DK175093B1

DK175093B1 - DNA-fragment, fremgangsmåde til fremstilling deraf, gærhybridpromotor, indeholdende DNA-fragmentet, fremgangsmåde til fremstilling deraf......

Info

Publication number: DK175093B1
Application number: DK198604096A
Authority: DK
Inventors: Albert Hinnen; Bernd Meyhack
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1985-08-29
Filing date: 1986-08-28
Publication date: 2004-05-24
Also published as: IL79837A; NO863458L; NO175871B; DK409686A; NO175871C; US5436136A; PH24715A; NZ217388A; HUT42525A; DK409686D0; JPS6251995A; GB8521496D0; GR862209B; CA1318616C; ES2006382A6; DD254212A5; IE862307L; EP0213593A1; PT83273A; IE58844B1

Description

i DK 175093 B1

Den foreliggende opfindelse angår fremstillingen af fremmede I polypeptider i gærværter under anvendelse af rekombinant-DNA-teknik. Nærmere betegnet angår opfindelsen 5 hidtil ukendte modstrømsaktiveringssekvenser (upstream activation sequences), hybridgærpromotorer, som indeholder * sådanne modstrømsaktiveringssekvenser, hidtil ukendte hybridvektorer, som er nyttige til transformationen af gærceller, de transformerede gærceller og anvendelsen af de 10 transformerede gærceller til fremstilling af polypeptider, som er fremmede for gæren.

I I løbet af de senere år er der opnået store fremskridt I indenfor gensplejsningsområdet, og i dag anvendes nogle I systemer, som udnytter gensplejsede mikroorganismer, især I 15 stammer af enterobakterien Escherichia coli og af bagegær I (Saccharomyces cerevisiae). Der er imidlertid et behov for I nye og bedre systemer, især eukaryote systemer, såsom gær, I der er egnede til økonomisk industriel proteinfremstilling i I stor målestok. Der findes forskellige gærvektorer, som er I 20 tilgængelige til genkloning. Til effektiv udtrykkelse af I fremmede gener i gær skal strukturkodningssekvenser I kombineres med kraftige gærpromotorer, som fordelagtigt skal I have regulerende egenskaber, der tillader exogen kontrol af I genekspression. Da ekspressionseffektiviteten I 25 (produktdannelse) antages at være en funktion af og I proportionalt med den anvendte promotors styrke, har man I indenfor gensplejsningsområdet især beskæftiget sig med I udviklingen af kraftigt virkende promotorsystemer.

I In vitro mutagenese af klonede gærgener, som koder for I 30 proteiner, og deres genindførelse i gærceller med henblik på I funktionel analyse har muliggjort identificeringen af I forskellige cis-virkende promotorelementer, jf. L. Guarente, I Cell 36, 799 (1984). Hvis man begynder med elementerne, der I støder umiddelbart op til proteinkodningsområdet ved I 35 5’-enden i genet, indeholder disse elementer følgende: 2 et 5'-transskriberet lederområde, som indeholder temmelig meget A-T, og som sommetider indeholder et CAACAACAA-tema (eller beslægtet sekvens), 5 transskriptionsstartpunkter anbragt ca. 40 til 60 bp (sommetider mere) fra translationsstartkodonen ATG og sædvanligvis rettet mod flere mRNA-startsteder af forskellige styrker, en TATA-box (sommetider mere end én) anbragt ca. 40 til 80 10 bp fra transskriptionsstartpunkteme, og som formentlig virker som essentielt RNA-polymerase II-genkende1sessted, modstrømsaktiveringssted eller -steder (UAS), som formodentlig er målsteder for reguleringsproteiner, og som er anbragt ca. 100 til 300 bp i modstrømsretningen fra 15 TATA-boxen.

UAS'et virker på en anden måde end de reguleringssteder, som findes i procaryoter, og ligner mere forstærkerstederne (enhancer sites) i pattedyrssystemerne. Ret detaljerede data er tilgængelige fra gær GAL 1, GAL 7, GAL 10-gruppen, hvor 20 et positivt virkende reguleringsprotein (GAL 4-genprodukt) vekselvirker direkte med UAS'et i GAL 1 - GAL 10, jf. Giniger et al., Cell 40, 767 (1985).

Ved fusionering af promotorsegmenter, der indkoder UAS'et for GAL 1 - GAL 10 foran TATA-boxen i gær CYC 1-genet, 25 dannes en hybridpromotor, hvis transskription nu kontrolleres af UAS'et for GAL 1 - GAL 10, dvs. er GAL

4-genafhængig, jf. L. Guarente et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7410 (1984). En lignende konstruktion dannes ved at fusionere promotorelementer for CYC 1 og LEU 2, jf. 30 L. Guarente et al., Cell 36, 503 (1984). Begge disse eksempler indbefatter promotorelementer og proteinkodningssekvenser fra gær, og det er ikke godtgjort, at disse systemer også virker med gener, som er fremmede i gær.

DK 175093 B1 3

Fra beskrivelsen til PCT-patentansøgning nr. 84/4757 kendes en UAS-komponent for gær PKG-genet- Der er vist et essentielt promotorelement lokaliseret mellem stillingerne 5 -324 og -455 (fra ATG'en). Det anføres, at tilføjelsen af denne komponent foran de andre promotorer potenserer styrken af enhver anden gærpromotor. Der er imidlertid ikke givet nogen eksempler, som underbygger denne påstand, idet argumenterne er baseret fuldstændigt på negative data 10 (ødelæggelse af en promotor). Det er vel muligt, at komponenten er en essentiel del af PKG-promotoren, men det er tvivlsomt, om en sådan komponent ville virke som en del af en hybridpromotor. Desuden er UAS'et for PKG ikke forbundet med et reguleringssignal, dvs. det tillader ikke 15 kontrol af ekspressionen (transskription) af ned- eller medstrømskodningssekvensen (downstream coding sequence) ved hjælp af et specifikt fysiologisk signal.

Nogle af promotorerne for glycolytiske gener indføres i nærværelse af glucose. De kan senere kobles fra, hvis 20 cellerne dyrkes i et glycosefrit medium. Dette betyder, at gærværtcelierne skal transformeres og regenereres i et medium, hvor glucose er erstattet med andre carbonkilder (acetat, glycerol, lactat osv.) for at beskytte cellerne mod akkumulering af et potentielt skadeligt eller letalt 25 genprodukt i cellerne. Da regenereringen af protoplaster [A. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)] eller er saltbehandlede hele celler [ Ito et al., J. Bacteriol. 153, 163 (1983)] sædvanligvis gennemføres i et kraftigt medium for at tillade hurtig regenerering af 30 cellerne og dannelse af kolonier, anvendes glucose som carbonkilde ved alle de for tiden anvendte transformationsmetoder. Det antages, at regenereringen og restitutionen i et glucosefrit medium forløber meget dårligt eller slet ikke.

υκ i /øuyø di 4

Det antages almindeligvis, at ekspressionstidspunktet skal reguleres for at sikre, at proteinet kun dannes i høje koncentrationer, når cellerne bedst kan tolerere de store 5 mængder fremmedproteiner, dvs. udenfor vækstperioden. Det er også ønskværdigt, at reguleringen af ekspressionen ikke afhænger af tilstedeværelsen eller fraværelsen af den vigtigste carbonkilde for mikrobiel vækst, nemlig glucose. Regulerbare og stærke promotorsystemer, som imødekommer 10 disse fordringer med hensyn til hensigtsmæssig og teknisk gennemførlig ekspression af fremmede gener ved hjælp af gær, findes næsten ikke. Der er derfor et behov for udvikling af sådanne promotorsystemer.

Det har overraskende vist sig, at en kombination af 15 TATA-boxområdet i promotorer, som kontrollerer ekspressionen af enzymer, der indgår i den glycolytiske proces, og som sædvanligvis antages at høre til de stærkeste af de kendte promotorer, med op- eller modstrømspromotorkomponenter fra en regulerbar promotor, bevirker frakoblingen, som ikke 20 afhænger af tilstedeværelsen eller fraværelsen af en essentiel bestanddel i vækstmediet, såsom en essentiel carbon- eller nitrogenkilde, til stærke hybridpromotorer, som opfylder hovedkravene, der stilles til teknisk anvendelige promotorsystemer.

25 Det er formålet med opfindelsen at anvende hybridpromotorer, især promotorer for glycolytiske gener, bragt under kontrol af UAS'et for sur phosphatase PH05-genet til effektiv ekspression af fremmede gener i gær.

Det er tillige formålet at tilvejebringe de nyligt isolerede 30 UAS-signaler for gær PH05-genet, hybridpromotorer indeholdende PH05 UAS-signalerne, hybridvektorer indeholdende sådanne hybridpromotorer samt gærværter transformeret med sådanne hybridvektorer.

DK 175093 B1 5

Det er desuden formålet med opfindelsen at tilvejebringe fremgangsmåder til fremstilling af UAS-signaleme, hybridpromotorerne, hybridvektorerne og de transformerede 5 gærværter samt anvendelsen af de transformerede gærværter til fremstilling af polypeptider.

1. Opstrømsaktiveringssekvenser og gærsur phosphatase (PH05)-genet og hybridpromotorer

Opfindelsen angår opstrømsaktiveringssekvenser afledt af 10 gær PH05-genet og anvendelsen deraf til fremstilling af hybridpromotorer.

Hidtil har man ikke vidst, om der findes et eller to opstrømsaktiveringsstéder.·eller -sekvenser ("UAS"), som modulerer transskriptionen af gær PH05-genet. PH05-Genet 15 koder for en repressibel gærsur phosphatase. Den frakobles ved høj koncentration af uorganisk phosphat og tilkobles under mangel på uorganisk phosphat, jf. B. Meyhack et al., EMBO-J. 1, 675 (1982).

Analysen af 5'-området af PH05-genet har nu ført til 20 identificeringen af cis-virkende elementer, som modulerer transskriptionen af PH05-genet. Et 623 bp BamHI-Sall-fragment af 5'-området af PH05-genet klonet i . fagvektoren M13mp9 (rekombinantvektor (M13mp9/PH05 Barn-Sal, jf. beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 143.081) 25 spaltes med exonuclease Bal31 startende fra Barn-stedet og ved et andet forsøg fra Sal-stedet. Der dannes således en række forkortede PH05-promotorfragmenter, som underkastes sekvensanalyse og forsynes med syntetiske EcoRI-linkere ved de afkortede ender. Ved kombination af fragmenter afkortet 30 ved Sal-stedet ("left arm promoter fragments") ved fragmenter afkortet ved Barn-stedet ("right arm promoter fragments") dannes en række sletningsmutanter fra PH05-promotorområdet, som afprøves for deres evne til at

Ulv 1 f OU5« Dl 6 foretage ekspression af PH05-strukturgenet. Det er konstateret, at sletningen mellem nucleotiderne -225 til -263 fører til en femdobbelt reduktion af sur phosphataseaktivitet, og sletninger mellem nucleotider -361 5 til -392 eller mellem nucleotider -346 til -369 fører til en tidobbelt reduktion af sur phosphataseaktivitet (angående nummereringen af nucleotiderne henvises til fig. 1 på tegningen). Disse virkninger tilskrives opstrømsaktiveringssteder (UAS), som er essentielle for 10 PH05-ekspression. UAS'et i nærheden af nucleotid -365 er indeholdt i et 268 bp BamHI-Clal-fragment (nucleotider -274 til -541) af 5’-området af PH05-genet og betegnes UAS1(PH05), medens et UAS-område i nærheden af nucleotid -245 er indeholdt i 100 bp Clal-BstEll-fragmentet 15 (nucleotider -174 til -273) i 5'-området i PH05-genet og betegnes UAS2(PH05).

Opfindelsen angår BamHI-Clal-DNA-fragmenter indeholdende opstrømsaktiveringssekvensen UAS1(PH04) indeholdt i BamHI-20 Clal-fragmentet mellem nucleotider -274 til -541 fra PH05-genet og modstrømsaktiveringssekvensen UAS2(PH05) indeholdt i Clal-BstEII-fragmentet mellem nucelotider -174 til -273 i PH05-genet. 1 5

Især foretrækkes opstrømsaktiveringssekvensen UAS1(PH05).

Den nøjagtige position af UAS1-reguleringssignalet i BamHI-Clal-fragmentet er blevet bestemt.

UAS1-reguleringssignalet er således indeholdt i et 31 bp DNA-fragment (stilling -381 til -351 i 30 PH05-promotorområdet). Fortrinsvis er fragmentet i begge sider forsynet med linkere med korte ender, som indeholder egnede restriktionssteder med forskudte ender, som er specifikke for en restriktionsendonuclease, såsom EcoRl. 31 ^ bp-fragmentet har følgende sekvens: 7 DK 175093 B1

GAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCA

CTTTATATATAATTTAATCGTGCAAAAGCGT

Opfindelsen angår endvidere fremgangsmåder til fremstilling : 5 af DNA-fragmenter, som indeholder UAS1(PH05) og/eller UAS 2-(PH05)-sekvenserne, omfatter spaltning af et DNA indeholdende PH05-genet, PH05-genet eller 51-terminaldelen deraf med egnede restriktionsendonucleaser og isolering af de ønskede fragmenter. Eksempelvis spaltes 623 bp BamHI-Sall-fragmentet 10 af PH05 (se ovenfor) indeholdende PH05-promotoren og en del af PHO5-kodningsområdet med restriktionsendonucleaser BamHI og BstEII, og det dannede 368 bp-underfragment, som indeholder begge modstrømsaktiveringssteder, isoleres. På tilsvarende måde giver spaltning af det ovenfor omtalte 15 BamHl-Sall-fragment med BamHI og Clal eller med Clal og

BstEII henholdsvis 268 bp BamHI-Clal-underfragmentet indeholdende UAS1(PH05) og 100 bp

Clal-BstEII-underfragmentet indeholdende UAS2(PH05).

Isoleringen og rensningen af fragmenterne og 20 underfragmenterne gennemføres på sædvanlig måde, f.eks. ved agarosegelelektroforese eller polyacrylamidgelelektroforese.

DNA-fragmenterne, som indeholder 25 opstrømsaktiveringsstederne ifølge opfindelsen, kan afkortes på i og for sig kendt måde, f.eks. ved partiel spaltning med en exonuclease, f.eks. Bal31, på en sådan måde, at UAS-funktionen bibeholdes i det afkortede fragment. Afkortningen kan gennemføres ved 5'-enden eller ved 3'-enden 20 af fragmenterne eller ved begge sider. Der foretages udvælgelse af de underfragmenter, hvori UAS-funktionen er bibeholdt, som beskrevet ovenfor, nemlig ved at ombytte de oprindelige sekvenser, som indeholder UAS'et eller 35 I UIS. 1 /OlttfJ Dl I 8 I UAS'erne med de afkortede fragmenter, hvorefter de dannede I PH05-promotorsletningsmutanter testes for deres evne til at I gennemføre ekspression af PH05-strukturgenet. Fragmenterne I og de afkortede derivater deraf ifølge opfindelsen I 5 indeholdende det ene eller begge op- eller modstrømsaktive- I ringssteder fra PH05-genet kan forsynes med syntetiske lin- I kersekvenser knyttet til begge ender for at lette konstruk- I tionen af hybridpromotorer og fastgørelse til en vektor.

I 10 DNA-fragmenterne samt de afkortede derivater deraf I indeholdende modstrømsaktiveringsstedet eller -stederne fra I PH05 kan også fremstilles ved kemisk DNA-syntese under I anvendelse af konventionel teknik på dette område. Egnede I teknikker er omtalt af S.A. Narang, Tetrahedron 39, 3 I 15 (1983). Især fremgangsmåderne omtalt i beskrivelsen til I europæisk patentansøgning nr. 146.785 kan anvendes.

I Opfindelsen omfatter tillige anvendelsen af I modstrømsaktiveringsstederne i PH05-genet til fremstilling I 20 af hybridpromotorer samt hybridpromotorer, som indeholder I modstrømsaktiveringssteder fra PH05-genet. 1

Opfindelsen angår især gærhybridpromotorer, som indeholder, I især består af et 5'modstrømspromotorelement indeholdende I 25 modstrømsaktiveringssted eller -steder fra gær PH05-genet og I et 3'-medstrømspromotorelement fra et gærgen, som er I forskelligt fra gær PH05-genet, indeholdende I transskriptionsinitieringssteder omfattende en funktionel I TATA-box, og som ender nær ved transiationsstartkodonet.

I 30 I 5' -Modstrømspromotorelementet er især et af de ovenfor I anførte DNA-fragmenter, især 368 bp I BamHI-BstEII-fragmenteme, som indeholder UAS1(PH05) og I UAS2(PH05), eller 268 bp BamHI-Clal-fragmentet indeholdende I 35 UAS1(PH05), eller afkortede derivater deraf, hvori UAS- funktionen er bevaret, såsom 31 bp-fragmentet indeholdende UAS1(PH05) eller endog mindre underfragmenter deraf.

DK 175093 B1 9 3'-Medstrømspromotorelementet er fortrinsvis afledt af 5 promotoren for et kraftigt udtrykt gærgen, især af promotoren for et gærgen, som koder for et glycolytisk enzym, såsom promotoren for enolase-, glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase- (GAPDH), 3-phosphoglycerat- kinase-(PGK), hexokinase-, pyruvat-decarboxylase-, 10 phosphofructokinase-, glucose-6-phosphat-isomerase-, 3-phosphoglycerat-mutase-, pyruvat-kinase- (PyK), triosephosphat-isomerase-, phosphoglucose-isomerase- og glucokinasegenerne. 3’-Promotorelementeme indbefatter TATA-boxen, som er involveret i anbringelsen af enzymet 15 RNA-polymerase II til korrekt transskriptionsinitiering og de korrekte startpunkter for transskriptionen (hoved mRNA-startpunkter). I medstrømsretningen fra TATA-boxen udstrækker 3'-promotorelementet sig til området mellem hoved mRNA-starten og transiationsstartkodonet (ATG), fortrinsvis 20 tæt ved translationsstartkodonet. På modstrømssiden fra TATA-boxen omfatter 3'-promotorelementerne omtrentlig 50 til 150 oprindelige basepar. Den nøjagtige længde af denne modstrøms-DNA-sekvens er ikke kritisk, da der synes at være nogen fleksibilitet, hvad angår afstanden mellem UAS'erne 25 og TATA-boxen.

Det foretrukne 3'-promotorelement ifølge opfindelsen er afledt af GAPDH-promotoren, som er kendt som en af de stærkeste gærpromotorer [ enzymet GAPDH kan udgøre ca. 5% af tørvægten af Saccharomyces cerevisiae, jf. E. G. Krebs, J.

30 Biol. Chem. 200, 471 (1953)]. Fortrinsvis starter 3'-GAPDH-promotorelementet ved nucleotid -300 til -180 og slutter ved nucleotid -1 i GAPDH-genet. Ved en foretrukken udførelsesform for opfindelsen indeholder 3*-promotor-elementet nucleotider -199 til -1 i GAPDH-genet. Ved en 35 anden foretrukken udførelsesform for opfindelsen Inde- — 10 ui\. i Aouyj di holder 3'-promotorelementet nucleotider -263 til -1 i GAPDH-genet.

Hybridpromotorerne ifølge opfindelsen kan indeholde et 5 enkelt UAS(PH05) eller flere UAS(PH05) af samme type, såsom UAS1(PH05), fortrinsvis anbragt i såkaldt hoved-mod-hale-orientering. Hvad angår 31-promotorelementet kan UAS'et eller 'eme have samme eller modsatte orientering sammenlignet med orienteringen i den ægte 10 PH05-promotor.

Bestanddelene af hybridpromotorerne ifølge opfindelsen, nemlig promotorelementet indeholdende UAS eller UAS'er for PH05 og promotorelementet indeholdende TATA-boxen, er bundet sammen ved hjælp af syntetiske linkere, ved hjælp af 15 kortendeligering eller eventuelt over naturligt forekommende forenelige restriktionssteder. 5'- og 3’-enderne i hybridpromotorerne ifølge opfindelsen er hensigtsmæssigt forsynet med syntetiske linkere, som tillader ligering til et vektor-DNA og, ved 3’-enden, binding til et heterologt 20 proteinkodningsområde.

Hybridpromotorerne ifølge opfindelsen opfylder alle de krav, som stilles til promotorer, der skal anvendes i bioteknologien. De er stærke, kan induceres ved hjælp af stoffer, som er forskellige fra essentielle carbon- eller nitrogenkilder 25 i vækstmediet, og kan håndteres hensigtsmæssigt i labora-toriemålestok og industriel målestok.

Opfindelsen angår desuden en fremgangsmåde til fremstilling af hybridpromotorer indeholdende et 51-modstrømspromotor-element omfattende et modstrømsaktiveringssted eller -steder 30 fra gær-PH05-genet og et 3'-medstrømspromotorelement fra et gærgen forskelligt fra PH05-genet omfattende transskriptionsinitieringssteder, som indeholder en funktionel TATA-box, og som ender tæt ved translationsstartkodonet, ved hvilken metode et 5'-modstrømspromotorelement indeholdende DK 175093 B1 11 et modstrømsaktiveringssted eller -steder fra gær-PH05-genet bindes til et 3’-raedstrømspromotorelement fra et gærgen forskelligt fra PH05-genet, som indeholder en funktionel 5 TATA-box og ender tæt ved translationsstartkodonet.

Ved en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden gennemføres ligering af promotorelementerne ved hjælp af syntetiske linkere.

De ovenfor omtalte medstrømspromotorelementer fra et gærgen 10 forskelligt fra PH05-genet fremstilles ved partiel spaltning af 5'-enden af en stærk gærpromotor, f.eks. en af de ovenfor anførte, som strækker sig til området mellem hoved-mRNA-starten og translationsstartkodonet, med en exonuclease, f.eks. Bal31, og binding af de dannede 5'-korte 15 ender til et syntetisk linker-DNA. Der foretages selektion af promotorelementer, som bibeholder transskriptions startstedet eller -stederne og TATA-boxen indeholdende ca.

50 til 150 basepar af sekvenser 5' til TATA-boxen. Selektionen gennemføres f.eks. ved spaltning af de dannede 20 promotorelementer med restriktionsendonucleasen, som genkender den syntetiske linkersekvens ved 5’-enden, og med restriktionsendonucleasen, som genkender den syntetiske linkersekvens ved 3'-enden af promotorelementet, hvorpå længden af det dannede DNA-fragment bestemmes ved hjælp af 25 agarosegelelektroforese. 3 *-Promotorelementerne kan også dannes ved kemisk syntese under anvendelse af kendte fremgangsmåder.

Hybridpromotorerne ifølge opfindelsen kan anvendes til den forhøjede og regulerede ekspression af pattedyrgener i gær.

12 2. Hybridvektorer indeholdende et gen, som koder for et heterologt polypeptid under kontrol af hybridpromotorer

Opfindelsen angår også gærhybridvektorer, som indeholder en 5 eller flere indsatte DNA-dele (DNA inserts), som hver indeholder et DNA-segment, der koder for et polypeptid heterologt til gær under transskriptionskontrol af en hybridpromotor bestående af et 51-modstrømspromotorelement med UAS eller UAS’er fra gær-PH05-genet og et 10 3'-medstrømspromotorelement fra et gærgen forskelligt fra PH05-genet indeholdende transskriptionsinitieringssteder omfattende en funktionel TATA-box.

Hybridvektorerne ifølge opfindelsen er valgt blandt gruppen bestående af et hybridplasmid og en lineær DNA-vektor.

15 Et DNA-segment, som koder for et polypeptid heterologt til gær, er et DNA (gen), der koder for mange forskellige polypeptider, herunder glycosylerede polypeptider, især fra højere eukaryoter, specielt pattedyr, f.eks. af animalsk eller især human oprindelse, f.eks. enzymer, som kan 20 anvendes f.eks. til fremstillingen af næringsmidler og til gennemførelse af enzymatiske reaktioner i kemien, eller ikke-enzymatiske polypeptider, der er nyttige og værdifulde til behandling eller forebyggelse af sygdomme hos mennesker eller dyr, f.eks. hormoner, polypeptider med immuno- 25 modulatorisk virkning, antiviral virkning og antitumor virkning, antistoffer, virusantigener, vacciner, koaguleringsfaktorer, levnedsmidler og lignende.

Som eksempler på polypeptider kan nævnes insulin, vækstfaktorer, såsom epidermal, insulinlignende, mastcelle, 30 nerve eller transformerende vækstfaktor, væksthormoner, såsom humane eller bovine væksthormoner, interleukin, såsom interleukin-1 eller -2, human makrofagmigreringsinhibe-ringsfaktor (MIF), interferoner, såsom human a-interferon.

DK 175093 B1 13 f.eks. interferon-oA, -aB, -aD eller -aF. (3-interferon, 7-interferon eller et hybridinterferon, f.eks. et aA-aD-eller et aB-aD-hybridinterferon, hepatitisvirusantigener, 5 f.eks. hepatitis B-virusoverfladéantigen eller -kærneantigen eller hepatitis A-virusantigen, plasminogenaktivatorer, såsom vævsplasminogenaktivator eller urokinase, tumornecrose faktor, somatostatin, renin, (3-endorphin, immunoglobuliner, såsom de lette og/eller tunge kæder af 10 immunoglobulin D, E eller G, immunoglobulinbindingsfaktorer, såsom immunoglobulin E-bindingsfaktor, calcitonin, humant calcitoninbeslægtet peptid, blodkoaguleringsfaktorer, såsom faktor IX eller Ville, eglin, såsom eglin C, desulphatohirudin, såsom desulphatohirudinvariant HVl, HV2 15 eller PA, eller human superoxiddismutase. Der foretrækkes sådanne gener, som koder for et humant a-interferon eller hybridinterferon, human vævsplasminogenaktivator (t-PA), hepatitis B-virusoverfladeantigen (HBVsAg), insulinlignende vækstfaktor I, eglin C og desulphatohirudinvariant HVl.

20 Hybridpromotoren er især en af de ovenfor anførte.

Hybridvektorerne ifølge opfindelsen kan indeholde en eller flere indsatte DNA-dele, som hver bl.a. indeholder hybridpromotoren og et DNA-segment, der koder for et polypeptid heterologt til gær. Hvis hybridvektorerne 25 indeholder flere indsatte DNA-dele, fortrinsvis 2-4 indsatte DNA-dele, kan disse forekomme i en tandemrække eller på forskellige steder i hybridvektoren. Foretrukne hybridvektorer indeholder en indsat DNA-del eller indsatte DNA-dele i en tandemrække.

30 I hybridvektorerne ifølge opfindelsen er gærhybridpromoto-ren operabelt bundet til polypeptidkodningsområdet for at sikre effektiv ekspression af polypeptidet. I en foretrukken udførelsesform for opfindelsen er gærhybridpromotoren bun- __

Vl\ I f WW«/W mm I

14 det direkte til kodningsområdet for det modne polypeptid med et translationsstartsignal (ATG) indsat ved bindingsstedet.

Et foretrukket område til binding af gærhybridpromotoren til 5 polypeptidkodningsområdet er området i umiddelbar nærhed af det endogene ATG.

Ved en anden foretrukken udførelsesform for opfindelsen indeholder konstruktionen en signalsekvens. Egnede signalsekvenser er f.eks. PH05-signalsekvensen, signal-10 sekvensen for gærinvertasegenet eller a-faktor-præ-pro-sekvensen samt signal sekvenserne naturligt bundet til polypeptidkodningsområdet, som skal udtrykkes. Der kan eventuelt konstrueres fusionerede signalsekvenser. Der foretrækkes sådanne kombinationer, som muliggør en præcis 15 spaltning mellem signalsekvensen og den modne polypep-tidsekvens. Andre sekvenser, såsom pro- eller spacer-sekvenser, der eventuelt kan bære specifikke processignaler, kan også være indeholdt i konstruktionerne for at lette nøjagtig behandling af precursormolekyler. Der 20 kan eventuelt dannes fusionerede proteiner indeholdende indre processignaler, som tillader korrekt modning in vivo eller in vitro. Fortrinsvis indeholder processignaleme en Lys-Arg-rest, som genkendes af en gærendopeptidase, som findes i sekretionsvejen.

25 Efter ekspression af genet går genproduktet over i sekretionsvejen og transporteres til det periplasmiske rum.

Hvis der kan opnås yderligere udskillelse gennem cellevæggen til dyrkningsmediet, vil der kunne opnås en betydelig forøgelse af udbyttet. Endvidere kan opkoncentreringen 30 forenkles, når cellerne ikke skal sprænges eller oplukkes. Desuden kan polypeptidet udvindes uden en yderligere methionin ved N-terminalen, da der ikke er noget behov for et ATG som et translationsstartsignal foran den modne kodningssekvens. Da glycosylering er forbundet med 35 sekretionsvejen, antages det dannede polypeptid at være DK 175093 B1 15 glycosyleret (forudsat at der findes glycosyleringssteder).

Der er flere faktorer, som bevirker, at glycosylerede polypeptider er fordelagtige i forhold til 5 ikke-glycosylerede polypeptider: Det glycosylerede polypeptid ligner mere det ægte polypeptid fra pattedyrceller end det ikke-glycosylerede polypeptid. Endvidere er sådanne proteiners tertiære struktur sandsynligvis afhængig i en vis grad af tilstedeværelsen af 10 glycosylrester. Det antages, at kulhydratrester, som forekommer i disse molekyler, har en fordelagtig indvirkning på den kemiske stabilitet og på farmakologisk virkning.

Fortrinsvis indeholder hybridvektorerne ifølge opfindelsen også 3'-flankeringssekvensen fra et gærgen, som indeholder 15 de rigtige signaler til transskriptionsterminering og polyadenylering. Den foretrukne 3'-flankeringssekvens er flankeringssekvensen fra gær-PH05-genet.

Opfindelsen angår især et lineært DNA-molekyle, som i det væsentlige består af en hybridpromotor bestående af et 20 5’-modstrømspromotorelement med UAS eller UAS'er for gær-PH05-genet og et 3’ -medstrømspromotore lement for et gærgen forskelligt fra PH05-genet indeholdende transskriptionsinitieringssteder omfattende en funktionel TATA-box, et DNA-segment, som koder for et polypeptid 25 heterologt til gær, og som kontrolleres af hybridpromotoren, og et DNA-segment, der indeholder korrekt anbragte transskriptionstermlneringssignaler for gær-PH05-genet.

I kraft af de homologe 3*- og 5'-flankeringssekvenser er den fuldstændige lineære DNA-vektor omfattende polypeptidkod-30 ningsområdet stabilt integreret ved PH05-stedet i gærkromosomet.

Opfindelsen angår især cirkulære hybridplasmider, som foruden hybridpromotoren, polypeptidkodningsområdet og

Ul\ I /9U90 D I

16 3'-flankeringssekvenser indeholder en eller flere yderligere DNA-sekvenser, som ikke er essentielle eller mindre betydningsfulde for promotorens funktion, dvs. for 5 ekspressionen af polypeptidkodningsområdet, men som kan udføre vigtige funktioner, f.eks. ved propageringen af gærcellerne transformeret med hybridvektorerne. Den eller de yderligere DNA-sekvenser kan være afledt af prokaryote og/eller eukaryote celler og kan omfatte kromosomale 10 og/eller extrakromosomale DNA-sekvenser. De yderligere DNA-sekvenser kan eksempelvis stamme fra (eller bestå af) plasmid-DNA, såsom plasmid-DNA fra bakterier eller eukaryoter, virus-DNA og/eller kromosomalt DNA, såsom kromosomalt DNA fra bakterier, gær eller højere eukaryoter.

15 Foretrukne hybridpiasmider indeholder yderligere DNA-sekvenser afledt af bakteriepiasmider, især Escherichia coli-plasmid pBR322 eller beslægtede plasmider, bakteriofag λ, gær 2 μ plasmid og/eller gær kromosomal DNA.

Specielt bærer de yderligere DNA-sekvenser et 20 gærreplikationsorigin og en selektiv genetisk markør for gær. Hybridpiasmider indeholdende et gærreplikationsorigin, f.eks. et kromosomalt autonomt replikationssegment (ars), holdes extrakromosomalt i gærcellen efter transformation og replikeres autonomt ved mitose. Hybridpiasmider indeholdende 25 sekvenser homologe til gær 2 μ plasmid DNA kan også anvendes. Disse hybridplasmider vil blive integrerede ved rekombination i 2 μ plasmider, som allerede findes i cellen, eller de vil replikere autonomt. 2 μ sekvenser er især egnede til højfrekvenstransformationsplasmider og fremkalder 30 høje kopital.

Hvad angår den selektive genmarkør for gær, kan der anvendes et hvilket som helst markørgen, som letter selekteringen af transformanter som følge af den phenotypiske ekspression af markøren. Egnede markører for gær er især sådanne, som 35 udtrykker antibiotisk resistens eller, i tilfælde af DK 175093 B1 17 auxotrope gærmutanter, gener, som komplementerer værtslæsioner. Tilsvarende gener tilvejebringer f.eks. resistens mod antibiotiket cycloheximid eller tilvejebringer 5 prototrofi i en auxotrop gærmutant, f.eks. URA3-, LEU2-, HIS3- eller TRPl-genet. Som markører kan endvidere også anvendes strukturgener, som er forbundet med et autonomt replikerende segment, forudsat at værten, som skal transformeres, er auxotrop for produktet, som udtrykkes af 10 markøren.

De yderligere DNA-sekvenser, som findes i hybridpiasmideme ifølge opfindelsen, indeholder tillige med fordel et replikationsorigin og en selektiv genetisk markør for en bakterievært, især Escherichia coli. Der er fordele, som er 15 forbundet med tilstedeværelsen af et Escherichia coli-replikationsorigin og en Escherichia coli-markør i en gærhybridvektor. For det første kan der opnås store mængder hybridvektor DNA ved vækst og forstærkning i Escherichia coli, og for det andet foregår konstruktionen af 20 hybridvektorer hensigtsmæssigt i Escherichia coli under anvendelse af hele den kendte kloningsteknik baseret på Escherichia coli. Escherichia coli-plasmider, såsom pBR322 og lignende, indeholder såvel Escherichia coli-replikationsorigin og Escherichia coli-genmarkører, som 25 tilvejebringer resistens overfor antibiotika, f.eks. tetracyclin og ampicillin, og de anvendes med fordel som en del af gærhybridvektorerne.

Den yderligere DNA-sekvens, der eksempelvis indeholder replikationsorigin og genetiske markører for gær, og en 30 bakterievært (se ovenfor) betegnes i det følgende som "vektor DNA", som sammen med gærpromotoren og polypeptidkodningsområdet danner et hybridplasmid ifølge opfindelsen.

18

En foretrukken udførelsesform for opfindelsen angår hybridpi asmider, der kan undergå replikation og phenotypisk selektering i en gærværtsstamme, og som indeholder en 5 gær hybridpr omo tor og en DNA-sekvens, som koder for et heterologt polypeptid, hvor DNA-sekvensen er anbragt sammen med transskriptionsstart- og -termineringssignaler samt translationsstart- og -stopsignaler i hybridplasmidet under kontrol af hybridpromotoren, således at den i en 10 transformeret gærstamme udtrykkes til dannelse af polypeptidet.

Hybridvektorerne ifølge opfindelsen fremstilles under anvendelse af i og for sig kendte fremgangsmåder, f.eks. ved binding af en hybridpromotor bestående af et 15 5'-modstrømspromotorelement med UAS(er) for gær-PH05-genet og et 3'-medstrømspromotorelement for et gærgen forskelligt fra PH05-genet omfattende transskriptionsinitieringssteder indeholdende en funktionel TATA-box, et DNA-segment, som koder for et polypeptid heterologt til gær, og 20 3’-flankerings- eller sidesekvenser for et gærgen, således at DNA-segmentet er under transskriptionel kontrol af hybridpromotoren , og eventuelt indfører et eller flere dannede lineære DNA'er i et vektor-DNA.

Der kan hensigtsmæssigt anvendes kortlagt lineær eller 25 fortrinsvis cirkulær vektor-DNA, f.eks. bakterieplasmid-DNA eller lignende (se ovenfor), med mindst ét restriktionssted, fortrinsvis to eller flere restriktionssteder. Fordelagtigt indeholder vektor-DNA'et allerede replikationsoriginer og genmarkører for gær og/eller en bakterievært. Vektor-DNA'et 30 spaltes under anvendelse af en passende restriktionsendonu-clease. Det spaltede DNA ligeres til det lineære DNA-fragment, som bl.a. indeholder gærhybridpromotoren og DNA-segmentet, som koder for polypeptidet. Inden eller efter bindingen af hybridpromotoren og polypeptidkodningsområdet 35 (eller samtidig dermed) er det også muligt at indføre - - - .... ------ DK 175093 B1 19 replikationsoriginer og/eller markører for gær eller en bakterievært. I alle tilfælde skal restriktions- og anelleringsbetingelserne vælges således, at der ikke sker 5 nogen forstyrrelse i de væsentlige funktioner i vektor-DNA'et og hybridpromotoren. Hybridvektoren kan være opbygget trinvis eller ved ligering af to DNA-segmenter, som indeholder alle de pågældende sekvenser.

Der kan anvendes forskellige teknikker til sammenbinding af 10 DNA-segmenter in vitro. Korte ender (fuldstændigt baseparrede DNA-dobbelstrengede) dannet ved hjælp af visse restriktionsendonucleaser kan llgeres direkte med T4-DNA-ligase. Oftere sammenbindes DNA-segmenter gennem deres enkeltstrengede såkaldte klæbrige eller forskudte 15 ender og lukkes covalent ved hjælp af en DNA-ligase, f.eks. T4-DNA-ligase. Sådanne enkeltstrengede klæbrige ender kan dannes ved at spalte DNA med en anden type endonuclease, som danner klæbrige eller forskudte ender (de to strenge i DNA-dobbeltstrengen spaltes forskellige steder med en 20 indbyrdes afstand på nogle få nucleotider). Enkeltstrengede ender kan også dannes ved at addere nucleotider til korte ender eller forskudte ender under anvendelse af terminaltransferase ("homopolymer endedannelse") eller ved simpelthen at afskære en streng i et DNA-segment med en 25 egnet exonuclease, såsom \-exonuclease. En anden foretrukken metode til fremstilling af forskudte ender består i ligering af et kemisk fremstillet linker-DNA, som indeholder et genkendelsessted for en endonuclease, der danner forskudte ender, med DNA-segmenter med korte ender, hvorpå det dannede 30 DNA spaltes med den pågældende endonuclease.

For at man kan opnå effektiv ekspression, skal genet være rigtigt anbragt med hensyn til sekvenser, som indeholder transskriptionelle (gærhybridpromotor) og translationsfunktioner. For det første skal ligeringen af DNA-segmentet 35 indeholdende hybridpromotoren med polypeptidkodningsområdet DK 175093 B1 20 gennemføres i den rigtige orientering. Hvis der er to mulige orienteringer, bestemmes den rigtige orientering ved konventionel restriktionsanalyse. Hybridvektorer, som 5 indeholder en forkert orienteret polypeptidgenindsætningsdel, omorienteres ved udskæring af gen-indsætningsdelen med en egnet restriktionsendonuclease, hvorpå genet genligeres med hybridvektorfragmentet. I alle tilfælde undgås forkert orientering ved ligering af to 10 DNA-segmenter, som indeholder forskellige restriktionssteder i enderne. Endvidere bør konstruktionen af hybridvektoren gennemføres på en sådan måde, at der opnås korrekt transskriptionsinitiering og -terminering. Hvad angår det sidste bør transskriptet fortrinsvis afsluttes i en 15 DNA-sekvens afledt af kromosomal gær-DNA eller gær-2 μ-plasmid. Fordelagtigt afsluttes transskriptet i en DNA-sekvens, som indeholder transskriptionsterminerings-signaler for et gærgen, f.eks. for PH05 eller TRP1. For det andet skal der dannes en korrekt aflæsningsstruktur.

20 Sædvanligvis kendes nucleotidsekvensen for promotorområdet og polypeptidkodningsområdet inden ligeringen eller kan let bestemmes, således at der ikke er problemer ved at tilvejebringe den rigtige aflæsningsstruktur.

Når der ønskes direkte ekspression af det modne polypeptid, 25 er det nødvendigt at eliminere signalsekvenser eller dele deraf, som eventuelt følger efter hybridpromotorområdet og/eller eventuelt findes foran kodningsområdet for det modne polypeptid, f.eks. ved spaltning med en exonuclease, f.eks. Bal3l. Et foretrukket område til direkte binding af 30 en gærpromotor til polypeptidkodningssekvensen findes mellem hoved mRNA-starten og ATG-translationsstartkodonet. Til binding i dette område før polypeptidkodningssekvensen skulle den have sit eget ATG til translationsinitiering, er dette ikke tilfældet skal den forsynes med et yderligere 35 syntetisk oligonucleotid. Gærhybridpromotoren kan også bindes til polypeptidkodningssekvensen ved hjælp af DK 175093 B1 21 et syntetisk oligodeoxynucleotid som forbindelsesmolekyle-Hybridpromotorområdet kan således eventuelt være spaltet nær dets 3'-ende, således at det mangler et forudbestemt antal 5 basepar. På tilsvarende måde kan polypeptidkodningssekvensen være spaltet nær dets 5'-ende. Et syntetisk oligodeoxynucleotid kan derpå dannes på en sådan måde, at der ved sammenbinding af gærhybr idpromotor en og polypeptidkodningssekvensen over forbindelsesoligodeoxy- 10 nucleotidet sker en gendannelse af de manglende basepar omfattende et ATG-translationsinitieringssignal, og polypeptidkodningssekvensen har den rigtige aflæsningsstruktur i forhold til promotoren.

Ligeringsblandingen, som indeholder den ønskede 15 hybridvektor, anvendes direkte i transformationstrinet eller opkoncentreres først med hensyn til hybridvektoren, f.eks. ved gelelektroforese, hvorpå den anvendes til transformationen.

Mellemprodukter, såsom vektorer, der stadig mangler en eller 20 flere væsentlige funktioner, samt de færdige hybridvektorer ifølge opfindelsen overføres eventuelt til en bakterievært, især Escherichia coli, af de ovenfor anførte årsager (f.eks. dannelse af store mængder af henholdsvis mellemprodukter og hybridplasmider). Bakterivektorer, såsom Escherichia 25 coliplasmidet pBR322 og de fragmenter deraf, som indeholder et bakteriereplikationsorigin og en eller flere genmarkører, er af denne grund de mest foretrukne vektorer. Når en sådan bakterievektor anvendes, omfatter de afsluttende trin til fremstillingen af gærhybridvektorerne fortrinsvis også 30 indførelsen af en genetisk markør og et replikationsorigin for gær.

r\ i i a i 22 3. Transformation af gærhybridvektorer indeholdende en polypeptidkodninqssekvens

Et andet aspekt af opfindelsen omfatter en fremgangsmåde til 5 fremstilling af transformerede gærceller, som kan danne et polypeptid heterologt til gær, ved hvilken fremgangsmåde gærceller transformeres med en hybridvektor, som indeholder en eller flere DNA-indsætningsdele, der hver omfatter et DNA-segment, som koder for et polypeptid heterologt til gær 10 under transskriptionel kontrol af en hybridpromotor bestående af et 5’-modstrømspromotorelement med et eller flere UAS’er for gær-PHO5-genet og et 3 *-medstrøms-promotorelement for et gærgen forskelligt fra PH05-genet omfattende transskriptionsinitieringssteder indeholdende en 15 funktionel TATA-box.

Nyttige gær omfatter arter af slægterne Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Rhodotorula, Torulopsis og beslægtede arter, jf. J. Lodder, "The Yeasts", Amsterdam 1971, især stammer af Saccharomyces cerevisiae.

20 Transformationen af gær med hybridvektorerne kan gennemføres under anvendelse af i og for sig kendte fremgangsmåder, f.eks. fremgangsmåden beskrevet af Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978). Denne fremgangsmåde kan opdeles i tre trin: 25 (1) Fjernelse af gærcellevæggen eller dele deraf.

(2) Behandling af de "nøgne" gærceller (spheroplaster) med det transformerende DNA i nærværelse af PEG (polyethylenglycol) og Ca2+-ioner.

(3) Regenerering af cellevæggen og selektionering af 30 de transformerede celler på et fast lag agar.

r 23 DK 175093 B1

Der foretrækkes følgende metoder: ad (1): Gærcellevæggen fjernes enzymatisk under anvendelse af forskellige præparater af glucosidaser, såsom 5 snegletarmsaft, f.eks. "Glusulase"® eller "Helicase"®, eller enzymblandinger udvundet fra mikroorganismer, f.eks. "Zymolyase”®, i osmotisk stabiliserede opløsninger, f.eks.

1 M sorbitol.

ad (2): Gærspheroplasterne aggregerer i nærværelse af PEG, 10 og der induceres lokale fusioner af cytoplasmemembranerne. Dannelsen af "fusionsagtige" betingelser er afgørende, om mange transformerede gærceller bliver diploide eller endog triploide under transformeringsprocessen. Metoder til selektionering af fusionerede spheroplastre kan anvendes 15 til opkoncentrering for transformanter, dvs. at der let kan foretages screening for transformerede celler blandt fusionsprodukter, som i forvejen er udvalgt.

ad (3): Da gærceller uden cellevæg ikke deler sig, er det nødvendigt at regenerere cellevæggen. Denne regenerering 20 gennemføres hensigtsmæssigt ved indlejring af spheroplastrene i agar. Man kan eksempelvis blande smeltet agar (ca. 50°C) med spheroplastrene. Efter afkøling af opløsningen til væksttemperaturer for gær (ca. 30eC) dannes et fast lag. Dette agarlag skal forhindre hurtig diffusion 25 og tab af vigtige makromolekyler fra spheroplastrene og derved lette regenereringen af cellevæggen. Det er imidlertid også muligt, men dog mindre effektivt, at opnå regenerering af cellevæggen ved udspredning af spheroplastrene på overfladen af forud fremstillede 30 agarlag.

Fortrinsvis fremstilles regenereringsagaren på en sådan måde, at der på samme tid kan optræde regenerering og selektionering af transformerede celler. Da gærgener.

UIS. 1 fOlKKS Bl 24 som koder for enzymer i aminosyrebiosyntesereaktioner, sædvanligvis anvendes som selektive markører (se ovenfor), gennemføres regenereringen fortrinsvis i minimalt 5 gæragarmedium. Når der kræves meget høj regenereringseffektivitet, er det fordelagtigt at anvende følgende totrinsmetoder: (1) cellevæggen regenereres i et koncentreret komplekst medium, og (2) de transformerede celler selektioneres ved replikal udpladning af cellelaget 10 på selektive agarplader.

Hvis hybridvektoren ikke indeholder- noget markørgen, kan de transformerede celler også identificeres ved hjælp af andre metoder. Sådanne metoder omfatter f.eks. in situ hybridisering med et mærket DNA-fragment homologt til 15 sekvenser i hybridvektoren (f.eks. ifølge Hinnen et al., se ovenfor), in situ immunoanalyser forudsat at et antistof for produktet af det indførte gen er tilgængeligt, eller andre screeningsmetoder, som måler genprodukter, der indkodes af det eller de transformerende plasmider.

20 Gæren kan eventuelt co-transformeres med en hybridvektor ifølge opfindelsen og en anden vektor indeholdende en genetisk markør for gær. Hvis de to forskellige vektorer har fælles DNA-sekvenser (disse kan være bakteriesekvenser på vektorerne), forekommer der rekombination, som fører til et 25 fusioneret hybridmolekyle, som kan selekteres.

Gæren kan også være co-trans formeret med en lineær DNA-vektor, der består af gærhybridpromotoren, det heterologe polypeptidkodningsområde kontrolleret af hybridpromotoren og transskriptionsstopsignaler for 30 gær-PH05-genet, og en vektor, som indeholder en selektiv markør for gær. Co-transformation tillader opkoncentrering af de gærceller, som har optaget DNA, som der ikke kan selekteres for direkte. Da kompetente celler optager alle typer DNA, vil en stor procentdel af celler transformeret DK 175093 B1 25 med en selektiv vektor også indeholde eventuelt tilsat DNA (såsom det ovenfor omtalte lineære DNA). Som følge af tilstrækkeligt lange homologe sekvenser (med en længde på 5 f.eks. 20 til 100 deoxynucleotider) vil polypeptidgenet være integreret stabilt i værtskromosomet. Den specifikke konstruktion ifølge opfindelsen vil føre til en stabil integrering af det heterologe gen ved det kromosomale sted for PH05-genet, nemlig i gærkromosom II.

10 De dannede gærstammer indeholdende hybridpiasmider ifølge opfindelsen kan forbedres med hensyn til produktion af heterologe polypeptider ved mutation og selektering under anvendelse af kendte fremgangsmåder. Mutationen kan eksempelvis gennemføres ved hjælp af ultraviolet bestråling 15 eller ved egnede kemiske midler.

Det har vist sig, at transformeringen af hybridvektoreme · ifølge opfindelsen og regenereringen af cellevæggene kan gennemføres hensigtsmæssigt i koncentrerede medier indeholdende glucose som kulstofkilde, og at dette er 20 væsentligt lettere end de tilsvarende trin gennemført med hybridvektorer indeholdende konventionelle promotorer, som kan induceres med glucose, som skal gennemføres i glucosefri medier for at undgå akkumulering af det potentielt letale genprodukt inden i cellerne.

25 Opfindelsen angår også gærværter transformeret med hybridvektorer indeholdende en eller flere indsatte DNA-dele, som hver omfatter et DNA-segment, der koder for et polypeptid heterologt til gær, under transskriptionskontrol af en hybridpromotor bestående af et 30 5·-modstrømspromotorelement med et eller flere UAS'er for gær-PH05-genet og et 3'-medstrømspromotorelement for et gærgen forskelligt fra PH05-genet omfattende transskriptionsstartsteder indeholdende funktionel TATA-box.

ir il i i lrww mm 26 4. Dyrkning af de transformerede gærceller og isolering af det udtrykte polypeptid

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af et 5 polypeptid, som er heterologt til gær, er ejendommeligt ved, at en gærstamme transformeret med en hybridvektor indeholdende en eller flere indsatte DNA-dele, som hver indeholder et DNA-segment, der koder for et polypeptid heterologt til gær under transskriptionel kontrol af en 10 hybridpromotor bestående af et 5’-modstrømspromotorelement med et eller flere UAS'er for gær-PH05-genet og et 3 '-medstrømspromotorelement for et gærgen forskelligt fra PH05-genet omfattende transskriptionsinitieringssteder , indeholdende en funktionel TATA-box dyrkes, og det udtrykte polypeptid isoleres.

De transformerede gærceller ifølge opfindelsen dyrkes på kendt måde i et flydende medium, som indeholder assimilerbare kilder for kulstof, nitrogen, uorganiske salte og om nødvendigt vækstfremmende stoffer.

20 Der kan anvendes forskellige kulstofkilder. Som eksempler på foretrukne kulstofkilder kan nævnes assimilerbare kulhydrater, såsom glucose, maltose, mannitol eller lactose, eller et acetat, såsom natriumacetat, som kan anvendes alene eller i egnede blandinger. Egnede nitrogenkilder indbefatter 25 f.eks. aminosyrer, såsom casaminosyrer, peptider og proteiner samt deres nedbrydningsprodukter, såsom trypton, pepton eller kødekstrakter, endvidere gærekstrakt, maltekstrakt, majsstøbevand samt ammoniumsalte, såsom ammoniumchlorid, ammoniumsulfat eller ammoniumnitrat, som 30 kan anvendes alene eller i egnede blandinger. Anvendelige uorganiske salte er f.eks. sulfater, chlorider, phosphater og carbonater af natrium, kalium, magnesium og calcium. Endvidere kan dyrkningsmediet også indeholde vækstfremmende stoffer. Vækstfremmende stoffer indbefatter f.eks. vækst- _ DK 175093 B1 27 promotorer, sporelementer, såsom jern, zink, mangan og lignende, og enkelte aminosyrer.

Da hybridpromotorerne ifølge opfindelsen er regulerede, må 5 sammensætningen af næringsmediet være tilpasset vækstfaserne. Under vækstperioden er hybridpromotorerne ifølge opfindelsen under høj phosphatkoncentration i alt væsentligt koblet fra. Eksempelvis er den mest foretrukne hybridpromotor ifølge opfindelsen, som indeholder et 10 5'-modstrømspromotorelement fra PH05 med UAS'erne for PH05 og et 3’-medstrømspromotorelement for GAPDH med TATA-boxen, koblet fra ca. 50 gange under disse betingelser. Derfor dannes potentielle toksiske genprodukter kun i meget små mængder, og skadelige virkninger på cellestofskiftet er 15 mindst mulige. Når der nås en tilstrækkelig celletæthed, foretages fortrinsvis en formindskelse af koncentrationen af ! uorganisk phosphat i dyrkningsmediet (lavt Pi-medium).

Derefter tilkobles hybridpromotorerne ifølge opfindelsen (undertrykkelse af promotorerne ophæves), og der opnås 20 maksimale koncentrationer af mRNA-transskripter.

Dyrkningen gennemføres under anvendelse af almindelige teknikker. Dyrkningsbetingelserne, såsom temperatur, dyrkningsmediets pH-værdi og fermenteringstiden, vælges på en sådan måde, at der dannes maksimale koncentrationer af 25 det ønskede polypeptid. Almindeligvis gennemføres dyrkningen under aerobe betingelser i submers kultur med rystning eller omrøring ved en temperatur på fra ca. 25 til ca. 35*C ved en pH-værdi på fra 4 til 8, f.eks. en pH-værdi på ca. 7, og i fra ca. 4 til ca. 20 timer, fortrinsvis indtil der er 30 opnået maksimale ubytter af de ønsker proteiner.

Isoleringen og rensningen af det udtrykte polypeptid kan om ønsket gennemføres under anvendelse af kendte fremgangsmå- DK 175093 B1 28 der. Når de transformerede celler er blevet dyrket til en tilfredsstillende celletæthed, består det første trin til udvinding af det udtrykte protein i frigørelse af proteinet 5 fra det indre af cellerne. Ved de fleste fremgangsmåder fjernes cellevæggen først ved enzymatisk nedbrydning, f.eks. med glucosidaser. Derefter behandles de dannede spheropiastre med detergenter, såsom "Triton". Eventuelt kan der anvendes mekaniske kræfter, såsom forskydnings-10 kræfter, f.eks. X-presse, fransk-presse, eller rystning med glasperler til oplukning af cellerne. Den fremkomne blanding koncentreres med hensyn til det ønskede polypeptid på konventionel måde, f.eks. ved fjernelse af størsteparten af det ikke-proteinholdige materiale ved behandling med 15 polyethylenimin, fældning af proteinerne ved mætning af opløsning med ammoniumsulfat eller trichloreddikesyre, gelelektroforese, dialyse, kromatografi, f.eks.

ionbytterkromatografi, størrelsesudelukkelseskromatografi, HPLC eller HPLC med omvendt fase, molekyl afskæring på en 20 egnet "Sephadex"®-søjle eller lignende. Den endelige rensning af det forrensede produkt kan eksempelvis opnås ved antistofaffinitetskromatografi.

I det tilfælde, hvor det ønskede polypeptid udskilles af gærcellerne til det periplastmatiske rum, kan der anvendes 25 en forenklet metode: Polypeptidet kan udvindes uden lysering af cellerne ved enzymatisk fjernelse af cellevæggen eller ved behandling med kemiske midler, f.eks. thiolreagenser eller EDTA, som bevirker beskadigelse af cellevæggen, hvorved polypeptidet kan frigøres. I det tilfælde, hvor 30 polypeptidet udskilles til dyrkningsvæsken, kan det udvindes direkte fra denne.

En blanding af opnåede glycosylerede og ikke-glycosylerede proteiner kan adskilles f.eks. ved kromatografi på en konkanavalin-A-"Sepharose"®-søjle. Ikke-glycosylerede 35 produkter vil passere gennem søjlen, hvorimod glycosylere- DK 175093 B1 29 de produkter vil blive adsorberet selektivt, hvorefter de kan elueres med konventionelle midler, f.eks. a-methylmannosid i kombination med et chaotropt middel, 5 såsom KSCN.

Det er også muligt at fjerne glycosylrester enzymatisk, f.eks. ved indvirkning af endoglycosidase H eller F. Denne metode tillader fremstillingen af ikke-glycosylerede produkter på praktisk taget ren form.

10 Opfindelsen angår endvidere polypeptideme fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Opfindelsen angår især modstrømsaktiveringssekvenseme for PH05, hybridpromotorerne, hybridvektorerne, de transformerede gærceller og fremgangsmåderne til 15 fremstilling deraf samt fremgangsmåden til fremstilling af polypeptider heterologe til gær som beskrevet i eksemplerne.

Opfindelsen forklares nærmere i det følgende med henvisning til tegningen, hvor 20 fig. 1 viser DNA-sekvensen i BamHI-Sall-fragmentet af PH05-promotorområdet, fig. 2 viser DNA-sekvensen for promotorområdet af GAPDH [klon 491, jf. G.A. Bitter et al., Gene 32, 263 (1984)], 25 fig. 3 skematisk viser fremstillingen af plasmid pGAPDH-EL, fig. 4 viser 3'-promotorelementer for GAPDH-genet anvendt ved den foreliggende opfindelse, fig. 5 viser et diagram af fremstillingen af plasmid pJDB207R/PH05-EL, 30 fig. 6 viser konstruktionen af plasmid pJDB207/PAPEL--EGL(UASl) fig. 7 skematisk viser isoleringen af et DNA-fragment, som koder for modent desulfatohirudin, 30 UK 1 /OUU3 Dl fig. β skematisk viser fremstillingen af plasmid PJDB207/PHO5-HIR, fig. 9 skematisk viser konstruktionen af plasmid 5 pJDB207/PH05(ECO)-HIR, og fig. 10 skematisk viser konstruktionen af plasmid pJDB207/PAPFL-TPA(UASl+UAS2).

Opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

10 Eksempel 1

Dannelse af PHQ5-promotorsletninger a) Bal31-spaltning

Rekombinantfag Ml3mp9/PH05-Bam-Sal indeholdende

BamHI-Sall-fragmentet for PH05 vist i fig. 1 anvendes som 15 kilde for PH05-promotoren (se beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 143.081). 20 μς af fag-DNA'et (RF: replikativ form) spaltes med restriktionsendonuclease Sall, hvorved der dannes et lineært DNA på ca. 9 kb. Efter ekstraktion med phenol/chloroform fældes DNA’et med ethanol.

20 DNA* et resuspenderes i 10 mM Tris pH 8,0 ved en koncentration på 0,5 /ig/ml. 16 /tg DNA spaltet med Sall spaltes med 2 E exonuclease Bal31 (BRL) i 100 μΐ 20 mM Tris pH 8,0, 199 mM NaCl, 12 mM MgCl2, 12 CaCl2 og 1 mM EDTA. Alikvoter på 2 μg DNA udtages efter inkubering ved 30eC i 25 henholdsvis 1, 2, 3, 4, 5 og 6 minutter og blandes straks med 50 μΐ phenol og 60 μΐ TNE. Efter ekstraktion med phenol/chloroform og ethanol fældning resuspenderes DNA’et i 10 mM Tris pH 8,0 ved en koncentration på 100 /tg/ml. Til analyse af udstrækningen af exonucleolytisk spaltning med 30 Bal31 saltes 0,5 /tg DNA fra hvert tidspunkt med endonuclease BamHI og analyseres på en 1,5%'s agarosegel i

Tris-boratpuffer, pH 8,3 (90 mM Tris.HCl, pH 8,3, 90 mM

borsyre, 2,5 mM EDTA). Gennemsnitligt fjernes 100 bp fra hver ende af fragmentet pr. minut ved Bal31-spaltning.

DK 175093 B1 31

b) Addition af EcoRI-linkere til det med Bal31 behandlede DNA

To A26O enheder af EcoRI-linkere (5'-GGAATTCC-3', BRL) 5 opslæmmes i 250 μΐ 10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA. 2 μg

EcoRI-linkere kineseres i 75 μΐ 60 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl2/ 15 mM DDT, 10 μΜ ATP og 33 E T4 polynucleotidkinase (Boehringer). Efter 1 time ved 37eC henstår blandingen til afkøling ved stuetemperatur, hvorpå den opbevares ved -20°C.

10 De anellerede, dobbeltstrengede EcoRI-linkere ligeres med deres korte ender til DNA-fragmenterne behandlet med Bal31.

1/2 μg Bal31-behandlet DNA (se eksempel la) inkuberes i 16 timer ved stuetemperatur med et 50-dobbelt overskud af kinaseret EcoRI-linkere i 20 μΐ 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM

15 MgCl2, 10 mM DTT, 4 mM ATP og 600 E DNA-ligase (Biolabs). Efter inaktivering af T4-DNA-ligasen (10 minutter ved 65*C) spaltes overskud af EcoRI-linkere med 50 E EcoRI (Boehringer) i et rumfang på 50 /il. DNA'et ekstraheres med phenol/chloroform, fældes med ethanol og opslæmmes i 10 mM 20 Tris, 1 mM EDTA (* TE). Derefter spaltes DNA'et med 5 enheder BamHI (Biolabs), og blandingen sættes på en 1,5%'s lavtsmeltende agarosegel (Sigma) i Tris-boratpuffer (se ovenfor). Båndene farves med ethidiumbromid og gøres synlige under langbølget UV-lys ved 366 nm. De brede diffuse 25 båndmønstre mellem ca. 100 bp og 600 bp udskæres af gelen, og DNA'et ekstraheres på følgende måde. Agarosestykket smeltes ved 65*C, indstilles på 500 mM NaCl og inkuberes ved 65‘C i 20 minutter. Et rumfang phenol (ækvilibreret med 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl) tilsættes. Den 30 vandige fase reekstraheres to gange med phenol og en gang med chloroform. DNA'et fældes med 2,5 rumfang koldt absolut ethanol og opsamles ved centrifugering. DNA-kuglen vaskes med koldt 80%'s ethanol, hvorpå der tørres i vakuum. DNA'et opslæmmes i 10 μΐ TE.

Ul\ I I wVwW w I

32 c) Ligerinq til M13mp9 3 /tg RF af M13mp9 spaltes med 15 enheder EcoRI (Biolabs) og 15 enheder BamHI (Boehringer) i et rumfang på 50 μΐ. Efter 5 phenolekstraktion og ethanolfældning opslæmmes DNA'et i 50 μΐ TE. 5 μΐ spaltet vektor-DNA (ca. 200 ng) blandes med 10 μΐ af ovennævnte prøver (DNA-fragmenter fremkommet ved forskellige Bal31-spaltninger som beskrevet i eksempel lb) og ligeres i et samlet rumfang på 20 μΐ i nærværelse af 60 10 mM Tris/HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP og 200 E T4-DNA-ligase i 15 timer. Der foretages transduktion af kompetente celler af stammen Escherichia coli JM101 i overensstemmelse med håndbogen "M13 cloning and sequencing system" udgivet af New England Biolabs. Fager fra et antal 15 hvide plak dyrkes og analyseres med hensyn til størrelsen af deres indsatte DNA-dele ved spaltning med restriktionsenzymer EcoRI og BamHI.

d) Bestemmelse af Bal31-sletningsslutpunkter ved Sanger-sekvensering (sletning fra Sall-stedet) 20 Der foretages sekvensering under anvendelse af dideoxy-DNA-sekvenseringssystemet ifølge Sanger et al., [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)] som beskrevet i den ovenfor anførte håndbog. Sletningsslutpunkterne er anført nedenfor: 25 Klon position af sidste nucleotid i PH05-sekvensen (se fig. 1) A -502 B -471 C -422 30 D -400 E -392 F -369 G -350 H -328 DK 175093 B1 33 I -300 K -283 L -255 5 M -226 N -211 O -187 P -111 Q - 88 10 R - 57 S - 33 e) Bestemmelse af Bal31-sletningsslutpunkter ved Sanger-sekvensering (sletning fra BamHI-stedet)

Der foretages et lignende sæt Bal31-sletninger som beskrevet 15 under a-c, bortset fra at M13mp9 PH05-Bam-Sal spaltes med BamHI. Molekylerne spaltet med Bal31 spaltes med EcoRI og Sall, og de dannede fragmenter klones i M13mp9 spaltet med EcoRI og Sall. Sletningsslutpunkterne anføres i det følgende: 20 Klon position af sidste nucleotid i PH05-sekvensen (se fig. 1) A' - 24 B* - 35 C - 41 25 D' - 48 E' - 74 F' - 89 G’ - 93 H’ - 97 30 1' -124 K' -162 L' -174 M1 -262 Ν' -277 35 0' -306

ur\ I f W I

34 P1 -332 Q’ -346 R’ -361 5 S' -382

Τ' -393 I

f) Konstruktion af indre PH05-promotorsletnlnger

Bal31-sletningen beskrevet ovenfor under d) danner et "venstre arm” PH05-promo tor fragment, som slutter med et 10 EcoRl-sted, og Bal31-sletningen beskrevet ovenfor under e) danner et "højre arm" PH05-promotorfragment, som slutter med et EcoRl-sted. Ved at kombinere "venstre arme" og "højre arme" fra forskellige stillinger dannes indre sletninger, som indeholder et EcoRI-bindersegment på stedet for det 15 slettede DNA. De enkelte indre sletninger dannes ved spaltning af de "venstre arme" og "højre arme" fra Ml3mp9-derivaterne med restriktionsendonucleaser EcoRI og BamHI (venstre arme) eller EcoRI og Sall (højre arme) og isolerer de tilsvarende fragmenter ved hjælp af blød 20 agarosegelelektroforese som beskrevet under b). ffkvimolære mængder "venstre arme", "højre arme" og 200 ng BamHI og Sall-spaltet M13mp9-vektor DNA ligeres som beskrevet under c). Efter transduktion til Escherichia coli JM101 udtages hvid plak, RF produceres og analyseres ved 25 restriktionsanalyse (BamHI, Sall, EcoRI). De nedenfor anførte arme er kombineret til dannelse af specifikke indre sletninger (angående nummereringen af nucleotiderne henvises til fig. 1): "venstre arm" "højre arm" sletning fra - til antal 30 slettede nucleo- tider A Τ' Δ 7 -501 til -394 108 B Τ' Δ 8 -470 til -394 77 35 C Τ' Δ 9 -421 til -394 28 35 DK 175093 B1 D S’ Δ10 -399 til -383 17 E R’ Δ11 -391 til -362 30 F Q* Δ12 -368 til -347 22 5 · G P’ Δ13 -349 til -333 17 H 0’ Δ14 -327 til -307 21 I Ν’ Δ15 -299 til -278 22 K Μ' Δ16 -282 til -263 20 L L' Δ17 -254 til -175 80 10 M L’ Δ18 -225 til -175 51 N L‘ Δ19 -210 til -175 36 O L·’ Δ20 -186 til -175 12 O K* Δ21 -186 til -163 24 O I’ Δ22 -186 til -125 62 15 O Η’ Δ23 -186 til - 98 89 P Η' Δ24 -110 til - 98 13 P G* Δ25 -110 til - 94 17 P F' Δ26 -110 til - 90 21 Q E· Δ27 - 87 til - 75 13 20 R Df Δ28 - 56 til - 49 8 R C' Δ29 - 56 til - 42 15 R B* Δ30 - 56 til - 36 21 S A' Δ31 - 32 til - 25 8

Eksempel 2 25 In vivo-analyse af de indre sletninger i PHQ5-promotoren

De forskellige sletninger beskrevet i eksempel 1 f) klones i plasmid pJDB207/PH05 [R. Haguenauer-Tsapis og A. Hinnen, Molecular and Cellular Biology, 4, 2668-2675 (1984) ] ved at ombytte vildtype PH05-Bam-Sal-fragmentet med den slettede 30 udgave. Efter transformering af gærstammen Saccharomyces cerevisiae AH216 (jf. beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 143.081) bestemmes sur phosphataseaktiviteten som beskrevet af Toh-e et al., J. Bacteriol. 113, 727 (1973). Sletninger af Δ11 og Δ12 35 udviser en ca. 10 ganges reduktion af PHO5-aktivitet og mm m m m mm m 36 fastlægger et modstrømsområde ("modstrømsakt i veringssted", UAS), som er essentielt for PH05-ekspression. En lignende af svækkende virkning konstateres fra sletning Δ17 (ca. 5 5 ganges reduktion) og for TATA-boxsletningerne Δ23 - Δ26 (ca.

30 ganges reduktion). Alle andre sletninger udviser aktiviteter af omtrentlig samme størrelse som vildtypen. Disse resultater indicerer, at tre områder med essentiel information for PH05-ekspression findes i følgende 10 positioner: 1. mellem positioner -349 og -383 (UAS1) 2. mellem positioner -225 og -263 (UAS2) 3. mellem positioner - 87 og -125 (TATA-box) DNA-fragmenter indeholdende UAS1 eller UAS2 eller UAS1 og 15 UAS2 for PH05 kan dannes ud fra rekombinantfag M13mp9/PH05 Barn-Sal (se eksempel 1) ved spaltning med passende restriktionsendonucleaser. UAS1 er indeholdt i et 268 bp BamHI-Clal-fragment med formlen GATCCGAAAGTTGTATTCAACAAGAATGCGCAAATATGTCAACGTATTTGGAAGTCATCTTATGTG CGCTGCTTTAATGTTTTCTCATGTAAGCGGACGTCGTCTAIAAACTTCAAACGAAGGTAAAAGGTT CATAGCGCTTTTTCTTTGTCTGCACAAAGAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCATAGAACG CAACTGCACAATGCCAAAAAAAGTAAAAGTGATTAAAAGAGTTAATTGAATAGGCAATCTCTAAAT G AAT, UAS2 er indeholdt i et 100 bp Clal-BstEII-fragment med 20 formlen

CGAIACAACCTTGGCACTCACACGTGGGACTAGCACAGACTAAATTTATGATTCTGGTCCCTGTTTT

CGAAGAGATCGCACATGCCAAATTATCAAATTG

og såvel UAS1 og UAS2 findes i 368 bp BamHI-BstEII-fragment med formlen DK 175093 B1 37 GATCCGAAAGIIGIAIICAACAAGAAIGCGCAAAIAIGICAACGIAIIIGGAAGICAICIIAIGXGC GCTGCTTTAATGTTTTCTCATGTAAGCGGACGTCGTCTATAAACTTCAAACGAAGGTAAAAGGTTCA TAGCGCTTTTTCTTTGTCTGCACAAAGAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCATAGAACGCAA CTGCACAATGCCAAAAAAAGTAAAAGTGATTAAAAGAGTXAATTGAATAGGCAATCTCTAAATGAAT CGATACAACCTTGGCACTCACACGTGGGACTAGCACAGACTAAATTTATGAIXCTGGTCCCTGXTTT CGAAGAGAICGCACATGCCAAATTATCAAATTG .

Eksempel 3

Konstruktion af fusionerede PHQ5 - GAPDH-hybridpromotorer

Resultaterne opnået i eksempel 1 og 2 gør et område omkring 5 position -365 [UAS1(PH05)] og et andet område omkring position -180 [UAS2(PH05)] fra PH05-genet til mulige kandidater for UAS med regulerende funktioner. UAS1(PH05) er ineholdt i et 268 bp BamHI-Clal-fragment, hvorimod såvel UAS1( PH05) og UAS2( PH05) er indeholdt i et 368 bp 10 BamHI-BstEII-fragment. Disse to fragmenter fusioneres hver for sig til to forskellige GAPDH-medstrømspromotorelementer, som indeholder TATA-boxen og transskriptionsinitieringssteder for GAPDH.

a) Konstruktion, af et gærgenbibliotek 15 30 /tg total højmolekylvægt gær-DNA [M.V. Olsen et al., J.

Mol. Biol. 132, 387 (1979) ] fra vildtype Saccharomyces

cerevisiae-stamme S288C inkuberes i 30 minutter ved 37eC med to enheder EcoRI-methylase (New England Biolabs) i 250 μΐ EcoRI-methyleringspuffer som anbefalet af leverandøren. DNA 20 fældes med ethanol, opslæmmes i 500 μΐ 25 mM Tris.HCl pH

8,5, 2 mM MgCl2 (EcoRI*-puffer) [H. Meyer, FEBS Lett. 90, 341 (1979)] og spaltes med EcoRI (Boehringer), indtil størrelsesfordelingen af DNA-fragmenterne har et maksimum i område 30-50 kb (en Xhol-spaltning af XDNA giver 25 hensigtsmæssigt 33 kb og 17 kb markører). Gær-DNA'et spaltet under EcoRI*-betingelser fraktioneres på en saccharose- 38 gradient (5-20% saccharose i 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 1 mM EDTA) i 6 timer ved 38.000 rpm i en SW 40-rotor. 30 fraktioner på 0,4 ml udtages fra toppen af gradienten. 5 Fraktion 16 indeholder DNA-fragmenter med en størrelse på 30-40 kb. DMA'et i denne fraktion (3 Mg) fældes med ethanol og llgeres i 16 timer ved 15eC i et samlet rumfang på 15 μΐ til 1 Mg kosmidvektor pYcl [B. Hohn et al., "Genetic Engineering", bind 2, s. 169, New York 1980] lineariseret 10 med EcoRI. Ligeringen gennemføres med 300 E T4-DNA-ligase (New England Biolabs) under anvendelse af puffersystemet beskrevet af leverandøren. DNA'et indsættes in vitro i bakteriofag λ [B. Hohn, "Methods in Enzymology", bind 68, s. 299, New York 1979], og de samlede fager anvendes til 15 transducering af Escherichia coli-stamme HB101 (r®, m®, leu®* pro®, recA). Effektiviteten af transduktionen er ca. 5000 ampicillin-resistente kolonier pr. μg pYcl-vektor. 3000 ampR-kolonier udtages og dyrkes hver for sig i huller i mikrotiterplader i LB-medium [10 g Bacto-Trypton (Difco), 5 20 g Bacto gærekstrakt (Difco), 10 g NaCl ] indeholdende 100 Mg/ml ampicillin.

b) Isolering af gær-GAPDH-genet

Det ovenfor beskrevne genbibliotek screenes med et syntetisk oligonucleotid [fremstillet under anvendelse af 25 phosphotriestermetoden K. Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. 97, 7327 (1975), J.F.M. de Rooij et al., Reel. Trav. Chim. Pays-Bas £8, 537 (1979)] med følgende struktur: 51-GCTCCATCTTCCACCGCCCC-3'. 10 m9 af oligonucleotidet kinaseres under anvendelse af 10 μΐ y-^'P-kTP (3000 Ci/mmol, 30 10 mC1/m1 Amersham) med T4 polynucleotidkinase (Boehringer) i et samlet rumfang på 50 μΐ som beskrevet af Maniatis et al. ["Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Lab., 1982, side 125 ]. Der foretages kolonihybridisering som beskrevet af samme forfatter (side 312). Positive kloner påvises ved 35 autoradiografi under anvendelse af en røntgenfilm (Kodak DK 175093 B1 39 X-5). Ved plasmid-DNA-isolering (se beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 100.561) fås en hybridklon, som indeholder et 2100 bp HindIII-fragment, som koder for 5 GAPDH [J.P. Holland et al., J. Biol. Chem. 254, 9839 (1979)]. Det endelige bevis for, at det klonede DNA er autentisk opnås ved DNA-sekvenseringsforsøg under anvendelse af det ovenfor omtalte oligonucleotid i kombination med dideoxy-sekvenseringsmetoden som beskrevet 10 af G.F. Hong [Bioscience Reports _1, 243 (1981)] for dobbeltstrenget DNA. Det klonede GAPDH-gen har samme sekvens som pgap491 publiseret af Holland et al. [J. Biol. Chem.

255, 2596 (1980)].

c) Fremstilling af GAPDH-medstrømspromotorelementer 15 (se fig. 2 og 3) 649 bp Taql-fragmentet, som indeholder position -27 til -675 fra ATG'et fra GAPDH-genet (se fig. 2) isoleres ved spaltning af ovennævnte hybridpiasmid med Taql (New England Biolabs), adskillelse af DNA-fragmenterne på en 1,2%'s blød 20 agarosegel og ekstraktion af DNA'et med varmt phenol (se eksempel 1). Taql-fragmentet klones i Clal-stedet i pBR322: 1 μg pBR322 spaltes med tre enheder Clal (New England Biolabs) som beskrevet af leverandøren. 300 ng af den phenolbehandlede og spaltede vektor llgeres til ca. 300 ng 25 indsat DNA (649 bp Taq-fragment) under anvendelse af 200 E T4-DNA-ligase i et samlet rumfang på 20 /il (se eksempel Ib).

Der foretages transformering til Escherichia coli HB101 for ampicillinresistens, plasmid DNA fremstilles og analyseres ved restriktionsanalyse [Taql, Dral ]. Orienteringen af 30 Taql-fragmentet bestemmes ved anvendelse af restriktions-endonuclease Dral i kombination med BamHI-stedet i plasmiderne, og der udvælges et plasmid, som har Taql-stedet i position -675 nær ved Hindlll-stedet i pBR322. Dette plasmid betegnes pBR322/GAPDH, og det lineariseres under 35 anvendelse af BamHI (New England Biolabs), hvorpå der fore- ui\ i /ouya di 40 tages spaltning roed Bal31 soro beskrevet i eksempel 1, bortset fra at der anvendes Bglll-linkere (5’-CAGATCTG-3',

New England Biolabs), og det spaltede plasmid cirkuleres 5 direkte ved en koncentration på 5 /ig/ml i et samlet rumfang på 20 jtl. Størrelsen af det Bal31-afkortede Taql-fragment bestemmes ved restriktionsanalyse (under anvendelse af Bglll og HindiII). Der udvælges to kloner, som indeholder DNA-fragmenter med en størrelse på ca. 200 bp og 265 bp fra 10 ATG i modstrømsretningen til GAPDH-prorootoren. Begge fragmenter Indeholder den formodede TATA-box ved ca. -140 bp. Disse kloner indeholder stadig replikationsoriginet i den pBR322-afledte del af DNA*et og betegnes henholdsvis pGAPDH-F og pGAPDH-E.

15 d) Kombination af medstrøms-GAPDH-elementet med UAS1(PH05) fra PH05 og proteinkodningsområdet for eglin C

I) GAPDH-elementer (se fig. 3)

For at forlænge GAPDH-promotorelementeme fra Taql-stedet 20 ved position -27 til en position i umiddelbar nærhed af ATG*en for GAPDH-genet fremstilles to syntetiske komplementære oligonucleotider med følgende struktur: 5' CGAATAAACACACATAAATAAAG 3' 3' TTATTTGTGTGTATTTATTTCTTAA 5’

25 Disse oligonucleotider tilvejebringer den ægte GAPDH-promotorsekvens fra position -26 til position -5 med dannelsen af et terminalt EcoRI-sted. 2 μg af hver af pi asraiderne pGAPDH-E og -F spaltes med 6 enheder Taql i 50 μΐ, og de dannede blandinger phenolbehandles, fældes med 30 ethanol og suspenderes i 10 μΐ vand. De syntetiske oligonucleotider anelleres ved blanding af 2 μΐ af hver enkeltstreng i 100 μΐ af en opløsning indeholdende 10 mM

DK 175093 B1 41

Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2/ 50 mM NaCl, opvarmning i 3 minutter til 90eC og langsom afkøling af opløsningen til stuetemperatur (i løbet af ca. 3 timer). 1 μg af hver af de 5 Taql-spaltede piasmider blandes med ca. et 20-dobbelt molært overskud af de anellerede oligonucleotider i et rumfang på 20 μΐ i ca. 18 timer under anvendelse af 800 E

T4-DNA-ligase. Hele blandingen spaltes med 3 enheder Bglll (New England Biolabs). DNA-fragmenterne adskilles på en 10 1,5%'s blød agarosegel. Bglll-EcoRI-fragmenteme på henholdsvis ca. 200 bp og 265 bp udskæres af gelen, ekstraheres og fældes med ethanol.

Plasmid pGAPDH-E spaltes med Bglll og EcoRI, og det store fragment (ca. 3,5 kb) isoleres. Dette fragment anvendes som 15 vektor til kloning af 265 bp og 200 bp

Bglll-EcoRI-fragmenterne under anvendelse af ligerings-, transformations- og plasmidisoleringsbetingelser som beskrevet ovenfor. De dannede plasmider betegnes pGAPDH-EL og pGAPDH-FL. DNA-sekvenserne for Bglll-EcoRI-fragmenteme 20 klonet i pGAPDH-EL og pGAPDH-FL er vist i fig. 4. Den nøjagtige størrelse af fragmenterne er henholdsvis 266 bp og 201 bp.

II) UAS1(PH05)-reguleringselementet 3 μς plasmid p31/Y (se beskrivelsen til europæisk 25 patentansøgning nr. 100.561) spaltes med 6 enheder Clal (New England Biolabs). De forskudte 3'-ender udfyldes ved en reaktion med Klenow-fragmentet af Escherichia coli-DNA-polymerase I (Bethesda Research Laboratories) under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Maniatis (se ovenfor).

30 Bglll-linkere (5f-CAGATCTG-3') tilsættes som beskrevet i eksempel 1. DNA*et spaltes med Sall og Bglll (New England Biolabs) og sættes på en 1%'s blød agarosegel. 548 bp fragmentet udskæres af gelen, phenolbehandles og fældes med ethanol som beskrevet ovenfor.

UI\ I 13U9J o I

42 III) Konstruktion af plasmid pJDB207R/PH05-EGL (se fig. 5)

Dette plasmid er en kilde for et DNA-fragment sammensat af 5 eglin C kodningsområdet og PH05-transskriptionsterminato-ren.

A) Isolering af pJDB207-vektorfragmentet: 6 jig plasmid pJDB207R/IF(a-3) (beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 100.561) spaltes fuldstændigt med 10 restriktionsendonucleasen BamHl. De dannede DNA-fragmenter med en størrelse på 6,85 kb og 1,15 kb fældes med ethanol og opslæmmes i 400 μΐ 50 mM Tris-HCl pH 8,0. Der tilsættes 4,5 enheder alkalisk phosphatase fra kalvetarm (Boehringer, Mannheim). Blandingen inkuberes i 1 time ved 37‘C. Derpå 15 inaktiveres phosphatasen ved inkubering ved 65eC i 1 time. Opløsningen indstilles til 150 mM NaCl. DNA-opløsningen sættes til et lag på 100 μΐ "DE 52" (Whatman )-anionby tt er ækvilibreret med 10 mM Tris-HCl pH 7,5 indeholdende 150 mM NaCl og 1 mM EDTA. Efter vaskning med den samme puffer 20 elueres DNA'et med 400 μΐ 1,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, og der fældes med ethanol. Det store BamHI-fragment på 6,85 kb adskilles fra det lille fragment på en 0,6%'s lavtsmeltende agarosegel i Tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3.

25 B) Isolering af et 534 bp PH05-promotorfragment 10 /ig plasmid p31/R (beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 100.561) spaltes med restriktionsendonucleaser EcoRI og BamHl. De dannede tre fragmenter adskilles på en 0,6%'s lavtsmeltende agarosegel i 30 Tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3. Der isoleres et 534 bp BamHl-EcoRI-fragment, som indeholder PH05-promotoren inklusive mRNA-startstedeme.

DK 175093 B1 43 C) Isolering af et 221 bp DNA-fragment indeholdende kodningssekvensen for eglin 8 μg plasmid pML147 (beskrivelsen til europæisk 5 patentansøgning nr. 146.785) spaltes med restriktionsendonucleaser BamHl og EcoRI. De dannede to DNA-fragmenter adskilles på en 0,6%’s lavtsmeltende agarosegel i Tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3. 221 bp-fragmentet isoleres.

10 D) Ligering af DNA-fragmenter

Tre DNA-fragmenter beskrevet ovenfor (eksempel 3dIIIA-C) med passende klæbrige ender ligeres i én reaktion: 0,1 pmol (0,45 μg) af 6,85 kb BamHI-vektorfragmentet, 0,2 pmol (70 ng) af 534 bp BamHI-EcoRI-PH05-promotor-fragmentet og 0,2 15 pmol (29 ng) af 221 bp EcoRI-BamHI-fragmentet af pML147 ligeres. Alle tre DNA-fragmenter er indeholdt i små gelblokke af lavtsmeltende agarose. De tre stykker agarosegel samles, smeltes ved 65‘C og fortyndes to gange. Ligeringen gennemføres i et samlet rumfang på 270 /il 60 mM 20 Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP med 16 enheder T4-DNA-ligase (Boehringer, Mannheim) ved 15eC i 16 timer. 10 μΐ alkanoler af ligeringsblandingen sættes til 100 μΐ calciumbehandlede, transformationskompetente Escherichia coli HBlOl-celler.

25 24 transformerede ampR kolonier dyrkes hver for sig i LB-medium indeholdende 100 pg/ral ampicillin. Plasmid-DNA fremstilles i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Holmes et al. [Anal. Biochem. 114, 193 (1981)] og analyseres ved dobbeltspaltning med HindiII/EcoRI. Fremkomsten af et 30 600 bp EcoRI-Hindlll-fragment indicerer, at den pågældende klon har PH05-promotor - eglin C-DNA-fragmentet indsat i ekspressionsvektoren i den rigtige orientering. Som forventet har ca. 50% af klonerne en indsat del i den rigtige orientering. En af disse kloner isoleres og betegnes uiv i /ousw di 44 pJDB207R/PH05-EGL.

6 ftg plasmid pJDB207R/PH05-EGL spaltes fuldstændigt med restriktionsendonucleaseme HindiII og Sall. Det store 6,1 5 kb (ventordel) fragment isoleres ved elektroforese på en blød agarosegel, phenolekstraktion og ethanolfældning.

Vektor-DNA'et opslæmmes i 20 μΐ vand. Eglinfragmentet dannes ved spaltning af pJDB207R/PH05-EGL med Hindlll og EcoRI. Det dannede 600 bp fragment adskilles ved elektroforese på en 10 blød agarosegel, phenolekstraktion og ethanolfældning.

Eglinfragmentet opslæmmes i 20 μΐ H2O.

IV) Ligering af fragmenterne under anvendelse af UAS1(PH05)-elementer (se fig. 6)

Ligeringen gennemføres under anvendelse af følgende fire 15 komponenter: 0,5 μg af 6,1 kb

Hindlll-Sall-vektor-fragmentet, 100 ng af 600 bp EcoRI-Hindlll eglin C-fragmentet, 200 ng af 266 bp Bglll-EcoRI-fragmentet af pGAPDH-EL og 100 ng af 548 bp Sall-BgIII-fragmentet indeholdende UAS1(PH05). Ligeringen 20 gennemføres som beskrevet ovenfor. Transformation af Escherichia coli HB101 for ampicillinresistens, plasmidisolering og restriktionsanalyse af positive kloner gennemføres som beskrevet ovenfor under anvendelse af restriktionsendonucleaser Hindlll, EcoRI, Bglll og Sall. Der 25 udvælges en positiv klon, som betegnes pJDB2076/PAPEL-EGL (UAS1).

En analog konstruktion gennemføres med 201 bp Bglll-EcoRI-fragmentet af pGAPDH-FL. Det dannede plasmidbetegnes pJDB207/PAPFL-EGL (UAS1).

DK 175093 B1 45 V) Konstruktion af hybrider roed UAS1(PHQ5) og UAS2(PH05)-elementer 3 μς af de ovenfor beskrevne piasmider (se IV) spaltes med 5 Bglll. Efter phenolekstraktion og ethanolfældning opslæmmes DNA'et i vand. De forskudte 3'-ender udfyldes med Klenow DNA-polymerase som beskrevet under II). Plasmiderne opvarmes til 70#C i 10 minutter til inaktivering af enzymet. Efter nedbrydning med Sall (Biolabs) isoleres de store fragmenter 10 (ca. 7,2 kb) ved elektroforese på blød agarosegel og phenolekstraktion, og det ethanolfældede DNA opslæmmes i vand.

På lignende måde spaltes plasmid p31/Y med BstEII, behandles med DNA-polymerase (Klenow-fragment) og spaltes med Sall.

15 651 bp-fragmentet isoleres som beskrevet ovenfor. Ved ligering med 200 ng af de ovenfor omtalte vektor-DNA’er med 651 bp-fragmentet fås følgende plasmider: pJDB207/PAPEL-EGL (UAS1 + UAS2) (indeholdende 266 bp

Bglll-EcoRI-fragmentet fra pGAPDH-EL) 20 pJDB207/PAPFL-EGL (UASl + UAS2) (indeholdende 201 bp

Bglll-EcoRI-fragmentet fra pGAPDH-FL).

Eksempel 4 a) Transformation af Saccharomyces cerevisiae GRF18

De fire plasmider fra eksempel 3dIV og 3dV indføres hver for 25 sig i Saccharomyces cerevisiae-stamme GRF18 (a, his3-ll, his3-15, leu2-3, leu2-112, canR) under anvendelse af transformeringsmetoden beskrevet af Hinnen et al. [Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)]. Transformerede gærceller selekteres på gærminimalmedieplader med underskud 30 af leucin. Enkelte transformerede gærkolonier isoleres og betegnes som Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPEL--EGL (UASl), /PAPFL-EGL (UASl), /PAPEL-EGL (UASl + UAS2) DK 175093 B1 46 og /PAPFL-EGL (UASI + UAS2).

b) Fermentering af transformenterne

Celler af de fire Saccharomyces cerevisiae 5 GRF18 - tr ans formant er dyrkes hver for sig i 10 ml gærminimalmedium (Difco gærnitrogenbasis uden aminosyrer tilsat 2% glucose og 20 mg/1 L-histidin) i 50 ml Er 1 enmeyer-kolber under rystning ved 30“C i 24 timer til en tæthed på 3 x 107 celler/ml. Cellerne vaskes i 0,9% 10 NaCl-opløsning og anvendes til lnokulering af 50 ml af et højt -medium (som ovenfor) og et lavt Pi-minimalmedium fremstillet i overensstemmelse med sammensætningen af Difco gærnitrogenbasismedium (uden aminosyrer) med 0,03 g/1 ^2^4, 1 9/1 KC1, 10 g/1 L-asparagin i stedet for 15 (NH4)2S04, 2% glucose og 1 g/1 L-histidin. Mediet inokuleres til en start ODgQQ på 0,03. Cellerne dyrkes i en 500 ml kolbe ved 30*C i 24 timer (ODgQOnm *1,8 for lavt Pi-medium, OD600nm = for hØjt Pi-medium).

c) Bestemmelse af indhold af eqlin C-titere 20 Når cellerne har nået en celletæthed (OD) som anført ovenfor, høstes cellerne, hvorpå de centrifugeres og oplukkes ved hjælp af glasperler. Blandingerne analyseres for eglinaktivitet ved måling af inhiberingen af human leukocytel astase i overensstemmelse med fremgangsmåden 25 ifølge U. Seemueller et al. [ Hoppe-Seyler*s Z. Physiol.

Chem. 358, 1105 (1977)]. Der opnås følgende aktiviteter: DK 175093 B1 47

Ekstrakt af eglin C aktivitet (mg/l/OD

Saccharomyces cerevisiae af kultur) induceret ikke induceret 5 (lav Pi) (høj Pi) pJDB207/PAPEL·-EGL (UAS1) 14 0,7 pJDB207/PAPFL-EGL (UAS1) 17 0,7 pJDB207/PAPEL-EGL (UAS1 + UAS2) 14 1 pJDB207/PAPFL-EGL (UAS1 + UAS2) 11 0,7 10 Eksempel 5

Ekspression af desulphatohirudin under kontrol af en PHQ5-GAPDH-hybridpromotor I. Regulering af nucleotidsekvensen ved 5'-enden af desulphatohirudin HV1-genet 15 Nucleotidsekvensen, som koder for desulphatohirudin (se beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 168.342) starter med GTT, som repræsenterer det NH2“terminale valin i det færdige genprodukt. Til hensigtsmæssig subkloning og ekspression i Escherichia coli er kodningssekvénsen 20 forlænget ved 5’-enden med 8 nucleotider indeholdende et EcoRI-restriktionssted og en ATG-initieringskodon. For at opnå nøjagtig "in frame" fusionering af hirudinkodningssekvensen til sekvensen, som koder for PH05-signalpeptidet, er det nødvendigt at fjerne disse 25 yderligere nucleotider. Dette opnås ved at omdanne EcoRI-restriktionsstedet til et "flush"-endested, addere et syntetisk oligonucleotid indeholdende et Hgal-genkendel-sessted i en sådan position, at efterfølgende spaltning med Hgal forekommer umiddelbart efter GTT-kodonet i 30 modstrømsretningen.

48 DK 175093 Bl

Indføring af et Hgal-restrlktionssted foran desulphato-hirudingenet (se fig. 7) 8 /tg plasmid pML310 (se beskrivelsen til europæisk 5 patentansøgning nr. 168.342) spaltes fuldstændigt med restriktionsendonuclease EcoRI. DNA'et (pML310/EcoRI) ekstraheres med phenol/chloroform og fældes med ethanol. De udragende 5'-ender fjernes med nuclease S^. 4 μ g pML310/EcoRI DNA spaltes i 100 μΐ 250 mM NaCl, 1 mM ZnS04, 10 30 mM natriumacetat pH 4,6 med 20 E/ml nuclease (Sigma) i 45 minutter ved 37“C.

DNA’et ekstraheres med phenol/chloroform og fældes med ethanol. DNA'et (pML3lO/EcoRI/S^) opslæmmes i 100 μΐ 50 mM Tris.HCl pH 8,0 og inkuberes med to enheder alkalisk 15 phosphatase fra kalvetarm (CIAP, Boehringer) i 1 time ved 37*C. Enzymet deaktiveres ved 65*C i 1,5 timer.

NaCl-koncentrationen i inkubationsblandingen indstilles på 150 mM. Det desphophorylerede DNA (pML310/EcoRI/Si/CIAP) renses ved adsorption på en "DE52" (Whatman)-ionbyttersøjle 20 i en saltpuffer med lav koncentration (150 mM NaCl, 10 mM Tris.HCl pH 8,0, 1 mM EDTA), hvorpå der elueres med en pufferopløsning med høj saltkoncentration (1,5 M NaCl, 10 mM Tris.HCl pH 8,0, 1 mM EDTA). DNA’et fældes med ethanol og opslæmmes i H2O til en koncentration på 0,8 mg/ml.

25 Et oligonucleotid med formlen 5’-AGCGTCGACGCT-3’ syntetiseres ved hjælp af phosphotriestermetoden [ Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 706 (1981)]. Sekvensen i oligonucleotidet er selvkomplementært indeholdende 30 genkendelsesstedet -GACGC- for restriktionsendonuclease DK 175093 B1 49

Hgal. Anellering af to enkelte strenge fører til en dobbeltstrenget DNA-linker på 12 basepar.

1,2 /*g af det syntetiske enkeltstrengede 5 oligodeoxynucleotid phosphoryleres i 10 μΐ 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 30 /tCi af [ 7-32p ] ATP (3000 Ci.mmol"*, Amersham) og 6 enheder T4 polynucleotidkinase (Boehringer) i 30 minutter ved 37°C, hvorpå der behandles i 15 minutter ved 37°C i nærværelse af 0,5 mM ATP. Blandingen 10 inkuberes yderligere i 10 minutter ved 75eC til inaktivering af enzymet, hvorpå blandingen henstår til afkøling til stuetemperatur til anellering.

0,6 /tg (170 pmol) af det 32plinker DNA blandes med

2,4 /tg (1,75 pmol ender) pML310/EcoRI/Si/CIAP og ligeres i 15 20 μΐ 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3,5 mM

ATP med 800 enheder T4 DNA-ligase (Biolabs) i 20 timer ved 15°C. Ligasen inaktiveres ved 85eC i 10 minutter, og overskud af linkermolekyler fjernes ved fældning af DNA’et i nærværelse af 10 mM EDTA pH 7,5, 300 iriM natriumacetat pH 6,0 20 og 0,54 rumfang isopropanol. Efter 30 minutter ved stuetemperatur centrifugeres DNA'et, hvorpå den dannede pellet opslæmmes i 45 μΐ ligeringsblanding (specificeret ovenfor), og der ligeres i 6 timer véd 15eC til dannelse af cirkelformet DNA.

25 Alikvoter på 1 fil og 3 μΐ af ligeringsblandingen sættes til 100 μΐ calciumbehandlede, transformationskompetente

Escherichia coli HBlOl-celler [ fremstilles ifølge fremgangf småden af D. Hanahan, J. Biol. Chem. 166, 557 (1983)]. Cellerne anbringes i is i 30 minutter, hvorpå der 30 inkuberes i 3 minutter ved 42®C, afkøles på is i 2 minutter, hvorpå der inkuberes i 1 time ved 37®C i 400 μΐ SOC-medium. Cellerne koncentreres i 100 μΐ hver og udplades på LB-agarplader indeholdende 50 μδ/ιηΐ ampicillin.

Ul\ I /OU»v> D I

! 50 12 transformerede ampR kolonier dyrkes hver for sig i LB-medium indeholdende 100 jig/ml ampicillin. Plasmid DNA fremstilles i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge 5 D.S. Holmes et al. [Anal. Biochem. 114, 193 (1981)].

Tilstedeværelsen af den syntetiske oligonucleotidlinker bekræftes ved DNA-sekvensering under anvendelse af et enkeltstrenget DNA-fragment som primer, der hybridiserer til den kodede streng for hirudin. En klon, som indeholder 10 linker DNA'et i den rigtige position foran hirudingenet betegnes pML310L.

II. Fusionering af PH05-signalsekvensen og desulphato-hlrudinstrukturgenet a) Isolering af 0,2 kb desulphatohirudinfragmentet 15 (se fig. 7) 12 pg plasmid pML310L spaltes fuldstændigt med restriktionsendonucleaserne BamHI og Pvul. Efter ekstraktion af DNA'et med phenol/chloroform og fældning med ethanol adskilles de to restriktionsfragmenter på en 1,2%'s 20 agarosegel i Tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3. 0,84 kb

Pvul-BamHI-fragmentet farvet med ethidiumbromid isoleres i en gelskive. DNA'et elektroelueres i en dialysepose indeholdende 3 ml 0,2 x TBE-puffer. Den lukkede pose nedsænkes i TBE-puffer pH 8,3 (90 mM Tris-base, 90 mM

25 bor syre, 2,5 mM EDTA). Efter 30 minutter ved 100 mA vendes strømmens polaritet i 45 sekunder for at afstøde DNA*et fra dialysemembranen. Pufferen, som omgiver gelskiven i dialyseposen, udtages, indstilles på 150 mM NaCl og ledes gennem en "DE52" (Whatman)-ionbyttersøjle. DNA*et elueres 30 med en puffer med høj saltkoncentration (1,5 M NaCl, 10 mM Tris.HCl pH 8,0, 1 mM EDTA), fældes med ethanol og genopløses i Η£θ i en koncentration på 0,1 mg/ml.

DK 175093 B1 51 0,84 kb Pvul-BamHI-fragmentet af pML310L spaltes yderligere roed restriktionsendonuclease Hgal. Denne spaltning danner et 198 bp Hgal-BamHI-fragment, som indeholder den komplette 5 kodningssekvens for modent desulphatohirudin. Yderligere Alul-spaltning berører ikke 198 bp Hgal-BamHI-fragmentet, men fjerner et andet Hgal-fragment af lignende størrelse.

0,2 kb Hgal-BamHI-fragmentet adskilles fra de andre fragmenter på en 1,5%'s agarosegel i TBEpuffer og isoleres 10 ved elektroeluering (som beskrevet ovenfor). DNA'et renses ved ionbytterkromatografi på en "DE52"-søjle og ved ethanol fældning. DNA’et opslæmmes i H2O i koncentration på 30 jig/ml (0,2 pmol/pl).

b) Isolering af PH05-promotorområdet med en del af PH05-15 signalsekvensen (se fig.8)

Plasmid p31/PH05-TPA18 (se beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 143.081) har PH05-promotoren og PH05-signalsekvensen fusioneret i struktur (frame) til et fremmed strukturgen (t-PA). Et 584 bp BamHI-BalI-fragment 20 indeholder PH05-promotoren og hele PH05-signalsekvensen bortset fra otte nucleotider ved 3’-enden.

8 fig p31/PH05-TPAl8 DNA spaltes med restriktionsendonuclease Ball (16 timer ved 37°C). DNA’et renses ved ekstraktion med phenol/chloroform og fældning med ethanol. DNA'et opslæmmes 25 i H2O i en koncentration på 0,7 mg/ml.

Den rigtige forbindelse mellem PH05-signalsekvensen og kodningsområdet for desulphatohirudin tilvejebringes ved hjælp af en syntetisk linker med formlen ( 1) 5’-CCAATGCA-3' 30 (2) 3'-GGTTACGTCAACA-5'

Ul\ Ί Dl 52

Otte nucleotider ved 5*-enden af linkeren (5'-CCAATGCA) repræsenterer en del af PH05-signalsekvensen fra Ball-stedet til behandlingsstedet. De udragende fem nucleotider ved 5 5'-enden af oligonucleotid (2) passer til

Hgal-spaltningsstedet ved 5'-enden af desulphatohirudinkod-ningssekvensen.

De enkelte enkelt-strengede oligonucleotider (1) og (2) syntetiseres ved hjælp af phosphotriestermetoden (Itakura et 10 al., se ovenfor). 1,1 øg og 1,8 øg af oligonucleotiderne henholdsvis (1) og (2) phosphoryleres hver for sig ved 5'-enderne, blandes 1 ækvimolære mængder og anelleres som beskrevet i eksempel 51.

1,3 øg (200 pmol) af det phosphorylerede, dobbeltstrengede 15 linker-DNA ligeres til 7 øg (1,8 pmol) p31/PH05-TPA18 spaltet med Ball i 40 øl 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 3,5 mM ATP, 5 mM DTT og 1400 enheder T4-DNA-ligase (Biolabs) ved 15*C i 16 timer. Ligasen inaktiveres i 10 minutter ved 85®C. Overskud af linker fjernes ved fældning 20 af DNA'et i nærværelse af 10 mM EDTA, 300 nM natriumacetat pH 6,0 og 0,54 rumfang isopropanol. DNA'et opslæmroes og spaltes yderligere med restriktionsendonucleasen BamHI. Efter ekstraktion af DNA'et med phenol/chloroform og fældning med ethanol adskilles de to restriktionsfragmenter 25 på en 1,2%'s agarosegel i Tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3.

0,6 kb fragmentet isoleres fra gelen. DNA'et elektroelueres og renses yderligere ved ionbytterkromatografi på en "DE52"-søjle og ved fældning med ethanol. 0,6 kb BamHI-Hgal-DNA-fragmentet opslæmmes i H2O til en 30 koncentration på 40 øg/ml.

c) Isolering af et pJDB207 gærvektorfragment (se fig. 8) 9 øg plasmid pJDB207R/PH05-TPA(12-2) DNA (se beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 143.081) spaltes med DK 175093 B1 53 restriktionsendonueleasen BamHI. Efter fuldstændig spaltning ekstraheres DNA’et med phenol/chloroform og fældes med ethanol. DNA'et opslæmmes i 50 mM Tris.HCl pH 8,0 til en 5 koncentration på 0,1 mg/ml og spaltes med 7 enheder alkalisk phosphatase fra kalvetarm i 1 time ved 37“C. Phosphatasen inaktiveres i 1,5 timer ved 65eC, og DNA'et renses ved ionbytterkromatografi på en "DE52"-søjle (se eksempel 51) og fældes med .ethanol. BamHI-fragmentet med en størrelse på 6,8 10 kb isoleres på en 1,2%'s agarosegel i Tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3. DNA'et elektroelueres og renses ved ionbytterkromatografi på en ''DE52"-søjle og ved fældning med ethanol. DNA'et opløses i vand til en koncentration på 0,4 mg/ml (0,1 pmol/jil).

15 d) Ligering af PH05-promotorfragmentet og desulphatohi-rudinstrukturqenet til pJDB207 gærvektorfragmentet (se fig. 8) pJDB207-gærvektoren, PH05-promotorfragmentet med PH05- signalsekvensen og desulphatohirudinstrukturgenet isoleres 20 alle som DNA-fragmenter (se eksempel 511 a-c), som ligeres til et ekspressionspiasmid.

0,3 pmol af 0,6 kb BamHI-Hgal-fragmentet af p31/PH05-TPA18 og 0,3 pmol af 0,2 kb Hgal-BamHI-fragmentet af pML310L ligeres til 0,1 pmol af 6,8 kb BamHI-fragmentet af 25 PJDB207R/PH05-TPA (12-2) i 10 μΐ 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP og 400 enheder T4-DNA-ligase i 20 timer ved 15°C.

En 1 μΐ alikvot af ligeringsblandingen sættes til 100 μΐ transformationskompetente Escherichia coli HBlOl-celler 30 fremstillet i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Hanahan (se ovenfor). Der anvendes også den der beskrevne transformationsforskrift. Cellerne udplades på LB-agarplader indeholdende 50 /»g/ml ampicillin.

54 24 ampR-kolonier dyrkes hver for sig i LB-medium med 100 μg/ml ampiclllin. Plasmid DNA analyseres med hensyn til størrelse og orienteringen af den indsatte del ved 5 spaltning roed restriktionsendonuclease Pstl. En enkelt klon med den korrekte orientering af den indsatte del betegnes som pJDB207/PH05-HIR.

III) Fremstilling af plasmid pJDB207/PH05(Eco)-HIR (se fig. 9) 10 Til hensigtsmæssig sammenføjning af UAS (PH05) -GAPDH-hybridpromotorelementeme til kodningsområdet for desulphatohirudin indeholdende PH05-signalsekvensen (som i plasmid pJDB207/PH05-HIR) indføres et EcoRI-restriktionssted i det 15 5'-ikke-translaterede område mellem mRNA-startstederne og ATG'et for kodningsområdet.

15 μg plasmid pJDB207/PH05-HIR spaltes med restriktionsendonuclease Dral (Boehringer). De dannede fire fragmenter adskilles på en 0,8%fs agarosegel i Tris-borat-20 EDTA-puffer pH 8,3. 4,2 kb DNA-fragmentet Isoleres fra gelen, elektroelueres og fældes med ethanol. DNA'et opslæm-mes i H2O til en koncentration på 0,6 mg/ml.

To syntetiske oligonucleotider med formlen 5'-AATTCGATTACCAATGTTT-3' 25 3'- GCTAATGGTTACAAA-5’ i en mængde på henholdsvis 2,3 og 2,9 μg kinaseres hver for sig i 20 μΐ 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,5 mM ATP og 20 E T4 polynucleotidkinase (Boehringer). Efter 45 minutter ved 37eC hældes de to reaktionsblandinger sammen, 30 opvarmes i 10 minutter til 75*C og henstår til afkøling til stuetemperatur. Den anellerede oligonucleotidlinker opbevares ved -20®C.

55 DK 175093 B1

5,5 fig (2,3 pmol) af 4,2 kb Dral-DNA-fragmentet inkuberes i 16 timer ved 15eC med et 70-dobbelt overskud af den 5 kinaserede og anellerede oligonucleotidlinker i 50 μΐ 50 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP og 800 E

T4-DNA-ligase (Biolabs). Efter inaktivering af T4-DNA-ligase i 10 minutter ved 85eC fjernes overskuddet af linkere ved fældning af DNA'et i nærværelse af 10 mM EDTA, 300 mM 10 natriumacetat pH 6,0 og 0,54 rumfang isopropanol. DNA'et spaltes med EcoRI og Hindlll. De dannede fragmenter adskilles på en 1%'s agarosegel i Tris-borat-EDTA-puffer pH

8,3. 643 bp-fragmentet isoleres fra gelen ved elektroeluering og fældning med ethanol. DNA'et opslæmmes 15 til en koncentration på 0,1 pmol/μΐ.

EcoRI-HindiIl-fragmentet indeholder PH05-signalsekvensen, kodningssekvensen for desulphatohirudin og PH05-transskriptionsterminatoren.

534 bp PH05-promotorfragmentet isoleres fra plasmid p31/R 20 (beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 100.561).

10 μg p31/R spaltes med restriktionsendonuclease EcoRI og BamHI. De dannede tre fragmenter adskilles på en 0,6%'s lavtsmeltende agarosegel i Tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3.

Der isoleres i 534 bp BamHI-EcoRI-fragment, som indeholder 25 ΡΗ05-promotoren indeholdende mRNA-startstederne.

Vektorfragmentet isoleres fra plasmid pJDB207/PH05-HIR. 6 μg af dette plasmid spaltes med BamHI og Hindlll. Det store 6,5 kb BamHI-Hindlll-fragment adskilles fra det lille fragment på en 0,6%'s lavtsmeltende agarosegel i 30 Tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3.

Tre DNA-fragmenter beskrevet ovenfor med de passende klæbrige ender ligeres ved følgende reaktion: 0,2 pmol

Ulv 1 f&U93 Bl 56 (70 ng) af 534 bp BamHI-EcoRI PH05-promotorfragmentet, 0,2 pmol (85 ng) af 643 bp EcoRI-Hindlll-fragmentet (hirudinkod-ningssekvens) og 0,1 pmol (0,4 μg) af 6,5 kb BamHI-Hindlll-5 vektorfragmentet ligeres i 10 μΐ 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP og 400 E T4-DNA-ligase i 6 timer ved 15*0» En alikvot af ligeringsblandingen på 1 μΐ sættes til 100 μΐ calciumbehandlede, transformationskompetente Escherichia coli HBlOl-celler.

10 12 transformerede ampR-kolonier dyrkes hver for sig i LB-medium indeholdende 100 /tg/ml ampicillin. Plasmid SNA fremstilles under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Holmes et al. [Anal. Biochem. 114, (1981) 193] og analyseres ved restriktionsspaltninger med EcoRI og BamHI. En klon med de 15 forventede restriktionsfragmenter isoleres og betegnes pJDB207/PH05(ECO)-HIR.

IV) Ligering af UASl(PH05)-GAPDH-hybridpromotorerne til proteinkodningsomr&det for desulphatohlrudin 15 μg plasmid pJDB207/PH05(Eco)-HIR spaltes med EcoRI og 20 Hindlll. DNA-fragmenterne adskilles på en 1%'s agarosegel i Tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3. 643 bp-fragmentet isoleres fra gelen, elektroelueres og fældes med ethanol. DNA'et opslæmmes i H2O til en koncentration på 0,1 pmol/μΐ.

6 μg plasmid pJDB207/PHO5-HIR spaltes fuldstændigt med 25 restriktionsendonucleaserne Hindlll og Sall. Det store 6,3 kb-fragment (vektordel) isoleres ved elektroforese på en blød agarosegel, ekstraktion med phenol og fældning med ethanol. Vektor-DNA-fragmentet opslæmmes i vand til en koncentration på 0,05 pmol/μΐ.

30 10 μg plasmid pGAPDH-EL (se eksempel 3dl) spaltes med Bglll og EcoRI. 266 bp Bglll-EcoRI-fragmentet isoleres på en 1,2%'s agarosegel i Tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3, elektro- DK 175093 B1 57 elueres fra gelen og fældes med ethanol. DNA'et opslæmmes i H2O til en koncentration på 0,3 pmol/μΐ.

0,3 pmol af 548 bp Sall-BgIII-fragmentet indeholdende 5 UAS1 (PH05) (eksempel 3dII), 0,3 pmol af 266 bp

Bglll-EcoRI-fragmentet af pGAPDH-EL, 0,3 pmol af 643 bp EcoRI-HindiII-fragmentet af pJDB207/PH05(Eco)-HIR og 0,12 pmol af 6,3 kb S al I-Hindi 11-vektor fragmentet ligeres i 20 μΐ 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 raM DTT, 1 mM ATP og 10 400 E T4 DNA-ligase (Biolabs) i 6 timer ved 15°C. Alikvoter på 1 |il og 3 μΐ af ligeringsblandingen sættes til 100 μΐ calciumbehandlede Escherichia coli HBlOl-celler. Der gennemføres plasmidisolering fra ampR-kolonier og restriktionsanalyse med Sall, Bglll, EcoRI og Hindlll som 15 beskrevet ovenfor (se eksempel 3dIII). Et positivt klon udvælges og betegnes pJDB207/PAPEL-HIR(UASl). En analog konstruktion gennemføres med 201 bp Bglll-EcoRI-fragmentet isoleret fra pGAPDH-FL. Et udvalgt plasmid betegnes pJDB207/PAPFL-HIR(UASl).

20 V) Liqering af UASl(PH05)-UAS2(PH05)-GAPDH-hybridpromo-torerne til protelnkodninqsområdet for desulphatohirudin 3 /ig af hver af plasmiderne pJDB207/PAPEL-HIR(UASl) og pJDB207/PAPFL-HIR(UASl) spaltes med Bglll. Efter ekstraktion med phenol og fældning med ethanol udfyldes de forskudte 25 3'-ender af DNA’et ved en reaktion med Escherichia coli-DNA-polymerase (Kl enow-fragment, Bethesda Research Laboratories) under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Maniatis et al. (se ovenfor). Enzymet inaktiveres ved 70°C i 10 minutter. DNA’erne spaltes yderligere med Sall, og de 30 store 7,2 kb-fragmenter isoleres ved elektroforese på en blød agarosegel, ekstraktion med phenol og fældning med ethanol. Hvert fragment opslæmmes i H2O til en koncentration på 0,05 pmol/fil. Fragmenterne indeholder hirudinkodningsområdet, størsteparten af vektorsekvenserne

1^1% I VW«/W v I

58 og den ene af to forskellige G APDH-promotorelementer isoleret fra pGAPDH-EL eller pGAPDH-FL.

Plasmid p31/Y (beskrivelsen til europæisk patentansøgning 5 nr. 100.561) spaltes med BstEII, inkuberes med Escherichia coli DNA-polymerase (Klenow-fragment) som beskrevet ovenfor og spaltes med Sall. 649 bp-fragmentet isoleres på en blød agarosegel og udvindes ved phenolekstraktion og fældning med ethanol.

10 0,3 pmol af 649 bp-fragmentet af p31/Y indeholdende UAS1-UAS2(PH05)-promotorelementet og 0,15 pmol af det ene af de to 7,2 kb-fragmenter ligeres og transformeres til Escherichia coli HB101 som beskrevet ovenfor. PIasmiderne fremstilles ud fra ampR-kolonier og analyseres ved 15 restriktionsspaltninger. Enkelte kloner udvælges, og deres plasmid DNA'er betegnes som pJDB207/PAPEL-HIR(UASl + UAS2) og pJDB207/PAPFL-HIR(UASl + UAS2).

Eksempel 6

En 31 bp DNA-sekvens er tilstrækkelig til at virke som et 20 phosphatkontrolelement

En 31 bp-sekvens fra modstrømsområdet af PH05-promotoren (position -381 til -351), fastlagt ved hjælp af de to flankeringssletninger Δ10 og Δ13 (se eksempel lf), kan muligvis indeholde et reguleringssignal. Dette kan afprøves 25 ved kemisk fremstilling af to komplementære oligonucleotider med følgende struktur: 5' -AATTCGAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCAG- 3' 3'- GCTTTATATATAATTTAATCGTGCAAAAGCGTCTTAA-5'

Denne sekvens Indeholder 31 bp sekvensen flankeret af EcoRI-restriktionssteder. EcoRI-stederne tillader let DK 175093 B1 59 polymerisation af sekvensen til dannelse af multimerer.

a) Kloning af 31 bp-elementet i vektor LT98 50 pmol af de to syntetiske oligonucleotider kinaseres hver 5 for sig i 20 ml 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,5 mM ATP og 20 E T4 polynucleotidkinase (Boehringer). Efter 45 minutter ved 37*C hældes de to reaktionsblandinger sammen, opvarmes i 10 minutter til 75°C, hvorpå blandingen henstilles til afkøling til stuetemperatur. De anellerede 10 oligonucleotider opbevares ved -20°C. 7,5 pmol af de kinaserede og anellerede oligonucleotider ligeres i 30 minutter som beskrevet ovenfor (eksempel 5III) i et samlet rumfang på 15 μΐ. Derefter adderes 5 μΐ LT98-vektor DNA spaltet med EcoRI [Dixon et al., Gene 25, 189 (1983)] (0,075 15 pmol), og inkuberingen fortsættes i i alt 6 timer. Efter transformation til Escherichia coli HB101 foretages isolering af plasmider, som analyseres ved spaltning med BamHI. Denne analyse giver oplysninger om den samlede længde af den indsatte del og muliggør at bestemme antallet af 20 EcoRI-fragmenter, som er klonet. Enkelte plasmider med 1, 2, 3, 4 eller 5 EcoRI-fragmenter selekteres, og DNA-sekvensering (Sangers metode) indicerer, at flere 31 bp elementer er klonet i hoved-til-hale-orientering.

b) Kloning i pJDB207 25 31 bp-oligomererne testes for promotorkontrolfunktionen ved indsætning af disse i modstrømsretningen i forhold til F-elementet for GAPDH-promotoren. Plasmid pJDB207/PAPFL-EGL(UASl) afkortes til dannelse af et plasmid, hvori UAS1-elementet er slettet: Plasmidet spaltes med Sall 30 og Bglll, renses på en gel, og det store vektorfragment isoleres. 1 en selvstændig reaktionsblanding spaltes det samme plasmid med BamHI. De skrå eller klæbrige 3'-ender udfyldes med Klenow-DNA-polymerase under anvendelse af 60 υκ i /&U93 m alle fire dNTP'er. Stederne med korte ender forlænges med phosphoryleret Bglll-linkere (CAGATCTG, Biolabs), og efter spaltning med Sall og Bglll isoleres et DNA-fragment med en 5 omtrentlig længde på 400 bp ved gelrensning. Det store vektorfragment ligeres med Sall-BgIII-fragmentet på omtrentlig 400 bp under anvendelse af T4-DNA-ligase. Efter Escherichia coli HBlOl-transformation og plasmidisolering fås et plasmid uden et PH05 UAS. Dette plasmid betegnes 10 pJDB207/GAPFL-EGL. Plasmidet spaltes med Bglll og tjener som en vektor til kloning af 31 bp oligomererne. LT98 indeholdende 1, 2, 3, 4 eller 5 oligonucleotidindsætningsdele spaltes med BamHl.

Fragmenterne med forskellig størrelse isoleres ved 15 gelrensning, hvorpå de hver for sig ligeres til pJDB207/GAPFL-EGL spaltet med Bglll. Ligeringsblandingen spaltes med Bglll til fjernelse af uønsket religeret vektor uden indsat DNA og anvendes derefter til at transformere Escherichia coli HB101. De opnåede plasmider analyseres ved 20 restriktionsanalyse med Sall og Dral (et sted i GAPDH-promotordelen). Efter transformation af gærstammen GRF18 bestemmes koncentrationen af eglin C som beskrevet i eksempel 4c. Efter 46 timers fermentering opnås følgende specifikke aktiviteter: 25 Klon Antal 31 bp- Orien- eglin C Kone.

PJDB207/ indsætnings- tering1 lav (mg/l/OD) dele høj PAP FLI (+) -EGL 1 -1 9,2 5,2 PAPFLI (-) -EGL 1 <- 10,2 2,1 30 PAPFLII( + )-EGL 2 -1 10,2 3,5 PAPFLIII( - )-EGL 3 «- 11,2 1,4 PAP FLIV (+) -EGL 4 10,7 1,5 PAPFLV (-) -EGL 5 <- 12,6 1,4 -» samme orientering som i PH05-promotor 35 <- modsat orientering i forhold til PH05-promotor DK 175093 B1 61

Eksempel 7

Ekspression af insulinliqnende vækstfaktor 1 (IGF-1) fra en PAPFL-promotor 5 Plasmid pAB113-IGF-l som beskrevet i beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 123.228 spaltes med Pstl. To syntetiske oligonucleotider (50 pmol) med formlerne henholdsvis

AATTCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCA og 10 GTACTCTAAAGGAAGTTAAAAATG

kinaseres og anelleres som beskrevet ovenfor. Den anellerede dobbeltstrengede adapter ligeres til plasmidet spaltet med Pstl, spaltes med EcoRI og BamHI, og EcoRI-BamHI-fragmentet på ca. 800 bp isoleres ved gelrensning. Plasmid 15 pJDB207/PAPFL-EGL( UAS1) spaltes med Sall og EcoRI, og fragmentet på ca. 700 bp isoleres ved gelrensning. Ved en tredje ligering ligeres 0,5 fig plasmid pCl/1 (beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 123.228, spaltet med BamHI og Sall, vektorgelrenset) med 100 ng af hver af henholdsvis 20 de to mindre gen- og promotordele. Efter Escherichia coli-transformation analyseres plasmiderne ved spaltning med EcoRI, BamHI og Sall. Transformation af gærstamme AB103 [deponeret ved ATCC under deponeringsnummeret 20.673, abortion af pYIGF-l-lO/1 ved hjælp af voksende vækstceller 25 i et komplekst medium natten over og testning af individuelle kolonier for forekomsten af IGF-1-piasmidet ved kolonihybridisering som beskrevet af Hinnen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)]] giver transformanter, som kun danner IGF-1 under inducerede (lav Pi) betingelser 30 (1 mg/1) som bestemt ved hjælp af konventionel kompetitiv radioimmunanalyse under anvendelse af radioaktivt mærket IGF-1 (Anderson et al. Somatomedins/Insulin-Like Growth Factors, Spencer, E.M., ed., Walter de Gruyter, Berlin).

62 DK 175093 Bl

Klonerne betegnes pCl/l/PAPFL-IGF-l/UASl).

Eksempel 8

Ekspression af vaevsplasmlnogenaktivator (t-PA) under 5 kontrol af en PH05-GAPDH-hybridpromotor (se fig. 10) 12 μg plasmid pJDB207/PH05-TPA18 (beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 143.081) spaltes fuldstændigt med restriktionsendonucleaser Sall og Hindlll. De dannede to DNA-fragmenter adskilles på en 0,8%'s agarosegel i 10 Tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3. Det lille 2,6 kb

SalI-HindlII-fragment isoleres ved elektroeluering, phenolekstraktion og ethanolfældning. DNA'et spaltes endvidere med Ball. 1,8 kb-fragmentet med en del af PH05-signalsekvensen, kodningssekvensen for t-PA og 15 PH05-terminatoren isoleres og renses som beskrevet ovenfor og opslæmmes i H2O til en koncentration på 0,1 pmol/ftl.

Hybridpromotorfragmentet isoleres fra plasmid pJDB207/PAPFL-HIR(UASl + UAS2) (se eksempel 5V). 12 pg plasmid DNA spaltes med Sall og Hindlll. Det dannede 1,5 20 kb-fragment spaltes yderligere med Ball. Et 920 bp-fragment indeholdende hybridpromotoren og en del af PH05-signal-sekvensen isoleres på en 1,5%'s agarosegel. DNA'et elektroelueres, ekstraheres med phenol, fældes med ethanol og opslæmmes i H2O til en koncentration på 0,1 pmol//tl.

25 0,2 pmol af 920 bp Sall-Ball-fragmentet, 0,2 pmol af 1,8 kb

Ball-Hindlll-fragmentet og 0,1 pmol af den med Sall og

Hindlll spaltede vektor pJDB207 ligeres i 16 timer ved 15*C i et samlet rumfang på 10 μΐ. En alikvot på 1 μΐ af ligeringsblandingen sættes til 100 μΐ calciumbehandlede, 30 transformationskompetente Escherichia coli HB101-celler.

DK 175093 B1 63 12 transformerede ampR-kolonier dyrkes hver for sig i LB medium indeholdende 100 /ig/ml ampicillin. Plasmid DNA fældes i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Holmes et al.

5 [Anal. Biochem. 114, 193, (1981)] og analyseres ved hjælp af restriktionsspaltninger med Pstl og BamHl/EcoRI. En klon med de forventede restriktionsfragmenter isoleres og betegnes pJDB207/PAPFL-TPA(UASl + UAS2).

En analog konstruktion gennemføres for UAS1(PH05)-elementet: 10 Et 820 bp Sall-Ball-fragment af pJDB207/PAPFL-HIR(UASl) (eksempel 5IV) isoleres og ligeres til 1,8 kb Ball-Hindlll-fragmentet, og vektoren spaltes med Sall og Hindlll. Det dannede plasmid betegnes pJDB207/PAPFL-TPA(UASl).

15 Analoge konstruktioner gennemføres med tilsvarende fragmenter isoleret fra pJDB207/PAPEL-HIR(UASl) eller pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1 + UAS2) (eksempel 5). De dannede plasmider betegnes pJDB207/PAPEL-TPA(UASl) og PJDB207/PAPEL-TPA(UAS1 + UAS2).

20 Eksempel 9

Ekspression af polypeptider under kontrol af PH05-GAPDH-hybridpromotorer a) Transformation af Saccharomyces cerevisiae GRF18:

Saccharomyces cerevisiae-stamme GRF18 (or, his3-ll, his3-15, 25 leu2-3, leu2-112, canR) transformeres med plasmiderne pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1) pJDB207/PAPFL-HlR(UASl) pJDB207/PAPEL-HIR(UASl + UAS2) pJDB207/PAPFL-HIR(UASl + UAS2)

30 pJDB207/PAPFLI(+)-EGL pJDB207/PAPFLI(-)-EGL PJDB207/PAPFLII(+)-EGL

UI\1f9USODI

64 pJDB207/PAPFLIII(-)-EGL pJDB207/PAPFLIV(+)-EGL pJDB207/PAPFLV(-)-EGL 5 pJDB207/PAPEL-TPA(UAS1) pJDB207/PAPFL-TPA(UASl) pJDB207/PAPEL-TPA(UAS1 + UAS2) PJDB207/PAPFL-TPA/UAS1 + UAS2) pCl/l/PAPFL-IGF-1(UAS1) 10 under anvendelse af transfonnationsmetoden beskrevet af

Hinnen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)]. Transformerede gærceller selekteres på gærminimalmedleplader, som har underskud af leucin. Enkelte transformerede gærkolonier isoleres og betegnes som følger: 15 Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPEL-HIR(UASl)

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJBB207/PAPFL-HIR(UASl) Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPEL-HIR(UASl) + UAS2)

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFL-HIR(UASl + 20 UAS2)

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFLI(+)-EGL Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFLI(-)-EGL Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFLII(+)-EGL Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFLIII(-)-EGL 25 Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFLIV(+)-EGL

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFLV(-)-EGL Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPEL-TPA(UASl) Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFL-TPA(UASl) Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPEL-TPA(UASl + 30 UAS2)

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFL-TPA(UASl + UAS2)

Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pCl/l/PAPFL-lGF-l(UASl) DK 175093 B1 65 b) Fermentering af transformanterne

Celler af Saccharomyces cerevisiae GRF18-transformanterne dyrkes hver for sig i 10 ml gærminimalmedium (Difco 5 gærnitrogenbasis uden aminosyrer tilsat 2% glucose og 20 mg/1 L-histidin) i en 50 ml Erlenmeyerkolbe med rystning ved 30*C i 24 timer til en tæthed på 3 x 10^ celler/ml. Cellerne vaskes i 0,9%'s natriumchloridopløsning og anvendes til inokulering af 50 ml lavt Pi-minimalmedium fremstillet i 10 overensstemmelse med sammensætningen af Difco gærnitrogenbasismediet (uden aminosyrer) men indeholdende 0,03 g/1 KH2PO4, 1 g/l KC1 og 10 g/1 L-asparagin i stedet for (NH4)2SC>4, 2% glucose og 1 g/1 L-histidin. Kulturerne inokuleres op til en celletæthed på 4 x 106 celler/ml og 15 omrøres ved 30°C i op til 42 timer med 200 o/m.

c) Koncentration af udtrykte genprodukter Gær udskiller desulphatohirudinforbindelser til dyrkningsvæsken. Efter fermentering i 22 timer udtages en 10 ml prøve fra dyrkningsmediet, hvorpå det opkoncentreres med 20 hensyn til proteiner ved af saltning og koncentrering på en Bond Elut C-18-søjle (1 ml, Analytichem International). Søjlen vaskes to gange med 1,5 ml vand-acetoni tril (9:1)-0,1%1s trifluoreddikesyre. Desulphatohirudin- forbindelserne elueres fra søjlen med vand-acetonitril-25 0,1%'s trifluoreddikesyre (6:4 r/r). 2 ml eluat koncentreres på et Speed Vac-koncentreringsapparatur (Savant) til et slutrumfang på 400 μΐ. Desulphatohirudin identificeres ved HPLC-analyse, ved sammenligning med autentisk desulphatohirudin og ved hjælp af 30 thrombininhiberingsprøven [jf. M.U. Bergmeyer (ed.), Methods in Enzymatic Analysis, bind II, s. 314-316, Verlag Chemie, Weinheim (DE) 1983 ].

Ulv 1 /OUbO O I

66

Resultaterne er vist i nedenstående tabel 1.

Tabel 1: Udskillelse af desulphatohirudin til dyrkningsvæsken fra Saccharomyces cerevisiae-stamme GRF18 5 transformeret med forskellige plasmider: desulphatohirudin plasmid [mg/1 dyrkningsvæske/OD5øo ] pJDB207/PAPEL-HIR(UASl) 2,0 10 pJDB207/PAPFL-HIR(UASl) 2,2 pJDB207/PAPFL-HIR(UASl + UAS2) 3,0 p JDB207/PAPEL-HIR( UAS1 + UAS2) 2,8 Vævpiasminogenaktivator (t-PA) akkumuleres i gærcellerne.

15 Celleekstrakter fremstilles, og t-PA-aktiviteten bestemmes på følgende måde: Celler fra 35 ml lavt Pi~dyrkningsmedium [B. Meyhack et al. EMBO-J. 1, 675 (1982)] ved en celletæthed på 1-2 x lO^/ml samles ved centrifugering i en Sorvall SS34-rotor i 10 minutter ved 3000 o/m. Cellerne vaskes i en 20 puffer indeholdende saltkomponenteme fra dyrkningsmediet (dvs. uden aminosyrer, glucose, vitaminer, sporelementer). Cellerne centrifugeres ved stuetemperatur i 5 minutter ved 3000 o/m. De bundfældede celler opslæmmes i et samlet rumfang på 4 ml kold 66 mM natriumphosphatpuffer pH 7,4 og 25 0,1% (r/r) "Triton" X-100. Cellesuspensionen overføres til et 30 ml Corex-rør, der tilsættes 8 g glasperler (0,4 mm i diameter), og suspensionen rystes på et hvirvelblandeapparatur (Scientific Instruments Inc., USA) med fuld hastighed i 4 minutter, hvorpå den afkøles i et 30 isbad. Mere end 90% af cellerne er oplukket ved denne behandling. Cellerester og glasperler aflejres ved centrifugering i 10 minutter ved 8000 o/m ved 4'C i en Sorvall HB-4-rotor. Supernatanten overføres til

Eppendorf-rør, fryses i flydende nitrogen og opbevares ved 35 -60eC.

DK 175093 B1 67 t-PA-Aktiviteten bestemmes under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Rånby [Biochim. Biophys. Acta 704, 461 (1982)] med små ændringer. D-Val-Leu-Lys-pNA (Kabi S-2251) 5 anvendes som substrat. Absorptionen ved 405 nro korrigeres for uspecifik spaltning og sættes i relation til en urokinasestandard. Resultaterne er anført i tabel 2.

Tabel 2: t-PA-Aktivitet i Saccharomyces cerevisiae-stamme GRF18 transformeret med forskellige plasmider: 10 t-PA-aktivitet [I.E./l plasmid gærcellekultur/ODgoo pJDB207/PAPFL-TPA(UASl) 300 pJDB207/PAPFL-TPA(UAS1 + UAS2) 200 15 ----—-

Eksempel 10

Isolering og karakterisering af IGF-1 fra en transformeret gærstamme a) Isolering af IGF-1 fra dyrkningsmediet: 20 Gærstamme pCl/l/PAPFL-lGF-l(UASl) dyrkes i 60 timer. 3 1 dyrkningsvæske høstes og centrifugeres som beskrevet i eksempel 9. Analyse ved hjælp af PRLC med omvendt fase af 2 ml supernatant (1:10 koncentration) giver en koncentration på 1 mg/1 IGF-1. Supernatanten behandles med 20 ml 25 "SP-Sephadex 025" (Pharmacia) ved pH 3,0 og omrøres i 60 minutter ved 4#C. Det adsorberede IGF-1 euleres fra den vaskede harpiks med en natriumacetatpuf fergradient (50 mM, pH 3,0 til 9,0) og renses yderligere ved 2 ionbyttertrin:

Det første trin gennemføres på en "CM-52"-søjle (Whatman, 30 1,5 x 8,5 cm, gradient, puffer A 20 mM NH4OAC pH 4,0, puffer B 100 mM NH4OAC pH 6,8). Det andet trin gennemføres på en 68

UIS. Ί f ouyj O I

"DE-53M-anionbyttersøjle (Whatman) (betingelser: 1,5 x 10,5 cm søjle, flow 1 ml/min., gradient, puffer A 20 mM NH4oaC Ph 9,0, puffer B 200 mM NH4OAC pH 6,5). -den afsluttende 5 rensning gennemføres på en semipræparativ RP-HPLC-søjle. Den aktive fraktion elueres med en retentionstid på 21,3 minutter, og man får 1,1 mg 95%’s ren IGF-1.

Betingelser: Vydac 218 TP 510 RP-HPLCsøjle, 10 x 250 mm, alikvote portioner (200 μΐ koncentreret 1:10) pr.

10 separation, AUFS 0,5 ved 220 nm, flow-rate: 3 ml/min.

Eluant: A: 0,1% trifluoreddikesyre, B: acetonitril/vand 8:2 + 0,07% trifluoreddikesyre, 3 minutter 35% B, derefter en forøgelse i løbet af 30 minutter til 45% B. De dannede fraktioner fortyndes 1:1 med vand og lyofiliseres.

15 b) Karakterisering af IGF-1 fra fermenteringen af stammen pCl/l/PAPFL-IGF-l(UASl)

Ifølge RP-HPLC-analyse er IGF-1 isoleret fra dyrkningsmediet (jf. eksempel 10a) identisk med autentisk IGF-1 fra serum.

Isoelektrlsk punkt pi:8,6 (Isoelektrisk fokussering, 20 TCA-fældning af proteinet).

Bestemmelse af aminosyresammensatnlngen

Omtrentlig 2,5 μg af det rene IGF-1 hydrolyseres i 24 timer med 6 N saltsyre ved 110*C, hvorpå der analyseres under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Chang et al.

25 [ DABS-C1-metode, Methods in Enzymology 91, 41 (1983)].

Hydrolysatet har følgende sammensætning: DK 175093 B1 69

Aminosyre Hydrolysat Aminosyre Hydrolysat

Asp 5,7 (5) Ile 0,7 (1) 5 Thr 3,2 (3) Leu 5,9 (6)

Ser 5,2 (5) Tyr 2,8 (3)

Glu 6,5 (6) Phe 3,9 (4)

Pro 5,3 (5) His

Gly 7,2 (7) Lys 3,0 (3) 10 Ala 6,1 (6) Arg 5,0 (6)

Val 2,7 (3) Met 0,9 (1)

Cystin 2,2 (3) Total (70)

Partiel sekvensanalyse 70 pg (10 nmol) ren IGF-1 underkastes en konventionel 15 sekvensanalyse ifølge Edman. De N-terminale PTH-aminosyrer bestemmes ved hjælp af RP-HPLC.

Resultater:

Cyklus 1 5 10

Aminosyre Gly-Pro-Glu-Thr-Leu-Cys*-Gly-Ala-Glu-Leu-20 Cyklus 11 15 20

Aminosyre Val-Asp-Ala-Leu-Gln-Phe-Val-Cys*-Gly-Asp-Cyklus 21 25 30

Aminosyre Arg-Gly-Phe-Tyr-Phe-Asn-Lys-Pro-Thr-Gly-Cyklus 31 35 40 25 Aminosyre Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Cyklus 41 45 50

Aminosyre Thr-Gly-Ile-Val-Asp-Glu-n.d.-n.d.-Phe-Arg- n.d.: ikke bestemt *: Cys (6) og Cys (18) er bestemt separat ved carboxy- 30 methylering med iodacetamid.

UIV Ί /DUyd D I ; 70

Den partielle sekvens fra aminosyre 1 til 50 er således identisk med den offentliggjorte primære sekvens for autentisk IGF-1.

5 C-Terminalanalyse

Det rene IGF-1 spaltes med carboxypeptidaase Y, og de frigjorte aminosyrer bestemmes i aminosyreanalysatoren (jf.

J.Y. Chang, R. Knedel, D.G. Braun, Biochem. J. 199, 547).

Resultater: 10 aminosyre 70 5 min. spaltning: -Ala 120 min. spaltning: Ser-Ala

Tilsyneladende molekylvægt IGF-1 (30 μς) analyseres på en SCS-urins tof gel [SUDS gel, 15 jf. Kyte et al., Anal. Biochem. 133, 515 (1983)]. Et enkelt bånd svarende til en tilsyneladende molekylvægt på 6000 -7000 Dalton iagttages.

Molekylvægtbestemmelse ved hjælp af FAB-MS

IGF-1 underkastes et såkaldt fast atom bombardment positive 20 ion mass spectrometry (FAB-MS). Apparat: ZAB-HF

massespektrometer fra VG-Analytical Ltd., Manchester, matrix: thioglycerol, Xenon bombardement, ionenergi 3 KeV, ydre kalibrering: CS30J29 (molekylvægt: 7667,4) t I ' empirisk formel: ^331^518^94^101^7 25 molekylvægt (beregnet): 7648,71 molekylvægt (fundet): 7648,07

Claims

1. BamHI-Clal-DNA-fragmentet mellem nucleotider -274 til -541 i PH05-gærgenet omfattende opstrømsaktiverings- 5 sekvensen UAS1(PH05) og subfragmenter deraf, hvori UAS-funk-tionen er bibeholdt.

2. DNA-fragment ifølge krav 1 med formlen

3. Clal-BstEII-DNA-fragment mellem nucleotider -174 til -273 i PH05-gærgenet omfattende opstrømsaktiveringssekvensen UAS2(PH05) og subfragmenter deraf, hvori UAS-funk-tionen er bibeholdt.

4. Fremgangsmåde til fremstilling af et DNA-fragment ifølge et af kravene 1-3 og subfragmenter deraf, hvori UAS-funktionen er bibeholdt, kendetegnet ved, at et DNA indeholdende PH05-gærgenet, PH05-gærgenet eller den 5'-terminale del deraf spaltes med restriktionsendonuclea-25 serne BamHI og Clal eller med Clal og BstEII, og eventuelt afkortes fragmenterne med en exonuclease på en sådan måde, at UAS-funktionen i det dannede subfragment bibeholdes, og fragmenterne eller subfragmenterne isoleres, eller DNA-fragmenterne eller -subfragmenterne fremstilles ved kemisk DNA-3 o syntese.

5. Gærhybridpromotor, som indeholder et 5'-opstrøms promotorelement, omfattende et DNA-fragment eller et subfragment deraf ifølge et af kravene 1-3, og et 3' - nedst rømspromo-35 torelement fra GAPDK-gærgenet begyndende ved nucleotid -300 til -180 og sluttende ved nucleotid -1 i GAPDH-genet. UW I /9U90 o 72

6. Hybridpromotor ifølge krav 5, kendetegnet ved, at 5'-opstrømspromotorelementet er 268 bp BamHI-C1al-fragmentet af 5'-området i PH05-gærgenet. 5

7. Hybridpromotor ifølge krav 5, kendeteg net ved, at 5'-opstrømspromotorelementet er 31 bp DNA'et med formlen

8. Hybridpromotor ifølge krav 5, kendeteg net ved, at 51-opstrømspromotorelementet er 100 bp Clal-

9. Hybridpromotor ifølge krav 5, kendeteg net ved, at 3'-nedstrømspromotorelementet omfatter nucleo-tider -199 til -1 i GAPDH-gærgenet. 20

10. Hybridpromotor ifølge krav 5, kendeteg net ved, at 3 * -nedstrømspromotorelementet omfatter nucleo-tider -263 til -1 i GAPDH-gærgenet.

10 GAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCA CTTTATATATAATTTAATCGTGCAAAAGCGT #

10 GAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCA CTTTATATATAATTTAATCGTGCAAAAGCGT omfattende opstrømsaktiveringssekvensen UAS1(PH05).

11. Fremgangsmåde til fremstilling af en gærhybridpro- motor, der indeholder et 51-opstrømspromotorelement, omfattende et DNA-fragment eller et subfragment deraf ifølge et af kravene 1-3, som er afledt af PH05-gærgenet, og et 3·-nedstrømspromotorelement fra GAPDH-gærgenet begyndende ved 30 nucleotider -300 til -180 og sluttende ved nucleotid -1 i GAPDH-genet, hvilken fremgangsmåde omfatter sammenføjning af PH05-gærgenet 5'-opstrømspromotorelement med GAPDH-gær-genets 3'-nedstrømspromotorelement. 35

12. Gærhybridvektor indeholdende et eller flere DNA- inserts, som hver især omfatter et DNA-segment, der koder DK 175093 B1 73 for et polypeptid heterologt med gær, under transkriptions-kontrol af en hybridpromotor bestående af et 5'-opstrømspromotorelement, som omfatter et DNA-fragment eller et subfrag-ment deraf ifølge et af kravene 1-3, der er afledt af PH05-5 gærgenet, og et 3'-nedstrømspromotorelement fra GAPDH-gær-genet, begyndende ved nucleotid -300 til -180 og sluttende ved nucleotid -1 i GAPDH-genet.

13. Hybridvektor ifølge krav 12, kendete g- 10 net ved, at den omfatter et 5'-opstrømspromotorelement ifølge et af kravene 6-8.

14. Hybridvektor ifølge krav 12, kendeteg net ved, at den omfatter et 3'-nedstrømspromotorelement 15 ifølge et af kravene 9 eller 10.

15. Hybridvektor ifølge krav 12, kendeteg net ved, at den indeholder en til fire DNA-inserts.

15 BstEII-fragmentet af 5'-området i PH05-gærgenet.

16. Hybridvektor ifølge krav 12, kendeteg net ved, at den indeholder en DNA-insert.

17. Hybridvektor ifølge krav 12, kendeteg net ved, at den er valgt blandt et hybridplasmid og en 25 lineær DNA-vektor.

18. Hybridvektor ifølge krav 12, kendeteg net ved, at den indeholder et DNA-segment, som koder for et polypeptid af højere eukaryotisk oprindelse. 30

19. Hybridvektor ifølge krav 12, kendeteg net ved, at gærhybridpromotoren er direkte forbundet med det modne polypeptids kodende område med en ATG indsats i sammenføjningsstedet. 35

20. Hybridvektor ifølge krav 12, kendete g- 74 net ved, at det polypeptidkodende område koder for et polypeptid, som indeholder et signalpeptid.

21. Hybridvektor ifølge krav 12, der er i stand til 5 at undergå replikation og fænotypisk selektion i en gær- værtstamme, omfattende en gærhybridpromotor og en DNA-se-kvens, som koder for et heterologt polypeptid, hvor denne DNA-sekvens sammen med transkriptions-start- og -termina-tionssignaler samt translations-start- og -stopsignaler er 10 anordnet i hybridvektoren under kontrol af hybridpromotoren, således at den udtrykkes i en transformeret gxrstamme til dannelse af polypeptidet.

22. Fremgangsmåde til fremstilling af en gærhybridvek-15 tor, der indeholder et eller flere DNA-inserts, som hver især indeholder et DNA-segment, der koder for et polypeptid heterologt til gær, under transskriptionskontrol af en hybridpromotor ifølge krav 5, omfattende sammenføjning af hybridpromotoren med et DNA-segment, som koder for et poly-20 peptid heterologt til gær, således at dette DNA-segment står under transskriptionskontrol af denne hybridpromotor, og eventuel indføring af et eller flere fremstillede lineære DNA*er i et vektor-DNA. 25

23. Gærvært, kendetegnet ved, at den er transformeret med en hybridvektor ifølge krav 12.

24. Gærvært ifølge krav 23, kendetegnet ved, at den er transformeret med en hybridvektor ifølge et 30 af kravene 12-21.

25. Transformeret Saccharomyces cerevisiae-stamme ifølge krav 23.

26. Fremgangsmåde til fremstilling af transformerede gærceller, som kan producere et polypeptid heterologt til DK 175093 B1 75 gær, hvilken fremgangsmåde omfatter transformering af gærceller med en hybridvektor ifølge krav 12.

27. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid 5 heterologt til gær, kendetegnet ved, at en gærstamme transformeret med en hybridvektor ifølge krav 12 dyrkes, og det udtrykte polypeptid isoleres.

28. Fremgangsmåde ifølge krav 27, kendete g- 10 net ved, at gærcellerne dyrkes i et væskemedium, som indeholder assimilerbare kilder for carbon, nitrogen, uorganiske salte og, om nødvendigt, vækstfremmende stoffer.

29. Fremgangsmåde ifølge krav 27, kendete g- 15 net ved, at DNA-sekvensen koder for et polypeptid af højere eukaryotisk oprindelse.

30. Fremgangsmåde ifølge krav 27, kendeteg net ved, at DNA-sekvensen koder for et polypeptid valgt 20 blandt et humant α-interferon, et humant hybridinterferon, human t-PA, HBVsAg, desulfatohirudin, eglin C og insulinlignende vækstfaktor.

31. Fremgangsmåde ifølge krav 27 til fremstilling af 25 eglin C.

32. Fremgangsmåde ifølge krav 27 til fremstilling af desulfatohirudin.

33. Fremgangsmåde ifølge krav 27 til fremstilling af human tPA.

34. Fremgangsmåde ifølge krav 27 til fremstilling af insulinlignende vækstfaktor. 35

35. Fremgangsmåde ifølge krav 27, kendete g- L/r\ I I ϋυ» D I 76 net ved, at gærværtsstanunen er en Saccharomyces cerevi-siae-stamxne.

36. Fremgangsmåde ifølge krav 27, kendete g-5 net ved, at der anvendes en hybridvektor ifølge et af kravene 12-21.

37. Fremgangsmåde ifølge krav 27, kendete g-n e t ved, at der anvendes en transformeret vært ifølge et 10 af kravene 23-25. i !