JPS6251995A - リプレツシブルイ−ストプロモ−タ− - Google Patents

リプレツシブルイ−ストプロモ−タ−

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JPS6251995A
JPS6251995A JP61201924A JP20192486A JPS6251995A JP S6251995 A JPS6251995 A JP S6251995A JP 61201924 A JP61201924 A JP 61201924A JP 20192486 A JP20192486 A JP 20192486A JP S6251995 A JPS6251995 A JP S6251995A
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dna
promoter
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アルベルト・ヒンネン
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は組換ＤＮＡ技術を用いるイースト宿主での異物
であるポリペプチドの製造に関する。更に詳しくは、本
発明は新規な上流活性配列、かかる上流活性配列を包含
するハイブリッドイーストプロモーター、イースト細胞
の形質転換に有用な新規なハイブリッドベクター、かか
る形質転換されたイースト細胞およびイーストに対して
異物であるポリペプチドの製造のためのかかる形質転換
されたイーストＭ胞の使用に関する。
近年遺伝子工学の分野で多大の進歩があり、遺伝子的に
操作された微生物殊に玉ンテロバクテリウム、エッシエ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）の菌
株および製パン用イースト〔サツカロミセス・セレヴイ
シエ（５ａｃｃｈａｒｏ■ｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）　）の菌株を用いるいくつかの系が現在１動いてい
る。しかしながら、産業上蛋白質を経済的かつ大規模に
生産するのに適した追加の改善された系、殊に直接生物
系例えばイーストに対する要望がある。現在、遺伝子ク
ローニングに種々のイーストベクターを用いることがで
きる。イーストでの異質遺伝子の効率の良い発現のため
に。
構造コード配列が強力なイーストプロモーターと組合さ
る必要があり、これらのプロモーターは有利には遺伝子
発現の外因性コントロールを可能とする調節特性を示す
必要がある０発現の効率（生成物形成）は使用するプロ
モーターの強さの函数でありかつ比例するので、遺伝子
工学の分野での当業者は強力なプロモーター系の開発に
特に留意している。
蛋白質のコードをしているクローニングされたイースト
遺伝子の試験管内での突然変異誘発および機能分析のた
めのイースト細胞への再導入により種々の必須のＣ１５
−作用プロモーターエレメントの同定が可能となった〔
参考までに、Ｌ、グアレンチ（Ｇｕａ　ｒｅｎ　ｔｅ）
　、セル（Ｃｅ　Ｉ　Ｉ）　、第３６巻。
１７９９頁、１９８４年を参照〕、遺伝子の５′末端で
の蛋白質コード領域を直ちにフランキング（ｆｌａｎｋ
ｉｎｇ）　しているエレメントで始り、これらのエレメ
ントは次のものを包含している。
一時１１ｆｃＡＡｃＡＡｃＡＡ　にｊ：たはｒＪＪ連配
列配列テイフを包含するむしろＡ−Ｔに富んだ５′転写
されたリーダー領域、 一通常異った強度のｍＲＮＡスタート部位の多重性を指
示している翻訳スタートコドンＡＴＧから約４０〜６０
ｂｐ　（時にはそれ以上）に位置する転写開始点、 一木質的なＲＮＡポリメラーゼＩＩ認識部位として働く
ものと予想される転写開始点から約４０〜８０ｂｐに位
置すＬＴＡＴＡボックス（時には２個以上）、 −ＴＡＴＡボックスから約１００−３００ｂｐ上流に位
置する上流活性部位（ＵＡＳ）、調節蛋白のための推定
ターゲット部位。
ＵＡＳは原核生物にみられる調節部位とは区別される様
式で働き、モして１乳動物系のエンハンサ一部位により
似ている。更に詳しいデータは。
陽性に作動する調節蛋白（ＧＡＬ４遺伝子生成物）が直
接ＧＡＬ−ＧＡＬＩＯのＵＡＳと相互作用をするイース
トＧＡＬ−１、ＧＡＬ７、ＧＡＬＩＯクラスターから得
られる〔ジンジャ−（Ｇｉｎｉｇｅｒ）等、「セル」、
第４０巻、第７６７頁、１９８５年〕。
イーストＣＹＣ１ｉｉ１伝子のＴＡＴＡボックスの前で
ＧＡＬＬ−ＧＡＬＩＯのＵＡＳをコードしているプロモ
ーターセグメントを融合することにより、ハイブリッド
プロモーターが発生し、その転写は今やＧＡＬＬ〜ＧＡ
ＬＩＯのＵＡＳのコントロール下にあり、すなわち、そ
のものはＧＡＬ４遺伝子依存性である〔１．グアレンチ
等、ブロク・ナツル争アカド・サイ舎Ｕ　Ｓ　Ａ　（Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　、第７９ｔ８、第７
４１Ｏ頁、１９８４年〕、同じような構築がＣＹＣ１お
よびＬＥＵ２のプロモーターエレメントの融合により行
われていた（Ｌ、グアレンチ等、セル、第３６巻、第５
０３頁、１９８４年〕、これらの実例は共にプロモータ
ーエレメントおよび蛋白コード配列を包含し、そしてこ
れらの系がイーストに対して異質である遺伝子でも働く
とする証拠は得られていない。
最近公開された特許出願（ＰＣＴ　　８４／４７５７）
にはイーストＰＧＫ遺伝子のＵＡＳエレメントが開示さ
れている。−３２４と−４５５との間（ＡＧＴから）に
位置する必須プロモーターエレメントの存在が示されて
いる。他のプロモーターの前にこのエレメントを（＝Ｊ
加することは他のイーストプロモーターの強度を増強す
ると述べられている。しかしながら、この主張を実体化
する実施例は示されてはなく、論議は全く否定的なデー
タ（プロモーターの破壊）に基いている。エレメントが
ＰＧＫプロモーターの木質的部分であることは十分可能
であるが、このようなエレメントがハイブリッドプロモ
ーターの部分として働くかどうかは疑わしい。更に、Ｐ
ＧＫのＵＡＳは′ｉＪＩＪｍシグナルと連けいしていな
い、すなわち特別な生理学的シグナルによって下流コー
ド配列の発現（転写）をコントロールし得ない。
グルコース分解性遺伝子のプロモーターのいくつかはグ
ルコースの存在下で誘導される。これらのプロモーター
は細胞がグルコースのない培地で生育すると潜在的には
とめられてしまう、これは、イースト宿主細胞を、細胞
内に蓄積する潜在的に有害なまたは致死性遺伝子生成物
に対して細胞を保護するために、グルコースを他の炭素
源（アセテート、グリセロール、ラクテート等）で置き
換えた培地中で形質転換させ、発生させなければならな
い、原形質体の再生（Ａ、ヒネン（Ｈｉｎｎｅｎ）等、
ブロク、ナツル、アカド、サイ、ＵＳＡ、ｍ７５￥！５
、第１９２９頁、１９７８年〕または塩処理全細胞の再
生〔伊藤等、Ｊ、バクチリオル（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
）　、第１５３巻、第１６３頁、１９８３年〕は細胞の
急速な発生およびコロニーの形成を可能とするために一
般に栄養分に富んだ培地で行われているので、現今使用
されているいずれの形質転換プロトコールは炭素源とし
てグルコースを使用している。グルコースのない培地で
の再生および回収は窮めて貧弱にしか働かない（もし働
いたとしても）ものと予想される。
発現の時機は、細胞が大量の異質蛋白に最もよく耐容し
得る場合のみ、すなわち生育期外に蛋白質を高いレベル
で生産するのを確実にするために、調節しなければなら
ないことが一般に当業者間で認められている。また、発
現のｙＪ節が微生物の生育に最も重要な炭素源、すなわ
ちグルコースの存在または不存在で左右されないことが
望ましい、イーストによる異質（ｆｏｒｅｉｇｎ）遺伝
子の都合の良い、技術的に通用可能な発現のためのこれ
らの要件を充足する調節可能な、かつ強力なプロモータ
ー系は出願分野でほどんど知られていない、それ故、か
かるプロモーター系の開発が要望されている。
意外なことに、グリコール分解経路に包括される酵素の
発現をコントロールし、また一般に現在知られている最
強力のプロモーターに属すると思われるプロモーターの
ＴＡＴＡボックスとその抑制または抑制解除が生育培地
の必須成分例えば必須炭素または窒素源の存在または不
存在に左右されない調節可能なプロモーターの上流プロ
モーターエレメントとの組合せによって、技術的に適用
可能なプロモーター系に課せられた主要な要件を充足す
る強力なハイブリッドプロモーターが誘導されることが
見い出された。
本発明の目的は、イーストでの異質遺伝子の効率のよい
発現のために酸ホスファターゼＰＨ０５遺伝子のＵＡＳ
のコントロール下におかれたハイブリッドプロモーター
、殊にグリコール分解性遺伝子のプロモーターの使用に
ある。
イーストＰＨ０５遺伝子の新たに単離されたＵＡＳシグ
ナル、ＰＨ０５ＵＡＳシグナルを包含するハイブリッド
プロモーター、かかるハイブリッドプロモーターを含有
するハイブリッドベクターおよびかかるハイブリッドベ
クターで形質転換されたイースト　（ｙｅａｓｔ）宿主
は更に本発明の目的である。
本発明の更に他の目的は前記のＵＡＳシグナル。
バイブリフトプロモーター、ハイブリッドベクターおよ
び形質転換されたイースト宿主の製法およびポリペプチ
ドの生産のための前記形質転換されたイースト宿主の使
用にある。
本発明はイーストＰＨ０５遺伝子から話導される上流活
性配列およびハイブリッドモーターを製造するためのそ
の使用に１″Ａする。
本発明に先立っては、イーストＰＨ０５遺伝子の転写を
調節する上流活性部位（または配夕哩、ｒＵＡｓＪ　）
が１個またはそれ以上存在しているか否かは当業者には
知られていなかった。
ＰＨ０５遺伝子はりプレッシブルイースト酸性ホスファ
ターゼをコードしている。このものは無機りん酸塩の高
濃度下で抑制され、そして無機りん酸塩欠乏下では抑’
１１１が解除される（Ｂ、メイハック（Ｎｅ７ｈａｃｋ
）等、ＥＭＢＯ−Ｊ、第１巻、第６７５頁、１９８２年
〕。
ＰＨ０５造伝子の５′領域の分析により、Ｐ）（０５遺
伝子の転写を調節するｃｉｓ−作用エレメントの同定が
結果として得られた。ファージベクターＭ１３ｍｐ９（
ｌｉＸ換えベクターＭ１３ｍｐ９／ＰＨ０５Ｂａｍ−５
ａｌ、欧州特許出願第１４３，０８１号参照）中にクロ
ーニングされたＰＨ０５遺伝子の５′領域の６２３ｂｐ
　　ＢａｍＨＩ−５ａｕ１フラグメントをＢａｍ部位か
ら出発するエキソヌクレアーゼＢａ１３１で消化し、そ
して、他の実験ではＳａ１部位から出発して消化してい
る。すなわち、−組の短縮ＰＨ０５プロモーターフラグ
メントが発生し、これらフラグメントは配列分析に付し
、そして短縮末端に合成ＥｃｏＲＩリンカ−をＵｎえて
いる。Ｓａｕ部位で短縮されたフラグメント（「左手プ
ロモーターフラグメント」）とＢａｍ部位で短縮された
フラグメント（「右手プロモーターフラグメントｊ〕と
の１合せによって、ＰＨ０５プロモーター領域の一組の
欠失突然変異株が生成され、これらをＰＨ０５構造遺伝
子の発現を行う能力について試験する。ヌクレオチド−
２２５乃至−２６３の間の欠失は酸性ホスフェ−！・活
性の５倍の減少をもたらし、またヌクレオチド−３６１
乃至−３９２の間またはヌクレオチド−３４６乃至−３
６９の間の欠失は酸性ホスファターゼ活性の１０倍の減
少をもたらすことがＦＩ！認された（ヌクレオチドの番
号付けについては、添付の第１図を参照）。これらの効
果はＰＨ０５発現に必須である上流活性部位（ＵＡＳ）
に帰せられる。ヌクレオチド−３６５の近辺のＵＡＳは
ＰＨ０５遺伝子の５′領域の２８６ｂｐ　　ＢａｍＨＩ
−Ｃ１ａｌフラグメント（ヌクレオチド−２７４乃至−
５４１）に含まれ、ＵＡＳＩ　（ＰＨ０５）と称される
。一方。
ヌクレオチド−２４５の近辺のＵＡＳ領域はＰＨ０５遺
伝子の５′のＬＱＯｂｐ　　Ｃ１ａｌ　−Ｂ　ｓ　ｔ　
Ｅ　ＩＩフラグメント（ヌクレオチド−１７４乃至−２
７３）に含まれ、ＵＡＳ２　（ＰＨ０５）と称される。
本発明は特にＰＨ０５遺伝子のヌクレオチド−１７４と
−５４１との間のＢ　ａｍＨｒ　−Ｂ　ｓ　ｔ　Ｅ　Ｉ
Ｉフラグメントに含まれる上流活性配列（ｕｐｓｔｒｅ
ａｍ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）　Ｕ
　Ａ　Ｓ　１（ＰＨ０５）およびＵＡＳ２　（ＰＨ０５
）に関する。
更に、本発明はＰＨ０５遺伝子のヌクレオチド−２７４
乃至−５４１の間のＢ　ａｍＨＩ　−ＣＪＬａＩフラグ
メントに含まれる上流活性配列ＵＡＳＩ　（ＰＨ０５）
およびＰＨ０５造伝子のヌクレオチド−１７４乃至−２
７３のＣ！；Ｌａ−ｒ−Ｅ　ｓ　ｔ　Ｅ　ＩＩに含まれ
る上流活性配列ＵＡＳ２（ＰＨ０５）に関する。
朽に好ましいのは上流活性配列ＵＡＳ　１（ＰＨ０５）
である、ＢａｍＨＩ−Ｃｌ＠ｌフラグメント内のＵＡＳ
ＬＰＡＩ！ｉシグナルの正確な位置を決定することがで
きた。すなわちＵＡＳＩ２Ｉ！Ｉ節シグナルは３１ｂｐ
　　ＤＮＡフラグメント（ＰＨ０５プロモーター領域の
−３８１乃至−３５１位置）に含まれている。好ましく
は、フラグメントは適当な制限部位を含有する平滑末端
リンカ−あるいは制限エンドヌクレアーゼ例えばＥＣ０
ＲＩに特異的な食い違い（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）末端を
一方の側に有している。３１ｂｐフラグメントは次の配
列を有している。
ＧＡＡＡＴＡＴＡＴＡＴＴＡＡＡＴＴＡＧＣＡＣＧＴＴ
ＴＴＣＧＣＡＣＴＴＴＡＴＡＴＡＴＡＡＴＴＴＡＡＴＣ
ＧＴＧＣＡＡＡＡＧＣ（ｉＴＵＳＡＩ　（ｐＨｏｓ）お
よび（または）ＵＡＳ２　（ＰＨ０５）配列を含有する
ＤＮＡフラグメントの！ｌＪ造法はＰＨ０５遺伝子を含
むＤＮＡ。
ＰＨ０５遺伝子またはその５′末端部分を適当な制限エ
ンドヌクレアーゼで開裂し、そして所望のフラグメント
をｒｌｉ　敲することからなる０例えば、ＰＨ０５プロ
モーターおよびＰ）（０５コード領域の部分を包含する
ＰＨ０５（上述）の６２３ｂｐＢａｍＨＩ−Ｓａｕｒフ
ラグメントを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよび
Ｂ　ｓ　ｔ　Ｅ　ＩＩで消化し、そして両方の上流活性
部位を含有する生成した３６８ｂＰサブフラグメントを
屯敲する。
同様な方法で、上記ＢａｍＨＩ−ＳａｌＴフラグメント
をＥａｍＨＩおよびＣｌａＩでまたはＣＪｌａＩおよび
ＢｓｔＥＩＩＣ’開裂するとＵＡＳ１（ＰＨ０５）を含
有する２６８ｂｐ　　ＢａｍＨＩ−Ｃ１ａ　ｒサブフラ
グメントおよびＵＡＳ２（ＰＨ０５）を含有する１ｏｏ
ｂｐ　　Ｃｕａｌ　−Ｂ　ｓ　ｔ　Ｅ　ＩＩサブフラグ
メントがそれぞれ得られる。フラグメントおよびサブフ
ラグメントの単離および精製は通常の手段例えばアガロ
ースゲル電気泳動またはポリアクリルアミド電気泳動に
より達成される。
本発明による上流活性部位を含有するＤＮＡフラグメン
トはそれ自体既知の方法例えばエキソヌクレアーゼ例え
ばＢ　ａ　Ａ、　３１による部分消化によって短縮フラ
グメントのＵＡＳ機能が保持されるようにして短縮する
ことができる。ｍ縮はフラグメントの５′末端または３
′末端あるいは両側で行うことができる。ＵＡＳ機能を
保持しているこれらのサブフラグメントの選定は上述の
如くして、すなわちＵＡＳを含有する元の配列を短縮フ
ラグメントで置き換えそしてＰＨ０５構造遺伝子の発現
を実施するための能力について得られたＰＨ０５プロモ
一ター欠失突然変異株を試験することにより行われる。
ＰＨ０５１伝子の上流活性部位の一方または両方を含有
する本発明によるフラグメントおよびその短１１ｉ１誘
導体は、ハイブリッドプロモーターの構築およびベクタ
ーへの接合を容易にするために一方の端に連結された合
成リンカ−配列を有していてもよい。
ＰＨ０５の上流活性部位を含有するＤＮＡフラグメント
ならびにその短縮話導体はまた当業者に周知の通常の技
術を用いる化学ＤＮＡ合成によっても製造することがで
きる。適当な技術はＳ。
Ａ、ナラング（Ｍａ　ｒａｕｇ）によって収集されてい
たしテトラヘドロン（Ｔｓｔｒａｈｅｄｒｏｎ）、第３
９巻、第３頁、１９８３年］、特に、欧州特許出願第１
４６．７８５号に記載の方法を用いることができ、参考
として１本文に挿入する。
本発明の更なる特徴は、ハイブリッドプロモーターおよ
びＰＨ０５遺伝子の上流活性部位を包含するハイブリッ
ドプロモーターの製造のためにＰＨ０５遺伝子の上流活
性部位を用いることである。
本発明は、特にイーストＰＨ０５ｉＪｔ伝子の上流活性
部位を包含する５′上流プロモーターエレメントおよび
翻訳スタートコドンに近い機能性ＴＡＴＡボックスおよ
び末端を包含する転写開始部位を包含するイーストＰＨ
０５遺伝子以外のイースト遺伝子の３′下流プロモータ
ーエレメントを包含し、特にこれらからなるイーストハ
イブリッドプロモーターに係るものである。
５′上流プロモーターエレメントは特に上に特定したＤ
ＮＡフラグメントの一つであり、特にＵＡＳ　１　（Ｐ
Ｈ０５）および行ＡＳ２　（ＰＨ０５）を含む３６８ｂ
ｐ　　ＢａｍＨＩ−ＢｓｔＥＩＩフラグメントあるいは
ＵＡＳＩ　（Ｐｆ（０５）を含む２６８ｂｐ　　Ｂａｍ
ＨＩ−ＣＪｌａＩフラグメントあるいはＵ　Ａ　Ｓ　ａ
能が保持されているその短縮誘導体例えばＵＡＳＩ　（
ＰＨ０５）を含む３１ｂｐフラグメントあるいはその更
に小さいサブフラグメントである。
３′下流プロモーターエレメントは好ましくは高度に発
現されたイースト遺伝子のプロモーター、殊にグルコー
ス分解酵素をコードしているイースト遺伝子のプロモー
ター、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、３−ホス
ホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、
ビルヴエートデカルポキシラーゼ、ホスホフルクトキナ
ーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３
−ホスホグリセレートムターゼ、ピルヴエートキナーゼ
（ＰｙＫ）、トリオセホスフェートイソメラーゼ、ホス
ホグルコースインメラーゼおよびグルコキナーゼ遺伝子
のプロモーターが誘導される。３′−プロモーターエレ
メントは正しい転写開始および転写の正しいスタートポ
イント（主要ｍＲＮＡスタートポイント）のために酵素
ポリメラーゼＩＴを配置するに当り包含されているＴＡ
ＴＡボックスを包含する。ＴＡＴＡボックスの下流には
、３′−プロモーターエレメントが、主要ｍＲＮＡスタ
ートと翻訳スタートコドン（ＡＴＧ）の間の領域、好ま
しくは翻訳スタートコドンに接近する領域に伸びている
。
ＴＡＴＡボックスの上流側で、３′−７’Ｏモーターニ
レメン斗は約５０−１５０の原塩基対を包含している。
この上流ＤＮＡ配列の正確な長さは重大なことではない
、それはＵＡＳとＴＡＴＡボックスとの間の間隙に若干
の融通性があると思われるからである。
本発明の好適な３′−プロモーターエレメントは当８に
分野で既知の最強のイーストプロモーターの一つである
ことが知られているＧＡＰＤＨプロモーターから誘導さ
れる［酵素ＧＡＰＤＨはＳ、セレヴイシエの乾燥重量の
約５％にのぼることができる。Ｅ、Ｇ、クレブス（Ｋｒ
ｅｂｓ）、　　Ｊ　。
ビオル、ケム（Ｊ、　Ｂｉｏ！、　Ｃｈｅｗ）、第２０
０巻、第４７１頁、１９５３年］、好ましくは、３′Ｇ
ＡＰＤＨプロモーターエレメントはヌクレオチド−３０
０乃至−１８０で始まり、ＧＡＰＤＨ遺伝子のヌクレオ
チド−１で縛る８本発明の好ましい一態様では、３′プ
ロモーターエレメントはＧＡＰＤＨ遺伝子のヌクレオビ
ー１９９乃至−１を包含している０本発明の他の好まし
い態様では、３′プロモーターエレメントはＧＡＰＤＨ
ｆｆｉ伝子のヌクレオ包子−２６３乃至−１を包含して
いる。
本発明のハイブリッドプロモーターは同じタイプの単−
ＵＡＳ　（ＰＨ０５）または多重ＵＡＳ（ＰＨ０５）例
えばＵＡＳＩ　（ＰＨ０５）を好ましくは頭部から尾部
方向に配合されて含有していてもよい。３′プロモータ
ーエレメントに関して、ＵＡＳは純正なＰＨ０５プロモ
ーターの方向に比して同一もしくは逆の配向を有してい
てもよい。
本発明によるハイブリッドプロモーターの成分、すなわ
ちＰＨ０５のＵＡＳを含むプロモーターエレメントおよ
びＴＡＴＡボックスを含むプロモーターエレメントを合
成リンカ−を介して平滑末端結合によりあるいは可能な
らば自然発生相合ｆｌノ制御部位を介して結合される０
本発明のハイブリッドプロモーターの５′および３′末
端は適当に合成リンカ−を有し、これによりベクターＤ
ＮＡへの結合および３′末端で異型の蛋白質コード領域
への接合を可能とする。
本発明によるハイブリッドプロモーターはバイオテクノ
ロジーで使用可能なプロモーターに課せられているすべ
ての要件を満たしている。これらのプロモーターは強力
であり、生育培地の必須炭素または窒素源とは異る物質
によって誘起され、そして実験室および工業的規模で都
合良く取り扱われる。
本発明はまたイーストＰ！（０５遺伝子の上流活性部位
を包含する５′上流プロモーターエレメントならびに官
能性ＴＡＴＡポ′ツクスおよび翻訳スタートコドンに接
近した末端を包含する転写１３Ｍ姑部位からなるイース
トＰＨ０５遺伝子以外のイースト遺伝子の３′下流プロ
モーターエレメントを包含するハイブリッドプロモータ
ーの製造法に関し、この方法はイーストＰＨ０５遺伝子
の上流活性部位を含有する５′上流プロモーターエレメ
ントを官能性ＴＡＴＡボックスを包含し、翻訳スタート
コドンに接近した末端を有するＰＨ０５遺伝子以外のイ
ースト遺伝子の３′下流プロモーターエレメントに結合
させることからなる。
本発明の好ましい態様では、プロモーターエレメントの
結合は合成リンカ−を経て行われる。
ＰＨ０５遺伝子以外のイースト遺伝子の上記下流プロモ
ーターエレメントは、主要ｍ　ＲＮ　Ａスタートと翻訳
スタートコドンとの間に拡がっている強力なイーストプ
ロモーター、例えば上述したものの１種をエギソヌクレ
アーゼ例えばＢａｎ３１で部分的に消化し、そして得ら
れた５′平滑末端を合成リンカ−ＤＮＡにｉ！Ｉ！絡す
ることによって製造される。転写スタート部位およびＴ
ＡＴＡボックスに対して配列５′の約５０−１５０塩基
対を包含するＴＡＴＡボックスを保持しているプロモー
ターエレメントが選択される０選択は、例えば得られた
プロモーターエレメントを５′末端で合成リンカ−配列
を認識している制限エンドヌクレアーゼによりまたプロ
モーターエレメントの３′末端で合成リンカ−配列を認
識している制限エンドヌクレアーゼによって開裂しそし
て得られたＤＮＡフラグメントの長さをアガロースゲル
電気泳動を用いて測定することによって行われる。
３′プロモーターエレメントは当業者に既知の方法を用
いて化学合成により製造することもできる。
本発明によるハイブリッドプロモーターはイースト中の
ＩｊｆｆｆＬ％物遺伝子の増進され、調節された発現に
使用することができる。
本発明はまた１個または多重のＤＮＡ挿入を含むイース
トハイブリッドベクターに関し、而して。
各挿入はイーストＰＨ０５のＵＡＳを伴う５′上流プロ
モーターエレメントおよび官能性ＴＡＴＡボックスを包
含する転写開始部位を包含するＰＨ０５遺伝子以外のイ
ースト遺伝子の３′下流プロモーターエレメントからな
るハイブリッドプロモーターの転写コントロール下にイ
ーストに対して異種のポリペプチドをコードしているＤ
ＮＡ断片からなる。
本発明によるハイブリッドベクターはハイブリッドプラ
スミドおよび直鎖ＤＮＡベクターからなる群から選択さ
れる。
イーストに対してＰＡ種のポリペプチドをコード・して
いるＤＮＡ断片は種々のポリペプチドをコードしている
ＤＮＡ　（遺伝子）であり、これらのポリペプチドはグ
リコジル化ポリペプチド、特に高級真核生物殊に曲孔動
物例えば動物もしくは殊にヒト由来のもの、例えば栄養
物の生産のためにまた化学で酵素反応を達成するために
使用し得る酵素、あるいはヒトおよび動物の疾病の治療
にまたはその予防に有用で価値のある非酵素系ポリペプ
チド、例えばホルモン、免疫調節、抗ウィルスおよび抗
腫瘍作用を有するポリペプチド、抗体、ウィルス性抗原
、ワクチン、凝固因子、食品等が包含される。
このようなポリペプチドの例には、インシュリン、成長
因子例えば表皮、インシュリン様、マスト細胞、神経ま
たは形質転換成長因子、成長ホルモン例えばヒトまたは
中成長ホルモン、インターロイキン例えばインターロイ
キン−１または−２、ヒトマクロファージ遊走阻止因子
（ＭＩＦ）、インターフェロン例えばヒトα−インター
フェロン例エバインターフェロン−αＡ、αＢ、αＤま
たはαＦ、β−インターフェロン、γ−インターフェロ
ニノあるいはハイブリ・ンドインターフェロン例えばα
Ａ−αＤ−またはαＢ−α−Ｄ−ハイブリッドインター
フェロン、肝炎ウィルス抗原、例えば肝炎Ｂウィルス表
面またはコア抗原あるいは肝炎Ａウィルス抗原、プラス
ミノーゲン活性化因子例えば組織プラスミノーゲン活性
化因子またはウロキナーゼ、腫瘍壊死因子、ソマトスタ
チン、レニン、β−エンドルフィン、　免疫グロブリン
例えば軽鎖および（または）重鎮免疫グロブリンＤ、Ｅ
またはＧ、免疫グロブリン結合因子例えば免疫グロブリ
ンＥ結合因子、カルシトニン、ヒトカルシトニン関連ペ
プチド、血液凝固因子、例えばファクター■またはＶＩ
Ｗｃ、エグリン例えばエグリンＣ、デスルファトヒルデ
ィン例えばデスルファトヒルディン変異型ＨＶ１．ＨＶ
２またはＰＡ、あるいはヒトスーパーオキシドジムスタ
ーゼが包含される。好ましい遺伝子はヒトα−インター
フェロン、またはハイブリッドインターフェロン、ヒト
組織プラスミノーゲン活性化因子（Ｌ−ＰＡ）、肝炎Ｂ
ウィルス表面抗原（ＨＢＶｓＡｇ）、インシュリン様成
長因子■、エグリンＣおよびデスルファトヒルディン変
異型ＨＶＩをコードしている遺伝子である。
ハイブリッドプロモーターは特に上に述べたものの一つ
である。
本発明によるハイブリッドベクターは１個または多重の
ＤＮＡ挿入を含有していてもよく、各挿入は就中ハイブ
リッドプロモーターおよびイーストに対して異種のポリ
ペプチドをコードしているＤＮＡ断片からなる。ハイブ
リッドベクターが多゛重ＤＮＡ挿入、好ましくは２−４
のＤＮＡ挿入を含むときは、これらの゛ものは直列配列
でまたはハイブリッドベクターの異なった位置に存在し
ていてもよい、好ましいハイブリッドベクターは１個の
ＤＮＡ挿入または直列配列のＤＮＡ挿入を含有している
。
本発明のハイブリッドベクターにおいて、イーストハイ
ブリッドベクターは実施可能なようにポリペプチドコー
ド領域に連結されてポリペプチドの有効な発現を確実に
している０本発明の好ましい一態様において、イースト
ハイブリッドプロモーターは接合部で挿入された翻訳ス
タートシグナル（ＡＴＧ）を伴う成熟ポリペプチドのコ
ード領域に直接連結されている。イーストハイブリッド
プロモーターをポリペプチドコード領域に結合している
好ましい領域は内生ＡＴＧに直に隣接している領域であ
る。
本発明の他の好ましい態様において、シグナル配列は構
成中に包含されている。適当なシグナル配列は例えばＰ
Ｈ０５シグナル配列、イーストインベルターゼ遺伝子の
配列、あるいはα−ファクターブレープロ配列および発
現されるべきポリペプチドコード領域に自然に連結され
ているシグナル配列である。あるいはまた、融合シグナ
ル配列を構築してもよい、シグナル配列と成熟ポリペプ
チド配列との間の正確な開裂を可能とするこれらの組合
せが好ましい、他の配列例えば特定のプロセシングシグ
ナルを運んでいてもいなくともよいブローもしくはスペ
イサ−配列を前駆体分子の正確なプロセシングを容易に
するために構成中に包含させることもできる。あるいは
また、融合蛋白質を発生させることもでき、これは生体
内または試験管内での適切な成熟を可能とする内部プロ
セシングシグナルを包含している。好ましくはプロセシ
ングシグナルはＬｙｓ−Ａｒｇ残基を含有し、これは分
泌経路にあるイーストエンドペプチダーゼにより認識さ
れる。
遺伝子の発現に当り、遺伝子生成物は分泌経路に入り、
ベリプラスミックスペースに移送される。細胞壁を通っ
て培地中に更に排出されると、収率の相当な増大が可能
となる筈である。また、破壊すべき１０胞を伴わない採
取方法は簡便化することができる。更にまた、ポリペプ
チドはＮ−末端での追加のメチオニンを伴わずして採取
することができる。それは成熟コード配列前の翻訳スタ
ートシグナルとしてのＡＴＧの必要がないからである。
グリコジル化は分泌経路と組合さっているので、生成さ
れたポリペプチドはグリコジル化されているものと予想
される（但し、グリコジル化部位が存在することが条件
）、非グリコジル化ポリペプチドに対してグリコジル化
ポリペプチドがまさっているいくつかの特徴がある。グ
リコジル化ポリペプチドは非グリコジル化ポリペプチド
よりも哺乳動物細胞からの純正なポリペプチドによりよ
く類似している。更にまた、かかる蛋白質の３級構造は
多分グリコジル残基の存在にある程度依存するものであ
る。これらの分子に存在する炭水化物残基が化学的安定
性および薬理学的活性に好ましい影響を有しているもの
と予想される。
好ましくは、本発明のハイブリッドベクターは転写終了
およびポリアデニル化のための適切なシグナルを含むイ
ースト遺伝子の３′フランキング（ｆ　１ｉｎｋ　ｉｎ
ｇ）配列をも包含している。好ましい３′フランキング
配列はイーストＰＨ０５ｉｉ伝子の該配列であう。
本発明は、特に、イーストＰＨ０５遺伝子のＵＡＳを伴
う５′上流プロモーターエレメントおよび官能性ＴＡＴ
Ａボックスを包含する転写開始部位を包含するＰＨ０５
遺伝子以外のイースト遺伝子の３′下流プロモーターエ
レメントからなるハイブリッドプロモーター、断片が前
記ハイブリッドプロモーターでコントロールされている
イーストに対して異種のポリペプチドをコードしている
ＤＮＡ断片ならびに適切に配置されたイースト　ＰＨ０
５ｉ伝子の転写終了シグナルを含むＤＮＡ断片から木質
的になる直鎖状ＤＮＡ分子に関する。
相同の３′および５′フランキング配列により、ポリペ
プチドコード領域を包含する全体の直線状ＤＮＡベクタ
ーはイースト染色体中のＰＨ０５遺伝子座において安定
して一体化されている。
本発明は、特に、ハイブリッドプロモーターとは別に、
ポリペプチドコード領域および３′フランキング配列が
追加のＤＮＡ配列を含有している環状ハイブリッドプラ
スミドに関し、これらの追加のＤＮＡ配列１士プロモー
ターの機能すなわちポリペプチドコード領域の発現に対
しては必須でないかまたは重要性がより少ないものであ
るが１例えば前記ハイブリッドベクターで形質転換され
たイースト細胞の製造に当り重要な機能を果たすことも
ある。追加のＤＮＡ配列は原核生物および（または）真
核生物細胞から誘導され、そして染色体および（または
）染色体外のＤＮＡ配列を包含していてもよい０例えば
、追加のＤＮＡ配列はプラスミド、例えば細菌もしくは
真核生物プラスミドＤＮＡ、ウィルスＤＮＡおよび（ま
たは）染色体ＤＮＡ例えば細菌、イーストまたは高級真
核生物染色体ＤＮＡから発していてもよい（またはそれ
らからなる）、好ましいハイブリッドプラスミドは細菌
プラスミド、殊にエッシェリヒア・コリ　（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　ｃａｌｉ）プラスミドｐＢＲ３２２また
は関連プラスミド、バクテリオファージ入、イースト２
ＩＬプラスミドおよび（または）イースト染色体ＤＮＡ
から誘導される追加のＤＮＡ配列を含有している。
特に、追加のＤＮＡ配列はイースト複製オリジンおよび
イーストのための選択的遺伝的標識（遺伝的マーカー）
を拒有している。イースト複製オリジン例えば染色体自
律複製断片（ａｒｓ）を含むハイブリッドプラスミドは
形質転換後イースト細胞内に染色体外として維持されそ
して有糸分裂で自律複製される。イースト２用プラスミ
ドＤＮＡに相同する配列を含むハイブリッドプラスミド
も同じく使用することかでざる。これらのハイブリッド
プラスミドは細胞内に既存の２ルブラスミドに組換えさ
れることにより一体化しそして自律複製する。２ル配列
は高頻度形質転換プラスミドに特に適していて、高いコ
ピーナンバーを生じる。
イーストの選択性遺伝的マーカーについては、マーカー
の表現型発現の故に形質転換体の選択を容易にするいず
れのマーカー遺伝子をも使用することができる。イース
トの適当なマーカーは特に抗生物質耐性を発現している
ものあるいは、栄養要求イースト変異種の場合、宿主遺
伝的欠陥を相補する遺伝子である。相当する遺伝子は例
えば抗生物質シクロヘキシイミドに対して耐性を付与す
るかまたは栄養要求イースト変異株例えばＵＲＡ３、Ｌ
ＥＵ２．ＨＩＳ３またはＴＲＰＩ遺伝子でプロトトロピ
ーをもたらす。マーカーとして自律複製断片と組合され
ている構造遺伝子を使用することも可能である（但′し
、形質転換される宿主がマーカーで発現される生成物に
対して栄養要求変異株であることが条件）。
有利には、本発明のハイブリッドプラスミドに存在する
追加ＤＮＡ配列はまた複製オリジンおよびｍ菌宿主、特
にエッシェリヒア・コリの選択的遺伝的マーカーを包含
している。Ｅ、コリ複製オリジンおよびイーストハイブ
リッドベクター中のＥ、コリマーカーの存在と組合さっ
て有用な特徴がある。まず、Ｅ、コリでの生育および増
幅により大量のハイブリッドベクターＤＮＡを得ること
カテキ、また第二にハイブリー２ドベクターの構築は、
抗生物質例えばテトラサイクリンおよびアンピシリンに
耐性を付与するＥ、フリ遺伝的マーカーおよびＥ、コリ
複製オリジン両者を含むＥ。
コリ、Ｅ、コリプラスミド例えばｐＢＲ３２２等に基い
てクローニング技術の全レパートリ−を利用してＥ、コ
リで都合よく行われ、そしてイーストハイブリッドベク
ターの部分として有利に使用される。
例えば複製オリジンおよびイーストの遺伝的マーカーお
よび細菌宿主（上記参照）を含む追加ＤＮＡ配列を以下
「ベクターＤＮＡＪと称し、このものはイーストプロモ
ーターおよびポリペプチドコード領域と共に本発明のハ
イブリッドプラスミドを形成している。
好ましい態様では、本発明は、イーストハイブリッドプ
ロモーターおよび異種ポリペプチドをコードしているＤ
ＮＡ配列からなるイースト宿主において複製および表現
型選択をなし得るハイブリッドプラスミドに関する。前
記ＤＮＡ配列は。
転写スタートおよび終了シグナルならびに翻訳スタート
およびストップシグナルと共に、前記ハイブリッドプラ
スミド中に、形質転換されたイースト菌株において前記
ポリペプチドを生産するように発現されているような該
ハイブリッドプロモーターのコントロール下におかれて
いる。
本発明のハイブリッドベクターは当該分野で既知の方法
によって製造される０例えば、イーストＰＨ０５遺伝子
のＵＡＳを伴う５′上流プロモーターエレメントおよび
官能性ＴＡＴＡボックスを包含する転写開始部位を包含
するＰＨ０５遺伝子以外のイースト遺伝子の３′下流プ
ロモーターエレメントからなるハイブリッドプロモータ
ー、イーストに対して異種のポリペプチドをコードして
いるＤＮＡ断片およびイースト遺伝子の３′フランキン
グ配列を連結して前記ＤＮＡ断片が前記ハイブリッドプ
ロモーターの転写コントロール下にあるようにし、そし
て任意にベクターＤＮＡに生産された１個またはそれ以
上の直線状ＤＮＡを導入することによって製造される。
少くとも１個の制限部位好ましくは２個以上の制限部位
を有する好都合に地図のかかれた直線状または好ましく
は環状ベクターＤＮＡ例えば細菌プラスミドＤＮＡ等（
上述参照）を使用することができる。有利には、ベクタ
ーＤＮＡは既に複製オリジンおよびイーストおよび（ま
たは）細菌宿主のための遺伝的マーカーを含有している
。ベクターＤＮＡは適当な郡１限エンドヌクレアーゼを
用いて開裂される。制限されたＤＮＡを就中イーストハ
イブリッドプロモーターを含む直線状ＤＮＡフラグメン
トにそしてポリペプチドをコードしているＤＮＡ断片に
結合させる。ハイブリッドプロモーターおよびポリペプ
チドコード領域の連結前後（あるいは同時にも）に、複
製オリジンおよび（または）イーストもしくは細菌宿主
のマーカーを導入することも可能である。いずれにして
も。
制限およびアニーリング条件は、ベクターＤＮＡとハイ
ブリッドプロモーターの本質的な機能を干渉しないよう
な仕方で選択しなければならならい、ハイブリッドベク
ターは順次構成されてもよいし、または関係のある全配
列を含む２つのＤＮＡ断片を結合させることによって構
成されてもよい。
試験管内でＤＮＡ断片を接合するのに種々の技術を使用
することができる。ある種の制限エンドヌクレアーゼに
より生成される平滑末端（完全にｆｆ！基対となってい
るＤＮＡ二重らせん）を直接Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合
してもよい、より普通には、ＤＮＡ断片を一本鎖付着端
を経て連結しそしてＤＮＡリガーゼ例えばＴ′４ＤＮＡ
リガーゼにより共有閉鎖する。このような−末鎖「付着
末端」は、ＤＮＡを食違い末端を生じる他の組のエンド
ヌクレアーゼで開裂することによって形成することがで
きる（ＤＮＡ二重らせんの二本の鎖は二、三のヌクレオ
チドの距離で異った点で開裂される）、−末鎖はまた末
端トランスフェラーゼを用いてヌクレオチドを平滑末端
もしくは食違い末端に付加することにより（「ホモポリ
マーティリング」）あるいは平滑末端をもつＤＮＡ断片
の一本の鎖を適当なエキソヌクレアーゼ例えば入−エキ
ソヌクレアーゼで単にかみもどすことにより形成させる
こともできる０食違い末端の生成のための更に好ましい
アプローチは、平滑末端をもつＤＮＡ断片に、エンドヌ
クレアーゼを形成する食違い末端のための認識部位を含
む化学的に合成されたリンカ−ＤＮＡを結合させること
にある。
有効に発現されるために、遺伝子は転写（イーストハイ
ブリッドプロモーター）および翻訳機能を含む配列に関
して適正に位こしていなければならない、まず、ハイブ
リッドプロモーターを包含するＤＮＡ断片とポリペプチ
ドコード領域との結合は適正な配向で行われなければな
らない、二つの配向が可能なときは、正しい方を通常の
制限分析によって定める。誤って配向されたポリペプチ
ド遺伝子挿入を含むハイブリッドベクターは適当なＭ１
限エンドヌクレアーゼで遺伝子挿入を切除し、そして遺
伝子をハイブリッドベクターフラグメントで再結合する
ことによって再配向する。いずれにしても、末端に異っ
たＷｔｌ限部位をそれぞれ有する２［のＤＮＡ断片を結
合することによって不適切な配向は避けられる。更にま
た。ハイブリッドベクターの構成は正しい転写開始、終
了を可能とするような方法で行われなければならない、
後者切点については、転写は好ましくはイースト染色対
ＤＮＡまたはイースト２ルプラスミドから誘導されるＤ
ＮＡで終るべきである。第二に、適切なリーデングフレ
ームが確立されなければならない、有利には、転写はイ
ースト遺伝子例えばＰＨ０５またはＴＲＰＩの転写終了
シグナルを含むＤＮＡ配列で終る０通常、プロモーター
領域およびポリペプチド領域のヌクレオチド配列は結合
前に知られており、または容易に定められるので、正し
いリーディングフレームを確立するのに問題はない。
成熟ポリペプチドの直接発現が所望されるときは、シグ
ナル配列またはその部分（ハイブリッドプロモーター領
域に任意に続いているが、モして／または成熟ポリペプ
チドコード領域に任意に先行している）を例えばエキソ
ヌクレアーゼ例えばＢａｕ３１で消化して除去しておく
必要がある。イーストプロモーターをポリペプチドコー
ド配列に直接結合するための好ましい領域は主要ｍ　Ｒ
Ｎ　ＡスタートとＡＴＧ翻訳スタートコドンとの間にあ
る。この領域で接合するには、ポリペプチドコード配列
は翻訳開始のためのそれ自体のＡＴＧを有していなけれ
ばならないが、そうでないときは追加の合成オリゴヌク
レオチドを用意する必要がある。イーストハイブリッド
プロモーターはまた結合分子として合成オリゴデオキシ
ヌクレオチドによってポリペプチドコード配列に連結し
てもよい、それで、ハイブリッドプロモーター領域は可
能ならばその３′末端に制限してもよく、その結果所定
の数の１ｎ基対を欠除する。
同様に、ポリペプチドコード配列はその５′−末端近く
に制限されてもよい０次に、合成オリゴデキオシヌクレ
オチドを、結合オリゴデオキシヌクレオチドを介してイ
ーストハイブリッドプロモーターとポリペプチドコード
配列を連結するとき、失われた塩基対がＡＴＧ翻訳開始
シグナルを包含して回復し、そしてポリペプチドコード
配列がプロモーターに関連して適性なリーデングフレー
ムにあるような方式で構成することができる。
所望のハイブリッドベクターを含む結合混合物は直接形
質転換工程に用いられ、あるいはまず例えば電気泳動に
よってハイブリッドベクターを富化し、そして次に形質
転換に用いる。
中間生成物例えば木質的な機能の一つまたはそれ以上を
なお欠除しているベクターならびに本発明の最終ハイブ
リッドベクターは上述の理由から任意に細菌宿主特にＥ
、コリに形質転換される（例えば、中間生成物およびハ
イブリッドプラスミドの大量生産）、＃菌ベクター例え
ばＥ、コリプラスミドｐＢＲ３２２および＃＠複製オリ
ジンおよび遺伝的マーカーを含むそのフラグメントはか
かる理由から最も好ましいベクターである。この細菌ベ
クターを用いる場合、イーストハイブリッドベクター製
造の最終工程はイーストの遺伝的マーカーおよび複製オ
リジンの導入をも包含している。
本発明の別の特徴は、イーストに対して異種のポリペプ
チドを生産し得る形質転換されたイースト細胞の製法を
包含し、この方法はイースト４１１１胞を１個または多
重のＤＮＡ挿入を含むハイブリッドベクターで形質転換
することからなり、各挿入はイーストＰＨ０５遺伝子の
ＵＡＳを伴う５′上流プロモーターエレメントおよび官
能性ＴＡＴＡボックスを包含する転写開始部位を包含す
るＰＨ０５遺伝子以外のイースト遺伝子の３′下流プロ
モーターエレメントからなるハイブリッドプロモーター
の転写コントロール下にイーストに対して異種のポリペ
プチドをコードしているＤＮＡ断片を包含している。
有用なイーストにはサツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏ
−Ｉｌｙｃｅｓ）、クルイヴエロミセス（に１ｕ７ｖｅ
ｒｏＢｃｅ＋）　。
カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）　、ロドトルラ（Ｒｈｏｄ
ｏｔｏｒｕｌａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉ
ｓ）属および関連した属の種が包含され［Ｊ、ロッダー
（Ｌａｄｄｅｒ）、「ザ命イーストＪ　（Ｔｈｅ　Ｙａ
ａｓｔｓ）、アムステルダム、１９７１年Ｊ、特にサツ
カロミセス・セレヴイシエの菌株があげられる。
ハイブリッドベクターとイーストとの形質転換は当該分
野で既知の方法１例えば、ヒネン（Ｈｉｎｎｅｎ）等［
ブロク、ナツル、アカド、サイ、ＵＳＡ、第７５巻、第
１９２９頁（１９７８年）］によって記載の方法に従っ
て行うことができる。この方法は次の３工程に分けるこ
とができる。
（１）イースト細胞壁またはその部分の除去。
（２）ＰＥＧ　（ポリエチレングリコール）およびＣａ
２＋イオンの存在下形質転換ＤＮＡによる「裸の」イー
スト細胞（スフェロプラスト）の処理。
（３）細胞壁の再生および寒天の固体層での形質転換さ
れた細胞の選択。
好ましい方法： ａｄ　（１）：イースト細胞壁を、種々のグルコシダー
ゼ製剤例えばカタツムリ朋液［例えば。
グルスラーゼ（Ｇｌｕｓｕｌａｇｅ）またはヘリカーゼ
（Ｈｅ　Ｉ　１ｃａｓｅ）］あるいは浸透圧的に安定化
された溶液（例えば１Ｍソルビット）中の微生物から得
られる酵素混合物［例えばチモリアーゼ（ＺｙＩｌｏ１
７ａｓｅ）　］を用いて酵素的に除去される。
ａｄ（２）：イーストスフェロプラストＰＥＧの存在下
で凝集し、そして細胞質膜の局所融合が誘起される。「
融合様」条件の発生は重大であり、そして多くの形質転
換されたイースト細胞は形質転換の過程でディプロイド
（ｄｉｐｌｏｉｄ）またはトリプロイド（ｔｒｉｐｌｏ
ｉｄ）にさえなる、融合スフェロプラストの選択を可能
とする操作は形質転換体を富化するのに使用することが
できる。すなわち。
形質転換された細胞は予備選択された融合生成物の間で
容易にスクリーニングすることができる。
ａｄ（３）：細胞壁を伴わないイースト細胞は分割しな
いので、細胞壁が再生されなければならない、この再生
は通常スフェロプラストを寒天に埋込ことによって行わ
れる０例えば、溶融寒天（約５０″Ｃ）をスフェロプラ
ストと混合する。溶液をイースト生育温度（約３０″Ｃ
）に冷却すると、固体層が得られる。この寒天層はスフ
ェロプラストから必須巨大分子の急速な拡散および損失
を防止し、そしてこれによって細胞壁の再生を容易にす
るものである。しかしながら、細胞壁再生はまた予備形
成された寒天層の表面にスフェロプラストをプレートと
することによっても得られる（効率はより低いカリ。
好ましくは、再生寒天は形質転換された細胞の再生およ
び選択を同時に可能とするような方法で製造される。ア
ミノ醜生合成経路の酵素をコードし、ているイースト遺
伝子は一般に選択性マーカー（上述）として使用される
ので、再生は、好ましくはイースト最小培地寒天で達成
される。非常に高い再生効率が要求されるときは、次の
２工程の操作が有利である：（１）栄養豊富な複合培地
での細胞壁の再生および（２）細胞層を選択性寒天プレ
ートにレプリカ平板とすることによる形質転換された細
胞の選択。
ハイブリッドベクターがマーカー遺伝子を含有していな
いときは、形質転換された細胞はまた代替的方法によっ
て同定することができる。このような方法は、例えば、
ハイブリッドベクターの配列と相同性の標識ＤＮＡフラ
グメントによる正常部位雑種［例えば、ヒネツ等による
、上述］、正常イムノアッセイ（但し導入遺伝子の生成
物の抗体が入試可能）あるいは形質転換性プラスミドに
よりコードされている遺伝子生成物を測定するその他の
スクリーニング方法が包含される。
あるいはまた、イーストは本発明によるハイブリッドベ
クターおよびイーストのための遺伝的マーカーを含有す
る第二のベクターで共形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｄｏｒ
ｍｅｄ）することができる、２種の異ったベクターが共
通したＤＮＡ配列を有するときは（これらはベクターに
存在するバクチリアル配列（ｂａｃｔｅｒｉａｌ　５ｅ
ｑｕｅｎｃｅｓ）であり得る）１組換えは融合選択可能
なハイブリッド分子となるように生じる。
イーストはまた。イーストハイブリッドプロモーター、
前記ハイブリッドプロモーターによりコントロールされ
る異種ポリペプチドコード領域およびイーストＰＨ０５
遺伝子の転写終結シグナルからなる直鎖ＤＮＡベクター
ならびにイーストのための選択的マーカーを含むベクタ
ーで共形質転換することもできる。共形質転換により、
直接選択することのできないＤＮＡをとりあげたイース
ト細胞に対して富化を与え得る。コンピテント細胞は任
意のタイプのＤＮＡをとり上げるので、選択的ベクター
で形質転換された細胞の高い％は任意の追加のＤＮＡ（
例えば上記直線ＤＮＡ）をもとり込む（ｈａｒｂｏｒ）
、十分に長い相同の配列（例えば長さ約２０−１００の
デオキシヌクレオチド）により、ポリペプチド遺伝子は
安定して宿主染色体と一体化される０本発明の特定の構
成はＰＨ０５遺伝子の染色体の位置で、すなわちイース
ト染色体■で相同遺伝子との安定な一体化を与える。
本発明によるハイブリッドプラスミドを含む得られたイ
ースト菌株は、当該分野で既知の方法を用いて突然変異
および選択により異種ポリペプチドの生産に当り改善さ
れている。突然変異は例えばＵＶ照射によりまたは適当
な化学薬剤によって行うことができる。
本発明によるハイブリッドベクターによる形質転換およ
び炭素源としてグルコースを含む栄養に富んだ培地での
細胞壁の再生は好都合に行うことができ、また、細胞内
に潜在的な致死遺伝子生成物のＫＭを防止するためにグ
ルコースを含まない培地で行わなければならないグルコ
ースで訪起され得る通常のプロモーターを含むｌ＼イブ
リッドベクターで行なわれる対応する工程よりも実質的
に容易であることがわかる。
本発明はまたハイブリッドベクターで形質転換されたイ
ースト宿主に関し、該ベクターは１個または多量のＤＮ
Ａ挿入を含有し、各挿入は、イーストＰＨ０５遺伝子の
ＵＡＳを伴う５′上流プロモーターエレメントおよび官
能性ＴＡＴＡボックスを包含する転写開始部位を包含す
るＰＨ０５遺伝子以外のイースト遺伝子の３′下流プロ
モーターエレメントからなるハイブリッドプロモーター
の転写コントロール下にイーストに対して異種のポリペ
プチドをコードしているＤＮＡ断片を包含し、またその
突然変異体に関する。
更に本発明はイーストに対して異種のポリペプチドを生
産する方法に関し、本発明の方法は、一つまたは多１Ｄ
ＮＡ挿入を含むノーイブリッドベクターで形質転換され
たイースト菌株（而して各挿入は、イーストＰＨ０５遺
伝子のＵＡＳを伴う５′上流プロモーターエレメントお
よび官能性ＴＡＴＡボックスを包含する転写開始部位を
包含するＰＨ０５遺伝子以外のイースト遺伝子の３′下
流プロモーターエレメントからなるバイブリフトプロモ
ーターの転写コントロール下にイーストに対して異種の
ポリペプチドをコードしているＤＮＡ断片からなる）ま
たはその突然変異体を培養し、そして発現ポリペプチド
を単離することを特徴とする。
本発明による形質転換されたイースト細胞は。
炭素、窒素、無機塩の同化可能な源および必要に応じて
生育促進物質を含む液体培地中で当業者に既知の方法で
培養する。
種々の炭素源が使用可能である。好ましい炭素源の例に
は同化可能な炭水化物例えばグルコース、マルトース、
マンニットまたはラクトースあるいは酢酸塩例えば酢酸
ナトリウムがあり、これらは単独または適当な混合物で
使用することができる。適当な窒素源には例えばアミノ
酸例えばカサミノ庸、ペプチドおよび蛋白質およびそれ
らの分解産物例えばトリプトン、ペプトンまたは肉エキ
ス、更には酵母エキス、麦芽エキス、コーン・スチープ
φリカー、ならびにアンモニウム塩例えば塩化アンモニ
ウム、硫醜アンモニウムまたは硝醜アンモニウムが包含
され、これらは単独でまたは適当な混合物で使用するこ
とができる。使用し得る無機塩には例えばナトリウム、
カリウム、マグネシウムおよびカルシウムの硫酸塩、塩
化物、りん酸塩、および炭酸塩が包含される。更に、栄
養培地はまた生長促進物質を含有していてもよい、生長
を促進する物質には例えば生長促進剤、微量元素例えば
鉄、亜鉛、マンガン等あるいは個々のアミノ酸が包含さ
れる。
本発明によるハイブリッドプロモーターは調節されてい
るので、栄養培地の組成は生長相に適合するようにしな
ければならない、生長Ｊｉｆｆの間に、高木スフエート
濃度下で本発明によるハイブリッドプロモーターは実質
的に低減される０例えば。
ＰＨ０５のＵＡＳを伴うＰＨ０５の５′上流プロモータ
ーエレメントおよびＴＡＴＡボックスを伴うＧＡＰＤＨ
の３′下流プロモーターエレメントを包含する本発明の
最も好ましいハイブリッドプロモーターはこれらの条件
下では約５０倍に低減してしまう、従って、潜在的に有
毒な遺伝子生成物は極めて低い率で合成されるだけであ
り。
そして細胞代謝に対する有毒な効果が最小限となる。十
分な細胞密度に達したときに、栄養培地中の無機りん酸
塩レベルが好ましくは低下する（低Ｐｉ培地）、ここで
１本発明によるハイブリッドプロモーターは上昇しく抑
制解除され）。
そしてｍＲＮＡ）ランスクリプトの最高レベルが得られ
る。
培養は通常の技術を用いて行われる。培養条件例えば温
度、培地のｐＨおよび醗酵時間は所望のポリペプチドの
最高レベルが生成されるような方法で選択される。一般
に、生育は好気条件下振とうもしくはかくはんを伴う深
部培養で約２５−３５°Ｃの温度で４−８のｐＨ値例え
ば約Ｐ）（７で約４−２０時間好ましくは所望の蛋白質
の最大収率に達するまで行われる。
所望により、発現ポリペプチドの単離、精製は当業者に
既知の方法に従って行われる。
形質転換された細胞が好都合な細胞密度に生育した後１
発現蛋白質の採取のための第一工程は細胞内部から蛋白
質を遊離させることにある。たいていの操作では、細胞
壁をまず例えばグルコシダーゼによる酵素的消化により
除去する０次に得られたスフェロプラストを洗浄剤例え
ばトライトン（Ｔｒｉｔａｎ）で処理する。あるいはま
た、機械的力例えばせん断力（例えばＸ−プレス、フレ
ンチ−プレス）あるいはガラスピーズとの振とうが細胞
を破壊するのに適しそいる。得られた混合物を通常の手
段例えばポリエチレンイミンでの処理による非蛋白質性
材料の大部分の除去、硫酸アンモニウムまたはトリクロ
ロ酢酸による溶液の飽和による蛋白質の沈殿、ゲル電気
泳動、透析、クロマトグラフィー例えばイオン交換クロ
マトグラフィー、サイズ−排除りｄマドグラフィー、Ｈ
ＰＬＣまたは逆相ＨＰＬＣ１適当なセファデックス（Ｓ
ａｐｈａｄｅｘ）カラムでの分子サイジング等によって
所望のポリペプチドについて富化する。予備精製された
生成物の最終精製は例えば抗体親和クロマトグラフィー
を用いて達成される。
所望のポリペプチドがイースト細胞により細胞壁間のス
ペースに分泌された場合、簡易化プロトコールを使用し
得る。ポリペプチドは細胞壁の酵素的除去によりあるい
は化学薬剤例えばチオール試薬またはＥＤＴＡによる処
理により（ポリペプチドを放出せしめる細胞壁損傷を生
じ得る）細胞溶解なしに採取することができる。ポリペ
プチドが培地中に分泌される場合は、そのものは直接培
地から採取することができる。
得られたグリコジル化および未グリコジル化蛋白質の混
合物は例えばコンカナバリン−Ａセファロース（Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ）カラムでのクロマトグラフィーにより分
離することができる。未グリコジル化生成物はカラムを
通過し、これに対してグリコジル化生成物は選択的に吸
着され、そして通常の手段例えばケイオトロピック剤（
ｃｈａｏｔｒａｐｉｃａｇｅｎｔ）例えばＫＳＣＮと組
合せたα−メチルマンノミドで溶出することができる。
グリコジル残基を酵素的に例えばエンドグリコシダーゼ
ＨまたはＦの作用により除去することも可能である。こ
の方法により実質的に純粋な形態で未グリコジル化生成
物の生産が可能である。
本発明は更に本発明の方法に従って製造されるポリペプ
チドに関する。
本発明は特にＰＨ０５の上流活性配列、ハイブリッドプ
ロモーター、ハイブリッドベクター、形質転換されたイ
ースト細胞およびそれらの製法ならびに実施例に記載の
如くイーストに対して異種のポリペプチドの製法に関す
る。
以下の実施例は本発明を具体的に説明するためのもので
あるが、本発明を限定するものと解すべきではない。
第１図に示したＰＨＯＦｚ７）ＢａｍＨＩ−３ａ文エフ
ラグメントを含む組換えファージＭ　１３　ｍ　ｐ　９
　／　Ｐ　Ｈ０５Ｂ　ａ　ｍ　−Ｓ　ａ　ｌをＰＨ０５
プロモーターの源として使用する（欧州特許出願第１４
３，０８１号参照）、ファージＤＮＡ　（ＲＦ、複製型
）２０ルｇを制限エンドヌクレアーゼ５ａＪＩＩで消化
すると約９ｋｂの直鎖ＤＮＡが得られる。フェノール／
クロロホルムで袖山後、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ
る。
ＤＮＡを０．５ｇ［／ａｌの濃度で１０ｍＭ）リスｐＨ
８，０＋、：再懸濁する。５ａｕＩ開裂ＤＮＡ１６ｇｇ
を２０ｍＭ）リスｐＨ８，０，１９９ｍＭＮａ（、ｌ、
１２ｍＭ　　Ｍ　ｇ　Ｇ　１２　、　１２ｍＭ　　Ｃａ
Ｃｕ２および１ｍＭＥＤＴＡの１００ｕＪｌ中の２Ｕの
エキソヌクレアーゼＢａｎ３１（ＢＲＬ）で消化する。
各２．ｇＤＮＡアリコートを３０℃での培養１．２．３
．４．５および６分後に取り出しそして直ちにフェノー
ル５０体文およびＴＮＥ６０ル交と混合する。フェノー
ル／クロロホルムでの抽出およびエタノール沈ｒｒＩ後
、ＤＮＡを１００　ｇ　ｇ／ｍ７（７）５度テ１０ｍＭ
）リスｐＨ８，０に再懸濁する。Ｂａ文３１によるエキ
ソヌクレアーゼによる開裂の程度を分析するために各時
点からのＤＮＡ０．５ｐｇをエンドヌクレアーゼＢａｍ
ＨＩで消化し、モしてトリスはう酸塩緩衝剤ｐＨ８，３
（９０ｍＭ）リス−ＨＣＩ　ｐＨ８，３，９０ｍＭはう
酸、２．５ｍＭＥＤＴＡ）中の１．５％アガロースゲル
で分析する。Ｂａ１３１消化の１分当り、フラグメント
の各末端から平均して１００ｂｐが除去される。
ＥｃｏＲＩリンカ−（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣ−３′、
ＢＲＬ）の２Ａ２６ｏユニツトを１０ｍＭトリスｐＨ８
，１ｍＭ　　ＥＤＴＡｃ７）２５０ｇＭに再懸濁する。
ＥｃｏＲＩリンカ−の２ｐＬｇを６０ｍＭトリスｐＨ７
，５，１０ｍＭ　　ＭｇＣＪＪ２．１５ｍＭ　　ＤＤＴ
、ｌｏｇＭ　　ＡＴＰおよび３３ＵのＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ〔ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）
　）の７５ＩＬｕ中でキナーゼ化する。３７℃で１時間
後、混合物を室温に冷却し１次に一２０°Ｃで保存する
。
アニーリングした二本鎖のＥｃｏＲＩリンカ−を平滑末
端でＢａ１３１処理ＤＮＡフラグメントに結合させる。
Ｂａ１３１処理ＤＮＡ　（実施例１ａ参照）の０．５ｇ
ｇを６０ｍＭ）リスｐＨ７、５、ＬＯｍＭ　　ＭｇＣｌ
２．ＬＯｍＭＤＴＴ、４ｍＭＡＴＰおよび６００ＵのＴ
４ＤＮＡリガーゼ〔バイオラブズ（Ｂｉｏｌａｂｓ））
の２０ｇ１中で５０倍過剰のキナーゼ化ＥｃｏＲＩリン
カ−と室温で１６時間培養する。Ｔ４ＤＮＡリガーゼの
失活後（６５℃で１０分間）、過剰のＥｃｏＲＩリンカ
−を５０終文容量で５０ＵのＥｃｏＲＩ　（ベーリンガ
ー）で開裂する。ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで
抽出し、エタノールで沈殿させ、そして１０ｍＭトリス
、１ｍＭＥＤＴＡ　（＝ＴＥ）に再懸濁する１次に、Ｄ
ＮＡを五単位のＢａｍＨＩ（バイオラブズ）で開裂し、
そして混合物をトリス−はう耐塩緩衝剤（上述のところ
を参照）中の１．５％低融点アガロースゲル〔シグマ（
Ｓｉｇｕｍａ）　）に適用する。
バンドをエチジウムブロマイドで汚染しそして３６６ｎ
ａ＋で長波ＵＶ先光下可視化する。約１００ｂｐと６０
０ｂｐとの間の広い拡散バンドパターンをゲルから切り
とし、そしてＤＮＡを次の如くして抽出する。アガロー
スの片を６５℃で液化し、５００ｍＭ　　ＮａＣ１・に
調整し、そして６５℃で２０分間培養する。フェノール
１容量（１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　　ｐＨ７，５，１ｍ
ＭＥＤＴＡ、５００ｍＭ　　ＮａＣＪＬｔ’平衡化した
）を加える。水相をフェノールで２回そしてクロロホル
ムで１回再抽出する。ＤＮＡを冷無水エタノール２．５
容量で沈殿させそして遠心分離で採集する。ＤＮＡペレ
ットを冷８０％エタノールで洗い、次に真空乾爆する。
ＤＮＡを１ｏＩＬｆＬＴＥに再懸濁する。
ｃ）Ｍ１３ｍ　　９への１ Ｍ　１３　ｍ　ｐ　９　ｃ７）　ＲＦの３ｇｇを５０川
文容量でＥｃｏＲＩ（バイオラブズ）１５屯位およびＢ
ａｍＨＩ（ベーリンガー）１５単位で消化する。フェノ
ール抽出およびエタノール沈殿後、ＤＮＡを５０ル文　
ＴＨに再懸濁する。切断ベクターＤＮＡ５ｐｕ　（約２
００　ｎｇ）を上記試料（実施例１ｂに記載した種々の
Ｂａ１３１消化物から得られるＤＮＡフラグメント）１
０ｕＪ１と混合し、１５時間６０　ｍ　Ｍ　トリス／Ｈ
ＣｌｐＨ７、５，６ｍＭ　　ＭｇＣｕ２．１０ｍＭＤＴ
Ｔ、１ｍＭ　　ＡＴＰおよび２００ＵのＴ４ＤＮＡリガ
ーゼの存在下２０ｇ文の総容縫で結合させる。菌株Ｅ、
コリ（Ｅ−ｃｏｌｉ）　Ｊ　Ｍ　１０１　（１）能力細
胞の形質導入は、ニュー・イングランド（Ｎｅｗ　Ｅｎ
ｇｌａｎｄ）バイオラブズで刊行されたマニュアル「Ｍ
１３クローニング・アンド参シークエンシング・システ
ムＪ　　（Ｍ　Ｌ　３　　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄｓｅ
ｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ）に従って行う、多数
の白色プラークからのファージが成長し、そして制限酵
素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩでの開裂によってそれら
のＤＮＡ挿入のサイズを分析する。
址 上記マニュアルに記載の如くサンガー等〔ブロク、ナシ
ナル、アカド、サイ、Ｕ　Ｓ　Ａ　（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　、第７
４巻、第５４６３頁、１９７７年〕のジデオキシＤＮＡ
配列システムを用いて塩基配列決定を行う、欠失終末点
を以下に示す。
Ｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　−３３Ｍ１３ｍ
ｐ９　　ＰＨ０５Ｂａｍ−３ａｌをＢａｍＨＩで切断す
る以外はａ−ｃに記載の如く同じようなセットのＢａＪ
１３１の欠失を行う。
Ｂａｕ３１消化分子をＥｃｏＲＩおよび５ａｌＩで切断
し、そして発生したフラグメントをＥｃｏＲＩおよび５
ａｕＩで消化したＭ　１３　ｍ　ｐ９にターニングする
。欠失終末点を以下に示す。
Ｔ’　　　　　　　　　　　　　　　　−３９３ｆ）　
　　、ＰＨ０５プロモーターノ′１のｄ）で記載したＢ
ａＪ１３１欠失セットでは末端がＥｃｏＲＩ部位である
「左手ＪＰＨ０５プロモーターフラグメントが生成し、
またｅ）で記載したＢ　ａ、Ｑ　３１欠失セツトではＥ
ｃ　ｏＲＩ部位が末端である「右手Ｊ　ＰＨ０５プロモ
ーターフラグメントが生成する０種々の位置の「左手」
および「右手」を組合せることにより、欠失ＤＮＡの部
位にＥｃｏＲＩリンカ−断片を含有する内部欠失が生成
される０個々の内部欠失は、制限エンドヌクレアーゼＥ
ｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ　（左手）またはＥｃｏＲＩ
および５ａｉＩ（右手）によるＭ１３ｍｐＬＪ導体から
「左手」および「右手」を切断し、そしてｂ）に記載の
如く軟アガロースゲル電気分解を経て相当するフラグメ
ントを単離することによって構成される０等モル徴の「
左手」　「右手」および２００ｎｇノＢ　ａｍＨｒおよ
び５ａｕＩ消化Ｍ　１３　ｍ　ｐ　９ベクターＤＮＡを
Ｃ）に記載の如く結合する。Ｅ、コリＪＭＩ　０１に形
質導入した後白色ブラー〃をとり上げ、ＲＦを生成させ
、そして制限分析（ＢａｍＨＩ、Ｓａ文Ｉ、ＥｃｏＲＩ
）により分析する０次の手が結合されて特定の内部欠失
（第１図参照、ヌクレオチドの番号付け）が生成される
。
欠失ヌ クレオ チドの Ｂ　　　　Ｔ’　　　Δ８　−４７０　　／／−３９４
７７ＣＴ’　　　Δ９　−４２１　　／／−３９４２８
０Ｓ′　　　Δ１０　−３９９　　／／−３８３１７Ｅ
　　　　Ｒ’　　　Δ１１　−３９１　　／ｌ−３８２
３０Ｆ　　　　Ｑ’　　　Δ１２　−３８８　　／／〜
３４７　　　２２Ｇ　　　　Ｐ’　　　Δ１３　−３４
９　　／／−３３３１７ＨＯ’　　　Δ１４　−３２７
　　／／−３０７２１１Ｎ’　　　Δ１５　−２９９　
　／／〜２７８　　　２２Ｋ　　　　Ｍ’　　　Δ１８
　−２８２　　／／−２８３２０Ｌ　　　　Ｌ’　　　
Δ１７　−２５４　　／／−１７５８０Ｍ　　　　Ｌ’
　　　Δ１６　　−２２５／／−１７５５１Ｎ　　　　
Ｌ’　　　Δ１９　−２１０　　／／−１７５３８ＯＬ
’　　　Δ２０　−１８６　　／／−１７５１２０Ｋ’
　　　Δ２１　−１８８　　／／−＋１３３　　　２４
０　　　　Ｉ’　　　Δ２２　−１８８　　／／−１２
５８２０Ｈ’　　　Δ２３　−１８８　　／／−８８８
９Ｐ　　　　Ｈ’　　　Δ２４　−１１０　　／１−９
８　　　１３Ｐ　　　　Ｃ’　　　Δ２５　−１１０　
　／／〜８４１７Ｐ　　　　Ｆ’　　　Δ２６　　−１
１０／／−９０２１Ｑ　　　　Ｅ’　　　Δ２７　−８
７　　／／−７５１３ＲＤ’　　　Δ２６　　−５８ｔ
ｔ−４８８ＲＣ’　　　Δ２θ　−５８／／−４２１５
ＲＢ’　　　Δ３０　−５６　　／／−３８２１Ｓ　　
　　Ａ’　　　Δ３１　−３２　　／ｌ−２５８＝−ｉ
　　２：　　ＰＨ０５プロモーターの　部　ノーの主１
♂±■ 実施例Ｉｆ）に記載した種々の欠失を、野生型ＰＨ０５
Ｂａｍ−３ａ立フラグメントを欠失バージョン（ｖｅｒ
ｓｉｏｎ）で鐙き換えることによりプラスミドｐＪＤＢ
２０７／ＰＨ０５（Ｒ，ハグエナウエルーツアピス（Ｈ
ａｇｕｅｎａｎｅ　ｒ−Ｔｓａｐ　ｉＳ）およびＡ、ヒ
ネン（Ｈｉｒ＋ｎｅｎ）　、モレキュラ・アンド・セル
ラ・バイオロジイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ
ｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）　、第４巻、第２６６８
−２６７５頁、１９８４年）にクローニングする。イー
スト菌株Ｓ、セレヴイシｘ　（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）　Ａ　Ｈ２１６（欧州特許出願第１４３，０８１号
参照）の形質転換後、酸ホスファターゼ活性をトエ〔↑
ｏｈ−ｅ）等により記載されたようにして（Ｊ、バタテ
リオル（日ａｃｔｅｒｉｏ１）、第１１３巻、第７２７
頁、１９７３年〕測定する。欠失Δ１１およびΔ１２は
約１０倍のＰＩ（０５活性の減少を示し、そしてＰＨ０
５発現に必須であるヒ流領域（「上流活性部位Ｊ　、Ｕ
ＡＳ）を定義する。同じような低下効果が欠失Δ１７（
約５倍の減少）およびＴＡＴＡボックス欠失Δ欠失−２
３６（約３０倍の減少）について認められる。他の全て
の欠失はほぼ野生型レベルの活性を示す、これらの結果
から、ＰＨ０５の発現のための必須情報の３領域が次の
位置に存在していることが示唆される。
１、　位置−３４９と−３８３との間（ＵＡＳｌ） ２、位置−２２５と−２６３との間（ＵＡＳ３、位置−
８７と−１２５との間（ＴＡＴＡボックス） ＰＨ０５のＵＡＳ　１またはＵＡＳ２またはＵＡＳ　１
とＵＡＳ２を含有するフラグメントは適当なエンドヌク
レアーゼで開裂することにより１１換え７７一ジＭ　１
３　ｍ　ｐ　９　／　Ｐ　Ｈ０５Ｂ　ａ　ｍ　−５ａ文
（実施例１参照）から生産することができる。
ＵＡＳＩは次の式を有する２６８ｂｐ　　ＢａｍＨＩ−
Ｃ１ａＩフラグメントに含まれている。
ＧＡＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴ（ｉＴＡＴＴＣＡＡＣＡＡＣ
ＡＡＴＧＣＣＣＡＡＡＴＡＴＩＩ；ＴＣＡＡＣＧＴＡＴ
ＴＴＧＧＡＡＧＴＣＡＴＣＴＴＡＴＯＴＱＵＡＳ２は次
の式を有する１１００ｂ ｐＣ１ａＩ−Ｂｓｔフラグメントに含まれている。
ＵＡＳＩおよびＵＡＳ２共に次の式を有する３６８ｂｐ
　　ＢａｍＨＩ−ＢｓｔＥＩＩＩｒラグメント中に存在
している。
ＣＡＴＣＣＣＡＡＡＣＴＴＣＴ八ＴＴ（：へＡＣへＡ（
ｉＡへＴＣＣＧＣＡＡＡＴ八ＴＣＴＣ八ＡＣＧＴＡへＴ
ＴＧＧへＡＧＴＣＡＴＣＴｒＡτＧＴＧＣ＋ＩＧＡＡＧ
Ａ（ｌｉＡＴＣＧＣＡＣＡＴＧＣＣＡＡＡＴＴＡＴＣＡ
ＡＡＴＴＧ　。
実施例１および２では、ＰＨ０５遺伝子の位置−３６５
のまわりの領域（ＵＡＳＩ　（ＰＨ０５）〕および位置
−１８０のまわりの別の領域（ＵＡＳ２　（ＰＨ０５）
）を調［機能を有するＵＡＳのための候補物を可能とす
る。ＵＡＳｌ　（Ｐ）（０５）は２６８ｂｐ　　Ｂ　ａ
　ｍ！（Ｉ　−Ｃ１ａＩフラグメント中に含まれ、一方
ＵＡＳ１（ＰＨＯ５Ａ）およびＵＡＳ２　（ＰＨ０５）
両者は３６８ｂｐ　　Ｂａｍｔ（Ｉ−ＢｓｔＥＩｒフラ
グメント中に含有される。これらの二つのフラグメント
は各々ＧＡＰＤＨのＴＡＴＡボックスおよび転写開始部
位を包含する２種の異ったＧＡＰＤＨ下流プロモーター
エレメントに融合される。
ａ）イースト′　−ライブラリーのｔ′野生型サツカロ
ミセス・セレヴイシエ （ＳａｃｃｈａｒｏＩＩ１７ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）菌株５２８８Ｃからの総高分子層イーストＤＮＡ
（Ｍ、Ｖ、オルセン（Ｏｌｓｅｎ）等、１９モル、ビオ
ル（Ｊ、　Ｍｏ！。
Ｂｉｏｌ、）、第１３２巻、第３８７頁、１９７９年〕
３０、ｇを供給業者の指示の如（ＥｃｏＲＩメチル化緩
衝剤２５０８Ｌ文中ＥＣｏＲＩメチラーゼにューイング
ランド、バイ才うブズ）２単位と共に３７℃で３０分間
培養する。ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、２５ｍＭ）
リス・ＨＣｌｐＨ８，５，２ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　（Ｅ
ｃｏＲＩ”緩衝液）〔Ｈ，メイヤー（Ｍｅ７ｅｒ）、　
Ｆ　Ｅ　Ｂ　５Ｌｅｔｔ、、第９０巻、第３４１頁、１
９７９年）５００ｐｉに再懸濁し、ＤＮＡフラグメント
のサイズ分布が３０−５０　ｋ！４囲の最大値を有する
までＥｃｏＲＴ　（ベーリンガー）で消化する（入ＤＮ
ＡのＸ　ｈ　ｏ　Ｉ消化により適当な３３ｋｂおよびｌ
　７ｋｂマーカーが提供される）。
ＥｃｏＲＩ’条件下で消化したイーストＤＮＡをＳＷ４
０ローターで３８’ＯＯＯｒｐｍで６時間ショ糖勾配（
１０ｍＩ’ｖｌトリス・ＨＣｌ　ｐＨ７，５，１ｍＭ　
　ＥＤＴＡ）でサイズ分別する。
３０フラクシヨン各０　、４ｍｌを勾配のトップから集
める。フラクション１６はサイズ３Ｏ−４０ｋｂのＤＮ
Ａフラグメントを含有している。このフラクションのＤ
ＮＡ（３ｇｇ）をエタノールで沈殿させ、モしてＥｃｏ
ＲＩで直線化したコスミ７ドベクターｐＹｃｉ（Ｂ、ホ
ーン（Ｈａｈｎ）等、「ゼネティック・エンジニアリン
グ（ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）Ｊ　、第
２巻、第１６９頁、ニューヨーク１９８０年〕の１ルｇ
に総量１５用立中で結合させる。結合は供給業者が記載
している緩衝剤を用いて３００Ｕ　　Ｔ４　　Ｉ）ＮＡ
リガーゼにューイングランドバイオラブズ）で実施する
。ＤＮＡを試験管内でバクテリオファージ入（Ｂ、ホー
ン、「メソド・イン・インチモロシイＪ　（Ｍｅｔｈｏ
ｄｇｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇり、第６８０、第２９９
頁、ニューヨーク１９７９年〕にパッケージする０組立
ファージを用いてＥ、コリ菌株ＨＢＩＯＩ（ｒθ、ｆｆ
１ｅ、Ｉｅｕｅ　、　　ｐｒａｅ　、　ｒｅｃＡ）ｋ を形質導入する。形質導入の効率はｐＹｃｕベクター１
ｐＬｇ当り約５０００アンピシリン耐性コロニーである
。
３０００ａＩＩｌｐＲコロニーをとりあげ、１１００ｐ
−／−アンピシリンを含有するＬＢ培地〔１０ｇバクト
　（Ｂａｃｔｏ）−トリプトン〔ディフコ（Ｄｉｒｃｏ
））　、　　５　ｇバクト・イースト・エクストラクト
　（Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ）　（デ
ィフコ）、ｉ。
ｇ　　ＮａＣｕ）中マイクロタイターディツシュのウェ
ルで個々に生育させる。
ｂ）イーストＧＡＰＤ）Ｉｉ　　　の−離」二記の遺伝
子ライブラリーを次の構造５′−ＧＣＴＣＣＡＴＣＴＴ
ＣＣＡＣＣＧＣＣＣＣ−３’を有する合成オリゴヌクレ
オチド〔板金等、Ｊ。
アム、ケム、ツク（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓａｃ
、）、第９７巻、第７３２７頁、１９７５年；Ｊ、Ｆ、
Ｍ、デ拳ローイ（ｄｅ　Ｒｏｏｉｊ）　等、レクル−ト
ラブ拳キム・ペイノーバス（Ｒｅｅｌ、　Ｔｒａｖ、　
Ｃｈｉｍ、　Ｐａｙｓ−Ｂａｓ）、第９８巻、第５３７
頁、１９７５年、ホスホトリエステル法を用いて製造〕
でスクリーニングする。オロゴヌクレオチリ１０ｇｇを
マニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等によって記載され
ている如く〔「モレキュラー−クローニングＪ　　（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、コールド・スプリ
ング・ハーバ−・ラボ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂ、）、１９８２年、第１２５頁〕総５
０．文容量でＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリン
ガー）γ−３２Ｐ−ＡＴＰ（３００ＱＣｉ／ｍ　ｍｏｌ
、１０ｐＣｉ／Ｊｔ、Ｑアメルシャム）１０．ｇｕを用
いてキナーゼ化する。同じ筆者が記載している如く（上
記文献、第３１２頁）コロニー交雑を行う、陽性コロニ
ーをコダック（Ｋｏｄａｋ）Ｘ　−５ＸＶｊ７　イルム
を用いるオートラジオグラフィーを用いて検定する。プ
ラスミドＤＮＡ単＃（欧州特許出願第１００，５６１号
参照）によりＧＡＰＤＨをコードしている２１００ｂ　
ｐ　　Ｈｉｎｄｍフラグメントを含むハイブリッドクロ
ーンカ生成する（Ｊ、Ｐ、ホランド（Ｈｏｌ　！ａｎｄ
）等、Ｊ、ビオル、ケム（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ
、）　、第２５４巻、第９８３９頁、１９７９年〕、年
目。
ニングされたＤＮＡの真正であることの最終の立証は、
二重鎖ＤＮＡについてＧ、Ｆ、ホンダ（Ｈａｎｇ）が報
告しているジデオキシ塩基配列決定プロトコール〔バイ
オサイエンスψレボーツ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｒｅ
ｐｏｒｔｓ）　、第１巻、第２４３頁、１９８１年〕と
組合せた上述のオリゴヌクレオチドを用いるＤＮＡ塩基
配列決定実験に由来する。
クローニングされたＧＡＰＤＨ遺伝子はホーランド等に
よって報告されているｐｇ、４９１　と同じ塩基配列を
有している（Ｊ、ピオル、ケム、第２５５頁、第２５９
６頁、１９８０年〕。
ＧＡＰＤＨ遺伝子（第２図参照）のＡＴＧから−２７乃
至−６７５の位置を包含する６４９　ｂ　ｐＴａｑ　Ｉ
フラグメントを、上記ｌ＼イブリッドプラスミドをＴａ
ｑｒにューイングランドバイオラブズ）で消化し、１．
２％軟アガロースゲルでＤＮＡフラグメントを分離し、
そしてＤＮＡを熱フェノールで抽出することによって単
離する（実施例１参照）、ＴａｑＩフラグメントのクロ
ーニングはｐＢＲ３２２のＣＪｌａＩ部位に行われ：ｐ
ＲＢ３２２のｌｌｊ−ｇを供給業者の指示とおりＣｆＬ
ａＩにューイングランドバイオラブズ）の３単位で開裂
する。フェノール化、切断されたベクター３００　ｎｇ
を総合１２０ｇ文でＴ４ＤＮＡリガーゼ２００Ｕを用い
て挿入ＤＮＡ　（６４９ｂｐ　　Ｔａｑフラグメント）
約３００ｎＨに結合させる。アンピシリン耐性に対して
Ｅ、コリＨＢ１０１への形質転換を行う、プラスミドＤ
ＮＡを制限分析（Ｔ　ａ　ｑ　Ｉ、ＤｒａＩ）により製
造し、分析する。ＴａｑＩフラグメントの配向はプラス
ミドのＢａｍＨＩ部位と組合せた制限エンドヌクレアー
ゼＤｒａＩを用いて確認し、そしてｐＢＲ３２２の旧ｎ
ｄＩ［１部位に近い一６７５位のＴａｑＩ部位を有する
プラスミドを選定する。ｐＢＲ３２２／ＧＡＰＤＨと称
するこのプラスミドをＢａｍＨＩにューイングランドバ
イオラブズ）を用いて直線状化し、Ｂ　ｇ　ｌ　Ｈリン
ガ−（５′−ＣＡＧＡＴＣＴＧ−３’、ニューイングラ
ンドバイオラブズ）を用いる以外は実施例１の如くして
Ｂａｕ３１での消化を行う。そして消化されたプラスミ
ドを総容量２０ル文で５ルｇ／文の濃度で直接環化する
。Ｂａ交３１短１１Ｔａｑｉフラグメントのサイズを〃
１限分析（ＢａｌＨおよび旧ｎｄｍを使用する）により
測定する。ＡＴＧ上流からＧＡＰＤＨプロモーター中に
約２００ｂＰおよび２６５ｂｐ伸びているＤＮＡフラグ
メントを含む２種のクローンを選定する６両者のフラグ
メントは約−１４９ｂｐで推定ＴＡＴＡボックスを含有
している。これらのクローンはＤＮＡのｐＢＲ３２２由
来部分になお８に製の源を含有し、そしてそれぞれｐＧ
ＡＰＤＨ−ＦおよびｐＧＡＰＤＨ−Ｆと称する。
コード１−　の１　せ Ｉ）ＧＡＰＤＨエレメント（第３図参照）ＧＡＰＤＨ遺
伝子のＡＴＧの一２７位乃至近接する位置でのＴａｑＩ
部位からＧＡＰＤＨプロモーターエレメントを伸長させ
るために次の構造を有する２種の合成相補オリゴヌクレ
オチドを合成する。
これらのオリゴヌクレオチドにより末端ＥＣ０ＲＩ部位
の発生を伴って一２６位乃至−５位の純正なＧＡＰＤＨ
プロモーターｍ基配列を提供する。プラスミドｐＧＡＰ
ＤＥ−Ｅおよび−Ｆの各２１Ｌｇを５０１Ｌ！ｌのＴａ
ｑ１６単位で消化し、そして得られた混合物をフェノー
ル化し、エタノール沈殿し、そして水１０ル文に再懸濁
する０合成オリゴヌクレオチドを、１０ｍＭトリス・Ｈ
ＣＪｌ　　ｐＨ７，５、ＬＯｍＭ　　ＭｇＣ１ｚ、５０
ｍＭ　　ＮａＣ１を含む溶液１ＯＯＪＬｆＬに各−末鎖
２ル文を混合し、９０°Ｃに３分間加熱し、そして溶液
を室温にゆっくりと冷却（約３時間以内）することによ
ってアニーリングする。
ＴａｑＩ消化プラスミド各１ル旦をＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａ
、リガーゼ８００Ｕを用いて約１８時間２０ＩＬｆＬ容
征の７ニーリングしたオリゴヌクレオチド約２０倍モル
過剰量と混合する。混合物全体をＢａ交■にューイング
ランドラブズ）３単位で消化する。ＤＮＡフラグメント
を１．５％軟アガロースゲルで分離する。それぞれ約２
００ｂｐおよび２６５ｂｐのＢｆｆｉｒｌ−ＥｃｏＲＩ
フラグメントをゲルから切断し、抽出しそしてエタノー
ル沈殿させる。
プラスミドｐＧＡＰＤＨ−ＥをＢｇ立■およびＥｃｏＲ
Ｉで消化し、そして大型の（約３．５ｋｂ）フラグメン
トを単離する。このフラグメントをベクターとして使用
して、上述したのと同じ結合、形質転換およびプラスミ
ド単離条件を用い２６５ｂｐおよび２００ｂｐ　　Ｂ　
ｇ交ＩＩ　−ＥｃｒＲＩフラグメントにクローニングす
る。生産されたプラスミドをＰＧＡＰＤＨ−ＥＵおよび
ｐＧＡＰＤＨ−ＦＬと称する。ｐＧＡＰＤＨ−ＥＬおよ
びｐＧＡＰＤＨ−ＦＬにクローニングされたＢ　ｇ　ｌ
　ＩＩ　−Ｅ　ｃ　ｏ　蓼ｒ　フラグメントのＤＮＡ配
列を第４図に示す、フラグメントの正確なサイズはそれ
ぞれ２６６ｂＰおよび２０１ｂｐである。
ＩＩ）ＵＡＳＩ　　ＰＨ０５・　　エレメントプラスミ
ドｐ３１／Ｙ（欧州特許出願第１００．５６１号参照）
３ｇｇをＣ又ａＩにューイングランドラブズ）６単位で
消化する　３を劣性末端をマニアナイス（上述）に従っ
て、Ｅ、コリＤＮＡポリメラーゼ■（ベテスダ・リサー
チ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅＳ）　）のフレナラ（Ｋｌ
ｅｎｏｖ）　フラグメントとの反応で満たす−ＢｇｌＨ
リンが−（５′−ＣＡＧＡＴＣＴＧ−３’）を実施例１
の如く加える。ＤＮＡを５ａｕＩおよびＢｇｕｌｌ（二
、−イングランドバイオラブズ）で消化し、そして１％
軟アガロースゲルで処理する。５４８ｂＰフラグメント
を上述の如くゲルから切断し、フェノール化し、そして
エタノール沈殿させる。
■）プラスミド　ＪＤＢ２０７ＲＰＨ０５−１以工二屈
戎（第５図参照） このプラスミドはエグリン（ｅｇｌｉｎ）Ｃコード望域
およびＰＨ０５形質転換ターミネータ−からなるＤＮＡ
フラグメントの源である。
Ａ）　　　ＪＤＢ２０７ベクターフラグメントの一讐 プラスミドｐＪＤＢ２０７Ｒ／Ｉ　Ｆ　（α−３）（欧
州特許出願第１００．５６１号）６単ｇを制限エンドヌ
クレアーゼＢａｍＨＩでの完結に消化する。サイズ６．
８５ｋｂおよびｌ　、１５ｋｂの得られたＤＮＡフラグ
メントをエタノールで沈殿させ、そして５０ｍＭ）リス
−ＨＣｕ　ｐＨ８，０の４００ｕｌに再懸濁させる。仔
牛賜アルカリ性ホスファターゼ（ベーリンガー、マイハ
イム）４．５単位を加える。混合物を３７℃で１時間培
養する０次にホスファターゼを６５℃で１時間培養して
不活化する。溶液を１５０ｍＭ　　ＮａＣ１に調節する
。ＤＮＡ溶液を１５０ｍＭ　　ＮａＣ１および１ｍＭ　
　ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ）リスーＨＣ文　ＰＨ７，５
で平衡化したＤＥ５２　（ワットマン（Ｗｈａ　ｔｍａ
ｎ））陰イオン交換体１００ｇ１ベツドにかける。同じ
緩衝剤で洗滌した後、ＤＮＡを１．５ＭＮａＣ文、ｌＯ
ｍＭ）リス−ＨＣＪＩ　　ｐＨ７，５，１ｍＭ　　ＥＤ
ＴＡの４００７Ｌｆｌで溶離しそしてエタノールで沈殿
させる。大型（７）６．８５ｋｂ　　ＢａｍＨ工フラグ
メントをト’Ｊノーホ／ｌ、酸ｆｆｉ　−Ｅ　Ｄ　Ｔ　
Ａ　ｗＩ衝剤ｐＨ８，３中０．６％低融点アガロースゲ
ルで小型のフラグメントから分離する。
プラスミドｐ３１／Ｒ（欧州特許出願第１００．５６１
号）１０川ｇを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよ
びＢａｍＨＩで消化する。
得られた３種のフラグメントをトリス−はう耐塩−ＥＤ
ＴＡ緩衝剤ＰＨ８，３中０．６％低融点アガロースゲル
で分離する。５３４ｂｐＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグ
メントを単離し、このものはｍＲＮＡスタート部位を包
含するＰＨ０５プロモーターを含有している。
プラスミドｐＭＬ１４７（欧州特許出願第１４６．７８
５号）８ｇｇを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよ
びＥｃｏＲＩで消化する。
得られた２種のＤＮＡフラグメントをトリス−はう酸塩
−ＥＤＴＡ緩衝剤ｐＨ８，３中０．６％低融点７カロー
スゲルで分離する。２２１ｂＰフラグメントを単離する
。
Ｄ）旦ＮＡフラグメントの 適当な接着末端を有する上記３種のフラグメント（実施
例３、ｄ、［Ａ　−Ｃ）を一つの反応で結合させる。６
．８５ｋｂ　　ＢａｍＨＩベクターフラグメント０．１
ｐｍｏｌｅ（０，４５ｇｇ）、５３４ｂｐ　　ＢａｍＨ
Ｉ−ＥｃｏＲＩＰＨＯ５プロモーターフラグメント０．
２ｐ回ｏｌｅ（７０用ｇ）およびｐＭＬ１４７の２２１
ｂｐＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントの０．２ｐ　
ｍｏｌｅ　（２９ｎｇ）を結合させる。３種のＤＮＡフ
ラグメント全部は低融点アガロースの小さいゲルブロッ
ク中に含まれている。アガロースゲルの３片をブー・ル
し１，６５℃で液化し、そして２倍に希釈する。結合は
１５°Ｃで１６時間６０ｍＭ）リス−ＨＣＪＩ　　ｐＨ
７，５、ｌｏｍＭＭ　ｇ　Ｃｌ　２、ｌｏｍＭ　　ＤＴ
Ｔ、１ｍＭＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリン
ガー、マンハイム）１６単位を伴う総量２７０ｇ１中で
行われる。結合混合物の１０．ｉアリコートをカルシウ
ム処理、形質転換コンピテントＥ、コリＨＢ１０１細胞
１００川見に加える。
２４の形質転換されたａｍｐＲコロニーをアンピシリン
１００ルｇ／−を含むＬＢ培地で個々に成育させる。プ
ラスミドＤＮＡをホルムズ等の方法〔アナル、ビオヘム
、第１１４４ｊ、第１９３頁、１９８１年〕に従って製
造し、そして旧ｎｄｍ／　Ｅ　ｃ　ｏ　Ｒに重消化によ
り分析する。６００ｂｐ　　ＥｃｏＲＩ−旧ｎｄＩ［Ｉ
フラグメントの出現は、特別なりローンが正しい配向で
発現ベクターに１申入されたＰＨ０５プロモーター−エ
グリンＣ−ＤＮＡフラグメントを有することを指示して
いる。予想どおり、クローンの約５０％は右配向に挿入
を有している。これらのクローンの一つを単離し、そし
てｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＥＧＬと称する。
プラスミドｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＥＧＬの６Ｊ
ｊ−ｇを制限エンドヌクレアーゼ旧ｎｄＩＩＩおよび５
ａｌｌで完全に消化する。大型の６．１ｋｂ（ベクタ一
部分）フラグメントを軟アガロースゲル電気泳動、フェ
ノール抽出およびエタノール沈殿によりｌｉＩする。ベ
クターＤＮＡを水２０ｐＬｌに再懸濁する。エグリンフ
ラグメントがＨｉｎｄＥ［ＩおよびＥｃｏＲＩでＰＪＤ
Ｂ２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＥＧＬを消化することにより生
成される。得られた６００ｂｐフラグメントを軟アガロ
ースゲル電気泳動、フェノール抽出およびエタノール沈
殿により分離する。エグリンフラグメントをＨ２Ｏの２
０用文に再懸濁する。
ｒＶ）ＵＡＳＩ　　ＰＨ０５エレメント　　いるフラグ
メントのト　　ｎ６　ジ■ａ 次の４種の成分を用いて結合を行う。６．１ｋ　ｂ　　
Ｈｉｎｄｍ　−Ｓ　ａ　ｌ　Ｉベクターフラグメント０
．５．ｇ、６００ｂｐ　　ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｌｌｌ
エグリンＣフラグメント１１００ｎ、ｐＧＡＰＤＨ−Ｅ
Ｌの２６６ｂｐ　　ＢｇＪＬ［ｌ−ＥＣ０ＲＩフラグメ
ント２００ｎｇおよびＵＡＳ　ｌ　　（ＰＨ０５）を包
含する５４８ｂｐ　　Ｓ　ａｎ　Ｉ−ＢｇＪＩＨ−Ｅｃ
ｏＲＩフラグメン）ｌＯＯｎｇ、結合は上述の如くして
行われる。アンピシリン耐性に対するＥ、コリＨＢＩＯ
Ｉの形質転換、プラスミドｅｌＳ階、および陽性クロー
ンの制限分析は制限エンドヌクレアーゼ旧ｎｄｍ、Ｅｃ
ｏＲ１，ＢｇＪｌｌｌおよびＳａ文Ｉを用いて先の述べ
た如くして行われる。１種の陽性クローンを選定し、そ
してｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＥＬ−ＥＧＬ　（ＵＡＳｌ
）と称する。
ｐＧＡＰＤＨ−ＦＬの２０Ｌｂｐ　　Ｂｇ！Ｑｌｒ　−
ＥｃｏＲＩフラグメントを用いて類似の構築を行う、生
成されたプラスミドをｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＦＬ−Ｅ
ＧＬ　（ＵＡＳ　１）と称する。
築 −に記プラスミド（■参照）３ル立をＢｇ文ＩＩで消化
する。フェノール抽出およびエタノール沈殿後、ＤＮＡ
を水に再懸濁する。３′劣性（ｒｅｃｅｓｓｅｄ）末端
をＴＩ）で述べた如くフレナラＤＮＡポリメラーゼで満
たす、プラスミドを７０°Ｃで１０分間加熱して酵素を
不活化する。
５ａＪＩＩ（バイオラブズ）で消化した後、大型のフラ
グメント（約７．２ｋｂ）を軟アガロースゲル電気泳動
およびフェノール抽出で単離しそしてエタノール沈殿し
たＤＮＡを水に再懸濁する。同様にして、プラスミドｐ
３１／ＹをＢ　ｓ　ｔ　Ｅ　ＩＩで消化し、ＤＮＡポリ
メラーゼ（タレナラフラグメント）で処理し、そしてＳ
ａ文工で開裂する。
６５１ｂｐフラグメントを上述の如くして単離する。上
記ベクターＤＮＡ２００ｎｇと６５１ｂｐフラグメント
との結合により次のプラスミドが得られる。
ｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＥＬ−ＥＧＬ　（ＵＡＳＩ＋Ｕ
ＡＳ　２）（ｐＧＡＰＤＨ−ＥＬからの２６６ｂｐ　　
Ｂｇ立Ｈ−Ｅ＋、ｏＲＩフラグメントを包含） ｐ、１ＴＤＢ２０７／ＡＰＡＰＦＩ、−ＥＧＬ　（ＵＳ
ＡＩ＋ＵＳＡ２）（ｐＧＡＰＤＨ−ＦＬからの２０１ｂ
ｐ　　Ｂｇ交ｒＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを包含） 実施例３ｄｒＶおよび３ｄＶの４種のプラスミドをそれ
ぞれ、ヒネン等〔ブロク、ナツル、アカド、サイ、ＵＳ
Ａ、第７５巻、第１９２９頁２１９７８年〕によって記
載された形質転換プロトコールヲ用いて、サツカロミセ
ス・セレヴイシ工菌株ＧＦＲ１８（ａ、ｈｉｓ３−１１
．ｈｉｓ３−１５、１ｅｕ２−３、Ｉｅｕ２−１１２．
　ｃａｎＲ）に導入する。形質転換されたイースト細胞
をロイシンを欠除したイースト最小培地プレートで選定
する。単独形質転換イーストコロニーを１１６し、そし
てサツカロミセス・セレウ゛イシェＧＲＦ１８／ｐＪＤ
Ｂ２０７／ＰＡＰＥＬ−ＥＧＬ　（ＵＡＳｌ）、ＰＡＰ
ＥＬ−ＥＧＬ　（ＵＡＳＩ）、／ＰＡＰＥＬ−ＥＧＬ　
（ＵＡＳ　ｌ＋ＵＡｓ２）および／ＰＡＰＥＬ−ＥＧＬ
　（ＵＡＳ　ｌ　＋ＵＡＳ　２）と称する。
ｂ）肪ユム１止五蔗邂 ４種のＳ、セレヴイシェＧＲＦ１８形質転換体の細胞の
それぞれをイースト最小培地（ディフコ中イースト・ナ
イトロジエン・ベース、アミノ酸を伴わない、２％グル
コースおよび２０℃ｍｇ／ＩＬ−ヒスチジン添加）中で
３ＸＩＯ’細胞／−の密度に３０℃で２４時間振とうし
て５０−エルシンマイヤーフラスコ中で生育させる。細
胞を０．９％ＮａＣ見で洗い、高Ｐｉ培地（上述のとお
り）５０−およびＣＮＨａ　）２　ＳＯ４，２％グルコ
ースおよびＩｇ／ｉ　　Ｌ−ヒスチジンの代りニ０　、
０３　ｇ／ｌ　　ＫＨ２ＰＯ４、ｌ　ｇ／　１ＫＣＩ、
Ｌｏｇ／ｌ　　Ｌ−アスパラギンを伴うディフコ中イー
スト・ナイトロジエン・ベース培地（アミノ酸含有しな
い）の処方に従ってＴＡ整した低Ｐｉ最小培地５０ｒＩ
Ｊに接種するのに使用する。培地を０．０３の出発０Ｄ
６ｏｏに接種する。
細胞を３０℃で２４時間５００−フラスコで生育させる
ＣＯＤ　　　　＝１．８．低Ｐｉ倍地、６００ｎＩ１１ ＯＤ”８００ｎｍ　３”、高Ｐｉ倍地）。
Ｃ）エグリンＣ（ＴＩＩの測− 細胞が上述の細胞密度（ＯＤ）に達したときに、細胞を
とり入れ、遠心分離しそしてガラスピーズで破壊する。
混合物をＵ、シーミュエラー（Ｓｅｅｍｕｅｌｌｅｒ）
等の方法〔ホッペーザイラー（Ｈｏｐｐｅ−９ｅｙｌｅ
ｒ）のＺ、フィシオル会ケム（２゜Ｐｈ２ｓｉｏ１．　
Ｃｈｅｍ、）、第３５８巻、第１１０５頁、１９７７年
〕に従ってヒト白血球エラスターゼ抑制をａ１１定する
ことによりエグリン活性を検定する６次の活性が得られ
る。
（ＵＡＳＩ＋ＵＡＳ２） デスルファトヒトレゾインをコードしているヌクレオチ
ド配列（欧州特許出願第１６８，３４２号参照）は最Ｐ
：遣仏子生成物でのＮＨ２末端バリンを示すＧＴＴで始
まる。Ｅ、コリでの通常のサブクローニングおよび発現
のために、コード配列をＥｃｏＲｒ制限部位およびＡＴ
Ｇ開始コドンを包含する８個のヌクレオチドにより５′
末端で伸長しておいた。ＰＨ０５シグナルペタチドをコ
ードする配列に対するヒルディンコード配列のフレーム
融合での正確さのためにこれらの追加のヌクレオチドを
除去しなければならない、これは、ＥｃｏＲＩ制限部位
を平滑末端部位に変換し。
ＨｇａＩ認識部位を含む合成オリゴヌクレオチドをＨｇ
ａＩによる次の開裂が直ちにＧＴＴコドンの上流を生じ
るような位置に付加することによって達成される。
プラスミドｐＭＬ３ｉｏ（欧州特許出願第１６３．３４
２号）８ＩＬｇを制限エンドヌクレアーゼＥＣ０ＲＩで
完全に消化する。ＤＮＡ（ｐＭＬ３１０／Ｅｃ　ｏＲＩ
）をフェノール／クロロホルムで抽出し、そしてエタノ
ールで沈殿させる。５′オーバーハンギング（ｏｖｅｒ
ｈａｎｇｉｎｇ）末端をヌクレアーゼＳ１で除去する。
ｐＭＬ３１０／ＥｃｏＲＩ　　ＤＮＡｃ７）４ｐｇを２
５０ｍＭＮａＣ文、１ｍＭ　　Ｚｎ５Ｏａ、３０ｍＭ酢
酸ナトリウムｐＨ４，６のｌｏｏｇｉ中ヌクレアーゼＳ
、（シグマ）の２０Ｕ／−で４５分間３７℃で消化スる
。ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出しそしてエ
タノールで沈殿させる。ＤＮＡ（ｐＭＬ３１０／Ｅｃｏ
ＲＩ／Ｓｔ　）を５０ｍＭトリス拳ＨＣ交　ｐＨ８，０
の１ｏ０７ｔｕに再懸濁しそして３７°Ｃで１時間仔牛
腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ、ベーリンガー
）の２単位で培養する。酵素を６５°Ｃで１．５時間不
活性化する。
培養混合物中のＮａ（、ｌ濃度を１５０ｍＭに調節する
。除ホスホリル化ＤＮＡ　（ｐＭＬ３１０／　Ｅ　ｃ　
ｏ　ＲＩ　／　Ｓ　ｒ　／　ＣＩ　Ａ　Ｐ　）を低Ｉ！
Ｘ緩衝剤（１５０ｍＭ　　Ｎ　ａ　Ｃｌ、１０　ｍ　Ｍ
　）リス−ＨＣｕ　　ｐＨａ、ｏ、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ
）でＤＥ５２　（ワットマン）イオン交換カラムに吸着
させることによって精製し、そして高温緩衝剤溶液（１
，５Ｍ　　ＮａＣｕ、１０ｍＭ）リス−ＨＣｕｐＨ８，
０１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）で溶出する。ＤＮＡをエタノー
ルで沈殿させ、そして０　、８　ｍｇ／−の濃度でＨ２
Ｏに再懸濁した。
式　　５　　’−ＡＧＣＧＴＣＧＡＣＧＣＴ−３　　′
を有するオリゴヌクレオチドをホスホトリエステル法〔
板台等、Ｊ、アム、ケム、ツク、第１０３巻、第７０６
頁、１９８１年〕により合成する。
オリゴヌクレオチドの配列は制限エンドヌクレアーゼＨ
Ｈａｒｃ７）ための認識部位−ＧＡＣＧＣ−を含有する
自己相補体である。２個の一本鎖のアニーリングを１ｌ
ｆｉ基対の二本鎖ＤＮＡリンカ−に導く。
合成−末鎖オリゴヌクレオチド１　、２ｇｇを３０分３
７℃で６０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　　ｐＨ７，５、ｌ　Ｏ
ｍ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　Ｃ１２、５ｍ　Ｍ　　Ｄ　Ｔ　Ｔ（
ｙ−３２ｐ）　ＡＴＰ　（３００ＱＣｔ　−ｍ　ｍａｔ
−’、アメルシャム）の３０ｐＣｉおよびＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（ベーリンガー）６単位の１０９Ｌ文
中でリン酸化する０次に、０．５ｍＭＡＴＰの存在下に
３７°Ｃで１５分間チェースする。更に、混合物を７５
°Ｃで１０分間培養して酵素を不活性化し、次にアニー
リングのために室温に冷却する。
０　、６　ｇｇ　（１７０ｐ　１Ｉｌｏｌ）　（７）３
２Ｆ−標識リンカ−ＤＮＡをｐＭＬ３　ｔｏ／ＥｃｏＲ
Ｉ／Ｓ、／ＣＩＡＰの２−４ｋｇ　（１，７５ｐ　ｍｏ
ｌ末端）と混合し、そして１５℃で２０時間６０ｍＭ）
リス−ＨＣｕ　　　　ｐＨ７，５、１０ｍＭ　　　Ｍｇ
Ｃ１２，５ｍＭ　　、ＤＴＴ、　３　、５ｍＭ　　Ａ　
Ｔ　Ｐ　、　　Ｔ　ａＤＮＡリガーゼの８００単位（バ
イオラブズ）の２０用文中で結合させる。リガーゼを８
５℃で１０分間不活性化し、そしてリンカ−分子の過剰
量を１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ　　ｐＨ７，５，３００ｍＭ
酢酸ｐＨ６，０およびインプロパツール０．５４容量の
存在下ＤＮＡの沈殿により除去する。室温で３０分後、
ＤＮＡをペレットにし、結合混合物（」二連の如く特定
）４５ｐ文に再懸濁させ、そして６時間１５°Ｃで結合
させて項状ＤＮＡを形成させる。
結合混合物の１ル文および３ル交アリコートをカルシウ
ム処理、形質転換コンピテントＥ、コリＨＢ　Ｉ　Ｏ１
細胞（Ｄ、ハナハ７　（Ｈａｎａｈａｎ）の方法、Ｊ、
ビオル、ケム、第１６６巻、第５５７頁、１９８３年）
１００．２に加える。細胞を３０分間氷上に放はし、次
に４２°Ｃで３分間培養し、２分間水上で冷却し、次に
ＳＯＣメディウム４００用文中３７℃で、１時間培養す
る。細胞を各１００ｇｕ中でｅｉ縮し、そしてアンピシ
リン５０＃Ｌｌ／−を含むＬＢ寒天プレートにのせる。
１２個の形質転換したａｍｐＲコロニーをアンピシリン
ｔｏＯｇｇ／−を含むＬＢ培地に個々に生育させる。プ
ラスミドＤＮＡをり、Ｓ、ホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）等
〔アナル、ビオ、ケム、第１１４巻、第１９３頁、１９
８１年〕の方法に従って製造する０合成オリゴヌクレオ
チドリンカーの存在は、ヒルディンのコード鎖に加水分
解するブライマーとして一本鎖ＤＮＡフラグメントを用
いるＤＮＡＩＭ基配列決定により確認される。ヒルディ
ン遺伝子の前に正しい位芒でＤＮＡリンカ−を含む１種
のクローンをｐＭＬ３１０Ｌと称する。
Ｔ１．ＰＨ０５シグナル　　　よびデスルフ　トヒルデ
　ン　゛パ　　の ａ）０．２ｋｂデスルフ　トヒルデ　ンフラグＬＺ上豆
通１（第７図参照） プラスミドｐＭＬ３１ＯＬの１２．ｇを制限エンドヌク
レアーゼＢａｍＨＩおよびＰｖｕ　Ｉで完全消化する。
ＤＮＡをフェノール／クロロホルムにより抽出しそして
エタノール沈殿した後、２個の制限フラグメントをトリ
ス−はう酸塩−ＥＤＴＡ緩衝剤ｐＨ８，３中１．２％ア
ガロースゲルで分離する。エチウムブロマイド汚染０．
８４ｋｂ　　ＰｖｕＩ”ＢａｍＨＩフラグメントをゲル
スライスに分離する。ＤＮＡを０．２×ＴＢＥ緩衝剤３
−を満たした透析バッグ中で電気溶出する。閉じたバッ
グをＴＢＥｄ衝剤ｐＨ８、３（９０ｍＭ）リス−ベース
、９０ｍＭはう酸、２．５ｍＭ　　ＥＤＴＡ）中に浸漬
する。
１００ｍＡで３０分後、電流の極性を反対にして透析膜
からＤＮＡをはじくようにする。透析バッグ中のゲルス
ライスを囲んでいる緩衝剤を回収し、１５０ｍＭ　　Ｎ
ａＣ１に調節し、そしテＤＥ５２（ワットマン）イオン
交換カラム中を通す。
ＤＮＡを高温緩衝剤（１，５Ｍ　　ＮａＣＪＬ、１０ｍ
Ｍ　　トリス−ＨＣｆＬ　ｐＨ８，ｏ、　１ｍＭＥＤＴ
Ａ）で溶出し、エタノールで沈殿させ、そして０．１１
１１ｇ／ｍｌの濃度でＨ２Ｏに再溶解する。
ｐＭＬ３１０Ｌ（７）０．８４ｋｂ　　Ｐ　ｖ　ｕ　Ｉ
　−ＢａｍＨＩフラグメントを更に制限エンドヌクレア
ーゼＨｇａＩで消化する。この消化により、成熟デスル
ファトヒルディンのための完全なコード配列を含有する
１９８ｂｐ　　Ｈｇａｌ　−Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩフラグメ
ントが発生する。追加のＡ１ｕＩ消化は１９８ｂｐＨｇ
ａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントに触れないが、同様なサ
イズの別のＨｇａＩフラグメントを除去する。
０．２ｋｂ　　ＨｇａＩ−ＢａｍＨＩ；ｙラグメントを
ＴＨＥ［衝剤中１．５％アガロースゲルで他のフラグメ
ントから分離し、そして電気溶出（上述のとおり）に単
離する。ＤＮＡをＤＥ５２イオン交換クロマトグラフィ
ーおよびエタノール沈殿により精製する。ＤＮＡを３０
ＩＬ文／−（０、２ｐ　ｍｏｌ／　ＪＬＩ）の濃度でＨ
２Ｏに再懸濁する。
プラスミドｐ　３１／ＰＨ０５−ＴＰＡ　１８　（欧州
特許出願第１４３，０８１号）は、フレームで異質構造
遺伝子（ｔ−ＰＡ）に融合したＰＨ０５プロモーターお
よびＰＨ０５シグナル配列を有している。５８４ｂｐ　
　ＢａｍＨＩ−ＢａＪＩＩフラグメントはＰＨ０５プロ
モーターおよびＰＨ０５シグナル配列の全部を含有し、
但し３′未満に８個のヌクレオチドを含有している。
ｐ３１／ＰＨ０５−ＴＰＡ１８　　ＤＮＡの８１Ｌｇ　
ヲＭ　ｔａエンドヌクレアージＢａＪＩＩで消化する（
３７℃で１６時間）、ＤＮＡをフェノール／クロロホル
ム抽出およびエタノール沈殿により精製する。ＤＮＡを
０．７ｒｍｇ／ｄの濃度でＨ２Ｏに再懸濁する。
ＰＨ０５シグナル配列とデスルファトヒルディンのコー
ド領域との間の正しい連接は式％式％ を有する合成リンカ−により提供される。
リンカ−（５’−ＣＣＡＡＴＧＣＡ）の５′末端での８
個のヌクレオチドはＢａｕＩ部位からプロセッシング部
位のＰＨ０５シグナル配列の部分を表わしている。オリ
ガノのレオチド（２）の５′オ一バーハンギング５個の
ヌクレオチドはデスルファトヒルディンコード配列の５
’末端でＨｇａｌ開裂部位に入っている。
個々の一本鎖オリゴヌクレオチド（１）および（２）は
ホスホトリエステル法（板金等、上述）により合成され
る。オリゴヌクレオチド（１）および（２）の１．１川
ｇおよび１．８ｐｇをそれぞれ実施例５Ｉに記載の如く
個別に５′末端でりん醜化し１等モル蚤で混合しモして
アニーリングする。
りん酸化二本　リンカ−ＤＮＡ１．３終ｇ（２００ｐ　
　ｍａｔ）を１５℃で１６時間６０ｍＭ）リス−ＨＣｌ
　　ｐＨ７−５、１０ｍＭＭｇＣＩＬ２．３．５ｍＭ　
　Ａ　　Ｔ　　Ｐ　、　　５　　ｍ　ＭＤＴＴおよび１
４００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（バイオラブズ）の４
０ｇ文中ＢａｕＩ開裂ｐ　３１　／ＰＨ０５−ＴＰＡ　
１８の７ｇｇ　（１、８ｐ　　ｍｏりと結合させる。リ
ガーゼを８５℃で１０分間不活性化する。リンカ−の過
剰量を１０ｍＭＥＤＴＡ、３００ｍＭ酢酸ナトリウムｐ
Ｈ６、０およびイソプロパツール０．５４容量の存在下
にＤＮＡの沈殿により除去する。ＤＮＡを再懸濁し、そ
して更にエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化する。Ｄ
ＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、モしてエタ
／−ル沈殿した後、２種の制限フラグメントをトリス−
はう酸塩−ＥＤＴＡｎ衝剤ｐＨ８，３中１．２％アガロ
ースゲルで分離する。０．６ｋｂフラグメントをゲルか
ら単離する。ＤＮＡを電気溶出し、そして更にＤＥ５２
イオン交換クロマトグラフィーおよびエタノール沈殿に
より精製する。０．６ｋｂ　　ＢａｍＨＩ　−ＨｇａＩ
ＤＮＡフラグメントを４０ルｇ／−の濃度でＨ２Ｏの再
懸濁する。
ｃ）　　　Ｊ　ＤＢ　２０　フィーストベクターフラグ
メン　ト　　　　−　　　　　　ｆ　　８　　　　Ａ　
■６ブラスミドｐ　Ｊ　ＤＢ　２０７Ｒ／ＰＨ０５−Ｔ
ＰＡ　（１２−２）ＤＮＡ　（欧州特許出願第１４３．
０８１号）９ｇｇを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ
で消化する。完全消化時、ＤＮＡをフェノール／クロロ
ホルムで抽出し、そしてエタノール沈殿させる。ＤＮＡ
を０　、１　ｍｇ／−の濃度で５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ
　　ｐＨ８，０に再懸濁し、モして３７°Ｃで１時間仔
牛賜アルカリホスファターゼ７単位で消化する。ホスフ
ァターゼを１．５時間６５°Ｃで不活性化しそしてＤＮ
ＡをＤＥ５２イオン交換クロマトグラフィー（実施例５
Ｉ参照）およびエタノール沈殿で精製する。６．８ｋｂ
大型ＢａｍＨＩフラグメントをトリス−はう耐塩−ＥＤ
ＴＡ緩衝剤ｐＨ８，３中１．２％アガロースゲルで分離
する。ＤＮＡを電気溶出し、そしてＤＥ５２イオン交換
クロマトグラフィーおよびエタノール沈殿により精製す
る。
ＤＮＡを０　、４ｍｇ／Ｊ　（０、１ｐ　ｍａｔ／　ｇ
文〕の濃度で水に溶解する。
ｄ）　Ｌ」」口３２０７二（二Ｚユニ！と久：二ョし区
２ｐＪＤＢ２０フィーストベクター、ＰＨ０５シグナル
配列を有するＰＨ０５プロモーターフラグメントおよび
デスルファトヒルディン構造遺伝子をすべてＤＮＡフラ
グメントとして単離しく実施例５Ｈａ−ｃ）、　これら
フラグメントは結合して発現プラスミドを形成する。
Ｐ３１／ＰＨ０５−ＴＰＡ１８の０．６ｋｂＢａｍＨｒ
−ＨｇａＩフラグメント０．３ｐｍｏｌおよびｐＭＬ３
１０Ｌの０．２ｋｂ　　Ｈｇａｌ−ＢａｍＨＩフラグメ
ントの０．３ｐｍａ＋を１５°Ｃで２０時間６０　ｍ　
Ｍ　）リス−ＨＣｌｐＨ７、５，１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ
２．５ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＡＴＰおよび４００単位のＴ
４ＤＮＡリガーゼの１０ｐＬ立中でｐＪＤＢ２０７Ｒ／
ＰＨ０５−ＴＰＡ　（１２−２）の６．８ｋｂＢａｍＨ
Ｉフラグメントに結合する。
結合混合物の１ル立アリコートをハナハン（上述）に従
って製造した形質転換コンピテントＥ。
コリＨＢＩＯＩの１００１Ｌｕに加える。形質転換プロ
トコールはまたこの刊行物から採用する。細胞をアンピ
シリン５０ｇｇ／−を含むＬＢ寒天プレート上にならし
ておく。
２４ａｍｐＲコロニーを個別にアンピシリン１００ｇｇ
／ｄ含有ＬＢ培地で生育させる。プラスミドＤＮＡを制
限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩで開裂することにより挿
入のサイズおよび配向を分析する。挿入の正しい配向を
有する単一クローンをｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−ＨＩ
’Ｒと称する。
ＰＨ０５シグナル配列を含有するデスルフアルトヒルデ
ィンのコード領域（プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０
５−ＨＩＲ（７）如＜）　にＵＡＳ（ＰＨ０５）　−Ｇ
ＡＰＤＨハイブリッドプロモーターエレメントの好都合
な接合のために、ＥｃｏＲＩ制限部位をｍＲＮＡスター
ト部位とコード領域のＡＴＧとの間で５′−非翻訳領域
に導入する。
プラスミドＰＪＤＢ２０７／ＰＨ０−ＨＩ　Ｒの１５、
ｇを制限エンドヌクレアーゼＤｒａｌ（ベーリンガー）
で消化する。得られた４個のフラグメントをトリス−は
う酸塩−ＥＤＴＡＩ衝剤中０．８％アガロースゲルで分
離する。４．２ｋｂ　　ＤＮＡフラグメントをゲルから
採取し、電気溶出し、そしてエタノールで沈殿させる。
Ｄ　Ｎ−Ａを０．６ｍｇ／−の濃度でＨ２Ｏに再懸濁さ
せる。
次の式 ％式％ を有する２種の合成オリゴヌクレオチド（それぞれ２．
３．ｇおよび２．９ｇｇ）を各々６０ｍＭトリス　ｐＨ
７，５，１０ｍＭ　　ＭｇＣｕ２　．５ｍＭ　　ＤＴＴ
、０．５ｍＭ　　ＡＴＰおよび２０ＵのＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（ベーリンガー）の２０ＪＬｆＬ中でキ
ナーゼ処理する。３７°Ｃで４５分後に、双方の反応混
合物を合し、７５℃に１０分間加熱しそして室温に冷却
する。アニーリングしたオリゴヌクレオチドリンカーを
一２０’Ｃで保存する。
４．２ｋｂ　　ＤｒａＩＤＮＡフラグメントの６．５ｐ
ｇ（２，３ｐ　　ｍａｔ）　　を、６０ｍＭ）リスＰＨ
７，５，１０ｍＭＭｇｃＭ２．５ｍＭＤＴＴ、３．５ｍ
ＭＡＴＰおよび８００Ｕ（７）Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（バ
イオラブズ）の５０＃Ｌ文中で７０倍過剰のキナーゼ処
理し、モしてアニーリングしたオリゴヌクレオチドリン
カーと共に１５℃で１６峙間培養する。Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼを８５゛Ｃで１０分間不活性化した後、過剰のリン
カ−を１０ｍＭＥＤＴＡ、３００ｍＭ＃酸ナトリウムＰ
Ｈ６，０およびインプロパツール０．５４容塁の存在下
ＤＮＡの沈殿によって除去する。
ＤＮＡをＥｃｏＲＩおよび旧ｎｄＩＩＩで消化する。
得られたフラグメントをトリス−はう酸塩−ＥＤＴＡ緩
衝剤ｐＨ８，３中１％アガロースゲルで分離する。６４
３ｂｐフラグメントをゲルから電気溶出およびエタノー
ル沈殿により採取する。
ＤＮＡをＯ，ｌｐｍｏ！／ル文の濃度で再懸濁する。　
ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩ［フラグメントはＰＨ０５シ
グナル配列、デスルファトヒルディンのコード配列およ
びＰＨ０５転写ターミネータ−を含有する。
５３４ｂｐ　　ＰＨ０５プロモーターフラグメントはプ
ラスミドｐ３１／Ｒ（欧州特許出願第１００．５６１号
）から４１離する。
ｐ３１／Ｒの１０ｐｇを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ
ＲＩおよびＢａｍＨＩで消化する。得られた３個のフラ
グメントをトリス−はう酸塩−ＥＤＴＡ緩衝剤ｐＨ８，
３中０．６％低融点アガロースゲルで分離する。ｍＲＮ
Ａスタート部位を包含するＰＨ０５プロモーターを含む
５３４ｂｐＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを単離
する。
ベクターフラグメントをプラスミドｐＪＤＢ２０７／Ｐ
Ｈ０５−ＨＩ　Ｒかも単離する。このプラスミド６ＩＬ
ｇをＢａｍＨＩおよび）ｌｉｎｄＤＩテ消化する。大型
の６．５ｋｂ　　ＢａｍＨＩ　−）１ｉｎｄ［フラグメ
ントをトリス−はう酸塩−ＥＤＴＡＩ衝剤ｐＨ８，３中
０．６％低融点アガロースゲルで小さいフラグメントか
ら分離する。
適当な接着末端を有する上記の３個のＤＮＡフラグメン
トを次の反応で結合させる。５３４ｂｐＢａｍＨＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ　　ＰＨ０５プロモーターフラグメント０．２
ｐ　ｍｏｌ（７０ｎｇ）、６４３ｂｐ　　ＥｃｏＲＩ−
ＨｉｎｄＩ［Ｉフラグメント（ヒルディンコード配列）
　０．２ｐ　ｍｏｌ（８５ｎｇ）　、および６．５ｋｂ
　　ＢａｍＨＩ−旧ｎｄＩＩＩベクターフラグメントＯ
，Ｌｐ　　ｍｏｌ（０，４ｇｇ）を６０ｍＭ）リスｐＨ
７，５，１０ｍＭ　　Ｍｇ０文２．５ｍＭ　　ＤＴＴ、
１ｍＭ　　ＡＴＰおよび４００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ
の１０ＪＬ！；Ｌ中１５℃で６時間結合させる。結合混
合物のｌＩＬ又アリコートをカルシウム無理、形質転換
コピテントＥ、コリＨＢ　１０１細胞１００ＪＬ見に加
える。
１２個の形質転換されたａｆｆｉｐＲコロニーをアンピ
シリン１００μｇ／−を含むＬＢ培地で個別に生育させ
る。プラスミドＤＮＡをホルムズ等〔アナル・ビオヘム
、５１１４巻、１９８１年。
第１９３頁〕の方法に従って製造し、そしてＥｃｏＲＩ
およびＢａｍＨＩ制限消化物により分析する。予想され
る制限フラグメントを有する１個のクローンを単離し、
そしてｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５（Ｅｃｏ）　−ＨＩＲ
と称する。
プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５ （Ｅｃｏ）−ＨＩＨの１５＃ＬｇをＥｃｏＲＩおよび旧
ｎｄ［で消化する。ＤＮＡフラグメントをトリス−はう
酸塩−ＥＤＴＡ緩衝剤ｐＨ８，３中１％アガロースゲル
で分離する。６４３ｂｐフラグメントをゲルから単離し
、電気溶出し、そしてエタノールで沈殿させる。ＤＮＡ
１ｒ、０　、１　ｐ　ａｏＩ／ル文の濃度でＨ２Ｏに再
懸濁させる。
プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−ＨＩ　Ｒの６ｋ
ｇを制限エンドヌクレアーゼ旧ｎｄＩＩＩおよびＳａ文
ｒで完全に消化する。大型の６．３ｋｂフラグメント（
ベクタ一部分）を軟アガロースゲル電気泳動、フェノー
ル袖山およびエタノール沈殿により単離する。ベクター
ＤＮＡフラグメントを０　、０５　ｐ　ｍｏｌ／＃Ｌｉ
の濃度でＨ２Ｏに再懸濁する。
プラスミドｐＧＡＰＤＨ−ＥＬ　（実施例３ｄＩ）　　
１０ｇｇをＢ　ｇ　ｌ　ＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化す
る。２６６ｂｐ　　ＢｇｉＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメン
トをトリス−はう酸ｆｆ１−ＥＤＴＡＩ衝剤ｐＨ８，３
中１．２％アガロースゲルで分離し、ゲルから電気溶出
しそしてエタノールで沈殿させる。ＤＮＡを０　、３　
Ｐ　Ｈ１０１／　＃Ｌ！１ｔ７）Ｑ度でＨ２゜に再懸濁
させる。
ＵＡＳＩ　（ＰＨ０５）を包含する５４８　ｂ　ｐＳａ
ｉＩ−Ｂｇ文ＩＩ　ｙラグメント０．３ｐｍｏｌ、ｐＧ
ＡＰＤＨ−ＥＬの２６６ｂｐ　　Ｂ　ｇ文ＩＩ　−Ｅｃ
ｏＲｒ；ｙラグメント０．３ｐｍｏｌ、ＰＪＤＢ２０７
／ＰＨ０５（Ｅｃｏ）−ＨｒＲの６４３ｂｐ　　Ｅｃｏ
Ｒｒ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント０．３ｐ　　ｍｏｌ
および６．３ｋｂ　　Ｓａｉ■−Ｈ１ｎｄＩＩＩベクタ
ーフラグメント０．１２ｐｍｏｌを１５℃で６時間６０
　ｍ　Ｍ　）リスｐＨ７，５，１０ｍＭＭｇＣ１２，５
ｍＭ　　ＤＴＴ、１ｍＭ　　ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（バイオラブズ）４００Ｕの２０ＪＬｎ中で結合
させる。結合混合物の１ｇｌおよび３用文の７リコート
をカルシウム処理Ｅ、コリＨＢ　１０１細胞１００ル文
に加える。　ａｍｐＲコロニーからのプラスミド単離、
および５ａｌＴ、ＢｇｌＨｌおよび旧ｎｄＩＩＩによる
制限分析は上述の如くとして行われる（実施例３ｄＩＩ
Ｉ）、１個の陽性クローンを選定し、そしてｐＪＤＢ２
０７／ＰＡＰＥＩ、−ＨＩＲ（ＵＡＳｌ）と称する。ｐ
ＧＡＰＤＨ−ＦＬから単離した２０１ｂｐ　　ＢｇＪＩ
ｌｌ−ＥＣＯＲＩフラグメントで類似の構築を行う、１
個の選定されたプラスミドをｐ　Ｊ　ＤＢ　２０７／Ｐ
ＡＰＦＬ−ＨＩ　Ｒ（ＵＡＳ・１）と称する。
プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＥＬ−Ｈｒ　Ｒ（Ｕ
ＡＳ　ｌ）およびｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＦＬ−ＨＩＲ
（ＵＡＳＩ）各３ｊＬｇをＢ　ｇ　ｌ　ＩＴで消化する
。フェノール抽出およびエタノール沈殿後、ＤＮＡの３
′劣性末端をマニアティス等に従って（上述）Ｅ、コリ
ＤＮＡポリメラーゼ（クレナウフラグメント；ベテスダ
争リサーチ・ラボラトリーズ）との反応でみたす、酵素
を１０分間７０℃で不活性化する。ＤＮＡを更に５ａｕ
Ｉで消化し、そして大型の７．２ｋｂフラグメントを軟
アガロースゲルＴｒ１．気泳動、フェノール抽出および
エタノール沈殿により単離する。各フラグメントを０．
０５ｐ　ｍｏ１／ＪＬＩの濃度でＨ２Ｏに再懸濁する。
フラグメントはヒルディンコード領域、ベクター配列の
大部分、ならびにｐＧＡＰＤＨ−ＥＬまたはｐＧＡＰＤ
Ｈ−ＦＬから単離された２種の異ったＧＡＰＤＨプロモ
ーターエレメントのいずれか一方を含有する。
プラスミドｐ３１／Ｙ（欧州特許出願筒１００．５６１
号）をＢｓｔＥＩｌｃ’消化し、上述の如く、Ｅ、コリ
ＤＮＡポリンラーゼ（フレナラフラグメント）と共に培
養し、モして５ａｕｌで開裂する。６４９ｂｐフラグメ
ントを軟アガロースゲルで分離し、そしてフェノール抽
出およびエタノール沈殿で採取する。
ｐ３１／Ｙの６４９ｂｐフラグメント０．３ｐｍｏｌ　
（ＵＡＳ　１−ＵＡＳ　２　（ＰＨ０５）プロモーター
エレメントを包含〕および７．２ｋｂフラグメントの一
方の０．１５ｐｍ＋ｏｆを上述の如く結合させ、Ｅ、コ
リＨＢ　１０１に形質転換させる。プラスミドをａｍｐ
Ｒコロニーから製造し、そして制限消化物により分析す
る。単一クローンを選択しそしてそれらのプラスミドＤ
ＮＡをｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＥＬ−ＨＩＲ（ＵＡＳ１
＋ＵＡＳ２）およびｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＦＬ−ＨＩ
Ｒ（ＵＡ　Ｓ　１　＋ＵＡＳ　２）と称する。
２種のフランキング（ｒ　Ｉａｎｋｉｎｇ）欠失Δ１ｏ
およびΔ１３（実施例Ｉｆ参照）により定められるＰＨ
０５プロモーター（−３８１乃至−３５１位？ｌ）の上
流望域からの３１ｂｐ配列は潜在的に調節シグナルを含
有し得る。これは次の構造を有する２種の相補オリゴヌ
クレオチドを化学的に合成することにより試験すること
ができる。
この配列はＥｃｏＲＩ制限部位にフランクされた３１ｂ
ｐ配列を含有している。ＥｃｏＲＩ部位は配列の重合を
容易にしてマルチマーの形成を可能とする。
ａ）３１ｂ　　エレメントのベクターＬＴ９８へのクロ
ーニング ２種の合成オリゴヌクレオチドの５０ｐＩＩｌｏｌを各
々６０　ｍ　Ｍ　）リスｐＨ７，５，１０ｍ’ＭＭｇＣ
１ｘ　、５ｍＭ　　Ｄ　Ｔ　Ｔ、０．５ｍＭＡＴＰおよ
びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー）２０
Ｕの２０１ｎｌ中でキナーゼ処理する。３７°Ｃで４５
分間後、両方の反応混合物を合し、１０分間７５℃に加
熱しそして室温に冷却する。アニーリングしたオリゴヌ
クレオチドを一２０°Ｃで保存する。キナーゼ処理し、
アニーリングしたオリゴヌクレオチド７．５ｐｍｏ＋を
上述の如く（実姉例５Ｉ１１）総容量１５用文で３０分
間結合させた０次に、ＥｃｏＲＩ切断ＬＴ９８ベクター
ＤＮＡ　（ディクソン（Ｄｉｘｏｎ）等、「ジーン」、
第２５巻、第１８９頁、１９８３年〕５ｐ交を加え（０
，０７５ｐｍｏ＋）そして計６時間培養を続ける。Ｅ、
コリＨＢ　１０１に形質転換させた後、プラスミドを単
離し、モしてＢａｍＨＩで消化して分析する。この分析
によって、挿入の全長についてのデータが得られ、また
クローニングされたＥｃｏＲＩフラグメントの数の推測
が可能となる。１，２．３．４または５ＥｃｏＲＩフラ
グメントを有する個々のプラスミドを選定しそしてＤＮ
Ａ塩基配列決定（サンガー法）により、多重３１ｂＰエ
レメントが頭部から尾部方向にクローニングされている
ことが示される。
ｂＬＬ上旦且ｌ立二二ａｐｏ二三上１ ３１　ｂｐルオリゴマ−、ＧＡＰＤＨプロモーターのＦ
エレメントの上流を挿入することにより、プロモーター
コントロール機能を試験する。
プラスミドｐＪＢＤ２−７／ＰＡＰＦＬ−ＥＧＬ（ＵＡ
ＳＩ）を短縮して欠失ＵＡＳＩエレメントを有するプラ
スミドを生成させる。このプラスミドをＳａ文工および
ＢｇｌＨで消化し、ゲル精製し、ソシテ大型ベクターフ
ラグメントを単離する。独立した反応混合物において、
同一プラスミドをＢａｍＨＩで消化する。劣性３′末端
を４種の全ｄＮＴＰを用いてフレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ）
　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼで満たす、平滑末端の部位を
ホスホリル化したＢ　ｇ　ｌ　ＩＩリンカ−（ＣＡＧＡ
ＴＣＴＧ、バイオラブズ）で伸長し、そして５ａｉｌお
よびＢ　ｇ　ｌ　ＩＩで消化した後約４００ｂｐの長さ
を有するＤＮＡフラグメントをゲルｊ＃製によって単離
する。大型のベクターフラグメントをＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて約４００ｂｐ　　Ｓａｉｌ−ＢｇｕｌＩフラ
グメントと結合さぜる。Ｅ、コリＨＢＩＯＩＯ形質転換
およびプラスミド単離後、プラスミドをＰＨ０５ＵＡＳ
なしで得る。このプラスミドをｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰ
ＦＬ−ＥＧＬと称する。このプラスミドをＢ　ｇ　ｌ　
ＩＩで消化し、モして３１ｂｐオリゴヤ−をクローニン
グするためのベクターとして役立つものである。１．２
．３．４またはＳオリゴヌクレオチド挿入を含宥するＬ
Ｔ９８をＢａｍＨＩで消化する０種々のサイズのフラグ
メントをゲル精製によって単離し、そしてＢ　ｇ　ｌ　
Ｈ切断ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＥＬ−ＥＧＬに独立して
結合させる。結合ミックスをＢ　ｇ　ｌ　ＩＩで消化し
てＤＮＡ挿入を伴わない所望しない再結合ベクターを除
去しそしてＥ、コリＨＢＩＯＩを形質転換するのに使用
する。得られたプラスミドをＳａｕおよびＤｒａｒによ
る制限分析により分析する（ＧＡＰＤＨプロモータ一部
分内の部位）、イースト菌株ＧＲＦ　１８の形質転換後
、エグリンＣ力価を実施例４Ｃに記載の如く測定する。
醗酵４６時間後に次の特定の活性が測定される。
←ＰＨ０５プロモーターの場合と逆の配向欧州特許願第
１２３，２２８号に記載されているプラスミドｐＡＢ　
１１３−ｒＧＦ−１をＰｓｔＩで消化する０次の式を有
する２種の合成オリゴヌクレオチド（５０Ｐ　！＋０１
）ＡＡＴＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＴＣＣＴＴＣＡＡＴＴＴ
ＴＴＡＣＴＧＣＡをそれぞれ上記の如くキナーゼ処理し
、そしてアニーリングする。アニーリングされた二本鎖
アダプターをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化したＰ
ｓｔＩ切断プラスミドに結合させる。そして約８００ｂ
ｐ　　ＥｃｏＲｒ−ＢａｍＨＩフラグメントをゲル精製
により単離する。プラ、　ス　ミ　ド　ｐＪＤＢ２０７
／ＰＡＰＦＬ−ＥＧＬ（ＵＳＡＩ）を５ａＪ１［および
ＥｃｏＲｌで消化し、そして約７００ｂｐフラグメント
をゲル精製により単離する。トリプル結合において、プ
ラスミドｐｃｉ／１（欧州特許出願第１２３，２２８号
；ＢａｍＨＩおよびＳａ交■で消化、ベクターゲル精製
）０．５μｇを２種のより小さい遺伝子およびプロモー
タ一部分の各１１００ｎと結合させる。Ｅ、コリ形質転
換後、プラスミドをＥｃｏＲｌ、ＢａｍＨＩおよびＳａ
ｕ、Ｉ消化で分析する。イースト菌株ＡＢ　１０３　（
ＡＴＣＣにＮｏ、２０６７３で寄託；複合培地で一夜イ
ースト細胞を生育させることによりｐＹｒＧＦ−１−１
０の不稔、モしてヒネン等〔ブロク、ナツル。
アカド、サイ、ＵＳＡ、第７５巻、第１９２９頁、１９
７８年〕に記載の如くコロニー交雑によりＩＧＦ−１プ
ラスミドの存在について個々のコロニーをテストする〕
形質転換によって、形質転換体が得られ、このものは放
射標識ＩＧＦ−１を用いる通常の拮抗放射線免疫検定法
で測定される如く誘起（低Ｐｉ）条件（１ｍｇ／立）の
みでＩ　ＧＦ−１を生成する〔アンダーソン（Ａｎｄｅ
　ｒｓｏｎ）等、　［ソマトメディンズ／インシュリン
ーライクφグロース・ファクターズ］（Ｓｏｍａｔｏｍ
ｅｄｉｎｓ／　Ｉｎ５ｕｌｉｎ−Ｌｉｋｅ　Ｇｒｏｗｔ
ｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ）。
スペンサー（Ｓｐｅｎｃｅｒ）、Ｅ、Ｍ、ｉ、クルター
・デーグルイタ−（Ｗａｌｔｅｒ　ｄｏ　Ｇｒｕｙｔｅ
ｒ））　、クローンをｐｃ　１／１／ＰＡＰＦＬ−ＩＧ
Ｆ−１（ＵＡＳＩ）と称する。
二・ｉｉ　　８：　　ＰＨ０５−ＧＡＰＤＨハイブリー
ドプロモーターのコントロール　での組 ブーｙ７．ミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−ＴＰＡ１８
（欧州特許出願第１４３，０８１号）１２、ｇを制限エ
ンドヌクレアーゼ５ａｌＴおよびＨｉｎｄｌｌＩで完全
消化する。得られた２種のＤＮＡフラグメントをトリス
−はう酸塩−ＥＤＴＡ緩衝剤ｐＨ８，３中０．８％アガ
ロースゲルで分離する。小さい２．６Ｋｂ　　ＳａｕＩ
−Ｈｉｎｄｍフラグメントを電気溶出、フェノール抽出
およびエタノール沈殿により単離する。更にＤＮＡをＢ
ａｕＩで消化する。ＰＨ０５シグナル配列の部分、ｔ−
ＰＡのコード配列およびＰＨ０５ターミネータ−を有す
る１、８ｋｂフラグメントを上述の如く単離、精製し、
そしてＱ　、　１　ｐ　ｍｏｌ／　ｐＬ１濃度でＨ２Ｏ
に再懸濁する。
ハイブリッドプロモーターフラグメントをプラスミドｐ
ＪＤＢ２０７／ＰＡＰＥＬ−）ＩＩＲ（ＵＡＳ　１　＋
ＵＡＳ２）からｒｌを離する（実施例５ｖ参照）。プラ
スミドＤＮＡのＬ２ｇｇをＳａ文■および旧ｎｄＩＩ［
で消化する。得られた１、５ｋｂフラグメントを更にＢ
ａｕＩで消化する。ハイブリッドプロモーターおよびＰ
Ｈ０５シグナル配列の部分を包含する９２０ｂｐフラグ
メントを１．５％アガロースゲルでｒｌｉ　離する。
ＤＮＡを電気溶出、フェノール抽出、エタノール沈殿し
、そしてＱ　、　１　ｐ　ｍｏｌ／　ｐＬｌの濃度でＨ
２Ｏに再懸濁する。
９２０ｂｐ　　５ａｕＩ−ＢａｕＩ：ｙラグメント０．
２ｐＩＩｌｏｌ、１．８ｋｂ　　Ｂａ１ｒ　−Ｈ１ｎｄ
ＩＩＩフラグメント０．２ｐｍｏ！および５ａｕＩ、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ、開裂ベクターｐＪＤＢ２０７の０．１ｐ
　ｍｏｌを総量ｌｏｇ交で１５℃で１６時間結合させる
。結合混合物の１ＩＬｕアリコートをカルシウム処理、
形質転換コンピテントＥ、コリＨＢ１０１細胞１００色
文に加える。
１２の形質転換されたａ＋ｍｐＲコロニーを個々にアン
ピシリンｌｏｏＪＬｇ／＋Ｒ１を含むＬＢＪ８地で生育
される。プラスミドＤＮＡはホルムズ（ＨｏｌｍｅＳ）
等の方法〔アナル・ビオケム、第１１４０、第１９３頁
、１９８１年〕に従って製造しそしてＰｓｔＩおよびＢ
ａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ制限消化物により分析する。予想
制限フラグメントを有する一つのクローンを単離し、そ
してｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＥＬ−ＴＰＡ　（ＵＡＳ　
１＋ＵＳＡ２）と称する。
類似の構築をＵＡＳＩ　（ＰＨ０５）エレメントについ
て行う：　ｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＦＬ−ＨＩ　Ｒ（Ｕ
ＡＳ　１）の８２０ｂｐ　　５ａｕＩ　−Ｂａ文エフラ
グメント（実施例５１Ｖ）を単離し。
そして１．８ｋｂ　　Ｂａｌニー旧ｎｄＩＩ［フラグメ
ントおよびＳ　ａｎ　Ｉ、　Ｈｉｎｄｌｌｌ開裂ベクタ
ーに結合させる。得られたプラスミドをｐＪＤＢ２０７
／ＰＡ　Ｐ　ＦＬ−ＴＰＡ　（ＵＡＳ　１）と称する。
ｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＥＬ−）（ｒＲ（ＵＡＳＩ）ま
たはｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＥＬ−ＨＩＲ（ＵＡＳ１＋
ＵＡＳ２）（実施例５）から単離した相当するフラグメ
ントで類似の構築を行う、得られたプラスミドをｐＪＤ
Ｂ２０７／ＰＡＰＥＬ−ＴＰＡ　（ＵＡＳ　ｌ）および
ｐＪＢＤ２０７／ＰＡＰＥＬ−ＴＰＡ　　（ＵＡＳ　１
＋ＵＡＳ２）　と称する。
肱ユ１遣： 次のプラスミドでサツカロミセス番セレヴイシ工菌株Ｇ
ＲＦ　１８　Ｃａ、　　ｈｉｓ３−１１、ｈｉｓ３−１
５、１ｅｕ２−３、１ｅｕ２−１１２、ｃａｎ”）を形
質変換させる。
ｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＥＬ−１１１Ｒ（ＵＡＳＩ）ｐ
ＪＤＢ２０７／ＰＡＰＦＬ−１１１Ｒ（ＵＡＳＩ）ｐＪ
ＤＩ３２０７／ＰＡＴ’ＥＬ−ＨＩＲ（ＵＡＳＩ　＋　
ＵＡＳ２）ｐＪＤＩ３２０７／ＰＡＰＦＬ−ＨＴＲ（Ｕ
ＡＳＩ　＋　ＵＡＳ２）ｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＦＬＩ
（＋）−ＥＧＬｐＪＤＩ１２０７／Ｉ’ＡＰＦＬＩ（−
）−ＥＧＬｐＪＤＩ３２０７／ＰＡＰＦＩＪＩ（＋）−
ＥＧＬｐＪＤ１１２０７／ＰＡＰＴ’ＬＩＩＩ（−）−
ＥＧＬｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＦＬＩＶ（＋）−ＥＧＬ
ｐＪＤＴ３２０フ／ＰＡＰＦＩ、Ｖ（−）−ＥＧＬｐＪ
ＤＢ２０７／ＰＡＰＥＬ−ＴＰＡ（ＵＡＳＩ）ｐＪＤＴ
１２０７／ＰＡＰＦＬ−ＴＰＡ（ｔｌＡｓｌ）ｐＪＤＴ
１２０７／ＰＡＰＥＬ−ＴＰＡ（ｔｌＡ’；１　＋　Ｌ
ＩＡＳ２）ｐＪＤＩ１２０７／ＰＡＴ’ＦＬ−ＴＰＡ（
Ｌ！ＡＳＩ　＋　ＬＩＡＳ２）ｐｃｌｌｌｌＰＡＰＦＬ
−■ＣＦ−１（ＵＡＳｌ）ここではヒネン（Ｈｉｎｎｅ
ｎ）等の報告〔ブロク。
ナツル、アカド、サイ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　（Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　、第７５巻、第１９
２９頁（１９７８年〕の形質転換プロトコールを使用す
る。形質転換イースト細胞をロイシンを欠除しているイ
ースト最小培地プレートで選定する。ｍ−の形質転換イ
ーストコロニーを！’ｔｉ＃Ｌ、そして次のとおり命名
する。
ｔ　−／　カＯミセス、セレウ４　シェＧＲＦ１８　／
　ｐＪＤＩ１２０７／　ＰＡＰＥＬ−１１１Ｒ（ＵＡＳ
Ｉ　）ｔｔ　　　　　　　ＧＲＦ１８／ｐＪＤＩ１２０
７／　ＰＡＰＦＬ−１１１Ｒ（ＵＡＳＩ　）／／　　　
　　　ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＥＩ、−４
ｆＴＲ（ＵＡＳＩ　＋　ＵＡＳ２）”　　　　　　ＧＲ
Ｆ１８／ｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＦＬ−１ｒＩＲ（ＵＡ
ＳＩ　＋　ＵＡＳ２）ｌｌＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７
／ＰＡＰＦＬＩ（＋）−ＥＧＬ”　　　　　　ＧＲＦ１
８／ｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＦＬＩ（−）−ＥＧＬＧＲ
ＦＩ８／ｐｃ１／１／ＰＡＰＦＬ−ＩＧＦ−１（ＵＡＳ
Ｉ）ｂ）髭五ＪｄＵ（Δ筺Ｍ Ｓ、セレヴイシェＧＲＦ１８形質転換体の細胞をそれぞ
れ３０°Ｃ１２４時間の振どうを伴う５゜−エルシンマ
イヤーフラスコ中イースト最小培地〔２％グルコースお
よび２０，１／ｌ　　Ｌ−ヒスチジンを加えたディフコ
・イースト・ナイトロジェ７ｅベース（Ｄｉｆｃｏ　Ｙ
ｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ５ｅ）、アミノ酸を
伴わない〕１０−で３Ｘ１０’細胞／−の密度に生育さ
せる＊Ｍ胞を０．９％ＮａＣ文で洗い、そして（ＮＨ４
）２　ＳＯ４，２％グルコースおよびＬｇ／ｌ　　Ｌ−
ヒスチジンの代りに０．０３ｇ／文　ＫＨ２ＰＯ４、Ｉ
ｇ／交ＫＣＩおよび１０ｇ／ｉ　　Ｌ−アスパラギンを
含むディフコ会イースト・ナイトロジェン・ベース培地
（アミノ酸を含まず）の処方に従って調製した低Ｐｉ最
小培地５０−に接種するのに使用する。培地を４Ｘ　１
０Ｓ細胞／−の細胞密度まで接種し、そして３０℃テ２
００　ｎｅｗｓ／分で４２時間までかくはんする。
。　−■・・伝　ノー　着の一価 イーストは培地中にデスルファトヒルディン化合物を分
泌する。２２時間醗酵後、試料１０−を培地からとり、
そして脱塩およびポンド・エル）　（Ｂｏｎｄ　Ｅｌｕ
ｔ）Ｃ−１８カラム〔１−、アナリテイケム・インター
ナショナル（Ａｎａ１７ｔｉｃｈｅｍＩｎｔｅｒｎａｔ
ｉｏｎａｌ）で′１３縮することにより蛋白に対して富
化する。カラムを水−アセトニトリル（９：１）−０，
１％トリフルオロ酢酸１．５−で二度洗滌する。デスル
ファトヒドリン化合物をカラムから水−アセトニトリル
−０，１％トリフルオロ酢酸（６：４ｖ／ｖ）で溶出す
る。溶出液２−をスピード・バック・コンセントレータ
−（Ｓｐｅｅｄ　Ｖａｃ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）
で最終容１４００９−１に濃縮する。デスルファトヒル
ディンは、ＨＰＬＣ分析、デスルファヒルディン標品と
の比較およびトロンビン抑制検定（Ｍ、Ｕ。
ベルグマイヤ−（Ｂｅｒｇｍｅ７ｅｒ）編、　　ｒメソ
ド０イン・エンザイマティック・アナリシス」（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａ１２ｓｉ
ｓ）、第ｎ巻、第３１４−３１６頁、フェルラグ・ヘミ
エ（Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ）、ワインハイム（Ｗ
ｅｉｎｈｅｉｍ）（ＦＲＧ）、１９８３年〕により同定
する。
結果を表１に示す。
表ユニ　　っ　プラスミ　′　／・　　　さ　　Ｓ。
組織プラスミノーゲン活性因子（ｔ−ＰＡ）がイースト
細胞に苓積する。細胞抽出物を製造し、モしてｔ−ｐＡ
活性を次の如く測定する。１−２ＸＩＯ’／−の細胞密
度で低Ｐｉ培地（Ｂ、メイハ＋７り（Ｍｅｙｈａｃｋ）
等、ＥＭＢＯ−Ｊ　、第１巻、第６７５頁、１９８２年
〕３５−から細胞を３００Ｏｒｐｍで１０分間ツルパル
（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＳＳ３４０−ターで遠心分離するこ
とにより採集する。細胞を培地のＩｎ成分を含む緩衝剤
（すなわち、アミノ酸、グルコース、ビタミン、微量元
素４伴わない）で洗滌する。細胞を室温で５分間３００
Ｏｒｐｍで遠心分離する。沈降細胞を冷却６６ｍＭりん
酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ７，４および０．１％（ｖ／ｖ
）ドライド７　（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ−１００計４ｍｌ
量に再懸濁した。細胞懸濁液を３０−コレックス・チュ
ーブに移し、ガラスピーズ（直径０．４ｍｍ）８ｇを加
え、そして懸濁液を全速で４分間ポルテックス・ミキサ
（Ｖｏｒｔｅｘ旧ｘｅｒ）　　（サイエンティフィック
・インスッルメンツ骨インコーボレーテッド（Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ１＋＋ＳｔｒｕｍｅｎｔｓＩｎｃ、）　、
　ＵＳＡ）　テ振とうし、そして次に水浴で冷却する。
この操作により細胞の９０％以上が破壊される。細胞片
およびガラスピーズをンルバールＨＢ−４０−ターで４
℃で８００Ｏｒｐｍで１ｏ分間遠心分離により沈降する
。上澄液をエッペンドルフ・チューブに移し、液体窒素
で凍結し、そして−６０″Ｃで保存する。
若干の変形をしたランビイ（Ｒａｎｂｙ）の方法〔ビオ
ヒムψビオフィズ参アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、）　、第７０４巻、第４
６１頁、１９８２年〕に従って、ｔ−ＰＡ活性を４１１
定する。Ｄ−Ｖａｕ−Ｌｅｎ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ　（カビ
（Ｋａｂｉ）　Ｓ　−２２５１）を基質として使用する
。
４０５ｎｍでの吸収を非特異的開裂に対して補正し、そ
してウロキナーゼ標準品と関連づける。結果を表２に示
す。
イースト菌株ｐｃｔ／１／ＰＡＰＦＬ−４ＧＦ−１（Ｕ
ＡＳＩ’）を６０時間培養するや培＋１！３交をとり、
実施例９に記載の如く遠心分離する。上澄液２−の逆相
ＨＰＬＣによる分析ではＬ　ｌｌ１ｇ／文ＩＧＦ−１℃
価を生じる。上澄液をｐ）１３　、０でｓｐ−セフｙデ
ックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｃ−２５〔ファルマシア
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））　２０　ｍｌ　テ処理しそし
て４℃で６０分間かくはんする。吸着されたＩＧＦ−１
を酢酸ナトリウム緩衝層勾配（５０ｍＭ、ｐＨ３，０”
ｐＨ９，０）により洗滌樹脂から溶出し、そして更に２
段階のイオン交換で精製する。第一段階はＣＭ−５２カ
ラム（ワットマン、１．５Ｃ■Ｘ８．５ｃｍ、勾配、緩
衝剤Ａ２０ｍＭ　　ＮＨａＯＡｃ　　ｐ）（４，０；緩
衝剤Ｂ１００ｍＭ　　ＮＨ４０Ａｃ　　ｐ）（６，８）
で実施する。第２段階はＤＥ−５３陰イオン交換カラム
（ワットマン）（条件：１．５ｃｍＸｌ０．５ｃ＋＋カ
ラム、流！’ｌＬ、Ｊ／分、勾配、緩衝剤Ａ２０ｍＭＮ
Ｈａ　ＯＡｃ　　ＰＨ９、Ｏ：ｎ衝剤Ｂ２００ｍＭＮＨ
ａ　ＯＡｃ　　ｐＨ６，５）で達成される。最終の精製
は半調製用ＲＰ−ＨＰＬＣカラムで行われる。２１．３
分の滞留時間で活性フラクションが溶出し、９５％純度
のＩＧＦ−１の１．１ｍｇが得られる。実験条件：バイ
ダック（Ｖｙｄａｃ）２１８　Ｔ５１０　　ＲＰ−ＨＰ
ＬＣカラム、１０１０Ｘ２５０；分離車りのアリュート
部分（２００牌文濃縮１　：　１０）；ＡＵＦＳｏ、５
，２２０ｍｎ；流速：３−７分、溶離液：Ａ：０．１％
トリフルオロ酢酸、３分３５％Ｂ、次に３５９６の間に
４５％Ｂに増大、得られたフラクションをｌ：ｌ希釈し
、凍結乾燥する。
培地（実施例１０ａ９照）から単離されたＩＧＦ−１を
ＲＰ−ＨＰＬＣ分析に従って血清からのＩＧＦ−１標品
と得られる。
等電点ｐＩ：８．６（等電フォーカシング、蛋白のＴＣ
Ａ沈殿） アミノ酸組　の・ 純粋なＩＧＦ−１の約２．５ＪＬｇを１１０℃で６ＮＨ
ＣｆＬで２４時間加水分解し、次にチャン（Ｃｈａｎ４
）等により報告（ＤＡＢＳ−Ｃ１方法；「メソド・イン
・エンチモロジイＪ　　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ）　、第９１巻、第４１頁、１９８３年
〕されているように分析する。加水分解物は次の組成を
有している。
純粋なＩＧＦ−１の７０ｐ−ｇ　（ｔｏｎ　ｍａｌ）を
エドマン（Ｅｄｍａｎ）に従って通常の配列に受けしめ
る。Ｎ−末端ＰＴＨ−アミノ酸はＲＰ−ＨＰＩ、Ｃによ
って測定する。
■ Ｃｙｃｌｅ　　　　　ｌ　　　　　　　　　　　５　　
　　　　　　　　　　　１０Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　（
ｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙａ＊−Ｇ
ｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｃｌｅ　　　　　
１］１５　　　　　　　　　　　　２０Ａｍｉｎｏ　ａ
ｃｉｄ　Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｓｕ−Ｇｉｎ−Ｐ
ｈｅ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ＊−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｅｌｅ
　　　　　２１　　　　　　　　　　２５　　　　　　
　　　　　　　３０Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　Ａｒｇ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｂａ−Ｔｙｒ−ＰＩ＋ｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｅ−Ｐ
ｒｏ−τｈｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｃｌｅ　　　　　３１　　
　　　　　　　　３５　　　　　　　　　　　　　４０
Ａｍｉｎｏ　　ａｃｉｄ　　Ｔｙｒ−（２１ｙ−５＠ｒ
−５ｅｒ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−
Ｇｉｎ−ｎ、ｄ、　：測定せず 零：　Ｃｙｓ（ｆ（）およびＣ７ｇ（１８）は別個にヨ
ウ素アセトアミドによるカルボキシメチル化により測定
する。
アミノ酸１−５０からの部分配列はこのようにしてＩＧ
Ｆ−１標品の公知の一次配列と同定される。
旦ニーに土じ玉折 純粋なＩＧＦ−１をカルボキシペプチダーゼＹで消化し
、そして″Ｍ敲アミノ酸をアミノ酸アナライザーで測定
する（ＪＪＹ、チャン、Ｒ，クネデル（Ｋｎｅｄｅｌ）
　、　Ｄ　、　Ｇ−ブラウン（Ｂｒａｕｎ）、バイオケ
ム（Ｂｉａｃｈｅｍ）、　Ｊ　、第１９９巻、第５４７
頁参照〕。
経理 アミノ酸　　　　　　　　　７０ ５分消化：　　　　　　　−Ａｌａ １２０分消化：　　　　５ｅｒ−Ａｌａ王土」づと１皿 ＩＧＦ−１（３０ルｇ）をＳＤＳ尿素ゲル（ＳＵＳＤゲ
ル；カイト（Ｋｙｔｅ）等、アナル：ビオケム（Ａｎａ
ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　、第１３３巻、第５１５頁
、１９８３年参照〕で分析する。
６０００〜７０００ダルトンの見かけ分子量に相当する
単一バンドが認められる。
ＰＡＢ−ＭＳによる　子量　。
ＩＧＦ−１をファスｌ−−アトム会ボンバードメント・
ポジティブ・イオン・マス番スペクロメト　リ　−　（
ｆａ　Ｓｔ　　ａｔｏｍ　　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ　
　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　　ｉ　ｏｎｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔ
ｒｏｍｅｔｒｙ）　　（Ｆ　Ａ　Ｂ　−Ｍ　Ｓ　）にか
ける、装コニマンチェスター、ＶＧ−アナリティカル・
リミッテッド（ＶＣ−Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｌｔｄ、
）のＺＡＢ−ＨＦマス・スペクトロメーター；マトリッ
クス：チオグリセロール；キャノンボンバード；イオン
エネルギー３ＫｅＶ；外部検量：Ｃｓ３Ｉ、Ｊ２ｇ（分
子量ニア６６７．４）実験式　　　　：０３３１Ｈ５１
８Ｎ９４ｏｌＯＩＳ７分子量（計算値）：　　７６４８
．７１／／　　（実験値）：　　７６４８．０７
【図面の簡単な説明】
第１図はＰＨ０５プロモーター領域のＢａｍＨＩ−Ｓ　
ａ　ＩＩフラグメントのＤＮＡ配列を示す。 第２図はＧＡＰＤＨのプロモーター望域のＤＮＡ配列（
クローン４９１．Ｇ、Ａ、ビターＢｉｔｔｅｒ）等、ジ
ー７　（Ｇｅｎｅ）　、第３２巻、第２６３頁。 １９８０年参照〕を示す。 第３図はプラスミドｐＧＡＰＤＨ−ＥＬの生産を図示す
る。 第４図は本発明で用いるＧＡＰＤＨ遺伝子の３′プロモ
ーターエレメントを示す。 第５図はプラスミドｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＥＧ
Ｌの生産を示すダイヤグラムを示す。 第６図はプラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＥＬ−ＥＧ
Ｌ　（ＵＡＳ　ｌ）の構成を示す。 第７図は成熟デスルフトヒルディンをコードしているＤ
ＮＡフラグメントの単離を示す図式を示す。 第８図はプラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−ＨＩＲ
の製造を図示する。 第９図はプラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５（Ｅｃｏ
）−ＨＩＲの構成を図示する。 第１０図はプラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＥＬ−Ｔ
ＰＡ　（ＵＡＳ　１＋ＵＡＳ２）の構成を示す図式を示
す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、イーストＰＨ０５遺伝子から誘導された上流活性配
    列。 ２、特許請求の範囲第１項記載のイースト ＰＨ０５遺伝子のヌクレオチド−１７４と −５４１との間のＢａｍＨ I −ＢｓｔＥIIフラグメン
    トに含まれる上流活性配列ＵＡＳ１（ＰＨ０５）および
    ＵＡＳ２（ＰＨ０５）。 ３、特許請求の範囲第１項記載のＰＨ０５遺伝子のヌク
    レオチド−２７４と−５４１との間のＢａｍＨ I −Ｃ
    ｌａ I フラグメントに含まれる上流活性配列ＵＡＳ１
    （ＰＨ０５）。 ４、特許請求の範囲第１項記載の式 【ＤＮＡ配列があります】 を有するＤＮＡに含まれる上流活性配列ＵＡＳ１（ＰＨ
    ０５）。 ５、特許請求の範囲第１項記載のＰＨ０５遺伝子のヌク
    レオチド−１７４と−２７３との間のＣｌａ I −Ｂｓ
    ｔＥIIフラグメントに含まれる上流活性配列ＵＡＳ２（
    ＰＨ０５）。 ６、イーストＰＨ０５遺伝子の上流活性部位を包含する
    ５′上流プロモーターエレメントおよびＧＡＰＤＨ遺伝
    子のヌクレオチド−３００乃至−１８０で始まり、ヌク
    レオチド−１で終るイーストＧＡＰＤＨ遺伝子の３′下
    流プロモーターエレメントからなるイーストハイブリッ
    ドプロモーター。 ７、５′上流プロモーターエレメントがイーストＰＨ０
    ５遺伝子の５′−領域の３８６ｂｐＢａｍＨ I −Ｂｓ
    ｔＥIIフラグメントである特許請求の範囲第６項記載の
    ハイブリッドプロモーター。 ８、５′上流プロモーターエレメントがイーストＰＨ０
    ５遺伝子の５′−領域の２８６ｂｐＢａｍＨ I −Ｃｌ
    ａ I フラグメントである特許請求の範囲第６項記載の
    ハイブリッドプロモーター。 ９、５′上流プロモーターエレメントが式 【ＤＮＡ配列があります】 の３１ｂｐＤＮＡである特許請求の範囲第６項記載のハ
    イブリッドプロモーター。 １０、５′上流プロモーターエレメントがイーストＰＨ
    ０５遺伝子の５′領域の１００ｂｐＣｌａ I −Ｂｓｔ
    ＥIIである特許請求の範囲第６項記載のハイブリッドプ
    ロモーター。 １１、ＵＡＳ１（ＰＨ０５）およびＵＡＳ２（ＰＨ０５
    ）を含有する特許請求の範囲第６項記載のハイブリッド
    プロモーター。 １２、ＵＡＳ１（ＰＨ０５）を含む特許請求の範囲第６
    項記載のハイブリッドプロモーター。 １３、ＵＡＳ２（ＰＨ０５）を含む特許請求の範囲第６
    項記載のハイブリッドプロモーター。 １４、３′下流プロモーターエレメントがイーストＧＡ
    ＰＤＨ遺伝子のヌクレオチド−１９９乃至−１を包含す
    る特許請求の範囲第６項記載のハイブリッドプロモータ
    ー。 １５、３′下流プロモーターエレメントがイーストＧＡ
    ＰＤＨ遺伝子のヌクレオチド−２６３乃至−１を包含す
    る特許請求の範囲第６項記載のハイブリッドプロモータ
    ー。 １６、各挿入がイーストＰＨ０５遺伝子のＵＡＳ群を伴
    う５′上流プロモーターエレメントおよびＧＡＰＤＨ遺
    伝子のヌクレオチド−３００乃至−１８０で始まり、ヌ
    クレオチド−１で終る３′下流プロモーターエレメント
    からなるハイブリッドプロモーターの転写コントロール
    条件下でイーストに対して異種のポリペプチドをコード
    しているＤＮＡ断片からなっている１個または複数のＤ
    ＮＡ挿入を含むイーストハイブリッドベクター。 １７、特許請求の範囲第７−１３項記載の５′上流プロ
    モーターエレメントおよび特許請求の範囲第１４または
    １５項記載の３′下流プロモーターエレメントからなる
    特許請求の範囲第１６項記載のハイブリッドベクター。 １８、イーストハイブリッドベクターが接合点で挿入さ
    れたＡＴＧを有する成熟ポリペプチドのコード領域に直
    接結合している特許請求の範囲第１６項記載のハイブリ
    ッドベクター。 １９、ポリペプチドコード領域がシグナル配列を有する
    ポリペプチドをコードしている特許請求の範囲第１６項
    記載のハイブリッドベクター。 ２０、各々がイーストＰＨ０５遺伝子のＵＡＳ群を伴う
    ５′上流プロモーターエレメントおよびＧＡＰＤＨ遺伝
    子のヌクレオチド−３００乃至−１８０で始まり、ヌク
    レトチド−１で終る３′下流プロモーターエレメントか
    らなるハイブリッドプロモーターの転写コントロール条
    件下でイーストに対して異種のポリペプチドをコードし
    ているＤＮＡ断片からなっている１個または複数のＤＮ
    Ａ挿入を含有するハイブリッドベクターで形質転換され
    たイースト宿主およびその突然変異体。 ２１、特許請求の範囲第１７項−１９項記載のハイブリ
    ッドベクターで形質転換された特許請求の範囲第２０項
    記載のイースト宿主およびその突然変異体。 ２２、各々がイーストＰＨ０５遺伝子のＵＡＳ群を伴う
    ５′上流プロモーターエレメントおよびＧＡＰＤＨ遺伝
    子のヌクレオチド−３００乃至−１８０で始まり、ヌク
    レオチド−１で終る３′下流プロモーターエレメントか
    らなるハイブリッドプロモーターの転写コントロール条
    件下でイーストに対して異種のポリペプチドをコードし
    ているＤＮＡ断片からなっている１個または複数のＤＮ
    Ａ挿入を含有するハイブリッドベクターで形質転換され
    たイースト菌株またはその突然変異株を培養し、そして
    発現ポリペプチドを単離することを特徴とするイースト
    に対して異種のポリペプチドを生産する方法。 ２３、ＤＮＡ配列が高級真核起原のポリペプチドをコー
    ドしている特許請求の範囲第２２項記載の方法。 ２４、ＤＮＡ配列がヒトα−インターフェロン、ヒトハ
    イブリッドインターフェロン、ヒトｔ−ＰＡ、ＨＢＶｓ
    Ａｇ、デスルファトヒルディン、エグリンＣおよびイン
    シュリン様成長因子からなる群から選択されるポリペプ
    チドをコードしている特許請求の範囲第２２項記載の方
    法。 ２５、特許請求の範囲第２２項記載のエグリン（ｅｇｌ
    ｉｎ）の生産方法。 ２６、特許請求の範囲第２２項記載のデスルファトヒル
    ディン（ｄｅｓｕｌｐｈａｔｏｈｉｒｕｄｉｎ）の生産
    方法。 ２７、特許請求の範囲第２２項記載のヒトｔ−ＰＡの生
    産方法。 ２８、特許請求の範囲第２２項記載のインシュリン様成
    長因子の生産方法。
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