FI104637B - Uudet yhdistelmä-DNA-molekyylit sekä bakteeri- ja sieni-isännät yhdistelmäinterferonien ja pektiinilyaasien tuottamiseksi - Google Patents

Description

104637

Uudet yhdistelmä-DNA-molekyylit sekä bakteeri- ja sieni-isännät yhdistelmäinterferonien ja pektiinilyaasien tuottamiseksi

Keksintö koskee geenitekniikan aluetta ja antaa käyttöön uusia DNA-molekyylejä, jotka sisältävät DNA-sekvenssejä, jotka koodittavat useita Aspergillus nlqerin pektiinilyaaseja, ja/tai niiden promoottori-, signaali- ja terminaattori-sekvenssejä. Uudet DNA-molekyylit ovat käyttökelpoisia pek- 1 tiinilyaasien ylituotantoon Aspergilluksessa ja/tai hybridi-vektorien konstruointiin, jotka ilmentävät vieraita geenejä rihmastollisissa ja muissa sienissä. Nyt on mahdollista tuottaa yhtä ainoaa pektiinilyaasia, jota muut pektiinilyaa-sit eivät kontaminoi.

vaikkakin geenitekniikan menetelmissä jo tunnetaan lukuisia polypeptidiekspressiosysteemejä prokaryoottisille ja eukary-oottisille isännille, uusia systeemejä tarvitaan jatkuvasti, joilla voi olla etuja tunnettuihin systeemeihin nähden.

Hyvin laajalti käytettyjä ovat prokaryoottinen Escherichia coli -isäntä ja eukaryoottinen hiivaisäntä, esim. Saccharomy- ces cerevisiae, joita varten on kehitetty suuri määrä erilai- - siä ekspressiohybridivektoreita, enimmäkseen plasmideja. = coli -isäntien haittapuolia ovat, että ne eivät pysty gly- kosyloimaan muodostunutta polypeptidiä, ja että johtuen eri- 5 tyksen puuttumisesta, vieras peptidi voi kertyä isäntäsolun s • = sisään ja estää lisäkasvua. Hiivaisännät glykosyloivat, ne * eivät kuitenkaan E. colin tavoin eritä polypeptidejä ravinto-alustaan, lukuunottamatta hyvin pienikokoisia. Hiivat erittä- : vät ainoastaan periplasmiseen tilaan. Korkeampia eukaryootti-, siä isäntiä ovat nisäkkäiden syöpäsolut, jotka kykenevät gly- ^ . kosyloimaan ja erittämään ravintoalustaan, niiden viljelyn -” kuitenkin ollessa hyvin hidasta ja kallista, ja on olemassa vaara, että onkogeenisiä nukleiinihappoja eristetään yhdessä tavoiteltavan peptidin kanssa, joista nukleiinihapoista pep- i tidiä ei ehkä voida irrottaa.

2 104637

Etsittäessä muita isäntiä, on tutkittu myös rihmastollisia sieniä kuten Neurospora orassa, Aspergillus nidulans ja Aspergillus niger. Sellaisia sieniä käytetään jo laajalti teollisiin tarkoituksiin; niiden käyttö geenitekniikan menetelmissä on kuitenkin ajasta jäljessä, johtuen pääasiassa soveliaan transformaatiosysteemin puutteesta. Toisin kuin Saccharomyces cerevlsiae, rihmastolliset sienet eivät sisällä plasmideja, joita voitaisiin käyttää vieraiden geenien siirtämiseen ja fenotyyppiselektioon. Rihmastollisia sieniä on kuitenkin mahdollista transformoida vierailla plasmideilla, jotka sisältävät valikoivan merkkigeenin.

Kaikki tähän mennessä rihmastollisille sienille kuvaillut vektorit eivät kahdennu itsenäisesti kuten hiivojen vektorit, vaan yhdistyvät sienen kromosomiin. Tätä tapahtumaa esiintyy vain hyvin harvoin. Yhdistävä transformaatio tekee transformanteista toisaalta edullisesti mitoottisesti hyvin pysyviä, jopa ei-valikoivissa olosuhteissa. Enemmän kuin sata kopiota käsittävästä pysyvästä integraatiosta on raportoitu.

Ensimmäinen rihmastollisia sieniä varten kuvailtu vektori sisälsi Neurospora crassan qa-2 -geenin valikoivana markkeri-na. Tämä geeni koodittaa entsyymiä katabolinen dehydrogenaa-si, ja sitä voidaan käyttää N. crassan aro-mutanttien toimin-- nalliseen komplementaatioon [Case, M.E., Schweizer, M., Kush- ner, S.R. ja Giles, N.H. (1979) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76, 5259-5263]. Aro-mutantit eivät kykene kasvamaan minimaa-lialustalla ilman aromaattisen aminohapon lisäystä. N. crassan transformointi qa-2 -vektorilla tapahtui plasmidin yhden kopion integraatiolla kromosomiin. 30 % pysyvistä Aro+-integ-ranteista piti paikoillaan liittyneen qa-2 -geenin, yhä kytkeytyneenä bakteerisiin plasmidisekvensseihin [Case, M.E.

(1982), Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollander, A., DeMoss, D., Kaplan, S., Konisky, J., Savage, D. ja Wolfe, R.S., ed.), ss. 87-100, Plenum]. Tämän havainnon perusteella ei-selektiivisten DNA-sekvenssien yhteistransfor- j 3 104637 maatio yhdessä selektiivisten DNA-sekvenssien kanssa tuli mahdolliseksi.

Aspergillus nidulansilla, jolla on suvullinen kierto, ja joka siitä johtuen on sovelias klassisiin geneettisiin manipulaatioihin, on identifioitu sekä negatiivisia että positiivisia valikointisysteemejä. Joko käyttämällä heterologista DNA:ta N. crassasta tai homologista DNA:ta, A. nldulansin pyrG-mutanttien toiminnallinen komplementaatio saatiin aikaan transformoimalla plasmideilla, jotka sisälsivät pyrG-geenin (Ballance et ai. BBRC 112, 284 1983; Tilburn et ai. Gene 26, 205, 1983j. Muissa systeemeissä mutaatioita trpC- tai arqB-lokuksissa täydennettiin toiminnallisesti transformoimalla sopivilla plasmideilla [Yelton et ai. PNAS 81, 1470, 1984;

Yelton et Timberlake J. Cell. Biochem. Suppl. 9C 173, 1985;

Johnstone et ai. EMBO J. 4, 1307, 1983].

Vallitseva positiivinen valintasysteemi on myös kehitetty käyttäen hyväksi amdS-geeniä, joka on eristetty A. nidulan-sista, joka geeni mahdollistaa sillä transformoidun A. nige-rin kasvun asetamidi ainoana typenlähteenä (Tilburn et ai.,

Gene 2jS, 205, 1983; Wernars et ai., Curr. Genet. 9, 361, 1985; Kelly, J.M. et ai., EMBO J. 4, 475, 1985). \ 9

Verrattuna N. orassaan tai A. nidulanslin, A. nlger on verrattomasti tärkeämpi organismi. Sitä käytetään laajalti entsyymien teollisessa tuotannossa, esim. elintarviketeollisuuden käyttöön. A. niger poikkeaa A. nidulansista erityskapa- r siteetin puolesta siten, että se erittää suuren määrän hydro- [ . ΐ lyyttisiä entsyymejä, esim. glukoamylaasia, a-amylaasia, pektinaasia, sellulaasia, β-glukanaasia, fl-galaktosidaasia, ; naringinaasia, pentosanaasia, hapanta proteaasia ja lignaa- sia, glukoamylaasin ja pektinaasikompleksin ollessa tärkeimmät .

r i A. nlgerlllä ei ole suvullista kiertoa. Mutaatioita ei ‘ siitä johtuen voi tuottaa meioottisten rekombinaatioiden 4 104637 kautta. Klassisen mutaation ja valikoimismenetelmien avulla voidaan kuitenkin saada aikaan kantojen laajaperäisiä parannuksia koskien hydrolyyttisten entsyymien eritystä.

A. nlqerin entsyymien geeneistä vain glukoamylaasin (Boel et ai. EMBO J. 3, 1581, 1984) ja alkoholi- ja aldehydidehydro-genaasin (WO 86/06097) geenejä, yhdessä niiden promoottori-ja signaalisekvenssien kanssa, on karakterisoitu ja käytetty transformaatiokokeissa A. nidulansin ja vastaavasti A. niger-in kanssa.

Valikoinnin markkereina A. nlqerin osalta on käytetty hetero-logista amds-geeniä (Kelly ja Hynes, EMBO 3. 4, 475, 1985), ja arqB-geenlä (Buxton et ai., Gene 37, 207, 1985; EP 184 438; WO 86/06097), molemmat saatuina A. nidulansilta.

A. niqer on tärkein organismi pektiiniä hajottavien entsyymien teolliseen tuotantoon. Pektiinit ovat suurimolekyylipai-noisia (20000-40000 D) polygalakturonldeja, jotka koostuvat a-1,4-glykosidisidoksellisista D-galakturonihapon polymeereistä, ja niitä esiintyy luonnossa korkeampien kasvisolujen aineosina, joissa ne ovat liittyneinä selluloosamolekyylei-hin, joita pääasiassa tavataan primäärisoluseinässä ja keskikerroksessa. Rikkaimpiin pektiinilähteisiin kuuluvat sitruunan ja appelsiinin kuori, joka sisältää noin 30 % tätä polysakkaridia. Pektiinientsyymit hajottavat hiilihydraatti-polymeerisubstraattia joko a-1,4-glykosidisidoksen (polyga-lakturonaasi) hydrolyysin kautta tai tyydyttymättömän a-4,5-galakturonihappotähteen transeliminaatiolla pektiinimolekyy-listä (eri pektiinilyaaseja). Pektiinilyaasin systemaattinen nimi on pektiinitranseliminaasi (EC 4.2.2.10).

A. niqerissä pektiinientsyymikompleksin proteiinit eivät ilmenny konstitutiivisesti. Indusoivissa olosuhteissa, käytettäessä pektiiniä tai sen hajoamistuotteita, A. niger ilmentää edellä mainittuja entsyymejä, mukaanlukien PLI, kun 5 104637 muita hiilenlähteitä, kuten glukoosi tai sakkaroosi, on rajoittavasti. Pintaviljelmissä pektiinientsyymit pyrkivät pysymään ulomman soluseinän yhteydessä. Pektiinin ja Ca2+:n pitoisuuksien nostaminen alustassa johtaa täydelliseen erittymiseen.

Pektinaaseja kuten PLI käytetään elintarviketeollisuudessa pääasiallisesti hedelmämehujen kirkastamiseen.

F.E.A. Van Houdenhoven (22) on puhdistanut ja osittain karakterisoinut A. nlqeristä kaksi erilaista pektiinilyaasia, PLI ja PLII. PLI sisältää neljä mannoositähdettä, kun taas PLII sisältää mannoosia ja glukoosia kumpaakin kaksi tähdettä. Entsyymeillä on erilaiset molekyylipainot (PLI: 37,5 kD, PLII: 36 kD). PLI:n aminohapposekvenssi on määritetty, ja se tuodaan esille julkaisussa EP 88 101 397,3. Tämä keksintö perustui pektiinilyaasi I:n (PLI) osarakenteen määrittämiseen, mikä mahdollisti DNA-koettimien synteesin, jotka koo-dittavat proteiinin merkityksellisiä osia. DNA-koettimien avulla oli mahdollista seuloa ja eristää PLI:tä koodittavaa DNA:ta, lopulta yhdessä sen pre- ja postsekvenssien kanssa, A. nlgerln geenikirjastosta.

Hybridisoimalla osia PLI-geenistä A. niqerin genomiseen kirjastoon, PL-geenejä on havaittu lisää, jotka ovat esillä Ξ olevan keksinnön mukaisena kohteena. A. nlqer N756:sta saatu ? PLI:n rakennegeeni, joka sisältää viereisen alueen N-pään puolella, on N-päästään identtinen PLD-geenin kanssa, joka on saatu A. niqer N400:sta. Jälkimmäinen ei niin muodoin ole ϊ osana esillä olevaa keksintöä. Esillä oleva PLA näyttää ole van osa aikaisemmin puhdistetusta PL-seoksesta nimeltä PLII.

...... .. _ r · Tämän jälkeen PLI:tä nimitetään myös PLD:ksi, ja PLI:n raken-negeeniä nimitetään pelD:ksi.

Keksinnön kohteina ovat yhdistelmä-DNA-molekyylit, jotka käsittävät DNA-sekvenssejä, jotka koodittavat uusia pektii- L

6 104637 nilyaasin ekspressiosysteemejä ja niiden johdannaisia, kuten esimerkiksi mainittujen pektiinilyaasien rakennegeenejS ja vastaavia säätelysekvenssejä, esim. promoottori-, signaaleja terminaattorisekvenssejä, ja hybridivektorit, jotka sisältävät vastaavia DNA-sekvenssejä, mukaanlukien hybridivektorit, jotka sisältävät DNA:ta, joka koodittaa homologisia tai heterologisia polypeptidejä, isännät, erityisesti rihmastolliset sienet, esim. Aspergillus-isännät, jotka on transformoitu mainituilla vektoreilla, menetelmät mainittujen yhdis-telmä-DNA-molekyylien ja mainittujen isäntien valmistamiseksi ja yhdistelmä-DNA-molekyylien käyttö uusien ekspressio-systeemien valmistamiseksi. Tarkoituksena on lisäksi polypep-tidien valmistaminen mainittujen DNA-molekyylien ja mainittujen isäntien avulla.

Uudet pektiinilyaasiekspressiosysteemit käsittävät DNA-sek-venssejä, jotka koodittavat mainittujen uusien pektiinilyaa-sigeenien promoottoreja, signaalisekvenssejä, rakennegeenejä ja terminaattoreita. Uudet pektiinilyaasit ovat nimeltään PLA, PLB, PLC, PLE ja PLF.

Eräs esillä olevan keksinnön mukainen kohde on erityisemmin hybridivektoreiden konstruointi, jotka sisältävät DNA-sekvenssejä, jotka koodittavat PLA:n, PLB:n, PLC:n, PLE:n ja PLF:n promoottoreja, valinnaisesti näiden proteiinien signaa-lisekvenssiä, ja valinnaisesti niiden terminaattoreita. Näitä hybridivektoreita käytetään tiettyjä proteiineja koodattavien geenien liittämiseksi ja rihmastollisten sienten transformoitiin, kuten Aspergillus, Penlcillium ja Cephalosporlum.

A. nlgerin yhteistransformointi kahden eri plasmidin kanssa voidaan suorittaa, jossa yhteydessä toinen plasmideista valitaan ryhmästä, joka sisältää keksinnön mukaisia uusia hybridivektoreita, ja toinen plasmidi on erityisesti konstruoitu valikoimisplasmidi, joka toimii rihmastollisen sienen muta-toidun kannan yhteydessä.

a 7 104637

Esillä oleva keksintö koskee myös mainittujen uusien pektii-nilyaasien ylituotantoa Aspergillus-lajelssa, ja yhtä laatua edustavien PL:ien tuotantoa, joita muut PL:t eivät kontami-noi, tai niiden ennaltamäärättyjen keinotekoisten seosten ? tuotantoa.

Esillä oleva keksintö koskee lisäksi minkä tahansa proteiinin tuotantoa, jonka rakennegeeni voidaan ilmentää esillä olevien yhdistelmä-PL-DNA-molekyylien läsnä ollessa tai niiden säätelyn alaisena.

Keksinnön'mukaiset eri kohteet käyvät selvemmin ilmi seuraa-, vasta keksintöä koskevasta yksityiskohtaisesta kuvauksesta.

Yhdistelmä-DNA-molekyylit

Erityisemmin esillä oleva keksintö koskee yhdistelmä-DNA -molekyyliä, joka sisältää DNA-sekvenssin, joka koodittaa pektiinilyaasien PLA, PLB, PLC, PLE tai PLF ekspressiosystee-mejä tai niiden johdannaista.

Ilmaisu "ekspressiosysteemi" tarkoittaa DNA-sekvenssiä, joka pystyy ilmentämään polypeptidin ja käsittää promoottorin, signaalisekvenssin, rakennegeenin ja terminaattorin.

m

Ilmaisu "johdannainen", käytettynä uusien DNA-sekvenssien i yhteydessä, on tarkoitettu sisältämään suurempia johdannaisia, jotka sisältävät niiden viereisiä sekvenssejä, mainitun DNA-sekvenssin paloja, mutantteja, erityisesti luonnollisina esiintyviä mutantteja, ja DNA-sekvenssejä, jotka ovat dege-11 neroituneita geneettisen koodin mukaisesti.

' Uusien yhdistelmä-DNA-molekyylien suuremmat johdannaiset ovat leikattavissa A. nlgerin genomista ja käsittävät kuvioissa 1-3, 5 ja 6 esitettäviä DNA-sekvenssejä, jollaisia voi löytää A. nlger N400:n genomisesta kirjastosta, joita on saatu nukleiinihappoja pilkkomalla, käsittelemällä paloja r β 104637 sopivalla restriktioentsyymillä, esim. EcoRI, BamHI tai Hin-dlll, liittämällä sopivaan vektoriin, esim. lambda-fagi ja plasmidi pBR322, kloonaamalla esim. E. colissa, ja leikkaamalla taas samalla restriktioentsyymillä. Sellaisia johdannaisia ovat esim. kuvioissa 1, 2, 3, 4, 5 ja 6 esitetyt plas-midien pGW820, pGW830, pGW840, pGW850, pGW860 ja pGW880 in-sertit.

Kaavan I (kuvio 9) mukaisen DNA-sekvenssin palat ovat niitä, jotka levittäytyvät näiden plasmidien kahden restriktiokohdan väliin, ja jotka pitävät yllä promoottori-, signaali-, rakenne- tai terminaattoritoimintoja.

Edullisia paloja ovat sellaiset, jotka sisältävät promootto-risekvenssin, signaalisekvenssin, uuden PL:n rakennegeenin tai terminaattorisekvenssin, tai minkä tahansa niiden yhdistelmän .

DNA-sekvenssin palaset voivat sisältää linkkereitä, jotka huolehtivat onnistuneesta kytkennästä muihin DNA-molekyyleihin .

PL-promoottorisekvenssi sijaitsee DNA-alueella ennen rakenne-geeniä ja sisältää määrältään noin 2000:een saakka, edulli-sesti noin 1000-1400:aan saakka nukleotidejä. pGW820:ssä promoottori sijaitsee sekvenssissä, joka on Sali (1240)- ja PstI (2420)-restriktiokohtien välissä. Promoottorisekvenssil-le TATAA-kehykset ovat tärkeitä RNA-polymeraasin tunnistus-kohtina. pelA:ssa TATAA-kehys sijaitsee kohdassa 1221 (kuvio 10), pelB:ssä kohdassa 951 (kuvio 11) ja pelC:ssä kohdassa 1261 (kuvio 12). Lyhyet promoottorit TATAA-kehysten ympäriltä signaalisekvenssien alkuun saakka ovat erityisen kiinnostavia » j polypeptidien ei-indusoidun ilmentämisen kannalta. Jos tarvi taan pektiini-indusoitua ilmentämistä, sekvenssit TATAA-kehysten yläpuolella ovat välttämättömiä promoottorin voimakkuuden säätelemiseksi. Sopivia linkkereitä voidaan liittää näihin palasiin.

9 104637 A. nigerin PLI:n promoottori on indusoituva, so., siihen kiinnittyneen rakennegeenin ilmentymistä, esim. rakennegeeni, joka koodittaa PLiää tai mitä tahansa vierasta geeniä, indusoi pektiinin tai pektiinin hajoamistuotteiden lisääminen alustaan. Pektiinin puuttuessa ja riittävän glukoosimäärän läsnä ollessa promoottori ei ole toimiva. Jos geenin yläpuoliset säätelysekvenssit puuttuvat, promoottorista tulee konstitutiivinen.

DNA, joka koodittaa signaalisekvenssiä, levittäytyy promoottorin loppupään ja valmista toimivaa proteiinia koodittavan sekvenssin alkupään väliin. PLA.-ssa ja PLB:ssä signaalisek-venssi sisältää noin 20 aminohappoa, pelC:ssä noin 18 aminohappoa. Vastaava kooditusalue ulottuu pelA:ssa ATG-kodonista kohdasta 1361 alaspäin Pstl-katkaisukohtaan kohdassa 1420, pelB:ssä kohdasta 1134 vähintään kohtaan 1191, ja peleissä kohdasta 1368 kohtaan 1422.

Kuten käy selville kaavoista I, II ja III, PLAin, PLBin ja PLCin rakennegeenit sisältävät useita introneita. Rakenne-geenit voivat sisältää myös sopivia linkkereitä.

Terminaattorit alkavat lopetuskodoneista, esim. TAA, ja saattavat ulottua yhteen restriktiokohtaan saakka mainittujen sekvenssien sisällä olevista restriktiokohdista. Termlnaatto-ripala sisältää vähintään 300 emäsparia (bp) ja voi sisältää sopivia linkkereitä.

Edellä mainittuihin paloihin sopivat linkkerit sisältävät r DNA-sekvenssin, joka sopii siihen DNA:n restriktiokohtaan, johon pala on tarkoitus kytkeä. Ne voivat sisältää ennalta 7 määritellyn restriktiokohdan.

Keksinnön mukaisen DNA-sekvenssin palaset ovat myös sellai sia, jotka koostuvat pienemmistä paloista, esim. sellaisia, jotka sisältävät promoottorin, promoottorin ja signaali- tai 10 104637 rakennesekvenssin, signaali- ja rakennesekvenssin, tai raken-negeenin ilman introneita, ja vastaavia.

Keksinnön mukaisen DNA-sekvenssin mutantit ovat esimerkiksi luonnollisina esiintyviä mutantteja. Keksinnön piiriin kuuluu myös signaalisekvenssin luonnollisia tai synteettisiä mutantteja, joiden hydrofobisuusprofiili on samankaltainen tai identtinen, esim. jossa yhteydessä kodonit polaarisille aminohapoille lysiini (Κδ+), tyrosiini (Υδ“) ja arginiini (R6+) vaihdetaan muiden aminohappojen kodoneihin, joilla on samanlaiset varaukset, ja hydrofobisten aminohappojen alaniini (A), leusiini (L) ja treoniini (T) kodonit korvataan muiden hydrofobisten aminohappojen kodoneilla. Esimerkiksi, positiivisesti varautuneen lysiinin kodoni voidaan korvata arginii-nin kodonilla ja päinvastoin, negatiivisesti varautuneen tyrosiinin kodoni glutamiinihapon tai asparagiinihapon kodonilla, ja/tai ei-polaarisen, hydrofobisen alaniinin kodoni jollakin kodoneista treoniinille, proliinille, valiinille, isoleusiinille, leusiinille, metioniinille tai fenyylialanii-nille, ja vastaavasti. Muut mutaatiot ovat "ei-toimivia mutaatioita" (silent mutations), joissa yksi tai muutama, esim. noin 30:een saakka, muu nukleotidi korvataan yhdellä tai useammalla muulla nukleotidilla, jolloin uudet kodonit koodittavat samaa aminohappoa (aminohappoja).

m ' Keksinnön mukaiset DNA-sekvenssit, jotka ovat degeneroitunei ta, ovat ei-toimivien mutaatioiden tavoin sellaisia, jotka ovat degeneroituneita geneettisen koodin merkityksessä siten, että rajoittamaton määrä nukleotidejä korvataan muilla nukleotideillä muuttamatta niiden koodittamaa aminohapposekvenssiä. Sellaiset degeneroituneet DNA-sekvenssit voivat olla käyttökelpoisia niiden erilaisten restriktiokohtien vuoksi. ,

Yhdistelmä-DNA-molekyylit, jotka sisältävät keksinnön mukaisen DNA-sekvenssin tai sen johdannaisen, ovat erityisesti yhdistelmä-vektoreita, vaihtoehtoisesti nimeltään hybridivek- 104637 11 toreita, jotka sisältävät sellaisia DNA-sekvenssejä insert-teinä. Ne ovat käyttökelpoisia kloonaukseen isännissä kuten bakteerit, sienet tai eläinsolut. Sellaisia hybridivektoreita saadaan mistä tahansa geenitekniikan alan käyttökelpoisesta vektorista kuten fagit, kosmidit, plasmidit tai kromosomaali-nen DNA, kuten esimerkiksi lambda-fagin johdannaiset, esim.

NM989, tai M13-fagi, esim. M13mp8-fagin DNA (ref. 15), joka * on tehty lineaariseksi BamHI-hydrolyysillä, bakteeriplasmi-dit, esim. pBR322, pUN121, pUC18, tai hiivaplasmidit, esim. hiivan 2y-plasmidi, tai myös kromosomaalinen DNA, joka on peräisin esim. Asperqilluksesta, esim. A. niqer, esimerkiksi EP 184 436:ssa annetut, tai vajaavaiset fagit tai vajaavaiset plasmidit auttaja-fagin tai auttaja-plasmidin läsnä ollessa, jotka mahdollistavat mainittujen vajaavaisten fagien tai plasmidien kahdentumisen, esim. M13(+)KS-vektori esim. M13K07-auttajafagin läsnä ollessa.

Keksinnön mukainen hybridivektori sisältää, keksinnön mukaisten DNA-sekvenssien tai niiden johdannaisen lisäksi, kahden- .

tumiskohdan ja valinnaisesti, riippuen DNA-johdannaisen tyy- j pistä, ilmentymisen kontrollisekvenssin, kuten tehostajasek-venssin (enhancer), yläpuolisen aktivointikohdan, promoottori- ja signaalisekvenssin, ja/tai rakennegeenin, jotka ovat | erilaisia kuin vastaavat esillä olevat A. niqer-peräiset , sekvenssit. Sellainen tehostajasekvenssi voidaan saada Physa- rum polycephalumin (PCT/EP 8500278) ekstrakromosomaalisesta ribosomaalisesta DNA:sta, tai se voi olla geenin yläpuolinen aktivointikohta happamen fosfataasin PH05-geenistä (EP-Hak. n:o 86 111 820,6), tai PH05, trp, PH05-GAPDH -hybridi (EP- 1 » Hak. n:o 86 lii 820,6), tai vastaava promoottori.

Esillä oleviin promoottori-, signaali- ja/tai terminaatto-risekvensseihin liitetyt rakennegeenit ovat, paitsi niitä, jotka koodittavat pektiinilyaaseja PLA, PLB, PLC, PLE ja PLF intronien kanssa tai ilman, myös homologisia muita pektiini- r*

lyaasigeenejä, esim. PLD (tai PLI-)-geeni, tai muita Asper- I

104637 12 gillus-geenejä ja heterologisia rakennegeenejä, jotka ovat lähtöisin viruksista, prokaryoottisista soluista tai eukary-oottisista soluista, ja jotka voivat olla peräisin genomises-ta DNA:sta tai cDNA:sta, jota on valmistettu mRNA-reitin kautta, tai se voi olla syntetisoitu kemiallisesti, jotka koodittavat laajaa, käyttökelpoista polypeptidijoukkoa, mukaanlukien glykosyloidut polypeptidit, erityisesti korkeammista eukaryoottisista, erityisesti nisäkkäästä, kuten eläimestä tai erityisesti ihmisestä lähtöisin olevia, kuten esimerkiksi entsyymit, joita voidaan käyttää, esimerkiksi, ravintoaineiden tuotantoon ja entsyymireaktioiden suorittamiseen kemiassa, tai polypeptidit, jotka ovat käyttökelpoisia ja arvokkaita ihmisten ja eläinten tautien hoidossa tai nii-den estämisessä, esimerkiksi hormonit, polypeptidit, joihin liittyy immunomodulatorisia, antiviraalisia ja antituumorisia ominaisuuksia, vasta-aineet, virusantigeenit, rokotteet, hyytymätekijät, elintarvikkeet ja vastaavat.

Esimerkkejä sellaisista heterologisista rakennegeeneistä ovat esim. ne, jotka koodittavat hormoneja kuten sekretiini, ty-mosiini, relaksiini, kalsitoniini, luteinisoiva hormoni, lisäkilpirauhashormoni, adrenokortikotropiini, melanosyyttiä stimuloiva hormoni, β-lipotropiini, urogastroni tai insuliini, kasvutekijöitä kuten epidermaalinen kasvutekijä, insulii-. nin kaltainen kasvutekijä (IGF), esim. IGF-I ja IGF-II, syöt tösolun kasvutekijä, hermon kasvutekijä, hermotukikudosperäi-nen hermosolun kasvutekijä, tai transformoiva kasvutekijä (TGF) kuten TGFB, kasvuhormoneja kuten ihmisen ja naudan kasvuhormonit, interleukiinia kuten interleukiini-1 tai -2, ihmisen makrofagin siirtymistä ehkäisevää tekijää (MIF), interferoneja kuten ihmisen α-interferoni, esimerkiksi inter-feroni-aA, aD tai aF, β-interferoni, γ-interferoni tai hybridi-interferoni, erityisesti hybridi-interferoni BDBB, pro-teinaasin inhibiittoreita kuten a1-antitrypsiini, SLPI ja vastaavat, hepatiittivirusantigeenejä kuten hepatiitti B -viruksen pinta- ja ydinantigeenit tai hepatiitti A -viruksen 13 104637 antigeeni tai hepatiitti eiA-eiB-antigeeni, plasminogeenin aktivaattoreita kuten kudoksen plasminogeenin aktivaattori tai urokinaasi, tuumorin nekroositekijä, somatostatiinia, renniiniä, β-endorfiiniä, immunoglobuliineja kuten immunoglo-buliinien D, E tai G kevyt- ja/tai raskasketjut, tai ihminen-hiiri -hybridi-immunoglobuliinit, immunoglobuliinia sitovaa tekijää kuten immunoglobuliini Eitä sitova tekijä, kalsito-niinia, ihmisen kalsitoniiniin liittyvää peptidiä, veren hyytymistekijöitä kuten tekijä IX tai ville, erytropoietiinia, egliiniä kuten egliini C, hirudiinia, desulfaattihirudiinia kuten desulfaattihirudiinin variantit HV1, HV2 tai PA, ihmisen superoksididismutaasia, viraalista tymidiinikinaasia, β-laktamaasia, glukoosi-isomeraasia. Edullisia geenejä ovat ne, jotka koodittavat ihmisen α-interferonia tai hybridi-interferonia, ihmisen kudoksen plasminogeenin aktivaattoria (t-PA), hepatiitti B-viruksen pinta-antigeeniä (HBVsAg), insuliinin kaltaista kasvutekijää I ja II, egliini Citä ja desulfatohirudiiniä, esim. variantti HV1. Esillä olevan . keksinnön mukaisissa hybridivektoreissa esillä oleva promoot tori- ja/tai signaalisekvenssi on toiminnallisesti kytkeytynyt polypeptidiä koodittavaan alueeseen, jotta polypeptidin ~ tehokas ilmentyminen varmistuisi.

Esillä olevan keksinnön mukaiset DNA-molekyylit voivat sisäl- " tää selektiivisiä markkereita riippuen isännästä, joka on tarkoitus transformoida, valikoida ja kloonata. Mitä tahansa * merkkigeeniä voidaan käyttää, joka helpottaa transformanttien valikointia markkerin fenotyyppisen ilmentymisen ansiosta.

Sopivia markkereita ovat erityisesti sellaiset, jotka ilmen- = tävät antibioottiresistenssiä, esim. tetrasykliiniä tai am-. pisilliiniä vastaan, tai auksotrofisten hiivamutanttien ol lessa kyseessä, geenit, jotka korjaavat isännän virheitä.

Vastaavat geenit antavat esimerkiksi resistenssin antibiootille sykloheksimidi, tai saavat aikaan prototrofian auksot- r rofisessa hiivamutantissa, esim. ura3, leu2, his3 tai trpi-qeeni. Markkereina on myös mahdollista käyttää rakenne- 1 104637 14 geenejä, jotka ovat yhdistyneet itsenäisesti kahdentuvaan osaseen, edellyttäen että transformoitava isäntä on auksotrofinen markkerin ilmentämän tuotteen osalta.

Erityisen tärkeitä ovat merkkigeenit, jotka korjaavat A. nicjer-isännän virheitä, kuten argB-geenl, joka koodittaa ornitiinikarbamoyylitransferaasia, esim. peräisin A. nigerls-tä tai A. nldulansista (EP 184 438), tai A. nidulansin DNA-palat, jotka ovat homologisia N. crassan pyr4-geenln kanssa (26) .

Esillä olevan keksinnön mukaisia edullisia suoritusmuotoja ovat hybridivektorit, joissa rakennegeeni, erityisesti hete-rologinen rakennegeeni on toimivasti kytkettynä esillä olevan keksinnön mukaisiin promoottori- ja signaalisekvensseihin. Sellainen edullinen hybridivektori on esim. pUC19/pelA-IFN AM119. Toinen sellainen edullinen hybridivektori on esim.

Ml 3(+ )KS/pelA-IFN AM119.

* Toisessa esillä olevan keksinnön mukaisessa suoritusmuodossa rakennegeeni, erityisesti heterologinen rakennegeeni on toimivasti kytkettynä suoraan esillä olevan keksinnön mukaisiin promoottorisekvensseihin. Sellainen edullinen hybridivektori on esim. M13(+)KS/pelAÄ-ss-IFN AM119.

Keksinnön mukaisia DNA-molekyylejä ja niiden johdannaisia, mukaanlukien palaset, voidaan käyttää DNA-geenipankkien tai mRNA:n seulontaan samanlaisten toisten DNA- tai mRNA-molekyy-lien osalta.

Yhdistelmä-DNA-molekyylien valmistusmenetelmä

Keksintö koskee myös menetelmää yhdistelmä-DNA-molekyylin valmistamiseksi, joka koodittaa pektiinilyaasin PLA, PLB, PLC, PLE tai PLF ekspressiosysteemiä tai sen johdannaisen valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää sen, että viljellään isäntää, joka on transformoitu DNA-molekyylillä, joka sisäl- 104637 15 tää DNA-molekyylin, joka koodittaa pektiinilyaasin ekspres-siosysteemiä tai sen johdannaisella, ja eristetään tavoiteltu yhdistelmä-DNA-molekyyli tai sen johdannainen, tai että se valmistetaan in vitro -synteesillä.

F

Isäntien viljely suoritetaan tavanomaisessa ravintoalustassa, johon voi olla lisättynä kemiallisia yhdisteitä, tai ne voivat puuttua siitä, mikä mahdollistaa transformanttien negatiivisen tai positiivisen valikoinnin, so. sellaisten isäntien, jotka sisältävät halutun DNA-molekyylin yhdessä valin-tamarkkerin kanssa, valikoinnin ei-transformanteista, so. sellaisista isännistä, joista puuttuu haluttu DNA-molekyyli.

Mitä tahansa alalla käyttökelpoisia isäntiä voidaan käyttää, esim. bakteereja kuten E. coli, sieniä kuten Saccharomyces cerevisiae, tai erityisesti rihmastollisia sieniä kuten Aspergillus, esim. A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius, A. awamori ja erityisesti A. niger. Edullinen isäntä on A. nlqer . An8, uusi mutantti, jolta puuttuu pyrA-geeni, jota kuvaillaan lisää jäljempänä. Isäntien transformointi suoritetaan tavanomaisilla menetelmillä.

DNA-sekvenssi, joka koodittaa PL-ekspressiosysteemiä, saadaan rihmastollisesta sienestä, joka sisältää sellaisen systeemin, erityisesti sen genomisesta kirjastosta tai myös mRNArn kautta.

Esillä olevien PL-ekspressiosysteemien valmistusta kuvaillaan seuraavassa yksityiskohtaisemmin.

*

Genominen kirjasto voidaan valmistaa esim. pilkkomalla osit-- tain A. niger -kannan, esim. N756 tai N400, genomista DNA:ta esim. Sau3AI:n tai MboI:n avulla, ja kloonaamalla suurimole-kyylipainoiset DNA-palaset sopivaan isäntävektoriin, esim.

E. colin plasmidi pUN121 tai lambda-vektori, esim. EMBL4.

Mikä tahansa muu A. niger-kanta, joka tuottaa haluttuja PL:- f 16 104637 iä, voi toimia genomisen kirjaston lähteenä, ja samalla tavoin muita sopivia vektoreita voidaan käyttää palasten vastaamitta j ina.

PL:iä koodittavien DNA-sekvenssien seulomiseksi onnistuneesti genomisesta kirjastosta, hybridisoiva DNA-koetin on välttämätön. Tämä voi olla synteettinen DNA-koetin, jos halutun PL:n sekvenssi tunnetaan, tai se voi käsittää tunnetun PL-geenin tai sen osia. Ensimmäistä lähestymisreittiä käytettiin PLI-geenin selville saamiseksi kuten on kuvailtu julkaisussa EP 88 101 397,3. Toista lähestymistapaa käytettiin esillä olevassa keksinnössä. Koska PLI-geenin DNA:n kokonaissekvenssi saatiin käyttöön, molempia DNA-koettimia, jotka sisältävät koko geenin jonkin sen osan, joka sisältää vähintään 14 ep:a (emäsparia), voidaan nyt käyttää seulontaan, johon kuuluu myös PL-systeemiä koodittavan mRNA:n seulonta.

Seulontatarkoituksia varten DNA-koettimet 5'-leimataan radio-aktiivisesti alalla tunnetuilla menetelmillä käyttäen y32P-ATP:tä ja T4-kinaasia. Isäntämikro-organismit, jotka sisältävät esillä olevan keksinnön mukaisia nukleiinihappoja insert-tinä, identifioidaan hybridisaation avulla leimatun koettimen kanssa geenikirjaston suodinkopioiden päällä.

Kloonit, joissa on näkyvissä hybridisaatioreaktio yhdelle tai useammalle DNA-koettimelle, eristetään ja monistetaan.

Käytettävät hybridisointiolosuhteet voivat olla enemmän tai vähemmän kovat, esim, yksinkertaisesti valitsemalla erilaisia lämpötiloja, ja liittyen erilaisten DNA-koettimien käyttöön, jotka ovat peräisin PLI- (tai PLD-)geenistä, esim. mittaamalla erilaiset hybridisoitumisreaktiot kokonaiseen 1,6 kep:n „ (kiloemäsparin) BamHI/Pstl-palaan, 649 ep:n BamHI/XhoI-palaan (N-pään pala) ja 244 ep:n XhoI/Pstl-palaan (C-pään pala) plasmideista pCG3Bll tai pGW840 (kuvio 4), kloonit voidaan jakaa eri ryhmiin perustuen niiden homologia-asteeseen (tau- ,7 104637 lukot II tai IV). Viisi λ-vektoria (X-PL113,k-PL122,X-PLl09, X-PL102 ja X-PL116) identifioitiin lopulta, pilkottiin, ja niiden pel-qeenien subklooneja valmistettiin pBR322:ssa, mikä johti plasmideihin pGW820, pGW830, pGW850, pGW860 ja pGW880 (kuviot 1-3, 5 ja 6). Näiden kloonien viisi geeniä t ovat nimeltään pelA, pelB, pelc, pelE ja vastaavasti pelF.

*

Geenit voidaan sekvensoida. pelA:n, pelBtn ja pelC:n koko sekvenssit ovat kaavojen I, II ja III mukaiset (kuviot 10, 11 ja 12).

Eksoni/introni-silmukkaliitoskohtien konsensus-sekvenssien (keskiarvojoukko-) samoin kuin intronin sisäisten sekvenssien [Boel E. et ai. (24) ja Mount S.M. 25] tietokoneavusteinen etsintä johtaa oletukseen, kuten pelD:ssä, neljän intronin läsnäolosta pelA;ssa ja pelB:ssä (kuviot 10 ja 11), ja kolmesta intronista pelCtssä (kuvio 12).

. Plasmideja pGW820, pGW830, pGW850, pGW860 ja pGW880 käytetään ’ muiden keksinnön mukaisten yhdistelmä-DNA-molekyylien val mistamiseksi. Sellaisia muita DNA-molekyylejä valmistetaan tavanomaiseen tapaan käyttämällä tavanomaisia restriktioent-syymejä, linkkereitä, ligaatio-, monistus- ja eristysproses-seja. i

Esimerkiksi, plasmidi pGW820 pilkotaan HindIII:lla. 3,9 kep (kiloemäsparin) Hindlll-pala subkloonataan pBR322:n Hindlll-kohtaan. Saadun plasmidin pGW822 3,3 kep BamHI-Hindlll-pala, joka sisältää pelA-geenin, kloonataan vektorin pUC19 BamHI- L

. ja Hindlll-kohtaan, jolloin saadaan vektori, joka on nimel- .· tään pUC19/pelA. pelA:n rakennegeeni leikataan pilkkomalla ί ' Sall.-llä ja PstI:llä. Jäljelle jäävään palaan, joka sisältää pelA:n promoottori-, signaali- ja terminaattorisekvenssit, liitetään signaali- ja terminaattorisekvenssien väliin geeni, joka koodittaa interferonihybridiä BDBB sopivan linkkerin avulla. Saatu plasmidi on nimeltään pUC19/pelA-IFN AM119 1 r 104637 18 (kuvio 11), ja se sisältää pelA:n promoottori- ja signaa-lisekvenssit, IFN BDBB -geenin ja pelA:n terminaattorin liittyneinä plasmidin pUC19 Hindlll-BamHI-palaan. Tämä plasmidi transformoidaan yhdessä" pCG59D7:n kanssa uridiini-auksotrofi-seen A. niqer -mutanttiin An8 (DSM 3917). Transformantit valikoidaan minimaalialustalla, joka sisältää arginiinia ja Bacto-Agar:ia, ja niistä analysoidaan interferonin ilmentyminen.

Toisessa keksinnön mukaisessa suoritusmuodossa pelA;n signaa-lisekvenssi voidaan poistaa. Saatu plasmidi on nimeltään Ml3(+)KS/pelAA-ss-IFN AM119, ja se sisältää pelA:n pro-moottorisekvenssin, IFN BDBB-geenin ja pelA-terminaattorin liittyneinä Bluescript M13(+)KS -vektorin Hindlli-BamHi -palaan. Tämä plasmidi transformoidaan yhdessä pCG59D7:n kanssa uridiini-auksotrofiseen A. niqer -mutanttiin An8 (DSM 3917). Transformantit valikoidaan minimaalialustalla, joka sisältää arginiinia ja Bacto-Agar:ia, ja niistä analysoidaan interferonin ilmentyminen.

• ·

Mutantteja, jotka sisältävät uusia restriktiopaikkoja, voidaan valmistaa, esimerkiksi in vitro paikka-kohdisteisen mutageneesin avulla tavanomaisten menetelmien mukaisesti [katso katsausartikkeli M.J. Zoller ja M. Smith, Methods Enzymol. 100, 468 (1983), D. Botstein ja D. Shortle, Science 229, 1193 (1985) tai K. Norris et ai., Nucl. Acids Res. 11, 5103 (1983)].

Korkeampia ilmenemisasteita varten, mikä tahansa eukaryootti-nen terminaattorisekvenssi voidaan liittää rakennegeenin .: päähän.

9

Y

Bakteerit transformoidaan tavanomaisella menetelmällä, ja transformantit identifioidaan niiden resistenssin avulla, esim. tetrasykliiniä vastaan.

104637 19

Kuvaillut ekspressiovektorit monistetaan erityisesti sopivissa E. coli -isäntäkannoissa kuten HB101, jotka transformoidaan ja valikoidaan tavanomaisilla alan menetelmillä. Monistettu plasmidi-DNA eristetään bakteereista tavanomaisilla menetelmillä, erityisesti kuten Birnboim & Doly (23) ovat kuvailleet.

Samalla tavoin voidaan konstruoida muita plasmideja, jotka sisältävät muita homologisia tai heterologisia geenejä.

Esillä olevan keksinnön mukaisia DNA-molekyylejä voidaan valmistaa'myös in vitro -synteesin avulla tavanomaisten menetelmien mukaisesti. In vitro -synteesi on erityisen käyttökelpoinen PL-ekspressiosysteemin pienempien palojen valmistukseen, esim. DNA-sekvenssien tai niiden mutanttien, jotka koodittavat PL:ien promoottori- tai signaalisekvenssiä.

Keksinnön mukaisia DNA-molekyylejä, jotka sisältävät PL-pro-. moottorin ja valinnaisesti PL-signaalisekvenssin, PL-rakenne- a ’ geenin, jonkin muun heterologisen rakennegeenin ja/tai PL- terminaattorin, voidaan käyttää myös rihmastollisten sienten transformoinein, kuten Aspergillus, Penlclllium tai Cepha-losporium, esim. A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius, A. _ awamorl ja erityisesti A. nlger.

Jotta transformoituneiden sienten seulonta ei-transformoitu- : neiden sienten joukosta olisi mahdollista, keksinnön mukaiset DNA-molekyylit sisältävät valintamarkkerin tai, vaihtoehtoisesti, sienet yhteistransformoidaan toisen vektorin kanssa, joka sisältää sellaisen markkerin. Muiden systeemien tavoin, sellainen valintamarkkeri on ilmennettävissä oleva rakenne-• * - geeni, jonka ilmentämä polypeptidi (entsyymi) antaa resis tenssin yhdisteille, jotka ovat toksisia transformantille, tai joka täydentää mutantin entsyymisysteemiä, josta puuttuu sellainen olennainen polypeptidi. Sellaisia merkkigeenejä ovat esimerkiksi tunnetut qa-2-, pyrG-, pyr4-, trpC-, amdS- ; tai argB-geenlt♦ 104637 20

Kuten julkaisussa EP 88 101 397,3 on kuvailtu, uusi merkki-geeni, nimeltä pyrA, eristettiin A. nlgerin genomisesta kirjastosta, joka liittyy läheisesti ja sisältää samankaltaisen toiminnon kuin A. nidulansin pyrG ja N. crassan pyr4, nimittäin tuottaa entsyymiä orotidiini-5'-fosfaattidekarboksylaa-si. Tämä entsyymi katalysoi orotidiini-5'-fosfaatin dekarbok-sylaation uridyylihapoksi (uridiini-5'-fosfaatti) ja myös fluorioroottihapon toksiseksi fluoriuridiiniksi. E. coli -klooni, joka sisältää pyrA-geenin, identifioitiin hybridisaa-tion avulla pDJB2:n, 24, 1,1 ke Hlndlll-palan kanssa, joka sisältää osan pyr4-geenistä, voitaessa kuitenkin käyttää minkä tahansa muun pyr-geenin DNA:ta, joka koodittaa orotidiini-5 ' -fosfaattidekarboksylaasla. Positiivisesta kloonista nimeltä E. coli B75183/pCG59D7, eristettiin plasmidi pCG59D7, joka sisältää pyrA-geenin, ja sitä käytettiin A. nigerin pyrA--mutantin yhteistransformointiin. Sellaiselta pyrA--mutantilta puuttuu orotidiini-5'-fosfaattidekarboksylaasin geeni, ja se on sen vuoksi kykenemätön tuottamaan vastaavaa , , entsyymiä. Sellaista mutanttia valmistettiin käsittelemällä A. nlgerin N756 konidiosporeja mutatoivassa uv-säteilytykses-sä, ja pesäkkeet, jotka selviävät elossa fluorioroottihapon ja uridiinin läsnä ollessa, valikoituvat. Pesäkkeet, jotka jäävät eloon fluorioroottihapon läsnä ollessa ja uridiinin puuttuessa, eliminoidaan. Loput uridiinia tarvitsevat mutan-tit, niiden transformoitavuuskyvyn perusteella, kuuluvat kahteen komplementaatioryhmään pyrA ja pyrB, joita edustavat mutantit An8 ja AnlO vastaavasti. Niitä käsitellään proto-plastien muodossa transformoivissa olosuhteissa pyrA:n sisältävän plasmidin pCG59D7 kanssa. Ainoastaan An8-pesäkkeiden todettiin tulleen transformoiduiksi ja sisältävän pyrA-gee-nin, minkä osoitti sen pilkotun DNA:n hybridisaatiokyky pUN-121:n DNA:n kanssa.

Keksintö koskee lisäksi isäntiä, jotka on transformoitu keksinnön mukaisilla hybridivektoreilla, ja menetelmiä niiden valmistamiseksi. Sellaisia transformantteja ovat esimerkiksi 2α 104637 bakteerit kuten E. coli, rihmastolliset sienet kuten Aspergillus,. Penlcllllum tai Cephalosporlum, ja erityisesti A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius, A. awamorl tai edullisesti A. niqer, esim. A. nlger An8. Keksintö koskee myös menetelmää sellaisten transformanttien valmistamiseksi, joka käsittää isännän käsittelyn transformoivissa olosuhteissa keksinnön mukaisen yhdistelmä-DNA-molekyylin kanssa, erityisesti hybridivektorin kanssa, valinnaisesti yhdessä valikoivan merkkigeenin kanssa, ja transformanttien valikoinnin.

Keksintö koskee myös yhdistelmä-DNA:n tai niiden johdannaisten käyttöä hybridivektoreiden valmistuksessa, jotka ilmentävät käyttökelpoisia homologisia tai heterologisia polypepti-dejä. Esimerkkejä geeneistä, jotka koodittavat sellaisia käyttökelpoisia polypeptidejä, esitetään edellä.

Keksintö koskee lisäksi menetelmää polypeptidien valmistamiseksi, jolle on tunnusomaista se, että keksinnön mukainen hybridivektori ilmennetään sopivassa isännässä. Tarvittaessa polypeptidi eristetään tavanomaisella tavalla, vektorin konstruktiosta riippuen, tuotteet joko ilmentyvät, tai, jos sig-naalisekvenssi on läsnä, ilmentyvät ja erittyvät.

Tämä menetelmä käsittää käyttökelpoisten homologisten tai heterologisten proteiinien tuottamisen sopivassa isännässä, esim. Aspergillus-lajit, viljelemällä isäntää, joka on trans- = formoitu ekspressiohybridivektorilla. Esimerkkejä geeneistä, jotka koodittavat sellaisia proteiineja, esitetään edellä.

Nyt on myös mahdollista tuottaa polypeptidejä PLA, PLB, PLC, ·: PLD, PLE tai PLF yksitellen, mikä tarkoittaa puhtaassa muo- r ' dossa ja minkään muun PL:n kontaminoimatta, jossa.yhteydessä voidaan käyttää erilaisia menetelmiä. Esim., yhdelle menetelmälle yhden polypeptidilajin tuottamiseksi, joka valitaan ryhmästä, johon kuuluvat PLA, PLB, PLC, PLD, PLE ja PLF, on tunnusomaista se, että isäntä, joka ei pysty ilmentämään 22 104637 mitään pektiinilyaasi PL:ää, transformoidaan DNA-ekspressio-vektorilla, joka ilmentää PLA:n, PLB:n, PLC:n, PLD:n, PLE:n tai PLF:n tuotetta.

Isäntä, joka ei kykene ilmentämään mitään pektiinilyaasi _ PL:ää, on joko mikro-organismi, jolla ei ole vastaavaa geeniä, esim. PL” Aspergillus-kanta, toinen ei-Aspergillus sieni tai jokin muu eukaryoottinen tai prokaryoottinen mikro-organismi, tai Aspergillus-kanta, jonka PL-tuotanto on estetty sopivasti säädellyssä kasvualustassa. Yhdenlajinen PL-geeni voidaan esimerkiksi ilmentää glukoamylaasin promoottorin säätelyn alaisena A. nigerissä ja A. awamorlssa, PH05-pro-moottorin säätelyn alaisena S. cerevlsiaessa tai PL-promoot-torin alaisena PL- A. niger-kannassa.

Lyhyt kuvaus kuvioista

Kuvio 1 esittää pelA-geenin sisältävän pGW820:n restriktio-karttaa.

: Kuvio 2 esittää pelB-geenin sisältävän pGW830:n restriktio- • karttaa.

Kuvio 3 esittää pelC-geenin sisältävän pGW850:n restriktio-karttaa.

Kuvio 4 esittää pelD-geenin sisältävän pGW840:n restriktio-karttaa.

Kuvio 5 esittää pelE-geenin sisältävän pGW880:n restriktio-karttaa.

Kuvio 6 esittää pelF-geenin sisältävän pGW860:n restriktio-karttaa.

Kuvio 7 esittää sekvensointistrategiaa pelA-geenille.

Kuvio 8 esittää sekvensointistrategiaa pelB-geenille.

Kuvio 9 esittää sekvensointistrategiaa pelC-geenille.

* Kuvio 10 esittää DNA-molekyylin pelA sekvenssin, jolla on * kaava I, joka sisältää geenin, joka koodittaa PLA:ta.

Kuvio 11 esittää DNA-molekyylin pelB sekvenssin, jolla on kaava II, joka sisältää geenin, joka koodittaa PLB:tä.

Kuvio 12 esittää DNA-molekyylin pelC-sekvenssiä, jolla on ! 23 '104637 kaava III, joka sisältää geenin, joka koodittaa PLC:tä.

Kuvio 13 esittää homologiaa aminohapposekvenssitasolla PLD:n, PLA:n ja PLC:n välillä.

Kuvio 14 esittää vektorin pUC19/pelA-IFN AM119 konstruktiota, joka sisältää geenin, joka koodittaa hybridi-interferonia BDBB.

Kuvio 15 esittää ei-koodittavaa juostetta osasta pelA-IFN - * fuusiota plasmidilla pelA-IFN AM119, silmukoituneen signaa-lisekvenssin ollessa asetettuna samansuuntaisesti oligonukle-otidi-alukkeen viereen, jota käytettiin pelA-signaalisekvens-sin deleetiomutageneesiin.

f

Seuraavat esimerkit auttavat valaisemaan keksintöä, sitä kuitenkaan mitenkään rajoittamatta.

Lyhenteillä on seuraavat merkitykset Amp ampisilliini ATP adenosiinitrifosfaatti . BSA naudan seerumin albumiini CIP vasikan suoliston alkalinen fosfataasi DNA deoksiribonukleiinihappo DTT 1,4-ditiotreitoli EDTA etyleenidiamiinitetraetikkahapon dinatriumsuola EGTA bis-(aminoetyyli)-glykolieetteri)N,N,N',N'-tetraetik- j kahappo ; kbp kiloemäsparia LMP alhainen sulamispiste mOsm milliosmoolia PEG polyetyleeniglykoli ? RNA ribonukleiinihappo : rpm kierrosta minuutissa - ' SDS natriumdodekyylisulfaatti

Te tetrasykliini

Tris tris(hydroksimetyyli)-aminometaani 1 U yksikköä V volttia p 104637 24

Puskurit, kasvualustat, reaqenssit: HHA B/g 10X restriktioentsyymipuskuri, käytettynä

BamHI-, Bglll-, Hindlll-, Mbol-, PstI- ja Xhol-hydrolyyseihin, joka sisältää 60 mM Tris-HCl:a (pH 7,4), 60 mM β-merkaptoeta-nolla, 60 mM MgCl2:a, 500 mM NaCl:a, 0,1 % BSA:a, 0,1 % gelatiinia.

EcoRI-puskuri 5X restriktioentsyymipuskuri, käytettynä

EcoRI-hydrolyyseihin, joka sisältää 500 mM Tris-HCl:a (pH 7,2), 25 mM MgCl2, 250 mM NaCl:a, 0,05 % BSA:a, 0,05 % gelatiinia.

IPTG r 100 mM isopropyyli-fi-tio-galaktopyranosi- dia (23,8 mg/ml) H20:ssa.

LC-alusta 1 % tryptikaasipeptonia (BBL), 0,5 % hii- vauutetta (BBL), 0,8 % NaCl:a, 1 ml Tris-HCl: a pH 7,5 litraa kohti.

minimaalialusta 1,05 % K2HP04:a, 0,45 % KH2P04:a, 0,1 % (NH4)2S04:a, 0,05 % E. colille natrium-sitraatti.2H20:ta, 1 mM MgS04:a, 1 mM tiamiini-HCl:a, 0,2 % glukoosia.

2XTY-alusta litraa kohti 16 g tryptikaasipeptonia, 10 g hiivauutetta, 5 g NaCl:a.

TBE-puskuri 1 litra sisältää 10,8 g Tris:a, 5,5 g boorihappoa, 4 ml 0,5 M EDTA:a (pH 8,0).

TE-puskuri 10 mM Tris-HCl:a (pH 8,0), 1 mM EDTA:a (pH 8,0).

laimea TE- 10 mM Tris-HCl:a (pH 8,0), 0,1 mM EDTA:a puskuri (pH 8,0).

X-gal 2 % (5-bromi-4-kloori-3-indolyyli-B-galak- tosidia) dimetyyliformamidissa.

SSC 0,15 M NaCl:a, 0,015 M natriumsitraattia.

* minimaalialusta 1 litra sisältää 1,5 g KH2P04:a, 0,5 g A. niqerille KCl:a, 0,5 g MgS04.7H20:ta, 4,0 g NH4Cl:a, 10,0 g glukoosia, hiveniksi FeS04, MnS04, ZnCl2, pH säädettynä arvoon 6,5 NaOH:lla.

täysalusta minimaalialusta plus 0,2 % tryptikaasi- 25 104637 A. nlqerille peptonia (BBL) 0,l-%:lle casaminohapoille (Difco), 0,1 % hiivauutetta (BBL), 0,05 % ribonukleiinihapon natriumsuolaa hiivasta (ICN, Cleveland, USA), 2 ml vitamiiniliu-osta litraa kohti.

r vitamiiniliuos 100 ml:aa kohti 10 mg tiamiinia, 100 mg riboflaviinia, 10 mg pantoteenihappoa, Λ 2 mg biotiiniä, 10 mg p-aminobentsoe-happoa, 100 mg nikotiiniamidia, 50 mg pyridoksiini-HCl: a.

Kaikki alustat jähmetetään maljoja varten lisäämällä 1,5 % agaria (BBL), pinta-agariin (-agaroosiin) käytetään 0,7 % agaria (BBL) tai agaroosia (Seakem).

PBS litraa kohti 0,37 g NaH2P04:a, 2,7 g Na2HP04:a, 8,5 g NaCl:a.

PSP 10 mM Tris-HCl:a (pH 7,6), 100 mM NaClra, 10 mM MgCl2:a, 0,05 % gelatiinia.

LDB 10 mM Tris-HCl:a (pH 7,6), 100 mM NaCl:a, j 10 mM MgCl2.

Seuraavia kantoja käytetään A. nlqer N400-villityyppi

A. nlqer N593 cspA, pyrA

A. niqer N756 valikoitu pektinaasikompleksientsyymien I

suuren tuotannon perusteella.

A. nlqer AN8 DSM 3917, A. nigerin N756 uridiini- _ auksotrofinen mutantti.

E. coll NM539 metB, supE, hsdM+, hsdR~, supF, (P2cox3) I

• j E. coll MH1 ara Dl39, A-lacX74, qalU, qalK, hsr~, ?

. : hsm+, strA

E. coll JM103 Δ-lac-pro, thi, strA, supE, endA, sbcB, hsdR4, F1, traD36, proAB, laclq, ZAM15 b E. coll JM109 A(lac-proAB), recAl, endAl, qyrA96, Γ thi, hsdRl7, supE44, relAl, λ-, [F', * ~ li 104637 26 traD36, proAB, laclq, ΖΔΜ15] E. coli CJ236 (dut-1,unq-l,thi-1,relA-1;pCJ105(Cmr); BIO-RAD muta-Gene Ml3 in vitro mutagenee-sipakkaus) E. coli MV1190 [A(lac-proAB), thi, supE, A(srl- recA)306::TnlO(tetr) (F':traD36, proAB, lac lqZAMIS)]. Kantaa MV1190 kuvaillaan BIO-RAD'in MUTA-GENE M13 iji vitro mutage-neesipakkauksen manuaalissa.

Seuraavia vektoreita käytetään: EMBL4 f EMBL4 on lambda-korvausvektori, jonka kloonauskapasiteetti on 9-23 kep:a (Frischauf et al., viite 2). Se sisältää moni-kloonausalueen lambdan päiden ja epäolennaisen täytealueen välissä. Tämä mahdollistaa moninkertaisten restriktioentsyy-mihydrolyysien suorituksen sillä tavalla, että täyteaineen takaisinligaatio vektorin päihin vähenee, kun vieras, kiin-; nostuksen kohteena oleva DNA liitetään. Vektorissa käytetään * myös hyväksi Spi-fenotyyppiä rekombinanttien suoran valikoin nin toteuttamiseksi (Zissler at ai., viite 20).

PCG3B11 Tätä plasmidia on kuvailtu EP-hakemuksessa 88 101 397,3, sen sisältäessä A. nlqer N756:n pelD (PLI) -geenin kloonattuna pBR322:ssa.

PPL29-5 Tätä plasmidia on kuvailtu EP-hakemuksessa 88 101 397,3, sen sisältäessä pelD (PLI) -geenin N-terminaalisen EcoRI-palan.

V * PPL35-5 Tätä plasmidia on kuvailtu EP-hakemuksessa 88 101 397,3, sen sisältäessä pelD (PLI) -geenin C-terminaalisen EcoRI-palan.

pBR 322

Plasmidi pBR322 sisältää antibioottien ampisilliini (ampR) 104637 27 ja tetrasykliini (tetR) resistenssigeenit. Plasmidi sisältää useita erikoisia kloonauskohtia, joista jotkut sijaitsevat joko amp- tai tet-geenissä niin, että kloonatun DNA:n liittäminen tuottaa antibiooteille herkkiä bakteereja.

r PEMBL18 ja PEMBL19

Dente et ai., (viitteet 7, 8) on kuvaillut näitä plasmideja.

PGW613

Goosen et ai. (viite 12) on kuvaillut tätä plasmidia.

M13mp-faql M13mpl8- ja M13mpl9-vektorit (Norrander et ai., viite 21) ovat yksijuosteista DNA:ta sisältävän bakteriofagin Ml3 johdannaisia, ja ne on tarkoitettu helpottamaan DNA:n sekvensointia mahdollistamalla DNA-palojen kloonauksen monikäyttöisessä polylinkkerikohdassa ja saman restriktiopalan kloonauksen molemmissa mahdollisissa orientaatioissa. Näihin vekto-; reihin kloonattuja sekvenssejä voidaan helposti käyttää temp-

* laatteina sekvensointireaktioissa tai yksijuosteisten koetti- I

mien tuotannossa, käyttämällä normaalia oligodeoksiribonukle-otidialuketta ja E. colin DNA-polymeraasi I:n Klenow-palasta. Vektori-DNA sisältää E. colin lac-operonin promoottorin ja β-galaktosidaasin 145:n ensimmäisen aminohapon geneettisen informaation. Polylinkkerisekvenssit, jotka sisältävät monikäyttöisiä restriktiokohtia, liitetään IacZ-sekvenssiin. Polylinkkeri säilyttää IacZ-lukukehyksen, ja vektori saa aikaan LacZa-isäntäkannan alleelikomplementaation, mikä tuottaa sinisiä plakkeja maljoilla, jotka sisältävät lPTG:tä ja ♦ X-gal:ia. Yhdistelmä-fagit, jotka sisältävät inserttejä, : jotka tuhoavat lukukehyksen tai muutoin häiritsevät IacZa- * - ’ peptidin ilmentymistä, tulevat näkyviin värittöminä plakkei- na.

pCG 59D7 Tätä plasmidia kuvaillaan EP:ssä 88 101 397,3, ja se voidaan 104637 28 saada Escherichia colista BJ5183/pCG59D7 (DSM 3968). Plasmidi sisältää pyrA-qeenin, ja sitä käytetään A. nigerln pyrA- -mutanttien yhteistransformointiin.

Ml 3(+)KS (Bluescript) (STRATAGENE, San Diego, CA, USA) dsDNA, joka sisältää M13-fagin kahdentumisen aloituskohdan. Auttajafagin läsnäollessa, esim. M13K07 (viite 29) tai R408 (viite 9), vektorin (+)-juoste kahdennetaan, pakataan ja vapautetaan alustaan.

Ml3 K07 M13-auttajafagi Ml3(+ )KS:lie. Mead et ai. kuvailee (viite 29) .

R408

Ml3-auttajafagi Ml3(+)KS:lie. Russell et ai. kuvailee (viite 9).

. Esimerkki 1.: Aspergillus niqerin qenomisen kirjaston konst- ’· ruointi

Esimerkki 1.1.: Suurlmolekyyllpainoisen DNA:n eristäminen A.nlqerlstä

Aspergillus nigerln N400-kannan konidiosporeja siirrostetaan 200 ml:aan minimaalialustaa itiöiden lopputiheyteen 106 iti-ötä/ml, ja ravistellaan 1 l:n erlenmeyereissä 24 tunnin ajan 28eC:ssa nopeudella 300 rpm käyttäen New Brunswickin pyörivä-liikkeistä ravistelijaa. Rihmasto otetaan talteen suodattamalla, käyttäen Btlchner-suppiloa varustettuna Myra-kankaalla, pestään kylmällä steriilillä saliinilla, jäädytetään nestety-pessä ja joko varastoidaan -60eC:ssa tai käytetään suoraan.

: Menetelmä, jota käytetään DNA:n eristämiseksi genomisen kir jaston valmistukseen, perustuu Yeltönin et ai. (viite 1) kuvailemaan menettelyyn. DNA-saanto on noin 50-100 yg/g rihmastoa tällä menetelmällä.

Kirjaston konstruoimista varten, 10 g rihmastoa jauhetaan l g:n erissä Braun'in mikro-pirstojassa. Jauhettu rihmasto 29 104637 siirretään l l:n steriiliin erlenmeyeriin, joka sisältää 200 ml uuttopuskuria (50 mM EDTA:a pH 8,5, 0,2 % SDS:a) ja 200 μΐ dietyylipyrokarbonaattia. Seos kuumennetaan hitaasti huoneen lämpötilaan, ja sen jälkeen se kuumennetaan 20 min. kuluessa 68eC:seen samalla ajoittain sekoittaen. Suspensio jäähdytetään huoneen lämpötilaan ja sentrifugoidaan 15 min. ajan nopeudella 12000 x g, 1/16 tilavuus 8 M kaliumasetaatti-liuosta pH 4,2 lisätään supernatanttiin, ja seos jätetään jäihin l tunniksi. Sakka poistetaan sentrifugoimalla (20 min.; 16000 x g; 4eC). Nukleiinihapot seostetaan supernatan-tista inkuboimalla 0,6 tilavuudella isopropanolia jäiden päällä 15'min. aikana. Pelletti otetaan talteen sentrifugoimalla (10 min.; 6000 x g; 4°C), pestään 70-%:sella etanolilla ja kuivataan lyhytaikaisesti. Pelletti suspendoidaan 10 mitään TE-puskuria, joka sisältää 20 yg/ml RNAasia A, (Boehrin-ger, Mannheim), ja sitä inkuboidaan 15 min. ajan 37°C:ssa. DNA:ta käsitellään nukleaasivapaalla pronaasilla (1 mg/ml loppupitoisuus) (Kochlight, Coinbrook) 1 tunnin ajan 37eC:- . ssa. Pronaasi-kantaliuos TE-puskurissa sisältää 20 mg/ml entsyymiä, jota inkuboidaan 1 tunnin ajan 37®C:ssa nukleaasi-en hydrolysoimiseksi.

8.5 g CsCl:a liuotetaan 9 ml:aan DNA-liuosta, 0,2 ml 10 mg/ml etidiumbromidia lisätään, ja tämä liuos sentrifugoidaan joko Beckman SW41 -roottorissa 60 tunnin ajan nopeudella 33000 rpm, tai Beckman 50Ti-roottorissa quickseal-putkissa 40 tunnin ajan nopeudella 45000 rpm. DNA-vyöhyke otetaan talteen putken sivupuhkaisun avulla. Etidiumbromidi poistetaan moninkertaisella uuttamisella vesi- ja NaCl-kyllästetyllä isopro-panolilla. 5 tilavuutta TE:a lisätään, DNA uutetaan TE-kyl- ; lästetyllä fenolilla, fenoli/kloroformi/isoamyylialkoholilla * : 25:24:1 ja kloroformi/isoamyylialkoholilla 24:1. DNA seoste taan lisäämällä 0,1 tilavuutta 3 M natriumasetaattia pH 5,2, 2.5 tilavuutta etanolia ja inkuboimalla yli yön -20*C:ssa. Sakka kerätään talteen sentrifugoimalla (1 tunti; 30000 x g; 4®C), pestään 70-%:sella etanolilla, kuivataan ja liuotetaan 400 yl:aan laimeaa TE-puskuria.

30 104637

Esimerkki 1.2.: A. nlqerln DNA:n osittainen pilkkominen Mbo-I:llä ja palasten eristäminen

Sen Mbol-pitoisuuden testaamiseksi, joka antaa suurimman määrän välillä 13,6 ja 23 kep:a sisältäviä palasia, 1 yg:n eriä A. nlger N400:n DNArsta pilkotaan sopivassa puskurissa alentaen Mbolrn määriä (0,5-0,001 U) 1 tunnin aikana 37°C:ssa 10 yl:n tilavuudessa. Reaktio pysäytetään lisäämällä 1 μΐ 0,25 M EDTA:a, ja näytteet ladataan 0,6-%:selle agaroosigee-lille TBErssä, joka sisältää 1 yg/ml etidiumbromidia. Sopivana markkerina on seos, joka sisältää lambda-DNA:ta ja Bglll:-11a pilkottua lambda-DNA:ta, josta saadaan vyöhykkeet, jotka käsittävät 49, 22,8, 13,6, 9,8, 2,3 kep:a ja näkymätön 0,45 kep pala. Mbol-pitoisuus, joka tarvitaan, jotta saadaan korkea saanto haluttuja 13,6-23 kep paloja, on 0,02 U/yg DNA:ta. Sen mukaisesti pilkotaan 200 yg DNA:ta kokonaistilavuudessa 2 ml, ja jaetaan 20:een samankokoiseen osaan välittömästi entsyymilisäyksen jälkeen. Yhden tunnin kuluttua 37eC:ssa, hydrolysaatit asetetaan jäiden päälle, ja 1 yg:n näyte aje-. taan geelillä, sopivan pilkkoutumisen testaamiseksi. Kun tulos on positiivinen, EDTA:a lisätään loppupitoisuuteen 25 mM reaktion pysäyttämiseksi, entsyymi kuumainaktivoidaan 65eC:ssa 10 min. ajan, näytteet kootaan yhteen, ja DNA saos-tetaan, pestään, kuivataaan ja liuotetaan 400 yl:aan TE:a.

Pilkottu DNA jaetaan osiin yli yön 0,4-%:sella preparatiivi-sella agaroosigeelillä (keskikaivo 120 x 1,5 mm). Bglll:lla pilkottua lambda-DNA:ta käytetään markkerina osittain pilkottujen DNA-palojen koon määrittämiseksi elektroforeesissa 4°C:ssa ja 40 V:n jännitteessä (3 V/cm). Geelialue, joka sisältää oikeankokoisia palasia leikataan pois geelistä, ja DNA elektroeluoidaan geelistä steriilissä dialyysiletkussa 2 ml:ssa TBE-puskuria 2-3 tunnin aikana 100 V:n jännitteessä, virta käännetään 30 sekunnin ajaksi, ja DNA:ta sisältävä puskuri kerätään talteen. Palaset väkevöidään sen jälkeen etanolisaostuksella ja liuotetaan 100 yl:aan laimeaa TE-pus-kuria.

104637 31

Esimerkki 1.3.: Vektorl-DNA:n valmistaminen, 1a A. niqerln molekyyllpalnoltaan suurten DNA-palojen kloonaus EMBL 4:ään.

A. nlqer -kannan N400 genomikirjasto konstruoidaan lambda-vektoriin EMBL4. Vektoria, jonka kloonauskapasiteetti on 9-23 kep:a, kuvailevat Frischauf et ai. (viite 2) ja Karn et r ai. (viite 3), ja se on ostettu Promega Biotech. Inc.'lta. Kaksinkertaisten inserttien välttämiseksi, jotka saavat ai-kunsa genomin eri osista, kloonaukseen on keksinnön mukaisesti käytetty minimipalapituutta 13,6 kep.

10 pg lambda EMBL4:n DNA:ta hydrolysoidaan loppuun 50 yksiköllä BamHIrtä sopivassa puskurissa 100 μ1:η tilavuudessa 2 tunnin aikana 37°C:ssa. Entsyymiä inaktivoidaan 10 min. ajan 65*C:ssa. NaCl-pitoisuus nostetaan 150 mMriin, ja 50 yksikköä Sall:tä lisätään, ja inkubointia jatketaan 37eC:ssa vielä toiset kaksi tuntia. EDTA-lisäyksen jälkeen pitoisuuteen 25 mM ja entsyymin inaktivoinnin jälkeen (10 min. 65eC), liuos uutetaan yhtä suurilla tilavuuksilla fenolia (TE-kyllästetyl-lä), fenoli/kloroformi/isoamyylialkoholia 25:24:1, klorofor-mi/isoamyylialkoholia. Pienten BamHI/Sall-polylinkkeripalas-ten eliminoimiseksi DNA seostetaan 0,6 tilavuudella isopropanolia, sen jälkeen kun on lisätty 0,1 tilavuutta 3 M nat-riumasetaattia pH 5,2. 15 minuutin kuluttua jäiden päällä ja 15 minuutin sentrifugoinnin jälkeen nopeudella 12000 x g ja 4"C, saostuma pestään perusteellisesti 70-%:sella etanolilla, kuivataan ja liuotetaan 40 yl:aan laimeaa TE-puskuria.

Esimerkki 1.4.: Genomisten A. niqerln DNA-palojen liqolnti ja in vitro -pakkaaminen

On olennaista, että esimerkin 1.3 mukaisesti valmistetut cos-·. kohdat tehdään kaksijuosteisiksi ennen ligaatioreaktiota.

' Vektoria, 100 mM Tris-HCl:SSä pH 7,5 ja 10 mM MgCl2:ssa, kuumennetaan 10 minuutin ajan 65eC:ssa ja pariutetaan yhden tunnin ajan 42eC:ssa. Koeligointien perusteella, vektorin suhteen palasiin ollessa suunnilleen 1:1 (painon mukaan) todetaan saatavan maksimimäärä rekombinantteja. Liittäminen : 32 104657 tapahtuu liuoksessa, joka sisältää 50 mM Tris-HCl:a pH 7.5, 10 mM MgCl2:a/ 10 mM DTT:a ja 1 mM ATP:a, käyttäen 9,5 yg vektoria ja 10 yg DNA-paloja kokonaistilavuudessa 100 yl. DNA-ligaasia (BRL) lisätään sen jälkeen pitoisuudessa 0,5 U/yg DNA:ta, ja ligaatioseosta inkuboidaan yli yön 14eC:ssa. Ligaation testaamista varten, ligoitua DNA:ta sisältävä näyte ajetaan agaroosigeelillä. 0,5 yg sisältävä näyte ligoidaan myös ilman palalisäystä 5 yl:n tilavuudessa.

Suuritilavuuksinen ligaatioseos väkevöidään etanolisaostuk-sella ja liuotetaan 20 yl:aan laimeaa TE-puskuria ennen in vitro -pakkaamista. In vitro -pakkaaminen suoritetaan Promega Packagene -uutteilla valmistajan ohjeiden mukaisesti, käyttäen 10 yl:n eriä pakkauksen sisältämän DNA:n 1 yg:aa kohti. Suurimolekyylipainoisesta lambda cI857 Sam 7:stä, joka toimitetaan uutteiden mukana, 1 yg pakataan erikseen kontrollin aikaansaamiseksi. Pakkaamisen jälkeen lisätään 500 yl fagin liuotuspuskuria (PBS) ja 5 yl kloroformia. Yhdistelmä-fagi -varastoja voidaan säilyttää 4°C:ssa. Saatu kirjasto on konst-' ruoitu kahdesta erillisestä ligaatiokokeesta.

Esimerkki 1.5.: A. nlger -kannan genomiklrjaston tiitterimää-ritys ja monistaminen E. coli NM539 -soluja kasvatetaan LC-alustalla, joka sisältää 0,2 % maltoosia, 10 mM MgS04:a ja 1 mM CaCl2:a optisen tiheyden arvoon (600 nm) 1,0. Sen jälkeen lisätään 0,2 ml:n eriä tästä viljelmästä 0,1 ml:aan fagilaimennussarjaa PSB:ssä. Fagiadsorption jälkeen 20 minuutin aikana 37°C:ssa, seos maljataan LC-agarmaljoille, ja näitä inkuboidaan yli yön 37eC:ssa. Titraatiotulokset, ilmaistuina plakinmuodostusyk-sikköjen (pfu) määränä fagisuspension millilitraa kohti, ovat * 12xl05 ja 4,2xl05 pfu/ml esimerkin 1.4. mukaisesti valmiste tun kahden fagivarastoerän osalta. Taustan vähentämisen jälkeen, joka lasketaan kontrolliligaatioista ilman paloja (17 % ja vastaavasti 40 %), rekombinanttien absoluuttinen määrä on 6xl05, mikä on yli 200 kertaa genomin pituus.

104637 33

Kirjaston monistamista varten käytetään 80 μ1:η erät kumpaakin fagivarastoerää E. coli NM539 -solujen infektoimiseksi, jotka maljataan LC-pinta-agaroosissa LC-agarmaljoille ja inkuboidaan sen jälkeen yli yön 37eC:ssa. Fagit eluoidaan agaroosista ravistelemalla maljoja kevyesti 5 ml:n kanssa PSB:tä maljaa kohti 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. PSB otetaan talteen, sentrifugoidaan (10 min. nopeudella 6000 x g) bakteerien poistamiseksi, ja kloroformia lisätään (0,5%:n loppupitoisuus). Molemmat fagivarastoerät, jotka monistuvat suunnilleen samassa määrin, sekoitetaan sen jälkeen (40 ml:n varastoerä), titrataan (8xl09 pfu/ml) ja varastoidaan 4°C:-ssa. r

Esimerkki 2.: A. nlqerin N400 genomikirjaston seulonta pek-tilnllyaasl D -geenin (pelD) suhteen ja geenin eristäminen.

Esimerkki 2.1.: Kirjaston seulonta pelD-geenln eristämistä varten lambda-genomikirjastosta, joka saatiin esimerkissä 1 kuvaillulla tavalla, 2,5 x 104 fagia sekoitetaan nesteytetyn LC-pinta-agaroosin kanssa ja malja-. taan 5:lie LC-agarmaljalle. Maljoja inkuboidaan yli yön 37e- C:ssa ja jäähdytetään 2 tunnin ajan 4°C:ssa. Kultakin maljalta siirretään 2 toistonäytettä Bentonin ja Davisin (viite 4) plakkihybridisaatiomenetelmän mukaisesti. Ensimmäinen kalvo (Schleicher and Schilll BA85 tai Millipore HATF 085) asetetaan maljan pinnalle yhdeksi minuutiksi, toinen toistokalvo kah- i deksi minuutiksi, ja toistonäytteiden paikka merkitään käyt- j täen tussia.

Kalvojen poistamisen jälkeen ne asetetaan maljaan, joka si-- sältää 100 ml denaturoivaa liuosta (1 M NaCl, 0,5 M NaOH) . yhden minuutin ajaksi, ja 1 minuutiksi 100 ml:aan renaturoi- vaan liuokseen (0,5 M Tris/HCl pH 7,5, 1,5 M NaCl). Kalvot siirretään sen jälkeen maljaan, joka sisältää 3 x SSC-liuosta (SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M natriumsitraatti pH 7,0). Kalvoja hangataan kevyesti hansikaskädellä bakteerijäänteiden poistamiseksi, ne siirretään uudelle maljalle, joka sisältää 3 x 34 104637 SSC-liuosta ja ravistetaan kevyesti 20 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. Kalvot blotataan Whatman 3 MM-paperin päällä, ja niitä kuivataan 10 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. Kalvoja paistetaan Whatman 3 MM-paperin päällä uunissa 80 eC:ssa 2 tunnin ajan. Jälkeenpäin niitä pestään 0,5 tunnin ajan 6 x SSC-liuoksessa huoneen lämpötilassa, ja ne siirretään sen jälkeen 50 ml:aan esilämmitettyä (56eC) esihybri-disaatioseosta, joka sisältää 50 mM Tris/HCl:a pH 7,5, 10 mM EDTA:a, 1 mM NaCl:a, 0,5 % SDS:a, 0,1 % natriumpyrofosfaat-tia, 10 x Denhardtin liuosta (50 x Denhardtin liuos = 1 % BSA:a, Boehringerin fraktio V; 1 % polyvinyylipyrrolidonia -40; 1 % Ficoll 400:a). Esihybridisaatioseokseen lisätään tuoreeltaan: 0,1 mg/ml denaturoitua lohen sperman DNA:ta (Maniatis, et ai. s. 327; viite 5) ja 0,01 mg/ml poly rA:ta. Esihybridisaatio kestää 4 tuntia 56eC:ssa kevyesti ravistellen. Hybridisaatioon käytettävä koetin on katkotransloitu (nick-translated) pPL35-5:n 3,5 kep EcoRI-pala, joka sisältää A. niqerln N756 -kannan pelD-geenln C-terminaalisen alueen.

, . (saatavissa E. colista BJ5183/pCG3Bll, DSM 3916, EP 88 101 397,3). Palanen eristetään ennalta sulamispisteeltä alhaisesta agaroosigeelistä, ja 0,3 yg palasesta katkotransloidaan (Maniatis, et ai. ss. 109-112; viite 5). Katkotransloitu DNA denaturoidaan 10 minuutin aikana kiehuvassa vesihauteessa, jäähdytetään jäissä ja lisätään 50 ml:aan esilämmitettyä esihybridisaatioseosta. Esihybridisoidut kalvot siirretään hybridisaatioseokseen yksitellen. Hybridisaatio tapahtuu 56eC:ssa yli yön kevyesti ravistellen. Kalvot pestään 56®C:-ssa: 2 x 30min. 0,5 1:11a 4 x SSC-liuosta, 0,1 % SDS:a, ja 2 x 30 min. 2 x SSC-liuoksella, 0,1 % SDS:a. Kalvot blotataan 3 MM -paperin päällä ja kuivataan ilmalla 1 tunnin aikana.

·. Sen jälkeen kun kalvot on kiinnitetty 3 MM-paperiin ja mer- : kitty oikein radioleimatulla värillä, ne peitetään Saran- päällyksellä ja autoradiografoidaan yli yön -70eC:ssa, käyttäen Konican röntgenfilmejä ja Kodakin X-Omatic-kasetteja tavanomaisten vahvistinvarjostimien kanssa. Tällä tavalla saadaan 44 positiivista signaalia viideltä seulotulta maljal- 35 104637 ta. Positiiviset plakit poimitaan steriilillä Pasteur-pipe-tillä asettamalla maljat varovaisesti autoradiogrämmin päälle oikealla tavalla käyttäen värimerkitsimiä. Agarpalat, jotka sisältävät positiivisia plakkeja, siirretään 1 ml:aan PSB:tä.

Fagien annetaan diffundoitua agarista 1 tunnin aikana huoneen r lämpötilassa pyörresekoittaen aika ajoin. Agar ja bakteeri-solujäänteet poistetaan sentrifugoimalla 5 min., 10 μΐ kloro-formia lisätään, ja fagierät varastoidaan 4eC:ssa. Positiiviset kloonit ovat nimeltään lambda-PLl - lambda-PL44. Koska fagit maljataan suuressa tiheydessä, positiiviset plakit on puhdistettava kahdesti maljaamalla ne alhaisessa tiheydessä (+ 100 fagia/malja; 0,1 ml fagikantaerän 103-laimennusta) ja toistamalla koko toistomaljausmenettely, hybridisoiminen ja positiivisten plakkien poiminta.

Esimerkki 2.2.: lambda-DNA:n eristäminen DNA:n eristämiseksi yhdistelmä-klooneista, fageja monistetaan ensin infektoimalla E. coli NM539 käyttäen 0,1 ml fagikanta-: eriä esimerkissä 1.5. kuvailluista puhdistetuista klooneista, • ja maljaamalla solut LC-pinta-agaroosissa LC-agarmaljoille.

Tämä tuottaa maljoja, joissa indikaattoribakteerit hajoavat koko kasvustoalueelta. 5 ml PSB:tä levitetään maljojen pääl- : le, ja fagit eluoidaan 2 tunnin aikana kevyesti ravistellen.

Eluoidut fagit kerätään talteen, solujäänteet poistetaan sentrifugoimalla, ja kloroformia lisätään l%:n pitoisuuteen. Muodostunutta maljalysaattia säilytetään 4*C:ssa. Sen tiitteri on tavallisesti noin 1011 pfu/ml.

Koska pienimittaiset eristystoimenpiteet maljalysaattien * varastoeristä ja pienimittaisista nestemäisistä viljelmistä (Maniatis et ai., ss. 65-68; viite 5) eivät aina johda kek- • ’ sinnön mukaisesti pilkottavissa olevaan DNA:hän, fageja eris tetään 250 ml:n lysaateista. Näitä valmistetaan kasvattamalla isäntää, E. coli NM539, O.D.600-arvoon 0,3 LC-alustassa + 0,2 % maltoosia, 10 mM MgS04:a, 1 mM CaCl2:a, ja lisäämällä sen jälkeen suunnilleen 1010 pfu:ta maljalysaattia. Kasvatettaessa edelleen bakteerit hajoavat 4 tunnin kuluessa.

36 104637 RNAasia ja DNAasia lisätään lysaatteihin loppupitoisuuteen 2 yg/ml, ja lysaatti jätetään huoneen lämpötilaan 1 tunniksi. Solujäänteet poistetaan sentrifugoimalla (20 min., huoneen lämpötila, lOOOOxg). 14,8 g NaClra ja 25 g PEG6000:a liuotetaan supernatanttiin, jotta loppupitoisuuksiksi saadaan 1 M NaCl:a ja 25 % (w/v) PEG:a. Fagit jätetään saostumaan 1 tunniksi jäissä tai yli yön 4eC:ssa, ja otetaan talteen sentrifugoimalla (20 min.; 10000 x g; 4eC). Pelletit suspendoidaan 3 ml:aan lambdan laimennuspuskuria (LDB; = 10 mM Tris/HCl:a pH 7,5, 20 mM MgCl2:a, 100 mM NaCl:a). 2,5 g CsCl:a liuotetaan 4 ml:aan fagisuspensiota, ja seos pipetoidaan Beckman'-in 5 ml:n/quickseal-putkiin, jotka täytetään sen jälkeen pitoisuudeltaan samalla CsCl:llä LDB:ssä. Putket suljetaan tiiviisti, ja niitä sentrifugoidaan yli yön Beckman'in VTi 65,2 -roottorissa nopeudella 50000 rpm ja 4eC:ssa. Samea fagivyöhyke, joka on näkyvä normaalin lampun valossa, otetaan imupistolla putken kyljestä. CsCl poistetaan dialyysin avulla steriilissä letkustossa 2 litraa vastaan liuosta, joka sisäl-. . tää 10 mM Tris/HCl:a pH 7,5, 10 mM MgCl2:a, 50 mM NaCl:a 4°C:ssa 4 tunnin aikana. Puskuri vaihdetaan kerran. Fagit kerätään talteen steriileihin Greiner-putkiin, tilavuus säädetään 1 ml:ksi dialyysipuskurilla, 50 μΐ 10 % SDS:a, 50 μΐ 0,5 M EDTA:a pH 8,0 ja 25 μΐ 20 mg/ml nukleaasivapaata pro-naasia lisätään, ja putkia inkuboidaan 1 tunnin ajan 37°C:-ssa. Tilavuus kasvatetaan 3 ml:ksi TE:llä, ja tämä liuos uutetaan yhtä suurilla tilavuuksilla TE:llä kyllästettyä fenolia, fenoli/kloroformi/isoamyylialkoholia 25:24:1 ja kloroformi/isoamyylialkoholia 24:1. Sen jälkeen kun on lisätty 0,1 tilavuutta 3 M natriumasetaattia pH 5,2 ja 2,5 tilavuutta etanolia, DNA saostetaan yli yön -20°C:ssa ja kerätään ·, talteen sentrifugoimalla (1 tunti 20000 x g 4eC:ssa). Pellet- : ti pestään 70%:sella etanolilla, kuivataan ja liuotetaan 200 μ1:3θη laimeaa TE-puskuria. Fagi-DNA:n saanto on noin 200 μg/250 ml lysaattia.

i 37 104637

Esimerkki 2.3.: pelD-kloonien restriktioanalyysl.

Positiivisista fageista valikoitiin umpimähkään 10 jatkoana-lyyseihin. l yg fagi-DNA:ta pilkotaan 10:llä yksiköllä Eco-RI:tä tai BglII:ta 20 yl:n tilavuudessa 2 tunnin aikana 37 eC:ssa valmistajan suosittelemissa puskureissa. Näytteet jaetaan osiin 0,6-%:sella agaroosigeelillä käyttäen 1 yg lambda CI857 Sam 7 -DNA:ta, joka on pilkottu Hindlll:lla (lambda x ' Hindlll), markkerina ja EMBL4-DNA:ta ja pCG3Bll-DNA:ta, pil kottuna EcoRI:llä, kontrolleina. Geeli valokuvataan UV-läpi-valaisijan päällä käyttäen Polaroid 667 -filmejä (4s., himmennin 8). DNA siirretään Schleicher & SchClll BA85 -nitrosel-luloosakalvoille Southern'in (1975) menetelmän mukaisesti, kuten Maniatis on kuvaillut ss. 382-386; (viite 5). Kalvoja hybridisoidaan seoksen kanssa, joka sisältää pelp-geenln 32P-leimattuja (katkotransloituja) paloja, kattaen koko geenin.

Nämä palaset ovat pPL29-5:n 2,9 kep EcoRI-pala ja pPL35-5:n 3,5 kep EcoRI-pala. Hybridisaatio- ja pesuolosuhteet ovat identtiset esimerkissä 2.1. kuvailtujen olosuhteiden kanssa. 1

Vyöhykepituudet lasketaan valokuvasta ja autoradiogrammeista, vertaamalla graafisesti puolilogaritmipaperilla tunnettuihin markkerivyöhykkeisiin. Kloonien restriktiokartat esitetään kuviossa 1. Kloonit \-PL4, -14, ja -40 sisältävät sekä ! 2.9 että 3,5 kep EcoRI hybridisoituvat palat, kuten on ha- j « väittävissä plasmidissa pCG3Bll. X-PL5, -6, -10 ja -33 j sisältävät 3,5 kep EcoRI-palan yhdessä toisen hybridisoituvan i

EcoRI-palan kanssa. Kloonit X-PL26 ja -28 sisältävät \ 2.9 kep EcoRI-palan yhdessä toisen hybridisoituvan palan kanssa, kun taas \-PL9 sisältää ainoastaan pienen 1,2 kep hybridisoituvan EcoRI-palan. pCG3Bll-plasmidin täydellinen 5,0 kep Bglll-pala, joka sisältää koko pelD-rakenneqee-nin, on läsnä vain klooneissa X-PL4, -14 ja -40. 3,7 kep hybridisoituva vyöhyke, joka on läsnä klooneissa X-PL5, -6, -10, -14, -33 ja -40, mutta ei plasmidissa pCG3Bll, sijaitsee pelD-geenln alapuolella 5,0 kep palassa. Jotkut hybridisoituvat Bglll-palat sisältävät vielä 1,2 kiloemäsparia vek- 3β 104637 torin oikeasta haarasta. Kaikki kloonit sisältävät myös ei-hybridisoituvia paloja, jotka ovat identtisiä. Koska sen vuoksi näyttää ilmeiseltä, että sekä rakennegeenin että geeniä ympäröivien alueiden restriktiokuviot ovat identtiset kaikissa klooneissa, päätellään, että ne saavat alkunsa samasta geenistä, nimittäin A. niqerin N400 -kannan pelD-geenistä. Maljattujen kloonien määrän ja oletetun 3xl07 ep genomipituuden perusteella, 25000 kloonia kohti, joiden keskimääräinen inserttipituus on 15 ke, odotetaan löytyvän vähintään 12 pelD-kloonia. Koska vain kaksi analysoiduista kymmenestä kloonista ovat identtisiä, kirjaston kompleksisuus on jopa suurempi kuin mitä oletettiin (vrt. esimerkki 3).

Esimerkki 2.4.: pelD-palojen subkloonaus X-PL4:n ja pCG3Bll-plasmidin 5,0 kep palaset, jotka sisältävät A. niqerin N400 ja N756 -kantojen pelD-geenit, vastaavasti, subkloonataan plasmidin pBR322 BamHI-kohtaan (katso kloonausvektorit). 4 yg X-PL4:ää ja 2 yg plasmi-dia pCG3Bll hydrolysoidaan loppuun 20 yl:ssa 10 U:n kanssa BglII:ta 2 tunnin aikana 37°C:ssa. Palaset erotellaan 1-%:-sella, sulamispisteeltään alhaisella LMP-agaroosigeelillä (BRL) TBE-puskurissa + 1 yg/ml etidiumbromidia jännitteessä 50 V. 5,0 kep pala leikataan pois geelistä, laimennetaan 0,4 ml:11a TE-puskuria, yhtä suuri tilavuus fenolia lisätään, ja seos kuumennetaan 65eC:seen 10 minuutiksi agaroosin sulatta-miseksi. Viiden minuutin sentrifugoinnin jälkeen nopeudella 12000 rpm Eppendorf 5414S -pöytäsentrifugissa, vesifaasi uutetaan fenoli/kloroformilla ja kloroformilla, saostetaan etanolilla, pestään, kuivataan ja liuotetaan lopuksi 10 yl:-aan laimeaa TE-puskuria.

’ 1 pg pBR322-DNA:ta, jota on valmistettu suurimittaisella 1 plasmid^valmistusmenetelmällä (Maniatis, et ai. s. 86; viite 5) ja puhdistettu CsCl-gradienttisentrifugoinnin avulla, pilkotaan 5 U:lla BamHI:tä 2 tunnin aikana 37eC:ssa 20 yl:n tilavuudessa. 2 yl 10 x CIP-puskuria ja 0,02 yksikköä CIP:iä 39 104637 u lisätään, ja inkubointia jatketaan vielä 30 minuuttia. EDTA:-aa lisätään loppupitoisuuteen 25 mM, ja seosta kuumennetaan 10 minuutin ajan 65eC:ssa. Liuos laimennetaan 200 yl:ksi TE-puskurilla ja uutetaan kolme kertaa TE-kyllästetyllä fenolilla, kerran fenoli/kloroformilla ja kerran kloroformilla. Etanolisaostuksen jälkeen DNA liuotetaan 50 yl:aan laimeaa TE-puskuria.

JT

100 ng palan sisältämää DNA:ta ligoidaan 20 ng:n kanssa vek-tori-DNA:ta 20 yl:n tilavuudessa esimerkissä 1.4. kuvailluissa olosuhteissa. Puolet ligaatioseoksesta käytetään transformoitaessa^ kompetentteja E. coli MH1 -soluja, jotka on preparoitu CaCl2-menetelmällä (Maniatis, et ai. s. 250; viite 5).

Solut maljataan LC-agarmaljoille, jotka sisältävät 50 yg/ml ampisilliiniä ja inkuboidaan yli yön 37eC:ssa. Transformant-tien herkkyys tetrasykliinille testataan levittämällä pesäkkeet ensin LC-maljoille, jotka sisältävät 20 yg/ml Tc:ä, ja sen jälkeen LC + amp -maljoille. Transformantteja kasvatetaan yli yön 5 ml:ssa LC:tä + amp 37eC:ssa, ja DNA eristetään 1,5 ml:sta viljelmää, käyttäen pienen mitan aikaiihajotusmene-telmää (Maniatis, et ai. s. 368; viite 5).

Pienessä mitassa preparoidut DNA:t pilkotaan BamHI:llä ja Pstl:llä, ja palat analysoidaan l-%:sella agaroosigeelillä.

Kahta plasmidia, jotka saavat alkunsa lambda-PL:stä, jotka sisältävät 5,0 kep Bglll-palan vastakkaisissa orientaatioissa, merkitään koodeilla pGW840 ja pGW841. Toisia plasmideja, jotka saavat alkunsa plasmidista pCG3Bll, merkitään koodeilla pGW870 ja pGW871. Niitä sisällään pitäviä MHl-soluja säilytetään glyserolissa -70°C:ssa. Plasmidi-DNA:ta, näiden kloonien 0,5 l:n viljelmistä, eristetään suuressa mitassa (Maniatis, .·· et ai. s 86; viite 5), puhdistetaan CsCl-sentrifugoinnilla, tehdään fenoliseksi, seostetaan etanolilla ja liuotetaan 400 yl:aan laimeaa TE-puskuria. Saanto on suunnilleen 500 yg. Plasmideille suoritetaan restriktiokartoitus. Plasmidia pGW840 koskeva kartta esitetään kuviossa 2, ja sitä on mahdo- 40 1 04 637 ton erottaa pGW870:stä. Plasmideja pGW841 ja pGW871, jotka sisältävät palasen päinvastaisessa orientaatiossa, on myös mahdoton erottaa toisistaan, mikä osoittaa pelD-geenien identtisyyden A. nlger -kannoissa N400 ja N756.

Esimerkki 3.: pelD:hen läheisesti liittyvien geenien seulonta, eristäminen ja karakterisointi

Esimerkki 3.1.: Hybridisaatio-olosuhteiden selvittäminen A. nigerln N400 -DNA:n genomlsten blottlen analyysin avulla.

2 pg DNA-näytteet A. nigerin kannasta N400 eristetään esimerkissä 1.1. kuvaillulla tavalla ja pilkotaan 20 μ1:η tilavuudessa 4 tunnin aikana 37eC:ssa, käyttäen BamHI:tä (BRL) tai HindIII:a (BRL) HHA B/g -puskurissa. Pilkotut näytteet erotellaan elektroforeettisesti 0,6-%:silla agaroosigeeleillä 40 V:n jännitteessä 18 tunnin aikana. DNA siirretään nitro-selluloosakalvoille, jotka paistetaan esimerkissä 2.3. kuvaillulla tavalla. (Esi)-hybridisaatioliuokset ovat identtiset esimerkissä 2.1. kuvailtujen liuosten kanssa.

Esihybridisointiin käytettävä lämpötila on aina sama kuin hybridisointilämpötila. Katkotransloitua pGW840:n 1,6 kep BamHI/Pstl-palaa, joka sisältää pelD-geenlä koodittavan alueen, on käytetty koettimena. Hybridisointi suoritetaan eri lämpötiloissa (52, 60 ja 68eC) 16 tunnin ja 40 tunnin aikana. Kahta seuraavaa pesuolosuhdetta käytetään kolmessa eri lämpötilassa: 2 x 30 min. 5 x SSC, 0,1 % SDS, jota seuraa 2 x 30 min. 3 x SSC, 0,1 % SDS, verrattuna pesuun 4 x 30 min. 5 x SSC, 0,1 % SDS. 68eC:n osalta otetaan mukaan myös pesu kahdesti liuoksella 2 x SSC, 0,1 % SDS ja kahdesti liuoksella 0,2 x SSC, 0,1 % SDS. 68eC:ssa, käyttäen 0,2 x SSC-pesuja, ; esiintyy vain homologista hybridisoitumista. Korkeampien suolapitoisuuksien käyttäminen aiheuttaa joidenkin muiden heikkojen signaalien ilmestymisen. 52®C:ssa tausta on suuri ja hybridisaatio heikkoa. Parhaat "heterologiselle" hybri-disaatiolle todetut olosuhteet ovat 60°C 40 tunnin ajan, käyttäen pesuyhdistelmää 5 x SSC ja 3 x SSC. Tätä voidaan 4i 104637 jopa vielä optimoida, käyttämällä 4 x SSC:n yhdistelmää 2 x SSC:n kanssa, sen sijaan, että käytetään yhdistelmää 5 x SSC, 3 x SSC. Näissä A. niger N400:n genomisissa bloteissa havaitut signaalit, kun koettimena on käytetty pGW840:n 1,6 kep BamHI/Pstl-palaa, esitetään yhteenvetona taulukossa I.

Taulukko I. Hybridisaatiosignaalit A. niger N400:n genomises-sa DNA:ssa, kun koettimena on pGW840:n 1,6 kep BamHI/Pstl-pala.

BamHI / Hindu I

7,5 kep voimakkaasti homologinen; 21,0 kep voimakkaasti pelD homologinen; pelD

4.3 kep voimakas 3,9 kep voimakas 4,1 kep heikko 7,1 kep heikompi 18,0 kep heikko 4,4 kep heikko 8.4 kep hyvin heikko 4,6 kep heikko 1,5 kep hyvin heikko

Esimerkki 3.2.: Kirjaston seulonta 2,5 x 104 fagia N400-lambdakirjastosta maljataan 5:lie maljalle, ja jokaisesta maljasta tehdään 3 nitroselluloosako-piota esimerkissä 2.1. kuvaillulla tavalla. (Esi)hybridisaa-tiopuskuria kuvaillaan myös esimerkissä 2.1. Ensimmäistä kopiota kustakin maljasta hybridisoidaan 60eC:ssa 40 tunnin ajan pGW840:n 1,6 kep BamHI/Pstl-palan kanssa ja pestään . kahdesti tuossa lämpötilassa 30 min. liuoksella 4 x SSC, 0,1 . % SDS ja kahdesti 30 min. liuoksella 2 x SSC, 0,1 % SDS, esimerkissä 3.1. kuvaillulla tavalla. Näitä olosuhteita nimitetään heterologisiksi olosuhteiksi. Toista kopiota kultakin maljalta hybridisoidaan 68eC:ssa saman palan kanssa, pesten kahdesti 30 min. liuoksella 2 x SSC, 0,1 % SDS ja kahdesti 30 min. liuoksella 0,2 x SSC, 0,1 % SDS tässä lämpötilassa.

42 1 0 4 6 37 Näitä olosuhteita nimitetään homologisiksi olosuhteiksi. Kolmatta kopiota kultakin maljalta hybridisoidaan homologi-sesti pGW840:n 0,35 kep BamHI-palan kanssa, joka sijaitsee pelD:n promoottorialueella välittömästi 1,6 kep BamHI/Pstl-palan vieressä. 29 plakkia saadaan, jotka hybridisoituvat heterologisesti mutta eivät homologisesti (tai hyvin heikosti). Nämä ovat nimeltään X-PL101 - X-PL129. 19 plakkia saadaan, jotka hybridisoituvat voimakkaan homologisesti ja heterologisesti BamHI/Pstl-koettimen kanssa. Nämä ovat nimeltään X-PL130 - X-PL148, ja niitä pidetään pelD-klooneina. Näistä kaksi hybridisoituu vain heikosti 0,35 kep BamHl>koettimen kanssa (X-PL145 ja X-PL146), ja ne sisältävät sen vuoksi luultavasti vain osan promoottorialueesta. Muut hybridisoituvat voimakkaasti. Vain 1 klooni saadaan, joka hybridisoituu vain 0,35 kep BamHI-koettimen kanssa (\-PL149).

Kaikki kloonit poimitaan ja puhdistetaan kahdesti maljäämällä ; ja hybridisoimalla ne heterologisesti 1,6 kep BamHI/Pstl- koettimen kanssa. Toisessa seulontakokeessa on lisäksi saatu 23 pelD-kloonia ja 25 muuta kloonia (X-PL151 - X-PL198).

Esimerkki 3.3.: Lambda-kloonien karakterisointi plakkihybri-disaatlosiqnaalin avulla eri koettimien kanssa, jotka ovat peräisin pelD:stä.

Tässä kokeessa kuvaillaan eristettyjen kloonien luokittelua, käyttäen pelD:n kooditusalueen eri osia koettimena. Mukaan on otettu lambda-PLIOI - 130, -145, kun taas lambda-PL4:ää käytetään positiivisena kontrollina. Kloonit maljataan, ja vain yksi kopio tehdään, joka jaetaan kuuteen osaan. Tämä on ; tarkoitettu eliminoimaan pois erot hybridisaatiosignaalissa kopioiden välillä. Kopioiden eri osat hybridisoidaan sekä homologisesti että heterologisesti seuraavien 32P-leimattujen koettimien kanssa: 1: täydellinen 1,6 kep BamHI/Pstl-pala pGW840:stä 2: 649 ep BamHI/XhoI-pala pGW840:stä (pelD:n N-terminaalinen 104637 43 kooditusosa) 3: 244 ep XhoI/Pstl-pala pGW840:stä (pelD:n C-terminaalinen kooditusosa) X-PL4, -130 ja -145, samoinkuin X-PL101 hybridisoituvat voimakkaasti näiden koettimien kanssa homologisissa ja heterologisissa olosuhteissa, kuten on odotettavissa pelD- 4 klooneilta. Jälkimmäinen klooni, λ-PLlOl, sijaitsee kalvon reunalla esimerkissä 3.2. eikä siitä johtuen tule kirjatuksi pelD:nä ensimmäisessä seulonnassa. Juuri mainitut kloonit luokitellaan kuuluviksi klooniryhmään I (pelD). X-PL112, -126 ja -127 osoittautuvat negatiivisiksi tässä kokeessa. Kaikki muut kloonit voidaan jakaa kahteen muuhun ryhmään: Ryhmä II hybridisoituu heterologisesti ei ainoastaan kokonaisen koettimen kanssa, vaan myös N-terminaalisen koettimen kanssa. Homologinen hybridisoituminen on vain heikkoa, kun koettimena on koko pelD-qeeni. Ryhmän III sisältämät kloonit eivät hybridisoidu N-terminaalisen koettimen kanssa lainkaan, eivätkä myöskään homologisesti koko koettimen kans-* sa. C-terminaalinen koetin jättää hybridisoitumatta sekä

Ryhmän II että Ryhmän III sisältämien kloonien kanssa. Näistä kokeista päätellään keksinnön mukaisesti, että eristettyjen kloonien joukossa on vähintään 2 läheisesti toisiinsa liittyvää geeniä.

Ryhmän II klooneihin kuuluvat: X-PL104, -105, -109, -113, -114, -115, -119, -122, -124, -125, -128 ja -129.

Ryhmän III klooneja ovat: X-PL102, -103, -106, -107, -108, -110, -111, -116, -117, -118, -120, -121 ja -123.

’ Esimerkki 3.4.: Eristettyjen lambda-kloonlen (Ryhmä I, II) - ’1 restriktloanalyysl.

Maljalysaattikantaeriä, 250 ml:n nestelysaatteja ja suuren mitan fagi-DNA -valmisteita näistä lysaateista valmistetaan kuten esimerkissä 2.2. on kuvailtu. Tämä tehdään 24:n kloonin osalta, niistä kolmen ollessa pelD-klooneja (X-PL4, -130, 104637 44 -145). Yhden kloonin DNA menetetään DNA:n eristämisen yhteydessä (X-PL124). Näistä klooneista eristetty DNA pilkotaan 1 yg:n näyte-erissä 20 yl:n kokonaistilavuudessa käyttäen 10 yksikköä entsyymiä. Kaikki kloonit pilkotaan EcoRI:llä, BamHI:llä, HindIII:lla, EcoRI/BamHI:llä, BamHI/-Hindlll:11a, EcoRI/Hindlll:11a ja EcoRI/BamHI/Hindlll:11a.

Palat erotellaan 0,6-%:isella agaroosigeelillä ja siirretään nitroselluloosakalvoille kuten esimerkissä 2.3. on kuvailtu. Blotit hybridisoidaan heterologisesti pGW840:n 1,6 kep Bam-HI/Pstl-palan kanssa kuten esimerkissä 3.1. on kuvailtu.

Kaksi kloonia ei hybridisoidu (X-PL112 ja X-PL129). Vyöhyke-pituudet sekä valokuvista että autoradiogrammeista lasketaan. Lukuunottamatta X-PL113 -kloonia, kaikki kloonit sisältävät liian monta palasta täydellisen kartan saamiseksi.

On kuitenkin mahdollista saada johdetuksi kartta hybridisoi-tuvasta alueesta ja, yhdistelemällä tuloksia ei-hybridlsoitu-vista vyöhykkeistä, osoittaa, mitkä kloonit ovat peräisin sa-. masta geenistä. On selvää, että jäljellä olevien Ryhmiin II

. ja III kuuluvien 18 kloonin joukossa on läsnä 5 geeniä. Nämä ovat nimeltään pelA, pelB, pelC, pelE ja pelF. Kloonien osoittaminen näille geeneille esitetään yhteeenvetona taulukossa II. 1 · , 45 104 6 tl

Taulukko II Eristettyjen kloonien osoittaminen eri pel-gee-neille (osalle) tarkoittaa, että hybridisoituvat vyöhykkeet ovat vain osaksi läsnä näissä klooneissa.

r

Ryhmä Geeni λ-kloonit I. pelD PL4, PL130, PL145 (osa) r II. peIA PL113, PL104, PL115, PL125 (osa) pelB PL119, PL122, PL128, PL105 (osa) pelC PL109 III. pelE PL116, PL107 (osa) . pelF PL102, PL103, PL110, PL120 PL121 (osa), PL123 (osa) * « » » v 46 104637

Taulukko III Hybridisoituvien vyöhykkeiden vertailu kromoso-maalisissa bloteissa ja eristetyissä geeneissä. Vyöhykepituu-det ilmoitetaan kiloemäspareina.

EcoRI BamHI Hindlll

Kromosomaalinen 2,9+3,5 7,5 21,0 Homologinen

signaali pelD

r + suurem- 4,3 3,9 Vahvimmat he- mat vyöhykkeet terologiset signaalit 18,0 7,1 Heikommat sig naalit 4,4 Heikot signaalit ; 8,4 4,6 Heikot signaa lit 4,1 1,5 Heikot signaa lit pelD 2,9+3,5 7,5 suuri pelA 7,5 4,3 3,9 pelB 8,7 suuri 7,1 pelC 5,0 suuri 4,4 pelE 6,2 8,4 4,6 pelF suuri 4,1 1,5+2,8 (hyvin heikko) • ' * • f

Taulukossa III esitetään eristettyjen geenien hybridisoitu-neet palapituudet verrattuna genomisten DNA-blottien hybri-disoituneisiin palapituuksiin. Näistä tuloksista päätellään, 47 1 0 4 6 3 7 47 että kaikki vyöhykkeet, jotka hybridisoituvat genomisissa bloteissa, ovat läsnä eristetyissä klooneissa, ja että näissä hybridisaatio-olosuhteissa muita läheisesti yhteen kuuluvia geenejä ei voida eristää. Plakkihybridisaatiotulokset (esimerkki 3.3.) ilmaisevat, että, huomioon ottamatta osittaisia jr klooneja, jokaisella geenillä on spesifinen hybridisaatiomal-li testattujen koettimlen kanssa. Tämä esitetään yhteenvetona * taulukossa IV.

Taulukko IV Signaalin voimakkuuden vertailu eri geeneillä homologisessa ja heterologisessa plakkihybridisaatiossa eri pelD-koettimien kanssa esimerkissä 3.3. kuvaillun kokeen mukaisesti. Hybridisaatioaste ilmaistaan + -merkkien lukumäärällä. Homologinen pelD-geeni hybridisoituu vähintään 10 + -merkin verran; +, hyvin heikko hybridisaatio; -, ei hybridisaatiota .

heterologinen hybridisaatio homologinen hybridisaatio koetin koko N-term. C-term. koko N-term. C-term geeni geeni :

___I

! pelA ++++ ++++ + +++ + - r pelB ++++ ++++ + + ± j1 pelC +++ ++++ - - pelE +++ - - . ’ pelF ++++ + + ± - 46 1 0 4 6 3 7

Esimerkki 3.5.: pelD:hen läheisesti yhteen kuuluvien geenien subkloonaus pBR322:een

Hybridisoituvien palasten subkloonit, jotka palat saadaan esimerkissä 3.3. kuvailluista λ-klooneista, tehdään vektorissa pBR322, joka pilkotaan EcoRI:llä, BamHIrllä tai HindIIl:lla ja defosforyloidaan jälkeenpäin. Palan eristäminen, LMP-agaroosigeeleistä, vektorin preparointi, ligointi, E. colin MHl transformointi, pienimittainen DNA:n eristäminen ja suuren mittakaavan plasmidieristys tehdään kaikki käyttäen standardimenetelmiä, joita on kuvailtu esimerkissä 2.4.

Palaset ligoidaan sopivaan vektoriin kuten esimerkissä 2.4. on kuvailtu. Transformoidut E. coli MHl -solut maljataan LC:lle + 50 yg/ml Amp. Transformanttien herkkyys tetrasyk-liinille testataan. EcoRI-kloonit ovat kaikki resistenttejä. Pienessä mitassa preparoidut DNA:t pilkotaan sen jälkeen sopivilla entsyymeillä oikeiden inserttien testaamiseksi ja palojen orientaation määrittämiseksi. Plasmidit, jotka on valikoitu, esitetään yhteenvetona taulukossa V. Niitä sisäl-: lään pitäviä soluja säilytetään glyserolissa -70eC.

Taulukko V pel-geenlen subkloonit pBR322:ssa. 1 i , 49 1 0 4 6 3 7 plasmidi geeni palanen alkuperä orientaatio pGW820 pelA 7,5 EcoRI X-PL113 2 pGW821 4,3 BamHI 2 pGW822 3,9 Hindlll 2 pGW823 7,5 EcoRI 1 pGW824 4,3 BamHI 1 PGW825 3,9 Hindlll 1 pGW8 30 / pelB 7,1 Hindlll X-PL122 1 pGW850 pelC 5,0 EcoRI X-PL109 1 pGW851 5,0 EcoRI 2 pGW860 pelF 4,1 BamHI X-PL102 1 pGW880 pelE 4,6 Hindlll X-PL109 1 pGW881 4,6 Hindlll 2

Plasmidit pGW820, -830, -850, -860 ja -880 on eristetty suuressa mitassa ja niistä on tehty restriktiokartoitus. Näiden plasmidien kartat esitetään kuvioissa 1-6. =

Geenin sijainnin ja orientaation määrittämiseksi, plasmidi- hydrolysaattien Southern-blotit hybridisoidaan heterologises-ti pGW840:n 1,6 kep BamHI/Pstl-palan kanssa, ja identtiset . hiotit hybridisoidaan heterologisesti saman plasmidin N-ter- .· minaalisen palan kanssa, joka on 649 ep BamHI/xhol-pala pGW- , ’ 820:n ja -830:n kartoitukseen, ja 766 ep BamHI/EcoRI-pala pGW850:lie ja -860:lle.

Plasmidit pGW820, pGW830, pGW850, pGW860 ja pGW880 kloonattiin E. coli HB101:een ja talletettiin 1. helmikuuta, 1988, so 104637

Deutsche Sammlung för Mikroorganismen' iin, Grisebachstr. 8, 3400 Göttingen. Ne saivat DSM-numerot 4388, 4389, 4390, 4391 ja vastaavasti 4392.

Esimerkki 4.; pelD-, pelA-, pelB- ja pelc-geenlen sekvenssin määrittäminen

Esimerkki 4.1.: A. nigerin kannan N400 pelD-geenin osasekvenssi ja sen Identtisyys A. nigerin kannan N756 pel I;n kanssa.

Sopivia restriktiopaloja eristetään pGW840:stä LMP-agaroosi-geelielektroforeesin jälkeen kuten esimerkissä 2.4. on kuvailtu. Nämä liitetään M13mpl8RF- ja M13mpl9RF-vektoreihin BRL:n M13-kloonaus/dideoksisekvensointi-käyttöohjeen mukaisesti (ss 26, 27; viite 6). E. colin JM103 transformointi, maljaviljely x-gal-indikaattoriminimaalimaljoille ja yksi-juosteisen DNA:n eristäminen yhdistelmä-fageista suoritetaan saman manuaalin ohjeiden mukaisesti (ss. 29-34). Muutama klooni sekvensoidaan käyttäen Sanger'in dideoksi-ketjunpysäy-tysmenetelmää, jota kuvaillaan BRL-manuaalin sivuilla 38-74.

Sekvenssit, jotka määritettiin nukleotidien -457 ja +100 välillä, ovat identtisiä PLI-geenin vastaavan sekvenssin kanssa, joka on peräisin A. nigerin N756:sta ja läsnä plasmi-dissa pCG3Bll (EP 88 101 397,3). Sekvenssi, joka määritettiin BamHI-paikasta -457 paikkaan +100 asti, käsittää 457 nukleotidia promoottorisekvenssistä, 57 nukleotidin koodittaessa signaalisekvenssiä ja 43 nukleotidin koodittaessa 13 ensimmäistä N-terminaalista aminohappoa toimintavalmiista PLD-proteiinista.

Identtisten pGW840:n sisältämän N400 pelD-geenin ja pCG3Bll-• :ta sisältämän N756 pelD-geenin restriktiokarttojen ja täysin identtisen N-terminaalisen sekvenssin perusteella otaksutaan, että molemmat geenit ovat identtiset. Sen mukaisesti otaksutaan, että PLD-proteiini on identtinen aikaisemman PLI-prote-iinin kanssa.

S1 104637

Esimerkki 4.2.; pelA-, pelB ja pelC-qeenlen sekvenssin määrittäminen

Palat pGW820:stä, pGW830:stä ja pGW850:stä subkloonataan M13mpl8RF:ään ja M13mpl9RF:ään (katso esimerkki 4.1.) tai plasmideihin pEMBL18 ja pEMBL19 (Dente et ai. viite 7, 8).

A

Plasmidikloonien yksijuosteista DNA:ta saadaan infektoimalla auttaja-fagilla R408 (Russell et ai. viite 9). Eksonukleaasi III deleetioklooneja pGW850:stä valmistettiin Henikoffin menetelmällä (viite 28). 3,0 ke Smal-Bglll-pala pGW850:stä, jossa pelC-geeni sijaitsee, subkloonataan plasmidiin pEMBLl9.

50 yg tästä kloonista pilkotaan Smal:llä ja Sacl:llä, ja fenoli/kloroformiuuton ja etanolisaostuksen jälkeen pilkotaan eksonukleaasi III:11a. Näytteitä otetaan eri aikaväleillä, eksonukleaasi III inaktivoidaan lisäämällä NaCl:a ja EDTA:a ja inkuboidaan 70eC:ssa 10 minuuttia. Esiintyöntyvät ssDNA-päät poistetaan Sl-nukleaasilla, ja kohesiiviset päät tasataan T4 DNA -polymeraasin avulla. Itsetoimivan ligaation ja E. colln JM103 transformoinnin jälkeen näillä deleetioklooneil-la, yksijuosteista DNA:ta saadaan infektoimalla auttaja-fagilla R408. pGW820 sekvensoidaan PvuII-kohdasta paikassa 1000 Clal-kohtaan paikassa 4175 (katso kuvio l). pGW830:n tapauksessa, 2774 ep Xhol-pala sekvensoidaan (katso kuvio 2). pGW850 sekvensoidaan EcoRI-kohdasta paikassa 0 paikkaan 3168 (katso kuvio 3).

Sekvenssistrategiat näiden geenien osalta esitetään kuvioissa 7, 8 ja 9. Useita oligonukleotidejä syntetisoidaan käyttäen Caruthers'in (viite 10) fosforamidiittimenetelmää, käyttäen .

Applied Biosystem’in (malli 380B) oligonukleotidi-synteesi-. laitetta. Niitä käytetään sekvensoinnin alukkeina, ja niiden ·' paikka esitetään kuvioissa 7 ja 8.

9 pelA-geenin koko sekvenssi annetaan kuviossa 9 5'---> 3'- suuntaan. 3175 ep sekvenssi alkaa PvuII-kohdan ensimmäisellä nukleotidillä paikassa 1000 pGW820:ssä ja päättyy Clal-kohdan viimeiseen nukleotidiin paikassa 4175 pGW820:ssä.

52 1 0 4 6 3 7 pelA-sekvenssi sisältää 1360 nukleotidiä promoottorialueesta, 1355 tähdettä rakenneosasta ja 360 nukleotidiä terminaattori-alueesta.

PLA:n aminohapposekvenssiä (katso esimerkki 6.3.) edeltää 20 aminohappoa sisältävä signaalisekvenssi, kuten voidaan päätellä nukleotidisekvenssistä.

MET-LYS-TYR-SER-THR-ILE-PHE-SER-ALA-ALA-ALA-ALA-VAL-PHE-ALA-GLY-* * * * * * *

SER-ALA-ALA-ALA

* f *

Homologia pelD-geenln signaalisekvenssin kanssa osoitetaan tähdellä. Toimintavalmiin proteiinin ensimmäiset viisi aminohappotähdettä sisältävät myös saman aminohapposekvenssin pelA:ssa ja pelD:ssä.

pelB-geenln koko sekvenssi esitetään kuviossa 10, myös 5'—> , , 3'-suunnassa. 2774 ep sekvenssi alkaa Xhol-kohdan ensimmäi sellä nukleotidillä pGW830:ssä ja päättyy toisen Xhol-kohdan viimeisen nukleotidin kohdalla.

pelB-sekvenssi sisältää 1133 nukleotidiä promoottorialueesta, 1373 tähdettä rakenneosasta ja 268 terminaattorialueesta. pelB-geeni koodittaa vähintään 20 aminohappoa sisältävää signaalisekvenssiä.

pelC-sekvenssi käsittää 1367 nukleotidiä promoottorialueesta, 1340 tähdettä rakenneosasta ja 461 terminaattorialueesta. pelC-geeni koodittaa 18 aminohappoa sisältävää signaalisek-• venssiä.

pelc HET-LYS-VAL-PRO X - X -PHE-LEU-GLN-LEU-LEU-CYS-LEU-ASN-ALA-ALA pelB * * * pelA * * * * pelD * * * * 53 104637 pelC LEU-ALA-SER-ALA pelB * * pelA * * pelD * * *

Homologia pelA-, pelB- ja pelD-qeenlen signaalisekvenssln kanssa osoitetaan joka kohdassa tähdellä. X:t lasketaan mukaan sekvenssien asettamiseksi suoraan riviin.

Konsensus-sekvenssien (keskiarvojoukko-) etsintä sienten eksoni/introni-silmukkaliitoskohdille ja intronin sisäiselle sekvenssille (Ballance, viite 11) johtaa oletukseen, että pelA-, B- ja C-geeneissä on läsnä neljä intronia. Paikat, joissa intronit sijaitsevat näiden pel-geenien kooditusaluei-den sisällä, ovat konservoituneet siinä merkityksessä, että mahdollisesti on olemassa viisi intronipaikkaa, mutta jokaisesta geenistä puuttuu eri introni. pelC-geenln osalta intro-neita oletetaan olevan kuitenkin vain kolme. Näistä vain yksi havaitaan paikassa, joka vastaa intronipaikkaa pelD;ssä ja pelArssa (introni-5). Näiden intronien paikat ja kutakin koskevat pituudet esitetään yhteenvetona taulukossa Via.

Taulukko via Intronien paikat pelD:n, pelA:n, pelB:n ja pelein sekvensseissä. Paikat viittaavat kooditussekvensseihin kuvioissa 10, 11 ja 12 ja pelD:n sekvenssiin.

geeni pelD pelA pelB pelC

int- paikka pituus) paikka pituus) paikka pituus | paikka pituus roni_ep _ep _ep _ep 1 202-267 66 poissa 1337-1398 62 poissa : 2 410-471 62 1708-1759 52 1543-1598 56 poissa 3 598-660 63 1886-1933 48 1725-1781 57 poissa 4 poissa poissa poissa 1853-1930 78 5 1446-1502 57 2031-2094 64 poissa 1998-2062 65 6 poissa poissa poissa 2232-2294 63 7 poissa 2329-2382 54 2113-2169 57 poissa 54 1 04637

Eksonien pituudet intronien välissä neljän pel-qeenln joukossa ovat samat näissä tapauksissa. Kuviossa 13 esitetään PLA:-n, PLB:n, PLC:n ja PLD:n suoraan riviin asetetut johdetut aminohapposekvenssit. pelA:n, pelB;n ja pelD;n kooditusaluei-den N-terminaalisessa osassa havaitaan suunnilleen 80-%:nen homologia nukleotidisekvenssihomologian perusteella, ja yli 80-%:nen homologia aminohapposekvenssihomologian perusteella. Tämä prosenttisuus on paljon alhaisempi peleillä. pelA;n, pelB:n ja pelD:n C-terminaalisessa osassa toimintavalmiin proteiinin tähde-285:n toisella puolella (vastaten tähdettä 305 kuviossa 13), homologia menetetään suuressa määrin, ja se tulee takaisin vasta C-pään lähellä.

Silmukointisignaali- ja 5'- ja 31-silmukointikohtien konsensus-sekvenssejä lukuunottamatta (taulukko Vlb) introneissa ei todeta homologiaa.

Taulukko Vlb Intronien konsensus-sekvenssien vertailu introni donori- silmukka vastaanottaja- eksoni introni introni eksoni 2

pelD 1 AAGAC GTGAGTTT..32 GGCTHACC..12..TGCCAG TTTGG

pelB 1 AGAAC GTAGGTCG..32..GCCTAACA...8..ATCCAG CTTCG

55 104637

pelD 2 ACCTA GTAAGTTG..37..TGCTGACA...3..GGATAG CAACA

pelA 2 GAATA GTATGTCC..29..ATCTAACT...1..GGATAG CTACA

pelB 2 ACTTA GTATGTTG..31..TGCTGATA..,3..GTATAG TGATA

pelD 3 ATCCA GTATGCAT..3 2..AACTAACC...9..CCACAG GAACA

pelA 3 ATCCA GTAGGTTA..25..CTCTAACG...1..AATCAG GAACA

pelB 3 ATCCA GTGAGTGC..3 3..TGCTAATA...2..GGCCAG GAACA

r

pelD 5 TTACT GTAAGTCG..31..CACTAATG...4..CTTCAG ACTGC

pelA 5 TTACT GTACGTGT..4 0..AGTTAACA...2..TGACAG ACCGC

pelC 5 GCGAG GTAAGACA..3 9..CGTTGACT...4..GATTAG ACCTC

pelA 6 CCAGA GTACGTGT..3 0..AACTAACA..11..TCACAG ACAAC

• ---------—--------— _- .--- *

pelA 7 ACTGT GTAAGTTG..24..ACCTGACT...8..TTGCAG GTCAA

pelB 7 ACGCC GTATGTCG..28..TACTGACA...7..CTACAG GTGAA

KONSENSUS ----- GTA-GT— . . 24 . . —CTAAC- . . . 1. . CAG----- ι

B

g c 40 t G t 12 T I

__a_

Proteiineille PLA, PLB, PLC ja PLD saadut aminohapposekvenssit osoittavat kaikkiaan 359 tähdettä kahdelle ensimmäiselle \ proteiinille, 360 PLC:lle ja 354 PLDrlle. Mitä tulee N-gly- » * kosylaatioon, yksi potentiaalinen glykosylaatiokohta on läsnä kaikissa neljässä proteiinissa paikassa 109 (toimintavalmiissa proteiinissa) (PLC:n osalta tämä vastaa paikkaa 105 ei-suoristetussa sekvenssissä). PLBrssä on läsnä toinen potentiaalinen kohta paikassa 232, kun taas PLD:ssä on läsnä kaksi 56 104637 muuta potentiaalista glykosylaatiokohtaa tähteiden 255 ja 329 kohdalla.

Esimerkki 5: A. nigerin yhteistransformointi käyttäen A. nigerin pyrA-geeniä vallntamarkkerina ja erilaisia A. niqerin pel-qeenejä yhtelstransformolvlna plasmideina Esimerkki 5.1. Plasmidien lisääminen ja puhdistaminen, joita käytetään A. niqerin transformoitiin

Kaikkia plasmideja monistetaan E. coli -kannassa MH1, ja plasmidi-DNA otetaan talteen 500 ml:n yön yli kasvaneista viljelmistä, kuten Maniatis et ai. on kuvaillut ss. 90-91; viite 5)./2,5 ml:n DNA-liuokseen TE-puskurissa, joka sisältää jopa 1 mg DNA:ta, lisätään 2,2 g CsCl:a ja 1 ml etidiumbromi-dia (10 mg/ml vedessä). Liuos siirretään quickseal-putkiin, jotka täytetään ja suljetaan tiiviisti valmistajan suositusten mukaisesti (Beckman). Sentrifugointi suoritetaan VTi 65,2 -roottorissa 20eC:ssa 16 tunnin aikana nopeudella 45000 rpm. Kahdesta fluoresoivasta vyöhykkeestä, jotka ovat näkyviä . ultraviolettivalossa, alempi vyöhyke, joka sisältää plasmidi- DNA:ta, eristetään putken sivupuhkaisun avulla. DNA-liuosta (suunnilleen 1 ml) uutetaan 5 kertaa vedellä kyllästetyllä butanolilla etidiumbromidin poistamiseksi. DNA seostetaan sen jälkeen etanolilla, suspendoidaan uudelleen TE-puskuriin, uutetaan kerran fenoli/kloroformilla ja kloroformilla, seostetaan jälleen ja varastoidaan -20eC:ssa.

Plasmidia pGW613, joka pitää sisällään OMP-dekarboksylaasi-geenin (pyrA) A. nigerin 5,0 kep DNA-palassa, käytetään transformanttien valikoimiseen (Goosen et ai.; viite 12). Plasmideja pGW820, pGW830, pGW840, pGW850, pGW860 ja pGW880, joita kuvaillaan esimerkissä 3.5., käytetään yhteistransfor-: moivina plasmideina.

57 104637

Esimerkki 5.2.: Protoplastien valmistaminen ja uridilni-auk-sotroflsen A. nlgerin mutanttikannan N593 transformolntl A, nlgerin kanta N593 (cspA, pyrA), joka on parentaalin N400-kannan johdannainen, on saatu positiivisen valikoinnin avulla toksista analogia, 5-fluorioroottihappoa, vastaan kuten hiivassa (Boeke et ai.; viite 13) uridiinin läsnä ollessa, kuten Goosen et ai. on kuvaillut; (viite 12).

*

Nestemäiseen minimaalialustaan, johon on lisätty 0,5 % hii-vauutetta, 0,2 % cas-aminohappoja, 10 mM uridiiniä (Janssen Chimica) ja 50 mM glukoosia, siirrostetaan 10^ A. nlgerin N593 konidiosporia ml:aa kohti, ja inkuboidaan 20 tunnin ajan 30°C:ssa New Brunswickin pyöriväliikkeisessä ravistelijassa.

Rihmasto otetaan talteen suodattamalla, Mira-kankaan läpi, pestään iso-osmoottisella (STS) minimaalialustalla (STC), jossa on seuraava koostumus: 1,33 M sorbitolia, 10 mM Tris-HCl:a pH 7,5, 50 mM CaCl2ia, säädettynä arvoon 1,7 mOsm. l g rihmastoa suspendoidaan uudelleen 20 ml:aan STC:a. Protoplas-. tit vapautetaan rihmastosta 2 tunnin sisällä lisäämällä 250 mg suodattamalla steriloitua Novozym 234:ää (Novo Industries, Tanska), ja inkuboimalla seosta 30eC:ssa ravistelijassa nopeudella 95 rpm. Protoplastit erotetaan myseelijäänteistä suodattamalla, käyttäen suppiloa, jossa on lasivillatuppo, ja puhdistetaan sentrifugoimalla (10 min. 2500 rpm) pelletiksi ja suspendoimalla uudelleen STC:hen.

Transformaatiota varten, 5 x 106 protoplastia siirretään 200 - yl:aan, joita inkuboidaan sen jälkeen yhdessä 1 yg:n kanssa Γ plasmidia pGW613 ja 10 yg:n kanssa yhtä seuraavista plasmi- \ deista pGW820, pGW830, pGW850, pGW860 tai pGW880 (tilavuus • pienempi kuin 20 yl). pGW840:n osalta käytetään suhdetta 1:3, , - ' ottamalla 6 yg plasmidia pGW613. Plasmidi-DNA:n lisäämisen

jälkeen protoplasteihin, 50 yl PCT:tä (10 mM Tris-HCl:a pH

7,5, 50 mM CaCl2:a, 25 % PEG6000:a) lisätään, ja inkubaatio-seosta pidetään jäissä 20 minuutin ajan.

58 104637

Sen jälkeen lisätään vielä 2 ml PCT:tä, ja seosta inkuboidaan vielä 5 minuuttia huoneen lämpötilassa. Lopuksi lisätään 4 ml STC:tä ja sekoitetaan. 1 ml:n eriä tätä lopullista trans-formaatioliuosta sekoitetaan 4 ml:n kanssa nesteytettyä iso-osmoottista MM pinta-agaria, joka on stabiloitu 0,95 M sakkaroosin avulla (säädettynä arvoon 1,7 mOsm). Protoplastiseos maljataan välittömästi agarmaljoille, jotka sisältävät samaa iso-osmoottista minimaalialustaa, ja näitä inkuboidaan 30°C:-ssa. Sopivat kontrollikokeet sisältävät protoplasteja, joita on käsitelty samalla tavalla ilman plasmidi-DNA:ta ja stabiloimattomalla minimaalialustalla, joka sisältää 2,5 mM uri-diiniä. /

Kolmen kasvatuspäivän jälkeen 30eC:ssa, hyvin kasvavat trans-formantit tulevat näkyviin, jotka sporuloivat (50-150 trans-formanttia/pg plasmidia pGW613). Sen lisäksi tulee näkyviin suuri määrä luultavasti hylkääviä (abortive) transformantte-ja. Yksittäisten transformanttien itiöitä otetaan sen jälkeen . ja maljataan erikseen 50 mM glukoosia sisältävälle minimaali- alustalle erillisten pesäkkeiden saamiseksi, joita käytetään itiöiden lisäämiseksi transformanttien lisäanalyysejä varten.

Kussakin tapauksessa viljellään vähintään kymmentä transfor-manttia nestemäisessä minimaalialustassa, DNA:ta uutetaan, ja siitä analysoidaan yhteistransformoivan plasmidi-DNA:n läsnäolo. Sienen DNA:ta eristetään lievästi modifioidulla menetelmällä, jota käytetään kasvi-RNA:n eristämiseksi (Slater, viite 14). Rihmasto pestään saliinilla, jäädytetään nestetypessä, ja 0,5 g hajotetaan, käyttäen mikrodismembraat-toria (Braun). Rihmastojauhetta uutetaan vastavalmistetulla ·, uuttopuskurilla. Uuttopuskuria valmistetaan seuraavasti: 1 ‘ ml tri-isopropyylinaftaleenisulfonihappoa (TNS), 20 mg/ml, sekoitetaan liuoksen kanssa, joka sisältää l ml:n p-aminosa-lisyylihappoa (PAS) (120 mg/ml) ja 0,5 ml 5 x RNB-puskuria (5 x RNB sisältää 121,1 g Tris:a, 73,04 g NaCl:a ja 95,1 g EGTA:a 1 litrassa, pH 8,5). Sen jälkeen kun on lisätty 1,5 i 59 104637 ml fenolia, uuttopuskuria tasapainotetaan 10 minuutin ajan 55°C:ssa. Lämmintä puskuria lisätään sen jälkeen rihmasto-jauheeseen, ja suspensiota sekoitetaan perusteellisesti 1 minuutin ajan käyttäen pyörresekoittajaa. Sen jälkeen lisätään 1 ml kloroformia ja sekoitetaan l minuutin ajan.

w vesifaasi erotetaan sentrifugoimalla (10 min. 10000 x g) ja # uutetaan kerran vielä yhtä suurella tilavuudella fenoli/klo-roformia (1:1) ja sen jälkeen kahdesti kloroformilla.

vesifaasi sisältää sekä RNA:ta että DNA:ta. DNA saostetaan 2 tilavuudella etanolia huoneen lämpötilassa ja otetaan talteen sentrifugoimalla (10 min. 10000 x g), pestään kahdesti liuottamalla uudelleen steriiliin tislattuun veteen ja saostamalla jälleen etanolilla. RNA poistetaan lisäämällä RNAasi A:ta (20 yg/ml) lopulliseen liuokseen. Menettelystä on tuloksena suurimolekyylipainoinen DNA (100-200 kep), saannon ollessa noin 300 yg DNA:ta/g rihmastoa, jota puhdistetaan edelleen ; CsCl/etidiumbromidi-tiheysgradienttisentrifugoinnilla pää asiallisesti Maniatiksen et ai. mukaisesti, s. 93; viite 5).

Kromosomaalisen DNA:n (2 yg) pilkkomiset suoritetaan inkuboi-malla 2 tunnin ajan 37eC:ssa EcoRI:llä pelA (pGW820)- ja pelc (pGW850)-transformanttien osalta, HindIII:lla pelB (pGW830)-transformanttien osalta, EcoRI:llä tai BglII:lla pelD-trans-formanttien osalta. Kaikissa tapauksissa käytetään alussa 20 U:ta restriktioentsyymiä, minkä jälkeen inkubointia jatketaan toiset 2 tuntia lisäämällä jälleen 20 U:ta restriktioentsyy-mejä. Pilkkomiset suoritetaan BRL:n toimittamissa sopivissa reaktiopuskureissa.

» « , ' DNA jaetaan sen jälkeen osiin 0,6-%:sella agaroosilla, blota- taan nitroselluloosakalvoilla ja hybridisoidaan pääasiallisesti siten kuin Maniatis et ai. on kuvaillut (viite 5), ss. 382-386, käyttäen vastaavia [a-32 P]-leimattuja koettimia.

βη 104637

o U

Seuraavat yhteistransformaation frekvenssit todetaan: pGW820 (pelA) 70 %; pGW830 (pelB), 70 %; pGW840 (pelD) 15 %; pGW850 (pelC) 60 %.

Plasmidin pGW613 massasuhde yhteistransformoivia plasmideja pGW820, pGW830, pGW850 (1:10) ja pGW840 (1:3) vastaan johtaa suurimmassa osassa havaittuja tapauksia yhteistransformoivien plasmidien kromosomaaliseen monikopiointegraatioon.

Esimerkki 5.3.: pelA:lla transformoidun A. niger -kannan AI5 qenomianalyys i

Muutama esimerkissä 5.2. kuvailtu monikopiotransformantti on analysoitu, ja pelA-transformantln A15 analyysi esitetään yksityiskohtaisena esimerkkinä.

A. niger -kannan N593 ja monikopioisen pelA-transformantti-kannan AI5 DNA:ta eristetään ja analysoidaan Southern-blot-tien hybridisaation avulla kuten esimerkissä 3.1. on kuvail-. tu. pelA-koettlmena käytetään 7,5 kep EcoRI-palaa (katso kuvio 3a). Genomiblotissa todetaan voimakas 7,4 kep:a sisältävä vyöhyke transformoidussa A15-kannassa, joka johtuu I-tyypin ja/tai II-tyypin integraatiotapahtumista (vrt. Hinnen et ai., viite 14a). Myös joitakin vähäisempiä, pituudeltaan vaihtelevia vuyöhykkeitä havaitaan, jotka edustavat reunapa-loja uudelleenjärjestymisen II-tyyppisistä integraatiotapahtumista.

7,4 kep EcoRI-vyöhykkeiden optiset tiheydet A. nlgerln pelA-transformanteissa A15 ja A. niger N593:n autoradiogrammit selataan käyttämällä Ultroscan XL -laitetta (LKB). Arvot korjataan pienten eroavuuksien osalta DNA-pitoisuudessa N593:n ja transformantin A15 välillä, selaamalla saadut tiheydet toisen koettimen kanssa, joka hybridisoituu pyruvaat-tikinaasi-geenin kanssa, joka on läsnä yksinkertaisena kopiona molemmissa kannoissa. Näistä tuloksista lasketaan, että pelA-transformantissa AI5 on läsnä suunnilleen 19 pelA-geenin kunnossa olevaa kopiota.

61 104637 Käyttäen plasmidin pGW830 Hindlll-inserttiä (kuvio 3b) koettimena, transformoidun kannan A15 Southern-blotin analyysi osoittaa, että pelA-sekvensslen yhdistymistä ei ole tapahtunut pelB-lokuksessa. Samalla tavoin, transformoidun pelB-kannan B13, pelC-kannan C16 ja pelD-kannan D12 analyysi vastaavien sopivien koettimien kanssa antaa kopiomääriksi suunnilleen 15, 50 ja 10.

ψ

Esimerkki 5.4.: pelA-transformoldun A. nlqer -kannan AI5 ja A. niqer N400:n Indusoitujen ja ei-lndusoitujen rihmastojen Northern-blot-analyysi

Minimaalialusta (250 ml), joka sisältää 50 mM glukoosia tai 1 % (w/v) omenapektiiniä (Brown Ribbon, d.e. 72,8 %, Obipek-tin AG, Bischofszell) siirrostetaan itiötiheydessä 10® itiö-tä/ml transformantin A15 itiöillä tai villityypin kannan N40Q itiöillä, otetaan talteen 30 tunnin kasvatuksen jälkeen 30 °C:ssa. Viljelyalustanäytteet (2 ml) otetaan myös talteen, dialysoidaan 2 litraa vastaan 10 mM natriumfosfaatti-puskuria . pH 7,0 4eC:ssa ja varastoidaan -20eC:ssa.

Nukleiinihapot eristetään rihmastosta kuten esimerkissä 5.2. on kuvailtu. RNA saostetaan vesifaasista kloroformilla uuttamisen jälkeen lisäämällä 1/3 tilavuutta 8 M LiClra. Liuosta sekoitetaan perusteellisesti ja inkuboidaan yli yön 0eC:ssa. RNA otetaan talteen sentrifugoimalla (300 rpm 30 minuutin ajan) käyttäen MSE Super Mlnor-sentrifugia, ja pestään sen jälkeen kerran kylmällä (-20oC) 2 M LiClrlla ja kerran kylmällä (-20eC) 96-%:sella etanolilla. Lopuksi RNA liuotetaan tislattuun veteen pitoisuudessa noin 1 mg/ml. Valmisteet ovat olennaisesti vapaat DNA:sta, saannon ollessa 1-2 mg RNA:ta/g rihmastoa. Suunnilleen 10 yg:n eriä RNA:ta ajetaan denaturoivilla fprmaldehydi/1-%:silla agaroosigeeleillä Maniatiksen et ai. mukaisesti (ss. 202-203; viite 5) käyttäen Hindlllrlla pilkottua lambda-DNA:ta tai RNA-tikapuumarkkeria (RNA-ladder) (BRL) molekyylipainomarkkereina. Geelit blotataan ja paistetaan Nytran'illa (Schleicher ja Schuell) valmistajan suosi- 62 104637 tusten mukaisesti, ja hybridisoidaan 68°C:ssa 16 tunnin aikana 7,4 kep EcoRI pelA -DNA-koettimen kanssa. Hybridisaatio- ja pesusuoritukset ovat samat kuin mitä on kuvailtu DNA-hybridisaatiolle homologisissa olosuhteissa esimerkin 3.2. mukaisesti.

Molemmat A. niqer-kannat tuottavat pektiinillä indusoituvaa mRNA:ta, jonka pituus on suunnilleen 1,6 kep:a. Kahden auto-radiogrammin optisten tiheyksien selaaminen osoittaa 15-20 kertaisen eron voimakkuudessa A15-transformantin ja villi-tyyppikannan välillä, mikä korreloi kopioluvun kasvun kanssa, laskettuna Southern-blot-analyysistä.

Esimerkki 5.5.: Pektiinilyaasin tuotanto transformoidun A. niqer -kannan Dl2 avulla A. nlgerin pelD-transformanttia D12, joka on saatu esimerkin 5.2. mukaisesti, kasvatetaan 2-vaiheisessa viljelymenettelys-sä, joka on samankaltainen kuin Hermersdörferin et ai. 27 kuvailema menetelmä polygalakturonaasin tuottamiseksi. Rih- >’ mastokerros muodostetaan nestemäisen viljelmän pinnalle sää tämällä 106 itiötä/ml esiviljelyalustaa (PCM, Pre Cultivation Medium), joka sisältää sokerijuurikasmassaa (4 %) ja NH4N03:a (1 %) pH 4,5. Viiden päivän kasvatusjakson jälkeen 30°C:ssa, 30 ml:ssa alustaa kasvanut rihmasto pestään saliinilla ja siirretään 50 ml:aan pääviljelyalustaa (MCM, Main Cultivation Medium). Tätä viljelmää kasvatetaan 30°C:ssa pyöriväliikkei-sessä ravistelijassa nopeudella 100 rpm. MCM:n koostumus alustalitraa kohti on: glukoosia (5 %), pektiiniä (d.e. 72,8 %; 0,1 %), NH4N03:a (0,75 %), KH2P04:a (0,5 %), FeS04.7H20:ta (0,03 %), MgS04.7H20:ta (0,03 %), CaC03:a (0,03 %), NaN03:a (0,03 %) pH 4,5. Näytteitä on otettu 24 tunnin aikana eri : aikavälein, ja ne analysoidaan SDS-polyakryyliamidigeelie- lektroforeesilla. pelD:n ilmentyminen on maksimaalista jo 7 viljelytunnin kuluessa. Proteiini kulkeutuu samalla tavalla kuin referenssinä käytetty PLI.

104637 6 3

Esimerkki 5.6.; Pektiinilyaasi A:n tuotanto transformoidun A. niqer -kannan AI5 ja A. niger N400:n avulla.

Dialysoidut viljelmäsuodokset (esimerkki 5.4.) lyofilisoi-daan, resuspendoidaan 0,2 ml:aan tislattua vettä ja siirretään SDS-polyakryyliamidielektroforeesiin (10-%:set geelit) käyttäen standardimenetelmiä (Laemmli, viite 15). Erotellut proteiinit siirretään nitroselluloosalle (Towbin et ai., viite 16). Blotit kyllästetään 5 tunnin aikana huoneen lämpötilassa l-%:sen BSA-liuoksen kanssa 10 mM Tris-HCl-puskurissa pH 7,5, joka sisältää 0,35 M NaCl:a. Tätä seuraa 16 tunnin inkubointi huoneen lämpötilassa polyklonaalisen vasta-aineen kanssa (0/, 1 %), joka on tarkoitettu (kehitetty) kahta pek-tiinilyaasia vastaan, jotka on puhdistettu van Houdehoven'in (1975) mukaisesti 50 ml:ssa samaa puskuria, joka sisältää 150 mM NaCl:a, 0,5 % BSAm:a, 1 % Triton X100:aa, 0,5 % deok-sikolaattia ja 0,1 % SDS:a. Blotteja huuhdellaan sen jälkeen 5 kertaa 200 ml:11a PBS:a ennen inkubointia 30 μ1:η kanssa vuohen anti-kani IgG-HRP:a (Sigma) toisena vasta-aineena 50 ; ml:aa kohti, ja pestään jälleen 5 kertaa PBS:llä. Blotit • värjätään lopuksi käyttäen 4-kloori-l-naftolia substraattina.

40 mg substraattia liuotetaan 0,5 ml:aan 96-%:sta etanolia ja sekoitetaan 100 ml:n kanssa liuosta, joka sisältää 50 mM Tris-HCl:a pH 7,5 ja 30 yl 30-%:sta vetyperoksidia, ja lisätään sen jälkeen blotteihin.

Esimerkki 5.7.: pelA-transformoitui en kantojen seulonta ke- r hänmuodostuksen avulla pektllnlä sisältävillä kiinteillä alustoilla.

pelA-transformoltujen kantojen itiöitä siirrostetaan itiöti- = heydessä suunnilleen 40 pesäkettä petrimaljaa kohti steriili- ^ en paperisuodinten päälle (Schleicher ja Schuell), jotka . ' asetetaan l-%:lla agarilla jähmetetyn minimaalialustan pin nalle, joka sisältää 0,01 % Triton-X100:a ja omenapektiiniä (1 %, d.e. 72,8 % Obipektin) hiilenlähteenä. Inkubointiaika on 72 tuntia 30eC:ssa, mistä on seurauksena erillisiä pesäkkeitä (2-4 mm). Paperisuodin siirretään toiseen steriiliin 64 104637 petrimaljaan, ja alustaa sisältävä malja värjätään vähintään 5 ml:lla ruteenipunaisen (0,1 % w/v) liuosta tislatussa vedessä, inkuboidaan 2 tunnin ajan ja pestään sen jälkeen useita kertoja tislatulla vedellä adsorboitumattoman väriaineen poistamiseksi, noudattamalla pääasiallisesti Ried'in ja Coll-mer'in kuvailemaa menetelmää (viite 17) polygalakturonaatille bakteeristen pektaattilyaasientsyymiaktiivisuuksien karakte-risoimiseksi.

Transformantit, jotka tuottavat liikaa PL A -proteiinia, havaitaan kehän halkaisijan suurenemisena yksittäisten pesäkkeiden ympärillä, verrattuna parentaaliin N400-kantaan.

Esimerkki 6: Pektilnilyaasi A:n (PLA) eristäminen, puhdistaminen ja karakterisoiminen A. nlqerin pelA-transformantista AI 5.

Esimerkki 6.1.; Viljelyolosuhteet pektlinilyaasl A:n valmistamiseksi A. nlqerin pelA-transformanttia A15, jota on kuvailtu esimerkissä 5, kasvatetaan täysalustalla petrimaljoilla 3 päivää 28°C:ssa itiöiden tuottamiseksi. Itiöt otetaan talteen maljoilta suspendoimalla itiöt 5 ml:aan steriiliä saliinia, joka sisältää 0,005 % Tween 80:tä. Suspensiota ravistellaan voimakkaasti Griffin-ravistelijalla 20 minuutin ajan. Minimaa-lialustalle (viite 21), joka sisältää 1 % (w/v) omenapektii-niä (Brown Ribbon, d.e. 72,8 %; Obipektin AG, Bischofzell), siirrostetaan itiöitä tiheydessä 106 itiötä/ml, käyttäen 250 ml alustaa 1 litran silikonoiduissa erlenmeyer-pulloissa. Rihmastoa kasvatetaan 40 tunnin ajan 30eC:ssa, käyttäen Gal-lenkamp'in pyöriväliikkeistä ravistelijaa nopeudella 200 rpm.

. Viljelyn jälkeen rihmasto poistetaan suodattamalla Mira-kan- « kaan läpi käyttäen Biichner-suppiloa. Kasvustosuodos (viite 21) laimennetaan tislatulla vedellä (viite 21), suodoksen pH (pH 3,7) säädetään arvoon 6,0 käyttäen 1 N NaOHiia, ja suodatetaan sen jälkeen jälleen käyttäen Whatman 1 -suodinpaperia.

65 104637

Esimerkki 6.2.: PLA:n puhdistaminen

Laimennettu kasvustosuodos (4 1) sijoitetaan DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia)-kolonniin (10 cm x 2,6 cm), esitasapai-notetaan 20 mM natriumfosfaatti-puskurilla pH 6,0. Kolonnia eluoidaan samalla puskurilla kunnes absorbanssi aallonpituudessa 280 nm saavuttaa arvon <0,1 O.D. Pektiinilyaasiaktiivi-suus eluoidaan sen jälkeen kolonnista sijoittamalla kolonniin lineaarinen gradientti, joka koostuu 20 mM natriumfosfaatti-puskurista (150 ml) ja 20 mM natriumfosfaattipuskurista, joka sisältää l M NaCl:a (150 ml).

Fraktioista määritetään aktiivisen pektiinilyaasin läsnäolo van Houdenhovenin (viite 18 s. 11) kuvaileman menetelmän mukaisesti, käyttäen Brown Ribbon -pektiiniä (d.e. 72,8 %) substraattina. Aktiivisuutta esiintyy 0,43 M NaCl-pitoisuuden lähettyvillä suolagradientissa. Aktiiviset fraktiot kerätään sen jälkeen yhteen ja dialysoidaan kahdesti 1 litraa vastaan 20 mM piperatsiini-HCl -puskuria pH 5,5 (näytekoko: 45,5 ml).

* : Seuraavassa vaiheessa dialysoitu näyte jaetaan kolmeen yhtä suureen osaan, jotka analysoidaan anioninvaihtokromatogra-fiällä kolmessa erillisessä ajossa, käyttäen standardia Pharmacia MONO Q -kolonnia yhdessä Pharmacian FPLC-systeemin kanssa. Kolonni esitasapainotetaan 20 mM piperatsiini-HCl -puskurilla pH 5,5. Entsyyminäytteen lataamisen jälkeen, kolonnia eluoidaan samalla puskurilla virtausnopeudella 1 ml/-min., kunnes perustasoinen absorbanssi saavutetaan jälleen. Sen jälkeen sijoitetaan lineaarinen suolagradientti. 22 ml:-ssa eluointipuskuria saavutetaan 0,6 M NaCl-loppupitoisuus.

Aktiivinen fraktio (4,4 ml) otetaan talteen, laimennetaan 25 ml:ksi käyttäen tasapainopuskuria, ja sama kromatografiame-nettely toistetaan.

Kaksi fraktiota, jotka sisältävät aktiivista entsyymiä (kokonaistilavuus 3 ml), dialysoidaan sen jälkeen 25 mM piperat- 66 104637 siinipuskuria vastaan pH 5,0 ja injisoidaan 1 ml:n erissä MONO P -kolonnin (Pharmacia) pinnalle, joka on esitasapaino-tettu samalla puskurilla. Injektioiden jälkeen muodostetaan pH-gradientti, käyttäen monipuskurin TM 74 5-%:sta liuosta (tislatussa vedessä, jonka pH on säädetty arvoon 3,0 käyttäen 4 N HCl:a). Aktiivinen entsyymi (3,2 ml) tulee näkyviin pH:n 3,2 tienoilla. Valmistetta dialysoidaan tehokkaasti 50 mM natriumfosfaatti-puskuria vastaan pH 6,0, ja sitä säilytetään -20eC:ssa. Puhdistustulokset esitetään yhteenvetona taulukossa Vila, ja niitä verrataan samanlaisiin pektiinilyaasin puhdistustuloksiin, jonka on tuottanut A. nigerin kanta N400 (taulukko/· vilb).

Taulukko Vila ja Vllb. Pektiinilyaasi A:n puhdistuskaavio A. niger pelA N593 transformantista ja pektiinilyaasin puhdistuskaavio A. nigerin kannasta N400.

Vila 1' Vaihe Tilavuus Kokonaisaktiivisuus Spesifinen pek- ml (I.U.) tiinilyaasiakti visuus (I.U./mg proteiinia DEAE Sepharose 45,5 39,8 4,9 MONO Q kromato- grafia (2 x) 2,3 19,9 18,4 MONO P kromato- grafia 3,2 17,4 28,6

Vllb villityyppi DEAE Sepharose 43,0 10,1 0,9 MONO Q kromato- grafia (2 x) 1,1 2,5 6,3 MONO P kromato- grafia 1,4 1,7 10,0 67 104637

Proteiinipitoisuudet on määritetty käyttämällä BCA proteii-ninmääritysreagenssia (Pierce) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Verrattuna villityypin kokonaisaktiivisuuteen, pGW820:llä # transformoidun A. niger N592:n kokonaisaktiivisuus on lisääntynyt puhdistamisen jälkeen noin 10-kertaisesti ja spesifi- ·* nen aktiivisuus noin 3-kertaisesti.

Esimerkki 6.3.: Pektiinilyaasi A:n N-terminaalisen osan aminohapposekvenssin määrittäminen.

500 yg pektiinilyaasia (PLA), joka on puhdistettu esimerkin 6.2. mukaisesti, dialysoidaan kolme kertaa 1 litraa vastaan Millipore-suodatettua tislattua vettä ja lyofilisoidaan. Aminohapposekvenssit määritetään Applied Biosystems'in malli 470A proteiinisekvensointilaitteella, joka on kytketty linjassa 120 A PTH-analysaattoriin Hunkapillerin (viite 17) kuvaileman menetelmän mukaisesti.

Seuraava N-terminaalinen aminohapposekvenssi määritetään entsyymille: VAL-GLY-VAL-SER-GLY-SER-ALA-GLU-GLY-PHE-ALA-GLU-?-VAL-THR-GLY-GLY-GLY-ASP-ALA.

Siten määritetty aminohapposekvenssi vastaa tarkalleen sekvenssiä, joka perustuu pelA-qeenln nukleotidisekvenssiin (katso esimerkki 4.2.).

, Esimerkki 6.4.: Pektiinilyaasi A:n ominaisuuksia .· Sekä A. niqerin kantaa N400 että pelA-transformanttia A15 „ ' viljellään kuten esimerkissä 6.1. on kuvailtu, ja entsyymi puhdistetaan kasvustosuodoksesta esimerkin 6.2. menettelyn mukaisesti. Siten saatuja kahta entsyymivalmistetta on vertailtu pektiinilyaasi II:een, joka puhdistetaan van Houden-hovenin (viite 18) mukaan.

68 104637 SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesista, käyttäen 10-%:siä geelejä, on tuloksena jokaisessa kolmessa tapauksessa yksinkertainen, molekyylipainoltaan identtinen vyöhyke, käyttäen kussakin tapauksessa 2-5 pg proteiinia.

Isoelektrinen fokusointi on suoritettu käyttäen standardi-menetelmiä (katso esim. Pharmacian ohjelehtinen, Isoelectric Focusing, 1982). FSBE-3000-laitetta ja vastaavaa virtalähdettä ECPS 3000/150 (Pharmacia) on käytetty. Saatu PLA on homogeeninen isoelektrisessä fokusoinnissa, ja sen isoelektrinen piste on alhaisempi (0,2 pH-yksikköä) kuin PLII:lla, jonka on raportoitu olevan 3,75 van Houdenhovenin mukaan (viite 18). PLII, joka on puhdistettu N400:n viljelysuodok-sesta, on heterogeeninen isoelektrisessä fokusoinnissa. Pää-vyöhyke vastaa sijainniltaan PLA-proteiinia. Kaksi vähäisempää vyöhykettä siirtyy lievästi katodia kohti. A. nigerin monikopiotransformantista A15 puuttuu näin ollen vähäisemmät entsyymimuodot, jotka havaitaan N400:ssa.

* ' PLA:n ja PLII:n kineettisten parametrien suora vertailu, jotka parametrit jälkimmäisessä tapauksessa osoitettiin van Houdenhovenin toimesta (viite 18), käyttäen 95-%:ista este-röityä omenapektiiniä substraattina, osoittaa molemmille entsyymeille identtiset Km- ja vmaks.-arval: ·

Esimerkki 7: Pektiinilyaasi D:n (PLD) eristäminen, puhdistaminen ja karakterisointi A. nigerin pelD-transformantista D12 Esimerkki 7.1.: Viljelyolosuhteet pektiinilyaasi D:n valmistamiseksi

Esimerkin 5.2. mukaisesti saatua A. nigerin pelD-transfor-manttia D12 viljellään aluksi esimerkin 5.5. mukaisesti 300 . ml:n erissä. Viiden päivän kasvatusjakson jälkeen PCM:ssä • 30eC:ssa, rihmastokerros siirretään 20 mM natriumfosfaatti- puskuriin (pH 6,0), joka sisältää 0,1 M natriumkloridia. Ravistelemalla rihmastoa 150 ml:ssa pyöriväliikkeisessä ravisteli jassa nopeudella 200 rpm 2 tunnin ajan, suurin osa pektiinilyaasista vapautuu kasvualustaan.

69 1 0 4 6 3 7

Esimerkki 7.2: PLD:n puhdistaminen

Rihmaston poistamisen jälkeen suodattamalla, entsyymiliuos sijoitetaan DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) -kolonniin (25 cm x 1,25 cm), joka on esitasapainotettu 20 mM natrium-fosfaatti-puskurilla (pH 6,0), joka sisältää 0,2 M natrium-kloridia. Kolonnia eluoidaan samalla puskurilla, kunnes ab-sorbanssi aallonpituudessa 280 nm saavuttaa arvon <0,1. Pek-' tiinilyaasiaktiivisuus eluoidaan kolonnista käyttämällä line aarista natriumkloridigradienttia (0,2 - 0,7 M) 20 mM nat-riumfosfaatti-puskurissa (pH 6,0) (kokonaistilavuus 800 ml). Fraktiot seulotaan pektiinilyaasi D:n läsnäolon osalta SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja Western-blottauk-sella (Towbin et ai., viite 16) kuten esimerkissä 5.6. on kuvailtu. Fraktiot, jotka sisältävät pektiinilyaasi D:tä, kerätään yhteen ja dialysoidaan 20 mM natriumfosfaatti-pusku-ria (pH 6,0) vastaan, joka sisältää 0,15 M natriumkloridia, ja siirretään anioninvaihtokromatografiaan, käyttäen Pharma-cian MONO Q -standardikolonnia yhdessä FPLC-systeemin kanssa. Lataamisen jälkeen kolonni pestään samalla puskurilla ennen-V kuin sijoitetaan 50 ml lineaarista natriumkloridigradienttia 20 mM natriumfosfaatti-puskurissa (pH 6,0). Aktiiviset fraktiot kerätään talteen, ja 1 ml:n eriä sijoitettiin 100 ml:n Superose-12-geelipermeaatiokolonniin, joka oli tasapainotettu 20 mM natriumfosfaatissa (pH 6,0), joka sisälsi 0,2 M natriumkloridia, ja joka oli liitetty FPLC-systeemiin. GPC-kolonnista saadut aktiiviset entsyymitraktiot (kukin 1 ml) analysoidaan SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla saadun pektiinilyaasin puhtauden tarkistamiseksi.

Taulukko VIII Pektiinilyaasi D:n puhdistuskaavio A. nlqerln pelD-transformantista D12.

f Λ

Vaihe tilavuus aktiivisuus spesifinen pektiini- (ml) (I.U.) lyaasiaktiivisuus (i.U./mg proteiinia) 70 1 0 4 6 3 7 viljelysuodos 1950 109 0,096 DEAE -

Sepharose FF 103 32,2 5,65

FF

MONO Q ja GPC 14,5 10,4 7,5

Esimerkki 7.3: Pektllnllyaasl D:n N-termlnaalisen osan aminohapposekvenssin määrittäminen 500 yg pektiinilyaasi D:tä, joka on puhdistettu esimerkin 6.2. mukaisesti, dialysoidaan kolme kertaa yhtä litraa vastaan Millipore-suodatettua tislattua vettä ja lyofilisoidaan. Aminohapposekvenssit määritetään Applied Biosystems'in malli 470A proteiinisekvensointilaitteella, joka on suoraan kytketty 120 A PTH-analysaattoriin, Hunkapiller'in (viite 19) kuvaileman menetelmän mukaisesti.

Entsyymille määritettiin seuraava N-terminaalinen aminohapposekvenssi: VAL-GLY-VAL-SER-GLY-THR-PRO-VAL-GLY-PHE-ALA-SER-SER-ALA-THR-

GLY-GLY-GLY-ASP-ALA-THR

Määritetty aminohapposekvenssi vastaa tarkalleen sekvenssiä, joka perustuu pelD-geenin nukleotidisekvenssiin.

Esimerkki 8: Pektiinilyaasi B:n (PLB) eristäminen, puhdistaminen ja karakterisointi A. nigerin transformantista B13.

*: Esimerkki 8.1.: Viljelyolosuhteet pektiinilyaasi B:n valmis tamiseksi

Esimerkin 5.2. mukaisesti saatua A. nigerin pelB-transfor-manttia B13 analysoidaan monikopio-ominaisuuden osalta esimerkin 5.3. mukaisesti. Northern-blot -analyysi, esimerkissä 5.4. kuvaillun menetelmän mukaisesti, osoittaa, että pektii- 71 104637 nillä indusoituvaa mRNA:ta muodostuu, jonka pituus on suunnilleen 1,6 kiloemästä. Kasvatusta, joka kestää 35 tuntia 30*C:ssa minimaalialustassa, joka sisältää l % (w/v) citrus-pektiiniä (d.e. 72,8 %) ja 1 % vehnän leseitä, käytetään entsyymin tuottamiseen, kuten esimerkissä 5.4. on kuvailtu.

#·

Entsyymiä muodostuu myös käytettäessä alustaa, joka sisältää 4 % (w/v) sokerijuurikasmassaa ja 1 % NH4N03:a.

Esimerkki 8.2.: PLB:n puhdistaminen

Kasvustosuodos laimennetaan kaksinkertaisesti tislatulla vedellä, ja pH säädetään arvoon 6,0 käyttäen 1 N NaOH:a, ja suodatetaan sen jälkeen jälleen, käyttäen Whatman 1 suodinpa-peria. Laimennettu suodos (2 1) sijoitetaan sen jälkeen DEAE-Sepharose Past Flow (Pharmacia) -kolonniin (9 cm x 3,2 cm), joka esitasapainotetaan 50 mM natriumasetaatti-puskurilla pH

5,0. Osa pektiinilyaasin aktiivisuudesta on läsnä eluaatissa, joka voidaan määrittää van Houdenhovenin kuvailemalla menetelmällä (viite 18, s. 11), käyttäen Brown Ribbon pektiiniä (d.e. 72,8 %) tai runsaasti esteröityä pektiiniä (d.e. 94 %). Pääosa pektiinilyaasiaktiivisuudesta voidaan eluoida käyttämällä suolagradienttia. Tämä aktiivisuus tulee näkyviin suolagradientissa, ja sen todetaan olevan identtinen PLA:n kanssa eluutiokäyttäytymisen ja näennäisen molekyylipainon perusteella SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesissa, kuten esimerkissä 6 on kuvailtu.

DEAE Fast Flow -kolonnin eluaatti dialysoidaan tislattua vettä vastaan ja sijoitetaan MONO S -kolonniin (Pharmacia), joka on etukäteen tasapainotettu 20 mM natriumasetaatti-pus- - kurilla pH 4,5. Entsyymi eluoituu kolonnista käyttämällä 0- 1,0 M natriumkloridi-suolagradienttia samassa puskurissa.

, " Entsyymi eluoituu miltei välittömästi kolonnista. Aktiiviset fraktiot kootaan yhteen ja laimennetaan sen jälkeen suunnilleen nelinkertaisesti tislatulla vedellä. Entsyymiliuoksen uudelleen kromatografoinnista on tuloksena fraktioita, jotka SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesin perusteella sisältävät puhdasta PLB-proteiinia.

72 104637

Esimerkki 8.3.: Pektilnilyaasl B:n ominaisuuksia Esimerkin 8.2. mukaisesti pelB-transformantista B13 puhdistetun entsyymin ominaisuudet määritetään, ja niitä verrataan pektiinilyaasi A:hän ja D:hen.

SDS-polyakryyligeelielektroforeesista, käyttäen 10-%:siä geelejä, on tuloksena yksinkertainen vyöhyke, jonka näennäinen molekyylimassa on 39,7 kDa. Samoissa olosuhteissa PLA:n ja PLD:n näennäiset molekyylimassat ovat 49,1 kDa ja vastaavasti 52,3 kDa.

Isoelektrlnen fokusointi suoritetaan kuten esimerkissä 6.4 on kuvailtu. PLB:n isoelektrlnen piste on 6,0, käytettäessä pH-gradienttia välillä pH 3 ja 7. Näyte sijoitetaan suurinpiirtein paikassa, joka vastaa pl-arvoa 5,0.

Puhdistettu PLB-entsyymi on myös reaktiivinen polyklonaalis-ten vasta-aineiden kanssa, jotka on valmistettu PLI:tä ja PLIl:ta vastaan, mikä testattiin Western-blot -analyysillä. PLD, A ja B voidaan helposti erottaa tällä tavalla näennäisten molekyylimassa-arvojen avulla.

Esimerkki 8.4.: PLB:n kineettisiä ominaisuuksia Esimerkin 8.2. mukaisesti puhdistettua entsyymiä karakterisoidaan kineettisesti. Entsyymi katalysoi pektiinilyaasi-reaktiota ja on aktiivinen laajalla pH-alueella (pH 5-9,5), mikä on testattu Mc Ilvainen puskurissa (μ = 0,5) erilaisissa pH-arvoissa (van Houdenhoven, viite 18). pH-optiml on laaja (pH 7,5-8,5). pH-arvossa 6,0 aktiivisuus on suunnilleen 55 %; pH-arvossa 9,5 tämä on vielä 85 % aktiivisuudesta pH-ar-·: vossa 8,0. Sekä runsaasti esteröityä pektilniä (d.e. 94 %) samoinkuin pektiinejä, joiden esteröitymisaste on alhaisempi, kuten Brown Ribbon pektiini (d.e. 72,8 %); Obipektin AG, Bischofszell), voidaan käyttää substraattina. Korkein aktiivisuus saadaan kuitenkin runsaasti esteröidyllä pektiinillä. Entsyymi ei reagoi polygalakturonaatin kanssa.

73 1 0 4 6 3 7 PLB:n katalysoima pektiinilyaasireaktio voidaan inhiboida lisäämällä EDTA:a reaktioseokseen (3 mM loppupitoisuutta käytetään); entsyymi reaktivoidaan lisäämällä ylimäärä Ca2+-ioneja. pelB koodittaa siten Ca2+-riippuvaista pektiinilyaa-sia. Entsyymin likimääräinen vaihtokerroin 25°C:ssa on 6500

T

ja Km-arvo 2,5 mM, kun käytetään runsaasti esteröityä pek-tiiniä substraattina. Nämä arvot määritetään van Houdenhove-nin (viite 18) menetelmän mukaisesti, käyttäen Mc Ilvainen puskuria pH 8,0 (μ = 0,5).

Esimerkki 9: vieraiden geenien ilmentyminen ja erittyminen pelA-promoottorin säätelyn alaisena

Plasmidin pGW820 3,9 ke Hindlll-pala subkloonataan pBR322:n Hindlll-paikkaan. Ampisilliinille resistenttien transformant-tien plasmidi-DNA:ta analysoidaan Hindlll- ja Sall-restrik-tiohydrolyysien avulla. Yhtä kloonia, joka sisältää pelA-insertin myötäpäiväisessä suunnassa, nimitetään pGW822:ksi. pelA:n indusoituvaa promoottoria käytetään vieraiden geenien ilmentämiseksi A. niqerissä. Täydellinen pelA-geeni on läsnä • · · plasmidissa pGW822. Promoottori ja pelA-signaalisekvenssl sijaitsevat l ke BamHI-Pstl-palassa. Pstl-katkaisukohta nuk-leotidipaikassa 1420 (kuvio 10) sopii yhteen signaalisekvens-sin 3'-pään kanssa, ja sitä voidaan käyttää fuusioitumiseen vieraan geenin kooditussekvenssin kanssa oikeassa lukukehyksessä. pelA:n kopioinnin lopetussignaalit sijaitsevat 1,3 ke sall-Hindlll-palassa.

Esimerkki 9.1.: pelA-geenin subkloonaus vektoriin pUC19 Plasmidin pGW822 3,3 ke BamHI-Hindlll-pala sisältää pelA-, geenin. Pala kloonataan vektorissa pUC19 (Pharmacia), joka " on katkaistu BamHI:llä ja HindIII:lla. Puhdistetut palat ,” ligoidaan. Ligaatioseoserää käytetään transformoitaessa Ca2+- käsiteltyjä, kompetentteja JM109-soluja. 3,3 ke BamHI-Hindlll-palan onnistunut kloonaus vektoriin pUC19 seulotaan ampisilliinimaljoilla X-Gal:n ja IPTG:n läsnä ollessa (T. Maniatis et ai., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 74 104637

Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, s. 52). Valkoiset am-pisilliinille resistentit transformantit poimitaan. Näiden pesäkkeiden plasmidi-DNA:ta analysoidaan BamHI/HindIII-kak-soishydrolyysien avulla. Yhtä oikean insertin sisältävää transformanttia nimitetään pUC19/pelA:ksi. Analoginen konstruktio pUC18:n kanssa johtaa pUC18/pelA:han.

Esimerkki 9.2: Ihmisen hybridi-interferonin BDBB ilmentyminen pelA-promoottorln säätelyn alaisena 9.2.1.: Plasmidin pUC19/pelA-IFN AM119 konstruointi (katso kuvio 14)

Plasmidi pUC19/pelA pilkotaan Sällillä. Lineaarisen palan kohesiiviset päät täytetään reaktiossa Klenow'n DNA-polymeraasi Iin kanssa (BRL), kun läsnä on 0,1 mM kutakin seuraavista dCTP, dGTP, dATP, dTTP, 60 mM Tris.HClia pH 7,5, 10 mM MgCl2:a 30 minuutin aikana huoneen lämpötilassa. Reaktio pysäytetään lisäämällä EDTAia loppupitoisuuteen 12,5 mM. DNA saostetaan etanolilla. Lineaarinen DNA-pala pilkotaan Pstli-llä. Fenoli/kloroformiuuton jälkeen DNA saostetaan etanolil-la.

Kaavan mukainen oligodeoksinukleotidilinkkeri liitetään lineaariseksi tehdyn plasmidin Pstl-kohtaan.

PstI Ddel (I) 5'- TGTGATCTGCC -3' (II) 3'- ACGTACACTAGACGGAGT -5'

Linkkeri täyttää Pstl-paikan vajaat päät, jotka sopivat yhteen pelA-slgnaalisekvenssin pään kanssa ja saa aikaan fuusi-" on interferoni- BDBBin kooditussekvenssiin oikeassa lukuke- • '· hyksessä. (I) edustaa interferonin BDBB-geenin 5'-terminaa lista nukleotidisekvenssiä Ddel-restriktiokohtaan saakka.

200 pmoolia kumpaakin oligonukleotidiä (I) ja (II) fosfory-loidaan ja tehdään kaksijuosteisiksi. Pstlillä katkaistu pUC19/pelA-plasmidi ja 100-kertainen molaarinen ylimäärä 75 104637 kaksijuosteista linkkeri-DNA:ta ligoidaan liuoksessa, joka sisältää 60 mM Tris.HCl:a pH 7,5, 10 mM MgCl2:a, 1 mM ATP:a, 5 mM DTT:a ja 400 yksikköä T4 DNA -ligaasia, 16 tunnin ajan 15eC:ssa. DNA-ligaasia inaktivoidaan 10 minuutin ajan 85°C:-ssa. Ylimäärä linkkereistä poistetaan seostamalla, kun läsnä on 10 mM EDTA:a, 300 mM natriumasetaattia pH 6,0 ja 0,54 tilavuutta isopropanolia.

Suuri 5 ke pala eristetään preparatiivisella 0,6-%:sella agaroosigeelillä. Pala sisältää pelA-promoottori- ja signaa-lisekvenssin (BamHI-[PstI]/linkkeri) ja pelA-terminaattorln ([Sali]ta6attu-HindIII) vektorissa pUC19.

Plasmidi pJDB207/PHO5-IPN AM119 (EP 205404) sisältää geenin hybridi-a-interferonille BDBB hiivan happamen fosfataasln (PH05) säädellyn promoottorin säätelyn alaisena. Plasmidi-DNA pilkotaan BamHI:llä ja HindIII:lla. 1,3 ke BamHI-Hindlll-pala eristetään, joka sisältää PH05-promoottorin, IFN BDBB:n kooditussekvenssin ja PH05:n kopioinnin lopetussekvenssin.

" Pala puhdistetaan DE52-kromatografiällä ja etanolisaostuksel- la, ja pilkotaan vielä Taql:llä. TaqI-restriktiopalojen ko-hesiiviset päät täytetään reaktiossa Klenow'n DNA-polyme-raasi I:n kanssa (BRL), kun läsnä on liuos, joka sisältää 0,1 mM sekä dCTP:tä että dGTP:tä, 60 mM Tris.HClia pH 7,5, 10 mM MgCl2:a, 30 minuutin aikana huoneen lämpötilassa. Reaktio pysäytetään lisäämällä EDTA:a loppupitoisuuteen 12,5 mM. DNA-palat seostetaan etanolilla ja pilkotaan lisäksi Ddel:llä. DNA-palat erotetaan preparatiivisella 0,8-%:sella agaroosigeelillä. 549 ep DdeI-[TaqI]tasattu pala elektroelu-; oidaan geelistä, puhdistetaan DE52-ioninvaihtokromato- grafiällä ja etanolisaostuksella. DNA-pala suspendoidaan * uudelleen veteen pitoisuudessa noin 0,1 pmoolia/yl.

0,2 pmoolia 549 ep DdeI-[TaqIJtasattua palasta ja 0,1 pmoolia 5 ke vektoripalasta ligoidaan 10 pl:ssa liuosta, joka sisältää 60 mM Tris.HCl:a pH 7,5, 10 mM MgCl2:a, 3,5 mM ATP:a, 5 76 104637 mM DTT:a ja 200 yksikköä T4 DNA -ligaasia (Biolabs), 16 tunnin aikana 15eC:ssa. 1 μΐ: erä ligaatioseoksesta käytetään transformoitaessa Ca2+-käsiteltyjä kompetentteja HB101-solu-ja.

Plasmidi-DNA:ta preparoidaan 12:sta ampisilliinille resistentistä pesäkkeestä ja analysoidaan hydrolyysien avulla EcoRI:-llä, PvuIIrlla, Clal:llä ja EcoRI/HindIII:lla. Klooni, joka sisältää odotetun restriktiomallin, valikoidaan. pelA-slgnaa-lisekvenssin ja interferoni BDBB:n toimintavalmiin kooditus-sekvenssin oikeassa lukukehyksessä tapahtunut yhteensulautuminen varmistetaan DNA:n sekvensoinnilla. Valitun kloonin plasmidi-DNA:ta nimitetään pUC19/pelA-IFN AM119:ksi.

Analoginen konstruointi pUC18/pelA:n kanssa johtaa plasmidiin pUCl8/pelA-IFN AM119.

Esimerkki 9.2.2.: Aspergillus nlqer -mutantin An8 yhteis-transformointl pCG59D7:llä ja pUC19/pelA-IFN AM119:llä Uridiini-auksotrofinen mutantti An8 (= DSM 3917, julkaistu EP:ssä 88 101 397,3) transformoidaan plasmidilla pCG59D7, jolloin saadaan uridiini-prototrofeja. Yhdessä transformoivan plasmidin kanssa lisätään ei-valikoivaa plasmidia pUC19/pelA-IFN AM119 satunnaisten yhteisintegranttien saamiseksi yhteis-transformaation yhteydessä.

A. niger An8:n konidiosporeja kasvatetaan 4 päivää 28eC:ssa täysalustassa, kunnes itiöinti on runsasta. 2 x 10® konidios-poria käytetään siirrostettaessa 200 ml minimaalialustaa, johon on lisätty 1 g/1 arginiinia ja uridiinia.

20 tunnin kasvatuksen jälkeen 28eC:ssa ja nopeudella 180 rpm., rihmasto otetaan talteen suodattamalla Mira-kankaan läpi, pestään kahdesti 10 ml:11a 0,8 M KCl:a, 50 mM CaCl2:a ja suspendoidaan uudelleen 20 ml:aan liuosta, joka sisältää 0,8 M KCl:a, 50 mM CaCl2:a, 0,5 mg/ml Novozym 234:ää (Novo 77 104637

Industries). Seosta inkuboidaan ravistelevassa vesihauteessa (30eC, 50 rpm.), kunnes protoplastien maksimaalinen vapautuminen voidaan havaita mikroskooppisesti (90-120 min.). Proto-plastisuspensio suodatetaan lasivillatupon läpi suppilossa rihmastojäänteiden poistamiseksi. Protoplastit pelletoidaan lievällä sentrifugoinnilla (10 min., 2000 rpm.) huoneen lämpötilassa ja pestään kahdesti 10 ml:11a 0,8 M KCl:a, 50 mM CaCl2:a. Protoplastit suspendoidaan lopuksi uudelleen 200-500 yl:aan 0,8 M KCl:a, 50 mM CaCl2:a, jolloin saadaan pitoisuus 1 x 108/ml.

Transformaatiota varten inkuboidaan 200 μ1:η eriä protoplas-tidispersiosta seoksessa, joka sisältää 5 yg plasmidia pCG59D7 ja 10 vg plasmidia pUC19/pelA-IFN AM119, 50 μΐ PCT:a (10 mM Tris.HClta pH 7,5, 50 mM CaCl2:a, 25 % PEG 6000:tta). Inkubointiseosta pidetään jäissä 20 minuutin ajan, PCT:a lisätään vielä 2 ml, ja seosta inkuboidaan vielä 5 minuuttia huoneen lämpötilassa. 4 ml 0,8 M KCl:a, 50 mM CaCl2:a, lisätään, ja 1 ml:aa käsittäviä eriä lopullisesta transformaa-·' tioliuoksesta sekoitetaan lignifoidun minimaalialustan kanssa (minimaalialusta + 1 g/1 arginiinia + 10 g/1 Bacto-Agaria (Difco)), joka on stabiloitu 0,8 M KCl:n kanssa. Seokset kaadetaan välittömästi samaa alustaa sisältäville agarmal-joille ja inkuboidaan 28eC:ssa.

2-3:n kasvatuspäivän jälkeen 28eC:ssa, stabiilit transforman-tit tulevat näkyviin voimakkaasti kasvavina ja itiöivinä pesäkkeinä taustakasvun pinnalla, joka sisältää monia satoja pieniä, luultavasti hylkääviä transformantteja.

„ * Esimerkki 9.2.3.: Hybridi-interferoni BDBB-qeenln .ilmentymi nen pelA-promoottorln säätelyn alaisena 37 transformanttia yhteistransformaatiokokeesta (esimerkki 9.2.2.) poimitaan, ja niistä analysoidaan interferonin ilmentyminen. Interferoniaktiivisuus määritetään Armstrong1in 78 104637 menetelmän mukaisesti (J.A. Armstrong, Appi. Microbiol. 21, 732 (1971)), käyttäen ihmisen CCL-23 -soluja ja vesikulaaris-ta stomatiittivirusta (VSV) tartuttavana (altistavana) viruksena.

Transformanttien konidiosporeja esiviljellään yksittäisesti 50 ml:aan esiviljelyalustaa (Pectin Slow Set L:ää (Unipectin, SA, Redon, Ranska) 3 g/1, NH4Cl:a 2 g/1, KH2P04:a 0,5 g/1, NaCl:a 0,5 g/1, MgS04.7H20:ta 0,5 g/1, CaS04 x 2 H20:ta 0,5 g/1, pH 7,0). Esiviljelmää inkuboidaan 72 tuntia nopeudella 250 rpm ja 28®C. 10 % eslviljelmästä käytetään siirrostetta-essa 50 ml pääviljelyalustaa (soijapavun jauhoa 20 g/1, pek-tiinin Slow Set:iä 5 g/1). Viljelmää kasvatetaan 72-96 tuntiin saakka nopeudella 250 rpm. ja 28°C. Eri ajankohtina (joka 20. tunti) otetaan näytteitä, solut pelletoidaan sent-rifugoimalla ja rikotaan ultraäänihajotuksella. Sekä superna-tantista että solu-uutteista testataan interferonin aktiivisuus kuten on kuvailtu (edellä). Pääosan interferoniaktiivi-suudesta todetaan erittyvän alustaan.

Esimerkki 10: Plasmidin M13(+)KS/pelAA-ss-IFN AM119 konstruointi

Plasmidin M13(+)KS/pelAA-ss-IFN AM119 2,8 ke ekspressio-kasetti sisältää indusoituvan pelA-promoottorin, hybridi-interferonin BDBB kooditussekvenssin ja pelA:n transkriptio-terminaattorin Bluescript Ml3(+)KS-vektorilla. Hybridi-interferoni BDBB ilmentyy ja sijaitsee isäntäsolussa. Plasmidi Ml3(+ )KS/pelAA-ss-IFN AM119 on peräisin plasmidista pUC-18/pelA-IFN AM119 (katso esimerkki 9.2.1.). pelA-slqnaalisek-venssi (ss) silmukoidaan pois paikka-kohdistetun mutageneesin avulla (katso kuvio 15). Hybridi-interferonin, joka ilmentyy rakenteesta ilman signaalisekvenssiä, odotetaan sijaitsevan solunesteessä.

79 104637

Esimerkki 10.1.; pelA-IFN AMI19 -kasetin subkloonaus Blue-scrlpt Ml 3(+)KS -vektoriin

Plasmid! pUC18/pelA-IFN AM119 (katso esimerkki 9.2.1.) pilkotaan BamHIillä ja HindIII:lla. 2,8 ke BamHI-Hindlll-pala sisältää pelA-promoottorln, signaalisekvenssin, IFN BDBB:n kooditussekvenssin ja pelA-terminaattorin. BamHI-Hindlll-pala eristetään ja liitetään Bluescript M13(+)KS (Stratagene) -vektoriin, joka on katkaistu BamHI:llä ja HindIII:lla. Ligaa-tiseoksen näyte-erää käytetään transformoitaessa Ca2+-käsi-teltyjä kompetentteja JM109-soluja. 2,8 ke BamHI-Hindlll-palan onnistunut kloonautuminen M13(+)KS:ään valikoidaan ampisillilnimaljoilla X-Gal:in ja IPTG:n läsnä ollessa. 12 valkoista, ampisilliinille resistenttiä pesäkettä poimitaan. Näiden pesäkkeiden sisältämä plasmidi-DNA analysoidaan BamHI-Bglll-kaksoishydrolyysin avulla. Yhtä transformanttia, joka sisältää oikean insertin, nimitetään Ml3(+)KS/pelA-IFN AM119 -transformantiksi.

Esimerkki 10.2; Yksljuosteisen DNA:n talteenotto soluista, ' jotka sisältävät Bluescript M13(+)KS -plasmldin

Plasmidia M13(+)KS/pelA-IFN AM119 käytetään transformoitaessa kompetentin E. colin kanta CJ236 (dut-1, unq-1, thi-1, relA-l;pCJ105(Cmr); BIO-RAD'in Muta-Gene M13 in vitro -mutagenee-sipakkaus). Tämä kanta sallii urasiilin inkorporoitumisen DNA:hän. Kantaa CJ236 kasvatetaan 10 mlrssa LB-alustaa, joka sisältää 100 mg/ml ampisilliiniä. O.D.600-arvon ollessa 0,5, solut superinfektoidaan fagilla M13K07 (Mead et ai., viite 29) infektiomultiplisiteetissä 50. Yhden tunnin kuluttua 37eC:ssa lisätään kanamysiiniä (50 mg/ml), ja viljelmää inku-boidaan 37eC:ssa ravistelijalla 5-6 tunnin ajan. Plasmidin Ml3(+)KS/pelA-IFN AM119 insertin pelA-IFN AM119 suhteen ei-- * koodittava juoste syntetisoidaan, pakataan ja vapautetaan alustaan. Yksijuosteista DNA:ta preparoidaan viljelmän super-natantista Kunkel'in et ai. mukaisesti (viite 30).

80 104637

Esimerkki 10.3.: Paikkakohdistettu oliqonukleotidimutageneesi yksijuostelselle DNA-templaatille

Paikkakohdistettu deleetiomutageneesi suoritetaan ei-koodit-tavalle yksijuosteiselle pelA-IFN AM119 -templaatille pelA-signaalisekvenssin silmukoimiseksi (kuvio 15).

Mutageeninen aluke sisältää osan pelA-promoottorisekvenssis-tä, mukaanlukien ATG:n (nukleotidipaikat 1343-1363 kuviossa 10) ja 21 nukleotidiä, jotka koodittavat toimintavalmiin IFN BDBB:n aminohappoja 1-7.

Mutageneesiä varten, 200 pmoolia mutageenistä aluketta fosfo-ryloidaan 20 yl:ssa liuosta, joka sisältää 50 mM Tris.HCl:a pH 7,5, 10 mM MgCl2:a, 5 mM DTT:a ja 0,5 mM ATP:a, käyttäen 8 yksikköä T4-polynukleotidikinaasia (Boehringer). Yhden tunnin kuluttua 37eC:ssa reaktio pysäytetään kuumentamalla 65°C:seen 10 minuutiksi.

.. 0,2 pmoolia yksijuosteista templaattia inkuboidaan 10 pmoolin : kanssa fosforyloitua mutageenista oligideoksiribonukleoti-

dialuketta ja 10 pmoolin kanssa M13 sekvensoinnin yleisalu-ketta 30 yl:ssa liuosta, joka sisältää 20 mM Tris.HCl:a pH

7,5, 10 mM MgCl2:a, 50 mM NaCl:a, 1 mM DTT:a 80eC:ssa 5 min. ajan. Liuoksen annetaan jäähtyä hitaasti huoneen lämpötilaan 30 min. ajanjakson kuluessa. Pariutettuun liuokseen lisätään 10 yl entsyymi-dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) -liuosta, joka sisältää 1 yl puskuria [0,2 M Tris.HCl pH 7,5, 0,1 M MgCl2], 5 yl 2 mM dNTP-seosta, 0,5 yl 20 mM ATP:a, 1 yl 0,2 M DTT:a, 0,5 yl T4 DNA -ligaasia (Biolabs, 400 U/yl) ja 1,2 yl Kle-now'n DNA-polymeraasia (BRL, 5 U/yl). Seosta inkuboidaan ’·. 15°C:ssa 16 tuntia. Reaktio pysäytetään inkuboimalla 65°C:ssa • · 10 minuuttia.

1 yl ja 3 yl ligaatioseosta käytetään transformoitaessa 0,2 ml kompetentteja E. colin MV1190 korjaus-miinus -kannan soluja [A(lac-proAB), thi, supE, Δ(srl-recA)306::TnlQ (tetr) 81 104637 (F':traD36, proAB, lac Ι^ΖΔΜΙδ)]. Kantaa MV1190 kuvaillaan manuaalissa BIO-RAD'in MUTA-GENE Ml3 in vitro - mutageneesi-pakkausta varten. 12 ampisilliinille resistenttiä pesäkettä poimitaan. Plasmidi-DNA:ta preparoidaan ja analysoidaan Scal-hydrolyysin avulla. pelA-signaalisekvenssin onnistunut silmukointi poistaa Scal-kohdan. Oikeat plasmidit tehdään lineaarisiksi Scal-kohdassa Bluescript-vektorissa. Yhtä plasmidia analysoidaan enemmän. Oikea liitos pelA-pro-moottorin ja hybridi-lFN-BDBB:n kooditussekvenssin välillä, mukaanlukien ATG, varmistetaan DNA:n sekvensoinnilla. Yhtä oikeaa konstruktiota nimitetään Ml3( + )KS/pelAA-ss-IFN AMI19:ksi.

Esimerkki 10.4.: A. niqerin yhteistransformaatio ja hybridi-interferonin ilmentäminen

Plasmideja M13(+ )KS/pelAA-ss-IFN AM119 ja pCG59D7 käytetään A. nlgerin mutantin An8 yhteistransformaatioon esimerkin 8.2.2. mukaisesti. Transformantteja viljellään kuten esimerkissä 8.2.3. on kuvailtu. Eri ajankohtina (joka 20. tunti) otetaan näytteitä, solut pelletoidaan sentrifugoimalla ja rikotaan ultraäänihajotuksella. Solu-uutteista testataan interferonin aktiivisuus (edellä). Pääosa interferoniaktiivi-suudesta todetaan solun sisällä.

Mikro-organismien tallettaminen

Seuraavat mikro-organismit talletettiin the Budapest Treaty'n mukaisesti Deutsche Sammlung von Mikroorganismen'iin, Ma-scheroder Weg lb, D-3300 Braunschweig:

Mikro-organismit Tall. no. Tall. pvm.

Escherichia coli HB 101/pGW820 DSM 4388 1.2.1988

Escherichia coli HB 101/pGW830 DSM 4389 1.2.1988

Escherichia coli HB 101/pGW850 DSM 4390 1.2.1988

Escherichia coli HB 101/pGW860 DSM 4391 1.2.1988

Escherichia coli HB 101/pGW880 DSM 4392 1.2.1988 β2 104637

Viite-j ulkalsut 1. Yelton, M.M., Hamer, J.E. ja Timberlake, W.E. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 1470-1474.

2. Frischauf, A.M., Lehrach, H. Poustra, A. ja Murray, N.

(1983) J. Mol. Blol. 170, 827-842.

3. Karn, J., Brenner, S., Barneff, L. ja Cesareni, G. (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77, 5172-5176.

4. Benton, W.D. ja Davis, R.W. (1977) Science 196, 180-182.

5. Maniatis, T., Fritsch, E.F. ja Sambrook, J. (1982): Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor,

New York.

6. BRL. Ml3 cloning/dideoxy sequencing instruction manual.

: 7. Dente, L., Cesareni, G ja Cortese, R. (1983) Nucl. Acids

Res. 11, 1645-1655.

8. Dente, L., Sollazzo, M., Baldari, C., G. Cesareni ja R.

Cortese: DNA Cloning col. l. a practical approach ed. D.M.

Glover, IRL Press Oxford 1985.

9. Russell, M., Kidd, S. ja Kelley, M.R. (1986) Gene 45, 333-338.

10. Caruther, M.H. Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene .· Fragments: a laboratory manual, Verlag Chemie (1982).

11. Ballance, D.J. (1986) Yeast 2, 229-236.

12. Goosen, T., Bloemhuevel, G., Gysler, Ch., de Bier, D.A., van der Broek, H.W.J. ja Swart, K. (1987) Current Genetics 11, 499-503.

83 104637 13. Boeke, J.D., Lacroute, F. ja Fink, G.R. (1984) Mol. Gen. Genet. 197, 345-346.

14. Slater, R.J. (1984): Methods in Molecular Biology vol. 2 Ed. J.M. Walker, The Humana Press Inc.

14a.Hinnen A., Hicks J.B. & Fink G.R. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929-1933.

15. Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 681-682.

16. Towbin, J., Staehelin, T. ja Gordon, J. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354.

17. Ried, J.L. ja Collmer, A. (1985) Applied and Environm. Microbiol. 50, 615-622.

18. van Houdenhove, F.E.A. (1975) Ph.d. Thesis Agricultural . University Wageningen, The Netherlands.

* 19. Hunkapiller, M.W. (1985) PTH Amino Acid Analysis, User Bulletin no. 14 Applied Biosystems.

20. Zissler, J. et al. (1971): The Bacteriophage Lambda,

Cold Spring Harbor Labs, New York, A.D. Hersley editor.

21. Norrande, J., Kempe, T ja Messing, J. (1983) Gene 26, 101-106.

, 22. F.E.A. van Houdenhove. Ph.DF. Thesis Agricultural Uni- / versity, Wageningen in Communications Agricultural Uni- versity -wageningen, The Netherlands 75-13 (1975).

23. Birnboim H.C. & Doly J. (1979). Nucleic Acids Res 7, 1513-1523 84 104637 24. Boel E., Hansen M.T., Hjort I., Hoegh I., Fill N.P.

(1984). EMBO J 3, 1581-1585.

25. Mount S.M. (1982). Nucleic Acids Res. 10. 459-472.

26. Ballance D.J. ja Turner G. (1985), Gene 36, 321-331.

27. HermersdÖrfer H. Leuchtenberger A. Wardsack Ch ja Rutt-loff H (1907) Influence of culture conditions on mycelial structure and polygalacturonase syntheseis of A. niger.

J. Basic Microbiol. 27, 309-315.

r 28. Henikoff, S. (1984) Gerne 28, 351-359.

29. Mead et al., (1986) Protein Engeneering 1, 67.

30. Kunkel et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 485.

< 1 ·

Claims (30)

1. Yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se sisältää DNA-sekvenssin pelA (kuva 10), joka koodittaa pek- 5 tiinilyaasia PLA, DNA-sekvenssin pelB (kuva 11), joka koodittaa pektiinilyaasia PLB, DNA-sekvenssin pelC (kuva 12), joka koodittaa pektiinilyaasia PLC, DNA-sekvenssin ' pelE, joka sisältyy plasmidiin pGW880 (kuva 5, DSM 4392) ja joka koodittaa pektiinilyaasia PLE, tai DNA-sekvenssin 10 pelF, joka sisältyy plasmidiin pGW860 (kuva 6, DSM 4391) ja joka koodittaa pektiinilyaasia PLF, tai näiden osasekvenssin, joka koodittaa jonkin mainitun pektiinilyaasin osaa, joka on promoottori, signaalisekvenssi, rakennegee-ni, geneettisen koodin mukaisesti degeneroitunut rakenne-15 geeni tai terminaattori tai mikä tahansa näiden osien yhdistelmä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA-molekyy-li, joka on pGW820 (DSM 4388). 20

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA-molekyy-li, joka on pGW830 (DSM 4389).

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA-molekyy-25 li, joka on pGW850 (DSM 4390). • «

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA-molekyy-li, joka on pGW880 (DSM 4392).

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA-molekyy- li, joka on pGW860 (DSM 4391). s

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA-molekyy-li, tunnettu siitä, että se sisältää pelkin promootto-35 risekvenssin. > « > 1 a 86 104637

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA-molekyy-li, tunnettu siitä, että se sisältää pelArn, pelB:n, pelC:n, pelE:n tai pelF:n promoottorisekvenssin.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA-molekyy- li, tunnettu siitä, että se sisältää pelA:n, pelB:n, pelC:n, pelE:n tai pelF:n signaalisekvenssin.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA-mole-10 kyyli, tunnettu siitä, että se sisältää pel A:n, pelB:n, pelC:n, peIE:n tai pelF:n rakennegeenin.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA-mole-kyyli, tunnettu siitä, että se sisältää pelA:n, peIB:n, 15 pelC:n, pelE:n tai pelFrn rakennegeenin ilman introneita.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA-mole-kyyli, tunnettu siitä, että se sisältää pelA:n, peIB:n, peICrn, pelE:n tai pelFin terminaattorin. 20

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA-mole-kyyli, tunnettu siitä, että se on yhdistelmä-hybridivek-tori, joka sisältää Aspergillus nigerille vieraan rakennegeenin . 25 • I

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA-mole-kyyli, tunnettu siitä, että se on hybridivektori pUCl9/pelA-IFN AM119 (kuva 14).

15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA-mole- kyyli, tunnettu siitä, että se on hybridivektori ·: M13(+)KS/pelAAss-IFN AM119 (esimerkki 10).

16. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA-mole-35 kyyli, tunnettu siitä, että se on hybridivektori M13(+)KS/pe2A-IFN AMI19 (esimerkki 10.1). i · t 87 104637

17. Transformoitu bakteeri- tai sieni-isäntä, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaisen yhdistelmä-DNA-molekyylin.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen transformoitu isäntä, tunnettu siitä, että se on Escherichia coli HB 101/pGW820 (DSM 4388).

19. Patenttivaatimuksen 17 mukainen transformoitu isäntä, 10 tunnettu siitä, että se on Escherichia coli HB 101/pGW830 (DSM 4389).

20. Patenttivaatimuksen 17 mukainen transformoitu isäntä, tunnettu siitä, että se on Escherichia coli HB 101/pGW850 15 (DSM 4390).

21. Patenttivaatimuksen 17 mukainen transformoitu isäntä, tunnettu siitä, että se on Escherichia coli HB 101/pGW860 (DSM 4391). 20

22. Patenttivaatimuksen 17 mukainen transformoitu isäntä, tunnettu siitä, että se on Escherichia coli HB 101/pGW880 (DSM 4392).

23. Patenttivaatimuksen 17 mukainen transformoitu isäntä, m ' • « tunnettu siitä, että se on Aspergillus niger An8 (DSM 3917), joka on transformoitu patenttivaatimuksen 1 mukaisella yhdistelmä-DNA-molekyylillä ja valintamarkkeriplas-midilla pCG59D7 (DSM 3968). 30

24. Patenttivaatimuksen 17 mukainen transformoitu isäntä, ” tunnettu siitä, että se on Aspergillus niger An8 (DSM 3917), joka on transformoitu pUC19/pelA-IFN AM119:lla (kuva 14) ja valintamarkkeriplasmidilla pCG59D7 (DSM 35 3968).

25. Patenttivaatimuksen 17 mukainen transformoitu isäntä, • r · · 88 104637 tunnettu siitä, että se on Aspergillus niger An8 (DSM 3917), joka on transformoitu patenttivaatimuksen 15 mukaisella M13(+)KS/pelAAss-IFN AMll9:lla ja valintamark-keriplasmidilla pCG59D7 (DSM 3968). 5

26. Patenttivaatimuksen 17 mukainen transformoitu isäntä, tunnettu siitä, että se on Aspergillus niger An8 (DSM 3917), joka on transformoitu patenttivaatimuksen 16 mukaisella M13(+)KS/pelA-IFN AM119:lla ja valintamarkke- 10 riplasmidilla pCG59D7 (DSM 3968).

27. Patenttivaatimuksen 13 mukaisen hybridivektorin käyttö yhdistelmäinterferonin BDBB valmistamiseksi bakteeri-tai sieni-isännässä. 15

28. Patenttivaatimuksen 13 mukaisen hybridivektorin käyttö yhdistelmäinterferonin BDBB valmistamiseksi Aspergillus -lajeissa.

29. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen yhdistelmä-DNA-mole- kyylin käyttö pektiinilyaasin PLA (kuva 10), pektiinily-aasin PLB (kuva 11), pektiinilyaasin PLC (kuva 12), pektiinilyaasin PLE, joka voidaan saada ilmentämällä plasmi-din pGW880 (kuva 5, DSM 4392) sisältämä pelE, tai pek-25 tiinilyaasin PLF, joka voidaan saada ilmentämällä plasmi-din pGW860 (kuva 6, DSM 4391) sisältämä pelF, tuottamiseksi ylimäärin Aspergill us-lajeissa.

30. Pektiinilyaasi PLA, jota koodittaa pelA (kuva 10),

30 PLB, jota koodittaa pelB (kuva 11), PLC, jota koodittaa pelC (kuva 12), PLE, jota koodittaa plasmidin pGW880 (ku-v va 5, DSM 4392) sisältämä pelE, tai PLF, jota koodittaa plasmidin pGW860 (kuva 6, DSM 4391) sisältämä pelF, puhtaassa muodossa. IM 35 89 104637