DE69932351T2

DE69932351T2 - DNS-kodierende Fusionsproteine, die durch Kupfer(II)-Ionen spezifisch spaltbar sind

Info

Publication number: DE69932351T2
Application number: DE69932351T
Authority: DE
Inventors: David Paul Maidenhead HUMPHREYS
Original assignee: Celltech R&D Ltd
Current assignee: UCB Celltech Ltd
Priority date: 1998-11-27
Filing date: 1999-11-29
Publication date: 2007-07-05
Anticipated expiration: 2019-11-30
Also published as: ATE332976T1; AU1289100A; EP1133566A1; DK1133566T3; GB9826112D0; DE69932351D1; WO2000032795A1; EP1133566B1

Description

Diese Erfindung betrifft rekombinante Fusionsproteine und Verfahren zum Spalten solcher Fusionsproteine, um ein gewünschtes Protein in nativer Form zu erhalten.
Um bei der intrazellulären Löslichkeit, der Reinigung und dem Nachweis zu helfen, werden viele Proteine, die von biotechnologischem Interesse sind, als Fusionsproteine exprimiert, einschließlich: Galactosidase, IgG bindendes Peptid, Glutathion S-Transferase, Maltose bindendes Protein, His-tag, myc-tag, Cellulose bindende Domäne, Calmodulin bindendes Peptid, FLAG-tag, und Strep-tag [Casadaban MJ et al, (1983); Nilsson B et al., (1987); Smith DB und Johnson KS, (1988), di Guan C et al., (1988); Hochuli E et al., (1988); Dreher ML et al. (1991); Ong E et al., (1991); Stofko-Hahn RE et al., (1992); Brizzard BL et al., (1994); und Schmidt TGM und Skerra A. (1994). Für die vollständigen Details der Veröffentlichungen, auf die hier Bezug genommen wird, siehe den Abschnitt der Beschreibung, der mit "REFERENZEN" überschrieben ist].
Es ist häufig für den Fusionspartner unerwünscht, mit dem interessierenden Protein nach der Reinigung assoziiert zu bleiben, weil dies mit der Protein Funktion, der strukturellen Analyse interferieren kann, oder es kann immunogen sein, wenn das Protein in vivo verabreicht wird. Es können Peptid Stellen, die durch spezifische Proteasen, wie Faktor Xa, TEV, Genenase I, Thrombin, Enterokinase und 3C gespalten werden, zwischen die zwei Protein Domänen eingeführt werden, um die Spaltung der zwei Domänen zu erlauben [Nagai K und Th⌀gersen HC, (1984); Dougherty WG of al., (1988); Carter P und Wells JA (1987); McKenzie KR et al., (1991); LaVallie ER et al., (1993); Walker PA et al., (1994)]. Jedoch können diese Enzyme teuer sein, schwankende Wirksamkeiten aufgrund von Unterschieden in den Sequenzen, welche die Zielstelle umgeben und der Erreichbarkeit der Stelle gegenüber einem großen Enzym, aufweisen, und sie benötigen einen weiteren Reinigungsschritt, um das proteolytische Enzym aus der Probe zu entfernen.
Die obere verbindende Tetrapeptid Sequenz ^NDKTH^C wurde als die Spaltstelle eines hoch gereinigten rekombinanten humanisierten γ1 Antikörpers durch Spuren von Cu²⁺ identifiziert [Smith MA et al., (1996)]. Die Sequenz wurde zwischen den Lys und Thr Resten gespalten. Der Grad der Spaltung stieg mit steigender Temperatur, der Länge der Zeit und dem pH-Wert der Inkubation und auch mit den steigenden Mengen von zur Verfügung stehenden Cu²⁺ Ionen an. Die ^NDKTH^C Sequenz wurde auch duch Cu²⁺ gespalten, wenn sie in einem kleinen Peptid anwesend war [Smith MA et al., (1996)].
Wir haben jetzt einen verbesserten Spaltungslinker zur Verwendung in der Konstruktion von rekombinanten DNS bzw. DNA Sequenzen konstruiert, die für Fusionsproteine kodieren. Der Linker kodiert für eine Kupfer(II)-Stelle, umfassend eine Sequenz aus vier verschiedenen Aminosäuren.
So stellen wir gemäß einem Aspekt der Erfindung eine DNA bereit, die für ein Fusionsprotein kodiert, umfassend zwei Polypeptide, welche über eine Spaltstelle verbunden sind, welche die Polypeptide nicht natürlich verbindet und welche durch Kupfer(II)-Ionen spezifisch spaltbar ist.
Um Zweifel zu vermeiden, wird der Begriff "welche nicht natürlich verbindet" hier verwendet, um Proteine auszuschließen, die in der Natur bekannt sind, und um eine Aminosäure Sequenz einzuschließen, die durch Kupfer(II)-Ionen spaltbar ist, zum Beispiel wie hier im Folgenden beschrieben.
Die Erfindung schließt auch einen Vektor ein, umfassend DNA, die für ein Fusionsprotein kodiert, umfassend zwei Polypeptide, welche über eine Spaltstelle verbunden sind, welche die Polypeptide nicht natürlich verbindet und welche durch Kupfer(II)-Ionen spezifisch spaltbar ist, und Wirtszellen, die mit einem solchen Vektor transformiert sind. Der Vektor kann insbesondere ein Expressionsvektor sein, der weiterhin insbesondere hier im Folgenden beschrieben ist. Wirtszellen schließen irgendwelche prokaryonten und eukaryonten Zellen, insbesondere bakterielle, Hefe-, tierische, z.B. Säugetier-, Insekten- und Pflanzenzellen ein.
Weiterhin schließt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins in nativer Form ein, umfassend 1) das Exprimieren des gewünschten Proteins als ein Fusionsprotein in einer Wirtszelle, die mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert ist, in der das gewünschte Protein als eines oder zwei Polypeptide, verbunden über eine Stelle, welche durch Kupfer(II)-Ionen spezifisch spaltbar ist, exprimiert wird, 2) das Spalten des Fusionsproteins mit Kupfer(II)-Ionen und 3) das Gewinnen des gewünschten, gespaltenen Proteins in nativer Form. Das Fusionsprotein, das in diesem Verfahren hergestellt wird, ist neu und bildet einen weiteren Aspekt der Erfindung.
In all den Aspekten der Erfindung, die hier beschrieben sind, kann die Spaltstelle irgendein Tetrapeptid sein, das durch Kupfer(II)-Ionen gespalten werden kann, und schließt insbesondere das Tetrapeptid ^NDKTH^C, wie hier beschrieben, und funktionelle Äquivalente davon, ein, zum Beispiel wo eine oder mehrere funktionell äquivalente Aminosäure/n als Alternative/n zu den gezeigten eingeschlossen/sind. Geeignete Substitutionen schließen jene Aminosäuren ein, die allgemein als konservative Austausche für D, K, T und H, zum Beispiel E für D, R für K, S für T und Y für H, bekannt sind. Einzelne, doppelte oder multiple Substitutionen können gemacht werden. Beispiele von besonders nützlichen Alternativen zu der ^NDKTH^C Stelle schließen ^NDRSH^C, ^NEKSH^C und insbesondere ^NDKTH^C, ein. Die DNA, die für das Peptid ^NDKTH^C kodiert, schließt jene ein, die in dem experimentellen Abschnitt im Folgenden beschrieben ist, und funktionelle Äquivalente davon, zum Beispiel aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Kodes. Die DNA, die für irgendeines der obigen funktionellen Äquivalente von ^NDKTH^C kodiert, ist auf die gleiche Weise einfach erhältlich.
Alle Aspekte der Erfindung sind weitreichend anwendbar auf die Herstellung irgendeines gewünschten Proteins, und die verschiedenen Begriffe "Polypeptid", "Fusionsprotein" und "Protein", so wie hier verwendet, sollen verstanden werden, dass sie irgendein Protein, Polypeptid, Peptid und Fragmente davon von irgendeiner prokaryonten, eukaryonten oder synthetischen Quelle einschließen, außer wo es anders angegeben ist. Besondere Beispiele schließen Säuger Polypeptide und Proteine, einschließlich Enzyme; Serum Proteine, insbesondere Antikörper; Cytokine; Hormone; Wachstumsfaktoren; Rezeptoren; strukturelle Proteine; und Vorläufer und Fragmente davon, ein.
Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine können unter Verwendung von Standard rekombinanten DNA Techniken hergestellt werden, welche die Expression der Proteine durch eine Wirtszelle einschließen. Isolierte DNA, die für jedes Protein kodiert, kann zum Beispiel in irgendeinen geeigneten Expressionsvektor durch funktionelle Verknüpfung der DNA mit irgendwelchen notwendigen Expressionskontrollelementen darin, eingeführt werden, und das Transformieren irgendeiner geeigneten prokaryonten oder eukaryonten Wirtszelle mit dem Vektor unter Verwendung von gut bekannten Verfahren, zum Beispiel die hier im Folgenden in dem experimentellen Abschnitt beschrieben sind. Zur Bildung der DNA, die für das Fusionsprotein kodiert, können eine geeignete DNA, die für das interessierende Protein kodiert; und sein Fusionspartner über eine Oligonukleotid Sequenz fusioniert werden, die für die Kupferspaltstelle kodiert, unter Verwendung von herkömmlichen Annealing Verfahren, um sicherzustellen, dass der richtige Leserahmen in dem Vektor aufrechterhalten wird. Wo andere potenzielle Kupferspaltstellen in der Ausgangs DNA identifiziert werden, können diese durch Standard Mutagenese Techniken, zum Beispiel wie in den Beispielen hier beschrieben, entfernt werden.
Die Expression des Fusionsproteins während der Kultur der Wirtszelle kann unter Verwendung von Standard Assay Verfahren überwacht werden, und an irgendeinem geeigneten Zeitpunkt während oder nach der Kultur kann das Protein aus den Wirtszellen und/oder aus dem Kulturmedium unter Verwendung herkömmlicher Protein Reinigungstechniken, wie Chromatographie und Filtration, isoliert werden.
Sobald sie erhalten wurden, können die erfindungsgemäßen Fusionsproteine unter Verwendung von Kupfer(II)-Ionen gespalten werden, um das gewünschte rekombinante Protein zu erhalten. Die Spaltreaktion kann unter Verwendung irgendeiner Quelle von Kupfer(II)-Ionen, zum Beispiel einem Kupfer(II)-Salz, z.B. CuCl₂, in einem geeigneten Lösungsmittel, zum Beispiel einem wässrigen gepufferten Lösungsmittel, bei einem geeigneten pH-Wert und einer geeigneten Temperatur durchgeführt werden. Die exakten Reaktionsbedingungen, einschließlich der verwendeten Kupfermenge, wird von der Natur und der Quantität des Fusionsproteins und den Spaltprodukten abhängen und kann vorteilhafterweise empirisch für jedes Protein bestimmt werden, zum Beispiel wie in dem experimentellen Abschnitt im Folgenden beschrieben ist. Wenn ein wässriger Puffer verwendet wird, kann der Puffer vorteilhafterweise ein Tris-Puffer sein. Die Herstellung des gewünschten Proteins kann während der Spaltreaktion unter Verwendung irgendeines geeigneten Assays, basierend zum Beispiel auf der Aktivität, Immunreaktivität und/oder der Größe des Proteins, überwacht werden. Das gewünschte Protein kann nach der Spaltreaktion unter Verwendung von Standard Protein Isolierungs- und Reinigungstechniken, zum Beispiel wie gerade beschrieben, gewonnen werden.
Auf die folgenden Figuren wird in den Beispielen unten Bezug genommen. In den Figuren:
1 Wirkung des Puffertyps auf die Wirksamkeit der Spaltung von "Null 2 FLAG" F(ab')₂ durch Cu²⁺
Coomassie gefärbte nicht reduzierende SDS-PAGE unter Verwendung von 4–20 % Tris-Glycin Gelen. Alle Spuren enthalten 1 μg Protein Äquivalente aus den Spaltreaktionen unter Verwendung von 50 mM Puffer bei pH 8,5 (mit Ausnahme von MES, dessen pH-Wert 5,5 betrug) für 16 h bei 62°C. Die Größe und die Wanderung der Molekulargewichtsmarker sind auf der linken Seite in kDa gezeigt. Die Spaltreaktionen in den Spuren 1 und 2 waren jeweils Tris gepuffert mit 1 mM und 0,1 mM Cu²⁺; die Spuren 3 und 4 waren jeweils Bicin gepuffert mit 1 mM und 0,1 mM Cu²⁺; die Spuren 5 und 6 waren jeweils Tricin gepuffert mit 1 mM und 0,1 mM Cu²⁺; die Spuren 7 und 8 waren jeweils CHES gepufffert mit 1 mM und 0,1 mM Cu²⁺; die Spuren 9 und 10 waren jeweils HEPES gepuffert mit 1 mM und 0,1 mM Cu²⁺; die Spuren 11 und 12 waren jeweils MES gepuffert mit 1 mM und 0,1 mM Cu²⁺.
2 Wirkung des pH-Werts auf die Wirksamkeit der Spaltung durch Cu(II)
3 Demonstration der Spaltung des FLAG Schwanzes und die Wirkung von Cu²⁺
Nicht reduzierende SDS-PAGE unter Verwendung von 4–20% Tris-Glycin Gelen. Alle Spuren enthalten 1 μg Protein Äquivalente (außer es ist anders angegeben) aus Spaltreaktionen unter Verwendung von 50 mM Puffer bei pH 9,0 (mit Ausnahme von MES, dessen pH-Wert 5,5 betrug) für 24 h bei 62°C. Die Spuren 1 und 8 waren mit Coomassie gefärbt. Die Größe und die Wanderung der Molekulargewichtsmarker ist auf der linken Seite in kDa gezeigt. Die Spaltreaktionen in den Spuren 1 und 5 waren jeweils Tris gepuffert mit 5 mM, 2,5 mM, 1 mM, 0,1 mM und 10 μM Cu²⁺; die Spur 6 war MES gepuffert mit 1 mM Cu²⁺; die Spur 7 war Tris gepuffert mit 10 mM EDTA; die Spur 8 war Tris gepuffert mit 0,5 mM Cu²⁺ und Complete^TM Protease Inhibitor. Die Spuren 9 und 11 zeigen den Immunnachweis von Beladungen des langen äquivalenten Proteins mit einem Anti-Flag monoklonalen Antikörper. Sie waren alle Tris gepuffert und enthalten jeweils 2,5 mM Cu²⁺, 1 mM Cu²⁺ und 10 mM EDTA. Die Spur 12 enthält ein Silber gefärbtes Gel, das mit 1 μg Protein beladen wurde, einer Tris gepufferten Spaltreaktion mit 1 mM Cu²⁺.
4 Wirkung auf das Spaltungsausmaß der Cu(II)-Konzentration
5 Wirkung des Metallions auf die Wirksamkeit der Spaltung
Mit Coomassie gefärbte, nicht reduzierende SDS-PAGE unter Verwendung von 4–20% Tris-Glycin Gelen. Die Größe und Wanderung der Molekulargewichtsmarker sind auf der linken Seite in kDa gezeigt. Alle Spuren enthalten 1 μg Protein Äquivalente aus den Spaltreaktionen unter Verwendung von 50 mM Tris Puffer bei pH 9,0 für 24 h bei 62°C, und enthalten jeweils 1 mM Cu²⁺, Fe³⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Ni²⁺, Zn²⁺ und 2,5 mM Cu²⁺ in den Spuren 1 bis 7.
6 Wirkung der Inkubationsdauer auf die Wirksamkeit der Spaltung
7 Wirkung der Inkubationstemperatur auf die Wirksamkeit der Spaltung
8 HPLC Mobilität von gespaltenem und ungespaltenem CUT1 Peptid
9 HPLC Mobilität von Peptiden, die nach der Spaltung von Null 2 FLAG F(ab')₂ gesammelt und sequenziert wurden
10 Plasmid Karte für pDPH76
BEISPIELE
Die folgenden Abschnitte beschreiben Aspekte der Erfindung detaillierter. Die folgenden Abkürzungen werden verwendet: Fab' – Antigen bindendes Antikörper Fragment; F(ab')₂ – dimeres Fab'; LC – leichte Kette (engl.: light chain); HC – schwere Kette (engl.: heavy chain).
Im Folgenden wird die Verwendung von Cu²⁺ als eine Alternative zu der enzymatischen Spaltung von Fusionsproteinen unter Verwendung eines humanisierten γ1 Fab' mit einem C-terminalen FLAG Peptid als einem Modell Protein gezeigt. Eine ^NDKTH^C Stelle wurde zwischen die Verknüpfung und das FLAG Peptid nach Mutagenese der nativen ^NDKTH^C Sequenz in die obere Verknüpfung eingeführt, um eine "Null" Stelle zu kreieren, die nicht länger durch Cu²⁺ gespalten wird.
Experimentelles Protokoll
Herstellung des "Null 2 FLAG" Expressionsplasmids
Das Plasmid pDPH76, das "Fab 40.4 Verknüpfung 1 Δ inter Null 2 FLAG" kodiert, stammte von dem Plasmid pDPH40, das "Fab 40.4 Verknüpfung 1/2 Δ inter" kodiert. pDPH40 weist eine Spe 1 Restriktionsstelle, eingeführt an dem 3' Ende des HC Cistrons, auf – wo das Interketten Disulfid Cys zu einem Ser mutiert wurde, zusammen mit dem angrenzenden Ser gegen einen Thr Austausch (Humphreys DP of al., 1997). Dies erlaubte die Klonierung der Region, welche die Verknüpfung, die Cu²⁺ Stelle, den Spacer und FLAG kodiert, als eine Spe I – Eco RI Oligonukleotid Kassette nach dem Annealen der Oligonukleotide:
5'TAGTCTGCAGGTGCTGACCTGCCCGCCGTGTCCGGATAAAACCCA TACCATCGAAGGCAGTACTAGCGATTATAAAGATGATGATGATAAATG ATGAGGATCCAAGCTTGCGGCCGCG 3', und 5'AATTCGCGGCCGCA AGCTTGGATCCTCATCATTTATCATCATCATCTTTATAATCGCTAGTAC TGCCTTCGATGGTATGGGTTTTATCCGGACACGGCGGGCAGGTCAG CACCTGCAGA 3', was zu dem Plasmid pDPH76 (10) führte. Die neu konstruierte kodierende Region enthielt auch einzelne BspE I und Sca I Restriktionsstellen. Es wurden Kodons, die von E. coli bevorzugt werden, gewählt [Wada KN et al., (1991)]. Die Sequenz der Oligonukleotid kodierenden Region wurde durch Sequenzieren von beiden Strängen unter Verwendung eines PRISM Cycle Sequencing Kits und eines ABI 373A Sequenziergeräts bestätigt.
Herstellung und Reinigung von "Null 2 FLAG" F(ab')₂
Hochdichte bakterielle Fermentationen von Stamm W31 10, enthaltend pDPH76, wurden wie zuvor beschrieben, durchgeführt [Humphreys DP et al., (1997)]. Die Extraktion von periplasmatischem Material, Protein G Reinigung von Fab', F(ab')₂ Herstellung und Phenyl Sepharose Reinigung wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt [Humphreys et al., (1998)]. Nach der Reinigung von F(ab')₂ wurde das Protein konzentriert und der Puffer gegen einige Volumina PBS unter Ver wendung einer Amicon, unter Druck stehenden, gerührten Zelle mit einer 10 kDa Ausschlussmembran bei Bedingungen zwischen 0,5 und 1,6 mgml^–1 ausgetauscht und mit einem 0,22 μM Filter für die Lagerung bei 4°C sterilisiert.
Cu²⁺ Spaltreaktionen
F(ab')₂ wurde in alle Reaktionen bei 0,33 mgml^–1 eingeschlossen, Tris und andere Puffer wurden bei einer Endkonzentration von 50 mM (aus einer 500 mM Stock Lösung) verwendet. Der pH-Wert der Puffer wurde mit HCL eingestellt, und Tris wurde bei pH 9,0 verwendet, außer es ist anders angegeben. Alle Metallionen, die getestet wurden, waren Chloridsalze gelöst in dH₂O und wurden aus 10 × Stocks für jede getestete Konzentration verwendet. Das Volumen der Reaktionen wurde mit dH₂O in 0,5 ml Eppendorf Gefäßen aufgefüllt, durch Vortexen gemischt und kurz zentrifugiert. Die Reaktionsvolumina waren meistens 15 μl, aber sie wurden auch bis 150 μl erweitert. Um Verdampfung während der längeren Inkubation bei Temperaturen im Bereich von 59°C bis 64°C zu vermeiden, wurden die Reaktionen mit einer Schicht Paraffinöl bedeckt. Inkubationen bei 62°C fanden in einem Luftinkubator statt, während andere Temperaturen in einem Biometra TRIOThermoblock mit heißen Deckeln stattfand. Für die SDS-PAGE wurden 1 μg Proben durch das Paraffinöl für eine sofortige Elektrophorese oder in 10 mM EDTA entnommen und bei 20°C vor der Elektrophorese während der Zeitverlaufsexperimente gelagert. Bei Proben, die für die HPLC Analyse bestimmt waren, wurde das Paraffinöl durch Pipettieren und Ether Extraktion entfernt. EDTA freier Complete^TM Protease Inhibitor (Boehringer Mannheim, UK) wurde nach den Anweisungen des Herstellers verwendet.
SDS-PAGE Analyse von "Null 2 FLAG" Spaltung durch Cu²⁺
1 μg pro Spur Cu²⁺ behandelter Proben wurde auf 4–20% Tris-Glycin Gelen (Novex, UK) nach Kochen in nicht reduzierendem SDS-PAGE Auftragungspuffer für 3 Min. elektrophoretisch getrennt. Die Gele wurden für 10 Min. mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt und anschließend für die Analyse durch Laser Scanning Densi tometrie auf einem Molecular Dynamics Model 300A Gerät entfärbt, unter Verwendung der ImageQuaNT Software Version 4.2 oder Trocknen zwischen Zellulose Membranen (Novex, UK). Dem "Null 2 FLAG" F(ab')₂ fehlte die Interketten Disulfid Bindung, und so trennt er sich in di-HC und freie LC Spezies während der nicht reduzierenden SDS-PAGE. Weil jedes F(ab')₂ Molekül zwei Cu²⁺ Spaltstellen enthält, sind drei Spezies nach Inkubation mit Cu²⁺ möglich: ungeschnitten (U), einmal gespalten (S) und zweimal gespalten (D) (3). Spezies, bei denen die FLAG Schwänze entfernt wurden, wandern schneller als ungeschnittene Spezies während der SDS-PAGE, was es leichter macht, sie zu identifizieren (3). Die untere Bande, welche die zweimal geschnittenen Spezies (D) darstellt, ist nicht immunreaktiv mit einem Anti-FLAG Antikörper, was zeigt, dass beide FLAG Schwänze von diesen Spezies entfernt wurden (Spuren 9 und 10, 3). F(ab')₂, der mit 10 mM EDTA behandelt wurde, zeigt nur einmal gespaltene Spezies durch Immundetektion, selbst nach einer 24 h Inkubation bei 62°C (Spur 11, 3). Gespaltener FLAG Schwanz konnte nach Silberfärbung von SDS-PAGE optisch dargestellt werden (Bande F, Spur 12, 3).
Die prozentuale kumulative Spaltung wurde nach der Messung des Absorptionsbereichs für jeden der Peaks für die drei Spezies berechnet, wobei somit: die kumulative Spaltung
ist.
Die Gelen wurden Silber gefärbt mit "Silber Stain II" von Daiichi Pure Chemicals Co. Ltd., Tokio, Japan. Das Western Blotten wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben [Humphreys DP et al., (1997)], mit der Ausnahme, dass der verwendete primäre Antikörper Anti-FLAG monoklonaler M2 bei einer 1/500 Verdünnung (Kodak, UK) war, der mit ExtrAvidin-HRP (Sigma) bei 1/500 gezeigt wurde. "Regen bogen" Marker wurden durchgängig als Molekulargewichtsstandards verwendet (Novex, UK).
Oberflächen Plasmon Resonanz
Die kinetische Analyse, um die "An" und "Aus" Raten für die Antigen Bindung an "Null 2 FLAG" F(ab')₂ Molekülen zu bestimmen, wurde unter Verwendung eines BIACORE 2000 (Biacore AB) durchgeführt. "Null 2 FLAG" F(ab')₂ Moleküle wurden durch ein anti-human IgG gefangen, das auf der Sensorchip Oberfläche immobilisiert war, gefolgt von einer Injektion von löslichem Antigen. Affinitätsgereinigtes Ziege anti-human Ig, F(ab')₂ spezifisches Fragment (Jackson ImmunoResearch), wurde auf einem Sensorchip CM5 über Amin Kopplungschemie bis zu einer Menge von 15500 RU immobilisiert. HBS Puffer (10 mM HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% Grenzflächen aktives P20, Biacore AB) wurde als der Laufpuffer mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 μl/Min. verwendet. Eine Injektion von "Null 2 FLAG" F(ab')₂ wurde durch immobilisiertes anti-human IgG bis zu einer Menge zwischen 340–390 RU gefangen. Lösliches Antigen wurde über die gefangene "Null 2 FLAG" F(ab')₂ Oberfläche bei 2 und 0 μg/ml injiziert. Die Oberfläche wurde durch Injizieren von 2 × 5 μl einer 30 mM HCl regeneriert. Das Sensorgramm für lösliche Antigen Bindung wurde mit einem Kontroll Puffer Sensorgramm korrigiert. Die kinetischen Parameter wurden unter Verwendung der BIA Bewertungs 2.1 Software berechnet.
Massenspektrometrie
Die molekulare Masse für Fab' und F(ab')₂ wurde unter Verwendung der Fisons VG Quattro 1 Triple Quadrupol Ausstattung im Elektrospray Ionisierungsmodus bestimmt. Die F(ab')₂ Proben wurden durch mehrfache Volumen Austausche mit 10 mM Ammoniumacetat unter Verwendung von Microcon Konzentration mit einer 10 kDa Membran Ausschlussgröße (Amicon, UK) entsalzt, um Tris zu entfernen.
Analyse der Aminosäure Zusammensetzung
Dies wurde in der Abteilung für Molekulare und Zellbiologie der Universität Aberdeen, UK auf einem ABI 420A Gerät nach Hydrolyse mit 6 M HCl für 40 Min. bei 160°C unter Argon durchgeführt.
HPLC Reinigung und N-terminale Sequenzierung des gespaltenen FLAG Schwanzes aus F(ab')₂
Die HPLC Reingung – Die Reaktionsgemische, die gespaltenes/ungespaltenes F(ab')₂ enthielten, wurden durch Hochleistungsflüssigchromatographie unter Verwendung einer Aquapore RP300, 7 Mikron, 2,1 × 100 mm Säule auf einem Hewlett Packard HP1090 mit Online Dioden Array für die Spektralanalyse aufgetrennt. Die Bestandteile wurden mit einem linearen Gradienten von 2 bis 95% Acetonitril in Wasser/Trifluoressigsäure (0,1% v/v), bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/Min., bei 21°C, gelöst. Die Peaks, die bei 214 nm absorbierten, wurden gesammelt und unter Vakuum konzentriert, um Acetonitril für die Peptid Sequenzierung zu entfernen.
Peptid Sequenzierung – Die Peptide in den Fraktionen wurden an Polyvinylidendifluorid Membran (Prosorb, Applied Biosystems) gebunden, und 100 mg Polybren (Biobrene, Applied Biosystems) wurde darauf aufgetragen, und sie wurden auf der Membran luftgetrocknet. Jedes Peptid auf der Prosorb Membran wurde anschließend durch Sequenzieren auf einem Applied Biosystems 470A mit online 120A Analysiergerät analysiert.
HPLC Analyse der Peptid Spaltung durch Cu²⁺
Die Peptide wurden in dH₂O gelöst und bei 0,5 mM Endkonzentrationen in Inkubationen mit Tris pH 9,0 bei 50 mM, und CuCl₂ von 2,5 mM bis 100 μM in einem Endreaktionsvolumen von 20 μl mit dH₂O in 0,5 ml Eppendorf Gefäßen verwendet, durch Vortexen gemischt und kurz vor dem Überschichten mit Paraffinöl zentrifugiert und bei 62°C für 16 – 24 h inkubiert. Das Paraffinöl wurde durch Pipettieren und Ether Extraktion entfernt. Die Peptide wurden durch HPLC unter Verwendung einer Symmetrie C18 Säule (3,5 Mikron, 4,6 × 150 mm) auf einem Hewlett Packard HP1090 mit einem Online Dioden Array für die Spektralanalyse analysiert. Die Bestandteile der Probe wurden auf einem linearen Gradienten, von 5 bis 95% Acetonitril in Trifluoressigsäure (0,1%, v/v), bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/Min., bei 21 °C gelöst. Die Elution wurde bei 214 nm überwacht.
ERGEBNISSE
Veränderung (engl.: Engineering) von Fab' mit C-terminaler Cu²⁺ Spaltstelle Das Fab' war von einem zuvor beschriebenen humanisierten γI Fab' ("Fab 40.4 Verknüpfung 1 Δ inter") [Humphreys DP et al., (1997)] abgeleitet. Dies bindet an humanes Cytokin mit hoher Affinität und wird in hoher Ausbeute aus dem Periplasma von E. coli nach hochdichter Zellfermentation von Stämmen, die Fab' Expressionsplasmid tragen, gereinigt. Das "Fab 40.4 Verknüpfung 1 Δ inter" weist zwei Cysteine in einer intakten γ1 Verknüpfung auf und weist die inter leichte Kette-Fd Disulfid Brücke (im Folgenden Interkette) aufgrund von Mutagenese der Interkette Cysteine zu Serinen, nicht auf. Um zu zeigen, dass die "Null" Cu²⁺ Stelle nicht durch Cu²⁺ gespalten wurde, wurde das Fab' zu F(ab')₂ dimerisiert. Eine nicht reduzierende SDS-PAGE von F(ab')₂, welches die Interkette Bindung nicht aufweist, lieferte eine einfach zu identifizierende Spezies mit zwei schweren Ketten mit einer Masse von ~ 50 kDa, die nur als Dimer verblieb, wenn die "Null" Stelle nicht durch Cu²⁺ gespalten wurde. Die kleinere Größe der di-HC Spezies im Vergleich zu der F(ab')₂ Spezies erleichterte auch die akkurate Analyse des Ausmaßes der Protein Spaltung durch nicht reduzierende SDS-PAGE.
Alle vier Reste in der nativen ^NDKTH^C Sequenz der oberen Verknüpfung von "Fab 40.4 Verknüpfung 1 Δ inter" wurden mutiert, um die Cu²⁺ Spaltstelle zu zerstören, was zu dem Protein führte, das als "Null 2 FLAG" bezeichnet wird. Im Anschluss an die mittlere Verknüpfung gibt es eine kurze hydrophile/flexible Spacer Region, gefolgt von einer Cu²⁺ Spaltstelle ^NDKTH^C, und schließlich ein FLAG Peptid (Briz zard BL et al., (1994)]. Die C-terminalen Sequenzen der zwei schweren Ketten sind unten zum Vergleich gezeigt. "Fab 40.4 Verknüpfung 1 Δ inter" schwere Kette
"Fab 40.4 Verknüpfung 1 Δ inter Null 2 FLAG" schwere Kette
Es wurde gefunden, dass das "Null 2 FLAG" Fab' nach der Reinigung aus E. coli Zellfermentationszellpasten durch Protein G Chromatographie in der Massenspektrometrie intakt war. Die beobachteten Massen für die leichte und schwere Kette betrugen jeweils 23.382,66 ± 1,18 und 26.739,62 ± 1,87, im Vergleich zu den vorhergesagten Massen von jeweils 23.384,25 und 26.742,04. Somit wurden die eingeführte Cu²⁺ Stelle, der flexible Spacer und das FLAG Peptid nicht durch E. coli Proteasen oder Bestandteilen des Mediums gespalten.
Wirkung der Puffer Zusammensetzung und des pH
Es ist bekannt, dass die Spaltreaktion einer nativen oberen Verknüpfungsstelle durch alkalische pHs begünstigt ist [Smith MA et al., (1996)]. Ein starker Puffer wurde benötigt, um die Untersuchung des optimalen pH zu ermöglichen, weil konzentriertes CuCl₂ sauer ist. Von Puffern mit primären Aminen ist bekannt, dass sie eine Bindungskapazität für Cu²⁺ Ionen aufweisen [Dawson RMC et al., (1989)]. Wir untersuchten die Wirksamkeit von Spaltreaktionen unter Verwendung von 50 mM Tris, Bicin, Tricin, CHES und HEPES als Puffer bei pH 8,5 unter Verwendung von Cu²⁺ Konzentrationen von 1 mM und 100 μM. Überraschenderweise führte Tris zu der wirksamsten Spaltung, Bicin und Tricin zu minimaler Spaltung, während CHES und HEPES zum Verlust des F(ab')₂ Materials (1) führten. Die Cu²⁺ Bindungskapazität des Tris Puffers (der 1° Amine enthält) kann tatsächlich vorteilhaft sein, die als ein Cu²⁺ Chelatierungs-/Puffer System und durch Präsentation von Cu²⁺ gegenüber der Fab' Cu²⁺ Bindungsstelle wirken.
Tris wurde anschließend bei pH-Werten von 8,0, 8,5, 9,0, 9,25 und 9,5 getestet, um den optimalen pH-Wert für Spaltreaktionen zu bestimmen. Die Ergebnisse in 2 zeigen eindeutig einen Anstieg in der Protein Spaltung bei ansteigendem pH-Wert. Ein pH-Wert von 9,0 wurde für alle nachfolgenden Spaltreaktionen als ein Kompromiss zwischen wirksamer Spaltung, wirksamer Abpufferung und dem Wunsch, milde Inkubationsbedingungen zu verwenden, gewählt. Die Inkubation mit 0,1 mM, 1 mM und 2,5 nM Cu²⁺ bei pH 5,5 in MES Puffer führte nicht zu einer Spaltung des FLAG Schwanzes (Spuren 11 und 12, 1 und Spur 6, 3).
Wirkung der Cu²⁺ Konzentration
Die [Cu²⁺], die eine optische Protein Spaltung lieferte, wurde empirisch bestimmt. Zuvor wurde gefunden, dass die maximale Protein und Peptid Spaltung bei einem molaren Verhältnis von zwischen 0,5 und 1 Cu²⁺: Protein/Peptid in einem nicht Tris Puffer liegt [Smith MA et al., (1996) und Allen G & Campbell RO (1996)]. Weil Tris Puffer eine signifikante Cu²⁺ Bindungskapazität aufweist, war die Vorhersage des wirksamen Maximums [Cu²⁺] schwierig. Es wurde ein Bereich von Cu²⁺ Konzentrationen von 10 mM bis 10 μM untersucht. Es wurde gefunden, dass 10 mM und 7,5 mM Cu²⁺ jeweils eine sofortige und über Nacht Präzipitation verursachten, aber die SDS-PAGE Analyse für den verbleibenden Rest der Titration ist in 3 gezeigt. Die Quantifizierung der Wirkung von [Cu²⁺] ist in 4 gezeigt. Dies zeigt, dass es eine klare Abhängigkeit des Ausmaßes der Spaltung von [Cu²⁺] gibt. Eine solche Spaltung war vollständig durch den Einschluss von EDTA in einer Endkonzentration von 10 mM (Spur 7, 3) inhibiert. Das Ausmaß der Spaltung mit 2,5 mM Cu²⁺ war durch Einschluss eines Breitband Protease Inhibitors (Spur 8, 3) nicht beeinflusst, was nahe legt, dass diese hoch gereinigte F(ab')₂ Probe nicht den Wirkungen einer kontaminierenden Protease unterworfen wird. Keine Spaltung von "Null 2 FLAG" wird nach 24 h Inkubation mit Ca²⁺, Fe³⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Ni²⁺ oder Zn²⁺ Ionen bei 1 mM (5) beobachtet, was zeigt, dass das Spaltereignis spezifisch aufgrund der Anwesenheit von Cu²⁺ Ionen auftrat.
Wirkung der Inkubationsdauer
Die Dynamik der Spaltung bei 62°C mit 2,5 mM Cu²⁺ sind nichtlinear (6). Es gab eine kurze Lag Phase von ungefähr 2 h bevor eine signifikante Protein Spaltung beobachtet wurde. Die Spaltung schritt nahezu linear bis ungefähr 12–14 Stunden (~ 50% Spaltung) fort, gefolgt danach von einer Verlangsamung in der Anhäufung von gespaltenen Spezies. Nach einer über Nacht Inkubation mit 2,5 mM Cu²⁺ waren ungefähr 53% der Cu²⁺ Stellen gespalten, 77% nach einer 24 h Inkubation und erreichten 86% nach 28,5 h. Die Lag Phase kann ein Indikator einer Cu²⁺ Verfügbarkeitswirkung, Äquilibrierung von Cu²⁺ zwischen Tris und F(ab')₂ Bindungsstellen oder der Bildung von reaktiven Peptid Spaltungsspezies sein [Allen G und Campbell RO (1996); Wolff SP et al., (1986); und Garrison WM (1968)]. Der Abfall in der Spaltungsgeschwindigkeit nach 14 h reflektiert wahrscheinlich einfach den Abfall der Verfügbarkeit von ungespaltetem Substrat.
Wirkung der Temperatur
Die Wirkung der Inkubationstemperatur auf die Wirksamkeit der Spaltung durch Cu²⁺ wurde durch den Zeitverlauf der Spaltung bei 59°C, 61°C und 64°C, was den Vergleich zu jener, die bei 62°C beobachtet wird, erlaubt, untersucht. Die Ergebnisse (7) zeigen, dass der Anstieg der Temperatur sowohl die anfängliche Akkumulationsgeschwindigkeit von gespaltenen Spezies als auch die End Gesamt prozentuale Spaltung nach einer 28,5 h Inkubation steigert. Jedoch wurde bei 64°C ein Protein Verlust während der Inkubation beobachtet, was zu einem scharfen Abfall in den gespaltenen Spezies und einem gleichzeitigen Anstieg in Messfehlern und Verlust von LC führte.
Die bestimmte maximale tolerierte Temperatur in einer Cu²⁺ Spaltreaktion wird vom Substrat Protein Typ und der Konzentration und dem [Cu²⁺] Puffer Typ und der Konzentration abhängen. Wir beobachten einen kleinen, aber signifikanten (≈ 25%) "Null 2 FLAG" Mengenverlust bei 62°C in Richtung des Endes der Inkubation, aber nicht nach Inkubation bei 59°C für 28,5 h.
Der Mangel der Interkette Disulfid Bindung in "Null 2 FLAG" kann eine wichtige Rolle in der Temperatursensitivität dieses Proteins während verlängerter Inkubation bei erhöhten Temperaturen spielen. Die LCs und HCs dieses F(ab')₂ können sich wahrscheinlich transient in Lösung trennen, und die Geschwindigkeit dieses Trennens wird mit der Temperatur ansteigen. Das Exponieren von normalerweise verborgenen Oberflächen, insbesondere auf der HC, kann zu Protein:Protein und Protein:Gefäß Aggregationsereignissen führen.
Spezifität der Cu²⁺ katalysierten Protein Spaltung
Um zu untersuchen, ob "Null 2 FLAG" wie erwartet zwischen dem Lys und Thr der eingestellten ^NDKTH^C Sequenz gespalten wurde, wurde eine Probe von "Null 2 FLAG", gespalten mit 2,5 mM Cu²⁺, für 18 Stunden durch Elektrospray Massenspektrometrie analysiert. In Abhängigkeit von dem Ausmaß der Spaltung kann jede di-HC Spezies einen oder beide FLAG Schwänze verlieren, was zu den Spezies S und D, wie in 3 gezeigt, führt (jeweils einzeln und doppelt gespalten). Die Spaltung zwischen Lys und Thr würde zu Spezies mit vorhergesagten Massen von jeweils 51.573,35 und 49.664,62 für die einzeln und doppelt gespaltenen Spezies führen. Wir finden, dass die zwei stärksten Peaks, die sich auf die di-HC beziehen, beobachtete Massen von 51.565,68 ± 10,47 und 49.662,08 ± 11,16 aufweisen, was in Übereinstimmung mit den vorhergesagten Massen für di-HC mit einem oder zwei entfernten FLAG Schwänzen liegt. Darüber hinaus finden wir keinen Beweis der Spezies, die gebildet würden, wenn die di-HC an der "Null 2" Stelle gespalten würden, noch für nicht spezifische Cu²⁺ Spaltungsfragmente.
Um zu bestätigen, dass die "Null 2" Sequenz nicht spaltbar war, untersuchten wir die Wirkung der Inkubation der Peptide "NULL 2" (^N Ac-VEPKTSLQVLT-NH₂ ^C) und "CUT 1" (^N Ac-VEPKTSDKTHT-NH₂ ^C) mit Cu²⁺ in 50 mM Tris pH 9,0 bei 62°C. Das Peptid "NULL 2" wurde nicht durch Cu²⁺ von 0,1 mM bis 2,5 mM (Daten nicht gezeigt) gespalten, wohingegen beobachtet wurde, dass "CUT 1" durch die höhere Konzentration von Cu²⁺ (8) gespalten wurde. Dies ist eine eindeutige Änderung in der Mobilität und Verteilung der zwei Peaks, die das CUT1 Peptid nach der Behandlung mit 2,5 mM Cu²⁺ darstellen, jedoch können wir nicht die ungewöhnliche Doppelwanderung dieses Peptids während der HPLC erklären. In der Massenspektrometrie wurde gefunden, dass reines CUT1 ≥ 95% des Gesamtlängenmaterials (Masse 1282,5) aufweist. Nach Inkubation von CUT1 mit 2,5 mM Cu²⁺ zeigen das Sammeln der Peaks aus der HPLC Reinigung und die Massenspektrometrie die Anwesenheit einer Haupt und einer geringen Spezies mit molekularen Massen von jeweils 944,5 und 1281,8. Das CUT1 Peptid, das zwischen dem Lys und Thr der Spaltstelle (Ac-VEPKTSDK-OH) gespalten ist, weist eine vorhergesagte Masse von 944,48 auf, während das Gesamtlängen und das nicht modifizierte CUT1 Peptid eine vorhergesagte Masse von 1282,5 aufweist, was zeigt, dass die Änderung in den Peaks, die für das Cu²⁺ behandelte Material in 8 gezeigt sind, die korrekte Spaltung des CUT1 Peptids darstellt.
Eine N-terminale Aminosäuren Sequenzierung von HPLC gereinigten Cu²⁺ gespaltenen FLAG Schwänzen wurde durchgeführt, um die Integrität der Aminosäuren an der Spaltstelle sicherzustellen. Fraktionen, die sich auf die vier Peptid Peaks mit verschiedenen Wanderungseigenschaften während der HPLC Reinigung beziehen, wurden gesammelt und sequenziert (9). Es wurde für alle gefunden, dass sie die richtige N-terminale ^NTHTIEG^C Sequenz aufweisen, was die akkurate Spaltung an der vorhergesagten Stelle bestätigt, und dass die THR und His Reste in der Cu²⁺ Stelle nicht zerstört oder während der Reaktion modifiziert wurden. Die zwei häufigsten Fraktionen wurden zu Beginn des Elutionsgradienten gesammelt und ergaben die vollständige Sequenz von ^NTHTIEGSTSDYKDDDDK^C. Der Grund für die Heterogenität der Wanderung des FLAG Schwanz Peptids während der HPLC ist unbekannt.
Wirkung von Spaltbedingtungen auf die Protein Funktion
Die SDS-PAGE und die Massenspektrometrie Analyse zeigten, dass die Spaltbedingungen die Integrität des "Null 2 FLAG" Proteins nicht stark beeinflussten, wie durch die Abwesenheit von neuen Protein Fragmenten bezeugt wurde. Wir nutzen den Vorteil der Antigen Bindungsfähigkeit des Fab 40.4 abgeleiteten "Null 2 FLAG", um zu untersuchen, ob geringfügigere Veränderungen in dem Protein nach der Inkubation der Spaltungsreaktion auftraten. Modifikationen von Resten in den CDRs können zu einem Verlust von Antigen Bindung führen. Von Gly, Pro, Lys und insbesondere His ist bekannt, dass sie Stellen für Protein Schädigung durch divalente Metallionen sind [Dean RT et al., (1989); Easton CJ et al., (1997); Hawkins CL und Davies MJ (1997)]. Die CDRs von "Null 2 FLAG" enthalten insgesamt 5 Gly, 2 Lys und 1 Pro Reste, so dass wir erwarten können, dass irgendwelche nicht spezifische Schädigung an F(ab')₂ messbarer im Verlust von Aktivität aufgrund der Schädigung insbesondere an den CDRs wiedergespiegelt wird. Oberflächen Plasmon Resonanz Affinitätsmessungen (Tabelle 1) zeigen, dass über Nacht Inkubation bei pH 9,0 mit oder ohne 2,5 mM Cu²⁺ nicht signifikant die Affinität von "Null 2 FLAG" F(ab')₂ beeinflusst. Die sehr geringe offensichtliche Verlust an Aktivität wird tatsächlich durch den Inkubationsvorgang und nicht aufgrund der Cu²+ selbst bewirkt. Dies kann die Fähigkeit der LC und HC des F(ab')₂ sich aufgrund der Abwesenheit der Interkette Disulfid Brücke zu trennen, darstellen.
Tabelle 1
Zusätzlich führten wir eine Analyse der Gesamt Aminosäure Zusammensetzung von "Null 2 FLAG" F(ab')₂ durch, die für 16 h bei 62°C in 50 mM Tris pH 9,0 mit oder ohne 2,5 mM Cu²⁺ inkubiert worden waren. Es gab keine neuen Peaks in der mit Cu²⁺ behandelten Probe, die ein Beweis für modifizierte Aminosäuren sein könnten, und es gab keinen signifikanten Unterschied in der Aminosäure Zusammensetzung zwischen den zwei Proben als Beweis der Degeneration von bestimmten Aminosäuren.
Diskussion
Die Ergebnisse zeigen den Beweis für die Verwendung der Tetrapeptid Sequenz ^NDKTH^C als eine Stelle für spezifische Spaltung von Fusionsproteinen durch Kupferionen. In dem Modell Protein wurde ein C-terminales FLAG Peptid exakt zwischen dem Lys und Thr der Zielsequenz abgespalten, wie durch Massenspektrometrie des verbleibenden N-terminalen F(ab')₂ Teils und der N-terminalen Sequenzierung des freigesetzten C-terminalen FLAG Peptids gezeigt wurde.
Die Spaltung ist wirksam, sie erreicht Mengen von 71%, 81% und 86% nach 28,5 h Inkubationen bei pH 9,0 und jeweils 59°C, 61°C und 62°C. Die Spaltstelle muss nicht dimer sein, um gespalten zu werden, weil wir eine signifikante Anhäufung von F(ab')₂ Spezies beobachten, an denen einer oder beide FLAG Schwänze entfernt wurden. Wir finden keinen Beweis für große schädliche Wirkungen auf die Struktur oder Aktivität des F(ab')₂, das in diesem System verwendet wurde, selbst nach Inkubation mit 2,5 mM Cu²+ für 16 h bei 62°C, pH 9,0. Es ist klar, dass die hohe Inkubationstemperatur das kritischste Element in der Bestimmung der Qualität des Proteins nach der Spaltbehandlung ist. Bei diesem bestimmten Protein ändert die 5°C Differenz zwischen 59°C und 64°C die Inkubation von einer, die eine Ausbeute von 71% Spaltung und nicht messbarem Protein Verlust, liefert, zu einer mit ≥ 70% Protein Verlust nach einer 28,5 h Inkubation. Jedoch muss die maximal tolerierte Temperatur für andere Proteine empirisch bestimmt werden.
Die Wirksamkeit von Spaltreaktionen ist hoch, selbst ohne Endoptimierung des Spaltvorgangs für "Null 2 FLAG" F(ab')₂. Durch das einfache Anheben der [Cu²⁺] von 2,5 mM auf ≤ 5 mM und dem pH auf 9,5, konnten wir das Ausmaß der Spaltung zu irgendeinem gegebenen Zeitpunkt anheben.
Die "Null" Stelle von "Null 2 FLAG" enthält Veränderungen an allen vier Resten (^NDKTH^C → ^NLQVL^C). Um das Risiko der Immunogenität gegen Fab' Material, das durch diese Technik gespalten wurde, zu minimieren, wird die Herstellung einer minimalen Zahl von Änderungen in der nativen ^NDKTH^C Stelle benötigt, während sie nicht spaltbar durch Cu²⁺ bleibt. Dieselben vier Reste (D, K, T und H) sind in die Metall Bindungsstelle von Serumalbuminen involviert, und so sind sie eindeutig in der Lage, divalente Kationen zu chelatieren [Sadler PJ et al., (1994)]. Jedoch ist in der Bildung einer "Null" Stelle die relative Wirkung jedes Rests auf die Fähigkeit der Stelle, gespalten zu werden, relevanter als dass das einfache Chelatieren von Cu²⁺ kritisch ist. Die pH Abhängigkeit der Spaltreaktion und der Peptid Varianten implizieren die Wichtigkeit des His Restes in der Spaltreaktion [Allen Gand Campbell RO, (1996)]. Es ist möglich, dass eine einzelne Mutation dieses Rests, oder kombiniert mit der Mutation des Thr Rests zu einem kleinen oder hydrophoben Rest dazu führt, dass es durch Cu²⁺ nicht mehr spaltbar ist.
Es wurde kein Beweis für die Spaltung von "Null 2 FLAG" F(ab')₂ an anderen Stellen als jener der ^NDKTH^C Sequenz gefunden. Dies stimmt mit der Abwesenheit dieses Tetrapeptids aus der 1° Struktur von "Fab 40.4" überein. Tatsächlich finden wir, dass die ^NDKTH^C Sequenz relativ selten ist. Nur 167 Übereinstimmungen wurden gegenüber 256.226 Einträgen gefunden, die in der NCBI Protein Datenbank recherchiert wurden. Um durch Cu²⁺ gespalten zu werden, muss diese Sequenz exponiert sein, und sie benötigt wahrscheinlich auch eine flexible/ungeordnete Struktur. Diese Kombination der Seltenheit von sowohl 1° und 3° Struktur der Cu²⁺ Spaltstelle macht das Ziel spezifisch genug, um eine allgemeine Protein Spaltstelle zu sein. Das Protein behält nur zwei Aminosäuren der Stelle nach der Spaltung, und so ist es für sie unwahrscheinlich, dass sie seine Struktur oder Funktion beeinflussen. Wenn die Spaltstelle eingeführt werden kann, wo ein Lys oder His bereits existiert, dann wird die Zahl der außerhalb liegenden Reste auf Eins reduziert. Dies kann von größerer Wichtigkeit sein, wo potenzielle Immunogenität ein Thema ist.
Der enorme Vorteil der Verwendung von ^NDKTH^C/Cu²⁺ liegt in den Kosten und der Einfachheit. Viele Proteasen können nicht für den großen oder industriellen Maßstab aufgrund der involvierten Kosten und des Problems der Sicherstellung der vollständigen Entfernung der kontaminierenden Protease nach der Spaltung verwendet werden. Wenn man gleiche Spaltungswirksamkeiten annimmt, ist die Spaltung von Protein mit CuCl₂ ungefähr 1,2 × 10⁵ fach billiger als jene unter Verwendung von Faktor Xa Protease. Darüber hinaus ist das CuCl₂ weder vom Tier abgeleitet noch unter Verwendung von tierischen Produkten hergestellt, was das Risiko von viraler/Prion Kontamination entfernt, und es kann einfach aus der Protein Probe durch die Zugabe von EDTA, gefolgt von Dialyse, entfernt werden. Gespaltenes Material sollte sich im Durchfluss nach der erneuten Beladung auf eine Affinitätssäule befinden, was ein einfaches Verfahren zum Trennen von gespaltenem und ungespaltenem Material ergibt, wenn der Fusionspartner ein Affinitätsschwanz ist.
REFERENZEN

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Claims

DNS, die ein Fusionsprotein kodiert, umfassend zwei Polypeptide, welche über eine Spaltstelle verbunden sind, welche die Polypeptide nicht natürlich verbindet und welche durch Kupfer(II)-Ionen spezifisch spaltbar ist, wobei die Spaltstelle das Tetrapeptid ^NDKTH^C, ^NDRSH^C, ^NEKSH^C oder ^NDKSH^C ist.
Vektor, umfassend die DNS nach Anspruch 1.
Wirtszelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 2 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins in nativer Form, umfassend: 1) das Exprimieren des gewünschten Proteins als ein Fusionsprotein in einer Wirtszelle nach Anspruch 3, in der das gewünschte Protein als zwei Polypeptide, verbunden über eine Stelle, welche durch Kupfer(II)-Ionen spezifisch spaltbar ist, exprimiert wird, 2) das Spalten des Fusionsproteins mit Kupfer(II)-Ionen und 3) das Rückgewinnen des gewünschten, gespaltenen Proteins in nativer Form.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das gewünschte Protein ein Antikörper oder ein Fragment davon ist.