DD267739A5 - Verfahren zur Herstellung eines zu Hefe heterologen Poly-Peptids - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines zu Hefe heterologen Polypeptids, gekennzeichnet dadurch, dass ein Hefestamm, der mit einem Hybridvector transformiert wurde, der einen oder mehrere DNS-Inserte enthaelt, von denen jeder ein DNS-Segment aufweist, das fuer ein zu Hefe heterologes Polypeptid codiert und das unter der Transkriptionskontrolle eines Hybridpromotors steht, welcher aus einem 5-Upstream-Promotorelement mit UAS(n) des Hefegens PHO5 und einem 3-Downstream-Promotorelement eines anderen Hefegens als dem PHO5-Gen, das Transkriptions-Initiierungsstellen einschliesslich einer funktionellen TATA-Box aufweist, besteht, oder eine Mutante davon gezuechtet wird und das exprimierte Polypeptid isoliert wird.

Description

Verfahren zur Herstellung eines zu Hefe heterologen Polypeptide

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zi. Herstellung eines zu Hefe heterologen Polypeptide«

Charakteristik des bekannten Standee der Technik

In den letzten Oahren wurden auf dem Gebiet der Gentechnik große Fortechritte erzielt« und einige Systeme, bei denen genetisch manipulierte Mikroorganismen, vor allem Stämme des Enterobakteriums Escherichia coil und von Bäckerhefe (Saccharomycee cerevisiae) angewandt werden, sind jetzt erfolgreich« Ee besteht aber ein Bedarf an zusätzlichen und verbesserten Systemen, vor allem eukaryotiechen Systemen wie Hefen, die eich für die wirtschaftliche und Großproduktion von Proteinen in der Industrie .eignen. Gegenwärtig stehen verschiedene Hefevectoren für die Gen-Clonierung zur Verfügung. Für die wirkungsvolle Expression von Fremdgenon in Hefe müeeen strukturelle Hefecodierungssequenzen mit starken Hefepromotoren kombiniert werden, die möglichst Regulatormerkmale zeigen sollten, die die exogene Kontrolle der Gen-Expression erlauben. Oa man annimmt, daß der Wirkungegrad der Expression (Produktbildung} eine Funktion der Stärke des verwendeten Promotore und proportional dazu ist, widmen die Fachleute auf dem Gebiet der Gentechnik ihre spezielle Aufmerksamkeit der Entwicklung kräftiger Promotoreyeteme.

Eine in vitro Mutagenese von cloniertenj für Proteine codierenden Hefegenen und ihr Wiedereinbau zurück in Hefezellen

ι.

zur Funktionsanalyse haben die Identifizierung verschiedener essentieller cie-wirkender Promotorelemente ermöglicht [hinsichtlich Referenz siehe L, Guarente, Cell 36,, 799 (1984).?» Beginnt, man mit den die Proteincodierungeregion am 5*-Ende des Gens unmittelbar flankierenden Elementen« so umfassen diese Elemente:

- eine S'-transcrlbierbare Führerregion, ziemlich A-T reich, die manchmal ein CAACAACAA- (oder verwendetes Sequenz)-Motiv enthält,

- Transcriptions-Inltiierungspunkte, die etwa 40 bis 60 bp (Basenpaare) (manchmal mehr) vom Tranelations-Start-Codon ATG entfernt liegen, was gewöhnlich auf eine Multiplizität von mRNS-Startstellen verschiedener Stärke hindeutet,

- eine TATA-Box (manchmal mehr als eine), die etwa 40 bis 60 bp von den Transcriptions-Xnitiierungepunkten entfernt liegt und vermutlich als essentielle RNS-Polymerase II Erkennungsstelle dient,

- Upstream-Aktivierung88telle(n) (UAS), presumptive Target-Stellen für Regulator-Proteine, die etwa 100 bis 300 bp vor der (upstream) TATA-Box liegen.

Die UAS wirkt in einer anderen Weise als die Regulatorstellen, die in Procaryoten gefunden wurden, und ähneln eher den Verstärkerstellen der Säugetiersysteme· Ziemlich ausführliche Angaben stehen über die Hefe GAL I ₁ GAL 7. GAL 10-Ansammlung zur Verfügung, wonach ein positiv wirkendes Regulator-Protein (GAL 4 Genprodukt) direkt mit der UAS von GAL 1 - GAL 10 zusammenwirkt (Giniger, u. a,_f Cell 40, 767 (1985)).

J67 733

J^:w*»ion von Promotorsegmenten, die die UAS von GAL-I-GAL₁ IO vor der TATA-Box dee Hefegene CYC 1codieren, wurde ein Hybridpromotor erzeugt, dessen Transcription Jetzt unter der Kontrolle der UAS von GAL 1 - GAL 10 steht, d. h. GAL 4 gen-abhängig Cl, Guarente, u, a«, Proc. Natl« Acad. Sei. USA 79, 7410 (1984)J. Eine ähnliche Konstruktion erfolgte durch Verschmelzen von Promotorelementen von CYC 1 und LEU 2 JL, Guarente, u. a., Cell 36,, 503 (19O4)J_# Diese beiden Beispiele enthalten Promotorelemente und Proteincodierungssequenzen von Hefe, und es gibt keinen Beweis, daß diese Systeme auch mit in bezug auf Hefe fremden Genen funktionieren.

In einer kürzlich veröffentlichten Patentanmeldung (PCT 84/4757) wird ein UAS-Elercent des Hefegens PGK beschrieben. Es wird das Vorhandensein eines wichtigen Promotorelementes, das zwischen den Positionen -324 und -455 (von dem ATG) liegt, gezeigt. Es wird behauptet, daß die Stärke jedes anderen Hefepromotors durch den Zusatz dieses Elementes vor anderen Promotoren potenziert würde. Es wird jedoch kein Beispiel zum Beweis dieser Behauptung angeführt, die Argumente basieren lediglich auf negativen Daten (Zerstörung eines Promotors), Es ist durchaus möglich, daß das Element ein wesentlicher Teil des PGK Promotors ist, es ist aber zweifelhaft, ob ein solchee Element als Teil eines Hybridpromotors wirken könnte. Außerdem ist die UAS von PGK nicht mit einem Regulatorsignal assoziiert, d, h., es ermöglicht keine Expressionskontrolle (Transcription) der davor gelegenen (Downstream-) Codierungssequenz durch ein spezifisches physiologisches Signal.

Einige der Promotoren glykolytischer Gene werden in Gegenwart von Glucose induziert. Sie können potentiell) unter-

drückt (turned off) werden« wenn dJ.e Zellen In einem glucooe-freien Medium gezüchtet werden. Das bedeutet, daß Hefev'irtazellen transformiert und in einem Medium regeneriert werden müssen, In dem Glucose durch andere Kohlenetoff quellen (Acetat, Glycerol, Lactat uew.) ersetzt ist, um die Zellen gegen ein potentiell schädliches oder tödliches Genprodukt, dae sich in der Zeil·? ansammelt, zu schützen. Oa die Regeneration von Protoplaeten/Ά. Hinnen, u. a«, Proc. Natl. Acad. Sei, USA 75, 1929 (1975)3 oder von mit Salz behandelten ganzen Zellen £lto, u. a,, 3, Bacteriol. 153, 163 (1983 ),J im allgemeinen in einem reichen Medium vorgenommen wird, um eine rasche Regeneration der Zellen und die Bildung von Kolonien zu ermöglichen, setzen alle derzeit benutzten Transformationsprotokoxle Glucose ale Kohlenstoff quelle ein. Ee wird erwartet, daß die Regeneration und Gewinnung in einem glucose-f reie.i Medium sehr schlecht vor sich geht (wenn überhaupt).

Im Fachgebiet ist allgemein bekannt, daß der zeitliche Ablauf dor Expression reguliert werden muß, damit das Protein auch wirklich nur in großen Mengen erzeugt wird, wenn die Zelle die großan Mengen von Fremdprotoincn am bestei tolerieren kann, d. h. außerhalb der Wachetumsperiode. Es empfiehlt sich auch, die Regulierung der Expression nicht von dem Vorhandensein oder dem Fehlen der für mikrobiologisches Wachstum wichtigsten Kohlenstoffquelle, d. h. Glucose, abhängig zu fachen. Regulierbare und kräftige Promotorsycteme, die diesen Bedingungen herkömmlicher und technisch durchführbarer Expression von Fremdgegen durch Hefe entsprechen, sind im Fachgebiet kaum bekannt. Es besteht daher die Notwendigkeit, solche Promotorsysteme zu entwickeln.

Überraschenderweise wurde jetzt gefunden, daß die Kombination der TAT», Box reg ion von Promotoren, die die Expression von am glykolytlachen Ablauf beteiligten Enzymen kontrollieren und von denen allgemein angenommen wird, daß βie zu den stärksten derzeit bekannten Promotoren gehören, mit Upetream· Promotorele.nenten eines regelbaren Promotore, dessen Repression oder Oerepression nicht vom Vorhandensein oder Fehlen einer wichtigen Komponente des Nährsubetratee, wlo einer essentiellen Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle, abhängig ist, zu starken Hybridpromotoren führt, die die für technisch anwendbare Promotorsysteme festgelegten Bedingungen erfüllen.

Ziel der Erfindunp

Ziel der Erfindung ist die Suche nach einem verbesserten Verfahren zur Herstellung eines zu Hefe heterologen Polypeptide.

Darlegung des Wesens der Erfindung. Ausführliche Beschreibung der Erfindung:

1. Upstream-Aktivierungs-Sequenzen des Säurephosphatase-Hefopens (PHO5) und von Hybridpromotoren

Die Erfindung betrifft Upstream-Aktivierunge-Sequenzen, die von dem Hefegen PHO5 abgeleitet sind, sowie deren Anwendung für die Herstellung von Hybridpromotoren.

Bis zu der Erfindung war es im Fachgebiet nicht bekannt, ob es eine oder mehrere Upstream-Aktivierungsstellen (oder

_ 6 - -²⁶¹

Sequenzen "UAS") gibt ι die die Transcription dee Hefegene PH05 modulieren. Oae PH05-Geη codiert für eine unterdrückbare Hefesöurephosphatase. Ihre Repression erfolgt bei einor hohen Konzentration in anorganischem Phosphat u.id ihre Oerepreesion inter Mangel on anorganischein Phosphat Cd» Meyhack, u. a., EM80-0, I₁ 675 (1982)J.

Die Analyse der 5'-Reglon des PHOS-Gens hat Jetzt zur Identifizierung von cie-wirkenden Elementen geführt, die die Transcription des PH05-Gene modulieren. Ein 623 bp BamHI-Sall-Fragment der 5'-Region des in den Phagenvector M13mp9 (Rekombinantvecto,- M13mp9/PH05 Bam-Sal, siehe EU-PA 143-081) clonierfen PHO5-Geno wir;' mit Exonuclease Ba 131 diysriert, wobei von der Bam-Stellt js begonnen wird, und in oinem anderen Versuch, von dei oal-Stelle aus. Dadurch wird ein Satz verkürzter PH05-Promotorfraqmente erzeugt, die der Sequenzanalyse unterzogen und mit synthetischen EcoRI-Linkern an den verkürzten Enden versehen werden« Durch die Kombination von an der Sal-Stelle verkürzten Fragmenten ("linker Arm P Omotor-Fragmenten") mit an der Barn-Stelae verkürzten Fragmenten ("rechter Arm Promotor-Fragmenten") wird ein Satz von Deletionsmutanten der PH05_-Promotor-Reglon geschaffen, die auf ihre Fähigkeit zur Auslösung öer Expression des PHOS-Strukturgens hin geprüft werden. Ee wurde ermittelt, daß die Deletion zwischen den Nucleotiden -225 bis -263 zu einer fünffachen Verringerung der Säurephosphatase-Aktivität führt, und Deletionen zwischen den Nucleotiden -361 bis -392 oder zwischen den Nucleotiden -346 bis -369 eine zehnfache Verringerung der Säurephosphatase-Aktivität ergeben (hinsichtlich der Numerierung der Nucleotide siehe Figur*1 der beigefügten Zeichnungen). Diese Wirkungen werden den Upstream-Aktivierur.geyteilen (UAS) zugeschrieben, die

- 7 - 367-733

für die PHOS-Exprossion von Bedeutung sind. Die UAS in der Nachbarschaft von Nucleotld -365 let in einen« 268 bp BamHI-ClaX-Fragment (Nudleotlde -274 bie -541) der 5'-Kegion dee PHO5-Gens enthalten und wird alo UASl(PHOS) bezeichnet, während eine UAS-Region in der Nachbarschaft von Nucleotid -245 in eiern 100 bp Clal-BatEII-Fragment (Nucleotide -174 bis -273) der 5' -Region dee PH05_-Ge η θ enthalten let und ale UAS2(PH05) bezeichnet wird.

Die Erfindung betrifft vor allem die Upetream-Aktivierunge-Sequenzen UASl(PHOjS) und UAS2(PH05), die in dem BamHI-BatEII-F ragment zwischen den Nucleotiden -174 und -541 dee PH05-Genr enthalten sind.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Upstream-Akt^ivierungs-Sequenz UASl(PHO ₁ S), die in dem BamHI-Clal-Fragment zwischen e'en Nucleotiden -274 bis -541 des PHOS-Gens enthalten ist, und die Upstream-Aktivierungs-Sequenz UAS2(PH05), die in dem Clal-BatEII-Fragment zwischen den Nucleotiden -174 bis -273 des PHO5-C5ens enthalten ist.

Besonders bevorzugt wird die Upstream-Aktivierungs-Sequenz UASl(PH05). Die genaue Lage dee UASl-Regulntoreignals innerhalb des BamHI-Clal-Kragmentes konnte bestimmt worden. Danach ist das UASl-Regulatorsignal in el"?m 31 bp ONS-Fragment (Position -301 bis -351 der PH05-Promotor-Region) enthalten. Vorzugsweise iet das Fragment auf beiden Seiten mit stumpfendenden Linkern, die geeignete Re3iriktlonsstellen enthalten, oder mit abgestuften Enden versehen, die spezifisch für eine Restriktions-Endonucleaee wie EcoRI sind· Das 31 bp Fragment hat die folgende Sequenz:

GAAATATATAT TAAATTACCACGTTTTCGGA CTTTATATAT.XATTTAATCGTGCAAAAGCGT

Dae Vorführen zur Herstellung von die UASl(PHO*)) und/oder UAS2(PH0£)-Sequenzen enthaltenden ONS-Fragmenten beeteht In der Spaltung einer das PHOft-Gen oder den 5' Terminalteil davon onthaltenden DNS mit geeigneten Reetriktions-Endonucletsen und der Isolierung der verlangten Fragmente* Zum Beispiel wird das 623 bp ßamHI-Fragment von PHOS (supra), eirtechließlich des PI-K¹J-PrOmOt ore und eines Teilos der PH05-Codierungsregion» mit den Restriktions-Endonucleasen BamHI u,id Baten digeriert, und das resultierende, beide Upstream-Aktivlerungestell*). enthaltende 368 bp Subfragment wird isoliert« In analoger Weise ergibt die Spaltung dee obigen BamHI-Sall-Fragmentee mit BamHl "ic· CIaI, oder mit Clal und BatEII das 268 bp BamHI-Clal-Subf ragi.ient, das UASlι ΡΗ05) onthält bzw. das 100 bp Clal-BatEIT-Suofragment, dan UAS2(PHC£) enthält. Die Isolierung und Reinigung der Fragmente und Gubfragmente wird durch herkömmliche Maßnahmen vorgenommen, z. B. durch Agarosegel· Elektrophorese odor PoIyacrylamldge]-Elektrophorese.

Die die erflndungsgemäßen Upstream-Aktivlerungestellen enthaltenden DNS-Fragmente können in einer an sich bcKcicnten Art verkürzt werden, z. B. durch partielle Digestion ι it einer Exonucleaee, beispielsweise Ba131, in einer solchen Weise, daß die UAS-Funktlon in dem verkürzten Fragment erhalten bleibt· Die Verkürzung kann an dem 5'-Ende oder an dem 3*-Ende der Fragmente oder an beiden Seiten vorgenommen werden. Die Selektion derjenigen Subfragmente, in denen die UAS-Funktion erhalten geblieben ist, erfolgt wie om .», und zwar durch Ersetzen der ursprünglichen, die '"M') ent-

haltenden Sequenzen duroh die verkürzten Fragmente und Testen der resultierenden PHOS-Promotor-Delatione-Mutanten hinsichtlich Ihrer Fähigkeit« die Expression des PH05» Strukturgene auszulösen. Die erfindungsgemäßen Fragmente und die verkürzten Derivate davon« die eine oder beide der L'petream-Aktivierungsstellen dee PH05-0ene enthalten, können mit synthetischen Linker-Sequenzen« die an beide End .r. angefügt werden, versehen werden« um die Konstruktion von Hybridpromotoren und die Anfügung an einen Vector zu erleichtern.

Öle DNS-Fragmente sowie die verkürzten Derivate da*'on, die die Upstream-Aktivierungeetel\e(n) von PH05 enthalten, können auch durch chemische DNS-Synthese unter Anwendung herkömmlicher Techniken, die im Fachgebiet allgemein bekannt sind, erzeugt werden. Entsprechende Tee. nlken sind von S. A. Narang ^Tetrahedron 39,, 3 (1983)J :.Msamraengee eilt worden« Es können vor allem die in EU-PA Nr. 146.785 beschriebenen Verfahren angewandt werden, die hier unter Bezugnahme einbezogen sind.

Weitere erfindungsgeir.äße Aspekte betreffen die Anwendung der Upetream-Aktivierungsstellen dee PHOS-Gens für die Erzeugung von Hybridpromotoren und Hybridpromotoren, die Upstream-Aktivlerungsstellen des PH05'Gens aufweisen.

Die Erfindung ist speziell auf Hefehybridpromotoren geruhtet, einschließlich eines, vor allem bestehend aus einem S'-Upstream-Promotorelement mit Upstreäm-Aktlvie.-ungestelle(n) des Hefegene PH05, und eines (einem) 3'-Downstream-Promotorelement eines anderen Hefegens als dem Hefegen PH05, das Transcriptions-Initiierungestellen aufweist, die eine funk-

- 10 -

tionelle ΤΑϊΑ-Βοχ enthalfen und dicht am Translations-Start-Codon enden*

Bei dem S'-Upstream-Promotorelement handelt Θ8 eich vor allem um eines der oben spezifizierten DNS-Fragmente, besonders um die 368 bp BamHI-BatEII-Fragmente, die UAS1(PHO5) und UAS2 (PH05) enthalten, oder das 268 bp BamHI-Clal-Fragment, das UASl(PHOS) enthält, oder verkürzte Derivate davon, in denen die UAS-Funktion erhalten geblieben ist, wie das 31 bp Fragment, das UA8i(£HOJ5) enthält, oder noch kleinere Subfragmente davon.

Das 3'-Downstreatn-Promotorelement ist vorzugsweise von dem Promotor eines atark verwirklichten Hefegeno abgeleitet, speziell von dem Promotor eines für ein glycolytlsches Enzym codierenden Hefegens, wie dem Promotor des Enolase-Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase-(GAPOH), 3-Phosphoglyceratkinaid' ^PGK), Hexokinase-, Pyruvatdecarboxylase-, Phosphofrtctokjnase-, Glucose-ö-phosphatisomorase-, 3-Phosphoglyceratmutase-, Pyruvatkinase-(.PyJ<), Triosephosphatisomerase-, Phosphoglucooeisomerase- und Glucokinase-Gens. Öle 3'-Promotorelemente enthalten die TATA-Box, die bei der Positionierung der Enzym-DNS-Polymerase II zur korrekten Transcription-Initiierung und der richtigen Startpunkte der Transcription (Haupt-mRNS-Startpunkte) eine Rolle spielt. Unterhalb (downstream) der TATA-Box erstreckt sich das 3'-Promotorelement in die Region zwischen dem Haupt-mRNS-Start- und dem Translatione-Startcodon (ATG), vorzugsweise bis dicht an das Translations-Startcodon. An der Upstream-Seite der TATA-Box enthalten die 3¹-Promotorelemente annähernd 50 bis 150 Original-Basenpaare. Die genaue Länge dieser Upstream-DNS-Sequenz ist nicht kritisch, Weil eine gewisse Flexibilität in den Abständen zwischen den UASn und der TATA-Box vorhanden zu sein scheint.

Jo? 73$

Das bevorzugte erfindungsgemäße 3'-Prowotorelenient ist von '.<or.i GAPOH-Promotor abgeleitet« von dem bekannt ist,, daß er einer dor stärksten, im Fachgebiet bekannten Hefepromotoron ist,£ Das Enzym "APOtI kann bis zu 5 % der Trockenmasee von S, cer&vJ.sjlae erreichen, siehe E, G, Krebs, 3. Biol, Cham, 200, 471 {1953)J, Vorzugsweise beginnt das 3'-GAPOH-PrOmOtOrelement an Nucleotid -300 bis -180 und endet an Nucleotid -1 des GAPOH-Gonso In einor bevorzugton Ausführungsform der crfi-dung umfaßt dao S'-Promotoreloment die Nucleotide -199 bia ~i des GAPCH-Gens. In einem anderen bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsbe.tspiel umfaßt das 3*-Promoi:orelemsnt die Nucleotide "-2S3 bis »1 des G*POH~Gerie,

Die erfindungsgemäßen Hybridpromotoren können ein einziges UAS(PH05) oder mehrere UAS(PH05) des gleichen Typp onthalton,, wie 'JASl(PH05), die vorzugsweioe in Kopf-Schwa'iz-Oriontierung angeordnet sind. Hinsichtlich dee 3'Promotorelementos kann (können) die üAftfn) die gleiche oder die umgekehrte Orientierung im Verhältneif zur Orientierung des ursprünglichen PH05-Pr omotors aufweisen.

Die Bestandteile der erfindungsnemäßen Hybridpromotoren, und zwar des Promotorel/ments, das UAS(i.) von PHO£ enthält, und des die TATA-box enthaltenden PfOttotoru!events, sind durch eynthetisoiie Linker, durch etuiflp^endencie Ligatlon oder, wenn möglich, durch natürlich vor!'omiT5ndij vartriigliehe Restrikticnsötellen verknüpft. DAe 5'- und 3*-Enden der erfindungsgemäßan Hybridpromctoren sind vorzugsweise rn.Lt synthetischen Linkern versehen, die die Ligation an eine Vector-DNS und, am 3'-Ende, die Anfügung an eine haterologe Prctein-Codierungsregiün ermöglichen»

- 12 -

Die erfindungsgemäßen Hybridpromotoren erfüllen alle Bedingungen, die an Promotoren, die in der Biotechnologie angewandt werden können, gestellt werden» Sie sind stark, induzierbar durch Substanzen, die sich von den essentiellen Kohlenetoff- oder Stickstoffquellen des Nährsubstrates unterscheiden und werden herkömmlich im Laboratoriums- und Industriemaßstab benutzt·

Dio Erfindung betrifft auch das Verfahren zur Herstellung von Hybridpromotoren, die ein S'-Upstream-Promotoreloment mit Upstream-Aktivierungsstelle(n) des Hefegens PHO5 und ein 3'-Downstream-Promotorelement eines anderen Hefegens als dem Hefegen PH05 enthalten, dos Transcriptions-Initiienmgsstellen einschließlich einer funktioneilen TATA-Box aufvvoist und dicht an dem Translations-Startcodon endet, wobei die Methode darin besteht, daß ein S'-Upstream-Promotorelement ,, das Upotream-Aktivierung8stelle(n) des Hefegene PH05 enthält, an oin 3'-Downstream-Promotorelement von einem anderen Hofegen .ile dom PH05-Gen, das eine funktioneile TATA-Box sr.thölt und dichtam Translations-Startcodcn endet, verknüpft wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die l.igation der Promotorelements durch synthetische Linker,

Die oben genannten Downstrsam-Proinotorelemente von einem anderen Hefegen als dem PHOS-Geη werden durch partielle Digestion cOa S'-Endee eines etarken Hefepromotors, zum Beispiel eines der oben genannten, der sich zu der Region zwischen dem Kaupt-mRNS-Start- und dem Translations-Startcodon erstreckt, mit einer Endonuclease, zum Beispiel Ba131, und durch Anfügung der resultierenden 5'-Stumpfenden an eine

- 13 -

synthetische Linker-DNS hergestellt« Ee werden Promotorelemente ausgewählt ι die die Transcirptions-Startetelle(n) und die TATA-Cox, die etwa 50 bis 150 Basenpaoire der Sequenzen 5' bis zur TATA-Box aufweisen« beibehalten. Die Selektion wird beispielsweise durch Spaltung der resultierenden Promotorelemente mit der Restriktionsendonucleaee« die die synthetische Linkersequenz an dem 5'-Ende erkennt, und mit der Restriktions-Endonuclease, die die synthetische Linker-Sequenz an dem 3'-Ende des Promotorelementes erkennt, und Bestimmung der Länge des resultierenden DNS-Fragmentes mit Hilfe der Agarosegel-Elektrophorese vorgenommen. Die 3'-Promotorelemente können auch durch chemische Synthese unter Anwendung von im Fachgebiet allgemein bekannten Methoden erzeugt werden«

Die erfindungsgemäßen Hybridpromotoren können für die verstärkte und regulierte Expression von Säugetier-Genen in Hefe verwendet werden.

2« Hybridvectoren, die ein heterologes Polypeptid unter der Kontrolle von Hybridpromotoren codierendes Gen enthalten

Die Erfindung betrifft auch Hefe-Hybridvectoren, die einen odor mehrere DNS-Inserts enthalten, von denen jeder ein DNS-Segment aufweist, das für ein zu Hefe heterologes Polypeptid unter der Transcriptionskontrolle eines Hybridpromotore codiert, der aus einem 5'-Upstream«Promotorelement mit UAS(n) des Hefegens PHOS_- und einem S'-Downstream-Promotorelemjnt von einem anderen Hefegen als dem PHOS-Gen besteht, das Transcriptions-Initiierungsstellen, einschließlich einer funktioneilen TATA-Box aufweist.

- 14 -

Die erfindungsgemäßen Hybridvectoren werden aus der aus einem Hybridplasmid und einem linearen DNS-Vector bestehenden Gruppe auegewählt·

Bai einem DNS-Segment, das für ein zu Hefe heterologes Polypeptid codiert, handelt es sich um eine ONS (Gen), die für eine große Vielzahl von Polypeptiden, einschließlich glycoeylierter Polypeptide, codiert, vor allem höhere e^karyotische, speziell von Säugetieren abgeleitete, z. B. tierischer Herkunft oder speziell vom Menschen stammend, wie Enzyme, die beispielsweise für die Herstellung von Nährstoffen und für die Durchführung enzymetischer Reaktionen in der Chemie eingesetzt werden können, oder nichtentymatische Polypeptide, die für die Behandlung von Human- und Tiererkrankungen oder für deren Verhütung nützlich und Wertvoll sind, zum Beispiel Hormone, Polypeptide mit immunomodulatorischen, Antivirus- und Anti-Tumor-Eigenschaften, Antikörper, Virus-Antigene, Vaccine, Gerinnungsfaktoren, Nährmittel und dergleichen.

Beispiele für derartige Polypeptide sind Insulin, Wachstumsfaktoren, wie epidermaler, insulin-artiger, Mastzellen-, Nerven- oder Transformatione-Wachstumsfaktor, Wachstumshormone wie Human- oder Rinder-Wachetumshormone, Interleukin, wie Interleukin-1 oder -2, Human-Makrophagen-Migrations-Inhibitionsfaktor (MIF), Interferone wie Human-Interferon, zum Beispiel Interferon- << A, ^B, ^D oder^F, ß- Interferon, ^-Interferon oder ein Hybrid-Interferon, zum Beispiel ein XA-/D- oder ein <* B- ^D-Hybrid- Interferon, Hepatitisvirus-Antigene wie Hepatitis-B-Virus-Oberflächen- oder -Kern-Antigen oder Hepatitis-A-Virus-Antigen, Plaeminogen-Aktivatoren, wie Gewebe-Plasminogen-Aktivator oder Urokinase,

- 15 -

Tumor-Necroee-Faktor, Somatoetatin, Renin, ß-Endorphln, Immunoglobuline, wie leichten und/oder schweren Ketten von Immunoglobulin 0, E oder G₁ Immunoglobulin-Bindungsfaktoren, wie Immunoglobulin-E-Bindungefaktor, Calcitonin, calcitonin-verwandtee Human-Peptid, Blutgerinnungsfaktoren, wie Paktor IX oder VIIIc, Eglin, wie Eglin C, Desulphatohirudin, wie Deeulphatohirudin-Variante MVl, HV2 oder PA, oder Human-Superoxiddismutase. Bevorzugte Gene sind diejenigen, die für ein Human- -Interferon oder Hybrld-Interferon, Human-Gewebe-Plaeminogen-Aktivator (t-PA), Hepatitie-B-Viru8-0berflächen-Antigen (HBVeAg), insulinartige,ι Wachstumsfaktor 1, Eglin C und Deeulphatohirudin-Variante HVl codieren.

Der Hybridpromotor ist vor allem einer der oben spezifizierten.

Die erfindungegemäßen Hybridvectoren können einen oder mehrere DNS-Insert(9) enthalten, von denen jeder unter anderem den Hybridpromotor und ein DNS-Segment aufweist, das für ein zu Hefe heterologee Polypeptid codiert. Wenn die Hybridvectoren mehrere DNS-InsertSj vorzugsweise 2 bis 4 OMS-Inserts, enthalten, dann können diese in einer Tandemanordnung oder an verschiedenen Stellen des Hybridvectors vorhanden sein.Bevorzugte Hybridvectoren enthalten einen DNS-Insert oder DNS-Inserts in einer Tandemanordnung. In den erfindungsgemäßen Hybridvectoren ist der Hefehybridpromotor operierbc?." mit der Polypeptid-Codierungsregion verknüpft, um eine effektivo Expression des Polypeptide zu gewährleisten. In einem bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel ist der Hefehybridpromotor direkt mit der Codierungsregion des ausgereiften Polypeptide mit einem an

- 16 -

der Verbindungestelle eingesetzten Translationsstartelgnal (ATG) verknüpft. Eine bevorzugte Region für die Vereinigung des Hefehybridpromotors mit der Polypeptidcodierungsregion ist die dem endogenen ATG unmittelbar benachbarte Region.

Bei einer anderen bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist eine Signalsequenz in der Konstruktion enthalten. Geeignete Signalsequenzen sind beispielsweise die PHOS" Signalsequen^i die des Hefe-Invertase-Gene oder die cL-Faktor-pre-pro-Sequenz und Signalsequenzen, die natürlich mit der zu verwirklichenden Polypeptidcodierungsregion verknüpft sind. Alternativ können verschmolzene Signalsequonzen konstruiert werden. Ee werden diejenigen Kombinationen bevorzugt« die eine exakte Spaltung zwischen der Signaleequenz und der ausgereiften Polypeptid-Sequenz ermöglichen. ZusätzlidDe Sequenzen, wie Pro- oder Spacer-Sequenzen, die spezifisch* Verarbeitungssignale tragen können oder nicht, können gleichfalls in die Konstruktion zur Erleichterung der einwandfreien Verarbeitung von Vorläufermolekülen einbezogen werden. Alternativ können verschmolzene Proteine erzeugt werden, die interne Verarbeitungssignale enthalten, die eine angemeseene Auereifung in vivo oder in vitro gestatten. Vor2.'jr;dweise enthalten die Verarbeitungseignale einen Lys-Arg-Rest, der durch eine in der Sekrotionsbahn liegende Hefeendopeptidase erkannt wird.

Nach der Expression de3 Gens gelangt das Genprodukt in die Sekretionsbahn und wird in den periplasmischen Raum transportiert. Wenn eine weitere Exkretion durch die Zellwand in das Nährsubstrat erreicht werden kann, müßte eine beträchtliche Erhöhung der Ausbeuten möglich werden. Auch der

- 17 - .207733

Gewinnungeprozeß kann ohne Zerstörung von Zellen vereinfacht werden. Außerdem kann das Polypeptid ohne ein-zusätzliches Methionin an dem N-Terminus gewonnen werden, weil kein ATG als Translations-Startsignal vor der ausgereiften Codierungssequenz erforderlich ist. Da die Glycoeylierung mit der Sekretionebahn in Beziehung steht, ist zu erwarten, daß das erzeugte Polypeptid glycosyliert wird (vorausgesetzt, daß Glycosylierungsstellen vorhanden sind). Es gibt verschiedene Merkmale, durch die glycosylierte Polypeptide gegenüber unglycosylierten Polypeptiden den Vorteil haben: Die glycosylierten Polypeptide ähneln dem echten Polypeptid von Säugetierzellen mehr ale es bei unglycosyliertem Polypeptid der Fall ist. Des weiteren let die tertiäre Struktur solcher Proteine wahrscheinlich bis zu einem gewiesen Grade von der Gegenwart von Glycosylresten abhängig.

Man nimmt an, daß in diesen Molekülen vorhandene Kohlenhydratreste einen günstigen Einfluß auf die chemische Beständigkeit und die pharmakologiache Aktivität haben.

Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäßen Hybridvoctoren auch die 3'-Flankierungssequenz eines Hefogens auf, das die eindeutigen Signale für die Tran9criptionstermination und Polyadenylation enthält. Die bevorzugte 3*-Flankierungssequenz iat die des Hefegens PH05.

Die Erfindung betrifft speziell ein lineares DNS-Molekül, das im wesentlichen aus einem Hybridvector, der aus einem 5'-Upstream-Promotorelement mit UAS(n) des Hefegens PH05 und einem 3*-Downstream-Promotorelement von einem anderen Hefegen als dem PH05~Gen besteht, das Transcriptions-Initi-

- ίο -

ierungestellen, einschließlich einer funktioneilen TATA*Box aufweist ι ein DNS-Segment, das für ein zu Hefe heterolo^es Polypeptid codiert, wobei das Segment durch den Hybridpromotor kontrolliert wird, und ein DNS-Segment, das die richtig angeordneten Transcriptions-Termdnationssignale des Hefegens PH05 enthält.

Aufgrund der homologen 3¹- und 5'-Plankierungssequenzen ist der gesamte lineare DNS-Vector, einschließlich der Polypeptid-Codierungsregion, an der PH05-Steile fest in das Hefechrr»mo-9om integriert.

Die Erfindung betrifft vor allem kreisförmige Hybridplasmide, die außer dem Hybridpromotor, der Polypeptid-Codierungsregion und den 3'-Flankierungesequenzen zusätzlich DNS-Sequenz(en) enthält, die unwesentlich oder weniger wichtig für die Funktion dee Promotors sind, d. h. für die Expression der Polypeptidcodierungsregion, die aber wichtige Funktionen erfüllen können, zum Beispiel bei der Vermehrung der nit den Hybridvectoren transformierten Hofezellen. Die zusätzliche(n) DNS-Sequer.z(en) können von prokaryotischen und/oder eukaryotischen Zellen abgeleitet sein unri können chromosome und/oder extra-chromosome DNS-Sequenzen enthalten. Zum Beispiel können die zusätzlichen DNS-Sequenzen von Plasmid-DNS stammen (oder daraus bestehen), wie bakterieller oder eukaryotischer Plasmid-DNS, Virus-DNS und/oder Chromosom-DNS, wie bakterieller, Hefe- oder höherer eukaryotischer Chromosomen-DNS. Bevorzugte Hybridplaemide enthalten zusätzliche DNS-Sequenzen, die von Bakterienplasmidefn, vor allem Escherlchia coil Plasmid pBR322 oder verwandten Plasmiden, Baktoriophage X, Hefe 2 ^j-Plasmid und/oder Hefechromosomen-DNS abgeleitet sind.

- 19 - J67 733

Die zusätzlichen DNS-Sequenzen tragen insbesondere einen Hefe-Replikations-Ursprung und einen eelektiven genetischen Markierer für Hefe. Hybridplasmide, die einen Hefe-Replikatione-Ureprung, z. B, ein chromosomes autonom replizierendes Segment (are) tragen, werden nach der Traneformation extrachromosomal innerhalb der Hefezelle gehalten und werden nach Mitose autonom repliziert· Hybridplfcsmide, die zu Hefe 2 /u-Plasmid-DNS homologe Sequenzen enthalten, können gleichfalls verwendet werden. Diese Hybridplasmide werden durch Rekombination in bereite innerhalb der Zelle vorhandene 2 /j-Plasmide integriert werden oder autonom replizieren. 2 ^-Sequenzen sind besonder» für Hochleletunge-Traraformations-Plaemide geeignet und führen zu hoher Kopieanzahl.

Als der selektive Gen-Markierer für Hefe kann jedes Markierer-Gen verwendet werden, das die Selektion für Traneformanten infolge der phenotypiechen Expression dee Markierers vereinfacht. Geeignete Markierer für Hefe sind vor allem diejenigen, die antlbiotieche Resistenz verwirklichen, oder im Falle auxotropher Hefemutanten Gene, die Wlrteläeionen ergänzen. Entsprechende Gene verleihen zum Beispiel Resistenz gegenüber den antibiotiechen Cycloheximid oder schaffen Prototrophie in einem euxotrophen Hefemutanten, zum Beispiel dem URA3, LEU2, HIS3 oder TRPi-Gen. Ee ist auch möglich, Strukturgene als Markierer zu verwenden, die mit einem autonom replizierenden Segment assoziiert sind, vorausgesetzt, daß der zu traneformierende Wirt für das durch den Markierer zu verwirklichende Produkt auxotroph ist.

Es ist vorteilhaft, daß die zusätzlichen, in den erfindungsgemäßen Hybridplasmiden vorhandenen DNS-Sequenzen auch einen Replikations-Ursprung und einen selektiven genetischen Mar-

. 20 -

kierer fur einen Bakterienwirt, vor allem EeChBrJChJa _{1 11} enthalten, Ee gibt nützliche Merkmale, die mit dem Vorhandensein einee E« coil Replikttionsursprunges und eines E. CoIi Markieren in einem Hefehybridvector zusammenhängen» Erstens können große Mengen Hybridvector-DNS durch Züchtung und Vermehrung in E, col.i gewonnen werden, und zweitens wird die Konstruktion von Hybridvectoren meist in E, coil unter Anwendung des gesamten Repertoires von auf E, coil basierender Cionierungetechnologie vorgenommen, E, coli-Plasmide, wie pBR322 und dergleichen, enthalten sowohl den Et coli-Replikationsursprunq ale auch genetische E_t coil Markierer, die Resistenz gegenüber Antibiotika, zum Beispiel Tetracyclin und Ampicillin, verleihen und vorteilhaft als Teil der Hefehybridvectoren verwendet werden.

Die zusätzliche DNS-Sequenz, die beispielsweise Replikatione·· Ursprung und genetische Markierer für Hefe und einen Bakterienwirt (siehe oben) enthält, wird anschließend ale "Vector* ONS" bezeichnet, die zusammen mit dem Hefepromotor und der Polypeptid-Codierungeregion ein erfindungsgemäßes Hybridplasmid bildet.

In einer bevorzugten Aueführungeform betrifft die Erfindung Hybridplasmide, die die Fähigkeit zur Replikation und phenotypiechen Selektion in einem Hofewirtestamm haben, der einen Hefehybridpromotor und eine ein heterologee Polypeptid codierende DNS-Sequenz aufweist, wobei die DNS-Sequenz zusammen mit dem Tranecriptions-Start- und -Terminationssignalan sowie Tranelatione-Start- und -Stopeignalen in dem Hybridplasmid unter Kontrolle des Hybridpromotors so angeordnet ist, daß ihre Expression in einem traneformierten Hefestamm zur Erzeugung des Polypeptide erfolgt.

- 21 -

Die erf A'idungsgemäßen Hybridvectoren werden nach im Fachgebiet bekannten Methoden hergestellt, zum Beispiel durch Verknüpfen eines Hybridpromotore, der aue einem 5'-Upstream-Promotorelement mit UAS(n) dee Hefegene PHO5 und einem V-nownstream-Promotorelement v^n einem anderen Hefegen ale dem PHJDg₁-Gen, das Transcripticns-Initiierungeetellen, einschließlich einer funktioneilen TATA-Box aufweist, besteht, eines DNS-Segments, das für zu Hefe heterologem PoIypeptid und 3*-Flonklerungssequenzen eines Hefegens codiert, so daß das DNS-Cjgment unter Tranecriptionekontrolle dee Hybridpromotors steht, und wahlweise Einbau einer oder mehrerer erzeugter linearer DNSn in eine Vector-DNS.

Zweckmäßig verzeichnete, lineare oder vorzugsweise kreisförmige Vector-DNS, zum Beipsiel Baktarien-Plasmld-DNS oder dergleichen (siehe oben) mit mindestens einer Reetriktioneatelle, vorzugsweise zwei oder mehr Restriktionsstellen, kann verwendet werden. Ee let vorteilhaft, wenn die Vector-DNS bereits Replikationsursprünge und Genmarkierer für Hefe und/oder einen Bakterienwirt enthält. Die Vector-DNS wird unter Verwendung einer entsprechenden Restriktionsendonucleaee gespalten. Die eingeochränkte DNS wird an das lineare DNS-Frayment, das unter anderem den Hefehybridpromotor enthält, und an das für das Polypeptid codierende DNS-Fragment Iigiert. Vor oder nach der Verknüpfung des Hybridpromotors und der Polypeptid-Codierungsregion (oder ebenso gleichzeitig) ist es euch möglich, Replikationsursprünge und/oder Markierer für Hefe oder einen Bakterienwirt einzubauen. In allen Folien sind die Restriktions- und Wärmebedingungen in einer solchen Weise zu wählen, daß keine Beeinträchtigung der wesentlichen Funktionen der Vector-DNS und des Hybridpromotors erfolgen kann. Der* Hybridvector kann sequentiell oder durch Ligation von zwei DNS-Segmenten, die alle in Frage kommenden Sequenzen aufweisen, aufgebaut werden.

- 22 -

267 733

Es können verschiedene Technikon für die Vereinigung von DNS-Segmenten in vitro angewandt werden. Durch bestimmte Restriktionsendonucleaoen erzeugte stumpfe Enden (»oll"· ständig basongepaarte DNS-Duplexe) können direkt mit T4-DNS-Liyase ligiert werden» Üblicher ist es, DNS-Segmente durch ihre eiisträngigen kohäsiven Enden zu verknüpfen und durch eine DNS-Ligase kovalent zu schließen« z. B. durch T4-DNS-Ligase, Solche ei net rängigen "kohäsiven Enden" können durch Spaltung von DNS mit einer anderen Klasse von Endonucleaeen, die abgestufte Enden erzeugen, gebildet werden (die beiden Stränge von dein DNS-Duplex werden an verschiedenen Stellen in einem Abstand von wenigen Nucleotiden gespalten)» Einzelne Stränge können auch durch die Addition von Nucleotiden an stumpfe Enden oder abgestufte Enden unter Verwendung von Terminal-Transferase gebildet werden ("homopolymeres Tailing") Verlängerung)) oder einfach durch Zurückziehen eines Strenges eines stumpfendenden DNS-Segmentes mit einer geeigneten Exonuclease wie Ti -Exonuclease» eine weiters bevorzugte Möglichkeit für die Erzeugung von abgestuften Enden besteht in der Ligation einer chemisch synthetisierten Linker-DNS, die eine Erkennungsstelle für ein Endonuclease bildendes, abgestuftes ende enthält, an stumpfendende DNS-Segmente, und der Digestion der reeultiorenden DNS mit der betreffenden Endonuclease«

Damit eine wirksame Expression erfolgen kann, muß das Gen einwandfrei in bezug auf Seqieizen, die franse rJ.pt ions-(Hefehybridpromotor) und Translationsfunktionen enthalten, angeordnet sein« Erstens muß die Ligation das den Hybrldpromotor aufweisenden DNS-Segmentes mit der Polypeptid-Codierungsregion in der richtigen Orientierung erreicht werden, Wenn zwei Orientierungen möglich sind, wird die richtige

- 23 - ,267

durch die herkömmliche Restriktionsanalyse bestimmt, Hybridvectoren, die einen falsch orientierten Polypeptid-Geninsert enthalten, werden durch Ausschneiden des Geninserts mit einer geoigneten Restriktionsendonuclease und erneute Ligation des Gens mit dem Hybridvectorfragment umorientiert« In jedem Fall wird eine falsche Orientierung durch die Ligation von zwei DNS-Fragmciten je mit unterschiedlichen Restriktionsstellen an ihren Enden vermieden. Außerdem sollte die Konstruktion des Hybridvectors in einer solchen Form vorgenommen werden, daß sie die korrekte Transcriptions-Initiierung und -Termination ermöglicht. Hinsichtlich des letzten Punktes sollte das Transcript vorzugsweise in einer DNS-Sequenz enden, die von Hefo-Chromosomen-ONS oder 2 yu-Hefeplasmid abgeleitet ist. Am besten endet das Transcript in einer DNS-Sequenz, die Transcriptions-Terminationssignale eines Hefegens enthält, z. B. von PHO5 oder TRPl. Zweitens muß ein einwandfreies Orientierungsschema (reading frame) aufgestellt werden. Normalerweise sind die Nucleotid-Sequenz der Promotorregion und die Folypeptid-Codierungeregion vor der Ligase bekannt, oder sie können leicht bestimmt werden, so daß es keine Schwierigkeiten bei der Aufstellung des richtigen Orientierungsschemas gibt.

Wenn did direkte Expression des ausgereiften Polypeptide verlangt wird, müssen wahlweise der Hybridpromotorregion und/oder wahlweise der Codierungsregion für das ausg^eifte Polypeptid vorausgehende Signalsequenzen oder Teile davon eliminiert werden, beispielsweise durch Digestion mit einer Exonuclease, z. B. mit Bal31. Eine bevorzugte Region für die direkte Verbindung einee Hefepromotors mit der Polypeptid-Codierungsregion liegt zwischen dem Haupt-mRNS-Start- und dem ATG-Translations-Startcodon. Für eine Verbindung in die-

- 24 -

ser Region sollte die Polypeptid-Codierungssequenz ihr eigenes ATG zur Translationeinitiierung haben, oder sonst muß es mit einem zusätzlichen synthetischen Oligonucleotid versehen werden. Der Hefehybridpromotor kann auch mit Hilfe eines synthetischen Oligodesoxynucleotids als Verbindungsmolekül mit der Polypeptid-Codierungssequenz verknüpft werden. Daher kann die Hybridpromotorregion, wenn möylich, nahe ihres 3'-Terminus so eingeschränkt werden, daß ihr eine vorbestimmte Anzahl von Basenpaaren fehlt. Analog kann die Polypeptid-Codierungssequenz nahe ihrem 5'Terminus eingeschränkt werden« Ein synthetisches Oligodesoxynucleotid kann dann in einer solchen. Weise konstruiert werden, daß die fehlenden Basenpaare bei der Vereinigung des Hefehybridpromotors und der Polypeptid-Codiorungseequenz fiber das verbindende Oligodesoxynucleotid einschließlich eines ATG-Translations-Initiierungesignals wieder hergestellt werden und die Polypeptid-Codierungssequenz sich in bezug auf den Promotor in dem richtigen Oriontierungsschema befindet.

Oas den erwünschten Hybridvector enthaltende Ligationsgemisch vird in dem Trandformationsechrltf direkt verwendet ode'r vorher für den Hybridvector, z, B, durch Gel-Elektrophorese, angereichert und dann für die Transformation verwendet.

Zwischenprodukte, wie Vectoren, denen noch eine oder mehrere wesentliche Funktionen fehlen, sowie die endgültigen erfindungsgemäßen Hybridvectoren, werden wahlweise in einen Bakterienwirt, speziell E. coli aus den oben genannten Gründen transformiert (z. B. Produktion von großen Mengen von Zwischenprodukten bzw. Hybridplasmiden). Bakterienvectoren, wie das E. coli Plasmid pBR322, und diejenigen Fragmente davon, die einen Bakterien-Replikationsursprung und Genmarkierer enthalten, sind die aus diesem Grund am meisten be-

- 25 -

vorzugten Vectoren. Bei der Verwendung eines solchen Bakterienvectors umfassen die letzten Schritte für die Herstellung der Hefehybridvectoren vorzugsweise auch den Einbau eines genetischen Markierers und eines Replikationeursprunges für Hefe.

3, Transformation von Hefe mit Hybridvectoren, die eine Polypeptid-Codierung88Qquenz enthalten

Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von traneformierten Hefezellen, die ein zu Hefe heterologes Polypeptid erzeugen können, wobei das Verfahren in der Transformation von Hefezellen mit einem Hybridvector besteht, der einen oder mehrere DNS-Inserts mit je einem DNS-Segment enthält, das für ein zu Hofe heterologes Polypeptid unter dor Transcriptionskontrolle eines Hybridpromotors codiort, der aus einem S'-Upstream-Promotorelement mit UAS(n) von dem Hefegen PHO5 und einem 3¹-Downstream-Promotorelement von einem anderen Hefegen als dem PHOS-Geη, das Transcriptions-Initiierungsstellen, einschließlich einer funktioneilen TATA-Box aufweist, besteht.

Nützliche Hefen umfassen Spezies der Gattung Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Rhodotorula, Torulopsis und verwandter Gattungen (siehe 3, Lodder, "The Yeasts" (Die Hefen), Amsterdam 1971), speziell S'.ämme von Saccharomyces cerevisiae

Die Transformation von Hefe mit den Hybridvectoren kann nach im Fachgebiet bekannten Verfahren vorgenommen werden, z. B. nach der von Hinnen, u. a,,£Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978 )J beschriebenen Methode. Diese Methpde kann in drei Schritte unterteilt werden:

- 26 - ,267 7,33

(1) Entfernung der Hefezellwand oder von Teilen davon

(2) Behandlung der "nackten" Hefezellen (Spheroplasten) mit der transformiertenden DNS in Gegenwart von PEG (Polyethylenglycol) und Ca ⁺-Ionen.

(3) Regeneration der Zellwand und Selektion der transformierten Zellen in einer festen Agar-Schicht.

Bevorzugte Methoden:

Zu (1): Die Hefezellwand wird enzymatisch unter Anwendung verschiedener Präparate von Glucosidasen wie Schneckendarmsafte (z. B, Glueulase oder Helicase ) oder Enzymmischungen, die von Mikroorganismen (ζ. B. Zymolyase ) in osmotisch stabilisierten Lösungen (z. B. 1 M Sorbitol) gewonnen wurden.

Zu (2): Die Hefespheroplaste ballen sich in Gegenwart von PEG zusammen, und es werden örtliche Fusionen der cytoplasmischen Membranen ausgelöst. Die Erzeugung von "fusions-artigen" Bedingungen ist kritisch, und viele transformierte Hefezellen werden im Laufe des Transformationsprozesses diploid oder sogar triploid. Verfahren, die eine Selektion von verschmolzenen Spheroplasten ermöglichen, können zur Anreicherung von Transf onianten angewandt werden, d, h,, transformierte Zellen können leicht aus vorselektierten Fusionsprodukten ausgesiebt werden.

Zu (3): Da sich Hefezellen ohne Zellwand nicht teilen, muß die Zellwand regeneriert werden. Diese Regeneration erfolgt am besten durch Einbetten der Spheroplaste in Agar. Zum Bei-

- 27 - ^? 733

spiel wird geschmolzenes Agar (etwa 50°) mit den Spheroplasten vermischt< Nach dem Abkühlen der Lösung auf.Hefewachstumstemperaturen (etwa 30°) wird eine feste Schicht gewonnen. Diese Agarschicht dient zur Verhinderung von schneller Diffusion und Verlust von wichtigen Makromol« külen aus den Spheroplasten und erleichtert dadurch die Regeneration der Zellwand. Die Zellwandregeneration kann aber auch dadurch erzielt werden (wenn auch mit einem geringeren Wirkungsgrad)« daß die Spheroplaste auf die Oberfläche von vorgeformten Agarschichten aufgestrichen werden.

Das Regenerations-Agar wird vorzugsweise in einer Weise hergestellt, durch die die gleichzeitige Regeneration und Selektion transformierter Zellen möglich ist. Da Hefegene, die für Enzyme von biosynthetischen Aminosäurebahnen codieren, allgemein als selektive Markierer (supra) verwendet werden, wird die Regeneration vorzugsweise in minimalem Hefe-Medium-Agar ausgeführt. Wenn sehr hohe Wirkungsgrade der Regeneration verlangt werden, dann ist ein Zwei-Stufen-Verfahren vorteilhaft: (1) Regeneration der Zellwand in einem reichen komplexen Medium, und (2) Selektion der transformierten Zellen durch wiederholtes Aufstreichen der Zellschicht auf selektive Agarplatten.

Wenn der Hybridvector keinerlei Markierer-Gen enthält, können die transformierten Zellen auch mit Hilfe alternativer Methoden identifiziert werden. Solche Methoden umfassen zum Beispiel die in situ Hybridisierung mit einem markierten DNS-Fragmont, das Sequenzen des Hybridvectors homolog ist (z. B. nach Hinnen, u. a,, supra), in situ Immunoanalysen, vorausgesetzt, daß ein Antikörper für das Produkt des eingeführten Gens vorhanden ist, oder andere Screening-Methoden, bei deien

- 28 -

J&i 7 35

die durch die traneformierenden Plasmide codiorten Genprodukte gemessen werden·

Alt»rnativ kann die Hefe mit einem erfindungsgemäßen Hybridvector und einem zweiten, einen genetischen Markierer für Hefe enthaltenden Vector co-transformiert werden. Wenn die beiden unterschiedlichen Vectoren gemeinsame DNS-Sequenzen haben (es können dies auf den Vectoren vorhandene Bakteriensequenzen sein), dann erfolgt Rekombination, die zu einem verschmolzenen selektierbaren Hybridmolekül führt.

Die Hefe kann auch mit einem linearen ONS-Vector, der aus dem Hefehybridpromotor, der heterologen Polypeptld-Codierungsregion, die durch den Hybridpromotor und die Transcription8-Terminations8ignale des Hefegens PH05 kontrolliert wird, und einem Vector, der einen selektiven Markierer für Hefe enthält, co-transf ormiert werden. Durch di<» Cotransformation kann eine Anreicherung derjenigen Hefezellen erfolgen, die ONS, die nicht direkt selektiert werden kann, aufgenommen haben. Oa kompetente Zellen jeden Typ von ONS aufnehmen, wird ein hoher Prozentanteil von mit einem selektiven Vector transformierten Zellen auch jede zusätzliche DNS enthalten (so die obige lineare DNS). Infolge von ausreichend langen homologen Sequenzen (z. B. etwa 20 bis 100 Oesoxynuclootide lang) wird dae Polypeptid-Ger. fest in das Wirtschromosom integriert. Die spezifischo erfindungsgemäße Konstruktion wird zu einer festen Integration des heterologen Gens an der Chromosomenstelle des PHOS-Gens, und zwar in das Hefe-Chromosom II, führen.

Die gewonnenen, die erfindungsgemäßen Hybridplasmide enthaltenden Hefestämme können bei der Herstellung heterologer

- 29 -

Polypeptide durch Mutation und Selektion unter Anwendung von im Fachgebiet bekannten Methoden verbessert werden« Die Mutation kann zum Beispiel durch UV-Bestrahlung oder geeignete chemische Reaktionsmittel zustande gebracht werden«

Es wurde gefunden, daß die Transformation mit den erfindungsgemäßen Hybridvectoren und die Regeneration der Zellwände in reichen Medien, die Glucose als Kohlenstoffquelle enthalten, in zweckmäßiger Form erfolgen können und wesentlich einfacher als durch die entsprechenden Schritte, die mit Hybridvectoren ausgeführt werden, die herkömmliche, durch Glucose induzierbare Promotoren enthalten, die in glucoeefreien Medien zur Verhinderung der Ansammlung des möglicherweise letalen Genproduktes innerhalb der Zellen vorgenommen werden müssen.

Die Erfindung betrifft euch Hefewirte, die mit Hybridvectoren transformiert wurden, die einen oder mehrere DNS-Inserts aufweisen, von denen jeder ein DNS-Segment, das für ein zu Hefe heterologes Folypeptid unter der Transcriptionskontrolle eines Hybridpromotors codiert, der aus einem 5'-Upstream-Promotorelement mit UAS(n) des Hefegene PHO5 und einem 3'-Downstream-Promotorelement von einem anderen Hefegen als dem PHO5-Gen, das Tranecriptione-Initiierungsstellen einschließlich einer funktionellen TATA-Box aufweist, besteht, sowie Mutanten davon.

4. Züchtung der transformierten Hefezellen und Isolierung des verwirklichten Polypeptide

Die Erfindung betrifft des weiteren eine Methode zur Herstellung eines zu Hefe heterologen Polypeptide, die dadurch ge-

- 30 -

kennzeichnet iet| daß ein Hefestamm, eier mit einem Hybridvector tranoformiert wurde, der einen oder mehrere DNS-Inserts enthält, von denen jedar ein DNS-Segmenv aufwe-st, für ein zu Hefe heterologes Polypeptic! unter der Transcirptionekontrolle eines Hybridpromotors codiert, der aus einem 5'-Up3tream-Promotorolement mit UAS(n) des Hefegene PH05 und einem 3'Qownstream-Promotorelement von einem anderen Hefegen als dem PH05-Gsn besteht, das Transcriptions-Initiierungsstellen einschließlich einer funktioneilen TATA-Box aufweist, oder eine Mutante davon gezüchtet werden und das verwirklichte Polypeptid isoliert wird.

Die erf indungsgemälien transformierten Hefezellen werden durch im Fachgebiet bekannte Verfahren in einem flüssigen Medium, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff, anorganischen falzen, und wenn erforderlich, Wuchsstoffen enthält, gezüchtet.

Verschiedene Kohlenstoffquellen können eingesetzt werden. Beispielsweise für bevorzugte Kohlenstoffquellen sind assimilierbare Kohlenwasserstoffe wie Glucose, Maltose, Mannltd oder Lactose, oder ein Acetat wie Natriumacetat, die entweder alleine oder in geeigneten Mischungen verwendet werden können· Geeignete Stickstoffquellen umfassen beispielsweise Aminosäuren, wie Casaminosäuren, Peptide und Proteine und deren Abbauprodukte wie Trypton, Pepton oder Fleischextrakte, außerdem Hefeextrakt, Malzextrakt, Maiequellwasser sowie Ammoniumsalze wie Ammoniumchlorid, -sulfat, oder -nitrat, die entweder alleine oder in geeigneten Mischungen verwendet werden können. Anorganische Salze, die verwendet werden können, umfassen zum Beispiel Sulfate, Chloride, Phosphate und Carbonate von Natrium, Kalium, Magnesium und Calcium.

- 31 -

Außerdem kann dae Nährmedium auch noch Wuchsstoffe enthalten. Substanzen, die dae Wachstum fördern, umfassen beispielsweise Wachetumepromotoren, Spurenelemente wie Elisen, Zink, Mangan und dergleichen, oder einzelne Aminosäuren.

Ua die erfindungegemäßen Hybridpromotoren reguliert sind, muß die Zusammensetzung des Nährmediums den Wachstumsphasen angepaßt werden. Während der Wachstumsperlode werden die erfindungsgemäßen Hybridpromotoren unter hoher Phosphatkonzentration im wesentlichen unterdrückt. Zum Beispiel wird der am meisten bevorzugte erfindungsgemäße Hybridpromotor, der ein S'-Upetream-Promotorelement von PHO5 mit den UAS(n) von PHO5 und ein 3'-Downstream-Promotorelement von GAPOH mit der TATA-Box enthält, unter diesen Bedingungen etwa um das Fünfzigfache reduziert. Daher werden potentiell toxische Genprodukt· nur mit sehr geringen Geschwindigkeiten synthetisiert und schädliche Einflüsse auf den Zellmetabolismus auf ein Mindestmaß reduziert. Wenn eine ausreichende Zelldichte erreicht ist, werden die Mengen des anorganischen Phosphats in dem Nährmedium vorzugsweise'reduziert (schwaches P.-Medium) Danach werden die erfindungsgemäßen Hybridpromotoren aktiviert (nicht mehr unterdrückt) und maximale Mengen von ,mRNS-Tranecripte gewonnen.

Die Züchtung wird unter Anwendung herkömmlicher Techniken vorgenommen. Die Züchtungsbedingungen wie Temperatur, pH-Wert des Mediums und Fermentationsdauer werden so gewählt, daß maximale Mengen des verlangten Polypeptide erzeugt werden. Im allgemeinen wird die Züchtung unter aeroben Bedingungen in Submerskultur inter Schütteln oder Rühren bei einer Temperatur von etwa 25° bis 35 ⁰C, boi einem zwischen 4und 8 liegenden pH-Wert, zum Beispiel annähernd bei pH 7, und etwa

- 32 -

733

4 bis 20 Stunden lang, vorzugsweiee bis maximale Mengen dee verlangten Proteine erreicht sind, erfolgen.

Die Ieolierung und Reinigung dee verwirklichten Polypeptide werden, wenn verlangt, nach im Fachgebiet bekannten Nethoden durchgeführt.

Nachdem die traneformierten Zellen bie zu einer zufriedenstellenden Zelldichte gezüchtet worden sind, besteht der erste Schritt für die Gewinnung des verwirklichten Proteine in der Freisetzung dee Proteins aus dem Zellinneren. Uei den meisten Verfahren wird die Zollwand zuerst durch enzymatische Digestion, z. B, mit Glucouidaee, entfernt. Anschließend werden die resultierenden Spheroplaste mit Oetergenzien wie Triton behandelt. Alternativ sind auch mechanische Kräfte wie S_cherkröfte (zum Beispiel X-Prosee, French-Proese) oder Schütteln mit Glasperlen für das Aufbrechen der Zellen geeignet. Das resultierende Gemisch wird hinsichtlich des gewünschten Polypeptide durch herkömmliche Maßnahmen angereichert, z. B, durch Entfernung dee größten Teiles von nicht eiweißhaltigem Material durch Behandlung mit Polyethylenimin Präzipitation der Proteine durch Sättigung der Lösung mit Ammoniumsulfat oder Trichloreseigsäure, Gelelektrophoreee, Dialyse, Chromatograph: ,, zum Beispiel Ionenauetauech-Chromatographie, Größen-Ausschaltungs-Chromatographie, HPLC oder Umkehrphasen-HPLC, Molekül-Größenklassifizlerung auf einer geeigneten Sephadu. -Säule oder dergleichen, nie endgültige Reinigung dos vorgereinigten Produktes wird beisplelssveLse mit Hilfe der Antikörperaffinitäte-Chromatographie erreicht.

In dem Falle, in dem das verlangte Polypeptid durch die Hefszelle in den periplasmischen Raum ausgeschieden wird, kann

ein vereinfachtes Protokollverfehren angewandt werden: Das Polypeptid kann ohne Ze 1.1-Ly β ie durch enzymatie-che Entfernung der Zellwand oder durch Behandlung mit chemiechen Mitteln, z, Q. Thiol-Reagenzien oder EOTA, die zu ZeIlwandechöden führen, die die Freisetzung dee Polypeptide erlauben, gewonnen werden« In dem Falle, in dem dae PoIypeptld in das Nähreubetrnt ausgeschieden wird, kann es direkt daraus gewonnen worden.

Ein Gemisch von gewonnenen, glycosylierten und unglycosyllerten Proteinen kann beispielsweise durch Chromatographie auf einer Concanavalln-A Sepharose -Säule getrennt werden. Unglycoeylierte Produkte werdon durch die Säuie hindurchlaufon, während glycosyliorto Produkte sich selektiv adsorbieren und mit Hilfe herkömmlicher Mittel eluiert werden können, z. B. * -Methylnannoeid in Kombination mit einem chaotropen Mittel wie KSCN.

Glycosyl-Rücketände können auch enzymatisch entfernt werden, ζ. Θ, durch die Wirkung von Endoglycosidaso H oder F, Durch diese Methode können unglycosylierte Produkte in weitgehend reiner Form erzeugt werden.

Die Erfindung betrifft außerdem auch Polypeptide, wenn sie jeweile nach den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden.

Die Erfindung befaßt sich speziell mit den Upetream-Aktivierungesequenzen von PH05« den Hybridpromotoren, den Hybridvektoren, den transformierton Hefezellen und don Verfahren für deren Herstellung sowie der Methode zur Erzeugung von zu Hefe heterologen Polypeptiden nach der Beschreibung in den Beispielen.

- 34 -

Kurze Boschreibung der Zeichnungent

Im folgenden experimentellen Teil werden verschiedene Ausführungsbeispiele der Erfindung unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, in denen darstellen:

Fig, 1: die DNS-Sequenz des BamHI-Sall-Fragmentea der PHO5·· Promotorregion,

Fig. 2: die DNS-Sequenz der Promotorregion von GAPOH £"&>η 491, siehe G. A. Bitter, u. a,, Gene 3£, 263 (1984)],

Fig. 3: schematisch die Erzeugung von Plasmid pGAPDH-EL,

Fig. 4: 3'Promotorolemunte des erfindungsgomäß verwendeten GAPDH"Gons.

Fig, 5: ein Diagramm, das dio Erzeugung von Plasmid pJDB207R/PH05-E6L zeigt,

Fig. 6: die Konstruktion von Plasmid p3D3207/PAPHL~EGL (UASl),

Fig. 7: ein schematisches Diagramm, das die Isolierung ni nes für ausgereiftes Deeulfatchirudin codierenden DNS-Fragmentes zeigt,

Fig. 8: schematisch die Herstellung von Plasmid pJDB207/PH05-HIR,

Fig. 9: schematiech die Konstruktion von Plasmid pODB2O7/ PHOS(EcO)-HIR,

- 35 -

Fig. lOj ein echematiechee Diagramm, dae die Konstruktion von Plasmdd pODB207/PAPFL-TPA(UASl+UAS2) zeigt.

Ausführungsbeispiel

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, sollen aber nicht als eine Einschränkung derselben betrachtet werden.

Experimenteller Teil Beispiel Ii Konstruktion von PHO5 Promotor-Deletionen

a) Ba 13!"Digestion

Rekombinant-Phage Ml3mp9/PH05-Bam-Sal, die das in Fig. 1 gezeigte BamHI-Sail-Fragment von PHO5 enthält, wird als Quelle für den PHO5-Promotor verwendet (siehe EU-PA 143.081).

20 pg der Phagen~DNS (RF: replikative Form) werden mit Rest riktions-Endonuclease Sail digeriert, wodurch sich eine linoare DNS von annähernd 9 kb ergibt. Nach der Extraktion mit Phenol/Chlcroforrn wird die DNS mit Ethanol ausgefällt. Die DNS wird erneut in 10 mM Tris, pH 8,0, mit einer Konzentration von 0,5 pg/ml suspendiert. 16 /jg von Sall-gespalteter DNS werden mit 2 U (Einheiten) von Exonuclease 8al31 (BRL) in 100 ^l von 20 mM Tris, pH 8,0, 199 mM NaCl, 12 mM MgCl₂, 12 mM CaCl₂ und 1 mM EDTA digeriert. Aliquoten von jeweils 2 yug DNS werden nach einor Inkubationszeit von 1, 2, 3, ^, und 6 min bei 30 ⁰C entnommen und sofort mit 50 μΐ Phenol und 60 μΐ TNE vermischt. Nach der Extraktion mit Phenol/Chloroform und der Ethanol-Prözipitaticn wird die DNS erneut in

- 36 - Ml733

10 mM Trie, pH 8,0, mit einer Konzentration von 100 suspendiert. Zur Analyse des Ausmaßes der exonucleolytiechen Spaltung durch Bal3l werden 0,5 )iq DNS von jedem Zeitpunkt mit Endonuclease BamHI digeriert und auf einem l,5%igen Agaroeegel in Trie-Boratpuffer, pH O₁3, analysiert (90 mM Tri8.HCl, pH 8,3, 90 mM Borsäure, 2,5 mM EDTA). Durchschnittlich werden 100 bp von jedem Ende des Fragmentes je 1 min der Bal31-Digestion entfernt.

b) Addition von EcoRI-Linkern zu der Bal3l-behandelten PNS

Zwei A₂₆₀ Einheiten von EcoRI-Linkern (5¹GGAATTCC-S¹, BRL) werden erneut in 250 μΐ von 10 mM Trie, pH 8, 1 mM EDTA suspendiert. Zwei /Ug von EcoRI-Linkern werden in 75 μΐ von 60 mM Trie, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 15 mM DDT, 10 jiM ATP und 33 U von T4-Polynucleotid-Kinase (Boehringer) kinaeiert. Nach 1 h bei 37 ⁰C wird das Gemisch auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und danach bei -20 ⁰C aufbewahrt.

Die wärmebehandelten, doppelsträngigen EcoRI-Linker wenden mit ihren stumpfen Enden an die Bal31-behandelten DNS Fragmente ligiert. Ein halbes Mikrogramm von Bal31-behandelter DNS (siehe Beispiel la) wird 16 Stunden lang bei Raumtemperatur mit einem 50fachen Überschuß von kinasierten EcoRI-Linkern in 20 μΐ 60 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 10 mM DDT, 4 mM ATP und 600 U von T4-DNS-Ligase (Biolabs) inkubiert. Nach der Inaktivierung der T4-DNS-Ligase (10 min bei 65 ⁰C) wird der Überschuß von EcoRI-Linkern durch 50 U von EcoRI (Boehringer) in einem Volumen von 50 μΐ gespalten. Die DNS wird nit Phenol/Chloroform extrahiert, durch Ethanol ausgefällt und wieder in 10 mM Tris, 1 mM EDTA (= TE) suspendiert. Danach wird die DNS mit 5 Einheiten von BamlHl (Biolabs) ge-

_ 37 - 26*73$

spalten, und dae Gemisch wird auf ein l,5%iges, niedrigschmelzendes Agarosegel (Sigma) in Tri8-Boratpuffer (siehe oben) aufgegeben· Die Banden werden mit Ethidiumbromid gefärbt und untor langwelligem UV-Licht von 360 nm beobachtet. Die breiten diffusen Bönderungsinuster zwischen etwa lOObp und 600 bp werden aus dem Gel ausgeschnitten, und die ONS wird wie folgt extrahiert: Das Stück Agaroee wird bei 65 ⁰C verflüssigt, auf 500 mM NaCl eingestellt und 20 min lang bei 65 ⁰C inkubiert. Es wird ein Volumen Phenol (äquilibriert mit 10 mM Tris.HCl, pH 7,5, ImM EDTA, 500 mM NaCl) zugesetzt. Die wäßrige Phase wird zweimal mit Phenol und einmal mit Chloroform reextrahiert. Die DNS wird mit 2,5 Volumen kaltem absolutem Ethanol ausgefällt und durch Zentrifugieren gesammelt. Das DNS-Pellet wird mit kaltem eo^igem Ethanol gewaschen und anschließend unter Vakuum getrocknet. Die DNS wird wieder in 10 μ\ TE suspendiert.

c) Liciation in Ml3mp9

3 /jg RF von Ml3mp9 werden mit 15 Einheiten EcoRI (Biolabs) und 15 Einheiten BamHI (Boehringer) in einem Volumen von 50 /jI digeriert. Nach der Phenolextraktion und der Ethanolausfällung wird die DNS wieder in 50 μΐ TE suspendiert. Fünf ul von ausgeschnittener Vector-DNS (etwa 200 ng) werden mit 10 μ\ der obigen Proben (DNS-Fragmenten) die aus den verschiedenen Bal31-Digest8 nach der Beschreibung in Beispiel Ib resultieren) vermischt und in einem Gesamtvolumen von 20 ^jI in Gegenwart von 60 mM Tris/HCl, pH 7,5, 6 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP und 200 U von T4-DNS-Ligase 15 Stunden lang ligiert. Die Transduktion von kompsntenten Zellen des Stammes E. coli OMlOl erfolgt nach dem Handbuch "M13 Cloning and sequencing system" (M13 Clonierungs- und Sequenzierungs-

system), veröffentlicht von New Engfland Biolabe. Phagen von einer Anzahl weißer Plaques werden gezüchtet und hinsichtlich der Größe ihrer DNS-Inseri.8 durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHX analysiert,

d) Bestimmung von Bal31 Doletione-Endpunkten durch Sanger Sequenzierung (Deletionen von der Sail Stelle)

Die Sequenzierupj wird unter Anwendung des Didesoxy-DNS-Sequenzierungosystems von Sangor, u, a, [Proc. Natl, Acad, Sei« USA 74, 5463 (1977)J, wie sie in dem oben angeführten Buch beschrieben wird, vorgenommen. Die Deletionsendpunkte sind unten aufgeführt:

Clon Position des letzten Nucleotide der PH05-Sequenz (siehe Fig. 1)

A -502

B -471

C -422

D -400

E -392

F -369

G -350

H -328

I -300

K -283

L -255

M -226

N -211

O -187

P -111

Q "88

R -57

S -33

- 39 -

e) Bestimmung von Bal31 Deletions-Endpunkten durch Sanger Sequenzierung (De let ionen von der BamHI Stelle) '

Eine ähnliche Reihe von Bal31-Deletionen wird wie unter a bis c beschrieben vorgenommeni nur wird M13mp9 PHO5 Bam-Sel durch BamHI abgebrochen. Die Bal31-digerierten Moleküle werden durch EcoRI und Sail abgebrochen, und die erzeugten Fragmente werden in mit EcoRI und Sail digerierten M13mp9 cloniert. Die Deletioneendpunkte sind unten angeführt:

Clon Position des letzten Nucleotide der PHO5-Sequenz (siehe Fig. 1)

A¹ -24

B¹ -35

C -41

D¹ -48

E' -74

F' -89

G¹ -93

H¹ -97

I¹ -124

K* -162

L· -174

M* -262

N¹ -277

O¹ -306

P' -332

Q' -346

R¹ -361

S¹ -382

T¹ -393

- 40 -

f) Konstruktion von internen PHOS-Promotor-Deletionen

Die unter d) beschriebene Bal31-üeletion erzeugt ein "linker Arm" PH05-Promotorfragment_t das mit einer EcoRI-Stelle endet, und die unter e) beschriebene Bal31-Oolotion erzeugt ein "rechter Arm" PH05-Promotorfragment, das mit einer EcoRI-Stelle endet. Durch die Kombination von "linken Annen" und "rechten Armen" von verschiedenen Positionen werden interne Deletionen geschaffen, die ein EcoRI-Linkersegment an der Stelle der ausgeschiedenen DNS enthalten. Die einzelnen internen Deletionen werden durch Abbrechen der "linken Arme" und der "rechten Arme" von den M13mp9-Derivaten durch die Restriktions-Endonucleasen EcoRI und BamHI (linke Arme) oder EcoRI und Sail (rechtu Arme) und Isolierung der entsprechenden Fragmente mit Hilfe der unter b) beschriebenen vVeichagarosegel-Elektrophoreee konstruiert. Äquimolar< Mengen von "linken Armen" und "rechten Armen" und 200 ng BamHI- und Sall-digerierte M13mp9-Vector-DNS werden wie unter c) beschrieben ligiert. Nach der Transduktion in E, coli OMlOl werden weiße Plaques gesäbelt, RF wird erzeugt und durch Rostriktionsanalyee (SamHI, Sail, EcoRI) analysiert. Die folgenden Arme werden zur Schaffung spezifischer interner Deletionen kombiniert (zur Numerierung der Nucleotide siehe Fig. 1):

"Linker "Rechter Deletion von Arm" Arm"

A T' Λ 7

B T' Δ 8

C T ό 9

D S' 4 10

E R¹ Λ 11

F Q' /112

G P¹ Δ 13

H 0' Λ14

von	- bis	-394	Anzahl der aus geschlossenen Nucleotide
-501	biP	-394	108
-470	bis	-394	77
-421	bis	-383	28
-399	bis	-362	17
-391	bis	-347	30
-368	bis	-333	22
-349	bis	-307	17
-327	bis	21

£6?733

- 41 -

I N¹ ά 15 -299 bis -278 22

K M¹ t 16 -28? bis -263 20'

L L¹ ί 17 -254 his -175 80

M L¹ 4 18 -225 bis -175 51

N L¹ t 19 -210 bis -175 36

0 L' 4 20 -186 bis -175 12

0 K' J\ 21 -186 bis -163 24

0 Ι' Δ 22 -186 bis -125 62

0 H' Δ 23 -186 bis - 98 89

P H¹ 424 -110 bis - 99 13

P G¹ 4 25 -110 bis - 94 17

P F¹ Δ 26 -110 bis - 90 21

Q E¹ Δ 27 - 87 bis - 75 13

R D¹ Δ 28 - 56 bis - 49 8

R C* Δ 29 - 56 bis - 42 15

R B¹ ^ 30 - 56 bis - 36 21

S A¹ Δ 31 - 32 bis - 25 8

Beispiel 2: In vivo Analyse der internen Deletionen das PH05-Promotors

Die verschiedenen, in Beispiel If) beschriebenen Deletionen in Plasmid püDB207/PH05 cloniert £r. Haguenauer-ITsapis und A. Hinnen, Molecular and Cellular Biology, £,2668 - 2675 (1984)3, indem das Wildtyp-PHOS-Bam-Sal-Fragment durch die ausgesonderte Version ersetzt wird. Nach der Transformation von Hefestamm S, cerevisiae AH216 (siehe EU-PA 143.081) wird die Säurephoephatase-Aktivität wie von Tohe, u. a. beschrieben f O. Bacteriol. 113_, 727 (1973)] bestimmt. Die Deletionen Δ 11 und ά 12 zeigen eine etwa zehnfache Verringerung der PH05-Aktivltät und definieren eine Upstream-Region &("Up8tream· Aktivierungsstelle", UAS), die für die PHOS-Expreseion von Bedeutung ist. Eine ähnliche verminderte Wirkung ist bei Dele·

- 42 -

267 ?33

tion A 17 (etwa 5fache Verringerung) und für die TATA-Box-Ooletionen Δ 23 bie Δ 26 festzustellen (etwa 3Ofache Verringerung). Alle anderen Deletionen zeigen Aktivitäten von annähernd Wildtyp-Ausmaß. Diese Ergebnisse zeigen, daß drei Bereiche mit wichtiger Information für die PHOS-Expression an den folgenden Positionen vorhanden sind:

1. Zwischen den Positionen -349 und -383 (UASl)

2. Zwischen den Positionen -225 und -263 (UAS2)

3. Zwiechen den Positionen - 87 und -125 (TATA-Box)

DNS-Fragmente, die die UASl oder UAS2 oder UASl und UAS2 von PHO5 enthalten, können von Rekombinant-Phage Ml3mp9/PHO5-Bam-Sal (siehe Beipsiel 1) durch Spaltung mit entsprechenden Restrlktions-Endonucleasen erzeugt werden* UASl ist in einem 268 bp BamHI-Clal-Fragment vorhanden, das folgende Formel hat:

gatccgaaagttgtattcaacmgaatccgcaaatatgtcaacgtatttggmgtcatctta tgtgcgctgctttmtgttttctcatgtaagcggacgtcgtctataaacttcaaacgaaggt aaaaggttcatagcgctttttctttgtctgcacamgmatatatattamttagcacgttt tcgcatagmcgcmctgcacmtgccaammagtmmgtgattaamgagttmttgm taggcmtctctmatgmt.

UAS2 iet in einem 100 bp Clal-BatEII-Fragment mit folgender Formel vorhanden:

CGATACMCCTTGGCACTCACACGTGGGACTAGCACAGACTAMTTTATGATTCTGGTCCC TGTTTTCGMGAGATCGCACATCCCMATTATCAMTTG

UND BEIDE UASl und UAS2 sind in dem 368 bp BamHI-BstEII-Fragment mit folgender Hormel vorhanden:

- 43 - 267733

gatccgaaagttgtattcaacaagaatgcgc *\λtatgtcaacgtatttggaagtcatcttatgtgcgctgctttaatüttttctcatgtaagcggacgtctataaacttcaaacgaaggtaaaaggttüatagcibtttttctttgtctgcacaaagamtatatattaaattagcacg ttttcgcatag^a'igcmctgcacaatgccaaaaaaagtaaaagtgat taaaagagttaattgaataggcaatctctaaatgaatcgatacaaccttggcactcacacgtgggactagcacagactaaatttatgattctggtccctgttttcgaagagatcgcacatgccaaattatcaaattg.

Beispiel 3 j Konstruktion von verschmolzenen PHO5-GAPDH-Hybridρromοtoreη

Durch Beispiel 1 und 2 werden eine Region um Position -365 C UASK PHOS)I und eine andere Region um Position -180 fUAS2(PriO5)1 des PH05-Gens zu möglichen Kandidaten für UAS mit regulierenden Funktionen. UASl(PHOS) ist in einem 268 bp BamHI-Clal-Fragment enthalten, während beide UASl(PHOS) und UAS2(PH05) in einem 368 bp BamHI-ietEII-Fragmont enthalten sind. Diese beiden Fragmente sir.d je mit zwei unterschiedlichen GAPDH-Downstroam-Promotorelementen, die die TATA-Box und Transcriptions-Initiierungsstellon von GAPDH enthalten, verschmolzen,

a) Konstruktion einer Hefeqen-Sammlunci

Dreißig ^ig von totaler Hefe-DNS mit hoher relativer Molekülmasse £m. V. Olsen, u, a., 3, Mol, Biol,, 132_, 387 (1979)3 vom Wildtyp-i.t-arom S288C von Saccharomyces cerevisiae werden 30 min lang bei 37 ⁰C mit 2 Einheiten von EcoRI-Methylase (New England Biolabs) in 250 μΐ von EcoRI-Methylationspuffer nach Empfehlung dee Lieferanten inkubiert. DNS wird durch Ethanol ausgefällt, in 500 ^jI von 25 mM Trie.HCl, pH 8,5, 2 mM MgCl₂ (EcoRI⁺Puffer) [H, Meyer, FEBS Lett. 90, 341 (1979 resuspendiert und mit EcoRI (Boehringer) digeriert, bis die

- 44 -

Größenverteilung der DNS-Fragmente ein im Bereich von 30 bia 50 kb liegendee Maximum aufweist (ein Xhol Digest von k DNS ergibt entsprochende 33 kb und 17 kb Markierer). Oie unter ECoRI⁺ Bedingungen digerierte Hefo-DNS wird 6 h lang mit 38 000 U/min in einem SW λο Rotor auf einem Saccharose-Gradienten (5 bie 20 % Saccharose in 10 mM Trie-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA) grüßenfraktioniert. Dreißig Fraktionen von je 0,4 ml werden oben vor: dem Grndienten gesammelt. Fraktion 16 enthält DNS-Fragmente mit einer Größe von 30 bie 40 kb. Die DNS dieser Fraktion (3/jg)wird mit Ethanol ausgefällt und 16 Stunden lang bei 15 ⁰C in einem Geeamtvolumen von 15 ^jI bis 1 pl Cosmid-Vector pYcl £B. Hohn, u. a,, in "Genetic Engineering", Bd. 2, S. 169, New York 19803 , linearisiert durch EcoRI, liegiort. Die Ligation wird mit 300 U T4-DNS-Ligase (New England Biolabe) unter Verwendung des vom Lieferanten beschriobenen Puffer-Systems ausgeführt. Die DNS wird in vitro [in Bakteriophage A, eingebaut. £*B. Hohn in "Methods in Enzymology", Bd. 66, S. 299, New York 1979J und die vereinigten Phagen werden zur Umwandlung von E. coil Stamm HBlCl verwendet (r^, mJ~, leiT, recA). Der Wirkungsgrad der Umwandlung beträgt stwa 5000 ampicillin-resistente Kolonien Je ^ig pYcl-Vector. 3000 amp Kolonien werden gesammelt und einzeln in den Vertiefungen von Mikrotiter-Schalen in LB-Medium /TlO g Bacto-Tryptone (Difco), 5 g Bacto Yeast Extract (Difco), 10 g NaClJ, das 100 ^ig/ml Ampicillin enthält, gezüchtet.

b) Isolierung dee Hefegens GAPDH

Die oben beschriebene Gen-Sammlung wird mit einem synthetischen Oligonucleotid ^hergestellt unter Anwendung der Phospho· triester-Methodei K. Itakura, u. a,, O. Am, Chem. Soc. 97, 7327 (1975); O. F. M. de Rooij, u. a«, Reel. Trav. Chim.

- 45 -

Pays-Bas 913, 537 (1979)} der folgenden Struktur« 5'-GCTCCA

TCTTCCACCGCCCC-3' geecreent. IO ug dee Oligonucleofide

• ' -52

werden unter Verwendung von 10 ^jI P-ATP (3000 Ci/mMol, 10 ^jCi/p 1 Amereham) mit T4-Polynucleotld-Klnaee (Boehrlnger) In einem Geeamfc/olumen von 50 yul nach der Beschreibung von Maniatis, u. a., f "Molecular Clonlng"i Cold Spring Harbor Lab., 1982, Seite 125J kinasiert. Die Kolonie-Hybridisierung wird wie vom gleichen Autor beschrieben (Seite 312) vorgenommen. Positive Clone werden durch Autoradiographie unter Anwendung von Kodak Röntgenfilm X-5 nachgewiesen. Die Plaamid-DNS-Isolierung (siehe EU-PA 100.561) ergibt ein Hybridclon, das ein für GAPDH codierendes 2100 bp Hindll-Fragment enthält^ O. P. Holland, u. a., 3, Biol. Chem. 254. 9039 (1979)J . Der endgültige Beweis für die Authentität der clonierten DNS kommt aus dem DNS-Sequenzierungeexperiment unter Anwendung dee oben genannten Oligonucleotide in Verbindung mit dem Dideeoxy-Sequenzierungsprotokoll nach der Bjdclireibung von G. F. Hong £ Bioecienco Reports 1,, 243 (1901 )J für doppelsträngige DNS. Das clonierte GAPDH-Gen hat die gleiche Sequenz wie pgap491, veröffentlicht von Holland, u. a. £j. Biol. Chem. 255, 2596 (198O)J.

c) Herstellung der GAPDH Downetream-Promotorelemente (siehe Flg. 2 und 3)

Das 649 bp Faql-Fragmont, das die Positionen -27 bis -675 von dem ATG des GAPDH-Gens enthält (siehe Fig. 2), wird durch Digerieren des oben genannten Hybridplasrnids mit Taql (New England Biolabs), Trennen der DNS-Fragmente auf einem l,2iiigom weichen Agarosegel und Extrahieren der DNS durch heißes Phenol (siehe Beispiel 1) isoliert« Die Clonierung des Taql-Fragmentee wird in die Clal-Stelle von pBR322 vorgenommen: 1 pg pBR322 wird mit drei Einheiten von CIaI (New

- 46 -

,207

England Biolabs) nach der Beschreibung des Lieferanten gespalten» 300 ng des phenolisierten und abgebrochenen Vectors werden mit etwa 300 ng von Ineert-DNS (649 bp Taq Fragment) unter Verwendung von 200 U von T4-DNS-Ligaee in einem Gesamtvolumen von 2OjLiI (siehe Beispiel Ib) ligiert. Die Traneformatiop erfolgt in E. coli HBlOl für Ampicillin-Resistenz, Plasmid-DNS wird hergestellt und durch Restriktionsaialyse fTaql, DralJ analysiert. Die Orientierung des Taql-Fragmentes wird unter Verwendung von Restriktions-Endonuclease Oral in Kombination mit der BamHI-Stelle der Plasmide vorgenommen, und ee wird ein Plasmid ausgewählt, das die Taql-Scelle von Position -575 nahe der Hindlll-Stelle von pBR322 hat. Dieses pBR322/GAPDH bezeichnete Plasmid wird unter Verwendung von BamHI (New England Biolabs) lintarisiert, und es wird eine Digestion mit Ba131 wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, nur werden Bglll-Linker (5'-CAGATCTG-S', New England Biolabs) verwendet, und das digerierte Plasmid wird direkt mit einer Konzentration von 5 /ig/ml in einen Gesamtvolumen von 20/jl zirkuliert. Die Größe des Bal31-verkürzten Taql-Fragmentes wird durch Restriktionsanalyse (unter Verwendung von BgIII und Hindlll) bestimmt. Es werden zwei Clone ausgewählt, die DNS-Fragmente enthalten, die sich M-wa 200 bp und 265 bp von dem ATG aufwärts in den GAPDH- ^romotor erstrecken. Beide Fragment© enthalten die vermutliche TATA-Box von etwa -140 bp, Ciese Clone enthalten noch den Replikation8Ureprung in dem von pBR322 abgeleiteten Teil der DNS und werden als pGAPDH-F bzw. pCAPDH-E bezeichnet.

d) Kombinieren des Downetream-GAPOH-Elemontee mit UASl(PHOS) von PH05 und der Protein-Codierungsregion von Eglin C.

I) GAPDH-Elemente (siehe Fig. 3)

- 47 -

.267 733

Um die GAPDH-Promotorelernente von der Taql-Stelle an der Position -27 zu einer unmittelbar neben dem ATG de9' GAPDH-Gen8 gelegenen Stelle zu verlängern, werden zwei eynthetische komplementäre üligonucleotido der folgenden Struktur synthetisiert:

5' - CGAATA/ ^.CACACATAAATAAAG 3 '

3' TTATTTGTGTGTATTTATTTCTTAA 5¹

Diese Oligonucleotide liefern die echte GAPDH-Promotoreequenz von Position -26 bis Position -5 unter Erzeugung einer terminalen EcoRI-Stelle, jeweils zwei yg der Plaemide pGAPDH-E und -F werden mit 6 Einheiten γοη Taql in 50 ^jI digeriert, und die resultierenden Mischungen werden pheholisiert, mit Ethanol ausgefällt und in 10 ^jI Wasser resuspendiert. üie synthetischen Oligonucleotide werden gehärtet, indem 2 ^jI jedes Einzelstranges in 100 ^jI einer Lösung, die 10 mM Tris.HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl enthält, vermischt werden, 3 min lang auf 90 ⁰C erhitzt werden und die Lösung langsam auf Raumtemperatur abgekühlt wird (innerhalb von etwa 3 Stunden). Ein ^ig von jedem der Taql-digerierten Plasmide wird mit einem etwa zwanzigfachen Molüberschuß der gehärtete η Oligonuclectide in einem Volumnn von 20 jjl etwa 18 Stunden lang unter Verwendung von 800 U von T4-DNS-Llgase vermischt* Die gesamte Mischung wird mit 3 Einheiten von BgIII (Neo England Biolabs) digeriert, üie DNS-Fragmente worden aur einen l,5%iger. weichen Agarosegel getrennt. Die Bglll-EcoRI-Fragmehte von etwa 200 bp bzw. 265 bp werden aus dem Gel ausgeschnitten, extrahiert und mit Ethanol ausgefällt .

Plasmld pGAPDH-E wird mit BgIII und EcoKI digeriert, und das große (etwa 3,5 kb) Fragment wird isoliert. Dieses

267733

- 48 -

Fragment wird als Vector zur Clonierung der 265 bp und 200 bp Bglll-EcoRI-Fraginente unter Anwendung von Ligations-, Transformatione- und Plasmid-Isolierungsbedingun* gen nach obiger Beschreibung verwendet, Oie erzeugten Plasmide werden als pGAPDH-EL und pGAPDH-FL bezeichnet. Oie DNS-Sequenzen der in pGAPDH-EL und pGAPDH-FL. clonierten Bglll-EcoRI-Fragmente werden in Fig. 4 gezeigt. Die genaue Größe der Fragmente beträgt 266 bp bzw. 201 bp.

II) Das UASfPH05)-Regulatorelement

3 /Jg von Pla9mid p3l/Y (siehe EU-PA Nr. 100.561) werden mit 6 Einheiten von CIaI (New England Biolabs) digeriert. Die vertieften 3*-Enden werden in einer Reaktion mit dem Klenow-Fragment von E. coil DNS-Polymerase I (Bethesda Research Laboratories) nach Maniatie (supra) gefüllt. Bgllll-Linker (5'-CAGATCTG-S¹) werden wie in Beispiel 1 beschrieben hinzugefügte Die DNS wird mit Sail und BgIII (New England Biolabs) digeriert und auf einem l%igen weichen Agarosegel zum Laufen gebracht. Das 548 bp Fragment wird aus dem Gel ausgeschnitten, phenolisiert und mit Ethanol ausgefällt, wie oben beschrieben wird.

III) Konstruktion von P^asmid pJDB207R/PH05-EGL(siehe Fig. 5)

^e Plasmidfiet eine Quelle eines DNS-Fragmentes, das aus der Eglin C-Codierungsregion und dem PH05 Transcriptionsterminator zusammengesetzt ist.

A) Isolierung des pJDB207 Vectorfragmentes

Sechs Jig von Plaen>id p3DB207R/IF(ei,-3) (EU-PA Nr. 100.561)

- 49 -

werden bis zur Vollständigkeit mit Restriktions-Endonuclease BamHI digeriert. Die resultierenden DNS-Fragmente mit einer Größe von 6,85 kb und 1,15 kb werden durch Ethanol ausgefälltund in 400 jjl von 50 mM Trie.HCl, pH 8,0, resuspendiert. 4,5 Einheiten von alkalischer Kalbsdarmphosphatase (Boehringer,Mannheim) werden zugesetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde lang bei 37 ⁰C inkubiert. Anschließend wird die Phosphatass durch einstündige Inkubation bei 65 C inaktiviert. Oie Lösung wird auf 150 mM NaCl eingestellt. Die DNS-Lösung wird auf ein 100-ul-Bett von DE 52 (Whatman) Ionenaustauscher aufgegeben, mit 10 mM Tris.HCl, pH 7,5 äquilibriert, die 160 mM NaCl und 1 mM EDTA enthält. Nach dem Waschen mit dem gleichen Puffer wird die DNS mit 400 μΐ von 1,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA eluiert und durch Ethanol ausgefällt. Das große 6,85 kb BamHI-Fragment wird von dem kleinen Fraement auf einem 0,6%igen niedrigschmelzenden Agaroeegel in Tri8-Borat-EDTA-Puffer, pH 8,3, getrennt.

B) Isolierung eines 534 bp PH05-Promotorfragmentes

Zehn jig von Plasmid p31/R (EU-PA Nr. 100.561) werden mit den Restrikliv/iie-Endonucleaeen EcoRI und BamHI digeriert. Die resultierenden 3 Fragmente werden auf einem 0,6%igen niedrigschmelzenden Agarosegel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH 8,3, getrennt. Ein 534 bp BamHI-EcoRI-Fragment wird isoliert, das den PHO5-Promotor einschließlich der mRNS-Startstellen enthält.

C) Isolierung eines 221 bp DNS-Fragmentes, daa die Codierungssequenz für Eplin enthält

Acht ^g von Plasmid pML147 (EU-PA Nr. 146.785) werden mit

- 50 -

73t

den Re8triktions-Endonucleasen BamHI und EcoRI digeriert. Die resultierenden zwei DNS-Fragmente werden auf einem 0,6%igen niedrig-schmelzenden Agaroeegel in Tria-Borat-EDTA-Puffer, pH 8,3, getrennt. Das 221 bp Fragment wird isoliert.

D) Ligation von DNS-Fragmenten

Drei oben beschriebene DNS-Fragmente (Beispiele 3dIIIA-C) mit entsprechenden klebrigen Enden werden in einer Reaktion ligiert: 0,1 pMol (0,45 /Jg) des 6,85 kb BamHI-Vectorfragments, 0,2 pMol (70 ng) des 534 bp BamHI-EcoRI-PHOS-Promotorfragments und 0,2 pMol (29 ng) des 221 bp EcoRI-BamHI-Fragments von pML147 werden ligiert. Alle drei DNS-Fragmente sind in einem kleinen Gelblock von niedrig-schmelzender Agarose enthalten. Die drei Stücke Agarosegel werden zusammengenommen, bei 65 C verflüssigt und zweimal verdünnt. Die Ligation erfolgt in einem Gesamtvolumen von 270^1 von 60 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP mit 16 Einheiten von T4-DNS-Ligase (Boehri.nger, Mannheim) 16 Stunden lang bei 15 ^VO. Eine 10-jjl-Ali quote des Ligatio'nsgemisches wird zu 100 ^jI mit Calcium behandelten kompetenten Transformationszellen ^{von E}* ^col3L HBlOl gegeben,

24 transformierte amp Kolonien werden einzeln in LP-Medium gezüchtet, das :IOO ^g/ml Ampicillin enthält. Plasmid»DNS wird nach der Methode von Holmes, u. a, £ Anal. Biochem. 114, 193 (198I)J hergestellt und durch Hindlll/EcoRI-Doppeldigestion analysiert. Das Erscheinen eines 600 bp EcoRI-Hindll-Fragmentee zeigt, daß das betreffende Clon das PHOS-Promotor-Eglin C-DNS-Fragnient in den Expressionsvector xn dt.· richtigen Orientierung eingefügt hat* Wie erwartet haben etwa 50 % der Clone einen Iisert in der richtigen Orientierung. Einer dieser Clone wird ι isoliert und als pJDB207R/PH05-EGL bezeichnet ·

- 51 - ^ο'^τ r«33

Seche jjg Plasmid pJDB207R/PH05-EGLworden hie zur Vollständigkeit mit den Restriktions-Endonucleason Hindlll und Sail digeriert. Das große 6,1 kb (Vactorteil) Fragment wird durch Weichagarosegei-Elektrophoreae, Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation isoliert. Die Vector-DNS "-'.rd in 20 μΐ Wasser resuspendiert. Daa Eglin-Fragment wird durch Digestion ^won pJ0B207R/PH05-EGL mit Hindlll und EcoRI geschaffen. Due resultierende 600 bp Fragment wird durch Weichagaroeegel-Elektrophorese getrennt, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Dae Eglin-Fragment wird in 20 ^l H₂O resuependiert.

IV) Ligation der Fragmente unter Verwendung von UASl(PHOS-Elementen (siehe Fig. 6)

Die Ligation wird unter Anwendung der folgenden vier Komponenten vorgenommen: 0,5 yg des 6,1 kb Hindlll-Sall-Vectorfragmentes, 100 ng des 600 bp EcoRI-HindllT-Eglin C-Kragmentes, 200 ng des 266 bp Bglll-EcoRI-Fragmentes von pGAPDH-EL und 100 ng dos 548 bp Sall-Bglll-Fragmentes, das UASl(PHOS) aufweist« Oie Ligation wird wie oben ausgeführt. Die Transformation von E, coil HBlOl für Ampicillin-Resistenz, die Plasmidisolierung und die Restriktionsanalyse von positiven Clonen werden nach obiger Beschreibung vorgenommen« wobei die Reetriktione-Endonucl&asen Hindlll, EcoRI, BgIII und Sail verwendet worden» Eq wird ein positives Clon ausgewählt und als p3DB207/PAPEL-EGL (UASl) bezeichnet.

Es wird eine analoge Konstruktion mit dem 201 bp BgIII-EcoRI-Fragment von pGAPDH-FL ausgeführt. Das erzeugte Plasmid wird p3DB207/PAPEL-EGL(UASl) genannt.

- 52 -

V) Konstruktion von Hybriden mit UASl(PHOS) und UAS2(PH05)-Elementen

3 wg der obigen Plasmide (siehe IV) werden mit BgIII digeriert. Nach der Phenoloxtraktion und Ethanolpräzipltation wird die DNS in Wasser resuspendiert. Die vertieften 3'-Enden werden mit Klenow-DN.^rj-Polymerase wie unter II) beschrieben ausgu illt. D.le Plasmide werden 10 min lang auf 70 ⁰C erhitzt, um das Enzym zu inaktivieren. Nach der Digestion mit Sail (Biolabs) werden die großen Fragmente (etwa 7,2 kb) durch Weichagarosegel-Elektrophoreso und Phenolextraktion isoliert, und die durch Ethanol ausgefällte DNS wird in Wasser resuspendiert.

In einer ähnlichenWeise wird Plasmid p31/Y mit BstEII digeriert, mit DNS-Polymerase (Klenow Fragment) behandelt und mit Sail gespalten. Das 651 bp Fragment wird nach obiger Beschreibung isoliert. Die Ligation von 200 ng der obigen Vector-DNSn mit dem 651 bp Fragment ergibt die folgenden Plasmide j

p0DB207/PAPEL-EGL (UASl + UAS2) (das das 266 bp Bglll-EooRI-Fragment von pGAPDH-EL aufweist)

pODB207/PAPEL-EGL (UASl 4 l'*.S2) (das das 201 bp Bglll-EcoRI-Bragment von pGAPDH-FL aufweist)·

Beispiel 4:

o) Transformation von Saccharomyces cerevisiae GRF18

Die vier Plasmide von Beispiel 3dIV und 3HV werden Jeweils in den Saccharomyces cerevisiae Stamm GRF18 (o£ , his3-ll,

. 53 -

his3-15, Ieu2-3,.leu2-112, can ) unter Anwendung dee von Hinnen, u, a, beschriebenen Transf onnationsprotokolls fProc. Nail. Acad. Sei. USA 75_, 1929 (1978)3 eingefügt. Traneformierte Hefezellen werden auf liefe-Minimalmedium-Platten mit Leucin-Mangel auegewählt. Einzelne transformierte Hefekolonien werden ieoliert und als Saccharomyces cerevieiae GRF18/püDB2O7/PAPEL-EGL (UASl), /PAPEL-EGL (UASl), /PAPEL-EGL (UASl + UAS2) und /PAPEL-EGL (UASl + UAS2) bezeichnet.

b) Fermentation der Tranef ο rmar. ten

Zellen der vier S. cerevielae GRF18 Transformanten werden jeweils in 10 ml von Hofe-Minimalmedium (Oifco Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren, dem 2 % Glucose und 20 ml/1 L-Hietidin zugesetzt wurden) in einem Erlenmeyorkolben 24 Stunden lang bei 30 ⁰C unter Schütteln bis zu einer Dichte von 3 κ 10 Zellen/ml gezeüchtet. Die Zellen werden in 0,9%igein WaCl gewaschen und zum Inokulieren von 50 ml eines starken P.-Mediums (wie oben) und eines schwachen P.-Minimalmediums, hergestellt mach der Rezeptur von Difco Yeqst Nitrogen Base Medium (ohne Aminosäuren) mit 0,03 g/l KH₂PO₄, 1 g/l KCl, 10 g/l L-Asparagin anstelle von (NH₄J₂SO 2 % Glucose und 1 g/l L-Histidin verwendet. Das Medium wird bis zu einem Ausgangs OD __ ^von 0,03 inokuliert. Die Zellen werden in einem 500-ml-Kolben 24 Stundon lang bei 30 ⁰C gezüchtet (OOßQOnm ^{= 1|8 iür 8cnwacne8} P^0D600nm ^{a 3}*° ^{für 8tarke8} P₁

c) Bestimmung von Eglin C Titern

Wenn die Zellen eine wie oben angegebene Zelldichte (00)

17	0,7
14	1
11	0,7

- 54 -

erreicht haben, werden die Zellen geerntet, zentrifugiert und durch Glaspirlen zerrissen. Die Mischungen werden auf Eglin-Aktivität hin analysiert, indem die Inhibition von Human-Leucozyten-Elastase nach der Methode von U, Soemueller u. a. fHoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 358, 1105 (1971)J gemessen wird. Die folgenden Aktivitäten wurden ermittelt:

Extrakt von Eglin C Aktivität (mg/l/OD

S. cerevisiae der Kultur)

" induziert (schwaches nicht indu-

P.) ziert istar-

kes ρ.)

p0DB207/PAPEL-EGL (UASl) 14 0,7

paDB207/PAPEL-EGL (UASl)

p0DB207/PAPEL-EGL (UASl + UASl)

pCJDB207/PAPEL-EGL. (UASl + UAS2)

Beispiel5: Expression von üesulfatohirudin unter der Kontrolfl eines PHOS-GAPDH-Hybridpromotors

I, Einstellung der Nucleotid-Sequenz an dem 5'-Ende des Desulfatohirudln-HVl-Gens

Die für Deeulfatohirudin codierende Nucleotid-Sequenz (siehe EU-PA 168.342) beginnt mit GTT, das für NH₂-Terminal-Valin in dem fertigen Genprodukt steht. Zur zweckmäßigen Subclonierung und Expression in E. coli wurde die Codierungssequenz an dem 5'-Ende durch acht Nucleotide, einschließlich einer EcoRI-Restriktionsetelle und eines ATG-Initiierungscodons verlängert. Für die exakte In-Frame-Fusion der Hirudin· Codierungssequenz zu der für dae PH05-Signa!peptid codierenden Sequenz müssen diese zusätzlichen Nucleotide entfernt werden. Das wird durch die Umwandlung der EcoRI-Retriketionsetelle in eine fluchtgerechte Endstelle, Hinzufügen eines

. 55 -

synthetischen OlJLgonucleotlds, das eine Hgal-Erkonnungsstello in einer aolchen Position enthält, daß die anschllefiende Spaltung mit Hgal unmittelbar vor (upstream) dem GTT-Codon erfolgt, erreicht.

Elnfüqunn einer Hqa >Restril<tion88telle _i vor dem Desulfatohirudln-Gen (siehe Fig. 7)

8 jjg von Plaemid pML3lC (siehe EP 168.342) werden bis zur Vollständigkeit mit der Restriktions-En^onucleaee EcoRI digeriert, üie DNS (pMLSlO/EcoRI) wird mit Phenoi/Chlorofonn extrahiert und mit Ethanol auegefällt. Überhängende 5'-Enden werden durch Nuclease A * entfernt. 4 Jig von pML3lO/ EcoRI-DNS werden in 100 ^l von 250 mM NaCl, 1 mM ZnSO₄, 30 mM Natriumacetat, pH 4,6, mit 20 U/ml Nuclease S₁ (Sigma) 45 min lang bei 37 ⁰C digeriert.

Die DNS wird mit Phenol/Chloroform extrahiert und durch Ethanol auegefällt. Die DNS (pMLSlO/EcoRI/Sj, wird in

100 μΐ von 50 mM Trie.HCl, pH 8,0, resuspendiert und mit2 Einheiten alkalischer Kalbsdarm-Phosphatase (CIAF, Behringer)eine Stunde lang bei 37 ⁰C inkubiert. Das Enzym wird 1,5

Stunden lang bei 65 ⁰C inaktiviert.

Die NaCl-Konzentration in dem Inkubationsmedium wird auf 150 mM eingestellt. Die dephosphorylierte DNS (pML.310/ ECORIZS₁ZCIAp) wird durch Adsorption auf einer Ionenaustauschsäule DE52 (Whatman) in einem schwachen Salzpuffer (150 mM NaCl, 10 mM Tris.HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) gereinigt und danach mit einer starken Salzpufferlösung (1,5 M NaCl, 10 mM Tris.HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) eluiert. Die DNS wird mit Ethanol ausgefällt und in H₃O mit einer Konzentration von 0,8 mgZml resuspendiert.

- 5G -

46?733

Pin Oligonticleotid der Formel 5'-AGCGTIiGACGCT-S¹

wird mit Hilfe der Phosphatriester-Methode synthetisiert fltakura, u. a., 3. Am. Chem. Soc. 103, 706 (1901)]. Die Sequenz des Oligonucleotids ist selbst-komplementär und enthält die Erkennungsstülle -GACGC- für Restriktions-tndonuclease !Igal, Hortung von zwei Einzelsträngen führt zu einem doppelst rängigen ÜNS-Linker von 12 Basenpaaren.

1,2 ^ug des synthetischen einsträngigen Oligodeeoxynuclootide werden in 10 ^iI von 60 mM Trie.HCl₁ pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 30,UCi von £^-³²P ATP (3000 Ci.mMol"¹, Amersham) und 6 Einheiten von T4-Polynucleotid-Kinase (Boehringer) 30 min lang bei 37 ⁰C phoephoryliert, worauf ein "Treiben" ( chase) von 15 Minuten bei 37 ⁰C in Gegenwart von 0,5 mM ATP folgt. Die Mischung wird weiterhin 10 Minuten lang bei 75 ⁰C inkubiert, um das Enzym zu inaktivieren, und wird dann zum Abkühlen auf Raumtemperatur zum Härten stehen gelassen.

0,6 jjg (170 pMol) der P-markierten Linker-DNS werden 'mit 2,4 |ig (1,75 pMol-ErHen) von pMLSlO/EcoRT./Sj/CIAP vermischt und in 20^1 von 60 mM TrIs.HCl, pH 7,E, 10 mM MgCl₂, 5 mh OTT, 3,5 mit ATP, 800 Einheiten von T4-CNS-Ligase (Biolabs) 20 Stunden lang bei 15 ⁰C ligiert. Die Ligase wird 10 min lang bei 85 ⁰C inaktiviert, und der Überschuß f-.n Linkermolekülen wird durch Präzipitatlon der HNS in Gegenwart von 10 mM EDTA, pH 7,5, 300 mM Natriumacetat, pH 6,0, und 0,54 Volumen Isopropanol entfernt. Nach 30 min bei Raumtemperatur wird die DNS pelletislert, in 45 μΐ Ligationsg^misch (oben spezifiziert) resuspendiert und 6 Stunden lang bei 15 ⁰C zur Bildung von kreisförmigerDNS ligiert.

- 57 -

J26?

Aliquoten von 1 /Jl und 3 μΐ des Ligationogemischee werden zu 100 pl mit Calcium behandelten kompetenten Transformations Ε« coli HBIOI-Zellen ^hergestellt nach der Methode von D, Hanahan, O. Biol, Chem. 166. 557 (1983)^ gegeben. D.io Zellen werden 30 min lang auf Eis stehen gelassen, danach 3 min lang bei 42 ⁰C inkubiert, 2 min lang auf Eis gekühlt und anschließend eine Stunde lang bei 37 ⁰C in 400 jjI SOC-Medium inkubiert* Die Zellen werden in jeweils 100 ^jI konzentriert A und auf LB-Agarplatten, die 50 ^ig/ml Ampicillin enthalten, aufgostriehen.

12 transformierte amp"-Kolonien werden einzeln in LB-Medium, das 100 ^jg/ml Ampicillin enthält, gezüchtet. Plasmid-DNS wird nach der Methode von D. S, Holmes, u. a.^Anal. Biochem. 114, 193 (198I)J hergestellt« Das Vorhandeneein des synthetischen Oligonucleotid-Linkers wird durch DNS-Sequenzierung bestätigt, wobei ein einsträngiges DNS-Fragment als Primer verwendet wird, der zu dem Codierungsstrang von Hirudin hybridisiert. Ein Clon,dae die Linker-DNS an der richtigen Stelle vor dem Hirudin-Gen enthält, wird als pML3lOL be»- zeichnet.

II. Fusion der PH05-Signalseguenz und des Desulfatohirudin-Strukturgens

a) Isolierung des 0,2 kb Desulfatohirudin-Fragmentes (siehe Fig. 7)

12 yug von Plasmid pML3lOL wurden bis zur Vollständigkeit mit den Restriktions-Endonucleasen BamHI und Pvul digeriert. Nach der Extraktion der DNS durch Phenol/Chloroform und Ethanolpräzipitation werden die beiden Roetriktionafragmente

- 58 -

auf einem l,2%lge>n Agaroeegel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH 8,3« getrennt. Das mit Ethidiumbrornid gefärbte 0,84 kb PvuI-BamHI-Fragment wird in einer Gelecheibe isoliert. Die DNS wird in einem mit 3 ml 0,2 χ TBE-Puffer gefüllten Dialysebeutel elektroeluiert« Der geschlossene Beutel wird in T'IE-Puffer, pH 8,3 (90 mM Tris-Base, 90 mM Borsäure, 2,5 mM EDTA) eingetaucht. Nach 30 min bei 100 mA wird die Polarität des Stromes 45 see lang umgekehrt, um die DNS von der DialyGomembran abzustoßen. Der die Gelscheibe in dem Dialyeebeutel umgebende Puffer wird zurückgewonnen, auf 150 mM NaCl eingestellt und durch eine Ionenauetauschersäule DE52 (Whatman) geleitet* Die DNS wird mit einem starken Salzpuffer )1,5 M NaCl, 10 mM Tris.HCl, pH 8,0, 1 r.iM EDTA) eluiert, mit Ethanol ausgefällt und wieder in H₃O ...ic einer Konzentration von 0,1 mg/ml gelöst.

Das 0,84 kb PvuI-BamHI-Fragment von pML310L wird weiter mit Restriktions-Endonuclease Hgal digeriert. Dieses Digest erzeugt ein 198 bp Hgal-BamHI-Fragment, das die vollständige Codierungssequenz für auegereiftes Deeulfatohirudin enthält. Zusätzliche Alul-Digestion berührt das 198 bp Hgal-BamHI-Fragment nicht, eliminiert aber ein anderes Hgal-Fragment von ähnlicher Größe.

Das 0,2 kb Hgal-BamHI-Fragment wird auf einem l,5%igen Agarosegel in TBE«Puffer von anderen Fragmenten getrennt und durch Elektroeluierung (nach obiger Beschreibung) isoliert. Die DNS wird durch DE52-Ionenaustausch-Chromatographie und Ethanolpräzipitation gereinigt. Die DNS wird in H₃O mit einer Konzentration von 30 ^ig/ml (0,2 ρΜυΐ/μΙ) resuspendiert.

- 59 -

.,26V733

b) Isolierung der PH05-Promotorregion mit einem Teil der PH05-Signalsequenz (aieha Fig. 8)

Plasmid P31/PHO5-TPA18 (eieho EU-PA Nr. 143.081) weiet den PH05-Promotor und die PH05-S:i.gnalsequ6,iz "in Frame" verschmolzen mit einem fremden Btrukturgen (t-PA) auf. Ein 584 bp BamHI-Ball-Fragment enthält den PH05-Promotor und die gesamte PHOS-Signalsequenz, jedoch acht Nucleotide an dem 3'-Ende.

8 fjg von P31/PH05-TPA18-DNS werden mit der Restriktions-Endonuclease Ball digeriert (16 Stunden lang bei 37 ⁰C). Die DNS wird durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation gereinigt. Die DNS wird in HgO mit einer Konzentration von 0,7 mg/ml resuspendiert.

Die einwandfreie Verbindung zwischen der PH05-Signaleequenz und der Cod ie rungs reg ion für Desulfatohirudin wird durch einen synthetischen Linker der- folgenden Formel geschaffen

(1) 5'-CCMTGCA-S'

(2) 3'-GGTTACGTCAACA-S'

Acht Nucleotide an dem 5'-Ende des Linkers (5'-CCAATGCA) stellen einen Teil der PH£5-Signalsequenz von der Ball-Stelle bis zur Bearbeitungsstelle dar. Die 5' überhängenden fünf Nucleotide von Oligonucleotid (2) paesen in die Hgal-Spaltungsstelle an dem 5'-Ende der Desulfatohirudin-Codierungssequenz.

Die einzelnen einsträngigen Oligonucleotido (1) und (2) werden mit Hilfe der Phosphotriester-Methode (Itakura, u. a«,

- 60 -

?33

supta) synthetisiert. 1,1 j.ig und 1,8 ug der Oligonuclertide (1) bzw. (2) werden an ihren 5'-Enden einzeln phosphoryliert, in äquimolaren Mengen vermibcht und wie in Beispiel 51 beschrieben gehärtet,

1,3 /Jg (200 pMol) der phosphorylierten, doppelsträngigon Linker-DNS wird zu 7 ^Jg (1,8 pMol) von Ball-gespaltetem P31/PH05-TPA18 in 40 ^il von 60 mM Tris.HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 3,5 mM ATP, 5 mM DTT und 1400 Einheiten von T4-DNS-Ligase (Biolabs) 16 Stunden lang bei 15 ⁰C ligiort. Die Ligase wird 10 min lang bei 85 ⁰C inaktiviert. Der Überschuß an Linkern wird durch Precipitation der DNS in Gegenwart von 10 mM EDTA, 300 mM Natriumacetat, pH 6,0, und 0,54 Volumen Isopropanol entfernt. Die DNS wird resuspendiert und weiter mit Restriktione-Endonuclease BamHI digeriert. Nach der Extraktion der DNS durch Phenol/Chloroform und Ethanol-Präz.lpitation werden die beiden Restriktionsfragmente auf einem l,2%igen Agarosegel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH 8,3, getrennt. Das 0,6 kb Fragment wird von dem Gel isoliert. Die DNS wird elektroeluiert und weiter durch DE52-Ionenaustausch-Chromatographie

und Ethanolprä^xpitation gereinigt. Das 0,e kb BamHI-Hgal-DNS-Fragment wird in Η«0 mit einer Konzentration von 40 pg/ml resuependiert.

c) Isolation eines pJDB2O7~Hefevektorfra_rqwentes (siehe Fig.8)

9 /jg von Plasmid pJDB207R/PH05-TPA( 12-2) DNS (siehe EU-PA 143.081) werden mit der Restriktions-Endonuclease BamHI digeriert. Nach vollständiger Digestion wird die DNS durch Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Die DNS wird in 50 mM Tris»HCl, pH 8,0, mit einer Konzentration von 0,1 mg/ml resuspendiert und mit 7 Einheiten alkalischer

- 61 - 367723

KalbbJarm-Phosphatase ein9 Stunde lang bei 37 ⁰C digeriert. Dje Phosphatase wird 1,5 Stunden lang bei 65 ⁰C inaktiviert, und die DNS wird durch DE52-Ionenaustau8ch-Chromatographie (sieh© Beispiel 51) und Ethanolprözipitation gereinigt. Das 6,8 kb große BsmHI-Fragmont wird auf einein 1,feigen Agarosegel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH 8,3, getrennt. Die DNS wird elektroeluiert und durch DE52-Ionenau8tau8ch-Chromatographie und Ethanol-Prözipitation gereinigt« Die DNS wird in H₂O mit einer Konzentration von 0,4 mg/ml (0,1 pMolAil) gelöst. .

d) Ligation des PH05-Promptorfragmentes und dee Desulfatohirudin-Strukturgens an das p0DB207 Hefevectorfragment (siehe Flg. 8)

Der pODB2O7 Hefevector, das PH0!5-Promotorf ragment mit der PH05-Signalsequenz und das Desulfatohirudin-Strukturgen werden alle als DNS-Fragmente isoliert (siehe Beispiel a-c), die zur Bildung eines Expressions-Plasmids ligiert werden*

0,3 pMol des 0,6 kb BamHI-Hgal-Fragmentes von p31/PH05-TPA18 und 0,3 pMol des 0,2 kb Hgal-SamHI-Fragmentes von pML310L werden mit 0,1 pMol eines 6,8 kb BamHI-Fragmentes von pODB 207R/PH05-TPA (12-2) in 10/jl von 60 mM Tris.HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 1 mM ATP und 400 Einheiten von T4-DNS-Ligase 20 Stunden lang bei 15 ⁰C ligiert.

Eine Ι-μΙ-Aliquote des Ligationsgemisches wird zu 100 μΐ Transformatione-kompetenten E.coil HBlOl-Ze?len gegeben, die nach Hanahan (supra) hergestellt wurden. Das Transformationsprotokoll wird gleichfalls aus dieser Veröffentlichung übernommen. Die Zellen werden auf LB-Agarplatten, die 50 ug/ml

- 62 - J26V

Ampicillin enthalten, aufgestrichen.

24 amp Kolonien werden einzeln in LB-Medium mit 100 /ig/ml Ampicillin gezüchtet. Plaemid-DNS wird durch Spaltung mit Restriktiono-Endonucleaso Pstl hinsichtlich Größe und Orientierung des Inserts analysiert. Ein einzelnes Clon mit der richtigen Orientierung dos Inserts wird als p3DB207/PH05-HIR bezeichnet·

III) Herstellung von Plaemid pODB207/PH05(Eco)-HIR (siehe Fig. 9)

Zur einfachen Verbindung der UAS^PHOSj- GAPDH-hy br id ρ romot orelemente mit der Codierungsrogion von Doeulfatohirudln, das die PHOS-Sicinalsequenz enthält- (wie in Plasmid p3DB207/PH05-HIR)₁ wird eine EcoRI-Reetriktionsstelle in die nicht-umgewandölte 5*-Region zwischen den mRNS-Startstellen und dem ATG der Codierungsregion eingefügt.

15 /jg von Plasmid püDB207/PH05-HIR werden mit Restriktione-Endonuclease Dral (Boehringer) digeriert. Die resultierenden 4 Fragmente werden auf einem 0,8%igen Agarosegel in Trio-Borat-EDTA-Puffer, pH 8_f3, getrennt. Das 4,2 kb DNS-Fragment wird aus dom Gel zurückgewonnen, elektroeluiert und durch Ethanol ausgefällt. Die DNS wird in H₂O mit einer Konzentration von 0,6 mg/ml rosuependiert.

Zwei synthetische Oligonuclootide der Formel

5'-AATTCGATTACCAATGTTT-S' 3 ' - GCTAATGGT TACAM- 5 *

(2,3 }jg bzw. 2,9 μg) werden jeweils in 20 ^jI von 60 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 0,5 mM ATP und 20 U von T4-Polynucleotid-Kinaoe (Boohringer) kinasiert. Nach 45 mm

- 63 -

733

bei 37 ⁰C werden die boiden Reaktionsmischungen zusammengenommen, IO min lang auf 76 ⁰C erhitzt und zum Abkühlen auf Raumtemperatur stehen gelassen, üer gehärtete Oligonucleotid-Linker wird bei -20 ⁰C aufbewahrt.

6,5 ^g (2,3 pMol) des 4,2 kb üral-DNS-Fragmentes werden 16 h lang bei 15 ⁰C mit einem 70fachen Überschuß des kina-9ierten und gehärteten Oligonucleotid-Linkers in 50 pl von 60 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgGl₂, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP und 800 Einheiten von T4-0NS-Ligaee (Biolabs) inkubiert. Nach der Inaktivierung der T4«DNS-Ligaee über einen Zeitraum von 10 min bei 85 ⁰C werden die überschüssigen Linker durch Präzipitation der DNS in Gegenwart von 10 mM EDTA, 300 mM Natriumacetat, pH 6,0, und 0,54 Volumen Isopropanol entfernt. Die DNS wird mit EcoRI und Hindlll digeriert. Die resultierenden Fragmente werden auf eihem l%igon Agarosogol in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH 8,3, getrenn'.. Das 643 bp Fragment wird aus dem Gel durch Elektroeluierung und cthanolpräzipitation zurückgewonnen. Die DNS wird mit einer Konzentration von 0,1 pMol/jUl resuspendiert. Das, EcoRI-Hindlll-Fragment enthält die PHOJj-Signalsequenz, die Codierungssequenz von Desulfiitohirudin und den PHOS-Transcriptionsterminat)r.

Das 534 bp PH05-Promotorfraqment wird von Pl.aemiJ p31/R isoliert (EU-PA 100.561).

Zehn jjg p31/R werden mit den Rest riktions-Endoniicleaaen EcoRI und BamHI digeriert. Die resultierenden 3 Fragmente werden auf einem 0,6%igen niedrigschmelzenden Agarosegel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH 8,3, getrennt. Ein 534 bp BamHI-EcoRI-Fragmant wird isoliert, da6 de.i PH05-Promotor einschließlich der mRNS-Startetellen enthält.

- 64 -

,367 733

Dae Vectorfragement wird von Plaemid pODB2O7/PHO!3-HIR isoliert.

6 lig dieses Plasmide werden mit BomHI und Hindlll digeriert. Das große 6,5 kb BanHI-Hindlll-Fragment wird auf einem 0,6/tjigen niedrig-schmelzenden Agaroeegel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH 8,3, von dem kleinen Fragment getrennt.

Drei oben beschriebene Dl^s-Fragmente mit den er.toprechenden klebrigen Enden werden in folgender Reaktion llgiert: 0,2 pMol (70 ng) dea 534 bp BamHI-EcoRI PH05-Promotorfragmentes, 0,2 pMol (85 ng) des 643 bp EcoRI-Hindlll-Fragmentes (Hirudin-Codierungscequenz) und 0,1 pMol (0,4 yg) des 6,5 kb BamHI-Hindlll Vectorfragmentes werden in 10 μ! von 60 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, ImM ATP und 400 U von T4-DNS-Ligase 6 h lang bei 15 ⁰C ligiert. Eine 1-^il-Aliquote des Ligationsgemieches wird zu 100 yl mit Calcium behandelten Transformatione-kompetenten E. coil HBIOI-Zellen gegeben.

12 transformierte amp Kolonien werden einzeln in Lß-Me,dium, das 100 ^jg/ml Ampicillin enthält, gezüchtet, Plasmid-DNS wird nach der Methode von Holmes, u, a. TAnal, öiochem. 114, 193 (1981)3 hergestellt und durch die EcoRI und BamHI Restriktionsdigeetn analysiert. Ein Clon mit den erwarteten Restriktionsfragmenten wird ieoliert und als ρODB207/PH05 (eco)-HIR bezeichnet.

IV) Ligation der UAS1(PH05)-GAPDH-Hybridpromotoren an die Protein-Codierunqsreqion von Desulfatohirudln

15 /ig von Plasmid p30B207/PH05CEco)-HIR werden mit EcoRI und Hindlll digeriert. Die ONS-Fragmente werden auf einem

- 65 -

Agarosegel in Trie-Borat-EüTA-Puffer, pH R,3, getrennt. Das 643 bp Fragment wird von dem Gel isoliert, elektroeluiert und mit Ethanol ausgefällt. Die DNS wird in HgO mit einer Konzentration von Ο,.ΐ pMol/ul resuependiert,

6 yug von Flaamid p3DB207/PH05-HIR werden bie zur Volletöndigkeit mit den Restriktione-Endonucleasen Hindill und Sail digeriert. Das große 6,3 kb Fragment (Vectorteil) wird durch Weichagarosogel-Elektrrophorese, Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation isoliert. Das Vector-DNS-Fragment wird in 'IgO mit einer Konzentration von 0,05 pMol/yl resuspendiert.

3.0 ^g von Plasmid pGAPDH-EL (siehe Beispiel 3dl) werden mit BgIII und EccRI digeriert. Das 266 bp Bglll-EcoRI-Fragmont wird auf einem l,2⁽,6igen Agarosegel in Trie-Borat-EDTA-Puffer, pH 8,3, getrennt, von dem Gel elektroeluiort und mit Ethanol auegjföllt. Die DNS wird in HgO mit einer Konzentration von 0,3 pMol/μΙ resuspendiert.

0,3 pMol des 548 bp Sall-Bglll-Fragmentes, das UASl(PHOS) aufweist (Beispiel 3dII), 0,3 pMol des 266 bp Bglll-EcoRI-Fragmentes von pGAPDH-EL, 0,3 pMol des 643 bp KcoRI-Hindll-Fragmentos von p3DB207/PH05(EcO)-HIR und 0,12 pMol des fi,3 kb Sall-Hindlll-Vectorfragmentea werden in 20 jjl von 60 mM Trie, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 1 mM ATP und 400 U von T4-UNS-Ligaee (Biolabs) 6 h lang bei 15 ⁰C ligiort. Aliquoten von

und 3 μΐ des Ligationsgemisches wer von zu 100 ^l mit Calcium behandelten E, coli HB lOJ-Zellen gegeben. Die Plasmid-

—Mao«·

Isolierung von amp -Kolonien und die Restriktionsanalyse mit Sail, BgIII, EcoRI und Hindlll werden nach obiger Beschreibung vorgenommen (siehe Beispiel 3dIII). E3 wird ein positives Clon ausgewählt und als püDB207/PAPEL-HIR(UASl) bezeichnet.

- 66 - J67

Eine analoge Konstruktion wird mit dem ouo pGAPDH-FL ieollorten 201 bp Bglll-EcoRI-Fragment ausgeführt. Ein ausgewähltes Plnsmid wird p3DB207/PAPFL-HIR(UASl) genannt.

V) Ligation des UAS1(PH05)-UAe2(PH05)-GAPDH-Hvbridpromotore an die Protein-Codierunneregion von Oesulfatohirudin

3 A«g von jedem der PlasMide pOOe207/PAPEL-HIR(UASl) und p0bö207/PAPFL-HIR( UASl) werden mit BgIII digeriert. Nach der "•henolextraktion und Her Ethanolpräzipitation werden die vertiefton 3*-Enden der DNS in einer Reaktion mit E ₁ . coil DNS-Polymerase (Kler.o«v Fragment: Betheeda Reeearch Laboratories) nach Maninis, u. a, (eupra) gefüllt. Da β Enzym wird bei 70 ⁰C 10 min lang inaktiviert. Die DNSn werden weiter mit Sail digeriert, und die gr«.H»ii 7,2 kb Fragmente werden durch Weichagarosegel-Elektrophorese, ^rhonolext:raktion und ethanolpräzipitation iooliert. Cedes Fragment wird in H_?0 mit einer Konzentration von 0,05 ρ Mo IAjI raeuapendiert .Die Fragmente enthalten die Hirudin-Codierungsregion, den größten Teil der Vektoreequenzen und eines der beiden unterschiedlichen aus pGAPDH-EL oder pGAPDH-FL isolierten GAPDH-Promotorelemente.

Plaemid ρ3ΐΛ (EU-PA 100.561) wird mit BstEII digeriert, mit E. coil DNS-Polymerase (Klenow-Fragment) nach obigu. 'Λ¹)-schreibung inkubiert und mit Sail gespalten. Due 649 b-> Fragment wird auf einem Weichagaroeegol abgetrennt und durch Phenolextraktion und Ethanolprözipltation zurückgewonnen.

0,3 pMol dos 649 bp Fragmentes von p.M/Y, das das UASl-L¹AS'.' (PH05)-Promotorelement aufweist, und 0,15 pMol von e.:.>ιθ.ι der 7,2-kb-Fragmente werden ligiert und in E_T coli iidi ι nach

- 67 -

obiger ^fajSchreibung transformiert. Plasmi'Je worHen von

amp Kolonien hergestellt und durch R.etriktionedigeete analysiert. Einzelne Clone werden auegewählt ι und ihre Plaemid-DNSn werden ale pODB2O7/PAPGL~HIR(UASl + UAS2) und pODB207/PAPFL-HIR(UASl + UAS2) bezeichnet.

Beispiel G: fcine 31-bp-DNS-Sequenz reicht aus, um als ein Phosphat-Kontrollelement zu wirken

Eine 31-bp-Sequenz von der Upetream-.1»sion dee PHQ5-Promotors (Positionen -381 bis -351), definiert durch dio beiden flankierenden Doletionen 4 10 und Δ 13 (sielie Beispiel If) könnten möglicherweine ein Regulatorsignal enthalten. .Das kann durch chemische Synthetisierung zweier komplementärer Oligonucleotide der folgenden Struktur getestet werden:

5'-AATTCGAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCAG-S"

3'- GCTTTATATATAATTTAATCGTCCAAAAGCGTCITmA-5'

Diese Sequenz enthält die 31 bp Sequenz, flankiert von EcoRI-Restriktionsstellen. Die EcoRI-Stellen ermöglichen eine einfache Polymerisation der Sequenz zur Bildung von Multimeren.

a) Clonlerunq des 31 bp Elementes in Vector LT98

50 pMol der beiden synthetischen Oligonucleotide werden jeweils in 20 ml von 60 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 0,5 mM ATP und 20 U von T4-Polynucleotid-Kinaee (Boehringer) kinasiert. Nach 45 min bei 37 ⁰C werden die beiden Reaktionsgemische zusammengenommen, 10 min lang auf 75 C erhitzt !ind zum Abkühlen auf Raumtemperatur stehen gelassen. Die gehärteten Oligonucleotide werden bei -20 ⁰C aufbewahrt.

- 68 -

7,5 pMol der kinaeierten und gehärteten Cligonucleotide werden 30 min lang nach obiger Deschreibung (Beispiel 5III) in einem Gesamtvolumen von 15 |il ligiort. üanach werden 5 yl von EcoRI-unterbrochener LT98 Vector-DMS [οίκο'Λ, u. a., Gene 2l5, 189 (1983)J zugegeben (0,075 pMol), und die Inkubation wird über insgesamt 6 Stunden fortgesetzt. Nach der Transformation in E, coli HOlOl werden Plasmide isoliert und durch Digestion mit BamHI analysiert. Ourch diese Analyse werden Daten über die Gesamtlänge des Inserts gewonnen und die Schätzung der Anzahl von clonierten EcoRI-Fragmenten ermöglicht. Einzelne Plasmide mit 1, 2, 3, 4 oder 5 EcoRI-Fragmenten werden ausgewählt, und die DNS-Sequenzierung (Sanger-Methode) zeigt, daß die multiplen 31 bp Elemente in Kopf-Schwanz-Orientierung cloniert wurden.

b) Clonierung in pJDB207

Die 31 bp Oligomere werden hineicht Hch ihrer Promotor-Konlrollfunktion getestet, indem sie oberhalb (upstreasn) des F-Elementes von dem GAPDH-Promotor eingefügt werden, Plaemid p0DB207/PAPFL-EGL(UASl) wird verkürzt, um ein Plasmid zu erzeugen, bei dem das UASl-Element deletiert ist: Das Plaemid wird mit S.ill und BgIII digeriert, auf Gel gereinigt, und das große Vectorfragment wird isoliert. In einem unabhängigen Reaktionsgemisch wird das gleiche Plasmid mit BamHI digeriert. Die vertieften 3¹-Enden werden mit Klenow-DNS-Polymerase unter Verwendung aller vier dNTP's gefüllt. Die stumpfendenden Stellen werden mit phosphorylierten BgIII-Linkern (CAGATCTG, Biolabe) verlängert, und nach der Digestion mit Sail und BgIII wird ein DNS-Fragment mit einer annähernden Länge von 400 bp durch Gelreinigung isoliert. Das große Vectorfragment wird mit dem annähernden 400 bp Sall-Bglll-

- 69 -

•267 ?33

Fragment unter Verwendung von T4-DNS-Liga3e Hgiert. Nach E, coil HBlOl Transformation und Plasmid-Isolierung wird ein Plasmid ohne ei/ie PH05 'JAS gewonnen. Dieses Plasmid wird p3DB207/GAPFL-EGL genannt. Dieses Plasmid wird mit BgIII digeriert und dient als Vector zur Clonierung der 31 bp Oligomere. LT98, das !, 2, 3, 4 oder 5 Oligonuclootid-Inserts enthält, wird mit BamHI digeriert. Die Fragmente verschiedener Größen werden mit Hilfe der Gelreinigung isoliert und unabhängig wit dem Bglll-unterbrochonen pCJDB207/ GAPFL-EGL ligiert. Das Ligationsgemisch wird mit BgIlI digeriert, um unerwünschten religierten Vector ohne DNS-Insert zu entfernen, und wird danach zur Transformation von E. coli HBlOl verwendet. Die gewonnenen Plasmide werden durch Reeitriktionsanalyse mit Sail und Oral (einer Stelle innerhalb des GAPDH-Promotorteiles) analysiert. Nach der Transformation von Hefestamm GRFlO werden Eglin C Titer nach der Beschreibung in Beispiel 4c bestimmt. Die folgenden spezifischen Aktivitäten werden nach einer Fermentationezeit von 46 Stunden gemessen:

Clon PÜDB207/

Anzahl von 31 bp Inserts

Orient ie- Eglin C (mg/l/OD) rung Titer starkes

schwaches P₄

PAPFLI(+(-EGL PAPFLI(-)-EGL PAPFLII(+)-EGL PAPFLIII(-)-EGL PAPFLIV(+)-EGL PAPFLV(-)-EGL

3 4 5

9.2	5,2
10,2	2,1
10,2	3,5
11,2	1.4
10,7	1,5
12,6	1,4

**·- gleiche Orientierung wie in PH05-Promotor -- umgekehrte Orientierung wie in PHQ5*Promotor

- 70 -

Beispiel 7» Expression von ineulinartigem Wachstumsvaktor 1 (IGF-I) aus einem PAPFL-Promotor

In der EU-PA 123.228 beschriebenes Plasmid pAB113-IGF~i wird mit Pstl digeriert. Zwei synthetische Oligonucleotide (50 pMol) je mit der Formel

AATTCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCA GTACTCTAAAGGAAGTTAAAAATG

werden jeweils kinasiert und nach obiger Beschreibung gehärtet. Der gehärtete doppelstränglge Adapter wird mit dem Petl-unterbrochenen Plasmid ligiert, mit EcoRI und BamHI digeriert, und das etwa 800 bp EcoRI-BamHI-Fragiiient wird durch Gelreinigung isoliert. Plasniid p3DB207/PAPFL-EGL( UASl) wird mit Sail und EcoRI digeriert, und das etwa 700 bp Fragment wird durch Gelreinigung isoliert. Bei einer dreimaligen Ligation v/erden 0,5 ^.ig von Plasmid pCl/1 (EU-PA 123.288; digeriert mit BamHI und Sail, Vector gelgereinigt) mit 100 ng von jedem der beiden kleineren Gene bzw. Promotorteile ligiert. Nach der E. coil Transformation werden die Plasmide durch EcoRI, BamHI und Sail Digestion analysiert. Durch die Transformation von Hefestamm AB103 /^hinterlegt bei ATCC unter Nr. 20 673; Abortion von pYIGF-1-10/1 durch gezüchtete Hefezellen in einem Komplexmedium über Nacht und Prüfen einzelner Kolonien auf das Vorhandensein dos IGF-1-Plasmids durch Kolonle-Hybridierung nach der Beschreibung von Hinnen, u. a, fProc. Natl. Acad. Sei. USA 75_, 1929 (1978) J] werden Transformanton gewonnen, die IGF-I nur unter induzierten (schwaches P.) Bedingungen (1 mg/1) erzeugen, wie durch die herkömmliche kompetitive Radioimmunoanalyse unter Verwendung von radiomarkiertem IGF-I bestimmt wird (Anderson, u. a., in: Somatomedins/ Insulin.Like Growth Factors (Somatomedine/insulinartige

- 71 -

Wachstumsfaktoren), Spencer, E, Μ« Heraueg,, Walter de Gruyter, Berlin). Die Clone werden als pCl/1/PAPFL-IGF-J.(UASl) bezeichnet,

Beispiel 8: Expression von Gewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA) unter der Kontrolle eines PHOS-GAPDH-Hybridpromotors (eiehe Fig. IP)

12 |»g von Plasmid pJDB207/PH05-TPA-18 (EU-PA 143.081) werden bis zur Vollständigkeit mit den Restriktions-Endonucleasen Sail und Hindll digeriert. Die beiden resultierenden DNS-Fragmente werden auf einem 0,8%igen Agarosegel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH 8,3, getrennt. Das kleine 2,6 kb Sall-Hindlll-Fragment wird durch Elektroeluierung, Phenolextraktion und ffthanolpräzipitation isoliert. Die DNS wird weiterhin mit Ball digeriert. Das 1,8 kb Fragment mit einem Teil der PH05-Signa1-soquenz, dor Codierungssequenz ttPA und dom PHOS-Terminator wird isoliert und wie oben gereinigt und in Η«0 mit einer Konzentration von 0,1 pMol/jil resuspendiert.

Das Hybridpromotorfragment wird von Plasmid p0DB207/PAPFL-HIR (UASl + UAS2) isoliert (siehe 3eispiel 5V). 12 pg Plasmid-DNS werden mit Sail und Hindlll digeriert, das resultierende 1,5 kb Fragment wird weiter mit Ball digeriert. Ein den Hybridpromotor und einen Teil der PHOS-Signalsequenz aufweisendes 920 bp Fragment wird auf einem l,5%igen Agarosegel isoliert» Die DNS wird elektroeluiert, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt und in H₂O mit einer Konzentration von 0,1 pMol/μΙ resuspendiert.

0,2 pMol des 920 bp Sall-Ball-Fragmontes, 0,2 pMol des 1,8 kb Ball-Hindlll-Fragmentes und 0,1 pMol des Sail, Hindlll* ge-

- 72 -

spalteten Vectors p3DB2O7 werden 16 h lang bei 15 ⁰C in einem Gesamtvolumen von IO μΐ liniert. Eine 1-^1-Aliquote dos Ligationsgemisches wird zu .1.00 ^l mit Calcium behandelten Transformatione-kompetenten C. coil HBlOl Zellen gegeben.

12 traneformierto amp Kolonien werden individuell in LB-Medium, das 100 ^jg/ml Ampicillin enthält, gezüchtet. Plasmid-DNS wird nach der Methode von Holmes, u, n.£ Anal. Biochem. 114. 193 (1981)j/ hergestellt und mit Hilf* von ?stl und BamHI/EcoRI Restriktionsdigests analysiert. Ein Clon mit den erwarteten Restriktionsfragmenten wird isoliert und als PÜDB207/PAPFL-TPA(UASl + UAS2) bezeichnet.

Eine analoge Konstruktion wird für das UASl(PH05)-Element ausgeführt: Ein 820 bp Sall-Sall-Fragment von p3D3207/PAPFL-HIR(UASl) (Beispiel 5IV) wird isoliert und mit dem 1,8 kb Ball-Hindll-Fragment und dom Sail, Hindlll-gespalteten Vector ligiert. Das resultierende Plasmid wird als pODB207/PAPFL-TPA(UASl) bezeichnec.

Analoge Konstruktionen werden mit entsprechenden Fragmenten, die von p0U3207/PAPEL-HIR( UASl) oder pODB2O7/PAPEL-HIR(UASl + UAS2) isoliert wurden, vorgenommen (Beispiel 5). Die resultierenden Plasmide werden als pODB207/PAPEL-TPA(UASl) und P0DB207/PAPEL-TPA(UASl + UAS2) bezeichnet.

Beispiel 9: Expression von Polypeptiden unter der Kontrolle von PH05-GAPDH-Hybridpromotoren

a) Transformation von Saccharomyces cerevisiae GRF18:

Stamm SaccharomMces cerevieiae GRF18 (oL , his-3-11, his3-15. leu2-3, Ieu2-112 can ) wird transformiert mit den Plasmiden

_{β 73} . -26"? 733

pODÜ2O7/PAPEL-HIR( UASl) p30B207/PAPFL-HIR(UASl) p3DB207/PAPEL-HIR(UASl + UAS2) p0DB207/PAPFL-HIR(UA31 + UAS2) p3DB207/PAPFLI( + )~EGL pODB207/PAPFLI(~)--EGL pODB207/PAPFl.II(+ )-EGL pDDB207/PAPFLIII(- )~EGL pODBP.07/PAPFLIV(+ )-EGL pODB207/PAPFLV(-)-EGL p0DB207/PAPEL-TPA( UASl) pC)DB207/PAPFL-TPA( UASl) pODB2O7/PAPEL-TPA(UASl + UAS2 ) P0DB2O7/PAPFL- TPA(UASl + UAS2) pCI/1/PAPFL-IGF-I(UASl)

wobei das von Hinnen, u. a. £Proc, Natl. Acad, Sei, USA 75 , 1929 (198I)J beschriebene Traneformationeprotokoll angewandt wird» Transformierte Hefezellen werden auf Hefe-Minimalmediumplatten, denen Leucin fehlt, auegewählt· Einzelne trans· formierte Hefekolonien werden isoliert und bezeichnet ale

Saccharomyces cerevisiae GRF18/p0DB2O7/PAPEL-HIR(UASl) Saccharomyces cerevisiae GRF18/pODB2O7/PAPFL-HIR(UASl) Saccharomyces corevisiae GRF18/pDDB2O7/PAPEL-HiR(UASl + UAS2) Saccharomyces cerevisiae GRF18/pa0B207/PAPFL-HIR(UASl + UAS2) Saccharomyces cerev/isiae GRF18/p0DB207/PAPFLI(+)-EGL Saccharomyces cerovisiae GRF18/pDDB207/PAPFLI(-)-EGL Saccharomyces cerevisiae GRF18/p0b3207/PAPFLII(+)-EGL Saccharomycee cerevieiae GRF18/p0DB207/PAPFLIII(-)-EGL Saccharomyces cerevisiae GRF18/pODB207/PAPFLlV(+)-EGL Saccharomyces corevisiae GRF18/p0DB207/PAPFLV(-)-EGL "

- 74 - 167 733

Saccharomycee corevisiao GRF18/p0DB207/PAPEL-TPA(UASl)

Saccharomyces cerevisiae GRF18/p0DB207/FAPFL-TPA(UASJ.)

Sacchoromyces cerevisiao GRF18/p3DB207/PAPEL-TPA(UASl+UAS2)

Saccharoifiycee cerevisiae GRF18/pCJDB2O7/PAPFL-TPA(UASl+UAS2)

Saccharomycee cerevisiae GRF18/pCI/1/PAPFL-IGF-1(UAS1)

b)Fermentation der Transformanton

Zellen der S- cerevisiae GRF18 Transformanten werden jeweils in IO ml Hefeminimalmedium (Difco, Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren, der 2 % Glucose und 20 mg/1 L-Histidin zugesetzt werden) in einem 50-ml-Erlenmayerkolben 24 Stunden lang bei 30 ⁰C unter Schütteln bis zu einer Dichte von 3 χ 10 Zellen/ ml gezüchtet« Die Zellen werden in O,Seigern NaCl gewaschen und zum Impfen von 50 ml eines schwachen P. Minimalmediums verwendet, das nach der Rezeptur des Difco Yeast Nitrogen Base Mediums (ohne Aminosäuren) hergestellt wurde, aber 0,03 g/l KH₃PO₄, 1 g/l KCl und IC g/l L-Asparagin anstelle von (NH₄J₂SO₄, 2 % Glucose und 1 g/l L-Histidin enthält. Die Kulturen werden bis zu einer Zelldichte von 4 χ 10 Zelle.n/ml inokuliert und bis zu 42 Stunden lang bei 30 ⁰C mit 200 U/min bewagt.

c) Titer von verwirklichten Genprodukten

Hefe scheidet Desulfatohirudin-Verbindungen in die Nährflüssigkeit aus. Nach einer Fermentationsdauer von 22 h wird eine 10-ml-Probe von dem Kulturmedium entrommen und durch Entsalzen und Konzentrieren auf einer ßond Elut C-18 Säule (1 ml, Analyticham Interne ional) in bezug auf Proteine angereichert. Oie Säule wird zweimal mit 1,5 ml Wasser-Acetonitrll (9:1) 0,1 % Trifluoreseigsäure gewaschen. Desulfatohirudinverbin-

- 75 - ^6? 733

düngen werden aus der Säule mit Was8er-Acetonitrll~0,l % Trifluoreoeigeäure (6:4, V/V) eluiert. 2 ml Eluat werden auf einem Speed Vac Konzentrator (Savant) bie zu einem endgültigen Volumen von 400 ^j?. eingeengt, Desulfatohirudin wird durch HPLC-Analyso, durch Vergleich mit authentischem Desulfatohirudin und mit Hilfe der Thrombin-Iqhibitionsanalyee identifiziert £ siehe M. U. Bergmoyer (Hg.) Methode in Enzymatic Analyois, Bd, II, S, 314 - 316, Verlag Chemie, Weihnheim (PRO) 19833.

Oie Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1: Sekretion von Üeeulfatohirudin in die Nöhrflüsoigkeit durch den mit verschiedenen Plasmidan transformierten Stamm S. cerevisiae GRF18

Plasmid üeeulfatohirudin

Cmg/l Nährflüssigkeit/00₆₀₀^

p0DB207/PAPEL-H IR (UASl) 2,0

p0DB207/PAPFL-H IR (UASl) 2,2

p3DB207/PAPFL-H IR (UASl + UAS2) 3,0

pCJD8207/PAPEL-H IR (UASl + UAS2 ) 2,8

Gewebe-Plaeminogen-Aktivator (t-PA) sammelt sich in den Hefezellen an. Zellextrakte werden hergestellt, und die t-PA-AI<tivität wird wie folgt bestimmt: Zellen von 35 ml schwachem P.-Kulturmedium/Tb. Meyhack, u. a., EMBO-O, 1, (1982)1 mit einer Zelldichte von 1 bis 2 χ 10 /ml worden durch Zentrifugieren in einem Sorvall-Rotor SS34 über einen Zeitraum von 10 min bei 3000 U/min gesammelt. Die Zellen werden in einem Puffer, der die Salzkomponenten des Kulturmediums (d.h. ohne

- 76 -

Aminosäuren, Glucose, Vitamine, Spurenelemente) enthält: cjewaschon. Die Zollen werden 5 min lang bei Raumtemperatur mit 3000 U/min zentrifugiert. Die eedimentierten Zellen werden in einem Geeam-volumen von 4 ml kaltem 6CmM Nat'iuci'-phosphatpuffer, pH 7,4, und 0,1 % (V/V) Triton x-100 resuspendiert. Die Zellsuspeniion wird in ein 30-ml-Corex-Röhrchen übertragen, 8 g Glasperlen (Durchmeseer 0,4 mm) werden zugegeben, und die Suspension wird auf einem Vortex Mixer (Scientific Instruments Ine,, USA) 4 min lang bei voller Geschwindigkeit geschüttelt' und anschließend in einem Eisbad abgekühlt. Mehr als 90 % der Zellen werden durcn diese Verfahrensweise zerbrochen. Zellbruchstückchen und Glasperlen werden durch 10 min Zentrifugieren bei 4 C mit 8000 U/min in einem Sorvall-Rotor HD-4 sedimentiert. Die überstehende Flüssigkeit wird in Eppendorf-Röhrchen übertragen, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -60 ⁰C aufbewahrt.

Die t-PA-Aktivität wird nach der Methode von Ranby £"Biochem. Biophys, Acta 704, 461 (1982)3 mit leichten Modifikationen bostimmt. D-Val-Leu-Lys-pNA (Kabi S-2251) wird als Substrat verwendet« Die Absorption bei 405 nm wird für unspezifische Spaltung korrigiert und zu einem Urokinase-Standard in Beziehung gesetzt. Die Ergebnisse sind In Tabelle 2 enthalten.

Tabelle 2: t-PA-Aktivitöt in S, cerevislae Stamm GRF18, trans· formiert mit verschiedenen Plasmiden

Plasmid t-PA-Aktivität

t-PA-Aktivität

U.U./l Hefezellenkultur/OD_6OOJ

p3DB207/PAPF L- TPA (UASl) 300

p3DB207/PAPFL-TPA(UASl + UAS2 ) 200

- 77 - ^? ?v33

Beispiel 10: Isolierung und Charakterisierung von IGP-I von einem transformierten Hefestamm

^a) Isolierung VOn ₁ IGF-I aus dem Kulturmedium ι

Hefestamm ρCl/1/PAPFL-CGF-I(UASl) wird 60 h lang gezüchtet. 3 1 Nährflüsfligkeit werden geerntet und wie in Beispiel 9 beschrieben zentrifugiert. Die Analyse durch Umkehrphasen-HPLC von 2 ml überstehender Flüssigkeit (Konz. 1:10) ergibt einen Titer von 1 mg/1 IGF-I, Die überstehende Flüssigkeit wird irit 20 ml SP-Sephailex C-24 (Pharmacia) bei einem pH von

3.0 behandelt und 60 min lang bei 4 ⁰C gerührt. Das adsorbierte IGF-I wird durch einen Matriumacotat-Puffergradienten .

(50 mM, pH 3,0, bis 9,0) aus dem gewaschenen Harz eluiert und durch zwei Ionenaustauschschritte weiter gereinigt: Der erste Schritt wird auf einer CM-52-Säule (Whatman), 1,5 cm χ 0,5 cm, Gradient, Puffer A, 20 mM NH₄CAc, pH 4,0; Puffer B 100 mM NH₄CAc, pH 6,B) ausgeführt. Der zweite Schritt wird auf einer DE-53 Anionenaustauscheöule (Whatman) vorgenommen (Bedingungen. 1,5 cm χ 10,5 cm Säule, Fließen 1 ml/min, Gradient, Puffer A 20 mN. NH₄CAc, pH 9,0; Puffer B 200 mM NH₄CAc, pH 6,5), Die endgültig") Reinigung wird auf einer somipräparativen RP-HPLC-Säule ausgeführt. Die aktive Fraktion eluiert mit einer Retentionszeit von 21,3 min und ergibt

1.1 mg 95 % reines IGF-I,

Versuchsbedingungen: Vydac 218 TP 510 RP-HPLC-Säule, 10 χ 250 mm; aliquote Portions (200^1 1:10 konzartriert) je Trennung; AUFS 0,5 bei 2 20 nm; Fließgeschwindigkeit: 3 ml/min. Eluierungemittel: A: O,liilge Trifluoressigsäure, B: Acetonitril/Wagser C:2 + 0,07.^6 Trif luoressigsäure, 3 min 35 % B, dann Zunahme im Laufe von 30 min auf 45 % B, Die resultie-

- 78 - ,26? 733

renden Fraktionen worden 1:1 mit Waeeer vordünnt und lyophilieiert.

b) Charakterisierung von IGF-I nus dar Fermentation dos Stommes pCl/1/PAPFL-IGF-K UASl)

Nach der RP-HPLC-Analyse ist aue dem Kulturmedium isoliertes IGF-I (siehe Beispiel 10a) mit authentischem IGF-I aue Serum identisch«

Isoelekirischer Punkt pi: 8,6 _k( Ieoelektrieohe Fokussierung, TCA Präzlpitation des Proteins),

Bestimmung der Aminosäure-Zusammensetzuno,

Annähernd 2,5 /ig des reinen IGF-I werden 24 h lang mit 6 N HCl bei 110 ⁰C hydrolysiert und dann nach dor Beschreibung von Chang, u. a.£ DABS-Cl-Methodeι Methode in Enzymology 91. 41 (1983)J analysiert. Das Hydrolysat ha\· die folgende Zusammensetzung:

Aminosäure	Hydrolysat	(5)	Aminosäure	Hydrolysat	(D
Asp	5,7	(3)	He	0;7	(6)
Th r	3,2	(5)	Leu	5,9	(3)
Ser	3.2	(6)	Ty r	2,8	(4)
GIu	6,5	(5)	Phe	3,9	-
Pro	5,3	(7)	His	mm	(3)
GIy	7.2	(6)	Ly s	3,0	(6)
AIa	6.1	(3)	Arg	6,0	(1)
VaI	2,7	(3)	Met	0,9	(70)
Cystin	2,2	gesamt

- 79 -

M?733

For tit) Uo Sequeruanalyeo

70 ^g (10 iiMol) dee reinon IGF-I werden einer herkömmlichen Sequenzanalyso r.^ Edman unterzogen« Die N-terminalen PTH-Aminoeüuren werdon mit Hilfe ¹JP-HPLC beetimmt.

Ergobnissot

Zyklus 15 10

Aminoeäuro GIy-Pro-Glu-Thr-Leu-Cye⁺-Gly-Ala-Glu-Leu~

Zykluo 11 15 20

Aminoeäuro Val-Aop-Ala-Leu-Gln-Phe-Val-Cye⁺»Gly-A8p- ·

Zyklue 21 25 3O

Aminoeäuro Arg-Gly-Phe-Tyr-Phe-Aen-Lye-Pro-Thr-Gly-

Zyklus 31 35 40

Aminoeäure Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Alo-Pro-Gln-

Zyklus 41 45 50

Aminoeäure Thr-Gly-Ile-Val-Aap-Glu-n«d«-n.d.-Phe-Arg-

n.d.t 'licht bestimmt

+ : Cye (6) und Cye (18) wurden getrennt durch Carboxy-Mothylierung mit Oodacetamid beetimmt«

Die Partialeequenz von Aminosäure 1 bis 50 let somit mit der veröffentlichten Primäreequenz von authentischem IGF-I identisch,

C-Termina!-Analyse

Das reine IGF-I wird mit Carboxypeptidaeo Y digeriert, und

- 80 -

.26? 733

die freigesetzten Aminosäuren werden in dem Aminosäure-Analyser bestimmt (siehe O. Y. Chang, R. Knedel, D, G. Brpun, Biochem. 3. 19j), 547).

Ergebniese: Aminosäure 70

5 min Digestion: -AIa

, 120 min Digeetion: Ser-Ala

Scheinbare relative Molekülmaese

Die IGF-I (30/.ig) wird auf einem SDS-Harnstoff-Gel ^SUDS-GeI; 3iohe Kyte, u. a., Anal. Biochem. 133, 515 (1983)J analysiert. Es wird eine einzige, einer scheinbaren relativen Molekülmasse von 6000 bis 7000 Dalton entsprechende Bande beobachtet.

Bestimmunp der relativen Molekülmasse durch FAB-MS

Das IGF-I wird der positiven Ionen-Massenspoktroskopie mit schneller Atombombard ie ru. ng (FAB-MS) unterzogen. Instrument: ZAB-HF-Maesenepektrometer von VG-Analytical Ltd. Manchester; Matrix: Thioglycerol; Xenon-Bombardierung; Ionenenergie 3 KeV; externe Kalibrierung: ^Ca ₃n³29 (^rel^ative Molekülmasse: 7667,4)

Empirische Formel: ^C331^H518^N94°101^S7

Relative Molekülmasse (berechnet): 7648,71 Relative Molekülmasse (gefunden): 7648,07

Claims (12)

1. Patentansprüche

   el 1« Verfahren zur Her9tollung einos zu Hefe heteriogenPolypeptide, gekennzeichnet dadurch, daß ein Hefestamm, der mit einem Hybridvector traneformiert wurde, der v-t.nen oder mehrere DNS-Ineerte enthölt, von denen jeder ein DNS-Segment aufweiet, dae für ein zu Hefe heterologee Polypeptid codiert und dae unter der Tranekr'jrtionskontrolle eines Hybridpromotore steht, welcher aus einem S'-Upstream-Promotorelement mit UAS(n) des Hefegene PH05 und einem 3'-Downstream-Promotorelement eines anderen Hefegene ale dem PH05-Gen, dae Transcriptions-Initiierungestellen einschließlich einer funktioneilen TATA-Box aufweiet, besteht, oder eine Mutante davon gezüchtet wird und dae exprimierte Polypeptid ieoliert wird.
2. 2. Verfahren zur Herstellung eines zu Hefe heterologon Polypeptide nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Hybridpromotor aue einem S'-Upetream-Promotorelement i* '.t UAS(n) des Hefegens PH.05 und einem 3'-Downstream-Promotoreloment des Hefegens GAPDH, das an den Nucleotiden -30U bis -180 beginnt uM an dam Nucleotid -1 endet, besteht .
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Hefezellen in einem flüssigen Medium, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff, anorganischen Salzen und wenn erforderlich Wuchsstoffe enthält, gezüchtet werdön.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß dae DNS-Segment für ein Pol/poptid höherer eukaryotischor Herkunft codiert.

   -A2- 267 735
5. 5. Verfahren nac^h -'ntoruch I, gekennzeichnet dadurch, daß das DNS-Segment für ein Polypeptid codiert, das aue dgr Human-pf -Interferon, ein Humon-Hybrid-Interferon, Humani-PA, HBVeAg, Dosulfetohirudin, Eglin C und insulinartiger Wachstumsfaktor umfassenden Gruppe ausgewählt ist.
6. 6» Verfahren nach Anspruch 1. gekennzeichnet dadurch, daß Eglin C hergestellt wird.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 1, gekonnzeichnet dadurch, daß Desulfatohirudin hergestellt wird.
8. 8. Vorfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß humanes t-PA hergestellt wird.
9. 9. Vorfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß insulinartiger Wachstumsfaktor hergestellt wird.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß

    es sich bei dom Hefewirt um einen Stamm von Saccharomyces cerevieiae handelt.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Hybridvector einen bis vier DNA-Inserte enthält,
12. 12. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Hybridvector einen DNA-lnsert enthält.

    HiCr?M 10 SkH-