 4). In Coomassie-gefärbten SDS-Gelen (3A) war eine zusätzliche Proteinbande nachweisbar, die dem in der Membran eingebetteten und somit trypsinbeständigen β-Kern entsprach (2). Ein identischer, in der Membran eingebetteter, trypsinbeständiger Kern wurde bereits für andere Zielpeptide/Passenger-Proteine beschrieben, die im Autodisplay verwendet wurden^[10] ^[11].
Zusammenfassend zeigen die vorliegenden Ergebnisse, dass durch beide Fusionsproteine, FP-CT und FP-ET, die Zielpeptid-/Passenger-Domänen an die Zelloberfläche (= Außenmembran) von E. coli transloziert werden und dort frei zugänglich sind. Da FP-CT einen einzigen Cysteinrest enthält, wurde ein Nachweisverfahren auf der Basis der Maleinimid-Kopplung durchgeführt: Nach SDS-PAGE wurden in derselben Weise wie zuvor für Western-Blot-Experimente beschrieben, Proteinbanden auf einen PVDF-Membranfilter überführt. Anstatt jedoch – wie im Stand der Technik üblich – einen Antikörper für den Nachweis zu verwenden, wurde Biotin-gekoppeltes Maleinimid hinzugefügt und eine Markierung wie vorstehend unter "Verwendete Materialen und Methode" beschrieben durchgeführt (vgl. auch Tabelle 1).
Maleinimid wird durch die Michael-Addition kovalent an den Cysteinrest gebunden, und nach Zugabe von Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat und eines chromogenenen Substrates (X-Phosphat) wird eine nachweisbare Färbung erhalten. 4C zeigt, daß FP-CT durch diese Prozedur tatsächlich gefärbt wird, FP-ET hingegen nicht. Dieses Ergebnis bestätigt die Effizienz dieses erfindungsgemäßen Cystein-abhängigen, Antikörper-unabhängigen Filterdetektionstests.
Beispiel 3: Photometrische Analyse von Zellen, die ein einziges Cystein tragen
Für diesen Zweck wurden identische Mengen mit jeweils 10⁹ Zellen von E. coli JK321 pSH4, die FP-CT mit einem einzigen Cystein exprimieren, und Kontroll-E. coli JK321 pJM1013, die FP-ET ohne Cystein exprimieren, 25 Minuten mit 500 μM Biotin-Maleinimid wie vorstehend unter "Verwendete Materialien und Methoden" beschrieben inkubiert. Nach der Zugabe von Strepatividin-β-Galactosidase-Konjugat wurden beide Zellproben 5 Minuten mit o-Nitrophenyl-β-D-Galactosid (ONPG), einem chromogenen Substrat für β-Galactosidase, inkubiert. Die Freisetzung von 2-Nitrophenol aufgrund der enzymatischen Aktivität wurde durch Absorption bei 405 nm bestimmt. Zellen, die FP-CT mit einem einzigen Cystein exprimierten, wiesen eine β-Galactosidase-Aktivität von 153 Miller-Einheiten auf^[15] (Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten), während Kontrollzellen, die FP-ET ohne Cystein exprimierten, eine Aktivität von 23 Miller Einheiten zeigten (Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten). Daraus folgt – nach einer Bereinigung der von den Testzellen erhaltenen Werte durch die von den Kontrolzellen erhaltenenen Werte – dass Zellen, die FP-CT exprimieren, eine β-Galactosidase-Aktivität von 130 Miller-Einheiten aufweisen. Dieser Unterschied in der Aktivität ist auf die spezifische Markierung von Cystein durch Biotin-Maleinimid zurückzuführen. Damit ist gezeigt, dass die Markierung eines einzigen Cysteins, das an der Zelloberfläche einer Bakterienzelle durch Autodisplay exprimiert wird, für die Analyse einer solchen geringen Anzahl von bakteriellen Zellen (10⁹) mittels Photometrie ausreichend ist. Das erfindungsgemäße Verfahren ist folglich auch zur Verwendung in der Online-Überwachung der Proteinproduktion z.B. von Zellen in einem industriellen Verfahren gut geeignet. Es kann insbesondere in Fällen angewendet werden, in denen das Protein selbst das Produkt eines Prozesses ist, z.B. um reine Enzyme zu erhalten, oder auch in Fällen, in denen Zellen erforderlich sind, die hohe Zahlen eines Enzyms oder eines anderen funktionellen Proteins exprimieren, bevor sie synthetischen Zwecken unterworfen werden.
Beispiel 4: Induzierbare Oberflächenexpression eines Zielpeptids/Passenger-Proteins mit einem einzigen Cystein
Für viele industrielle oder synthetische Anwendungen ist es von großem Vorteil, die Expression des gewünschten rekombinanten Proteins auf Transkriptionsebene zu kontrollieren. Zum Beispiel ermöglicht dies die Produktion einer hohen Zahl von Zellen, bevor mit der Expression des rekombinanten Proteins durch Zugabe eines spezifischen Induktors begonnen wird. Um ein induzierbares Autodisplay-System zu erhalten und das erfindungsgemäße cysteinspezifische Markierungsverfahren in der Überwachung der kontrollierten Induktion einer Proteinexpression einzusetzen, wurden Fusionsproteine FP-CT und FP-ET von einem induzierbaren T7/Lac-Promotor exprimiert. Zu diesem Zweck wurde das künstliche Vorläufergen, das für die Autotransporter-Domäne kodiert, mit einem Zielpeptid/Passenger, der ein einziges Cystein (FP-CT) enthält, in den Vektor pET11d eingesetzt. Dieser Plasmidvektor, der im Handel erhältlich ist, ist für die induzierbare Proteinexpression spezifiziert. Das neue Plasmid, das auf diese Weise erhalten wurde, wurde als pET-SH4 bezeichnet (3). Es ermöglichte die induzierbare Expression des Zielpeptid/Passenger-Proteins FP-CT von dem aus pET11d stammenden T7/Lac-Promoter. Mit dem Gen, das für FP-ET kodiert, wurde auf gleiche Weise verfahren und dabei das Plasmid pET-SH3 erhalten (3), welches als Kontrolle diente. Beide Plasmide wurden in den Bakterienstamm E. coli BL21 (DE3) transformiert, der im Handel frei erhältlich ist und üblicherweise für die T7/Lac-Promoter-vermittelte Induktion der Expression verwendet wird. Die anschließende Proteinexpression wurde analysiert. Wie in 5 dargestellt, konnte eine sehr große Menge an FP-CT in der Außenmembranfraktion von BL21 (DE3) pET-SH4 Zellen nach der Induktion mit IPTG nachgewiesen werden. Die Expressionsrate war noch höher als jene der natürlichen Außenmembranproteine OmpA und OmpF/C. Sie konnte sowohl in Coomassie-gefärbten SDS-Gelen (5A) als auch durch Western-Blotting mit Antikörper DÜ142 (5B) nachgewiesen werden.
Nach der Induktion konnte außerdem mittels der cysteinspezifischen Maleinimid-Kopplung eine einzige Proteinbande, entsprechend FP-CT, nachgewiesen werden (5C), die in nicht induzierten Zellen nicht nachweisbar war. Dieses Ergebnis stimmte mit jenen überein, die durch Western-Blot und Coomassie-Färbung von SDS-Gelen erhalten wurden, und zeigt, dass die T7/Lac-Promoter-kontrollierte Expression von FP-CT stringent war.
Beispiel 5: Durchflusszytometrische Analyse von Zellen, die ein Protein mit einem einzigen Cystein tragen
Zellen von E. coli BL21 (DE3) pET-SH4, die FP-CT exprimieren, wurden mit Fluorescin-Maleinimid markiert (Tab. 1). Zu diesem Zweck wurden Proben einer Zellsupension mit einer OD₅₇₈= 1,0 mit 500 μM Fluorescin-Maleinimid 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, nachdem sie 30 Minuten mit IPTG induziert worden waren. Nach Beendigung der Reaktion und Entfernung von überschüssigem Markierungsreagens durch wiederholtes Waschen mit Puffer wurden die Zellen auf eine endgültige OD₅ ₇ ₈ = 0,05 verdünnt und einer Durchflusszytometrie unter Verwendung eines FACSCalibur Durchflusszytometers unterzogen. E. coli BL21 (DE3) pET-SH3, das FP-ET (ohne Cystein) exprimiert, wurde auf gleiche Weise vor der Durchflusszytometer-Analyse behandelt und als Kontrolle verwendet. 6 zeigt, dass die Stärke der Fluoreszenz von BL21 (DE3), das FP-CT exprimiert, deutlich von dem intrinsischen Hintergrundsignal der E. coli-Kontrolle, die FP-ET exprimiert, unterscheidbar war. Dies zeigt, dass die Maleinimid-Kopplung eines einzigen Cysteins in einem Protein, das auf der E. coli Oberfläche erschien, eine praktikable, gut funktionierende Markierungsprozedur für die Durchflusszytometer-Analyse ist.
Als nächstes wurde untersucht, ob diese spezifische und sensitive Markierung die Überwachung des Zeitverlaufs der Expression rekombinanter Proteine auf der Oberfläche von E. coli nach der Induktion ermöglicht. Zu diesem Zweck wurde den Proben mit E. coli BL21 (DE3) pET-SH4 Zellen IPTG hinzugefügt, um die Expression von FP-CT zu starten. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurden Proben genommen, mit Fluoreszein-Maleinimid wie zuvor beschrieben markiert und anschließend durch Durchflusszytometrie analysiert. Wie aus 7 ersichtlich ist, stieg der Mittelwert der Fluoreszenz von 10 000 analysierten Zellen über einen Zeitraum von 90 Minuten für jede Probe kontinuierlich an, während die mittlere Fluoreszenz von Kontrollzellen, die FP-ET exprimierten, sich nur leicht verschob. Dies gibt die kumulative Anzahl von FP-CT Molekülen wieder, die auf der Oberfläche von E. coli aufgrund der Induktion der Expression durch IPTG erschienen. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnise, dass die Cystein-Markierung durch Michael-Addition an Derivate von Maleinimid eine einfach durchzuführende und effiziente Methode zur Überwachung des Erscheinens rekombinanter Proteine auf der Zelloberfläche nach Induktion der Expression ist und im Hoch-Durchsatzverfahren wie der Durchflusszytometrie anwendbar ist. Die Vorteile dieser Markierungs- und Detektionsmethode sind offensichtlich: es sind nur minimale Mengen von Zellen notwendig, die in weniger als einer Stunde markiert werden können. Zusätzlich kann die durchflusszytometrische Analyse markierter Zellen innerhalb von Sekunden durchgeführt und automatisiert werden. Der Gehalt eines rekombinanten Proteins kann selbst in einer kleinen Probe rasch und, falls erwünscht, automatisch bestimmt werden kann. Dies kann z.B. zur Online-Überwachung der Proteinexpression an der Oberfläche lebender Zellen in industriellen Prozessen genutzt werden.
Beispiel 6: Durchflusszytometrische Sortierung einzelner Zellen, die ein cysteinhaltiges Protein an der Oberfläche tragen
Zellen von E. coli BL21 (DE3) pET-SH4, die FP-CT mit einem einzigen Cystein exprimieren, und E. coli BL21 (DE3) pET-SH3, die FP-ET ohne Cystein exprimieren, wurden in einem Verhältnis von 1:1 gemischt, mit Fluoreszein-Maleinimid markiert und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Wie aus 8C hervorgeht, resultierten daraus in einer Probe zwei Zellpopulationen, die durch ihre Fluoreszenzstärke unterschieden werden konnten. Die relativen Fluoreszenzstärken beider Zellpopulationen waren mit jenen identisch, die erhalten wurden, wenn Zellen von BL21 (DE3) pET-SH3 (FP-ET) und pET-SH4 (FP-CT) markiert und getrennt analysiert wurden (8A bzw. 8B). In der gemischten Probe wurde ein Sortierfensters definiert (8C), so dass Zellen mit einer Fluoreszenz, die jener von FP-CT-positiven Zellen entsprach (8B), von dem Sortiermodul des FACSCalibur Zytometers aussortiert wurden. Diese Zellen wurden gesammelt und – nachdem eine Teilmenge von Zellen für das Wachstum und die anschließende DNA-Analyse entfernt worden war –, erneut einer Durchflusszytometrie unterzogen. 8D zeigt die Fluoreszenzverteilung der Zellen in der sortierten Probe. Wie erkennbar ist, wurde nach nur einer Runde Zellsortierung eine Population mit hoher Fluoreszenz, entsprechend den FP-CT Zellen, aus der Mischung von positiven und negativen Zellen heraussortiert. Zur Verifizierung der Identität der Zellen, die durch diese Prozedur sortiert worden waren, wurde die zuvor entfernte Teilmenge von Zellen verdünnt und adäquate Verdünnungen auf Agarplatten ausplattiert, um einzelne Kolonien zu erhalten. Die Anzahl einzelner Zellklone, die durch diese Prozedur erhalten wurde, entsprach der Zahl, die durch Durchflusszytometrie bestimmt wurde. Das bedeutet, dass die Zellen das Markierungs- und Sortierungsprotokoll ohne Verlust überstehen. Aus zehn der erhaltenen einzelnen Zellklone wurde Plasmid DNA isoliert und einer Restriktionsanalyse unterworfen. In dieser Analyse wurde die Tatsache ausgenutzt, dass pET-SH4 eine XhoI-Restriktionsstelle enthält, die in pET-SH3 fehlt (3). Alle analysierten Zellklone enthielten Plasmid pET-SH4. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Markierung eines einzigen Cysteins, das in einem Protein an der Zelloberfläche exprimiert wird, die Selektion entsprechender Zellen aus einer heterogenen Population durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) ermöglicht. Das erfindungsgemäße Markierungsverfahren ermöglicht folglich, daß aus einer Mischung von Zellen, die ein bestimmtes gewünschtes Protein, z.B. ein Enzym, exprimieren, und nicht-exprimierenden Zellen diejenigen Zellen, die das gewünschte Protein exprimieren, schnell und mit hohem Durchsatz selektiert werden, um eine optimierte Zellpopulation zu erhalten, bevor sie in einem industriellen oder synthetischen Prozess angewendet wird.
Für die Zellsortierung wurden 270 000 Zellen der Mischung analysiert und insgesamt 86 000 Zellen aussortiert. Aufgrund des Sortierverfahrens waren die selektierten Zellen stark verdünnt. Daher musste ein viel größeres Volumen dieser Zelllösung durch den Durchflusszytometer laufen, bevor 10 000 Zellen, die feststehende Anzahl von Zellen für jedes Experiment, auf Fluoreszenz analysiert waren. Dies führte zu dem Auftreten eines Peaks geringer Fluoreszenz (8D), der keine wachsenden Zellen enthielt und von dem daher angenommen wird, dass er aus Pufferverunreinigungen besteht.
Beispiel 7: Cystein-Markierung von bovinem Adrenodoxin, das an der E. coli Oberfläche exprimiert wird
Für den Nachweis, daß auch natürlich vorkommende Cysteine in Zielpeptiden/Passenger-Proteinen, die auf der E. coli Oberfläche (= Außenmembran) exponiert werden, mit dem erfindungsgemäße Verfahren markierbar und detektierbar sind, wurde das Ferredoxin der bovinen Nebennierenrinde, Adrenodoxin (Adx) ausgewählt. Adx enthält fünf Cysteine und einen Eisen-Schwefel-Cluster als prothetische Gruppe. Vier der fünf Cysteine sind an der Bindung der [2Fe-2S]-Gruppe beteiligt. Im Stand der Technik ist bekannt, dass apo-Adx effizient über den Autotransporter-Pfad zu der E. coli Zelloberfläche transportiert wird^[2]. Die prothetische Gruppe kann nach dem Transport eingesetzt werden, um aktives, elektron-transferierendes holo-Adx zu erhalten^[11]. Für den hier beschriebenen Nachweis wurden die Untersuchungen auf das Surface-Display von apo-Adx beschränkt. Zu diesem Zweck wurde die kodierende Region von Adx in den Vektor pET-SH3 eingesetzt, und die Oberflächentranslokation wurde wie zuvor beschrieben verifiziert. Mit Zellen einer Übernachtkultur wurde frisches Medium beimpft, anschließend inkubiert wurde, bis ein exponentiales Zellwachstum erhalten wurde. Die Adx-Expression wurde durch Zugabe von IPTG über 30 Minuten induziert. Zellen wurden geerntet, auf OD₅ ₇ ₈ = 1,0 eingestellt und mit Fluoreszein-S-Maleinimid wie zuvor beschrieben markiert. 9B zeigt, dass diese Behandlung im Vergleich zu Kontroll-pET-SH3-Zellen zu einer deutlich erhöhten Fluoreszenz von Zellen führte (9A). Damit ist gezeigt, dass die erfindungsgemäße Markierungs- und Detektionsmethode zur Überwachung der Expression von Zielpeptiden/Passenger-Proteinen geeignet, die inhärente (d.h. eigene, natürliche) Cysteine enthalten.
Beispiel 8: Überwachung der Oberflächenexpression eines Zielpeptids/Passenger-Proteins ohne Cysteine oder ohne zugängliche Cysteine
Zur Überwachung der Oberflächenexpression eines Zielpeptids/Passenger-Proteins ohne oder ohne vom äußeren (umgebenden) Medium aus zugängliche Cysteine mittels Autodisplay wird die kodierende Region dieses Zielpeptids/Passenger-Proteins in das Plasmid pET-SH4 an der XbaI, XhoI, oder BglII Restriktionsstelle eingesetzt (3). Dies führt zu einer Co-Sekretion des Cysteins, das von pET-SH4 abgeleitet ist, und die Oberflächentranslokation des rekombinanten Zielpeptids/Passengers kann durch das co-sezernierte einzige Cystein nachgewiesen werden. Diese Verfahren eignet sich insbesondere für die Analyse des Surface-Displays von Enzymen, – im speziellen von bakteriellen Enzymen und hierunter vor allem von Esterasen und Oxidoreduktasen, – für die kein spezifischer Antikörper verfügbar ist. Der Transport und die Oberflächenzugänglichkeit wird durch Cystein-Markierung und anschließende Western-Blot-artige Experimente verifiziert.
Beispiel 9: Eignung von Maleinimid und Maleinimid-Derivaten für die erfindungsgemäße Markierung von Cystein
Kontrollzellen von E. coli, die Zielpeptide/Passenger-Proteine ohne Cysteine exprimieren, waren immer negativ, unabhängig von der angewendeten Detektionsmethode (4C, 7, 8A), E. coli Zellen ohne Plasmid waren ebenso negativ (nicht dargestellt). Da das Periplasma von E. coli bekanntermaßen eine Reihe von Proteinen mit frei zugänglichen und reaktiven Cysteinen enthält^{[19, 20]}, beweisen diese Ergebnisse, dass Maleinimid und die Maleinimid-Derivate, die in dieser Studie verwendet wurden, nicht imstande waren, die Außenmembranbarriere zu durchdringen. Offensichtlich waren sie weder hydrophob genug, um durch die asymmetrische Lipid-Doppelschicht hindurchzugehen, noch klein genug, um durch die hydrophiler Poren zu gelangen, die von den Porinen bereitgestellt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren unter Einsatz von Maleinimid und/oder dessen Derivate, mit anderen Worten: die erfindungsgemäße Maleinimid-abhängige Markierungs- und Detektionsmethode, ist infolgedessen auch dazu geeignet, eine Oberflächenexposition von zum Beispiel der periplasmatischen Lokalisation eines Proteins zu unterscheiden, das ein oder mehrere Cysteine enthält.
Beispiel 10: Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Proteinreinigung
Zu diesem Zweck wurde das Gen für eine spezifische IgA1-Protease-Spaltungsstelle während der (in den vorstehenden Beispielen beschriebenen) Vektor-Konstruktion eingefügt (3). Die externe Zugabe einer ortsspezifischen IgA1-Protease setzt das Zielpeptid/Passenger-Protein mit dem anhaftenden Cystein frei, wenn das entsprechende Gen in die Vektoren pJM1013, pSH4, pET-SH3 oder pET-SH4 eingesetzt wurde. Außerdem kann eine zusätzlichen Spaltungsstelle für eine ortsspezifische Protease, z.B. Faktor X, in N-terminaler Ausrichtung zu dem Cystein, das zur Reinigung verwendet wird, eingesetzt werden. Im Anschluß an die erfindungsgemäße Biotin-Maleinimid-Markierung wird in einem ersten Schritt durch Einsatz einer IgA1-Protease das Zielpeptid/der Passenger mit dem an Biotin-Maleinimid gekoppelten Cystein von der Zelloberfläche freigesetzt und danach das Protein z.B. mit Hilfe einer Strepavidin-beschichteten Säule (oder eines anderen Strepavidin-beschichteten Trägers) gereinigt. In einem zweiten Schritt setzt der Faktor X das gereinigte Zielpeptid/Passenger-Protein von der Säule frei, wodurch das zur Reinigung verwendete Cystein zurückbleibt.
Beispiel 11: Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Aufreinigung von Zellen
Aus einer Mischung verschiedener Zellen werden diejenigen Zellen aufgereinigt, die ein bestimmtes insbesondere gewünschtes rekombinantes Peptid oder Protein an ihrer Oberfläche exprimieren, welches wenigstens ein zugängliches Cystein aufweist. Zu diesem Zweck werden alle Zellen einer Markierungsreaktion mit Biotin-Maleinimid unterworfen. Allein diejenigen Zellen, die das bestimmte, insbesondere gewünschte rekombinante Polypeptid bzw. Protein mit dem (den) zugänglichen Cystein(en) an ihrer Oberfläche exprimieren, werden im Verlauf dieser Reaktion tatsächlich mit Biotin-Maleinimid markiert. Diese markierten Zellen werden anschließend an Streptavidin-überzogene Kügelchen, Streptavidin-Agarose, oder jede andere Streptavidin-modifizierte Matrix gekoppelt, z.B. in Flüssigchromatographiesäulen und auf diese Weise aus der Mischung von Zellen angereichert. In entsprechender Weise können Zellen, die ein Enzym, einen Antikörper oder ein anderes funktionales Protein an der Oberfläche exprimieren, immobilisiert werden, um sie in kontinuierlichen Reaktionen einzusetzen. Außerdem können Zellen mit dieser Methode an Membranen fixiert werden, um sie z.B. in Oberflächenplasmon-Resonanzexperimenten zu verwenden.
Literaturzitate:

[1] G. Georgiou, C. Stathopoulos, P. S. Daugherty, A. R. Nayak, B. L. Iverson, R. Curtiss, 3rd, Nat Biotechnol 1997, 15, 29.
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Tabelle 1: Maleinimid-Cystein-Verbindungen an der Zelloberfläche und Detektionsmethoden

Claims

Verfahren zum Nachweis der Expression eines durch Rekombination erzeugten Polypeptids in einer demgemäß transformierten Wirtszelle, wobei das rekombinante Polypeptid in oder an der die Wirtszelle gegen das sie umgebende äußeren Medium abgrenzenden Zelloberfläche repräsentiert wird und einen von dem äußeren Medium aus zugänglichen Abschnitt aufweist, dadurch gekennzeichnet, a) daß man das rekombinante Polypeptid derart konstruiert, daß es in dem zugänglichen Abschnitt wenigstens einmal die Aminosäure Cystein aufweist, b) daß man die Wirtszelle einem äußeren Medium aussetzt, welches eine Markersubstanz enthält, die spezifisch an Cystein bindet, c) daß man die Bindungreaktion zwischen Cystein und der Markersubstanz herbeiführt, d) und daß man die Wirtszelle anschließend einem Prozess zur Detektion der Cystein-Marker-Verbindungen unterwirft.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Polypeptid konstruiert wird, indem man a) eine Nukleinsäure bereit stellt, die die für das Polypeptid und dessen Repräsentation an der Zelloberfläche kodierende Nukleotidsequenz umfaßt, wobei diese Nukleotidsequenz in ihrem für den zugänglichen Abschnitt des Polypeptids kodierenden Bereich wenigstens ein Cystein-Codon aufweist, welches entweder natürlicherweise in dem für den zugänglichen Abschnitt kodierenden Bereich der Nukleotidsequenz enthalten ist oder artifiziell in diesen Bereich insertiert wird, b) diese Nukleinsäure in eine Wirtszelle einschleust, und c) die Expression dieser Nukleinsäure in der Wirtszelle herbeiführt.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure für ein Fusionsprotein kodiert, welches aus dem in/an/auf der Zelloberfläche repräsentierten Ziel-Polypeptid und einem für dessen Expression und Repräsentation notwendigen Helfer-Polypeptid besteht, und daß sie die für das Ziel-Polypeptid kodierende Nukleotidsequenz sowie die für das Helfer-Polypeptid kodierende Nukleotidsequenz umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure für ein Fusionsprotein kodiert, welches aus Signalpeptid, Ziel-Polypeptid, Linker-Polypeptid und Transportdomäne eines Autotransporters besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle eine Bakterienzelle ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle eine Gram-negative Bakterienzelle, insbesondere eine Enterobakterienzelle ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle eine Bakterienzelle, ausgewählt aus der Gruppe Eschericha coli, Shigella flexneri, Serratia marcescens, Helicobacter mustelae, Bordetella pertussis, Haemophilus influenza, Helicobacter pylori, Rickettsia sp. und Neisseria sp. ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Markersubstanz Maleinimid und/oder ein Maleinimidderivat und die Bindungsreaktion eine Michael-Additions-Reaktion ist.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Maleinimidderivat biotyniliertes Maleinimid ist.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Prozess zur Detektion von Cystein-Maleinimid-Verbindungen und/oder Cystein-Maleinimidderivat-Verbindungen ein photometrischer Prozess ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Prozess zur Detektion von Cystein-Maleinimid-Verbindungen und/oder Cystein-Maleinimidderivat-Verbindungen ein Western-Blot ist.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Maleinimidderivat Fluoreszein- Maleinimid ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Prozess zur Detektion von Cystein-Maleinimid-Verbindungen und/oder Cystein-Maleinimidderivat-Verbindungen ein Fluoreszenzaktiveirter Zellsorting-Prozess ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Markersubstanz ein Haloacetyl-Derivat und die Bindungsreaktion eine Alkylierung ist
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Markersubstanz ein Pyridyl-Disulfid-Derivat und die Bindungsreaktion eine Konjugationsreaktion ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren mit lebenden Zellen durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Aufreinigung von Proteinen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Aufreinigung von Zellen, die das gewünschte, durch Rekombination erzeugte Polypeptid oder Protein exprimieren.
Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einem Ganzzellbiokatalysationsprozess gekoppelt bzw. kombiniert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Überprüfung der Enzym- oder Protein-Expression eines Ganzzellbiokatalysators vor, während oder nach einem synthetischen oder industriellen detoxifizierenden Prozesses.