DE3841943C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen 1 bis 24 angegebenen Fusionsproteinvektoren, ihre
Verwendung zur Expression, Sequenzierung und ortsspe
zifischen Mutagenese fremder Gene nach Anspruch 28 sowie
ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen oder proteinhaltigen Genprodukten
durch Expression eines Expressionsvektors nach den Ansprüchen 25 bis 27.
Zwei der großen Ziele der biologischen und medizinischen
Forschung sind heutzutage a) eine starke Expression
eukaryotischer, medizinisch oder biotechnologisch
relevanter Proteine in bakteriellen Organismen wie
Escherichia coli mit anschließender einfacher und
schneller Aufreinigung der Genprodukte sowie b) der
schnelle Authentizitätsnachweis positiver Klone aus
c-DNA Banken über die Sequenzierung und Expression
enzymatisch aktiver Genprodukte der klonierten DNA.
Als Grundlage für die Erstellung von Expressions
systemen dienen Viren oder Plasmide. Zwei Arten der
Expression werden dabei unterschieden: die direkte
Expression ins Cytoplasma und die Expression als
Fusionsprotein (Balbas, P. et al. [1986], Gene 50,
3-40). Bei der direkten Expression werden Plasmide mit
starken Promotoren und Terminatoren verwendet, die eine
hohe Transkriptionsrate erlauben (Amman, A. und Brosius,
J. [1985], Gene 40, 183-190).
Zur Bildung von Fusionsproteinen wird die fremde DNA so
in ein bakterielles Gen einkloniert, daß sich das
fremde Gen im Leseraster des bakteriellen Proteins
befindet. Statt des reinen prokaryontischen Genprodukts
entsteht dann ein Hybrid aus dem bakteriellen Protein
und dem Fremdprotein. Fusionsproteingene nutzen den
optimierten Transkriptions- und Translations-Apparat
der Bakterien, der eine effektive Proteinbiosynthese
ausgehend vom bakteriellen Anteil erlaubt. Reine eu
karyotische Gene sind in vielen Fällen unter anderem
wegen der Verwendung anderer Codons nur
schwer direkt in Bakterien zu exprimieren (Marston),
A. O. [1986], Biochem. J. 240, 1-12).
Die Bildung eines Hybridproteins kann weiterhin die
schnelle Aufreinigung ermöglichen, entweder über die
enzymatische Aktivität des bakteriellen Anteils
(Silhavy, J., Berman, L. and Englist, L. W. [1984], in
"Experiments with gen fusions", pp 186-187, Cold Spring
Harbor Labaratory) oder durch Affinitätschromatographie
wie z. B. von β-Galaktosidase an APTG-Säulen (Germino,
J. and Bastia, D. [1984], Proc. Natl. Sci. USA 81,
4692-4696), von Protein A an IgG-Säulen (Uhlen, M. et al.
[1983], Gene 23, 369-378) oder von Glutathion-S-
transferase an Glutathion-Säulen (Smith, D. B. and
Johnson, K. S. [1988], Gene 67, 31-40).
Diese Möglichkeit, das exprimierte Fremdprotein als
Fusionsprotein schnell und quantitativ aufreinigen zu
können, ist ein wichtiger Weg zur schnellen Isolierung
von Fremdproteinen mit authentischer Aminosäuresequenz.
Der letzte entscheidende Schritt ist die Abtrennung des
Fremdproteinanteils aus dem Fusionsprotein. Dies kann
entweder chemisch über eine Bromcyan-Spaltung erfolgen
(Nishikawa, S. et al. [1986], Biochem. Biophys. Res.
Comm. 138, 789-794) oder enzymatisch mittels Proteolyse.
Verschiedene Proteasen, deren Erkennungssequenz nur
extrem selten in anderen Proteinen als dem eigentlichen
Substrat vorkommen, sind hierzu geeignet. Ein Beispiel
für diese hochspezifischen Proteasen ist Collagenase,
die ihr Substrat Collagen in der Sequenz
am N-terminalen Ende von Gly spaltet. Polypeptide
authentischer Sequenz sind allerdings erst nach weiterer
Verdauung der Glycin- und Prolinreste durch Amino
peptidase zu gewinnen (Daum, J. et al. [1980], Euro
päische Patentanmeldung EP 00 20 290).
Ein weiteres Beispiel ist der Blutgerinnungsfaktor Xa,
der die Sequenz am
C-Terminus von Arginin spaltet und somit fusionierte
Fremdproteine direkt freisetzen kann (Nagai, K. and
Thorgersen, H. C. [1984], Britische Patentanmeldung
GB 84 12 517).
Eine der Schwierigkeiten mit beiden Erkennungsregionen
ist, daß sie nach der Spaltung des direkt fusionierten
Fremdproteins oft nicht für die Protease zugänglich
sind, eine spezifische Proteolyse also unterbleibt.
Weiterhin kann es im Verlauf der Proteinbiosynthese zu
einer falschen Faltung des Hybridproteins kommen, wo
durch dieses in der Zelle präzipitiert und nur mit sehr
aufwendigen Methoden wieder renaturiert werden kann.
Auch die denaturierten Fusionsproteine werden von den
Proteasen nicht immer geschnitten.
Im Fusionsproteinplasmid pSS20 (Scholtissek, S. and F.
Grosse [1988], Gene 62, 55) wurde daher als "Abstands
halter" zwischen dem bakteriellen lacZ-Gen und dem
Fremdprotein-Gen ein 180 Basenpaare langes Collagen-Gen
fragment eingeführt, was zu einer Expression von löslichen
Fusionsproteinen führte, die bei einer direkten Fusion
präzipitierten und nicht durch Collagenase zu spalten
waren. Allerdings lagen die spezifischen Collagenase-
Erkennungssequenzen mitten in diesem Genfragment, so daß
nach Affinitätsaufreinigung und Proteolyse ein 40
Aminosäuren langer Rest am N-Terminus des fremden
Proteins verblieb.
Ein weiterer Typ von Fusionsproteinen besitzt vor dem
Fremdgen eine Signalsequenz, die eine Sekretion des Fremdproteins
in den periplasmatischen Raum oder ins Medium erlaubt (Hahn,
U. et al. [1988], Eur. J. Biochem.). Bisher gibt es aber nur
wenige erfolgreiche Beispiele einer solchen Sekretion, da es
nicht nur auf das Signalpeptid bei der Prozessierung ankommt.
In den meisten Fällen verbleibt das Fusionsprotein mit cytoplasmatischem
Fremdprotein in der Zelle, oder es bleibt in der inneren
Membran stecken.
In bezug auf eine schnelle eindeutige Identifizierung
von c-DNA Klonen fehlt den angesprochenen Fusionsprotein-Plasmiden
aber ein weiteres wichtiges Element: die Möglichkeit schnell
einzelsträngige DNA des Fremdgens zur Sequenzierung und ortsspezifischen
Mutagenase herzustellen. Außerdem sind in den
meisten bisher beschriebenen Fusionsprotein-Plasmiden die
"multi-cloning sites" nicht in allen drei möglichen Leserastern
vorhanden und die Auswahl der Restriktionsschnittstellen
nicht optimal für eine direkte Klonierung von c-DNA
Banken in diese Plasmide.
Aus Molecular Biologicals, Pharmacia (1986), S. 67 und S. 69
sind multifunktionelle Vektoren bekannt, welche den Replikationsorigin
des Phagen f1 als Replifikationsorigin für eine
Einzelstrang DNA-Synthese enthalten. Auf diese Weise ist
Klonierung und in vitro Mutagenese in einem einzigen Vektorsystem
möglich.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein
Vektorsystem zu konstruieren, das die genannten Nachteile bisheriger
Systeme vermeidet. Es soll sowohl das Problem des Authentizitätsnachweises
klonierter Gene oder Genfragmente einer c-DNA
Bank prinzipell lösen, als auch die starke Expression mit
anschließender schneller Aufreinigung des Genproduktes, die
schnelle Sequenzierung und ortsspezifische Mutagenese bekannter
fremder Gene ermöglichen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Konstruktion
eines Fusionsproteinvektors gelöst, der auf einem Vek
toranteil in Transkriptionsrichtung
- a) einen Promotor und gegebenenfalls einen Operator,
- b) ein Gen für ein bakterielles Protein, das über seine enzymatische Aktivität oder durch Affinitäts chromatographie aus einer Mischung von Proteinen abgetrennt werden kann,
- c) eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid mit β-Faltblattstruktur kodiert,
- d) eine spezifische Protease-Erkennungssequenz,
- e) eine "multi-cloning"-Stelle zum Einligieren eines Fremdgens und
- f) den Replikationsursprung eines einzelsträngigen DNA-Phagen enthält.
Erfindungsgemäß wird, ausgehend von dem Promotor/Ope
rator die starke Expression eines Triproteins erlaubt,
das aus dem Produkt des Gens (b), der DNA-Sequenz (c)
und einem Fremdprotein, das in die "multi-cloning"-
Stelle einligiert wird, besteht. Das Triprotein kann in
einem Schritt über Affinitätschromatographie oder, wie
bereits oben beschrieben, über die enzymatische Aktivi
tät des bakteriellen Proteins (Silhavy et al., supra)
aufgereinigt werden und anschließend durch eine proteo
lytische Spaltung das Fremdgenprodukt freigesetzt wer
den. Der Replikationsursprung eines einzelsträngigen
DNA-Phagen ermöglicht eine schnelle Herstellung von
Einzelstrang-DNA zur Sequenzierung und ortsspezifischen
Mutagenese der Fremd-DNA.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ent
hält die "multi-cloning"-Stelle Restriktionsschnitt
stellen zur Klonierung von Fremdgenen in allen drei
Leserastern. Weiter ist es zur Expression von Fremdgenen
bevorzugt, daß der Fusionsproteinvektor Stopcodons für das
Fremdgen in allen drei Leserastern enthält. Die starke Expression
fremder DNA wird zusätzlich durch eine Terminatorsequenz
unterstützt, wobei als Terminatorsequenz die Lambda-t₀-Sequenz
besonders bevorzugt ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung
enthält der Fusionsproteinvektor den Replikationsursprung des
Phagen f1.
Als Vektoranteil kann der erfindungsgemäße Fusionspro
teinvektor alle für die Herstellung von Expressionssystemen geeigneten
DNA-Anteile enthalten. Hierbei wird je nach gewünschter
Wirtszelle zur Expression ein Plasmid, Cosmid, eukaryontischer
Vektor, Hefeplasmid, Shuttle-Vektor oder ein Teil eines
solchen bevorzugt. Da eukaryontische Proteine in Prokaryonten
nicht posttranslational modifiziert werden können, ist es also
nicht möglich, Proteine, die für ihre katalytische Ak
tivität phosphoryliert oder glykosyliert werden müssen,
in E. coli in aktiver Form zu exprimieren. Vorzugsweise werden
daher eukaryontische Proteine, welche eine solche posttranskriptionale
Modifikation benötigen, unter der Kontrolle eines
starken Promotors in niedrigen Eukaryonten wie z. B. Hefe
(Saccharomyces cerivisiae), oder unter der Kontrolle eines
für Säugerzellen spezifischen Promotors, wie z. B. dem Ratten-
Preproinsulin-Genpromotor oder dem SV40 frühen Promotor in
Säugetierzellen, wie z. B. COS7-Affen-Nieren-Zellen, expri
miert.
Weiter erlauben die erfindungsgemäßen Fusionsprotein
vektoren jedoch auch das schnelle Umklonieren der Teile
gemäß Merkmal (a) bis (f) und gegebenenfalls der Stop
codons und Terminatorsequenzen in einen Shuttle-Vektor,
um die Expression in niedrigen oder höheren eukaryon
tischen Zellen zu gewährleisten.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der
Erfindung ist das Gen gemäß Merkmal (b) des Hauptan
spruches das lacZ-Gen, das Glutathiontransferasegen,
das Gen für Protein A oder ein Teil eines dieser Gene
oder eines Gens für ein Protein mit enzymatischer
Aktivität, der jedoch die Bindungsspezifität des Gesamt
gens bei der Affinitätschromatographie bzw. die enzyma
tische Aktivität beibehält.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, daß das Gen (b) unter
der Kontrolle seines homologen Promotors und gegebenen
falls Operators gemäß Merkmal (a) steht. Hierbei ist es
erfindungsgemäß besonders bevorzugt, daß der Fusions
proteinvektor das lacZ-Gen unter der Kontrolle des lac-
Promotors/Operators enthält. Weiter ist es erfindungs
gemäß besonders bevorzugt, daß die DNA-Sequenz gemäß
Merkmal (c) des Patenthauptanspruches ein Teil des
Collagenasegens ist. Hierbei ist es möglich, die
Protease-Erkennungssequenz gemäß Merkmal (d) des
Patenthauptanspruches mit der DNA-Sequenz gemäß Merkmal
(c) zusammenzufassen, da das Collagenasegen mehrere
Erkennungssequenzen für Collagenase aufweist. Diese
Collagenase-Erkennungssequenz muß sich jedoch in der DNA-
Sequenz gemäß Merkmal (c)
direkt am Ende der Collagen-DNA-Sequenz
befinden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Er
findung erlaubt daher ein erfindungsgemäßer Fusions
proteinvektor, ausgehend vom lac-Promotor/Operator die
induzierbare starke Expression eines Triproteins, das
aus β-Galactosidase, einer β-Faltblattstruktur, wie
z. B. Collagen, als "Abstandhalter", einer spezifischen
Protease-Erkennungssequenz und dem Fremdprotein
besteht. Das Tri-Protein kann in einem Schritt über
Affinitätschromatographie an APTG-Sepharose aufgerei
nigt werden und anschließend durch eine proteolytische
Spaltung mit Collagenase oder Faktor Xa freigesetzt
werden. Der erfindungsgemäß bevorzugte Replikationsur
sprung des Einzelstrang-DNA-Phagen f1 ermöglicht eine
schnelle Herstellung von Einzelstrang-DNA zur Sequen
zierung und ortsspezifischen Mutagenese der Fremd-DNA.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Fusionsprotein-
Vektoren sind die Vektoren pAX4a+, DSM 5059, pAX4a-,
DSM 5060, pAX4b+, DSM 5061, pAX4b-, DSM 5062, pAX4c+,
DSM 5063, pAX4c-, DSM 5064.
Die Konstruktion dieser neuen erfindungsgemäßen Fusions
proteinvektoren wurde ausgehend von Plasmid pSS20
(siehe Fig. 1) wie folgt durchgeführt:
Das Plasmid besitzt als erstes wichtiges Element ein
vollständiges lacZ-Gen (β-Galaktosidase) mit lac Promotor/-
Operator Region. Direkt von dem 3′-Ende des lacZ-Gens
ist als zweites Element ein 180 Basenpaare langes
Collagen-Genfragment im Leseraster fusioniert, das drei
Erkennungsregionen für die Collagenase besitzt. An
schließend folgt in allen drei Leserastern eine "multi
cloning site".
Im ersten Schritt der Konstruktion der pAX4-Vektoren
wurde über die Ligation des Oligodesoxynukleotides von
Fig. 2 die Erkennungssequenz für den Blutgerinnungsfaktor
Xa am 3′-Ende des Collagen-Genfragmentes von
pSS20 über die PstI-Schnittstelle eingeführt.
Der neue Vektor mit der Faktor Xa-Erkennungssequenz
wurde pAX1 genannt und ist in Fig. 3 dargestellt. Er
besitzt zusätzlich zur "multi-cloning site" von pSS20
noch die Restriktionsschnittstellen NruI und SAlI.
Im nächsten Schritt wurde zunächst aus dem Plasmid pSS9
(Scholtissek, S. and F. Grosse [1985], Nucleic Acids
Res. 15, 3185) der t₀-Terminator des Bacteriophagen
Lambda als 84 bp NruI/HindIII Fragment (Fig. 4 und
Fig. 5I) isoliert.
Dieses Fragment wurde mit zwei synthetischen komplementären
Oligonukleotiden zur Einführung von Stop-Codons in alle
drei Leseraster (Fig. 5 II) ligiert und in die PstI/HindIII-
Schnittstellen von pAXl (Fig. 5 III)
kloniert.
Der entstandene Vektor pAX2 besitzt nun die Elemente:
Xa-Erkennungsstelle, direkt anschließend singuläre
Restriktionsschnittstellen für NruI, SalI, PstI und
SmaI, Stop-Condons in drei Leserastern und den t₀-Ter
minator und ist in Fig. 6 dargestellt.
Zur Herstellung von Einzelstrang-DNA der klonierten
fremden Gene wurde der Replikationsursprung des Bakterio
phagen f1 aus dem Vektor pEMBL8+ (Dente, L. et al.
[1983], Nucleic Acids Res. 11, 1645-1655) als 514
Basenpaare langes RsaI-Fragment isoliert. Der Vektor
pAX2 wurde mit DraII geschnitten, die überstehenden
Enden aufgefüllt und das RsaI-Fragment über eine "blunt
end"-Ligation in pAX2 eingeführt. Da sich bei dieser
Ligation zwei Orientierungen für den Replikationsursprung
ergeben, wurde die Orientierung der jeweiligen Klone
über spezifische Restriktionsverdauungen identifiziert.
Die neuen Fusionsprotein-Plasmide wurden entsprechend
pAX3+ (siehe Fig. 7) und pAX3- genannt und sind ebenfalls
bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung.
Zur Eliminierung der beiden EcoRI-Schnittstellen in den
Vektoren pAX3+/- wurde folgende Strategie angewandt:
Die EcoRI-Stelle am Ende des lacZ-Gens (Position 5761)
wurde durch ortsspezifische Mutagenese mittels zweier
"Mismatch Primer" nach der Methode von Taylor und
Eckstein ([1985] Nucleic Acids Res. 13, 8765-8785)
durchgeführt. Die EcoRI-Schnittstelle im pBR322 Anteil
(Position 6173) wurde nach Linearisierung durch EcoRI
aufgefüllt und wieder ligiert. Fig. 8 verdeutlicht
diese Verfahrensschritte. Die so erzeugten Vektoren
wurden pAX4+/- genannt (Fig. 9).
Zur einfachen Klonierung fremder DNA wurde schließlich
eine neue "multi-cloning-Position" mit Schnittstellen
in allen drei Leserastern einkloniert, wie in Fig. 10
gezeigt. Die jeweiligen Linker wurden durch automatische
Oligonukleotid-Synthese dargestellt. Fig. 11
zeigt beispielsweise das so erhaltene Plasmid-pAX4a+.
Insgesamt sind somit sechs verschiedene besonders
bevorzugte Fusionsprotein-Plasmide konstruiert worden:
pAX4a+, pAX4a-, pAX4b+, pAX4b-, pAX4c+, pAX4c-.
Diese sechs Plasmide sind am 06.12.1988 unter den
Nummern 5059, 5060, 5061, 5062, 5064 und 5064 bei der
DSM hinterlegt worden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren
zur Herstellung von Proteinen oder proteinhaltigen
Genprodukten durch Expression eines Expressionsvektors,
der ein für das gewünschte Produkt kodierendes Gen
enthält, in geeigneten Wirtszellen und Isolierung des
Produkts aus den Zellen oder dem Kulturmedium, das
dadurch gekennzeichnet ist, daß man in die "multi-clo
ning"-Stelle eines Vektors nach einem der Ansprüche 1
bis 24 das Gen für das gewünschte Produkt insertiert,
den entstehenden Expressionsvektor exprimiert, das
gebildete Fusionsprotein aus aufgeschlossenen Zellen
oder dem Kulturmedium über seine enzymatische Aktivität
oder über Affinitätschromatographie isoliert und durch
Verdauung mit der der Proteaseerkennungssequenz entspre
chenden Protease das gewünschte Produkt aus dem Fusions
protein abtrennt und gewinnt.
Zur Expression eines eukaryontischen Proteins in einer
prokaryontischen Wirtszelle wird die cDNA des Gens in
sertiert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung verwendet man einen Fusionsproteinvektor,
der als Merkmal (b) das lacZ-Gen enthält und führt die
Isolierung des Fusionsproteins an APTG-Affinitätschro
matographiesäulen durch. Ebenfalls erfindungsgemäß mög
lich und bevorzugt sind die Verwendung des Gens für
Protein A und die Isolierung über IgG-Säulen oder von
Glutathion S-Transferase und die Isolierung an Gluta
thionsäulen.
Mit den erfindungsgemäßen Vektoren konnten sowohl
prokaryotische Gene, wie z. B. Histidyl-tRNA-Synthetase
aus E. coli (Freedman, R. et al. [1985], J. Biol. Chem.
260, 10063), als auch eukaryotische Gene, wie z. B.
Isoleucyl-tRNA-Synthetase aus Saccharomyces cerevisiae
(Englisch, U. [1987], Biol. Chem. Hoppe-Seyler 368,
971-979) erfolgreich als Fusionsprotein in Escherichia
coli exprimiert werden. Nach der Aufreinigung durch
Affinitätschromatographie an APTG-Sepharose konnten die
Fremdproteine selektiv durch Spaltung mit der Protease
Faktor Xa freigesetzt werden.
Sowohl die Fusionsproteine als auch die durch Spaltung
freigesetzten Synthetasen zeigen eine den nativen
Enzymen vergleichbare Aktivität.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung
eines Fusionsproteinvektors gemäß einem der Ansprüche 1
bis 24 zur Herstellung von Einzelstrang-DNA der Fremd-DNA
zur Sequenzierung oder zur ortsspezifischen Mutagenese
der Fremd-DNA.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Eine wäßrige Lösung der betreffenden DNA wurde
unter den nachfolgenden Reaktionsbedingungen und
Zusatz der betreffenden Restriktionsendonukleasen
bei 37°C inkubiert.
Restriktionsendonuklease | |
Reaktionsbedingungen | |
DraII, RsaI | |
50 mM Tris/Hcl pH 8,0 | |
10 mM MgCl₂ | |
NaeI | 50 mM Tris/HCl pH 8,0 |
10 mM MgCl₂ | |
20 mM NaCl | |
HindIII, PstI | 50 mM Tris/HCl pH 8,0 |
10 mM MgCl₂ | |
50 mM NaCl | |
NruI | 50 mM Tris/HCl pH 8,0 |
10 mM MgCl₂ | |
50 mM NaCl | |
50 mM KCl |
Nach erfolgter Inkubation wurden entstandene
DNA-Fragmente gelelektrophoretisch getrennt und
das betreffende Fragment isoliert. Die Isolierung
der DNA-Fragmente aus Agarosegelen erfolgte durch
Adsorption an Glasmilch (Vogelstein, B. and D.
Gillespie [1979], Proc. Natl. Acad. Sci, USA 76,
615), aus Acrylamidgelen durch Diffusion (Maxam,
A. M. and Gilbert, W. [1977], Proc. Natl, Acad.
Sci. USA 74, 560-564).
Alternativ wurde die DNA-Lösung mit 1/10 Vol. 3M
NaoAC-Lösung pH 4,8 und 2 Vol Ethanol versetzt und
20 min bei -78°C oder 12 h bei -20°C gefällt. Nach
Zentrifugation (15 min, 5000 g) und Trocknen des
Pellets im Vakuum (bis 0.1 hPA) wurde der
Rückstand im angegebenen Volumen Wasser gelöst.
Hybridisierung: Verwendete Oligonukleotide wurden
in wäß. Lösung in den unten angegebenen Konzen
trationen 5 min auf 95°C erhitzt, 30 min bei 37°C
und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Die zu ligierenden Fragmente wurden in der ange
gebenen Konzentration 6-16 h bei 25°C in 50 mM
Tris/HCl pH 7,6, 10 mM MgCl₂, 5% (w/v) PEG 6000,
1 mM ATP und 1 mM DTT unter Zusatz von T4-DNA-
Ligase inkubiert. Anschließend wurden kompetente
Zellen (Hanahan, J. [1983], J. Mol. Biol. 166,
557-580), TG1 oder MJ109, mit unten angegebenen
Volumina des Ligationsansatzes transformiert, die
entstandenen Transformanden auf LBamp (50 µg
Ampicillin/ml) selektiert und die nach Birnboim
und Doly ([1979], Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523)
isolierte DNA mittels Restriktionsanalyse charakterisiert.
Die Oligodesoxynucleotidsynthese erfolgte nach der
Festphasen-Phosphoamiditmethode (Beaucage, S. L.
and Caruthers, M. H. [1981], Tetrahedron Lett. 22,
1859) mit einem DNA Synthesizer.
3.1. Synthetisierte Oligodesoxynukleotide | |
Faktor Xa-Linker I | |
5′-ATCGAGGGTAGGGTCGCGATGTCGACTGCA-3′ | |
Faktor Xa-Linker II | 5′-GTCGACATCGCGACCCTACCCTCGATTGCA-3′ |
Stop-Oligo I | 5′-GCCCGGGGTGATTGATTGA-3′ |
Stop-Oligo II | 5′-TCAATCAATCACCCGGGCTGCA-3′ |
EcoRI-mismatch/pAX3+ | 5′-CTCAGCTGGAATACCGCCGATA-3′ |
EcoRI-mismatch/pAX3- | 5′-TATCGGCGGTATTCCAGCTGAG-3′ |
Linker I pAX4a+/- | 5′-CGACCATGGAATTCGGTACCAGATCTAGAGTCGACTGCA-3′ |
Linker II pAX4a+/- | 5′-GTCGACTCTAGATCTGGTACCGAATTCCATGGTCG-3′ |
Linker I pAX4b+/- | 5′-GACCATGGAATTCGGTACCAGATCTAGAGTCGACTGCA-3′ |
Linker II pAX4b+/- | 5′-GTCGACTCTAGATCTGGTACCGAATTCCATGGTC-3′ |
Linker I pAX4c+/- | 5′-ACCATGGAATTCGGTACCAGATCTAGAGTCGACTGCA-3′ |
Linker II pAX4c+/- | 5′-GTCGACTCTAGATCTGGTACCGAATTCCATGGT-3′ |
70 µg pSS20xc wurden nach Zusatz von 30 U PstI
in einem Gesamtvolumen von 50 µl nach 1.1 linea
risiert. Die mit Ethanol gefällte DNA wurde in
50 µl Wasser gelöst.
Je 160 pmol Xa-Linker I und II wurden mit 2 µl
des linearisierten pSS20xc aus 1.1.1. in 21 µl
Wasser hybridisiert und anschließend in einem
Gesamtvolumen von 30 µl unter Zusatz von 2 U
T4-DNA-Ligase 6 h ligiert. Zur Transformation
(TG1-Zellen) wurden 3 µl des Ligationsansatzes
verwendet. Der korrekte Einbau des Linkers wur
de durch Maxam-Gilbert-Sequenzierung (Köchel,
H. G. [1982], Dissertation, Braunschweig) und Re
striktionsanalyse bestätigt.
10 µg pAX1 wurden in einem Gesamtvolumen von
50 µl mit je 20 U PstI und HindIII inkubiert.
Das geschnittene Plasmid wurde über ein 1%iges
Agarosegel abgetrennt, nach 1.1. isoliert und in
50 µl Wasser aufgenommen.
30 µg pSS9 wurden in einem Endvolumen von 100 µl
zunächst mit 30 U HindIII linearisiert und nach
Umpuffern mit 30 U NruI nachgeschnitten. Das
freigesetzte 84 bp-t₀-Terminator-Fragment wurde
über ein 8%iges Acrylamidgel abgetrennt, nach
1.1 isoliert und in 50 µl Wasser aufgenommen.
500 ng des geschnittenen pAX1 aus 2.2.1., 50 ng
des t₀-Fragments aus 2.2.2. wurden mit je 100 pmol
der Stop-Oligos I und II in einem Volumen
von 21 µl hybridisiert und nach Zugabe von 2 U
T4-DNA-Ligase 8 h ligiert. Zur Transformation
(TG1-Zellen) wurden 10 µl des Ligationsansatzes
eingesetzt.
Der korrekte Einbau des Linkers und des Termi
nators wurde durch Maxam-Gilbert-Sequenzierung
bestätigt.
10 µg pAX2 wurden in einem Reaktionsvolumen von
50 µl mit 20 U DraII linearisiert. Nach voll
ständiger Verdauung wurde die DNA gefällt und
überstehende Enden nach Maniatis ("Molecular
Cloning - A laboratory manual", Cold Spring
Harbor, New York [1982]) in einem 100-µl-Ansatz
mit 5 U Klenow-Polymerase aufgefüllt und nach
erneuter Fällung in einem 50-µl-Ansatz mit 2 U
alkalischer Phosphatase (Maniatis, T. s. o.) de
phosphoryliert und wiederum gefällt. Das Pellet
wurde in 50 µl Wasser aufgenommen.
30 µg pEMBL8+ wurden in einem Gesamtvolumen von
100 µl mit 30 U RsaI geschnitten. Die Fragmente
wurden auf einer 2%igen HEC (Hydroxyethyl
cellulose)-Agarose getrennt, das 514-bp-f1-ori-
Fragment nach 1.1 isoliert und in 50 µl Wasser
aufgenommen.
500 ng des linearisierten pAX2 aus 2.3.1. wurden
mit 100 ng des 514-bp-Fragmentes aus 2.3.2 in
einem Volumen von 21 µl hybridisiert und nach
Zugabe von 2 U T4-DNA-Ligase in einem 30-µl-An
satz 6 h ligiert. Zur Transformation (TG1-Zellen)
wurden 10 µl des Ligationsansatzes eingesetzt.
Die Orientierung des f1-oris in den positiven
Klonen konnte durch Doppelverdauung mit NaeI und
HindIII bestimmt werden.
10 ml einer Zellsuspension (TG1-pAX3+ bzw.
Tg1/pAX3-) in LBamp wurden bei einer Zelldichte
von 0,8 OD600 nm mit 10 µl einer Phagensuspen
sion M13KO7
infiziert, 1 h bei 37°C inkubiert, anschließend
mit 40 ml LB-Medium + 50 µg Ampicillin/ml und
70 µg Kanamycin/ml versetzt und weitere 5 h bei
37°C inkubiert. Die Aufarbeitung der Einzel
strang-DNA erfolgt nach einer Vorschrift von
Eckstein (Nakamaye, K. L. and Eckstein, F. [1986]
Nucleic Acids Res. 14, 9679-9698). Die Einzel
strang-DNA wurde in 100 µl Wasser gelöst (Aus
beute ca. 100-200 µg/50 ml Ansatz).
Für die "Annealing"-Reaktion wurden 10 µg ein
zelsträngige DNA des Plasmides pAX3+ bzw. pAX3-
mit 8 pmol der EcoRI-mismatch-Oligodesoxynukleo
tide pAX3+ bzw. pAX3- eingesetzt. Die weiteren
Reaktionen wurden nach Vorschrift von Eckstein
und Taylor (Nucl Acids Res. 8765-8785 [1985])
durchgeführt.
Je 10 µg der Plasmide pAX3+/-EcoRI 5761 und
pAX3-/EcoRI 5761 wurden in einem Gesamtvolumen
von 50 µl mit 20 U EcoRI linearisiert und nach
vollständiger Hydrolyse gefällt. In einem 50 µl
Ansatz wurden die überstehenden Enden mit 5 U
Klenow-Polymerase aufgefüllt (s. 2.3.1.). Die
gefällte DNA wird in 50 µl Wasser gelöst.
500 ng der linearisierten DNA aus 2.4.3. wurden
in einem Gesamtvolumen von 20 µl mit 2 U T4-DNA-
Ligase 6 h ligiert. 10 µl des Ligationsansatzes
wurden zur Transformation in kompetenten TG1-
Zellen eingesetzt. Die Eliminierung beider
EcoRI-sites wurde durch Maxam-Gilbert-Sequen
zierung (s. 2.1.2.) bestätigt.
Je 10 µg der Plasmide pAX4+ bzw. pAX4- wurden
in einem Endvolumen von 50 µl zunächst mit 20 U
PstI linearisiert und nach Umpuffern mit 20 U
NruI weiter verdaut. Die geschnittenen Vektoren
wurden über ein 1%iges Agarosegel abgetrennt,
nach 1.1. isoliert und in je 50 µl Wasser aufge
nommen.
Ligationsansätze | |
1. 3 µl pAX4+/PstI/NruI aus 2.5.1. | |
+100 pmol Linker I/pAX4a+/- | |
+100 pmol Linker II/pAX4a+/- | |
2. 3 µl pAX4+/PstI/NruI aus 2.5.1. | +100 pmol Linker I/pAX4b+/- |
+100 pmol Linker II/pAX4b+/- | |
3. 3 µl pAX4+/PstI/NruI aus 2.5.1. | +100 pmol Linker I/pAX4c+/- |
+100 pmol Linker II/pAX4c+/- | |
4. 3 µl pAX4-/PstI/NruI aus 2.5.1. | +100 pmol Linker I/pAX4a+/- |
+100 pmol Linker II/pAX4a+/- | |
5. 3 µl pAX4-/PstI/NruI aus 2.5.1. | +100 pmol Linker I/pAX4b+/- |
+100 pmol Linker II/pAX4b+/- | |
6. 3 µl pAX4-/PstI/NruI aus 2.5.1. | +100 pmol Linker I/pAX4c+/- |
+100 pmol Linker II/pAX4c+/- |
Die Ansätze (3 µl Vektor300 ng DNA) wurden in
einem Volumen von 20 µl hybridisiert und unter
Zugabe von je 2 U T4-DNA-Ligase in einem 30-µl-
Ansatz 6 h ligiert. Zur Transformation (TG1-
Zellen) wurden je 10 µl der Ligationsansätze
eingesetzt.
Der korrekte Einbau der Linker wurde durch
Maxam-Gilbert-Sequenzierung (s. 1.1.2.) be
stätigt.
10 µg pAX4+ wurden in einem Gesamtvolumen von 50 µl
mit 20 U SmaI linearisiert und nach Umpuffern
in einem Endvolumen von 100 µl mit 20 U SalI
umgesetzt.
Der gefällte Vektor wurde anschließend in einem
Ansatz von 50 µl mit 2 U alkalischer Phosphatase
dephosphoryliert (s. 2.3.1.). Das Pellet der
Ethanol-Fällung wurde in 50 µl Wasser aufgenommen.
500 ng des mit SmaI und SalI geschnittenen Vektors
pAX4+ aus 4.1.1. wurden mit 300 ng eines
3221 bp SalI/EcoRV-Fragmentes des IRS-Gens in
einem Gesamtvolumen von 30 µl mit 2 U T4-DNA-
Ligase 6 h ligiert. Für die Transformation in
TG1-Zellen wurden 10 µl des Transformationsansatzes
eingesetzt. Das entstandene Plasmid wurde
mit pPM10 bezeichnet.
Die Aufarbeitung erfolgt nach 3.2. Aus einer Zellmasse
von 2,6 g (Naßgewicht) konnten 2.4 mg sauberes
Fusionsprotein gewonnen werden.
Die Spaltung erfolgt nach Vorschrift 3.3.
Claims (28)
1. Fusionsproteinvektor, enthaltend nacheinander auf
einem Vektoranteil in Transkriptionsrichtung:
- a) einen Promotor und gegebenenfalls einen Ope rator,
- b) ein Gen für ein bakterielles Protein, das über seine enzymatische Aktivität oder durch Affinitätschromatographie aus einer Mischung von Proteinen abgetrennt werden kann,
- c) eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid mit β-Faltblattstruktur kodiert,
- d) eine spezifische Protease-Erkennungssequenz,
- e) eine "multi-cloning"-Stelle zum Einligieren eines Fremdgens und
- f) den Replikationsursprung eines einzelsträngi gen DNA-Phagen enthält.
2. Fusionsproteinvektor nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß die "multi-cloning"-Stelle Restriktionsschnitt
stellen zur Klonierung von Fremdgenen in allen
drei Leserastern enthält.
3. Fusionsproteinvektor nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß er Stopcodons für das Fremdgen in allen drei
Leserastern enthält.
4. Fusionsproteinvektor nach Anspruch 1, 2 oder 3,
dadurch gekennzeichnet,
daß er zusätzlich eine Terminatorsequenz aufweist.
5. Fusionsproteinvektor nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Terminatorsequenz die Lambda-t₀-Sequenz
ist.
6. Fusionsproteinvektor nach einem der Ansprüche 1
bis 5, dadurch
gekennzeichnet, daß er den
Replikationsursprung des Phagen f1 enthält.
7. Fusionsproteinvektor nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß sein
Vektoranteil ein Plasmid, Cosmid, eukaryontischer
Vektor, Hefeplasmid, Shuttle-Vektor oder ein Teil
eines solchen ist.
8. Fusionsproteinvektor nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß das Gen
(b) das lacZ-Gen, das Glutathiontransferasegen
oder das Gen für Protein A ist.
9. Fusionsproteinvektor nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß das Gen
(b) unter der Kontrolle seines homologen Promotors
und gegebenenfalls Operators als Merkmmal (a)
steht.
10. Fusionsproteinvektor nach Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet,
daß er das lacZ-Gen unter der Kontrolle des
lac-Promotors und -Operators enthält.
11. Fusionsproteinvektor nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß die
DNA-Sequenz (c) ein Teil des Collagengens ist.
12. Fusionsproteinvektor nach einem der Ansprüche 1
bis 11, dadurch
gekennzeichnet, daß die Protease
erkennungssequenz (d) eine Collagenaseerkennungs
sequenz ist.
13. Fusionsproteinvektor nach einem der Ansprüche 1
bis 11, dadurch
gekennzeichnet, daß die
Proteaseerkennungssequenz (d) die
Erkennungssequenz für den Faktor Xa ist.
14. Fusionsproteinvektor nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß er anstel
le des vollständigen Gens (b) nur einen Teil
davon, der die enzymatische Aktivität oder die
Bindungsspezifität bei der Affinitätschromatographie
aufweist, enthält.
15. Vektor pAX4a+, DSM 5059.
16. Vektor pAX4a-, DSM 5060.
17. Vektor pAX4b+, DSM 5061.
18. Vektor pAX4b-, DSM 5062.
19. Vektor pAX4c+, DSM 5063.
20. Vektor pAX4c-, DSM 5064.
21. Vektor pAX3+.
22. Vektor pAX3-.
23. Vektor pAX4+.
24. Vektor pAX4-.
25. Verfahren zur Herstellung von Proteinen oder pro
teinhaltigen Genprodukten durch Expression eines
Expressionsvektors, der ein für das gewünschte
Produkt kondierendes Gen enthält, in geeigneten
Wirtszellen und Isolierung des Produkts aus den
Zellen oder dem Kulturmedium,
dadurch gekennzeichnet,
daß man in die "multi-cloning"-Stelle eines
Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 24 das Gen
für das gewünschte Produkt insertiert, den entste
henden Expressionsvektor exprimiert, das gebildete
Fusionsprotein aus aufgeschlossenen Zellen oder
dem Kulturmedium über seine enzymatische Aktivität
oder über Affinitätschromatographie isoliert und
durch Verdauung mit der der Proteaseerkennungsse
quenz entsprechenden Protease das gewünschte Pro
dukt aus dem Fusionsprotein abtrennt und gewinnt.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch
gekennzeichnet, daß man zur
Expression eines eukaryontischen Proteins in einer
prokaryontischen Wirtszelle die cDNA des Gens
insertiert.
27. Verfahren nach Anspruch 25 oder 26,
dadurch gekennzeichnet,
daß man einen Fusionsproteinvektor verwendet, der
als Merkmal (b) das lacZ-Gen enthält und die Iso
lierung an APTG-Affinitätschromatographiesäulen
durchführt.
28. Verwendung eines Fusionsproteinvektors gemäß einem
der Ansprüche 1 bis 24 zur Herstellung von
Einzelstrang-DNA zur Sequenzierung und zur ortsspezi
fischen Mutagenese der Fremd-DNA.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19883841943 DE3841943A1 (de) | 1988-12-13 | 1988-12-13 | Fusionsprotein-vektoren |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19883841943 DE3841943A1 (de) | 1988-12-13 | 1988-12-13 | Fusionsprotein-vektoren |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3841943A1 DE3841943A1 (de) | 1990-06-21 |
DE3841943C2 true DE3841943C2 (de) | 1991-05-08 |
Family
ID=6369061
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19883841943 Granted DE3841943A1 (de) | 1988-12-13 | 1988-12-13 | Fusionsprotein-vektoren |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE3841943A1 (de) |
-
1988
- 1988-12-13 DE DE19883841943 patent/DE3841943A1/de active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE3841943A1 (de) | 1990-06-21 |
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