HU212832B - Method for producing dna molecules coding for pectin lyases and/or containing promoter, signal and terminator sequences thereof - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás olyan új DNS molekulák előállítására, amelyek az Aspergillus niger különböző pektin-liáz enzimeit kódolják, és/vagy tartalmazzák ezek promoter, szignál és terminátor szekvenciáit.

Az új DNS molekulák alkalmasak pektin liázok nagymennyiségben való előállítására Aspergillus-szal és/vagy fonalas vagy más gombákban, idegen gének kifejezésére képes hibrid vektorok készítésére. Ezáltal most lehetséges más pektin liázokkal nem szennyezett egyetlen pektin liáz előállítása.

Jóllehet a génsebészetben számos polipeptid expressziós rendszer ismert már mind prokarióta mind eukarióta gazdaszervezetekhez, folyamatos igény van az ismert rendszerekkel szemben előnnyel rendelkező új rendszerekre.

Nagyon széles körben használt az Escherichia coli prokarióta gazdaszervezet, valamint az élesztő eukarióta gazdaszervezet, például a Saccharomyces cerevisiae, amelyekhez nagyszámú különböző hibrid expressziós vektort fejlesztettek ki, főleg plazmidokat. Az E. coli gazdaszervezetek hátránya, hogy nem képesek glikozilezni a keletkező polipeptidet, valamint nem képesek az idegen polipeptidet szekretálni, így az felhalmozódhat a gazdasejten belül, és akadályozza a további növekedést. Az élesztő gazdasejtek glikozileznek, azonban az E. colihoz hasonlóan nem szekretálják a polipeptideket, a legkisebbek kivételével, a tápközegbe. Az élesztők csak a periplazmatikus térbe szekretálnak. A magasabb rendű eukarióta gazdasejtek ráksejtek, amelyek képesek glikozilezni és a tápközegbe szekretálni, azonban tenyésztésük nagyon lassú és drága, valamint az a veszély is fennáll, hogy a kívánt pepiiddel együtt onkogén nukleinsavakat is izolálunk, amelyektől a fehérjét nem lehet megtisztítani.

Az újabb gazdaszervezetek iránti igény miatt a fonalas gombákat, például a Neurospora crassa-t és az Aspergillus niger-t is megvizsgálták. Ezek a gombák már széles körben használtak ipari célokra, azonban alkalmazásuk génsebészeti célokra le van maradva, főleg azért, mert a megfelelő transzformációs rendszer hiányzik. A Saccharomyces cerevisiaevel szemben a fonalas gombák nem tartalmaznak plazmidokat, amelyek idegen gének bevitelére és fenotípus szelekcióra alkalmasak. Az azonban lehetséges, hogy a fonalas gombákat szelektálható marker-gént tartalmazó idegen plazmidokkal transzformáljuk. A fonalas gombákra eddig leírt plazmidok nem replikáidnak autonóm módon, amint az élesztő plazmidok teszik, viszont integrálódnak a gomba kromoszómába. Ez csak nagyon kis valószínűséggel történik meg. Másrészről azonban előny, hogy az integratív transzformáció a transzformánsokat mitotikusan nagyon stabillá teszi, még nemszelektív körülmények között is. Több mint száz másolat stabil integrálódását is leírták.

A fonalas gombákhoz leírt első vektor a Neurospora crassa qa-2 génjét tartalmazta szelekciós markerként. Ez a gén a katabolikus dehidrogenáz enzimet kódolja, és a N. crassa aro mutánsainak funkcionális komplementálására használható [Case, Μ. E„ Schweizer, M„ Kushner, S. R. és Giles, N. H., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 76, 5259-5263 (1979)]. Az aro mutánsok képtelenek olyan minimál táptalajon növekedni, amely nem tartalmaz aromás aminosav kiegészítőket. A N. crassa transzformációja a qa-2 vektorral a plazmid egyetlen kópiájának integrálódását eredményezi a kromoszómába. A stabil Aro⁺ integránsok 30%-a az integrált qa-2 gént a bakteriális plazmid szekvenciákhoz kapcsoltan tartalmazzák [Case, Μ. E. in Genetic Engineering of Microorganisms fór Chemicals (Hollander, A., DeMoss, D., Káplán, S., Konisky, J., Savage, D. and Wolfe, R. S. eds), 87-100, Plenum (1982)]. Ez a megfigyelés a nem-szelektálható DNS-szekvenciák szelektálhatókkal való ko-transzformációját könnyű feladattá teszi.

Az Aspergillus nidulans rendelkezik szexuális ciklussal, ennélfogva alkalmas klasszikus genetikai manipulációkra, itt mind negatív, mind pozitív szelekciós rendszereket azonosítottak. Akár N. crassa-ból származó heterológ DNS-sel akár homológ DNS-sel transzformálva az A. nidulans pyrG mutánsokat, a pyrG gént tartalmazó plazmidok képesek funkcionális komplementációra [Ballance et al., BBRC, 112, 284 (1983); Tilbum et al., Gene, 26, 205 (1983)]. Más rendszerekben a trpC vagy argB lokuszokban lévő mutációkat funkcionálisan komplementálják a megfelelő plazmidokkal végzett transzformációval [Yelton et al., PNAS, 81, 1470 (1984); Yelton et Timerlake, J. Cell. Biochem. Suppl. 9c, 173 (1985); Johnstone et al., EMBO J., 4, 1307(1983)].

Domináns pozitív szelekciós rendszereket is kifejlesztettek az A. nidulans-ból izolált amdS gén felhasználásával, amely képessé teszi az ezzel transzformált A. niger sejteket, hogy egyedüli nitrogén-forrásként acetamidot tartalmazó táptalajon is növekedjenek [Tilbum et al., Gene, 26, 205 (1983); Wemars et al., Curr. Génét, 9, 361, (1985); Kelly J. M. et al., EMBO J, 4, 475 (1985)].

A A. crassa-hoz. vagy A. nidulans-hoz hasonlítva az A. niger messze a legfontosabb mikroorganizmus. Széles körben használják enzimek ipari méretekben való előállítására, például az élelmiszeriparban való felhasználás céljaira. Az A. niger szekréciós kapacitásában különbözik az A. nidulans-tól, amennyiben számos hidrolitikus enzimet választ ki, például glükoamilázt, alfa-amilázt, pektinázt, cellulázt, béta-glukanázt, bétagalaktozidázt, naringinázt, pentozanázt, savas proteázt és lignázt, amelyek közül legfontosabb a glükoamiláz és pektináz komplex.

Az A. niger-ről nem ismert, hogy lenne szexuális ciklusa. A mutációkat ennélfogva nem lehet mitotikus rekombinációk útján bevinni. Azonban klasszikus mutációs és szelekciós eljárásokkal erőteljes törzsfejlesztést lehetett a hidrolitikus enzimek kiválasztásában elérni.

Az A. niger enzimek génjei közül csak a glükoamilázt [Boel. et al., EMBO J., 3,1581 (1984)] valamint az alkohol és aldehid dehidrogenázt jellemezték (WO 86/06097) promoter és szignál szekvenciájukkal együtt, és használták A. nidulans-szal illetve A. nigerrel végzett transzformációs kísérletekben.

Az A. niger-nél szelekciós markerként a heterológ

HU 212 832 Β amds gént [Kelly and Hynes, EMBO J., 4, 475 (1985)] és az ArgB gént [Buxton et al., Gene, 37, 207 (1985); EP 184 438; WO 86/06097] használják, mindegyiket A. nidulans-bói állítottuk elő.

Az A. niger a legfontosabb mikroorganizmus a pektin-bontó enzimek ipari előállításában. A pektinek nagy molekulatömegű (20 000—40 000 D) poligalakturonidok, amelyek 1,4-glikozidos kötéssel kapcsolt D-galakturonsav polimerekből állnak, és a természetben magasabbrendű növények alkotóelemeiként fordulnak elő, ahol a cellulóz molekulákhoz kapcsolódnak és főleg a primer sejtfalban és a középső lamellában találhatók. A pektin leggazdagabb forrása a citrom és narancshéj, amely körülbelül 30%-ot tartalmaz ebből a poliszacharidból. A pektinbontó enzimek a szénhidrátpolimer szubsztrátot vagy az alfa-1,4-glikozidos kötés hidrolízisével (poligalakturonáz), vagy a pektin molekulából az alfa-4,5 telítetlen galakturonsav transzeliminációjával (különböző pektin liázok) bontják le. A pektin liáz szisztematikus neve pektin transzelimináz (EC 4.2.2. 10).

A. nigerben a pektinbontó komplex fehérjéi nem fejeződnek ki konstitutíven. Indukáló körülmények között, pektint vagy annak lebomlási termékeit használva, az A. niger expresszálja az említett enzimeket, beleértve a PLI-t, ha a többi szénforrás, például a glükóz és szacharóz limitáló koncentrációban van jelen. Felületi tenyészetekben a pektinbontó enzimek általában a külső sejtfalhoz kapcsolódnak. Ha a táptalajban nő a pektin és Ca²⁺ koncentráció, ez teljes szekrécióhoz vezet.

A pektinázokat, például a PLI-t az élelmiszeriparban használják főleg gyümölcslé derítésre.

A. niger-ből két különböző pektin liázt, PLI-et és PLII-t tisztított és jellemzett részlegesen Ε E. A. Van Houdenhaven (22). A PLI négy mannózcsoportot tartalmaz, míg a PLII két-két mannóz és glükóz csoportot. Az enzimek molekulatömege különböző (PLI: 37.5 kD, PLII: 36 kD). A PLI aminosav sorrendjét meghatározták, és a 0278355 számon közzétett EP szabadalmi leírásban közlik. Ez a találmány a pektin liáz I (PLI) részleges szerkezet-meghatározásán alapul, amely lehetővé tette a fehéije megfelelő részeit kódoló DNS próbák szintézisét. A DNS próbák segítségével volt lehetséges a PLI-t kódoló DNS keresése és izolálása, természetesen pre- és poszt-szekvenciáival együtt, egy A. niger génbank-ból.

A PLI gén darabjait A. niger genomiális génbankhoz hibridizálva, további, a jelen találmány tárgyát képező PL géneket azonosítottunk. Az A. niger N756 törzsből nyert, N-terminális kísérő véggel rendelkező PLI struktúrgén N-terminálisánál azonos az A. niger N400-ból nyert PLD génnel. Ennek megfelelően ez utóbbi nem tartozik a jelen találmányhoz. A PLA úgy tűnik, hogy része a korábban tisztított PLII jelű keveréknek.

A továbbiakban a PLI másik neve PLD és a PLI struktúrgén neve pelD.

A találmány tárgya rekombináns DNS molekulák előállítása, azaz új pektin liáz expressziós rendszereket és származékaikat kódoló DNS-szekvenciák, azaz az említett pektin liázok struktúrgénjei és a megfelelő szabályozó szekvenciák, például promoter, szignál és terminátor szekvenciák, valamint a megfelelő DNSeket tartalmazó hibrid vektorok, beleértve homológ vagy heterológ polipeptideket kódoló DNS-t tartalmazó hibrid vektorokat, gazdaszervezetek, főleg fonalas gombák, például az Aspergillus gazdaszervezetek (az említett vektorokkal transzformálva) előállítására, valamint a rekombináns DNS molekulák alkalmazására új expressziós rendszerek előállításában. A találmány tárgya továbbá polipeptidek előállítása az említett DNS-ekkel és az említett gazdaszervezetekkel.

Az új pektin liáz expressziós rendszerek az említett új pektin liáz gének promoterét, szignál szekvenciáját, struktúrgénjét és terminátorát kódoló DNS szekvenciákat tartalmaznak. Az új pektin liázok jele PLA, PLB, PLC, PLE és PLF.

Pontosabban a jelen találmány egyik tárgya olyan új hibrid vektorok előállítása, amelyek a PLA, PLB, PLC, PLE és PLF promotereket kódoló DNS szekvenciákat tartalmaznak és opcionálisan ezen fehérjék szignál szekvenciáját, és szintén opcionálisan ezen fehérjék terminátorait kódoló DNS szakaszokat tartalmaznak. Ezeket a hibrid vektorokat használják arra, hogy adott fehérjéket kódoló géneket beléjük építsenek, valamint fonalas gombák, például Aspergillus, Penicillium és Cephalosporium transzformálására. Az A. niger kotranszformációja két különböző plazmiddal végrehajtható, amikoris az egyik plazmidot a találmány szerinti új hibrid vektorok közül választjuk, míg a másik egy speciális szelekciós plazmid, amely egy fonalas gomba mutáns törzsében működtethető.

A találmány tárgya továbbá az említett új pektin liázok nagymennyiségben való előállítása Aspergillus fajokban, valamint a PL-ok külön-külön, tiszta állapotban, más PL-ok által nem szennyezett formában való előállítása vagy ezek előre meghatározott összetételű mesterséges keverékeinek előállítása.

A jelen találmány tárgya ezenkívül bármely olyan fehéije előállítása, amelynek struktúrgénje a szabadalomban említett PL DNS-ek jelenlétében vagy szabályozásával expresszálható.

A találmány különböző szempontjai nyilvánvalóbbak lesznek a találmány alábbiakban következő részletes leírásából.

A rekombináns DNS molekulák

A találmány tárgya eljárás rekombináns DNS molekula előállítására, amely a PLA, PLB, PLC, a pGW 880 plazmidban lévő pelE gén expresszálásával nyert PLE vagy a pGW 860 plazmidban lévő pelF gén expresszálásával nyert PLF pektin liázok, illetve ezek származékának expressziós rendszereit kódoló DNS szekvenciát tartalmaz, ahol a származék jelentése egy olyan nagyobb variáns, mely tartalmazza a határoló szekvenciákat; az említett DNS szekvenciák fragmensei, illetve olyan DNS szekvenciák, amelyek a genetikai kódnak megfelelően degeneráltak. A találmány szerinti eljárás során egy genomiális könyvtárat készítünk, a könyvtárat szűrőlapon készült másolatokon hibridizáljuk, majd a rekombináns DNS molekulát izoláljuk.

HU 212 832 Β

Az „expressziós rendszer szakkifejezés egy polipeptid expressziójára képes DNS szekvenciát jelent, amely a promotert, szignál szekvenciát, a struktúrgént és a terminátort tartalmazza.

Az új rekombináns DNS molekulák nagyobb variánsai azok, amelyek kivághatok az A. niger genomból és az 1., 2., 3., 5. és 6. ábrákon bemutatott DNS szekvenciákat tartalmazzák, amint azok az A. niger N400 genomiális génbankjában találhatók, amelyet a nukleinsavak fragmentálásával, a fragmensek megfelelő restrikciós enzimekkel, pl. EcoRi, HindlII, BemlI való kezelésével, megfelelő vektorba, pl. lambda fágba és a pBR322 plazmidba ligálással, klónozással, pl. E. coli-ban, majd a klónozásnál alkalmazottal azonos restrikciós enzimmel való kivágással állítottunk elő. Az ilyen származékok például a pGW820, pGW83O, pGW840, pGW850, pGW860 és pGW88O plazmidokba beépített darabok, lásd az 1„ 2„ 3„ 4., 5. és 6. ábrát.

Az I általános képletű (9. ábra) DNS szekvencia fragmensei azok, amelyek ezen plazmidok két restrikciós helye között találhatók és megtartják a promoter, szignál, struktúrális vagy terminátor funkciót.

Azok a fragmensek előnyösek, amelyek tartalmazzák a promoter szekvenciát, a szignál szekvenciát, egy új PL struktúrgénjét, vagy a terminátor szekvenciát, vagy ezek bármely kombinációját.

A DNS szekvencia fragmensei tartalmazhatnak linkereket, amelyek lehetővé teszik más DNS molekulákhoz való sikeres kapcsolódásukat.

A PL promoter szekvencia a struktúrgén előtti DNS régióban található és körülbelül 2000, előnyösen 10001400 nukleotidot tartalmaz. A pGW820 plazmidban a promoter a Sáli (1240) és Pstl (2420) restrikciós helyek közötti szekvencián található. A promoter szekvenciánál a TATAA boxok fontosak, mint az RNS-polimeráz felismerési helyei. A pelA génen a TATAA box a 1221 (10. ábra) pozícióban, a pelB génen a 951 pozícióban (11. ábra) és a pelC génen az 1261 pozícióban (12. ábra) található. A TATAA boxok körüli rövid promoterektől a szignál szekvenciák kezdő pontjáig terjedő rész különösen érdekes a polipeptidek nem-indukált expressziója szempontjából. Ha pektin-indukált expresszióra van szükség, akkor a TATAA boxok előtti szekvenciákra van szükség a promoter erősségének szabályozására. Megfelelő linkereket kapcsolhatunk ezekhez a fragmensekhez.

Az A. niger PLI génjének promotere indukálható, azaz a hozzákapcsolt struktúrgén expresszióját, például a PL vagy bármely idegen gén expresszióját pektin vagy pektin bomlási termékeknek a táptalajhoz adásával indukálhatjuk. Pektin távollétében illetve elegendő glükóz jelenlétében a promoter nem működik. Ha az upstream regulátor-szekvenciák hiányoznak, akkor a promoter konstitutívvá válik.

A szignál szekvenciát kódoló DNS a promoter vége, és az érett fehérjét kódoló szekvencia kezdete között helyezkedik el. A PLA és PLB esetében a szignál szekvencia körülbelül 20 aminosavat tartalmaz a pelC pedig 18 aminosavat. A megfelelő kódoló régió a pelA esetében az 1361-es pozícióban levő ATG kodontól az

1420-as helyen lévő Pstl hasítási helyig teqed, a pelB esetében az 1134. pozíciótól legalább az 1191. pozícióig, és a pelC esetében az 1368. pozíciótól a 1422. pozícióig.

Amint az nyilvánvaló az I, Π, ΠΙ képletekből, a PLA, PLB és PLC számos intront tartalmaz.

A struktúrgének tartalmazhatnak megfelelő linkereket is.

A terminátor régiók a stop kodonok egyikével, például TAA-val kezdődnek és az említett szekvenciákban lévő egyik restrikciós helyig tarthatnak. A terminátor fragmens legalább 300 bázispárt tartalmaz, és tartalmazhat megfelelő linkereket is.

A fenti fragmensekhez megfelelő linkerek DNS szekvenciája beleillik annak a DNS-nek a restrikciós helyébe, amelyhez a fragmenst kapcsolni kell. Tartalmazhatnak előre meghatározott restrikciós helyet.

A találmány szerinti DNS szekvencia fragmensei is olyanok, hogy kisebb fragmensekből állnak, például a promotert, a promotert és a szignál vagy struktúrgén szekvenciát, a szignál és struktúrgén szekvenciát, a struktúrgént intronok nélkül tartalmazó fragmensek, és hasonlók.

A jelen találmány szerinti DNS szekvencia mutánsai például természetben előforduló mutánsok. A találmány foglalkozik még a szignál szekvencia hasonló vagy azonos hidrofobicitási profillal rendelkező természetes vagy szintetikus mutánsaival, amelyekben például a lizin (K⁶*), tirozin (Y^5-) és arginin (R&*) poláros aminosavak kodonjait hasonló töltésű más aminosavak kodonjával cseréljük ki, és az alanin (A), leucin (L), treonin (T) hidrofób aminosavak kodonjait más, hidrofób aminosavak kodonjaival helyettesítjük. Például a pozitiven töltött lizin kodonját az arginin kodonjára cserélhetjük, és fordítva, a negatívan töltött tirozin kodonját a glutamát vagy aszpartát kodonjával cseréljük ki, és/vagy az apoláros, hidrofób alanin kodonját bármely, treonint, prolint, valint, izoleucint, leucint. metionint vagy fenilalanint, illetve hasonló aminosavat kódoló kodonnal cseréljük ki. A többi mutáció „csendes mutáció”, mikoris egy vagy több (egészen 30-ig) nukleotidot cserélünk ki úgy, hogy az új kodonok ugyanazokat az aminosav(ak)at kódolják.

A jelen találmány szerinti azon DNS szekvenciák, amelyek degeneráltak, azok a csendes mutációkhoz hasonlóak, amelyek a genetikai kód értelmében annyiban degeneráltak, hogy korlátlan számú nukleotidot helyettesítünk más nukleotiddal, anélkül, hogy megváltoztatnánk az általuk kódolt aminosav-szekvenciát. Az ilyen degenerált DNS-szekvenciák hasznosak lehetnek eltérő restrikciós hasítási helyeik miatt.

A jelen találmány szerinti DNS szekvenciát, vagy annak származékát tartalmazó rekombináns DNS molekulák főleg rekombináns vektorok (másnéven hibrid vektorok), amelyek beépített szakaszként ilyen DNS szekvenciákat tartalmaznak. Használhatók klónozásra különböző gazdaszervezetekben, például baktériumokban, gombákban vagy állati sejtekben. Ezek a hibrid vektorok a génsebészetben használt bármely vektorból származhatnak, például fágokból, kozmidok4

HU 212 832 Β ból, plazmidokból vagy kromoszomális DNS-ből, ilyenek a lambda fág származékok, például az NM 989, az Ml3 fág származékok, péládul a BamHI emésztéssel linearizált M13 mp8 fág DNS (15. irodalmi hivatkozás), bakteriális plazmidok, például a pBR322, pUN121, pUC18 vagy élesztő plazmidok, például az élesztő 2 mikronos plazmidja, vagy kromoszomális DNS, amely Aspergillus-ből, például A. niger-ből származik, lásd EP 184 438, vagy defektív fágok illetve plazmidok segítő fág vagy segítő plazmid jelenlétében, amely lehetővé teszi az említett defektív fágok vagy plazmidok replikációját, például az Ml3 (+) KS vektor, az M13KO7 segítő fág jelenlétében.

A találmány szerinti hibrid vektor, a találmány szerinti DNS szekvenciák vagy származékaik mellett tartalmaz egy replikációs origót és opcionálisan a DNS származék típusától függően egy expressziós kontroll szekvenciát, például egy fokozó szekvenciát, upstream aktiváló helyet, egy promoter és szignál szekvenciát és/vagy a jelen A. niger eredetű szekvenciától eltérő struktúrgént. Az ilyen fokozó szekvencia származhat a Physarum polycephelum extrakromoszomális riboszomális DNS-éből (PCT/ET 8500278), vagy lehet a PH05 savas foszfatáz gén upstream aktiváló helye (EP Appl. Pub. No. 02 13593), vagy a PH05, trp, PH05GAPDH hibrid (EP Appl. Pub. No. 02 13593) illetve bármely hasonló promoter.

A leírt promoter, szignál és/vagy terminátor szekvenciákhoz ligáit struktúrgének a különböző, PLA, PLB, PLC, PLE és PLF pektin liázokat (intronnal vagy anélkül) kódolók mellett más, homológ pektin liáz gének, például a PLD (vagy PLI), vagy más Aspergillus gének és vírusokból, prokarióta sejtekből vagy eukarióta sejtekből származó heterológ struktúrgének, amelyek származhatnak genomiális DNS-ből, mRNS-en keresztül előállított cNDS-ből, vagy kémiai szintézisből, nagyszámú hasznos polipeptidet kódolhatnak, beleértve a glikozilezett polipeptideket, pontosabban magasabbrendű eukarióta, főleg emlős, úgymint állati vagy főleg emberi eredetű polipeptid, például enzimek, amelyek használhatók például táplálék előállítására, enzimatikus reakciók végrehajtására a kémiában, vagy polipeptidek, amelyek hasznosak és értékesek humán és állati betegségek kezelésében vagy ezek megelőzésében, például hormonok, immunmodulátor, anti-virális és anti-tumor tulajdonságú polipeptidek, antitestek, vírus antigének, vakcinák, véralvadási faktorok, élelmiszerek és hasonlók.

Az ilyen heterológ struktúrgének például a hormonokat kódolók, úgymint a szekretin, timozin, relaxin, kalcitonin, leuteinizáló hormon, paratiroid hormon adrenokortikotropin, melanocita stimuláló hormon, béta-lipotropin, urogasztron vagy imulin, a növekedési faktorok, úgymint az epidermális növekedési faktor, inzulinszerű növekedési faktor (IGF), pl. az IGF-I és IGF-II, emlőssejt növekedési faktor, idegsejt növekedési faktor, gliasejt eredetű idegsejt növekedési faktor vagy transzformáló növekedési faktor (TGF), úgymint a TGF béta, növekedési hormonok, úgymint a humán és szarvasmarha növekedési hormonok, interleukin, úgymint interleukin-1 és -2, humán makrofág migrációgátló faktor (MIF), interferonok, úgymint humán alfa-interferon, például interferon-alfa A, -alfa B,- alfa D, vagy alfa F, béta-interferon, gamma-interferon vagy egy hibrid interferon, például egy alfa A-alfa D- vagy alfa B-alfa D- hibridinterferon, főleg a BDBB hibrid interferon, proteináz inhibitorok, úgymint az alfa 1 - antitripszin, SLP1 és hasonlók, hepatitisz vírus antigének, úgymint a hepatitisz B vírus felületi vagy mag-antigén, vagy a hepatitisz A vírus antigén vagy hepatitisz non A-nonB antigén, plazminogén aktivátorok, úgymint a szöveti plazminogén aktivátor vagy urokináz, tumor nekrózis faktor, szomatosztatin, renin, béta-endorfin, immunoglobulinok, úgymint a D, E vagy G immunoglobulinok könnyű és/vagy nehéz láncai, vagy az emberegér hibrid immunoglobulinok, immunoglobulin kötő faktorok, például az immunoglobulin E-t kötő faktor, kalcitonin, humán kalcitoninnal rokon peptid, véralvadási faktorok, úgymint a IX vagy VIIIc faktor, eritropoietin, eglin, azaz eglin C, hirudin, deszulfatohirudin variánsok: HV1, HV2 vagy PA, humán szuperoxid-diszmutáz, virális timidin kináz, béta-laktamáz, glükóz izomeráz. Az előnyös gének a humán alfa-interferont vagy hibrid interferont, humán szöveti plazminogén aktivátort (t-PA), hepatitisz B vírus felületi antigént (HBVsAg), inzulinszerű növekedési faktor I-et illetve ΙΙ-t, eglin C-t és deszulfatohirudint, például a HV variánst kódoló gének. A jelen találmány szerinti hibrid vektorokban a promoter és/vagy szignál szekvencia úgy kapcsolódik a polipeptidet kódoló régióhoz, hogy biztosítsa a polipeptid hatékony expresszióját.

A jelen találmány szerinti DNS molekulák a transzformálandó, szelektálandó és klónozandó gazdaszervezettől függően tartalmazhatnak szelekciós markereket. Bármely marker gént lehet használni, amely a marker fenotipikus expressziója következtében megkönnyíti a transzformánsok szelekcióját. Azok a számbajövő markerek, maelyek antibiotikum rezisztenciát fejeznek ki például tetraciklin vagy ampicillin ellen, vagy élesztő auxotróf mutánsok esetében a gazdaszervezet genomjában meglévő hibákat komplementáló gének. A megfelelő gének például a cikloheximid antibiotikummal szembeni rezisztenciát szolgáltatnak, vagy egy auxotróf törzset prototróffá tesznek, például az urai, leu2, hisi vagy trpl gének. Az is lehetséges, hogy markerként autonóm replikálódó szegmenttel kapcsolt struktúrgént használjunk, azzal a feltétellel, hogy a transzformálandó gazdaszervezet auxotróf a marker gén által expresszált - termékre.

Különösen fontosak azok a marker gének amelyek az A. niger gazdaszervezet lézióit komplementálják, például az omitin karbamoil transzferázt kódoló argB gén [A. «íger-ből vagy A. nidulans-ból származik (EP 184 438)], vagy a N. crassa pyr4 génnel homológ A. nidulans DNS fragmens.

A jelen találmány egy előnyös megvalósítási formája olyan hibrid vektor, amelyben a stmktúrgén, különösen a heterológ stmktúrgén működésileg kapcsolódik a jelen találmány szerinti promoter és szignál szek5

HU 212 832 Β venciákhoz. Ilyen előnyös hibrid vektor például a pUC19/pclA-IFN AMI 19. Másik ilyen előnyös hibrid vektor például az M13(+)KS/pelA-IFN AMI 19.

A jelen találmány egy másik előnyös megvalósítási formájában a struktúrgén, különösen a heterológ struktúrgén operatíven kapcsolódik közvetlenül a jelen találmány szerinti promoter szekvenciához. Ilyen előnyös hibrid vektor például az M13(+)KS/pelAAss-IFN AM119.

A találmány szerinti DNS molekulák, valamint származékaik, beleértve a fragmenseket is, felhasználhatók DNS génbankok vagy mRNS átvizsgálására további hasonló DNS-ek vagy mRNS-ek izolálása céljából.

Eljárás rekombináns DNS molekulák izolálására

A találmány tárgya továbbá eljárás a PLA, PLB, PLC, PLE vagy PLF pektin liáz expressziós rendszert kódoló rekombináns DNS molekula, vagy ennek származékai előállítására, azzal jellemezve, hogy a pektin liáz rendszert vagy származékát kódoló DNS szekvenciát tartalmazó DNS molekulával transzformált gazdasejtet tenyésztünk, izoláljuk a kívánt rekombináns DNS molekulát vagy származékát, vagy in vitro szintézissel állítjuk elő.

A gazdasejtek tenyésztését szokványos tápközegben végezzük, amelyet kiegészíthetünk, vagy hiányossá tehetünk olyan vegyületekre nézve, amelyek lehetővé teszik, a transzformánsok negatív vagy pozitív szelekcióját, azaz a szelekciós markerrel ellátott kívánt DNS molekulát tartalmazó gazdasejtek elválasztását a kívánt DNS molekulát nem tartalmazó gazdasejtektől, azaz a transzformálatlan sejtektől.

Bármelyik a szakterületen ismert transzformálható gazdaszervezet használható, úgymint a baktériumok, úgymint az E. coli, gombák, úgymint a Saccharomyces cerevisiae, vagy különösen a fonalas gombák, úgymint az aspergillusok, például az A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius, A. awamori, és főleg az A. niger.

Egy előnyös gazdaszervezet az A. niger An8, egy új mutáns, amelyben az alábbi leírás szerint hibás a pyrA gén. A gazdaszervezetek transzformálását szokásos módszerrel végezzük.

A PL expressziós rendszert kódoló DNS szekvenciát az ilyen rendszert tartalmazó fonalas gombákból izoláljuk, pontosabban ezek genomiális génbankjából, vagy mRNS-en keresztül.

Az alábbiakban a jelen találmányban használt PL expressziós rendszerek előállítását adjuk meg részletesebben.

A genomiális génbankot úgy állíthatjuk elő, hogy egy A. niger törzs, például az N756 vagy N400 genomiális DNS-ét részlegesen emésztjük például SauíAl vagy Mbol restrikciós enzimekkel és a nagymolekulatömegű DNS fragmenseket megfelelő gazdavektorban, például a pUN121 E. coli plazmidban, vagy egy lambda vektorban, például EMBL4-ben klónozzuk.

Bármely más, a kívánt PL-eket termelő A. niger törzs szolgálhat forrásul a genomiális génbankhoz, és hasonlóképpen más megfelelő vektorok is használhatók a fragmensek megfogására.

Abból a célból, hogy sikeresen átvizsgáljuk a genomiális génbankot a PL-eket kódoló DNS szekvenciák után, egy hibridizációs DNS próba szükséges. Ez lehet egy szintetikus DNS próba, ha a kívánt PL szekvenciája ismert, vagy lehet egy ismert PL gén vagy annak egy része. Az első megközelítést használták a PLI gén keresésére (EP 88 101 Pub. No. 0278355). A második megközelítést használjuk a jelen szabadalmi leírásban. Mivel a PLI gén teljes DNS szekvenciája ismertté vált, a screeneléshez akár a teljes gén, akár bármelyik, legalább 14 bp méretű részlete használható, amibe beletartozik a PL rendszert kódoló mRNS screenelése is.

Screenelési célokra a DNS próbákat az 5’ végükön radioaktívan jelöljük a szakirodalomból ismert módszerekkel, gamma³²-ATP-t és T4 kinázt használva. A jelen találmány szerinti nukleinsavakat insezrtumként tartalmazó gazda mikroorganizmusokat úgy izoláljuk, hogy génbank filter-lenyomatához hibridizáljuk a jelzett DNS-t.

Az egy vagy több DNS próbával hibridizációs választ adó kiónokat izoláljuk és amplifikáljuk.

A hibridizálási körülmények lehetnek többé vagy kevésbé szigorúak, például különböző hőmérsékletek választásával, valamint ezt kombinálva a PLI (vagy PLD) génből származó különböző DNS próbákkal, például mérve a különböző hibridizációs válaszokat a pCG3Bll vagy pGW830-ból (4. ábra) származó teljes

1,6 kb méretű BamHI/PstI fragmentre, a 649 bp méretű BamHI/HhoI fragmentre (N-terminális fragment), és a 244 bp méretű XhoI/PstI fragmentre (C-terminális fragment), a kiónokat a homológiájuk mértéke alapján (II vagy IV táblázat) különböző osztályokra lehet osztani. Öt lambda vektort (lambda-PL113, lambdaPL122, lambda-PLI09, lambda-PL102 és lambdaPL116) azonosítottunk, emésztettünk restrikciós enzimekkel és pel génjeiket pBR322 plazmidban szubklónoztuk, így kaptuk a pGW820, pGW83O, pGW850, pGW860 és pGW880 plazmidokat (1., 2., 3., 5. és 6. ábra). Ezeknek a kiónoknak az öt génjét nevezzük pelA, pelB, pelC, pelE és pe/F-nek.

A gének szekvenálhatók. A pelA, pelB és pelC gének teljes szekvenciáját az I, II és III képlettel adjuk meg (10., 11. és 12. ábra).

Egy számítógéppel végzett keresés exon/intron kapcsolódási helyek, valamint intron belső szekvenciák iránt [Boel E. et al., (24) és Mount S. M. (25)] annak a megállapításához vezet, mint a pe/D-nél, hogy a pe/A-ban és peZB-ben négy intron van (10. és 11. ábra), míg a pe/C-ben három (12. ábra).

A pGW82O, pGW830, pGW850, pGW860 és pGW880 plazmidokat, arra használjuk, hogy más, a jelen találmányban szereplő rekombináns DNS molekulákat állítsunk elő. Ezeket a DNS molekulákat szokásos módon állítjuk elő, ismert restrikciós enzimeket, linkereket, ligálást, amplifikálást és izolálási eljárást használva.

Például a pGW820 plazmidot HindlII restrikciós enzimmel emésztjük. A 3.9 kb méretű HindlII fragmenset a pBR322 plazmid HindlII helyére klónozzuk. Az így kapott pGW822 plazmid 3,3 kb méretű BamHI-HindlII

HU 212 832 Β fragmensét, amely a pelA gént tartalmazza, a pUC19 vektor BamHI-Hindin helyére klónozzuk, így kapjuk a pUC19/pelAjelű vektort. ApelA struktúrgént Sáli és Pstl restrikciós enzimekkel való emésztéssel távolítjuk el. A megmaradó firagmensbe, amely a pelA promotert, szignál és terminátor szekvenciát tartalmazza a szignál és a terminátor szekvencia közé ligáljuk megfelelő linker segítségével a BDBB hibrid interferont kódoló gént. A kapott plazmid neve pUC19/pelA-IFN AMI 19 (11. ábra) és tartalmazza a pelA promoter és szignál szekvenciáját, az IFN BDBB gént és a pelA terminátort a pUC19 HindlIIBamHI fragmenséhez kapcsolva. Ezt a plazmidot együtt transzformáljuk a pCG 59D7 plazmiddal az uridin auxotróf A. niger An8 mutánsba (DSM3917 letétbe helyezve

1986.11. 11-én).

A transzformánsokat arginint és Bacto-Agart tartalmazó minimál táptalajon szelektáljuk és vizsgáljuk interferon expressziójukat.

A találmány egy másik előnyös megvalósítási formájában a pelA szignál szekvenciáját kivágjuk. A kapott plazmid neve M13(+)KS/pelAAss-IFN AMI 19, és a pelA promoter szekvenciáját, az IFN BDBB gént és a pelA terminátor régiót tartalmazza a Bluescript M13(+)KS vektor HindlII-BamHI fragmentjéhez kapcsolva. Ezt a plazmidot együtt transzformáljuk a pCG59D7 plazmiddal az uridin auxotróf A. niger An8 mutánsba (DSM 3917). A transzformánsokat arginint és Bacto-Agart tartalmazó minimál táptalajon szelektáljuk, és vizsgáljuk interferon expressziójukat.

Új restrikciós hasítási helyeket tartalmazó mutánsok is előállíthatók, például in vitro, helyspecifikus mutagenezissel, az ismert módszereket használva [lásd M. J. Zoller és M. Smith összefoglaló cikkét, Methods Enzymol., 100,468 (1983); D. Botstein and D. Shortle, Science, 229, 1192 (1985); vagy K. Norris et al., Nucl. Acids Rés. 11,5103(1983)].

Erősebb expresszió elérése céljából bármely eukarióta terminátor szekvenciát hozzáligálhatunk a struktúrgén végéhez.

A baktériumokat ismert módszerekkel transzformáljuk, a transzformánsokat rezisztenciájuk, például tetraciklin elleni rezisztenciájuk alapján azonosítjuk.

Részletesebben: a leírt expressziós vektorokat megfelelő E. coli gazdasejtekben, például HB 101-ben amplifíkáljuk, transzformáljuk, és a szakmában ismert módszerekkel szelektáljuk,. Az amplifikált plazmid DNS-t baktériumokból ismert módszerekkel, pontosabban a Birnboim-Doly (23) által leírt módszerrel izoláljuk.

Hasonló módon, más plazmidok is előállíthatók más homológ vagy heterológ génekkel.

A jelen találmány szerinti DNS molekulákat in vitro szintetikus módszerekkel is előállíthatjuk, ismert módon. Az in vitro szintézis különösen a PL expressziós rendszer kisebb fragmenseinek előállítására használható, például a PL-ek promoter vagy szignál szekvenicáit, illetve ezek mutánsait kódoló DNS szekvenciák előállítására.

A találmány szerinti, PL promotert, opcionálisan egy PL szignál szekvenciát, egy PL struktúrgént, bármely más heterológ struktúrgént és/vagy egy PL terminátort tartalmazó DNS-molekulák fonalas gombák, úgymint Aspergillus Penicillium vagy Cephalosporium, például A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius, A. awamori és főleg A. niger transzformálására is használhatók.

Hogy a transzformált gombákat ki tudjuk választani a nem-transzformált gombák közül, ezért a találmány szerinti DNS molekulák szelekciós markert tartalmaznak, vagy egy másik megoldás, hogy a gombákat együtt transzformáljuk egy másik, ilyen markert tartalmazó vektorral. Csakúgy mint más rendszerekben, az ilyen szelekciós marker egy expresszálható struktúrgén, az expresszált polipeptid (egy enzim) pedig rezisztenciát hoz létre a tanszformánsra nézve toxikus vegyületekkel szemben, vagy teljessé teszi az alkalmazott mutáns enzimrendszerét, amelyből hiányzik az adott lényeges polipeptid. Az ilyen marker gének például az ismert qa-2, pytG, pyr4, trpC, amdS vagy argB gének.

Amint az a 0278355 számon közzétett EP szabadalmi leírásban szerepel, egy új marker gént, jele pyrA, izoláltak az A. niger genomiális génbankjából, amely rokonságban van, illetve hasonló funkcióval rendelkezik, mint az A. nidulans pyrG vagy a N. crassa pyr4 génje, azaz az orotidin 5’-foszfát dekarboxilázt termeli. Ez az enzim katalizálja az orotidin 5’-foszfát dekarboxilezését uridilsavvá (Uridin-5’-foszfát dekarboxilezését uridilsavvá (Uridin-5’-foszfát), valamint a fluoroorotsav dekarboxilezését a toxikus fluoro-uridinné. Egy a pyrA gént tartalmazó E. coli kiónt azonosítottuk a plDB2 (24) plazmid 1,1 kb méretű HindlII fragmensével (amely a pyr4 gén egy részét tartalmazza) való hibridizálás alapján, azonban bármely, orotidin-5’foszfát dekarboxilázt kódoló pyr gén DNS-e is felhasználható. Egy pozitív klónból, jele E. coli B75183/pCG59D7, a pyrA gént tartalmazó gént izoláljuk és használjuk az A. niger pyrA mutáns kotranszformálására. Ennek a pyrA^- mutánsnak működésképtelen az 5’-foszfát dekarboxiláz génje, ennélfogva képtelen a megfelelő enzim előállítására. Ilyen mutánsokat az A. niger N756 konidiospóráinak UV besugárzással való kezelésével állítunk elő, és a fluoro-orotsav valamint uridin jelenlétében túlélő telepeket izoláljuk. Azokat a telepeket elimináljuk, amelyek fluoro-orotsav jelenlétében és uridin jelenléte nélkül életben maradnak. A megmaradó uridin-igényes mutánsok, transzformálhatóságuk alapján, két komplementációs csoportba (pyrA és pyrB) oszthatók, amelyeket az An8 és AnlO mutáns képvisel. Ezeket protoplaszt formában transzformáló körülmények között kezeljük a pyrA gént tartalmazó pCG59D7 plazmiddal. Csak az An8 telepeket lehetett transzformálni, és tartalmazták a pyrA gént, amit úgy lehetett igazolni, hogy a belőlük izolált, emésztett DNS a pUN121 DNS-sel hibridizálni volt képes.

A találmány figyelembe vesz továbbá a találmány szerinti hibrid vektorokkal transzformált egyéb gazdaszervezeteket is. Az ilyen transzformánsok például a baktériumok, például az E. coli vagy a fonalas gombák.

HU 212 832 Β úgymint az Aspergillus, Penicillium vagy Cephalosporium, különösen az A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius, A. awamori vagy előnyösen az A. niger, például az A. niger An8. A találmány foglalkozik továbbá ilyen transzformánsok előállításával, azzal jellemezve, hogy egy gazdaszervezetet, transzformálási körülmények között rekombináns DNS molekulával, főleg a találmány szerinti hibrid vektorral kezelünk, adott esetben egy szelekciós marker génnel együtt, valamint a transzformánsok szelektálásával.

A találmány tárgya továbbá a rekombináns DNS-ek illetve származékaik felhasználása olyan hibrid vektorok előállítására, amelyek hasznos homológ vagy heterológ polipeptideket expresszálnak. Az ilyen hasznos polipeptideket kódoló génekre példát az előzőekben adtunk.

A találmány tárgya továbbá eljárás polipeptidek előállítására, azzal jellemezve, hogy a találmány szerinti hibrid vektort megfelelő gazdaszervezetben expresszáljuk. Ha szükséges, a polipeptidet szokásos módon izoláljuk. A vektor szerkezetétől függően a vektor vagy expresszálódik, vagy ha szignál szekvencia van jelen, akkor expresszálódik és szekretálódik.

A találmány magában foglalja hasznos homológ vagy heterológ fehérjék előállítását megfelelő gazdaszervezetben, például Aspergillus fajban, olymódon, hogy egy hibrid expressziós vektorral transzformált gazdaszervezetet tenyésztünk. Az ilyen fehérjéket kódoló génekre az előzőekben adtunk néhány példát.

Az is lehetséges, hogy a PLA, PLB, PLC, PLD, PLE vagy PLF polipeptideket külön előállítsuk, aaz tisztán, nem szennyezve bármely másik PL által, különböző módszerek alkalmazásával. A PLA, PLB,

PLC, PLD, PLE és PLF csoportból választott egyik polipeptid előállításának egyik módszere az, hogy egy gazdaszervezetet, amely egyik említett pektin liázt sem képes expresszálni, transzformáljuk a PLA, PLB, PLC,

PLD, PLE vagy PLF expresszálására képes DNS expressziős vektorral.

Az a gazdaszervezet, amely képtelen egyetlen pektin liáz expressziójára, az vagy egy olyan mikroorganizmus, amely nem rendelkezik a megfelelő génnel, például egy PL Aspergillus törzs, más nem-Aspergillus gombák, vagy bármely más eukarióta vagy prokarióta mikroorganizmus, illetve egy olyan Aspergillus törzs, amelynek PL termelése megfelelő táptalaj-összetétel biztosításával szuppresszálva van. Egy PL gén expresszálható például glükoamiláz promoterrel A. niger-ben vagy A. awamoriban, PHO5 promoterrel S. cerevisiae-ben, vagy PL promoterrel PL^- A. niger törzsben.

Az ábrák rövid leírása

Az 1. ábra mutatja a PelA gént tartalmazó pGW820 plazmid restrikciós térképét; ahol

A. niger N400 DNS

Ap ampicillin rezisztencia gén (pGB322) pel ApelA kódoló régó a nyíl mutatja a gén orientációját A 2. ábra mutatja a pelB gént tartalmazó pGW83O plazmid restrikciós térképét, ahol

A. niger N400 DNS

Ap ampicillin rezisztencia gén (pGB322) pelB pelB kódoló régó a nyíl mutatja a gén orientációját

A 3. ábra mutatja a pelC gént tartalmazó pGW850 plazmid restrikciós térképét, ahol * A. niger N400 DNS

Ap ampicillin rezisztencia gén (pGB322) pelC pelC kódoló régó a nyíl mutatja a gén orientációját A 4. ábra mutatja a pelD gént tartalmazó pGW840 plazmid restrikciós térképét, ahol A. niger N400 DNS

Ap ampicillin rezisztencia gén (pGB322) pelDpe/D kódoló régó a nyíl mutatja a gén orientációját

Az 5. ábra mutatja a pelE gént tartalmazó pGW88O plazmid restrikciós térképét, ahol o A. niger N400 DNS

Ap ampicillin rezisztencia gén (pGB322) pelE pelE kódoló régó

A 6. ábra mutatja a pelF gént tartalmazó pGW860 plazmid restrikciós térképét, ahol

A. niger N400 DNS

Ap ampicillin rezisztencia gén (pGB322) pelF pelF legkisebb fragmentje, amely hibridizál a pelD génnel a nyíl mutatja a gén orientációját A 7. ábra mutatja a pel A gén szekvenálásának stratégiáját.

A gelA gént hosszú vékony fekvő téglalap formájában mutatjuk be. Az üres részek a nem-kódoló régiók, a vonalkázott részek a kódoló régiók, ss. szignál szekvencia; 1-5 intronok pozíciója. A restrikciós helyek pozícióját a vonalszakaszon mutatjuk be, a vonal alatti számok a pGW 820-on (1. ábra) levő helyzetnek felelnek meg, az enzim-nevek alatti számok a meghatározott szekvencián (10. ábra) levő helyzetnek felelnek meg. Az előállított szubklónokat kettős nyíllal (=>) jelöljük, nl-nl3 az 5’-3’ és rl-rl4 a 3’-5' irányban a génhez viszonyítva. Az univerzális szekvenáló primerrel meghatározott szekvenciákat egyszeres nyíllal (—>) jelöljük. A kis befeketített részek speciálisan szintetizált primereknek felelnek meg, az ezekkel olvasott szekvenciákat és irányokat nyilakkal jelöljük.

A; HR576, B: HR5636, C: HR58O3, D: HR5764. E: HR5767, F: HR5763, G: HR5804, H: HR5763

A 8. ábra mutatja a pelB gén szekvenálásának stratégiáját.

A pelB gént hosszú vékony fekvő téglalap formájában mutatjuk be.

ss: szignál szekvencia; 1-5 intron pozíciók.

A restrikciós helyek pozícióját a vonalszakaszon mutatjuk be, a vonal alatti számok a pGW 830-on (2. ábra) lévő helyzetnek felelnek meg, a vonal fölötti számok a meghatározott szekvencián levő helyzetnek felelnek meg (11. ábra).

Az előállított szubklónokat kettős nyíllal (=>) jelöljük, nl-nl3 az 5’-3’ és r 1 -r 12 a 3’-5’ irányban a génhez

HU 212 832 Β viszonyítva. Az univerzális szekvenáló primerrel meghatározott szekvenciákat egyszeres nyíl (—>) jelöli. A kis befeketített részek speciálisan szintetizált primereknek, szekvenciáknak felelnek meg, az ezekkel leolvasott irányokat nyíllal jelöljük.

A: HR5767, B: HR5770, C: HR5826, D: HR5827, E: HR5828, F: HR5829

A pontozott részeket tartalmazó nyilak az Extended Klenow szekvenálási módszerrel (Gibco BRL Focus 9:3, 1-4) meghatározott szekvenciákat mutatják.

A: belső Ml3 szekvenáló primer starthely (14 bázis 17-ből) a pelB szekvencián.

A 9. ábra mutatja a pelC gén szekvenálásának stratégiáját.

A pelC gént befeketített hosszú vékony téglalap formájában mutatjuk be. A gén orientációja balról jobbra, az 1368-as pozícióban levő ATG kódontól a 2708-as pozícióban levő stopkodonig.

A restrikciós hasítási helyek számozása a pGW 850 számozáshoz képest (3. ábra) fordított, de megfelel a meghatározott DNS szekvencia számozásának (12. ábra). Az előállított szubklónokat kettős nyíllal (=> ) jelöljük, nl-nl7-ig az 5’-3’ irányban és rl-rl2 a 3’-5’ irányban, a génhez viszonyítva. A meghatározott szekvenciák hosszát hosszú vékony téglalapokkal jelöljük. Az exonukleáz III kiónokat befeketített nyilakkal jelöljük, el-el4 (-»).

A10. ábra mutatja a PLA-t kódoló gént tartalmazó, I képletű pelA DNS molekula szekvenciáját;

A11. ábra mutatja a PLB-t kódoló gént tartalmazó, I képletű pelB DNS molekula szekvenciáját;

A 12. ábra mutatja a PLC-t kódoló gént tartalmazó, I képletű pelC DNS molekula szekvenciáját;

A 13. ábra mutatja a PLD, PLA és PLC között aminosav szinten meglévő homológiát, ahol a homológ aminosavak be vannak kerítve. A kötőjeleket a szekvenciák illesztése céljából tettük be.

A 14. ábra mutatja a BDBB hibrid interferont kódoló gént tartalmazó pUC19/pelA-IFN AM 119 vektor előállítását, ahol pUC19/pelA

1. Sáli emésztés

2. Klenow DNS polimeráz

3. PstI emésztés

4. Linker ligálás

5.5 kb fragmens izolálása pJDB207/PH05-IFN AMI 19

1. BamHI, HindlII emésztés

2. 1,3 kb fragmens izolálása

3. Taql emésztés

4. Klenow DNS polimeráz

5. Ddel emésztés

6. 549 bp fragmens izolálása

A 15. ábra mutatja a pelA-IFN fúzió nem-kódoló szálát a pelA-IFN AMI 19 plazmidon, kihurkolódó szignál szekvenciával, a pelA szignál szekvencia deléciós mutageneziséhez használt illeszkedő oligonukleotid primer molekulával. Az ábrán az 5’GGTTCTACACACTTCACCATGTGTGATCTGCCTCAGACTCAC-3’

MetCy s AspLeuProGl nThrHi s 1 7 primer extenciós DNS szintézisben primerként használt mutagén oligodezoxinukleozid.

A következő példák a találmány illusztrálását szolgálják, de semmiképpen nem korlátozzák azt.

A rövidítések jelentése

Amp ampicillin

ATP adenozin-trifoszfát

BSA szarvasmarha szérum albumin

CIP borjúbél alkalikus foszfatáz

DNA dezoxirobonukleinsav

DTT ditiotreitol

EDTA etilén-diamin-tetraecetsav dinátrium só EGTA bisz-(aminoetil)-glikoléter) Ν,Ν,Ν’,Ν’-tetraecetsav, kb kilobázis-pár

LMP alacsony olvadáspontú mOsm milliozmol

PEG polietilénglikol

RNA ribonukleinsav rpm fordulat per perc

SCS nátrium-dodecil-szulfát

Te tetraciklin

Tris trisz (hidroximetil)-aminometán

U egység

V volt.

Pufferek, táptalajok, reagensek;

HHAB/g lOxtömény restrikciós enzim puffer, BamHI, BglII, Hindin, Mbol és Xhol emésztéshez, összetétele 60 mM TrisHCl (pH 7,4), 60 mM béta-merkapto-etanol, 60 mM MgCl₂, 500 mM NaCl, 0,1% BSA 0,1% zselatin,

EcoRI puffer 5xtömény restrikciós enzim puffer EcoRI emésztésekhez, összetétele 500 mM Tris-HCl (pH 7,2), 25 mM MgCl₂, 250 mM NaCl, 0,05% BSA, 0,05% zselatin,

IPTG 100 mM izopropil-béta-tio-galaktopiranozid (23,8 mg/ml) vízben,

LC táptalaj 1% triptikáz pepton (BBL) 0,5% élesztőkivonat (BBL), 0,8% NaCl, 1 ml TrisHCl pH 7,5 per liter, minimál táptalaj 1,05% K₂HPO₄, 0,45 KH₂PO₄, 0,1% (NH₄)₂, SO₄ (0,05% E. colihoz), nátrium-citrát x 2H₂O, 1 mM MgSO₄, 1 mM tiamin-HCl, 0,2% glükóz,

2xTY táptalaj literenként 16 g triptikáz pepton (BBL), 10 g élesztőkivonat, 5 g NaCl

TBE puffer 1 liter tartalmaz 10,8 g Tris-t, 5,5 g bórsavat, 4 ml 0,5 M EDTA-t (pH 8,0),

TE puffer 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0), alacsony TE puffer 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA (pH 8,0),

X-gal 2%-os (5-bróm-4-klór-3-indolil-béta-galaktozid) dimetilformamidban

SSC 0,15 NaCl, 0,015 M nátrium-citrát minimál táptalaj A niger-hez 1 liter tartalma: 1,5 g KH₂PO₄, 0,5 g KC1, 0,5 g MgSO₄x7H₂O. 4,0 g

HU 212 832 Β

NH₄C1, 10,0 g glükóz, FeSO₄, MnSO₄ ZnCl₂ nyomnyi mennyiségben, a pH 6,5-re állítva nátrium-hidroxiddal komplett táptalaj A. niger-hez minimál táptalaj plusz

0,2% triptikáz pepton (BBL), 0,1% kazaminsav (Difco), 0,1% élesztőkivonat (BBL), 0,05% ribonukleinsav nátrium só élesztőből (ICN, Cleveland, USA), 2 ml vitamin oldat literenként, vitamin oldat 100 ml-ben 10 mg tiamin, 100 mg riboflavin, 10 mg pantoténsav, 2 mg biotin, 10 mg pamino-benzoesav, 100 mg nikotinamid, 50 mg piridoxin-HCl,

Szilárd táptalajok készítésénél az adott összetételű táptalajokat 1,5% agarral (BBL) szilárdítjuk, fedőagar(óz) céljára 0,7% agart (BBL) vagy agarózt (Seakem) használunk.

PBS literenként 0,37 g NaH₂PO₄, 2,7 g Na₂HPO₄, 8,5 g NaCl,

PSB 10 mM Tris-HCl (pH 7,6) 100 mM NaCl, 10 mM

MgCl₂, 0,05% zselatin,

LDB 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂.

A következő törzseket használjuk:

A. niger N400 vad típusú A. niger N593 cspA, pyrA

A. niger N756 nagymennyiségű pektináz enzim előállítására szelektált törzs.

A. niger AN8 DSM 3917, az A. niger N756 uridin auxotróf mutánsa

E. coli NM539 metB, supE, hsdM⁺, hsdR~, supE, (P2cox3) Clonteh

E. coli MH1 ara Dl39, Á/acX74„ ga/U, ga/K, hsr, hsm⁺, strA,

E. coli JM103 Alac-pro, thi, strA, supE, endA, SbcB, hsdRA, F¹, íraD36, pro AB, Zaelq, ΖΔΜ15 (Stratagene)

E. coli JM109 A(lac-proAB), recAl, endAl, gyrA96, thi, hsdRll, supEAA, relAl, λ^-, [F’, traD36, proAb, lacP, ΖΔΜ15] (Stratagene)

E. coli:CJ236 (dut-l, ung-l, thi-l, reZA-1; pCJ105 (Cm¹); BIO-RAD Muta-Gene M13 in vitro mutagenezis kit)

E. coli MCI 190 [A(lac-proAB), thi, supE, A(srlrecA)306::Tnl0(tet^r) (F’:traD36, proAB, lac 11ΖΔΜ15)]. Az MV1190 törzset a BIO-RAD MUTA-GENE M13 in vitro mutagenezis kit használati utasításában írják le.

A következő vektorokat használjuk EMBL4

Az EMBL4 egy lambda helyettesítési vektor 9-23 kb klónozási kapacitással (Frischauf et al., 2. ref). Egy multiklónozó helyet tartalmaz a lambda karok és a nem létfontosságú kitöltő régió között. Ez lehetővé teszi, hogy többszörös restrikciós enzimes emésztést hajtsanak végre olymódon, hogy a kitöltő régiónak a vektor karokhoz való visszaligálódása minimális legyen, mivel fontos idegen DNS épül be. A vektor felhasználja a Spi fenotípust, hogy lehetővé tegye a rekombinánsok direkt szelekcióját (Zissler et al., 20. ref.) pCG3Bll (1986. 12. 12. DSM 3916)

Ezt a plazmidot az EP-A-278355 számú szabadalom leírásában közük, az A. niger N756 pelD (PLI) génjét tartalmazza pBR322-ben klónozva.

pPL29-5

Ezt a plazmidot az EP-A-278355 számú szabadalom leírásában írták le, a pelD (PLI) gén N-terminális EcoRI fragmentjét tartalmazza.

pPL35-5

Ezt a plazmidot az EP-A-278335 számú szabadalom leírásában közük, a pelD (PLI) gén C-termináüs EcoRI fragmentjét tartalmazza.

pBR322

A pBR322, plazmid ampicillin rezisztenciát (amp^R) és tetraciklm rezisztenciát (tet^R) kódoló géneket tartalmaz. A plazmidon számos egyszeres klónozási hely található, melyek közül néhány vagy az amp vagy a tét génben található, így a klónozott DNS inszerciója, antibiotikum érzékeny baktériumokat eredményez.

pEMBL18 és pEMBL19

Ezeket a plazmidokat Dente és munkatársa írták le (7., 8. ref.) pGW613

Ezt a plazmidot Goosen és munkatársai írták le (12. ref.)

Ml 3 mp fág

Az M13 mpl8 és M13 mpl9 vektor (Nörrander és mtsai, 21. ref.) az M13 egyszál- DNS bakteriofág származékai, úgy tervezték őket, hogy megkönnyítsék a DNS szekvenálást, olymódon, hogy lehetővé tegyék a DNS fragmensek klónozását verzatil poliünker helyre és ugyanannak a fragmensnek a klónozását mindkét lehetséges orientációban. Az ezekbe a vektorokba klónozott szekvenciákat könnyen lehet templátként használni szekvenálási reakciókban, vagy egyszálú próbák előállításában standard oügodezoxiribonukleotid primerek és az E. coli DNS polimeráz I Klenow fragmentjének felhasználásával. A vektor DNS tartalmazza az E. coli lac operon promoterét, valamint a béta-galaktozidáz első 145 aminosavának genetikai információját. A több restrikciós hasítási helyet tartalmazó polilinker szekvenciákat a laz Z szekvenciába építik be. A polilinker megtartja a lac Z leolvasási fázisát, és a vektor allelikusen komplementál egy Lac Z alfa gazdasejtet, így IPTG és X-gal tartalmú lemezeken kék tarfoltokat kapunk. A beépített DNS szakaszokat tartalmazó rekombináns fágokban elromlik a leolvasási fázis, vagy a DNS darab másképpen zavarja a lac Z alfa peptid expresszióját, így ezeket színtelen tarfoltok formájában lehet felismerni.

pCG59D7

Ezt a plazmidot az EP-A-278355 számú szabadalom leírásában írták le, és az Escherichia coli BJ5183/pCG59D7 (DSM 3968) törzsből lehet előállítani. A plazmid tartalmazza a pyrA gént, és az A. niger pyrA^- mutáns ko-transzformálására használják.

M13(+)KS (Bluescript) STRATAGENE. San Diego, CA, USA) dsDNS vektor, amely az M13 fág replikációs origóját tartalmazza. Segítő fág, pl. M13KO7

HU 212 832 Β (29. ref.) vagy R408 (9. ref) jelenlétében a vektor (+) szála replikálódik, csomagolódik, és a táptalajba kerül.

M13KO7

Az M13(+)KS segítő M13 fágja. Mead és munkatársai (29. ref) írják le.

R408

Az M13(+) KS segítő M13 fágja. Russell és munkatársai írják le (9. ref.)

1. példa

Aspergillus niger genomiális génkönyvtárának előállítása

1.1. Nagymolekulatömegú DNS előállítása A. niger-ből

Az Aspergillus niger N400 törzs konidiospóráit 200 ml minimál táptalajba oltjuk 10⁶ spóra/ml végső sprórasűrűségben, majd 1 1-es Erlenmeyer lombikban rázatjuk 24 órán át 28 °C-on 300/perc fordulatszámmal, New Brunsewick körkörös rázógépben. A micéliumot szűréssel nyerjük ki, Myracloth-tal bélelt Büchner tölcsért használva, hideg steril sóoldattal mossuk, folyékony nitrogénben lefagyasztjuk, és/vagy tároljuk -60 °C-on, vagy azonnal felhasználjuk. A genomiális génbank előállítására alkalmas DNS izolálást módszere a Yelton és mtsai (1. ref) által leírt módszeren alapszik. A DNS hozam körülbelül 50-100 pg/g micélium ezzel a módszerrel. Génbank készítéshez 10 g micéliumot dörzsölünk el folyékony nitrogénban, 1 g-os részletekben, Braun mikro-diszmembrátorban. A porított micéliumot 1 literes steril Erlenmeyer lombikba teszszük át, amely 200 ml extrakciós puffért (50 mM EDTA, pH 8,5 0,2% SDS) és 200 pl dietilpirokarbonátot tartalmaz. Az elegyet lassan szobahőmérsékletre melegítjük, majd 20 perc alatt 68 °C-ra melegítjük, miközben alkalmanként megrázzuk. A szuszpenziót szobahőmérsékletre hűtjük, majd 15 percig 12 OOOxg-vel centrifugáljuk, a felülúszóhoz 1/16 térfogat 8M káliumacetátot adunk (pH 4,2), majd az elegyet egy órán át hagyjuk jégben állni. A csapadékot centrifugálással eltávolítjuk (20 perc, 16 OOOxg, 4 °C). A nukleinsavakat kicsapjuk a felülúszóból, 0,6 térfogat izopropanollal jégen inkubálva 15 percig. A csapadékot centrifugálással nyerjük ki (10 perc, 6000xg, 4 °C), 70%-os etanollal mossuk, majd röviden szárítjuk. Az üledéket 20 pg/ml RNáz A-t tartalmazó 10 ml TE-ben szuszpendáljuk (Boehringer, Mannheim), majd 15 percig 37 °Con inkubáljuk. A DNS-t nukleáz-mentes pronázzal kezeljük (1 mg/ml végkoncentráció) (Kochlight, Coinbrook) 37 °C-on egy órán át. A pronáz törzsoldat TE pufferben 20 mg/ml koncentrációban tartalmazza az enzimet, amelyet a nukleázok emésztésére 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk.

8,6 g CsCl-ot oldunk 9 ml DNS oldatban, ehhez 0,2 ml 10 mg/ml etidium-bromidot adunk, és vagy Beckman SW41 rotorban centrifugáljuk 60 órán át 33 000 rpm-mel, vagy Beckman 50Ti rotorban gyors lezárású csövekben 40 órán át 45 000 rpm-mel. A DNS csikót a cső oldalának kilyukasztásával nyerjük ki. Az etidiumbromidot vízzel és NaCl-dal telített izopropanollal végzett többszöri extrakcióval távolítjuk el. 5 térfogat TE puffért adunk hozzá, a DNS-t extraháljuk TE-vei telített fenollal, fenol/kloroform/izoamilalkohol 25:24:1 arányú elegyével, majd kloroform/izoamilalkohol 24:1 arányú elegyével. A DNS-t kicsapjuk 0,1 térfogat 3 mólos (pH 5,2) nátrium-acetát és 2,5 térfogat etanol hozzáadásával, majd éjszakán át -20 °C-on inkubáljuk. A csapadékot centrifugálással kinyerjük (1 óra. 30 OOOxg) 4 °C), 70%-os etanollal mossuk, szárítjuk, majd 400 pl alacsony TE-ben oldjuk.

7.2. Az A. niger DNS részleges emésztése Mbolgyel, a fragmensek izolálása

Hogy megállapítsuk azt az Mbol koncentrációt, amely legnagyobb mennyiségben eredményez 13,6 és 23 kb méret közötti fragmenseket, A. niger N400 DNS 1 pg-os részleteit emésztjük a megfelelő pufferben csökkenő mennyiségű (0,5-0,001 U) Mbol-gyel, 1 órán át 37 °C-on, 10 pl térfogatban. A reakciót 1 pl 0,25 M EDTA hozzáadásával leállítjuk, majd a mintákat 0,6%-os TBE-ben került agarózra visszük, amely 1 pg/ml etidium-bromidot tartalmaz. Megfelelő marker a lambda fág DNS, valamint a BglII restrikciós enzimmel emésztett lambda DNS, amely 49; 22,8; 13,6; 9,8:

2,3 kb méretű csikókat eredményez, valamint egy nem látható 0,45 kg méretű fragmenst. A kívánt 12.6-23 kb méretű fragmensek nagy mennyiségben való előállításához a 0,02 U/pg DNS Mbol koncentráció felel meg. Ennek megfelelően 2 ml össztérfogatban lévő 200 pg DNS-t emésztünk, majd az enzim hozzáadása után közvetlenül 20 egyforma részre osztjuk. Egy órán át 37 °C-on végzett emésztés után az emésztményeket jégbe tesszük, és 1 pg-os mintát futtatunk gélen, a megfelelő mértékű emésztés leellenőrzésére. Pozitív eredmény esetén EDTA-t adunk az elegyhez 25 mM végkoncentrációban a reakció leállítására, az enzimet hővel inaktiváljuk 65 °C-on tartva az elegyet 10 percig, a mintákat egyesítjük, a DNS-t kicsapjuk, mossuk, szárítjuk és 400 pl TE-ben oldjuk. A fragmentált DNSt éjszakán át 0,4%-os preparatív gélen futtatva választjuk szét (a középső felviteli hely mérete 120x1.5 mm). BglII restrikciós enzimmel emésztett lambda DNS-t használunk markerként a részlegesen emésztett DNS fragmensek méretének meghatározására elektroforézissel (4 °C, 40V; 3V/cm). A megfelelő méretű fragmenseket tartalmazó gél-régiót kivágjuk a gélből, a DNS-t elektroeluáljuk a gélből steril dialízis hüvelyben, 2 ml TBE-be, 2-3 órán át 100 V feszültséggel. Az áramot 30 mp-re megfordítjuk, és a DNS-t tartalmazó puffért összegyűjtjük. A fragmenseket ezután etanolos kicsapással töményítjük, majd 100 pl alacsony TE-ben oldjuk.

1.3. Vektor DNS készítése és az A. niger nagy molekulatömegű DNS fragmenseinek klónozása EMBL4-ben

Az A. niger N400 genomiális génbankját EMBL4 lambda vektorban állítjuk elő. A vektort, amelynek klónozási kapacitása 9-23 kb között van, Frischamf et al (2. ref) valamint Karn et al. (3. ref) írják le, és a Promega Biotech. Inc.-től vásárolható. Hogy a genom

HU 212 832 Β különböző részeiből származó dupla inszerteket elkerüljük, klónozáshoz minimum 13,6 kb méretű fragmenset használtunk.

gg lambda EMBL 4 DNS-t emésztünk meg teljesen 50 egység BamHI restrikciós enzimmel megfelelő pufferben 100 μΐ térfogatban, 2 órán át 37 °C-on. Az enzimet 10 perces 65 °C-os hőkezeléssel inaktiváljuk. A NaCl koncentrációt 150 mM-ra emeljük, 50 egység Sáli enzimet adunk hozzá, és az inkubálást további 2 órán át folytatjuk 37 °C-on. EDTA-t 25 mM végkoncentrációban hozzáadva, majd az enzim hőinaktiválása (10 perc 65 °C) után az oldatot egyenlő térfogatú TE pufferral telített fenollal, fenol/kloroform/izoamilalkohol 25:24:1 arányú elegyével, majd kloroform/izoamilalkohol eleggyel extraháljuk. A kis BamHl/SalI polilinker fragmensek eliminálása céljából a DNS-t 0,6 térfogat izopropanolból csapjuk ki, 0,1 térfogat 3,0 mólos nátrium-acetát (pH 5,2) hozzáadása után. 15 percig jégen tartjuk, majd 15 percig 12 OOOxg-vel centrifugáljuk 4 °C-on, a csapadékot alaposan mossuk 70%-os etanollal, szárítjuk, majd 40 gl alacsony TE-ben oldjuk.

1.4. A. niger genomiális DNS fragmentek ligálása és in vitro pakolása

Lényeges, hogy az 1.3 pont szerint előállított vektor cos helyeit egymáshoz illesszük a ligálási reakció előtt. A 100 mM Tris-HCl (pH 7,5) és 10 mM MgCl₂ oldatban lévő vektort 10 percig 65 °C-on tartjuk, majd illesztjük 1 órán át 42 °C-on. Teszt-ligálásokból kiderült, hogy a körülbelül 1:1 tömeg vektor-ffagmens arány adja a maximális számú rekombinánst. A ligáló elegy összetétele: 50 mM Tris-HCl pH7,5, 10 mM MgCl₂,10 mM DTT és 1 mM ATP, 9,5 μg vektort és 10 μg DNS ffagmentes használva 100 μΐ össztérfogatban. A DNS ligázt (BRL) 0,5 U^gDNS koncentrációban adjuk hozzá, és a ligáló elegyet éjszakán át 14 °C-on inkubáljuk. Aligálás tesztelésére a ligáit DNS-ből kivett mintát agaróz gélen futtatjuk. Ezenkívül 0,5 μg vektort fragmens hozzáadása nélkül ligálunk 5 μΐ térfogatban.

A nagytérfogatú ligáló elegyet etanolos kicsapással töményítjük, majd az in vitro pakolás előtt 20 μΐ alacsony TE-ben oldjuk. Az in vitro pakolást Promega Packagen extraktummal végezzük, az előállító előírásai szerint, 10 μΐ-es részeket használva 1 μg DNS pakolásához. A cI857 Sam7 nagy molekulatömegű lambdából, amelyet az extraktummal szállítanak, 1 μg-ot külön pakolunk hogy megfelelő kontrollal rendelkezzünk. Pakolás uátn 500 μΐ fágoldat puffért (PSB) adunk hozzá, valamint 5 μΐ kloroformot. A rekombináns fágok 4 °C-on tárolhatók. A kapott génbankot két különböző ligálási kísérlettel állítjuk elő.

7.5. Az A. niger N400 törzs genomiális génkönyvtárának titrálása és amplifikálása

E. coli NM539 sejteket 0,2% maltózt, 10 mM MgSO₄-et és 1 mM CaCl₂-ot tartalmazó LC táptalajon növesztünk, míg 600 nm-en mért optikai denzitása 1,0 lesz. Ezután ennek a tenyészetnek 0,2 ml-es alikvot részeit 0,1 ml, PSB-ben készült fág hígítási sorhoz adjuk. Miután a fágok 20 percig adszorbeálódtak 37 '’Con, 3 ml 0,6%-os LC fedő-agart (45 °C) adunk hozzá. A titrálási eredményeket tarfolt képző egység per miben (pfu) kifejezve, az 1.4 pont szerint előállított két fág szuszpenzió 12X10⁵ és 4,2x1ο⁵ pfu/ml koncentrációjú volt. A hátteret, amelyet úgy számítunk, hogy a fragmensek nélkül végzett ligálást nézzük (17% és 40%), kivonva, a rekombinánsok abszolút száma 6xl0⁵ ami körülbelül 200-szorosa a genom hosszának.

A génbank amplifikálásához mindkét fág-szuszpenzióból 80-80 μΐ-t használunk E. coli NM539 sejtek megfertőzésére, amelyeket LC fedő agarózban LC agarlemezekre szélesztünk, majd éjszakán át 37 °C-on inkubáljuk. A fágokat kioldjuk az agarózból, olymódon, hogy a lemezeket 5-5 ml PSB-vei rázatjuk egy órán át szobahőmérsékleten. A PSB-t összegyűjtjük, centrifugáljuk (10 perc, 6000xg) a baktériumok eltávolítására, majd kloroformot adunk hozzá (0,5% végkoncentrációban). A fágszuszpenziókat, amelyeket közel azonos mértékben amplifikáltunk összekeveijük (40 ml térfogatban), titráljuk (8xl0⁹ pfu/ml), és 4 ’Con tároljuk.

2. példa

Az A. niger N400 genomiális génbankjának átvizsgálása a pektin Ház D génre (pelD) és a gén izolálása

2.1. A génbank átvizsgálása

Hogy a pelD gént izoláljuk, az 1. példában előállított lambda genomiális génbankból, 2.5X10⁴ fágot keverünk el folyékony LC-fedőagarózzal és 5 LC agarlemezre szélesztjük. A lemezeket éjszakán át 37 °C-on inkubáljuk, majd 2 órára 4 °C-ra hűtjük. Mindegyik lemezről 2-2 replikát készítünk Benton és Davis tarfolt hibridizálási módszerével (4. ref.). Az első szűrőt (Schleicher and Schüll BA85 vagy Millipore HATF 085) a lemezre helyezzük 1 percre a második replikát 2 percre, és a replikák helyzetét tussal megjelöljük.

A szűrőket ezután 100 ml denaturáló oldatot (1 M NaCl, 0,5 M NaOH) tartalmazó tálba helyezzük 1 percre, majd 1 percre 100 ml renaturáló oldatba (0,5 M Tris-HCl. pH 7,5,1,5 M NaCl). A szűrőket ezután 3 x SSC oldatot (SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M nátriumcitrát, pH 7,0) tartalmazó tálba helyezzük. A szűrőket gyengén dörzsöljük kesztyűs kézzel a bakteriális törmelék eltávolítása céljából, átvisszük friss, 3 x SSC tartalmú tálba, majd szobahőmérsékleten enyhén rázatjuk. A szűrőket Whatman 3 MM papíron blottoljuk, majd 10 percig szobahőmérsékleten szárítjuk. A szűrőket ezután Whatman 3 MM papíron sütjük egy szárítóban, 80 °C-on két ótán át; Ezután fél órán át 6 x SSC-ben mossuk szobahőmérsékleten, majd áttesszük 50 ml előre melegített (56 °C) prehibridizációs elegybe, amelynek összetétele 50 mM Tris-HCl pH 7,5,10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,5% SDS, 0,1% nátrium-pirofoszfát, lOx Denhardt oldat (50xDenhardt oldat: 1% BSA, Boehringer V-ös frakció; 1% polivinil-pirrolidon -40; 1% Ficoll 400). A prehibridizációs elegyhez frissen kell hozzáadni; 0,1 mg/ml heringsperma DNS-t (Maniatis et al., 327. old., 5. ref.) és 0,001 mg/ml poli rA-t. A prehibridizációt 4 órán át 56 °C-on végezzük enyhe rá12

HU 212 832 Β zatás közben. A hibridizáláshoz használt próba a pPL355-ből származó, nick transzlációba vitt 3,5 kb méretű EcoRI fragmens, amely az A. niger N756 törzs pelD génjének C-terminális régióját tartalmazza (hozzáférhető az E. coli BJ 5183/pCG3Bll-ből, DSM 3916 (1986. 12.

12.) 0278355 számon közzétett EP. A fragmenst előzőleg alacsony olvadáspontú agarózból izoláljuk, majd a fragmensből 0,3 gg-ot nick transzlációba viszünk (Maniatis etal., 109-112. old., 5. ref). A nick transzlációval készült DNS-t 10 percig forrásban lévő vízben denaturáljuk, ezután jégbehűtjük, és 50 ml előre melegített prehibridizációs elegyhez adjuk. A prehibridizált szűrőket ezután egyenként a hibridizációs elegybe visszük át. A hibridizálást 56 °C-on végezzük, enyhe rázás közben. A szűrőket 56°C-on mossuk: 2x30 percig fél liter 4xSSC, 0,1% SDS oldattal, majd 2x30 percig 2xSSC + 0,1% SDS összetételű oldattal. A szűrőket 3 MM papíron blottoljuk, majd levegőn 1 órán át szárítjuk. 3 MM papírhoz ragasztjuk őket, megfelelően jelöljük radioaktív izotópos tintával, ezután PVC fóliával (Sárán wrap) borítjuk, és éjszakán át autoradiografáljuk -70 °C-on Konica X-ray filmmel és Kodak X-Omatic kazettával, normál intenzifikáló screent használva. Ilymódon az átvizsgált 5 lemezen 44 pozitív jelet kapunk. A pozitív tarfoltokat steril Pasteur pipettával izoláljuk, nagyon gondosan illesztve a lemezeket az autoradiogramra, a tiszta-jeleket felhasználva. A pozitív tarfoltokat tartalmazó agar-darabokat 1 ml PSBben szuszpendáljuk. A fágokat engedjük diffundálni az agaiból 1 óra hosszat szobahőmérsékleten, időnként vortexelve a szuszpenziót. Az agart és a bakteriális sejttörmeléket centrifugálással távolítjuk el, 10 gl kloroformot adunk hozzá, és a fágszuszpenziót 4 °C-on tároljuk. A pozitív kiónok neve lambda-PLl-től lambda PL44-ig terjed. Mivel a fágokat nagy sűrűségben szélesztjük, a pozitív tarfoltokat kétszer kell tisztítani, kis sűrűséggel szélesztve őket (±100 fág/lemez; 0,1 ml a fágszuszpenzió 1 Ötszörös hígításából), majd az egész eljárást (replikázás, hibridizálás, pozitív tarfoltok izolálása) megismételve.

2.2. Lambda DNS izolálása

Hogy a rekombináns klónokból DNS-t izoláljunk, a fágokat először amplifikáljuk, E. coli NM539-et fertőzve a tisztított klónokból származó fág-szuszpenzió 0,1 miével az 1.5. pontban leírtak szerint, majd a sejteket LC fedőagarózban LC agarlemezre szélesztjük. így olyan lemezeket kapunk, amelyeken az indikátor baktérium egybefüggő lízisét kapjuk. 5 ml PSB-t viszünk a lemezekre és a fágokat 2 óra alatt, enyhe rázatás közben eluáljuk. Az eluált fágokat Összegyűjtjók, a sejttörmeléket centrifugálással eltávolítjuk, majd kloroformot adunk hozzá 1% végkoncentrációban. A kapott lemez-lizátumot 4 °C-on tároljuk. Titere általában 10¹¹ pfu/ml.

Mivel kismennyiségű lemez-lizátum szuszpenziókból és kismennyiségű folyadék-tenyészetből (Maniatis et al., 65-68. old., 5. ref.) nem mindig sikerül emészthető DNS-t izolálni, ezért a fágokat 250 ml lizátumból izoláljuk. Ezeket úgy állítjuk elő, hogy a gazdaszervezetet, az E. coli NM539-et 0,3-es OD^-ig növesztjük LC+0,2% maltóz, 10 mM MgSO₄, 1 MM CaCl₂ összetételű táptalajban, majd ehhez körülbelül 10¹⁰ pfu-t adunk a lemez-lizátumból. Tovább növesztve, a baktériumok 4 órán belül lizálnak.

A lizátumhoz RN-áz-t és DNáz-t adunk 2 gg/ml végkoncentrációban, és a lizátumot egy órán át szobahőmérsékleten hagyjuk állni. A sejttörmeléket centrifugálással eltávolítjuk (20 perc, szobahőmérséklet, 10 OOOxg). 14,8 g NaCl-t és 25 g PEG 6000-et oldunk a felülúszóban, így kapunk végkoncentrációként 1 M NaCl-t és 251% PEG-et. A fágokat egy órán át jégen állva, vagy éjszakán át 4 °C-on állva hagyjuk kicsapódni, majd centrifugálással összegyűjtjük (20 perc; 10 OOOxg; 4 °C). Az üledéket 3 ml lambda hígító pufferben (LDB = 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM Mg Cl₂, 100 mM NaCl) szuszpendáljuk. 4 ml fág-szuszpenzióban 2,5 g CsCl-ot oldunk, és az elegyet 5 ml-es Beckman gyorszárású csövekbe töltjük, majd ugyanilyen CsCl koncentrációjú LDB oldattal töltjük fel. A csöveket lezárjuk, majd éjszakán át centrifugáljuk Beckman Vti 65,2 rotorban 50 000 rpm-mel 4 °C-on. A zavaros fág csíkot, amely normál lámpafényben látható, a cső oldalába szúrt lükön keresztül távolítjuk el. A CsCl-t dialízissel távolítjuk el sterildializáló hüvelyben, 21 10 mM Tris-HCl pH7,5, 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl összetételű oldattal szemben 4 “’Con 4 óra alatt. A puffért egyszer cseréljük. A fágokat steril Greiner csövekben gyűjtjük össze, a térfogatot 1 ml-re állítjuk a dialízis pufferrel, 50 gl 10% SDS-t, 50 gl 0,5 M EDTA-t (pH 8,0) és 25 gl 20 mg/ml nukleáz-mentes pronázt adunk hozzá, és a csöveket 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A térfogatot 3 ml-re növeljük TE-vei, majd ezt az oldatot extraháljuk azonos térfogatú TE-vei telített fenollal, fenol/kloroform/izoamilalkohol 25:24:1 arányú elegyével, majd kloroform/izoamilalkohol 24:1 arányú elegyével. 0,1 térfogat 3 M nátrium acetát (pH 5,2) és 2,5 térfogat etanol hozzáadása után a DNS-t kicsapjuk éjszakán át -20 °C-on tartva, majd centrifugálással összegyűjtjük (1 óra, 20 OOOxg 4 °C). A csapadékot 70%-os etanollal mossuk, szárítjuk majd 200 gl alacsony TE-ben oldjuk. A kapott fág DNS mennyisége körülbelül 200 gg/250 ml lizátum.

2.3. A pelD klánok restrikciós analízise A pozitív fágok közül véletlenszerűen kiválasztunk tízet további analízis céljából. 1 gg fág DNS-t 10 egység EcoRI és BglII restrikciós enzimekkel emésztünk 20 gl térfogatban 2 órán át 37 °C-on az előállító által javasolt pufferben. A mintákat 0,6%-os agaróz-gélen választjuk el, markerként 1 gg lambda cI857 Sam7 DNS-t (Hindlü-mal emésztve) használunk, kontrollként pedig EcoRI-gyel emésztett EMBL4 és pCG3B 11 DNS-t. A gélt UV transzilluminátorral átvilágítva Plolaroid 667 filmre fényképezzük (4 sec, 8-as blende). A DNS-t Southern módszerével Schleicher and Schüll BA85 nitrocellulóz filterre visszük át (Maniatis, 382386. old., 5. ref). A szűrőket a teljes gént tartalmazó pelD gén ³¹P-vel jelzett (nick transzlációba vitt) fragmenseinek keverékével hibridizáljuk. Ezek a fragmensek a 2,9 kb méretű EcoRI fragmens a pPL29-5 plazmidból, valamint a pPL35-5 plazmid 3,5 kb méretű

HU 212 832 Β

EcoRI fragmense. A hibridizálási és mosási körülmények ugyanazok mint amit a 2.1 pontban leírtunk.

A csíkok méretét a fotóról és az autoradiogramról határozzuk meg, féllogaritmikus papíron összehasonlítva az ismert marker sávokkal. A kiónok restrikciós térképét az 1. ábrán adjuk meg. A lambda -PL4, -14 és 40 kiónok mind a 2,9, mind a 3,5 kb méretű EcoRI fragmenttel hibridizálnak, mint a pCG3Bll. A lambda -PL5, -6,-10 és -33 klón tartalmazza a 3,5 kb méretű EcoRI fragmentet más hibridizáló EcoRI fragmenssel együtt. A lambda -PL26 és -28 klón a 2,9 kb méretű EcoRI fragmentet tartalmazza más hibridizáló fragmenssel együtt, míg a lambda -PL9 klón csak egy kisméretű, 1,2 kb méretű hibridizálódó EcoRI fragment tartalmaz. A pCG3Bll teljes 5,0 kb méretű Bgin fragmense, amely a teljes pelD struktúrgént tartalmazza, csak a lambda -PL4, -14 és -40 kiónokban van meg. A lambda -PL5, -6, -10, -14, -33 és -40 kiónokban jelenlévő 3,7 kb méretű hibridizálódó csík, amely nincs meg a pCG3B 11-ben, a pelD géntől downstream található az 5,0 kb fragmenten. Néhány hibridizálódó BglII fragmens még tartalmaz 1,2 kb-t a vektor jobb kaijából. Az összes klón tartalmaz azonos nem hibridizálódó ffagmenseket. Mivel mind a struktúrgén, mind a gén környezetének restrikciós mintázata azonos mindegyik kiónban, ezért arra következtetünk, hogy mindegyik az A. niger N400 törzs azonos pelD génjéből származnak. A szélesztett kiónok számából, a feltételezett 3x10⁷ bp genom-méretből és az átlagban 15 kb méretű inszertet tartalmazó 25 000 kiónból számítva legalább 12 pelD kiónt kellett volna találni. Mivel az analizált 10 klónból csak 2 azonos, ezért a génbank komplexitása a feltételezettnél nagyobb (lásd 3. példa).

2.4 A pelD fragmensek szubklónozása

Az A. niger N400 és N756 pelD génjét tartalmazó lambda PL4 és pCG3B 11 5,0 kb méretű BglII fragmensét a pBR322 plazmidban klónozzuk, a BamHI helyen (lásd klónozó vektorok). 4 pg lambda -PL4 és 2 pg pCG3B 11 DNS-t teljesen megemésztünk 20 pl össztérfogatban 10 egység BglII restrikciós enzimmel 2 órán át 37 °C-on. A fragmenseket elválasztjuk 1%-os alacsony olvadáspontú LMP agarózban (BRL), TBE + 1 pg/ml etidium-bromidot használva, 50 V feszültségen. Az 5,0 kb méretű fragmentet kivágjuk a gélből, 0,4 ml· TE-vei hígítjuk, azonos térfogatú fenolt adunk hozzá, majd az elegyet 10 percig 65 °C-ra melegítjük, hogy az agaróz megolvadjon. Miután 5 percig 12 000 rpm-mel centrifugáltuk Eppendorf 54 145 asztali centifugán, a vizes fázist fenol/kloroformmal majd kloroformmal extraháljuk, etanollal kicsapjuk, mossuk, szárítjuk, majd végül 10 pl alacsony TE-ben oldjuk.

pg pBR322 plazmid DNS-t, amelyet a nagymenynyiségű plazmid izolálására alkalmas módszerrel állítunk elő (Maniatis et al., 86. old., 5. ref.) és CsCl gradiens centrifugálással tisztítottunk, 5 egység BamHI enzimmel emésztünk 2 órán át 37 °C-on 20 pl térfogatban. 2 pl CP puffért adunk hozzá, majd 0,02 egység CIP-et adunk hozzá, majd az inkubálást további 30 percig folytatjuk. Az elegyhez EDTA-t adunk 25 mM végkoncentrációban, majd az elegyet 10 percig 65 °C-on tartjuk. Az oldatot

TE-ve, 200 pl-re hígítjuk, majd háromszor extraháljuk, először TE-vel telített fenollal, majd fenol/kloroform eleggyel, végül kloroformmal. Etanolos kicsapás után a DNS-t 50 pl TE-ben oldjuk 100 ng fragmens DNS-t Egálunk 20 ng vektor DNS-sel 20 pl térfogatban, az 1.4. pontban leírt körülmények között. A ligáló elegy felével E. coli MH1 kompetens sejteket transzformálunk, amelyeket a CaCl₂-os módszerrel állítunk elő (Maniatis et al., 250. old., 5. ref.). A sejteket 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LC agarlemezekre szélesztjük, majd éjszakán át 37 °C-on inkubáljuk. A transzformánsoknak tetraciklin érzékenységét vizsgáljuk olymódon, hogy a telepeket először 20 pg/ml Tc-t tartalmazó LC lemezekre visszük át, majd LC+ amp tartalmú lemezekre. A transzformánsokat éjszakán át 5 ml LC+amp táptalajban inkubáljuk 37 °C-on, majd a DNS-t a tenyészet 1,5 ml-éből izoláljuk, az alkalikus lízisen alapuló miniprep módszerrel (Maniatis et al., 368. old., 5. ref.).

A miniprep DNS-t BamHI és PstI restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a fragmenseket 1%-os agaróz gélen vizsgáljuk. A lambda -PL4-ből származó, az 5,0 kb méretű BglII fragmenst ellentétes orientációban tartalmazó két plazmidot pGW840 és pGW841 jelzéssel látjuk el. A pCG3Bll plazmidból származó másik két plazmid jele pGW870 és pGW871. A plazmidokat tartalmazó MH1 sejteket glicerinen tartjuk -70 °C-on. Ezekből a kiónokból félliteres tenyészeteket készítünk, majd plazmidot izolálunk belőlük a nagymennyiségű plazmid DNS izolálására alkalmas módszerrel (Maniatis et al., 86. old. 5. ref.), CsCl centrifugálással tisztítjuk, fenolozzuk, etanollal kicsapjuk, majd 400 pl alacsony TE-ben oldjuk. A kitermelés körülbelül 500 pg. A plazmidokat restrikciós térképezésnek vetjük alá. A pGW840 plazmid térképét a 2. ábrán mutatjuk be, ez megkülönböztethetetlen a pGW870 térképétől. Ugyanígy, a pGW841 és pGW871 plazmidok, amelyek a fragmenst ellentétes orientációban tartalmazzák, megkülönböztethetetlenek, mutatva, hogy az A. niger N400 és N576 törzsekből származó pelD gének azonosak.

3. példa

A pelD-vel rokon gének keresése, izolálása és jellemzése

3.1. Hibridizálási körülmények beállítása A. niger

N400 DNS genomiális blotjainak elemzésével

Az 1.1 példában izolált, az A. niger N400 törzsből származó 2 pg DNS-t emésztünk 20 pl térfogatban 4 órán át 37 °C-on BamHI (BRL) vagy Hindin (BRL) enzimmel HHA B/g pufferrel. Az emésztett mintákat elektroforetikusan elválasztjuk 0,6%-os agaróz gélen. 40 V feszültséggel, 18 órán át futtatva. A DNS-t nitrocellulóz szűrőkre visszük át, sütjük a 2.3. pontban leírtak szerint. A (pre)-hibridizációs oldatok azonosak a

2.1 példában leírtakkal.

A prehibridizáláshoz alkalmazott hőmérséklet mindig ugyanaz, mint a hibridizáláshoz használt hőmérséklet. Próbaként a pGW840 plazmidból származó, nick transzlációba vitt 1,6 kb méretű BamHI/PstI fragmentet használjuk, amely a pelD gén kódoló régióját

HU 212 832 Β tartalmazza. A hibridizálást különböző hőmérsékleteken (52, 60, 68 °C) végezzük 16 illetve 40 órán át. A három különböző hőmérsékleten a következő két különböző mosási körülményt használjuk: 2x30 perc 5xSSC + 0,1% SDS, ezt követi 2x30 perc 3xSSC + 0,1% SDS; a másik: 4x30 perc 5xSSC + 0,1% SDS.

°C-on kétszer mossuk 2xSSC + 0,1% SDS oldattal, majd kétszer mossuk 0,2xSSC + 0,1% SDS oldattal is. 68 °C-on 0,2xSSC mosásokat alkalmazva csak homológ hibridizáció történik. Magasabb sókoncentrációk alkalmazása esetén más, gyengébb jelek is megjelennek. 52 °C-on a háttér magas és a hibridizáció gyenge. A heterológ hibridizációhoz legjobbnak talált körülmények: 60 °C. 40 órán át, 5xSSC és 3xSSC mosások. Ezt tovább optimalizálható, ha 4xSSC mosást kombinálunk 2xSSC-veI 5xSSC mosás helyett, és ezt kombináljuk 3xSSC mosással. Az A. niger N400 genomiális blotjaiban látott jeleket, amelyeket a pGW840 1,6 kb BamHI/PstI fragmensével hibridizálva kapunk, az 1. táblázatban foglaljuk össze.

1. táblázat

A pGW8401,6 kb BamHI/PstI fragmensével hibridizált A. niger N400 genomiális DNS jelek

BamHI	HindlII
7,5 kb erősen homológ pelD	21,0 kb erősen homológ pelD
4,3 kb erős	3,9 kb erős
4,1 kb gyenge	7,1 kb gyengébb
18,0 kb gyenge	4,4 kb gyenge
8,4 kb nagyon gyenge	1,5 kb nagyon gyenge

3.2 A génbank screenelése

Az N400 lambda génbankból 2,5x10⁴ fágot szélesztünk 5 lemezre és mindegyik lemezről 3-3 nitrocellulóz replikát készítünk, a 2.1 pontban leírtak szerint. A (pre) hibridizációs puffért is a 2.1. példában írjuk le. Mindegyik lemezről az első replikát 60 °C-on hibridizáljuk 40 órán át a pGW840 1,6 kb méretű BamHI/PstI fragmensével, majd ezen a hőmérsékleten kétszer mossuk 30 percig 4xSSC + 0,1% SDS oldattal, majd kétszer 30 percig 2xSSC + 0,1% SDS oldattal a 3.1. példában leírtak szerint. Ezek a körülmények a továbbiakban a heterológ körülmények. Az egyes lemezekről készült második replikát ugyanezzel a fragmenssel hibridizáljuk 68 °C-on, kétszer 30 percig mosva 2xSSC + 0,1% SDS oldattal, majd kétszer 30 percig 0,2xSSC + 0,1% SDS oldattal, ugyanezen a hőmérsékleten. Ezek a körülmények a homológ körülmények. Az egyes lemezekről készült harmadik replikát homológ körülmények között hibridizáljuk a pGW840 0,35 kb méretű BamHI fragmentjével, amely az 1,6 kb méretű BamHI/PstI fragmenssel szomszédos pelD promoter régióban található. 29 tarfoltot kapunk, amelyek heterológ körülmények között hibridizálnak de nem (vagy nagyon gyengén) hibridizálnak homológ körülmények között. Ezek jelzése lambda -PLIOl-től lambda -PL 129-ig tart. 19 olyan tarfoltot kapunk, amelyek mind heterológ, mind homológ körülmények között erősen hibridizálnak a BamHI/PstI próbával. Ezek jelzése lambda -PL130-tól lambda -PL148-ig tart, és pelD kiónoknak tekintendők. Ezek közül 2 csak gyengén hibridizál a 0,35 kb méretű BamHI próbával (lambdaPL145 és lambda -PL146) ezért valószínűleg egy részét tartalmazzák a promoter-régiónak. A több erősen hibridizál. Csak egy olyan klón van, amely csak a 0,35 kb méretű BamHI próbával (lambda -PL 149) hibridizál.

Minden kiónt kétszer izolálunk és tisztítunk szélesztéssel és az 1,6 kb méretű BamHI/PstI próbával való heterológ hibridizálás alapján. Egy második sőréénél és során 25 egyéb kiónt találtunk (lambda PLl51től lambda PL198-ig).

3.3 A lambda-klónok jellemzése a pelD-ből származó különböző próbákkal végzett tarfolt hibridizálás alapján

Ebben a kísérletben az izolált kiónok osztályozását írjuk le, próbaként a pelD kódoló régió különböző részeit használva. Ide tartoznak a lambda PLIOl-től -130-ig terjedő kiónok, valamint a lambda PL4-et használjuk pozitív kontrollként. A kiónokat kiszélesztjük és csak egy replikát készítünk, amelyet 6 részre osztunk. Ennek az a célja, hogy kizáija a replikák közötti hibridizációs szignál különbségeket. A replikák különböző részeit mind homológ, mind heterológ módszerrel hibridizáljuk a következő ³²P-vel jelzett próbákat használva.

1: a pGW840-ből származó 1,6 kb méretű teljes BamHI/PstI fragmens,

2: a pGW840-ből származó 649 bp méretű BamHI/XhoI fragment (a pelD N-terminálisát kódoló rész)

3: a pGW840-ből származó 244 bp méretű XhoI/PstI fragment (apelD C-terminálisát kódoló rész).

A lambda -PL4, -130 és -145 ki ónok, valamint a lambda -PL101 klón erősen hibridizál ezekkel a próbákkal homológ és heterológ körülmények között, amint azt a pelD klónoktól elvárjuk. A lambda -PL 101 klón a 3.2. példában a filter szélén helyezkedik el, ezért az első screenelés során nem találtuk pe/D-nek.

Az említett kiónokat az I. osztályba tartozónak (pelD) minősítjük. A lambda -PLl 12, -126 és -124 kiónok negatívnak bizonyultak ebben a kísérletben. Az összes többi kiónt két másik osztályba lehet sorolni, a II. osztály kiónjai heterológ körülmények között erősen hibridizálnak nemcsak a teljes próbával, hanem az Nterminális próbával is. A homológ körülmények között végzett hibridizálás csak gyenge a teljes pelD génnel mint próbával. A ΙΠ. osztály kiónjai egyáltalán nem hibridizálnak az N-terminális próbával, és homológ körülmények között a teljes próbával sem. A C-terminális próba sem a II, sem a III osztályba tartozó klónokkal nem képes hibridizálni. Ezekből a kísérletekből azt a következtetést vonjuk le, hogy az izolált kiónok között legalább 2 rokon gén található.

AII. osztályhoz tartoznak:

-PL104, -105, -109, -113, -114, -115, 119, -122,

124, -125,-128 és-129.

HU 212 832 Β

ΑΙΠ. osztály kiónjai:

-PL102, -103, -106, -107, -108, -110, -111, -116, -117,-118,-120,-121 és-123.

3.4. Az izolált lambda-klónok restrikciós analízise (I, II osztály)

Lemez-lizátum szuszpenziókat, 250 ml-es folyékony lizátumokat és nagymennyiségű fág -DNS preparátumokat ezekből a lizátumokból a 2.2 pont szerint állítunk elő. Ezt 24 klón esetében végezzük el, amelyekből 3 pelD klón (lambda -PL4, -130, -145). A DNS izolálás során egy kiónt elvesztettünk (lambda-PL124). Az ezekből a kiónokból izolált DNS-t 1 pg-os részletekben 20 pl össztérfogatban 10 egység enzimmel emésztjük. Az összes kiónt EcoRI, BamHI, HindlII, EcoRI/BamHI, BamHI/Hindin, EcoRI/HindlII és EcoRI/BamHI/HmdHI emésztésnek vetjük alá. A fragmenteket 0,6%-os agaróz gélen választjuk el, majd a 2.3 pontban leírt módon nitrocellulóz filterekre visszük át. A biotokat heterológ módon hibridizáljuk a pGW840 1,6 kb méretű BamHI/PstI fragmentjéhez, a 3.1. példában leírtak szerint. Két klón (lambda -PL112 és lambda -PL 129) nem hibridizál. A fragmentek méretét mind a fényképek mind az autoradiogramok alapján kiszámítjuk. A lambda -PL113 klón kivételével mindegyik klón túl sok fragmenst tartalmaz ahhoz, hogy teljes térképet állítsunk össze.

Az azonban lehetséges, hogy a hibridizálódó régió térképét összeállítsuk és más nem hibridizálódó sávokról nyert adatokkal kombinálva meghatározzuk, hogy mely kiónok származnak ugyanabból a génből. Az világos, hogy a megmaradó 18, Π és ΠΙ osztályú elemzett kiónban 5 gén található. Ezek jelzése pelA, pelB, pelC, pelE és pelF. A kiónok és a gének egymáshoz rendelését a II. táblázatban foglaljuk össze.

2. táblázat

Az izolált kiónok hozzárendelése a különböző pel génekhez (rész) azt jelenti, hogy a hibridizálódó sáv csak részben található meg ezekben a kiónokban

II. táblázat

Osztály	Gén	Lambda-klónok
1.	pelD	PL4, PL130, PL145 (rész)
II.	pelA	PL113, PL104, PL115, PL125(rész)
	pelB	PL119, PL122, PL128, PL105 (rész)
	pelC	PL109
III.	pelE	PL116, PL107 (rész)
	pelE	PL116, PL107 (rész)
	pelF	PL 102, PL103, PL110, PL 120 PL121, (rész), PL123 (rész)

III. táblázat

A hibridizálódó sávok összehasonlítása a kromoszomális blot-okban és izolált génekben. A sávok hossza kb-ban van

	EcoRI	BamHI	HindlII
Kromo- szomális	2,9+3,5	7,5	21,0	Homológ pelD szignál
	+ nagyobb sávok	4,3	3,9	Legerősebb heterológ szignálok
		18,0	7,1	Gyengébb szignálok
			4,4	Gyengébb szignálok
		8,4	4,6	Gyenge szignálok
		4,1	1,5	Gyenge szignálok
pelD	2,9+3,5	7,5	nagy
pelA	7,5	4,3	3,9
pelB	8,7	nagy	7,1
pelC	5,0	nagy	4,4
pelE	6,2	8,4	4,6
pelF	nagy	4,1	1,5+2,8	(nagyon gyenge)

Az izolált génekből származó hibridizálódó fragmensek és a genomiális DNS blot-okból származó hibridizálődó fragmensek hossza látható a ΙΠ. táblázatban. Ezekből az adatokból azt a következtetést lehet levonni, hogy a genomiális blot-okban lévő összes sáv megtalálható az izolált kiónokban, és ilyen hibridizációs körülmények között más, rokon gént nem lehet izolálni. A tarfolt hibridizációs eredmények (3.3. pont) azt mutatják, hogy figyelmen kívül hagyva a részleges kiónokat, a vizsgált próbákkal minden egyes gén specifikus hibridizációs mintázatot ad. Ennek összefoglalása a IV. táblázatban található.

IV. táblázat

A különböző gének által adott jelek erősségének összehasonlítása különböző pelD próbákkal adott homológ és heterológ tarfolt hibridizáció során, a 3.3. pontban leírt kísérlet alapján, a hibridizációs mértékét + jelek számával fejezzük ki. A homológ pelD gén legalább 10 + jel erősséggel hibridizál; ± nagyon gyenge hibridizálás; - nincs hibridizálás.

HU 212 832 Β

heterológ hibridizáció	homológ hibridizáció
próba	teljes gén	N- term.	c- term.	teljes gén	N- term.	C- term.
pelA	++++	++++	+	+++	+	-
pelB	++++	++++	±	+	±	-
pelC	+++	++++	-	-	-	-
pelE	+++	-	-	-	-	-
pelP	++++	+	±	+	-	-

3.5. A pelD rokon gének szubklónozása pBR322ben

A 3.3. pontban leírt lambda-klónokból nyert hibridizálódó fragmensek szubklónjait EcoRI, BamHI vagy Hindin restrikciós enzimekkel emésztett, majd ezt követően defoszforilezett pBR322 vektorba építjük. A fragmensek izolálását alacsony olvadáspontú gélből, a vektor-készítést, ligálást az E. coli MH1 transzformálását, a miniprep DNS izolálást és a nagy mennyiségű plazmid izolálást egyaránt a 2.4. pontban leírt standard eljárásokkal végezzük.

A fragmenseket a megfelelő vektorba a 2.4. pontban leírt módon ligáljuk. A transzformált E. coli MH1 sejteket LC+50 gg/ml Amp táptalajra szélesztjük. Vizsgáljuk a transzformánsok tetraciklin érzékenységét. Az EcoRI kiónok mind rezisztensek. A miniprep DNS mintákat a megfelelő enzimekkel emésztjük, hogy a megfelelő inszertumokat megtaláljuk és hogy meghatározzuk a fragmensek orientációját. A kiválasztott plazmidokat az V. táblázatban foglaljuk össze. A plazmidokat tartalmazó sejteket -70 °C-on tartjuk glicerinben.

V. táblázat

Apel gének szubklónjai pBR322-ben

plazmid	gén	fragmens	eredet	orientáció
pGW820	pelA	7,5 EcoRI	X-PL113	2
pGW821		4,3 BamHi		2
pGW822		3,9 HindlII		2
pGW823		7,5 EcoRI		1
pGW824		4,3 BamHi		1
pGW825		3,9 HindlII		1
pGW830	pelB	7,1 HindlII	X-PL122	1
pGW85O	pelC	5,0 EcoRI	X-PL109	1
pGW851		5,0 EcoRI		2
pGW86O	pelF	4,1 BamHi	Á-PL102	1
pGW88O	pelE	4,6 HindlII	Á-PL109	1
pGW881		4,6 HindlII		2

A pGW820, -830, -850, -860 és -880 plazmidokat nagymennyiségben izoláljuk, majd restrikciós elemzésnek vetjük alá. Ezeket a plazmidoknak a térképét az

1-6. ábrákon mutatjuk be.

Ágén helyének és orientációjának meghatározásához az emésztett plazmidok Southern blotjait hibridizáljuk heterológ körülmények között a pGW840 1,6 kb méretű BamHI/PstI fragmensével, majd ugyanezeket a blot-okat hibridizáljuk heterológ körülmények között ugyanennek a plazmidnak az N-terminális fragmensével, amely a pGW820 és -830 térképezéséhez használt 649 bp méretű BamHI/XhoI fragmens, valamint a pGW850 és -860-hoz használt 766 bp méretű BamHI/EcoRI fragmens.

A pGW82O, pGW830, pGW850, pGW860 és pGW88O plazmidokat E. coli HBlOl-be transzformáltuk és 1988. február 1-jén letétbe helyeztük a Deutsche Sammlung für Mikroorganizmen-nél, 3400 Göttingen, Grisebachstr 8. Nyilvántartási számuk DSM 4388, 4389, 4391 illetve 4392.

4. példa

A pelD, pelA, pelB és pelC gének nukleotid-szekvenciájának meghatározása

4.1. Az A. niger N400 törzsből származó pelD gén részletes szekvenciája, és azonossága az A. niger N756 törzsből származó pell génnel

A 2.4. példa szerint a pGW840 plazmidból alacsony olvadáspontú agarózban végzett gélelektroforézissel megfelelő restrikciós fragmenseket izolálunk. Ezeket a BRL M13 klónozási/dezoxi szekvenálási készlet használati utasítása szerint (26-27. oldal, 6. ref.) M13 mpl9RF vektorokba ligáljuk. Az E. coli JM103 transzformálását, minimál X-gal indikátor lemezekre való szélesztését, valamint az egyszálú DNS rekombináns fágokból való izolálását ugyanezen használati utasítás instrukciói szerint végezzük (29-34. oldal).

Néhány kiónt szekvenálunk a Sanger didezoxi lánc-terminációs módszerrel, a BRL leírás 38-74. oldalán leírtak szerint.

A -457 és +100 nukleotidok között meghatározott szekvenciák azonosak az A. niger N576 törzsből származó PLl gén megfelelő szakaszával, ami a pCG3B 11 plazmidon található (EP Pub. No. 0278355). A -457-es pozícióban levő BamHi pozíciótól a + 100-as nukleotidig terjedő, szekvenált szakasz 457 nukleotidot tartalmaz a promoter szekvenciából, 57 nukleotid a szignálszekvenciát kódolja és 43 nukleotid kódolja az érett PLD fehérje első 13 N-terminális aminosavát.

A pGW840-ben lévő N400 pelD gén és a pCS3B 11-ben lévő N756 pelD azonos restrikciós térképe, és a teljesen azonos N-terminális szekvenciaadatok alapján feltételezhető, hogy a két gén azonos. Ennek megfelelően feltételezhető, hogy a PLD fehérje azonos a PLl fehérjével.

4.2. A pelA, pelB és pelC gének nukleotid szekvenciájának meghatározása

A pGW820, pGW830 és pGW850 fragmenseket Ml3 mpl8RF és M13 mpl9RF vektorokban szubkló17

HU 212 832 Β nozzuk (lásd 4.1. pont), vagy a pEMBL18 és pEMBL19 plazmidokban (Dente et al., 7., 8. ref.). A plazmid klónokból az R408 segítő fággal való fertőzéssel kapunk egyszálú DNS-eket (Russel et al., 9. ref.).

ApGW 850-ből Henikoff módszerével (28. ref.) állítunk elő exonukleáz ΙΠ deléciós kiónokat. A pGW850 plazmid 3,0 kb méretű Smal-BglII fragmensét, amelyen a pelC gén található, pEMBL19 plazmidban klónozzuk. Ebből a kiónból 50 μg-ot emésztünk S_mal és SacI restrikciós enzimekkel, majd fenol/kloroformos extrakció és etanolos kicsapás után exonukleáz ΠΙ-mal emésztjük. Különböző időközönként veszünk mintákat, az exonukleáz ΙΠ-at NaCl és EDTA hozzáadásával, majd 10 perces 70 °C-os inkubálással inaktiváljuk. A kinyúló ssDNS végeket Sj nukleázzal eltávolítjuk, majd a ragadós végeket T4 DNS polimerázzal tesszük tompavégűvé. Ezeknek a deléciós kiónoknak önmagával való ligálása és E. coli JM103 transzformálása után egyszálú DNS-t R408 segítő fággal való fertőzés után kapunk. A pGW820-at a Pvull helytől (100-es számú nukleotid) a 4175-ös pozícióban lévő Clal hasítási helyig szekvenáljuk (lásd 1. ábra). A pGW83O esetében a 2774 bp méretű Xhol fragmenst szekvenáljuk (lásd 2. ábra). A pGW850 plazmidot a 0-ás pozícióban lévő EcoRI hasítási helytől a 3168-as pozícióig szekvenáljuk (lásd 3. ábra).

Ezeknek a géneknek a szekvenálási stratégiáját a 7.,

8. és 9. ábrán mutatjuk be. Oligonukleotidokat szintetizálunk a Caruthers-féle foszforamidit módszerrel (10. ref.), Applied Biosystem 380B oligonukleotid szintetizátort használva. Ezeket szekvenáló primerként használjuk, pozíciójukat a 7. és 8. ábrán mutatjuk be.

A pelA gén teljes szekvenciáját a 9. ábrán mutatjuk be, 5’ -> 3’ irányban. A 3175 bp méretű szekvencia a pGW820 1000-es pozíciójában lévő Pvull hely első nukleotidjával kezdődik, és a pGW820 4175-ös pozíciójában lévő Clal hely utolsó nukleotidjával végződik.

A pelA szekvencia 1360 nukleotidot tartalmaz a promoter régióból, 1355 csoportot a struktúrális részből és 360 nukleotidot a terminátor régióból.

A PLA aminosav szekvenciáját (lásd 6.3 pont) 20 aminosavból álló szignál szekvencia előzi meg, amint az a nukleotid-szekvenciából kikövetkeztethető.

MET-LYS-TYR-SER-THR-ELE-PHE-SER-ALA-ALA-ALA-ALA-VAL-PHE-ALA-LYG-SER-ALA-ALA-ALA *** * * * * * * *

ApelD gén szignál szekvenciájával való homológiát csillaggal jelöljük. Ezenkívül az érett fehérje első 5 aminosava azonos mind a pelA mind a pelD génben.

A pelB gén teljes szekvenciáját a 10. ábrán mutatjuk be, szintén 5’ —» 3’ irányban. A 2774 bp-méretű 30 szekvencia a pGW830 Xhol helyénél kezdődik és a második Xhol hely utolsó nukleotidjánál végződik.

A pelB szekvencia 1133 nukleotidot tartalmaz a promoter régióból, 1373 csoportot a struktúrális részből és 268 csoportot a terminátor régióból.

A pelB gén legalább 20 aminosavból álló szignál szekvenciát kódol.

A pelC szekvencia 1367 nukleotidot tartalmaz a promoter régióból, 1340 maradékot a struktúrális részből és 461 nuklaotidot a terminátor régióból. A pelC a gén 18 aminosavból álló szignál szekvenciát kódol.

pelC MET-LYS-VAL-PRO X-X-PHE-LEU-GLN-LEU-LEU-CYS-ASN-ALA-ALA pelB * * * pelA * * * * p<?/D * * * * pelC LEU-ALA-SER-ALA pelB * * pelA * * pelD * * *

A pelA, pelB és pelD szignál szekvenciájával való homológiát mindegyik helyen csillaggal jelöljük. A Xeket a szekvenciák illesztése céljából használjuk.

A gomba exon/intron illeszkedési helyek konszenzus szekvenciái, valamint az intton belső szekvenciáinak keresése (Ballance, 11. ref.) arra a megállapításra vezet, hogy a pelA, B és C génben négy intron található. Azok a pozíciók, amelyeknél az inttonok találhatók ezen pel gének kódoló régióin belül, konzerválódtak, abban az értelemben, hogy potenciálisan öt intton pozíció van, de mindegyik génből egy másik intton hiányzik. A pelC génben azonban csak három intton található meg. Ezek közül csak egy van a pelD és pelA bármelyik intronjának megfelelő helyen (5-ös intron). Ezeknek az inttonoknak a pozícióját és hosszát foglaljuk össze a Via. táblázatban.

Via. táblázat

Az inttonok pozíciója a pelD, pelA, pelB és pelC szekvenciákban. A pozíciók a 10,11. és 12. ábrákon lévő kódoló szekvenciáknak, valamint a pelD szekvenciáknak felelnek meg.

gén	pelA	pelA	pelB	pelC
intron	pozíció	hossz bp	pozíció	hossz bp	pozíció	hossz bp	pozíció	hossz bp
I	202-267	66	nincs		1337-1398	62	nincs

HU 212 832 Β

gén	pelA	pelA	pelB	pelC
intron	pozíció	hossz bp	pozíció	hossz bp	pozíció	hossz bp	pozíció	hossz bp
2	410-471	62	1708-1759	52	1543-1598	56	nincs
3	598-660	63	1886-1933	48	1725-1781	57	nincs
4	nincs	nincs	nincs				1853-1930	78
5	1446-1502	57	2031-2094	64	nincs		1998-2062	65
6	nincs	nincs	nincs				2232-2294	63
7	nincs		2329-2382	54	2113-2169	57	nincs

Ezekben az esetekben a négy pel génben az exonok hossza az intronok között azonos. A 13. ábrán a PLA, PLB, PLC és PLD egymáshoz illesztett aminosav szekvenciái láthatók. A pel A, pelB és pelD kódoló régióinak N-terminális részén a nukleotid szekvencia alapján körülbelül 80%-os homológia figyelhető meg, és több mint 80% az aminosav szekvencia alapján. Ez a százalék jóval kisebb a pe/C-vel. A pelA, pelB és pelD C-terminális részében az érett fehérje 285. aminosavától kezdődően (az 13. ábrán a 305. aminosavnak felel meg) a homológia nagy mértékben elvesz, és csak a C-terminális közelében tér vissza.

Az illeszkedési szignál és az 5’, 3’ hasítási helyek konszenzus szekvenciái kivételével az intronokban nem található homológia.

VI. b. táblázat

A konszenzus intron szekvenciák összehasonlítása

intron	donor exon 1	intron	hurok	akceptor intron	EXON 2
pelD 1	AAGAC	GTGAGTTT	.32	GGCTGACC.	12.	TGCCAG	TTTCG
pelB 1	AGAAC	GTAGGTCG.	.32	.GCCTAACA.	. .8	.ATCCAG	CTTCG
pelD 2	ACCTA	GTAAGTTG	.37	.TGCTGACA	. .3	. GGATAG	CAACA
pelA 2	GAATA	GTATGTCC	.29	.ATCTAACT.	. .1	.GGATAG	CTACA
pelB 2	ACTTA	GTATGTTG	.31	.TGCTGATA	. .3	.GTATAG	TGATA
pelD 3	ATCCA	GTATGCAT	.32	.AACTAACC.	. .9	.CCACAG	GAACA
pelA 3	ATCCA	GTAGGTTA	.25	.CTCTAACG	. .1	.AATCAG	GAACA
pelB 3	ATCCA	GTGAGTGC	.33	.TGCTAATA	. .2	.GGCCAG	GAACA
pelD 5	TTACT	GTAAGTCG	.31	.CACTAATG	. .4	.CTTCAG	ACTGC
pelA 5	TTACT	GTACGTCT	.40	.AGTTAACA	. .2	. TGACAG	ACCGTC
pelC 5	GCCAG	GTAAGACA	.39	.CGTTGACT	. .4	.CATTAG
pelC 6	CCAGA	GTACGTGT	.30	.AACTAACA.	.11	.TCÁCAG	ACAAC
pel A 7	ACTGT	GTAAGTTG	.24	.ACCTGACT.	. .8.	.TTGCAG	GTCAA
pelB 7	ACGCC	GTATGTCG	.28	.TACTGACA.	. .7	.CTACAG	GTGAA
KONSZENZUS	....	GTA-GT—	.24	.—CTAAC-.	. .1	.---CAG	---
		g c a	40	t G t	12	T

A PLA, PLB, PLC és PLD fehérjék megállapított aminosav sorrendje az első két fehéije esetében 359 aminosavat jelent, 360-at a PLC, 354-et a PLD esetében. Az N-glikozilezést tekintve egy potenciális glikozilezési hely található mind a négy fehérjében a 109-es pozíció60 bán (az érett fehérjében) (a PLC esetében a nemillesztett szekvenciában ez a 105-ös helynek felel meg. APLB-ben a második potenciális hely a 232-es pozícióban található, míg a PLD-ben még két potenciális glikozilezési hely található a 255 és 329-es csoportoknál.

HU 212 832 Β

5. példa

Az A. niger ko-transzformációja az A. niger pyrA gént használva szelekciós markerként és a különböző A. niger pel géneket tartalmazó plazmidokat használva ko-transzformációs plazmádként

5.1. Az A. niger transzformációjára használt plazmidok előállítása és tisztítása

Mindegyik plazmidot E. coli MH1 törzsben szaporítjuk, és a plazmid DNS-t 500 ml-es ovemight tenyészetekből nyerjük ki. Maniatis et al. leírása szerint (90-91. old., 5. ref.). Maximum 1 mg DNS-t tartalmazó 2,5 ml DNS oldathoz 2,2 g CsCl-ot és 1 ml etidiumbromidot (10 mg/ml vízben) adunk. Az oldatot gyors lezárású csövekbe tesszük, amelyeket a gyártó (Beckman) előírásai szerint töltünk meg és zárunk le. A centrifugálást VTi 65.2 rotorban végezzük 20 °C-on 16 órán át 45 000 rpm-mel. Az ultraibolya fényben látható két fluoreszkáló csík közül a plazmid DNS-t tartalmazó alsó csíkot izoláljuk a cső oldalának kilyukasztásával. A DNS oldatot (körülbelül 1 ml) ötször extraháljuk vízzel telített butanollal az etidium-bromid eltávolítására. A DNS-t ezután alkohollal kicsapjuk, TE-ben oldjuk, egyszer-egyszer extraháljuk fenol/kloroform eleggyel, illetve kloroformmal, újra kicsapjuk, majd -20 °C-on tároljuk.

Az OMP-dekarboxiláz gént (pyrA) 5 kb méretű A. niger fragmensen tartalmazó pGW613 plazmidot használjuk transzformánsok szelektálására (Goosen et al., 12. ref.). A 3.5. pontban leírt pGW820, _PGW830, pGW840, pGW850, pGW860 és pGW88O plazmidokat használjuk kotranszformáló plazmidokként.

5.2. Protoplasztok készítése és az uridin auxotróf

A. niger N593 törzs transzformációja

Az A. niger N593 törzset (cspA, pyrA), amely az N400 szülő-törzs származéka az élesztőhöz hasonlóan (Boeke et al., 13. ref.) az 5-fluoro-orotsav toxikus analóggal szembeni pozitív szelekcióval nyertük, a Goosen és mtsai (12. ref.) által leírt módon, uridin jelenlétében.

0,5% élesztő kivonattal, 0,2% kazaminosavval, 10 mM uridinnel (Janssen Chimica) kiegészített folyékony minimál-táptalajt oltunk be milliliterként 10⁶ A. niger N593 konidiospróbával, majd 20 órán át 30 ‘’Con inkubáljuk New Brunswick körkörös rázón. Amicéliumot szűréssel nyerjük ki (Myracloth-on keresztül), izoozmotikus (STS) minimál táptalajjal mossuk (STC), amelynek összetétele a következő: 1,33 M szorbitol, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM CaCl₂, 1,7 mOsm-ra állítva. 1 g micéliumot szuszpendálunk 20 ml STCben. A micéliumból protoplasztok szabadulnak fel 2 órán belül 250 mg szűréssel sterilezett Novozym 234 (Novo Industries, Dánia) hozzáadására, az elegyet 30 °C-on inkubálva 95 rpm-mel működő rázón. A protoplasztokat üveggyapottal töltött tölcséren átszűrve választjuk el az épen maradt micélumtól, majd centrifugálással tisztítjuk (10 perc, 2500 rpm), STC-ben ülepítve és újraszuszpendálva.

Transzformációhoz 5xl0⁶ protoplasztot szuszpendálunk 200 μΐ térfogatban 1 pg pGW613 plazmiddal és 10 pg-mal a fenti plazmidok közül az egyik DNS-sel: pGW820, pGW830, pGW850, pGW860 vagy pGW88O (a térfogat 20 μΐ-nél kevesebb). A pgW840nél 1:3 arányt használunk, 6 pg pGW613-ot véve. Miután a protoplasztokhoz hozzáadtuk a plazmid DNS-t, 50 pl PCT-t (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl₂, 25% PEG 6000) adunk a szuszpenzióhoz, majd 20 percig jégen tartjuk.

Ezután újabb 2 ml PCT-t adunk hozzá, és az elegyet 5 percig szobahőmérsékleten tartjuk. Végül 4 ml STC-t adunk hozzá és összekeverjük. Ebből a végső transzformációs oldatból 1 ml-es alikvot részeket veszünk ki és 0,95 M szacharózzal (1,7 mOsM-ra állítva) stabilizált 4 ml folyékony izoozmotikus MM fedőagarhoz adjuk. A protoplaszt keveréket azonnal ugyanilyen izo-ozmotikus minimál táptalajra visszük és 30 °C-on inkubáljuk. A megfelelő kontrollok plazmid DNS nélkül, hasonlóan kezelt protoplasztok nem-stabilizált, 2,5 mM uridint tartalmazó minimál táptalajon.

napos 30 °C-os inkubálás után jól növekedő, sporuláló transzformánsok jelennek meg (50-150 transzformáns/pg pGW613). Emellett számos, valószínűleg abortív transzformáns megjelenik. A különböző transzformánsok spóráit leszedjük és egymástól szeparálva 50 mM glükózt tartalmazó minimál táptalaj oh szélesztjük izolált telepek előállítása céljából, amelyeket a további transzformáns analízishez szükséges spórák előállításához lehet használni.

Mindegyik esetben legalább tíz transzformánst tenyésztünk folyékony minimál táptalajon, a DNS-t kivonjuk és vizsgáljuk, tartalmaz-e kotranszformáló plazmid DNS-t. A gomba DNS-t a növényi RNS izolálására leírt módszer enyhe módosításával állítjuk elő (Slater, 14. ref.). A micéliumot sóoldattal mossuk, folyékony nitrogénben lefagyasztjuk és 0,5 g-ot elroncsolunk mikrodiszmembrátorban (Braun). A micéliumport frissen készített extrakciós pufferrel extraháljuk. Az extrakciós puffért a következőképpen állítjuk elő: 1 ml tri-izopropil-naftalin-szulfonsavat (TNS) (20 mg/ml koncentrációjú) keverünk 1 ml (120 mg/ml) p-aminoszalicilsavval és 0,5 ml 5xRNB pufferrel (az 5xRNB összetétele: 121,1 1 g Tris, 73,04 g NaCl,

95,1 g EGTA 1 literben, pH 8,5). 1,5 ml fenol hozzáadása után az extrakciós puffért 10 percig 55 °C-on ekvilibráljuk. A meleg puffért a micélium-porhoz adjuk, és a szuszpenziót 1 percig alaposan megkeverjük vortex mixerrel. Ezután 1 ml kloroformot adunk hozzá és 1 percig kevertetjük.

A vizes fázist centrifugálással (10 OOOxg, 10 perc) elválasztjuk, és még egyszer extraháljuk fenol/kloroform 1:1 arányú elegyével, majd kétszer kloroformmal.

A vizes fázis mind RNS-t, mind DNS-t tartalmaz. A DNS-t 2 térfogat etanollal szobahőmérsékleten kicsapjuk, és centrifugálással kinyerjük (10 perc, 10 OOOxg), kétszer mossuk steril desztillált vízben való oldással és etanolos kicsapással. Az RNS-t 20 pg/ml RN-az A végső oldathoz való hozzáadásá20

HU 212 832 Β val távolítjuk el. Az eljárás eredményeként nagy molekulatömegű (100-200 kb) DNS-t kapunk, körülbelül 300 gg DNS/g micélium kitermeléssel, ezt tovább tisztítjuk CsCl/etidium-bromid sűrűség-gradiens centrifugálással, lényegében a Maniatis kézikönyv leírása szerint (93. old. 5. ref.).

A kromoszomális DNS 2 gg-os részleteinek emésztését a pelA (pGW820) és pelC (pGW850) transzformánsok esetében 2 órán át 37 °C-on EcoRI restrikciós enzimmel végezzük, a pelB (pGW83O) transzformánsok esetében Hindin restrikciós enzimmel, a pelD transzformánsok esetében EcoRI vagy BglII restrikciós enzimmel. Mindegyik esetben először 20 U restrikciós enzimet használunk, majd az inkubálást újabb 2 órán át folytatjuk újabb 20 egység enzim hozzáadásával. Az emésztéseket a BRL által szállított megfelelő reakciópufferben végezzük.

A DNS-t ezután 0,6%-os agarózon frakcionáljuk, nitrocellulózra blottoljuk, majd hibridizáljuk lényegében a Maniatis kézikönyvben (5. ref.) leírtak szerint (382-386. oldal), a megfelelő [a~³²p]-vel jelzett próbákat használva.

A következő kotranszformációs frekvenciákat kapjuk: pGW820 (pelA) 70%; pGW830 (peffi), 70%, pGW840 (pelD) 15%; pGW850 (pelC) 60%.

A pGW613 tömegének aránya a kotranszformáló pGW820, pGW83O, pGW850 (1:10) és pGW840 (1:3) plazmidokhoz a legtöbb esetben azt eredményezi, hogy a kotranszformáló plazmidok több példányban integrálódnak a kromoszómába.

5.3. A pelA-val transzformált A. niger A15 törzs genomiális analízise

Számos, az 5.2. pontban leírt multikópiás transzformánst elemeztünk, és az A15 pe/A transzformáns analízisét adjuk meg részletes példaként.

Az Λ. niger N593 törzs és a pelA multikópiás transzformáns A15 törzsekből DNS-t izolálunk, és a

3.1. pontban leírt módon Southern hibridizációval vizsgáljuk. pelA próbaként a 7,5 kb EcoRI fragmenst használjuk. A transzformált A15 törzs genomiális blotjában egy intenzív 7,4 kb méretű sáv található, amely I-es vagy ΙΙ-es típusú integrációs eseményből származik (lásd Hinnen et al., 14a. ref.). Ezenkívül néhány kisebb, különböző hosszúságú sáv is található, amelyek a II. típusú átrendeződés integrációs eseményeinek határfragmenseit jelentik.

Az A15 A. niger pelA transzformáns és az A. niger N593 autoradiogramjaiban lévő 7,4 kb méretű EcoRI sávok optikai sűrűségét Ultroscan XL (LKB) berendezéssel határozzuk meg. A kapott értékeket az A15 transzformáns és az N593 DNS koncentrációja közötti minimális különbségek miatt korrigáljuk úgy, hogy a piruvát kináz génnel hibridizálódó második próbával kapott sűrűségeket vizsgáljuk, mivel ez a gén mindkét törzsben egyetlen példányban fordul elő. Ezekből az adatokból kiszámítható, hogy az A15 pelA transzformánsokban körülbelül 19 intakt pelA gén található.

A pGW83O (3b. ábra) HindlII inszertumát próbaként használva, az A15 transzformált törzs Southern blot-jának elemzése azt mutatja, hogy a pelA szekvenciák integrálása nem a pe/B lókusznál történt. Hasonlóan, a pe/B-vel transzformált B13 törzs, a C16 pelC törzs és a D12 pelD törzs analízise a megfelelő próbákkal kb. 15,50 és 10-es kópiaszámot eredményez.

5.4. A pelA-val transzformált A. niger AJ 5 törzs és az A. niger N400 indukált és nem-indukált micéliumának Northern biot analízise

250 ml 50 mM glükózt vagy 1 v% almapektint (Brown ribbon, d.e. 72,8%, Obipektin AG. Bischofszell) tartalmazó minimál táptalajt inokulálunk az A15 transzformáns vagy az N400 vad típusú törzs 30 °C-on 30 órát növekedett spóráival 10⁶ spóra/ml sűrűségben. A tenyészetből 2 ml-es mintákat veszünk, 2 110 mMos nátrium-foszfát pufferrel (pH 7,0) szemben dializáljuk 4 °C-on, majd -20 °C-on tároljuk.

Amicéliumból az 5.2. pontban leírtak szerint izolálunk nukleinsavakat. Az RNS-t kloroformos extrakció után 1/3 térfogat 8M LiCl hozzáadásával csapjuk ki a vizes fázisból. Az oldatot alaposan összekeverjük, majd éjszakán át 0 °C-on inkubáljuk. Az RNS-t centrifugálással nyerjük ki (300 rpm, 30 perc), MSE Super-Minor centrifugát használva, majd egyszer mossuk hideg (-20 °C) 2 M LiCl-dal, és egyszer hideg (-20 °C) 96%-os etanollal. Az RNS-t végül desztillált vízben oldjuk, körülbelül 1 mg/ml koncentrációban. A preparátumok lényegében DNS mentesek, a kitermelés 1-2 mg RNS/g micélium. Körülbelül 10 gg RNS-t futtatunk denaturáló 1%-os agaróz formaldehid gélen, a Maniatis kézikönyv szerint (202203. oldal. 5. ref.): HindlII restrikciós enzimmel emésztett lambda DNS-t, vagy a BRL RNS-t használva molekulatömeg markerként. A géleket Nytron-on (Schleicher and Schüll) blottoljuk és sütjük a gyártó előírásai szerint, és 68 °C-on 16 órán át hibridizáljuk a 7,4 kb méretű EcoRI pelA DNS próbával. A hibridízálási körülmények ugyanazok mint amit a 3.2. példában a homológ körülmények között végzett DNS hibridizálásra írtunk le.

Mindkét A. niger törzs termel pektin-indukálta mRNS-t, melynek hossza kb. 1,6 kb. A két autoradiogram optikai sűrűségét összehasonlítva 15-20-szoros különbséget látunk az A15 transzformáns és a vad típusú törzs között, ami megfelel a Southern biot analízisből számított kópiaszám növekedésnek.

5.5. Pektin liáz termelés a transzformált A. niger

Dl 2 törzzsel

A D12 A. niger peíD transzformánst, amelyet az

5.2. pont szerint állítottunk elő, kétlépéses eljárással tenyésztünk, hasonlóan a Hermersdörfer és mtsai (27) által a poligalakturonáz előállítására leírt eljáráshoz. Micélium-réteg keletkezik folyékony tápközeg felszínén, miután 10⁶ spóra/ml koncentrációval oltunk tenyésztés előtti táptalajt (PCM, összetétele: cukorrépaszelet (4%) és NH4NO3 (1%) pH 4.5.) A micéliumot 5

HU 212 832 Β napig növesztjük 30 °C-on 30 ml táptalajban, majd sóoldattal mossuk és 50 ml fő tenyésztő táptalajba (MCM) visszük át. Ez a tenyészet 30 °C-on nő, 100 rpm-mel körkörös rázón. Az MCM összetétele literre számolva glükóz (5%) pektin (d.e. 72,8%; 0,1%), NH4NO3 (0,75%) KH₂PO₄ (0,5%), FeSO₄ x 7H₂O (0,03%), MgSO₄ x 7H₂O (0,03%) CaCO₃ (0,03%), NaNO₃ (0,03%), pH 4,5. 24 órán át különböző időpontokban mintákat veszünk és SDS poliakril-amid gélelektroforézissel vizsgáljuk. A pelD expressziója már a tenyésztés 7. órájában maximális. A fehérje a referenciaként használt PLI-vel azonos módon vándorol.

5.6. Pektin Ház A termelés a transzformált A. niger

A15 törzzsel és az A. niger 400 törzzsel

A dializált tenyészlé szőrieteket (5.4. pont) liofilezzük, 0,2 ml desztillált vízben szuszpendáljuk, majd standard módszerekkel (Laemmli, 15. ref.) SDS-poliakrilamid gélelektroforézisnek vetjük alá (10%-os gél). Az elválasztott fehérjéket nitrocellulózra visszük át (Towbin et al., 16. ref). A blot-okat 5 órán át szobahőmérsékleten telítjük 1%-os BSA oldattal (az oldat öszszetétele: 10 mM Tris-HCl puffer pH 7,5, 0,35 N NaCl). Ezt követi egy 16 órás inkubálás szobahőmérsékleten 0,1%-os poliklonális antitesttel, amely a van Houdehoven (1975) (18) által tisztított két pektin liáz elleni antitest. Az antitest oldat térfogata 50 ml, összetétele 150 mM NaCl, 0,5% BSAm, 1% Triton x 100, 0,5% dezoxikolát és 0,1% SDS. A biotokat ezután ötször öblítjük 200 ml PBS-sel, mielőtt második antitestként 30 μΐ kecske anti-nyúl IgG-HRP (Sigma)-val inkubálnánk 50 ml-ként, majd ismét ötször mossuk PBS-sel. A blot-okat végül szubsztrátként 4-klór-1-naftollal festjük. A szubsztrátból 40 mg-ot oldunk 0,5 ml 96%-os etanolban, majd elegyítjük 100 ml 50 mM Tris-HCl pH 7,5 oldattal és 30 μΐ 30%-os hidrogénperoxiddal, majd a blot-okhoz adjuk.

5.7. A pelA-val transzformált törzsek screenelése pektin-tartalmú szilárd táptalajon való udvarképzés alapján

A pelA transzformált törzsek konídiumait kb. 40 telep/Petri csésze spórasűrűségben steril papírszűrőre (Schleicher and Schüll) inokuláljuk, ezt azután 0,01% Triton-X 100-at és szénforrásként almapektint (1%, d.e. 72,8% Obipektin) tartalmazó 1%-os agarral szilárdított minimál táptalajra tesszük. Az inkubációs periódus 72 óra 30 °C-on, ezalatt izolált telepek keletkeznek (24 mm). A papírszűrőt ezután másik steril petricsészébe visszük át, és a táptalaj-tartalmú petricsészét legalább ml desztillált vizes 0,1 v%-os ruténium-vörös oldattal festjük, 2 órán át inkubálva, majd néhányszor desztillált vízzel mosva a nem adszorbeálódott festékanyag eltávolítására, lényegében a Ried és Collmer (17. ref.) által poligalakturonátra leírt eljárást követve, a bakteriális pektát liáz enzim aktivitásának jellemzésére.

A PLA fehérjét nagy mennyiségben termelő transzformánsokat az egyes telepek udvar-átmérőjének növekedése alapján azonosítjuk, az N400 szülő törzzsel összehasonlítva.

6. példa

Az A15 A. niger pelA transzformánsból pektin liáz

A izolálása, tisztítása és jellemzése

6.1. Tenyésztési körülmények a pektin liáz A előállításához

Az 5. példában leírt A15 A. niger pelA transzformánst Petri-csészében komplett táptalajon 3 napon át 28 °C-on növesztjük, spórák előállítása céljából. A konidiumokat leszedjük ezekről a lemezekről, úgy hogy 0,005% Tween 80-at tartalmazó 5 ml steril sóoldatban szuszpendáljuk a spórákat. A szuszpenziót Griffin-rázón erősen rázatjuk 20 percig. Az 1 t% almapektint (Brown Ribbon, d.e. 72,8%, Obipektin AG, Bischofszell) tartalmazó minimál táptalajt (21. ref.) 10⁶ spóra/ml spórasűrűséggel inokuláljuk, 1 literes szilikonozott Erlenmeyer-lombikba 250 ml táptalajt helyezve. A micéliumot 40 órán át 30 °C-on növesztjük, 200 rpmmel rázatva Gallenkamp körkörös rázóberendezésben. Tenyésztés után a micéliumot szűréssel nyerjük ki Miracloth-ot Büchner-tölcsérbe téve. A tenyészet szűrletét (21. ref.) desztillált vízzel hígítjuk (21. ref.), a szűrlet pH-ját (pH 3,7) pH 6,0-ra állítjuk. IN NaOH-t használva erre a célra, majd ismét szűrjük Whatman 1 szűrőpapíron.

6.2. A PLA tisztítása

A hígított tenyészlé szűrletet (41) DEAE-Sepharose Fást Flow (Pharmacia) oszlopra visszük (10 cm x

2,6 m), amelyet elő-ekvilibráltunk 20 mM nátriumfoszfát pufferrel pH 6,0. Az oszlopot ugyanezzel a pufferrel eluáljuk, amíg a 280 nm-en mért abszorbancia értéke <0,1 OD. lesz. A pektin liáz aktivitást ezután leoldjuk az oszlopról 20 mM nátrium foszfát puffer (150 ml) és 20 mM nátrium-foszfát puffer + 1 M NaCl (150 ml) oldatokból előállított lineáris gradienssel.

A frakciók pektin liáz aktivitását a van Houdenhoven (11. old., 18. ref.) által leírt eljárással ellenőrizzük szubsztrátként Brown Ribbon pektint (d. e. 72,8%) használva. Az aktivitás a sógradiensben körülbelül 0,43 M NaCl-nél jelentkezik. Az aktív frakciókat egyesítjük, majd kétszer dializáljuk 1 liter 20 mM piperazin-HCl pufferrel szemben (pH 5,5 a minta térfogata 45,5 ml).

A következő lépésben a dializált mintát 3 egyforma részre osztjuk, amelyeket három különböző futtatásban anioncserélő kromatográfiának vetünk alá, standard Pharmacia MONO Q oszlopot használva Pharmacia FPLC rendszerben. Az oszlopot elő-ekvilibráljuk 20 mM piperazin-HCl pufferrel (pH 5,5). Az enzimminta felvitele után az oszlopot ugyanazzal a pufferrel eluáljuk 1 ml/perc áramlási sebességgel, amíg az alapvonal abszorpciót ismét el nem érjük. Ezután lineáris sógradienst alkalmazunk. Mire az oszlopra felvitt eluáló puffer eléri a 22 ml a térfogatot, a 0,6 M NaCl koncentrációt elérjük.

Az aktív frakciót (4,4 ml) összegyűjtjük, 25 ml-re hígítjuk ekvilibráló pufferrel és ugyanezt a kromatografálási lépést megismételjük.

Az aktív enzimet tartalmazó két frakciót (össztérfogat 3 ml) ezután 25 mM-os piperazin-pufferrel (pH

HU 212 832 Β

5,0) szemben dializáljuk, majd 1 ml-es részletekben MONO P oszlopra (Pharmacia) visszük, amelyet előekvilibráltunk az előző pufferrel. Az injektálások után pH gradienst állítunk elő, a TM 74 polipuffer 5%-os oldatát használva (desztillált vízben, a pH-ját 4 N sósavval 3,0-ra állítjuk). Az aktív enzim (3,2 ml) pH=3,2nél jelenik meg. A preparátumot alaposan dializáljuk 50 mM foszfát pufferrel (pH 6,0) szemben, majd -20 °C-on tároljuk. A tisztítás eredményeit a Vlla. táblázatban foglaljuk össze, és az adatokat az A. niger N400 törzsből nyert pektin liáz hasonló tisztításával kapott adatokkal (Vllb. táblázat) hasonlítjuk össze.

Vlla és Vllb táblázat

Tisztítási séma az A. niger pelA N593 törzsből nyert pektin liáz A-ra és az A. niger N400 törzsből nyert pektin liázra.

Vlla

Lépés	Térfogat ml	Összaktivitás (I. U.)	Specifikus pektin liáz aktivitás (I. UVmg fehéije)
DEAE Sepharose	45,5	39,8	4,9
MONO Q kromatográfia (2x)	2,3	19,9	18,4
MONO P kromatográfia	3,2	17,4	28,6
Vllb vad típus
DEAE Sepharose	43,0	10,1	0,9
MONO Q kromatográfia (2x)	1,1	2,5	6,3
MONO P kromatográfia	1,4	1,7	10,0

A fehérje-koncentrációt PCA fehétje-reagenssel határozzuk meg (Pierce), az előállító utasításai szerint.

A vad típus összaktivitásához hasonlítva, a pGW820 plazmiddal transzformált A. niger N592 összaktivitása tisztítás után tízszeresére nőtt, specifikus aktivitása pedig háromszorosra.

6.3. A pektin liáz A N-terminális része aminosav szekvenciájának meghatározása

500 μg, a 6.2 pont szerint tisztított pektin liázt (PLA) háromszor dializálunk 1 1 Millipore szűrővel szűrtdesztillált vízzel szemben, majd liofilizálunk. Az aminosav-szekvenciát Applied Biosystems 470A fehérje szekvenátorral határozzuk meg, amelyet on-line kapcsolunk egy 120 A PTH analizátoreal, a Hunkapiller (17. ref.) által leírt módszerrel. A meghatározás szerint az enzim N-terminális aminosav szekvenciája a következő:

VAL-GLY-VAL-SER-GLY-SER-ALA-GLU-GLYPHE-ALA-GLU-7-VAL-THR-GLY-GLY-GLY-ASPALA.

Az így meghatározott aminosav szekvencia pontosan megfelel a pelA gén nukleotid szekvencia alapján (4.2 pont) meghatározottal.

6.4. A pektin liáz A tulajdonságai

Mind az A. niger A400 törzset, mind az A15 pelA transzformánst a 6.1. példában leírt módon tenyésztjük, majd a tenyészet szűrletéből az enzimet a 6.2. pontban leírt eljárás szerint tisztítjuk. Az így kapott két enzim preparátumot a van Houdenhoven (18. ref) szerint tisztított pektin liáz II-vel hasonlítottuk össze.

Az SDS poliakrilamid gélelektroforézis (10%-os géllel) mindhárom esetben egyetlen, azonos molekulatömegű csíkot eredményez, mindig 2-5 pg fehérjét felvive a gélre.

Az izoelektromos fokuszálást standard műszerekkel végezzük (lásd pl. a Pharmacia, Isoelectric Focussing, 1982 leírást). Egy FSBE-3000 berendezést, és a megfelelő EcPS 3000/150 tápegységet használjuk. A kapott PLA izoelektromos fokuszálás alapján homogén, és alacsonyabb izoelektromos ponttal (0,2 pH egység) rendelkezik, mint a PLII, amely van Houdenhoven (18. ref.) mérései szerint 3,75. Az N400 tenyészlé szűrletből tisztított PLII izoelektromos fokuszálás alapján heterogén. A fő csík helyzete megfelel a PLA fehérjének. Két kisebb csík tolódik el enyhén a katód felé. Tehát az A15 multikópiás A. niger transzformánsban az N400-nál látható minor-enzim-formák hiányoznak.

A PLA és PLII kinetikai paramétereinek direkt összehasonlítása (az utóbbit van Houdenhoven határozta meg, 18. ref.), szubsztrátként 95%-os eszterifikált alma-pektint használva, azt mutatja, hogy a két enzim Km és Vmax értékei azonosak.

7. példa

Pektin liáz D (PLD) izolálása, tisztítása és jellemzése a Dl2 A. niger pelD transzformánsból

7.1. Tenyésztési körülmények pektin liáz D előállítására

Az 5.2. pontban előállított D12 A. niger pelD transzformánst először az 5.5. pont szerint 300 ml-es alikvotokban növesztjük. Miután PCM-ben 5 napon át 30 °C-on növesztjük, a micélium-tömeget 20 mM-os foszfát pufferbe (pH 6,0) visszük át, amely 0,1 M nátrium-kloridot tartalmaz. A micéliumot 150 ml térfogatban körkörös rázón rázatva 200 rpm-mel 2 órán át, a pektin liáz legnagyobb részét kibocsátja a táptalajba.

7.2. A PLD tisztítása

Miután a micéliumot szűréssel eltávolítottuk, az enzim-oldatot DEAE-Sepharose Fást Flow (Pharmacia) oszlopra visszük (25 cm x 1,25 cm) amelyet előekvilibráltunk 20 mM nátrium-foszfát pufferrel (pH

HU 212 832 Β

6,0), amely 0,2 M nátrium-kloridot tartalmaz. Az oszlopot ugyanezzel a pufferrel mossuk, addig míg a 280 nm-nél mért elnyelés értéke <0,1. A pektin liáz aktivitást lineáris nátrium-klorid gradienssel (0,2-től 0,7 M-ig) oldjuk le, amelyet 20 mM-os nátrium-foszfát pufferben (pH 6,0) állítunk elő, össztérfogat 800 ml. A frakciókban SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel és Western blot-tal (Towbin et al., 16. ref.) keressük a pektin liázt, az 5.6. példában leírtak szerint. A pektin liáz D-t tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd 20 mM foszfát puffer (pH 6,0) + 0,15 M nátrium-klorid oldattal szemben dializáljuk, majd anioncserélő kromatográfiának vetjük alá standard Pharmacia MONO Q oszlopon FPLC rendszerben. Az oszlopra vitel után az oszlopot ugyanezzel a pufferrel mossuk, mielőtt az oszlopot 20 mM nátrium-foszfát pufferben (pH 6,0) készített 50 ml lineáris nátrium-klorid gradienssel leoldjuk. Az aktív frakciókat összegyűjtjük, és 1 ml-es alikvotokat viszünk fel 100 ml-es Superose-12 gélpermeációs oszlopra, amelyet 0,2 M nátrium-kloridot tartalmazó 20 mM nátrium-foszfát (pH 6,0) oldattal előekvilibrálunk, majd FPLC készülékhez kapcsolunk. A GPC oszlopról kapott 1 ml-es aktív enzim frakciókat SDS poliakrilamid gélelektroforézissel vizsgáljuk, ellenőrizzük a kapott pektin liáz tisztaságát.

Vili. táblázat

Tisztítási séma a Dl2 A. niger pelD transzformánsból nyert pektin liázra

Lépés	Térfogat (ml)	Aktivitás (I. U.)	Specifikus pektin liáz aktivitás (I. U./mg fehérje)
Tenyészlé szűrlet	1950	109	0,096
DEAE-Sepharose FF	103	32,2	5,65
MONO Q és GPC	14,5	10,4	7,5

7.3. A pektin liáz D N-terminális része aminosavszekvenciájának meghatározása

500 pg, a 6.2. pont szerint tisztított pektin liáz D-t háromszor dializálunk 1 liter Millipore szűrőn szűrt desztillált vízzel szemben, majd liofilezünk. Az aminosav szekvenciát Applied Biosystems 470A fehérje szekvenátorral határozzuk meg, amelyet on-line 120A PTH analizátorhoz kapcsolunk, a Hunkapillar (19. ref.) által leírt eljárás szerint.

A meghatározás szerint az enzim N-terminális aminosav-szekvenciája a következő: VAL-GLY-VAL-SER-GLY-THR-PRO-VAL-GLY-PHEALA-SER-SER-ALA-THR-GLY-GLY-GLY-ASPALA-THR.

A meghatározott aminosav-szekvencia pontosan megegyezik a pelD gén nukleotid szekvenciájából szármáz tathatóval.

8. példa

Pektin liáz B (PLB) izolálása, tisztítása és jellemzése a B13 A. niger transzformánsból

8.1. A pektin liáz B előállításának tenyésztési körülményei

Az 5.2. példa szerint előállított B13 A. niger pelB transzformáns multikópiás karakterét vizsgáljuk az 5.3. példa szerint. Az 5.4. pontban leírt eljárás szerinti Northern biot analízis azt mutatja, hogy egy körülbelül

1,6 kb méretű pektinnel indukálható mRNS keletkezik. 1 v% citruspektint (d.e. 72,8%) és 1% búzakorpát tartalmazó minimál táptalajon való növesztést (35 óra, 30 °C) használunk az 5.4. példában leírt enzim előállítására. Az enzim előállítható még 4 v% cukorrépa-szeletet és 1% NH₄NO₃-at tartalmazó táptalajon is.

8.2. A PLB tisztítása

A tenyészlé szűrletet kétszeresre hígítjuk desztillált vízzel, pH-ját 1 N NaOH-val 6,0-ra állítjuk, majd ismét megszűrjük Whatman 1 szűrőpapírral. A hígított szűrletet (2:1) ezután DEAE-Sepharose Fást Flow (Pharmacia) oszlopra visszük (9 cm x 3,2 cm), amelyet 50 mMos nátrium-acetát pufferrel (pH 5,0) elő-ekvilibrálunk. Az eluátumban lévő pektin liáz aktivitás egy része mérhető a van Houdenhoven (18. ref., 11. old) által leírt eljárással, Brown Ribbon pektint (d.e. 72,8%) vagy erősen észterezett pektint (d.e. 94%) használva. A pektin liáz aktivitás legnagyobb részét sógradienssel lehet leoldani. Ez az aktivitás a sógradiensben jelenik meg és a PLA-val azonos eluciós tulajdonságai, valamint a 6. példában leírt SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel mért látszólagos molekulatömege alapján.

A DEAE Fást Flow oszlopról lejövő eluátumot desztillált vízzel szemben dializáljuk, majd MONOS oszlopra (Pharmacia) visszük, amelyet elő-ekvilibráltunk 20 mM-os nátrium-acetát pufferrel (pH 4,5). Az enzimet ugyanebben a pufferben készített 0-0,1 M koncentrációjú nátrium-klorid sógradienssel oldjuk le az oszlopról. Az enzim majdnem azonnal leoldódik az oszlopról. Az aktív frakciókat egyesítjük, majd körülbelül négyszeresre hígítjuk desztillált vízzel. Az enzimoldat újra kromatografálásával olyan frakciókat kapunk, amelyek az SDS-poliakrilamid gélelektroforézis alapján a tiszta PLB fehéijét tartalmazzák.

8.3. A tiszta pektin liáz B tulajdonságai

A B13 pelB transzformánsból a 8.2. pont szerint tisztított enzim tulajdonságait meghatároztuk és a pektin liáz A és D tulajdonságaival hasonlítottuk össze.

10%-os gélen végzett SDS poliakrilamid gélelektroforézissel egyetlen csíkot kapunk, amelynek látszólagos molekulatömege 39,7 kD. Ugyanilyen körülmények között a PLA és PLD látszólagos molekulatömege 49,1 kD illetve 52,3 kD.

Az izoelektromos fokuszálást a 6.4. pontban leírtak szerint végezzük. A PLB izoelektromos pontja 6,0, pH3 és 7 közötti pH gradienst használva. A mintát körülbelül a pl 5,0 pontnak megfelelő helyen vittük fel.

A tisztított PLB enzim is reagál a PLI és PLII

HU 212 832 Β enzimek ellen készített poliklonális antitestekkel, Western biot analízis alapján. A PLD, A és B ilymódon könnyen megkülönböztethető látszólagos molekulatömegük alapján.

8.4. A PLB kinetikai tulajdonságai

A 8.2. pont szerint tisztított enzimet kinetikailag jellemezzük. Az enzim katalizálja a pektin liáz reakciót és széles pH tartományon (pH 5-9,5) aktív különböző pH-jú Me Hvaine pufferben (μ = 0,5) vizsgálva (van Houdenhoven, 18. ref.). A pH optimum széles (pH

7,5-8,5). pH - 6,0-nál az aktivitás körülbelül 55%-os; pH = 9,5-nél az aktivitás még 85%-a a pH = 8,0-nál mért értéknek. Mind az erősen észterezett pektint (d.e. 94%), mind a kevésbé észterezett pektineket, mint például a Brown Ribbon alma-pektin (d.e. 72,8%; Obipektin AG Bischofszell) használhatjuk szubsztrátnak. A legmagasabb aktivitást azonban erősen észterezett pektinnel kapjuk. Az enzim nem reagál poligalakturonáttal.

A PLB-vel katalizált pektin liáz reakciót EDTA-nak a reakcióelegyhez adásával lehet gátolni (3 mM végkoncentrációban); az enzim reaktiválható feleslegben hozzáadott Ca²⁺ ionokkal. A pelB tehát Ca²⁺ függő pektin-liázt kódol. 25 °C-on szubsztrátként erősen észterezett pektint használva az enzim hozzávetőleges tum-over száma 6500, Km értéke 2,5 mM. Ezeket az értékeket van Houdenhoven eljárása szerint határozzuk meg (18. ref.) pH = 8,0-s McIIvaine puffért használva (μ = 0,5).

9. példa

Idegen gének expressziója és szekréciója pelA promoterrel

A pGW820 plazmid 3,9 kb méretű Hindin fragmensét pBR322 plazmid HindlII helyére szubklónozzuk. Az ampicillin rezisztens transzformánsok plazmid DNS-ét HindlII és Sáli restrikciós emésztéssel vizsgáljuk. Egy kiónt, amely a pelA inszertumot az óramutató járásával megegyező irányban tartalmazza, pGW822nek nevezzük. A pelA indukálható promotert használjuk idegen gének A. niger-öen való expressziójára. A pGW822 plazmidon a teljes pelA gén megtalálható. A promoter és a pelA szignál szekvencia egy 1 kb méretű BamHI-PstI fragmenten található. Az 1420-as nukleotidnál lévő PstI hasítási hely (10. ábra) egybeesik a szignál szekvencia 3’ végével, így felhasználható arra, hogy az idegen fehérjét kódoló szekvenciával leolvasási fázisban fuzionáljuk. A pelA transzkripciós jelei egy

1,3 kb méretű Sall-Hindül fragmensen találhatók.

9.1. A pelA gén szubklónozása pUC19 vektorban

A pGW822 plazmid 3,3 kb méretű BamHI-HindHI fragmentje tartalmazza a pelA gént, A fragmentet BamHI és HindHI restrikciós enzimekkel hasított pUC19 vektorba (Pharmacia) klónozzuk. A tisztított fragmenseket összeligáljuk. A ligáló elegy egy alikvot részét használjuk Ca²⁺ ionokkal kezelt, kompetens JM 109 sejtek transzformálására. Azokat a sejteket, amelyek pUC 19-be klónozva tartalmazzák a 3,3 kb méretű

BamHI-HindHI fragmenseket, ampicillin tartalmú lemezeken szelektáljuk X-Gal és IPTG jelenlétében (T. Maniatis et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold-Spring Harbor Laboratory, 1982, 52. oldal). Fehér, ampicillin rezisztens transzformánsokat izolálunk. Ezeknek a telepeknek a plazmid DNS-ét BamHI/HindlH kettős emésztéssel vizsgáljuk. Egy, a megfelelő inszertumot tartalmazó transzformánst pUC19/pelA-nak nevezünk. ApUCl 8 vektorral készült analóg konstrukció jelzése pUC18/pelA.

9.2. BDBB humán hibrid interferon expressziója pelA promoterrel

9.2.1. A pUC19/pelA-IFN AM119 (14. ábra) plazmid előállítása

A pUC19/pelA plazmidot Sáli restrikciós enzimmel emésztjük. A lineáris fragmens tapadós végét Klenow DNS polimeráz I (BRL) enzimmel töltjük fel, 0,1 mM dCTP, dGTP, dATP, dTTP jelenlétében, 60 mM TrisHCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂ összetételű oldatban, 30 percig szobahőmérsékleten folytatva a reakciót. A reakciót EDTA hozzáadásával (12,5 mM végkoncentrációban) állítjuk le. A DNS-t etanollal kicsapjuk. A lineáris DNS fragmenst PstI restrikciós enzimmel emésztjük. Fenol/kloroformos extrakció után a DNS-t etanollal kicsapjuk.

Következő összetételű oligodezoxinukleötid linkért ligálunk a Iinearizált plazmid PstI helyére.

PstI Ddel (I) 5’-TGTGATCTGCC-3’ (II) 3’-ACGTACACTAGACGGAGT -5’

A linker feltölti a PstI 3’ végét, amely egybeesik a pelA szignál-szekvenciával, és létrehozza a leolvasási fázisban lévő fúziót a BDBB interferon kódoló szekvenciájával. (I) jelenti a BDBB interferon gén 5’ nukleotid szekvenciáját a Ddel restrikciós helyig. Az (I) és (II) oligonukleotidokból 200-200 pmolt foszforilezünk és egymáshoz illesztjük őket. A PstI enzimmel hasított pUC19/pelA plazmidot és a kétszálú linker DNS 100szoros moláris feleslegét ligáljuk 60 mM Tris-HCl pH

7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM ATP, 5 mM DTT és 400 egység T4 DNS ligáz összetételű oldatban 16 órán át 15 °C-on. A DNS ligázt 10 percig 85 °C-on tartva inaktiváljuk. A linker feleslegét kicsapással távolítjuk el, 10 mM EDTA izopropanol jelenlétében.

A nagy 5 kb méretű fragmenst preparatív 0.6%-os agaróz gélből izoláljuk. A fragmens a pelA promotert és szignál szekvenciát (BamHI-[PstI]/linker) és a pelA terminátort ([SalI]tompa-HindIII) tartalmazza pUC19 vektorban.

A pJDB207/PH05-IFN AMI 19 plazmid (EP 205 404) a hibrid BDBB alfa-interferon génjét tartalmazza, az élesztő savas foszfatáz (PH05) szabályozható promoterének kontrollja alatt. A plazmid DNS-t BamHI és HindlII restrikciós enzimekkel emésztjük. Az 1,3 kb méretű BamHI-HindHI fragmenst izoláljuk, amely tartalmazza a PH05 promotert, az IFN BDBB kódoló szekvenciáját és a PH05 transzkripció terminációs szekvenciát. A fragmenst DE52 kromatográfiával

HU 212 832 Β tisztítjuk, majd etanolos kicsapással, és tovább emésztjük Taql restrikciós enzimmel. A Taql restrikciós fragmensek ragadós végét Klenow DNS polimeráz I (BRL) enzimmel töltjük fel, 0,1 mM dCTPés dGTP jelenlétében, 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂ összetételű oldatban, 30 percig szobahőmérsékleten. A reakciót EDTA hozzáadásával állítjuk le (végkoncentráció

12.5 mM). A DNS fragmenseket etanollal kicsapjuk, majd tovább emésztjük Ddel restrikciós enzimmel. A DNS fragmenseket 0,8%-os preparatív agaróz gélen választjuk el. Az 549 bp méretű DdeI-[Taq] tompavégű fragmenst elektroeluáljuk a gélből, DE52 ioncserélő kromatográfiával és etanolos kicsapással tisztítjuk. A DNS fragmenst vízben szuszpendáljuk 0,1 pmol/μΐ koncentrációban.

0,2 pmol 549 bp méretű DdeI-[TaqI] tompavégű fragmenst és 0,1 pmol 5 kb méretű fragmenst ligálunk 10 μΐ 60 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂,

3.5 mM DTT és 200 egység T4 DNS ligáz összetételű oldatban 16 órán át 15 °C-on. A ligáló elegy 1 μΐ-es alikvot részét használjuk Ca²⁺ ionokkal kezelt, kompetens HB101 sejtek transzformálására.

ampicillin rezisztens transzformáns telepből plazmid DNS-t izolálunk, majd EcoRI, PvuII, Clal és EcoRI/HindlII emésztéssel analizáljuk. Egy a várt restrikciós mintázattal rendelkező kiónt kiválasztunk. A helyes, leolvasási fázist a pelA szignál szekvencia és az érett BDBB interferon kódoló szekvenciája között DNS szekvenálással ellenőrizzük. A kiválasztott klón plazmid DNS-ének jelzése pUC19/pelA-IFN AMI 19.

A pUC18/pelA plazmiddal készült analóg konstrukció eredménye a pUC18/pelA-IFN AMI 19 plazmid.

9.2.2. Az Aspergillus niger An8 mutáns kotranszformációja pCG59D7 és pUC19/pelA-IFN AM119 plazmidokkal

Az An8 uridin auxotróf mutánst (DSM 3917, leírás a 0278355 számon közzétett EP bejelentésben) a pCG59D7 plazmiddal transzformálva uridin prototrófokat kapunk. A transzformáló plazmiddal együtt a pUC19/pelA-IFN AMI 19 nem-szelektív plazmidot és transzformáljuk, így kapunk kotranszformációval random kointegránsokat.

Az A. niger An8 konidiospóráit 4 napon át 28 °Con növesztjük komplett táptalajon, amíg teljesen be nem spórázik a tenyészet. 2xl0⁸ konidiosprórát használunk 1 g/1 argininnel és uridinnel kiegészített 200 ml minimál táptalaj inokulálására.

A tenyészetet 20 órán át 28 °C-on 180 rpm-mel növesztjük, majd a micéliumot Miracloth-on át szűrve kinyerjük, kétszer mossuk 10 ml 0,8 M KC1,50 mM CaCl₂ összetételű oldattal, majd szuszpendáljuk 20 ml 0,8 M KC1,50 mM CaCl₂, 0,5 mg/ml Novozym 234 (Novo Industries) összetételű oldatban. A szuszpenziót vízfürdős rázóberendezésben rázatjuk (30 °C, 50 rpm), addig amíg maximális protoplaszt felszabadulást detektálunk mikroszkóposán (90-120 perc). A protoplaszt szuszpenziót üveggyapoton szűrjük a micélium-törmelék eltávolítására. Aprotoplasztokat enyhe centrifugálással ülepítjük (10 perc, 2000 rpm) szobahőmérsékleten, majd kétszer mossuk 10 ml 0,8 MKC1,50 mM CaCl₂ összetételű oldattal. A protoplasztokat végül szuszpendáljuk 200-500 μΐ 0,8 MKC1, 50 mM CaCl₂ összetételű oldatban, lxlO⁸ protoplaszt/ml koncentrációt beállítva. Transzformációhoz a protoplaszt szuszpenzióból 200 μΐ alikvot-ot inkubálunk 5 pg pCG59D7 és 10 pg pUC19/pelA-IFN AM119 DNS-t és 50 pl PCT-t (10 mM Tris-HCl pH 7,5.50 mM CaCl₂,25% PEG 6000). Az inkubációs elegyet 20 percig tartjuk jégen, újabb 2 ml PCT-t adunk hozzá, és az elegyet további 5 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. 4 ml 0,8 M KC1, 50 mM CaCl₂ összetételű oldatot adunk az elegyhez, majd a végső transzformációs oldat 1 ml-es alikvotjait keverjük folyékony minimál agar táptalajjal (Minimál táptalaj + 1 g/1 arginin + 10 g/1 Bacto Agar (Difco)), amelyet 0,8 M KCl-lel stabilizálunk. A keverékeket azonnal azonos összetételű agarlemezekre öntjük és 28 °C-on tartjuk.

2-3 napi 28 °C-os inkubálás után stabil transzformánsok tűnnek fel erősen növekedő és sporuláló telepek formájában, többszáz kicsi, valószínűleg abortív transzformánsok, mint háttér mellett.

9.2.3. A BDBB hibrid interferon gén expresziója pelA promoterrel

A kotranszformációs kísérletből (9.2.2. pont) transzformánst izolálunk és elemzünk interferon expresszió szempontjából. Az interferon aktivitást Armstrong módszerével határozzuk meg [J. A. Armstrong, Appl. Mierobiol, 27, 732 (1972)], humán CCL-23 sejteket, valamint ingerlő vírusként vezikuláris sztomatitisz vírust (VSV) használva.

A transzformánsokból származó konidiospórákat egyenként tenyésztjük 50 ml előtenyésztő táptalajban (Pectin Slow Set L (Unipectin, SA, Redon, Francé) 3 g/1, NH₄C1 2 g/1, KH₂PO₄ 0,5 g/1, NaCl 0,5 g/1, MgSO₄ x2H₂O 0,5 g/1, pH 7,0). Az előtenyészetet 72 órán át 28 °C-on inkubáljuk 250 rpm-mel. Az előtenyészetből 10%-ot használunk 50 ml fő-táptalaj beoltására (Szójaliszt 20 g/1, pektin Slow Set 5 g/1). A tenyészetet 72-96 órán át 28 °C-on tenyésztjük 250 rpm-mel. Különböző időpontokban (minden 20 órában) mintát veszünk, a sejteket centrifugálással ülepítjük, majd ultrahanggal feltárjuk. A felülúszónak és a sejt extraktnak is megvizsgáljuk az interferon aktivitását a leírás szerint (idézett mű). Az interferon aktivitás legnagyobb része a táptalajba kiválasztva található.

70. példa

Az M13(+)KS/pelAAss-IFN AMI19 plazmid előállítása

Az M13(+)KS/pelAÁss-IFN AMI 19 plazmid

2,8 kb méretű expressziós kazettája tartalmazza a pelA promótert, a BDBB hibrid interferon kódoló szekvenciáját és a pelA transzkripciós terminátort a Bluescript M13(+)KS vektoron. A BDBB hibrid interferon expresszálódik és a sejtben gyűlik össze. Az M13(+) KS/pe/AAss-IFN AMI 19 plazmid a pUC18/pelA-IFN AM119 plazmidból származik (lásd 9.2.1. pont). A pelA szignál szekvencia helyspecifikus mutagenezissel kihurkolódik (lásd 15. ábra).

HU 212 832 Β

A konstrukcióról expresszálódó, szignál-szekvencia nélküli hibrid interferonról várható, hogy a címszóiban gyűlik össze.

10.1. A pelA-IFN AMI 19 kazetta szubklónozósa a

Bluescript Ml 3(+)KS vektorban

A pUC 18/peLA-IFN AM119 plazmidot (lásd 9.2.1. pont) Hindin és BamHI restrikciós enzimmel emésztjük. A 2.8. kb méretű BamHI-HindlU fragmens tartalmazza a pelA promotert, a szignál szekvenciát, az IFN BDBB kódoló szekvenciát és a pelA terminátort. A BamHI-HindlII fragmenst izoláljuk és a BamHI-HindlII restrikciós enzimekkel hasított Bluescript Ml3 (+)KS (Stratagene) vektorhoz ligáljuk. A ligáló elegy egy alikvot részét használjuk Ca²⁺ ionokkal kezelt, kompetens JM109 sejtek transzformálására. Azokat a telepeket, amelyek a 2,8 kb méretű BamHI-HindlH fragmensnek az M13(+)KS vektorba való sikeres ligálásával, transzformálással kapott sejtekből nőnek ki, ampicillin jelenlétében, valamint X-gal-t és IPTG-t tartalmazó lemezen szelektáljuk. 12 db fehér, ampicillin rezisztens telepet izolálunk. Ezekből a telepekből plazmid DNS-t izolálunk, majd BamHI/Bgin kettős emésztéssel analizáljuk. Egy, a megfelelő inszertet tartalmazó transzformánst M13(+)KS/pelA-IFN AMI 19 jelzéssel látjuk el.

70.2. Egyszálú DNS kinyerése a Bluescript

M13(+)KS plazmidot tartalmazó sejtekből

Az M13(+)KS/pelA-IFN ΑΜ119 plazmiddal kompetens E. coli CJ236 (dut-1, ung-1, thi-1, relA-1; pCJ105 (cm¹)) törzset transzformálunk (BIO-RAD Muta-Gene M13 in vitro mutagenezis kit). Ez a törzs lehetővé teszi, hogy uracil épüljön be a DNS-be. A CJ236 törzset 10 ml 100 mg/1 ampicillint tartalmazó LB táptalajon növesztjük. Amikor a tenyészet sűrűsége az OD₆₀₀ = 0,5 értéket eléri, a sejteket M13 K07 fággal felül fertőzzük (Mead et al., 29. ref.), a fertőzés multiplicitása 50. Egy óra elteltével (37 °C-on) 50 mg/1 kanamicint adunk hozzá és a tenyészetet 37 °C-os rázón 5-6 órán át inkubáljuk. Az M13(+)KS/peLA-IFN AMI 19 plazmid pe/A-IFN AMI 19 inszertjére vonatkozó nemkódoló szálat szintetizálunk, pakolódik és táptalajba kikerül. Az egyszálú DNS-t a tenyészet felülúszójából Kunker et al., (30. ref.) módszerével izoláljuk.

10.3. Helyspecifikus oligonukleotid mutagenezis az egyszálú DNS templáton

A helyspecifikus deléciós mutagenezist a nem-kódoló egyszálú pelA IFN AMI 19 templáton hajtjuk végre, hogy a pelA szignál szekvenciát kihurkoljuk (15. ábra).

A mutagén primer tartalmazza a pelA promoter szekvencia egy részét, beleértve az ATG kodont (az 13431363-as nukleotidok, 10. ábra), valamint 21 nukleotidot, amelyek az érett IFN BDBB 1-7 aminosavát kódolják.

A mutagenezishez 200 pmol mutagén prímért foszforilezünk 20 μΐ 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT és 0,5 mM ATP összetételű oldatban, 8 egység T4 polinukleotid kinázt (Boehringer) használva erre a célra. Az elegyet 60 percig inkubáljuk 37 °C-on, majd a reakciót 10 perces 65 °C-os hőkezeléssel állítjuk le.

0,2 pmol egyszálú templátot inkubálunk 10 pmol foszforilezett mutagén oligodezoxiribonukleotid primerrel és 10 pmol univerzális Ml3 szekvenáló primerrel 30 μΐ 20 mM Tris-HDl pH 7,5, 10 mM MgCL. 50 mM NaCl, 1 mM DTT összetételű oldatban 80 “’Con 5 percig. Az oldatot lassan hagyjuk szobahőmérsékletre hűlni, körülbelül 30 perc alatt. Az egymáshoz illesztett elegyhez 10 μΐ enzim -dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) oldatot adunk, amely 1 μΐ puffért [0,2 M Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M MgCL], 5 μΐ 2 mM-os dNTP elegyet, 0,5 μΐ 20 mM ATP-t, ί μΐ 0,2 MDTT-t, 0,5 μΐ T4 DNS ligázt (Biolabs, 400 U/μΙ) és 1,2 μΐ Klenow DNS polimerázt (BRL, 5 U/μΙ) tartalmaz. Az elegyet 16 órán át 15 °C-on inkubáljuk.

és 3 μΙ-t használunk a ligáló elegyből 0.2 ml kompetens, repair mínusz E. coli MV 1190 [A(/ac-proAB), thi, supE, A(srl-recA) 306::Tnl0(tet^r) (F’:tra D36, proAB, ZacI^qZAM15)] törzs transzformálására. Az MV 1190 törzset a BIO-RAD MUTA-GENE M13 in vitro mutagenezis kit kézikönyvében írják le. 12 ampicillin rezisztens telepet izolálunk. A plazmid DNS-t kinyerjük és Seal emésztéssel analizáljuk. A pelA szignál szekvencia sikeres kihurkolása eltávolít egy Seal helyet. A megfelelő plazmidokat a Bluescript vektorban lévő Seal hasítási helyen linearizáljuk. Egy plazmidot tovább vizsgálunk. A pelA promoter és a hibrid IFN BDBB kódoló szekvencia (ATG-vel együtt) közötti megfelelő kapcsolódást DNS szekvenálással igazolunk. Az egyik megfelelő konstrukció az M13(+)KS/pelA Ass-IFN AMI 19 jelzést kapja.

10.4. Az A. niger kotranszfo rotációja és a hibrid interferon expressziója

Az M13(+)KS/pelAAss-IFN AMI 19 és pCG59D7 plazmidokat használjuk az An8 A. niger mutáns kotranszformációjára, a 8.2.2. példa szerint. A transzformánsokat a 8.2.3. pont szerint tenyésztjük. Különböző időpontokban (20 óránként) mintát veszünk, a sejteket centrifugálással ülepítjük, majd ultrahanggal feltárjuk. Vizsgáljuk a sejtextraktumok interferon aktivitását (idézett mű). Az interferon aktivitás zömét intracellulárisan találjuk.

A mikroorganizmusok letétbe helyezése

A következő mikroorganizmusokat helyeztük letétbe a Budapesti Egyezmény alapján a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen-nél (Grisebachstr. 8. D3400, Göttingen):

Mikroorganizmusok	Letéti szám	Letétbe helyezés időpontja
Escherichia coli HB 101/pGW820	DSM 4388	1988. febr. 1.
Escherichia coli HB 101/pGW830	DSM 4389	1988. febr. 1.
Escherichia coli HB 101/pGW850	DSM 4390	1988. febr. 1.
Escherichia coli HB 101/pGW860	DSM 4391	1988. febr. 1.
Escherichia coli HB 101/pGW 880	DSM 4392	1988. febr. 1.

HU 212 832 Β

Irodalomjegyzék

1. Yelton, M.M., Hamer, J. E. and Timberlake, W. E. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 5/, 1470-1474.

2. Frischauf, A. M., Lehrach, H., Poustra, A. and Murray, N. (1983) J. Mól. Bioi. 770, 827-842.

3. Karn. J., Brenner, S., Bameff, L. and Cesareni, G. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5172-5176.

4. Benton, W. D. and Davis, R. W. (1977) Science 796, 180-182.

5. Maniatis, T., Fritsch, E. F. and Sambrook, J. (1982) in: Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Harbor, New York.

6. BRL. Ml3 klónozás/didezoxi szekvenálás kézikönyve.

7. Dente, L., Cesareni, G. and Cortese, R. (1983) Nucl. Acids Rés. 77, 1645-1655

8. Dente, L., Sollazzo, M., Baldari, C., G. Cesarani and R. Cortese, in: DNA Cloning vol. 1. a practical approach ed. D. M. Glover, IRL Press, Oxford 1985.

9. Russell, M., Kidd, S. and Kelley, M. R. (1986) Gene 45, 333-338.

10. Caruther, Μ. H. Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments: a laboratory manual, Verlag Chemie (1982).

11. Ballance, D. J. (1986) Yeast 2, 229-236.

12. Goosen, T., Bloemheuval, G„ Gysler, Ch„ de Bier,

D. A., van den Broek, H. W. J. and Swart, K. (1987) Current Genetics 77, 499-503.

13. Boeke, J. D., Lacroute, E and Fink, G. R. (1984) Mól. Gén. Geaet, 797, 345-346.

14. Slater, R. J. (1984) in: Methods in Molecular Biology vol. 2. Ed. J. M. Walker, The Humana Press Inc.

15. Hinnen A., Hicks J. B. & Fink G. R. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929-1933.

15. Laemmli, U. K. (1970) Natúré 227, 681-682.

16. Towbin, H., Staehelin, T. and Gordon, J. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76,4350-4354.

17. Ried, J. L. and Collmer, A. (1985) Applied and Environm. Microbiol. 50, 615-622.

18. van Houdenhoven, Ε E. A. (1975) Ph.D. Thesis Agricultural University Wageningen, The Netherlands.

19. Hunkapiller, M. W. (1985) PTH Amino Acid Analysis, User Bulletin no. 14 Applied Biosystems.

20. Zissler, J. et al. (1971) in: The Bacteriophage Lambda, Cold Spring Harbor Labs, New York, A. D. Hersley editor.

21. Norrander, 1, Kempe., T. and Messing, J. (1983) Gene 26, 101-106.

22. F. E. A. von Houdenhoven. Ph.D. Thesius Agricultural University, Wageningen in Communications Agricultural University Wageningen, The Netherlands 75-13 (1975).

23. Bimbóim H. C. & Doly J. (1979). Nucleic Acids Rés 7, 1513-1523.

24. Boel E., Hansen Μ. T, Hjort I., Hoegh I„ Fiil N. P. (1984). EMBO J. 3, 1581-1585.

25. Mount S. M. (1982). Nucleic Acids Rés. 10. 459472.

26. Ballance D. J. and Tumer G. (1985), Gene 36,

321-331.

27. Hermersdörfer H. Leuchtengerger A, Wardsack Ch and Ruttloff H (1907) Influence of culture conditions on mycelial structure and polygalacturonase synthesis of A niger. J. Basic Microbiol. 27, 309-315.

28. Henikoff, S. (1984) Geme 28, 351-359.

29. Mead et al., (1986) Protein Engeneering 1, 67.

30. Kunkel et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 485.

Claims (26)

1. Eljárás PLA pektin liáz, PLB pektin liáz, PLC pektin liáz, PLE pektin liáz, vagy PLF pektin liáz expressziós rendszereket, vagy ezek származékait tartalmazó rekombináns DNS molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy egy Aspergillus niger genomiális könyvtárat készítünk, az említett könyvtárat szűrőlapon készült másolatain végzett hibridizálással átvizsgáljuk, majd a PLA, PLB, PLC, PLE, PLF vagy PLD-ből származó próbákkal hibridizálódó, rekombináns DNS molekulát tartalmazó klónból a tárgyi kör szerint DNS molekulát izoláljuk, kívánt esetben az így előállított DNS molekulából a PL promoter és/vagy szignál szekvencia és/vagy struktúrgén és/vagy terminátor szakaszokat kihasítjuk, majd egy új kombinációban ligáljuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy

- a DNS-en a struktúrgén előtt lokalizált és maximum 2000 nukleotidot tartalmazó PLA, PLB, PLC, PLE vagy PLF promotert, vagy

- a DNS-en a promoter és az érett fehérjét kódoló szekvencia között lokalizált PLA, PLB, PLC, PLE vagy PLF szignál szekvenciát, vagy

- a PLA, PLB, PLC, PLE vagy PLF-et kódoló struktúrgént, vagy

- a DNS-en a struktúrgén stopkodonjánál kezdődő PLA, PLB, PLC, PLE vagy PLF terminátort, vagy ezeknek abármely kombinációját állítjuk elő.

3. Eljárás az 1. igénypont szerinti DNS molekulát tartalmazó vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy replikálható vektort egy restrikciós enzimmel hasítunk és az 1. igénypont szerinti DNS molekulával ligáljuk.

4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pGW820 vektort állítjuk elő.

5. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pGW830 vektort állítjuk elő.

6. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pGW850 vektort állítjuk elő.

7. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pGW88O vektort állítjuk elő.

8. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pGW860 vektort állítjuk elő.

9. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hibridizációs műveletnél próbaként a pGW820, pGW83O, pGW850, pGW880 vagy pGW860 egy restrikciós fragmensét alkalmazzuk.

HU 212 832 Β

10. Eljárás Aspergillus nigerre nézve heterológ struktúrgént tartalmazó hibrid vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 2. igénypont szerint előállított PLA, PLB, PLC, PLE vagy PLF promotert, és/vagy szignál szekvenciát és/vagy terminátort tartalmazó rekombináns DNS molekulát, és egy tárgyi kör szerinti struktúrgént tartalmazó nukleinsav molekulát egy vektorba beépítünk.

11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rekombináns DNS molekulát és valamely, a BDBB interferont kódoló struktúrgént építünk be egy vektorba.

12. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pUC19/pelA-IFN AMI 19 hibrid vektort állítjuk elő.

13. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az Μ13(+)KS/pelA-delta-ss-IFN AMI 19 hibrid vektort állítjuk elő.

14. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az M13(+)KS/pelA-IFN AMI 19 hibrid vektort állítjuk elő.

15. Eljárás az 1. igénypont szerinti eljárással előállított rekombináns DNS molekulát tartalmazó transzformáit bakteriális vagy gomba gazdaszervezet előállítására, azzal jellemezve, hogy egy gazdaszervezetet az említett rekombináns DNS molekulával transzformálunk, kívánt esetben egy szelekciós jelzőgénnel együtt, majd a transzformánsokat szelektáljuk.

16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az Escherichia coli HB 101/pGW820 (DSM

4388) transzformált gazdaszervezetet állítjuk elő.

17. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az Escherichia coli HB 101/pGW830 (DSM

4389) transzformált gazdaszervezetet állítjuk elő.

18. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az Escherichia coli HB 101/pGW850 (DSM

4390) transzformált gazdaszervezetet állítjuk elő.

19. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az Escherichia coli HB 101/pGW860 (DSM

4391) transzformált gazdaszervezetet állítjuk elő.

20. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az Escherichia coli HB 101/pGW880 (DSM

4392) transzformált gazdaszervezetet állítjuk elő.

21. Eljárás a 10. igénypont szerint előállított, hibrid vektort tartalmazó transzformált bakteriális vagy gomba gazdaszervezet előállítására, azzal jellemezve, hogy egy gazdaszervezetet az említett hibrid vektorral transzformálunk, kívánt esetben egy szelekciós jelzőgénnel együtt, majd a transzformánsokat szelektáljuk.

22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 10. igénypont szerint előállított hibrid vektorral és a pCG59D7 szelekciós jelzőgént tartalmazó plazmiddal transzformált Aspergillus niger AN8 (DSM 3917) transzformáns gazdaszervezetet állítjuk elő.

23. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pUC19/pelA-IFN AMI 19 plazmiddal és a pCG59D7, szelekciós jelzőgént tartalmazó plazmiddal transzformált Aspergillus niger An8 (DSM 3917) transzformáns gazdaszervezetet állítjuk elő.

24. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az M13(+)KS/pelAdeltass-IFN AMI 19 plazmiddal és a pCG59D7, szelekciós jelzőgént tartalmazó plazmiddal transzformált Aspergillus niger An8 (DSM 3917) transzformáns gazdaszervezetet állítjuk elő.

25. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az M13(+)KS/pelA-IFN AMI 19 plazmiddal és a pCG59D7, szelekciós jelzőgént tartalmazó plazmiddal transzformált Aspergillus niger An8 (DSM 3917) transzformáns gazdaszervezetet állítjuk elő.

26. Eljárás PLA, PLB, PLC, PLE vagy PLF polipeptid előállítására Aspergillus gazdaszervezetben, azzal jellemezve, hogy a tárgyi kör szerinti pektin háznak az 1. igénypont szerint előállított struktúrgénjét tartalmazó eszpressziós rendszerrel transzformált Aspergillus gazdaszervezetet szaporítjuk, majd a képződött polipeptidet izoláljuk.