ES2199217T3 - Promotor de levadura y su utilizacion. - Google Patents
Promotor de levadura y su utilizacion.Info
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Abstract
LA INVENCION CONCIERNE A LAS SECUENCIAS DE ADN QUE COMPRENDEN TODO O PARTE DEL PROMOTOR DEL GEN ADM4 DEL K.LACTIS O DE UN DERIVADO DE ESTE, Y QUE POSEEN UNA ACTIVIDAD DE PROMOTOR TRANSCRIPCIONAL. CONCIERNE IGUALMENTE A LA UTILIZACION DE ESTAS SECUENCIAS PARA LA EXPRESION DE GENES RECOMBINADOS.
Description
Promotor de levadura y su utilización.
La presente invención se refiere al campo de la
biología molecular. De una manera más particular, la invención se
refiere a una nueva secuencia de ADN que presenta una actividad de
promotor de transcripción, a vectores de expresión que contienen
esta secuencia, y a su utilización para la producción de proteínas
recombinantes y, por ejemplo, proteínas heterólogas. La invención se
refiere también a las células recombinantes que contienen esta
secuencia de ADN.
Los progresos realizados en el campo de la
biología molecular han permitido modificar microorganismos para
hacerles producir proteínas heterólogas. En particular, numerosos
estudios genéticos se han realizado sobre la bacteria E.
coli. Sin embargo, la aplicación industrial de estos nuevos
modos de producción está limitada todavía, en particular por los
problemas de eficacia de expresión de los genes en microorganismos
recombinados. Del mismo modo, con el fin de aumentar las
prestaciones de estos sistemas de producción, se han efectuado
investigaciones con el fin de aislar promotores fuertes, que
permitan obtener niveles elevados de expresión de proteínas
heterólogas. En el caso E.coli, se pueden citar, en
particular, los promotores de los operones triptofano y
lactosa.
De una manera más reciente, en el caso de la
levadura S. cerevisiae, se han llevado a cabo estudios sobre
promotores derivados de genes implicados en la glicólisis.
Principalmente pueden citarse los trabajos sobre el promotor del gen
de la 3-fosfoglicerato kinasa PGK (Dobson et
al., Nucleic Acid Res. 10, 1982, 2625; Hitzeman et al., Nucleic
Acid Research 1982, 7791), sobre el del gen de la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa GAPDH (Holland et al., J. Biol. Chem.
254, 1979, 9839; Musti et al., Gene 25, 1983, 133),
sobre el del gen del alcohol deshidrogenasa 1 ADH1
(Bennentzen et al., J. Biol. Chem. 257, 1982, 3018; Denis et
al., J. Biol. Chem. 25, 1983, 1165), o sobre el del gen de
la enolasa 1 ENO1 (Uemura et al., Gene 45, 1986,
65).
Recientemente se han desarrollado útiles
genéticos con el fin de servirse de la levadura
Kluyveromyces como célula huésped para la producción de
proteínas recombinantes. La puesta en evidencia de un plásmido de
tipo 2-micrón originario de K. drosophilarum
(plásmido pKD1 - EP 241 435) ha permitido establecer un sistema
huésped/vector muy eficaz para la producción de proteínas
recombinantes (EP 361 991). Sin embargo, los promotores utilizados
en este sistema no han sido nunca optimados. En particular, se
trata esencialmente de promotores heterólogos, es decir que
proceden de otros microorganismos, tal como principalmente S.
cerevisiae. Esta situación puede engendrar diferentes
inconvenientes y, principalmente, limitar la actividad del promotor
debido a la ausencia de ciertos elementos de la maquinaria para
transcripción (por ejemplo de trans-activadores).
Presentar una cierta toxicidad para la célula huésped debido a una
ausencia de regulación, o afectar a la estabilidad del vector.
En estas condiciones, la falta de promotores
homólogos fuertes en el caso de Kluyveromyces, constituye un
factor que limita en la explotación industrial este sistema de
expresión.
La solicitante ha identificado, clonado y
secuenciado ahora una región del genoma de Kluyveromyces
lactis que presenta una actividad de promotor de transcripción
(véase la figura 1). De una manera más precisa, esta región
corresponde al promotor del gen ADH4 de K. lactis
(KlADH4), que codifica la alcohol deshidrogenasa IV. El gen
KlADH4 ha sido identificado y clonado a partir de un banco genómico
de K. Lactis (Saliola et al. yeast 7: 391-400
(1991)) pero la región promotora de este gen no ha sido identificada
y sus propiedades no han sido nunca puestas en evidencia. La
región, identificada por la solicitante o derivados o fragmentos de
esta región pueden ser utilizados de manera muy ventajosa para la
producción de proteínas recombinantes en el caso de las levaduras
del género Kluyveromyces. Se entiende que esta secuencia
puede utilizarse igualmente en otros organismos huésped.
Por otra parte, el análisis de la región del
genoma de Kluyveromyces, obtenido ha permitido poner en
evidencia una actividad promotora bidireccional. Esta observación
indica que la hebra complementaria de la región representada en la
figura 1, tiene, igualmente, una actividad promotora que actúa en la
otra orientación.
Además, otra ventaja de la actividad promotora
obtenida reside en su carácter regulable. De este modo, según las
condiciones de utilización (medio, cepa), es posible controlar la
actividad del promotor y, por lo tanto, iniciar o reprimir la
expresión de un gen recombinado.
Otra ventaja de la región promotora obtenida
reside en la ausencia de represión de la glucosa. Este resultado es
sorprendente puesto que se trata del primer ejemplo de promotor
derivado de un gen ADH inducido por el etanol y no reprimido
por la glucosa. En efecto, en el caso de S. cerevisiae, el
gen ADH2 es expresado sobre diferentes fuentes de carbono no
fermentables (glicerol, etanol, lactato, piruvato), pero en contra
de lo que ocurre en el caso de KlADH4, la expresión de este
gen está reprimida de una manera muy fuerte cuando se ha añadido
glucosa al medio (Denis et al., J. Mol. Biol. 148 (1981)
355). Igualmente la expresión del gen alcA, que codifica un
alcohol deshidrogenasa I en el caso de Aspergillus nidulans
es inducido por el etanol, pero es sensible a la expresión por la
glucosa (Falembok, J. Biotechnol. 17 (1991) 11). Berg, J.
Biotechnolog 8 (1990) 2 ha tratado la subclonación de
fragmentos de promotores del Lac 4 gen de K. lactis.
Igualmente se han divulgado en este documento señales que permiten
la secreción del producto de expresión.
\newpage
Un objeto de la presente invención reside por lo
tanto en una secuencia de ADN constituida por la totalidad o una
parte de la secuencia representada en la figura 1, o de su hebra
complementaria, o de un derivado de la misma, y que tiene una
actividad de promotor de transcripción.
En el sentido de la presente invención, se
entiende por derivada, cualquier secuencia obtenida a partir de la
secuencia dada en la figura 1 mediante modificaciones estructurales
(mutaciones, deleciones, substituciones, adiciones,
fragmentaciones...) conservando una actividad de promotor. En
particular, las mutaciones pueden corresponder a uno o varios
nucleótidos, y las adiciones y/o substituciones pueden referirse a
elementos de regulación, o a regiones activadoras, tales como los
"UAS".
Cuando se realiza un derivado, su actividad de
promotor de transcripción puede ponerse en evidencia de varias
formas, y en particular colocando bajo el control de la secuencia
estudiada un gen de resistencia o un marcador de complemento.
Cualquier otra técnica conocida por el técnico en la materia puede
utilizarse evidentemente a este efecto.
Como ejemplos de derivados según la invención, se
pueden citar, de una manera más particular, un promotor que
comprende el fragmento SacI-BamHI de 500 pb
aproximadamente, cuya secuencia está representada en la figura 2, o
un fragmento SalI-HindIII de 700 pb aproximadamente
cuya secuencia está representada en la figura 3, o el fragmento
BgIII-SacI de 700 pb aproximadamente que corresponde
al fragmento comprendido entre los nucleótidos 1 y 723 de la hebra
complementaria de la secuencia representada en la figura 1.
La construcción de estos promotores está descrita
en detalle en los ejemplos.
La secuencia representada en la figura 1 se ha
obtenido a partir de un fragmento BamHI de 8 kb aproximadamente,
obtenido por sección de un banco de ADN genómico total de
Kluyveromyces lactis por medio de una sonda heteróloga que
procede del gen de estructura ADH2 de S. cerevisiae.
La solicitante ha mostrado, en efecto, que es posible clonar una
región promotora en el caso de Kluyveromyces, por
hibridación a partir de sondas heterólogas correspondientes a un
gen de S. cerevisiae. Los detalles de la clonación de la
secuencia están dados en los ejemplos. Los derivados según la
invención pueden prepararse a continuación a partir de estas
secuencias, como se ha indicado en los ejemplos.
Otro objeto de la invención se refiere a un ADN
recombinante, que comprende una secuencia de ADN tal como se ha
definido anteriormente y uno o varios genes de estructura con
excepción del gen KIADH4 de K. Lactis.
Este ADN recombinante puede contener, por
ejemplo, la secuencia promotora representada en la figura 1 o un
derivado de esta, en la que se ha insertado un punto de
restricción, que facilita la utilización de esta secuencia como
promotor "portátil".
Preferentemente, este ADN recombinante contiene
uno o varios genes de estructura. En particular, puede tratarse de
genes que codifiquen proteínas de interés farmacéutico o
agroalimentario. A título de ejemplo, se pueden citar los enzimas
(tales como principalmente la superóxido dismutasa, la catalasa, las
amilasas, las lipasas, las amidasas, la quimosina etc.), los
derivados de la sangre (tales como el
suero-albúmina, la alfa- o la
beta-globina, el factor VIII, el factor IX, el
factor de Willebrand, la fibronectina, la
alfa-1-antitripsina, etc.), la
insulina y sus variantes, las linfoquinas (tales como las
interleukinas, los interferones, los factores de estimulación de las
colonias [G-CSF, GM-CSF,
M-CSF...], el TNF, el TRF, etc.), los factores de
crecimiento (tales como la hormona de crecimiento, la
eritropoyetina, el FGF, el EGF, el PDGF, el TGF, et.), las
apolipoproteínas, polipéptidos antigénicos para la realización de
vacunas (hepatitis, citomegalovirus, Eppstein-Barr,
herpes, etc.), o incluso fusiones de polipéptidos tales como
principalmente, fusiones que comprenden una parte actividad
fusionada con una parte estabilizante (por ejemplo fusiones entre
la albúmina o fragmentos de albúmina y el receptor o una parte de
un receptor de virus [CD4, etc.]).
Además, de una manera más preferente, el ADN
recombinante contiene, igualmente, señales que permiten la
secreción del producto de expresión del o de los citados genes de
estructura. Estas señales pueden corresponder a las señales
naturales de secreción de la proteína considerada, pero igualmente
puede ser de un origen diferente. En particular pueden utilizarse
señales de secreción derivadas de genes de levadura, tales como las
de los genes de la toxina killer(Stark et Boyd, EMBO J.
5 (1986) 1995) o de la feromona alfa (Kurjan et Herskowitz,
Cell 30 (1982) 933; Brake et al., Yeast 4 (1988)
S436).
En un modo de realización particular de la
invención, el ADN recombinante forma parte de un plásmido de
expresión, que puede ser de replicación autónoma o integrante.
En particular, pueden obtenerse vectores de
replicación autónoma si se utilizan secuencias de replicación
autónomas en el caso del huésped elegido. Principalmente, en el
caso de la levadura, puede tratarse de orígenes de replicación
derivados del plásmido (pKD1, 2\mu, etc.), o bien de secuencias
cromosómicas (ARS).
Los vectores de integración pueden obtenerse
principalmente utilizando secuencias homólogas a ciertas regiones
del genoma del huésped, que permitan, por recombinación homóloga,
la integración del vector.
Otro objeto de la invención se refiere a las
células recombinadas que contienen una secuencia de ADN tal como se
ha definido anteriormente.
Ventajosamente, las células se eligen entre las
levaduras, y de una manera más preferente todavía, entre las
levaduras del género Kluyveromyces. Es evidente sin embargo
que la invención cubre todas las células recombinantes en las
cuales sean activas las regiones promotoras de la invención.
Estas células pueden obtenerse por cualquier
método que permita introducir un ADN extraño en una célula. Puede
tratarse, principalmente, de transformación, electroporación, o de
cualquier otra técnica conocida por el técnico en la materia.
Otro objeto de la invención se refiere a la
utilización de una secuencia, tal como se ha definido
anteriormente, para la expresión de genes recombinados.
Como se ha ilustrado en los ejemplos, las
secuencias de ADN según la invención permiten, en efecto, una
producción a niveles elevados de proteínas recombinantes.
Por otra parte, la actividad promotora
bidireccional de las secuencias de la invención permite una
utilización particularmente ventajosa. Sin embargo, es posible
utilizar estas secuencias para la expresión simultánea de varios
genes recombinados en las dos orientaciones opuestas.
Ventajosamente, la invención se refiere a la
utilización de una secuencia tal como se ha definido anteriormente
para la expresión simultánea de dos genes recombinados insertados a
uno y otro lado del promotor, en las dos orientaciones
opuestas.
Ventajosamente, las secuencias de la invención
pueden utilizarse para la expresión de genes que codifiquen
proteínas de interés farmacéutico o agroalimentario. A título de
ejemplo, se pueden citar las proteínas enumeradas
anteriormente.
La presente invención permite, igualmente, la
realización de un procedimiento para la producción de proteínas
recombinantes, según el cual se cultiva una célula recombinada, tal
como se ha definido anteriormente, y se recupera la proteína
producida. A título de ejemplo de proteína, se pueden citar las
proteínas enumeradas anteriormente.
De manera preferente, el procedimiento de la
invención es aplicable a la producción de
suero-albúmina humana, o de sus variantes
moleculares. Se entienden por variantes moleculares de la albúmina,
las variantes naturales que resultan del polimorfismo de la
albúmina, las formas truncadas, o cualquier proteína híbrida a base
de albúmina.
Por otra parte, un aspecto particularmente
ventajoso de la invención reside en la posibilidad de regular la
actividad de los promotores. La solicitante ha mostrado, en efecto,
que la actividad promotora estaba inducida, específicamente, por el
etanol. A este efecto, el etanol inductor puede ser añadido bien
directamente al medio de cultivo, o bien puede producirse
intracelularmente por la cepa huésped, según sus capacidades de
fermentación, a partir de la fuente de carbono introducida en el
medio. La regulación puede obtenerse por lo tanto en varias
condiciones:
- o bien cultivándose la célula recombinada en un
medio que contenga una fuente carbonada diferente del etanol y no
transformable en etanol por la célula. En este caso, la actividad
del promotor es inducida por la adición del etanol en el medio. Por
ejemplo, en el caso de K. lactis 2359/152 y de K.
lactis MW98-8C, el promotor KlADH4 es
inactivo cuando las células sean cultivadas sobre medio que
contenga glicerol, pero es inducida tras adición de etanol.
- o bien cultivando, en un medio que contenga una
fuente carbonada fermentable (por ejemplo glucosa), una célula
recombinada que presente una deficiencia al nivel de su metabolismo
de fermentación, y de este modo, incapaz de producir etanol a
partir de esta fuente carbonada. En este caso, la actividad del
promotor es inducida bien por adición de etanol al medio, o bien por
adición de otra fuente fermentable que intervenga en una etapa
aguas debajo de la deficiente, y capaz de ser metabolizada en
etanol a despecho de dicha deficiencia. A título de ejemplo, se
puede utilizar una fuente que presente una mutación rag2, y
que, de este modo, no tenga la actividad fosfoglucosa isomerasa. En
este caso, el promotor KlADH4 es inactivo sobre el medio
glucosa, y la actividad del promotor puede inducirse por adición de
etanol o de fluctosa.
Otras ventajas de la presente invención se
pondrán de manifiesto por la lectura de los ejemplos que siguen,
que deben ser considerados como ilustrativos y no limitativos.
Secuencia nucleotídica del fragmento de 1,2 kb
que corresponde al promotor KlADH4 de K. lactis.
Secuencia nucleotídica del fragmento
SacI-BamHI de 0,5 kb aproximadamente, que
corresponde al promotor KlADH4 truncado en el vector
pP4-15Kan.
Secuencia nucleotídica del fragmento
SalI-HindIII de 0,7 kb aproximadamente, que
corresponde al promotor KlADH4 truncado en los vectores
pYG129 y pYG130.
Representación esquemática del plásmido
P6-4-98 y construcción de los
plásmidos P6-2200-2 y
pP4-33.
Representación esquemática del plásmido
pSK-Kan401 y construcción de los plásmidos
pP4-Kan y pP4R-Kan.
Construcción y representación de los plásmidos
pP4-GUS y pSK-GUS.
Representación esquemática del plásmido pKan707 y
construcción de los derivados del fago M13, pYG64 y pYG65.
Construcción y representación de los plásmidos
pYG69 y pYG70.
Construcción y representación del plásmido
pYG72.
Representación esquemática del plásmido pYG404 y
construcción del plásmido pYG404\DeltaH.
Construcción y representación del plásmido
pYG128.
Construcción y representación de los plásmidos
pYG131 y pYG132.
Construcción y representación de los plásmidos
pP4-15Kan y pP4-60Kan.
Construcción y representación de los plásmidos
pYG129 y pYG130.
Gel de poliacrilamida nativo (5%) coloreado según
el protocolo descrito en el ejemplo 7.1.2 y que demuestra la
expresión de la actividad \beta-glucoronidasa en
la cepa MW98-8C transformada con el plásmido
pP4-GUS (líneas 1 y 6 que corresponden a 6 clones
independientes). Los resultados obtenidos a partir de la cepa
MW98-8C transformada con el plásmido
pSK-GUS (testigo) están dados en las líneas C.
Gel de poliacrilamida-SDS al 8,5%
tras coloración con azul de Coomássie que demuestra la secreción de
la suero-albúmina humana a partir de la cepa
MW98-8C transformada con el vector pYG132. Pistas
a-c, albúmina extraída del plasma humano
(Sigma)utilizada como patrón y depositada a concentraciones
crecientes (0,5, 1,0 y 1,5 \mug por pista). Las otras pistas
corresponden a 25 \mul de sobrenadante de cultivo obtenidos a
partir de los medios descritos en los ejemplos 7.2.1. Glu, glucosa;
Glu/EtOH, glucosa/etanol; Gly, glicerol; Gly/EtOH,
glicerol/etanol.
\newpage
Gel de poliacrilamida-SDS al 8,5%
tras coloración con azul de Coomássie que demuestra la secreción de
la suero-albúmina humana a partir de la cepa CBS
293.91 transformada con el vector pYG132. Pistas
a-c, albúmina extraída del plasma humano (Sigma)
utilizada como patrón y depositada a concentraciones crecientes
(0,5, 1,0 y 1,5 \mug por pista). Las otras pistas corresponden a
25 \mul de sobrenadante de cultivo obtenidos a partir de los
medios descritos en el ejemplo 7.2.1. Glu, glucosa; Glu/EtOH,
glucosa/etanol; Gly, glicerol; Gly/EtOH, glicerol/etanol.
Gel de poliacrilamida-SDS al 8,5%
tras coloración con el azul de Coomássie que demuestra la secreción
de la suero-albúmina humana a partir de la cepa CBS
293,91 transformada con el vector pYG130. Pistas
a-b, albúmina extraída del plasma humano (Sigma)
utilizada como patrón y depositada a concentraciones crecientes
(0,5 y 1,0 \mug por pista). Las otras pistas corresponden a 25
\mul de sobrenadante de cultivo obtenidos a partir de los medios
descritos en el ejemplo 7.2.1. Glu, glucosa; Glu/EtOH,
glucosa/etanol.
Tabla
1
Resumen de las diferentes construcciones
efectuadas a partir del promotor KlADH4 entero (fragmento de
1,2 kb, o bien en forma de un fragmento BglII-BamHI
[pP4-Kan, pP4R-Kan, y
pP4-GUS], o bien en forma de un fragmento
SalI-HindIII [pYG131 y pYG132]).
Tabla
2
Resumen de las diferentes construcciones
efectuadas a partir del promotor KlADH4 truncado (fragmento
SacI-BamHI de 0,5 kb, cuya secuencia nucleotídica
está dada en la figura 2 [pP4-15Kan]; fragmento
BgIII-SacI de 0,7 kb que corresponde a las
posiciones 1-723 de la secuencia nucleotídica dada
en la figura 1 [pP4-60Kan]; fragmento
SalI-HindIII de 0,67 kb cuya secuencia nucleotídica
está dada en la figura 3 [pYG129 et pYG130]).
Tabla
3
Estudio de la regulación de la expresión del gen
KlADH4. La presencia o la ausencia de la actividad
enzimática ADH IV, puesta en evidencia según el protocolo descrito
en el ejemplo 5, se ha indicado por los símbolos + o -.
Los métodos clásicos de biología molecular, tales
como el centrifugado de ADN plasmídico en gradiente de cloruro de
cesio - bromuro de etidio, la digestión con los enzimas de
restricción, la electrofóresis sobre gel, la electroelución de los
fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa, la transformación en
E.coli, etc., están descritos en la literatura (Maniatis et
al., "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986; Ausubel et al.,
(eds.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley
& Sons, New York 1987).
La mutagénesis dirigida in vitro por
oligodeoxinucleótidos se ha efectuado según el método desarrollado
por Taylor et al. (Nucleic Acids Res. 13 (1985)
8749-8764), utilizándose el estuche distribuido por
Amersham. El secuenciado de nucleótidos se ha realizado según la
técnica de los dideoxi descrita por Sanger et al. (Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467). La
amplificación enzimática de fragmentos de ADN específicos se ha
efectuado por reacción de PCR
("Polymerase-catalyzed Chain Reaction") en las
condiciones descritas por Mullis et Faloona (Meth. Enzym.,
155 (1987) 335-350) y Saiki et al (Science
230 (1985) 1350-1354), utilizándose un
"DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) siguiéndose las
recomendaciones del fabricante.
Los plásmidos siguientes han servido para las
diferentes etapas de clonación, o durante la construcción de
vectores de expresión.
- Vector de substitución
Lambda-L47: Loenen et Brammar, Gene 10 (1980)
249-259;
- Plásmido pBR322 (Pharmacia, Uppsala,
Suecia);
- Plásmido pTZ19 (Pharmacia, Uppsala,
Suecia);
- Plásmido pSK-Kan401: Chen et
Fukuhara, Gene 69 (1988) 181-192;
- Plásmido pBI221 (Clontech Laboratories, Palo
Alto, CA, USA);
- Plásmido pBC SK +/- (Stratagene, La Jolla, CA,
USA);
- Plásmido pYG404 (EP 361 991);
- Plásmido pKan707 (EP 361 991);
- Bacteriófago M13mp7: Messing et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 3652.
Se han utilizado las cepas siguientes para la
clonación, la construcción y la utilización de los promotores de la
invención.
- K. lactis CBS2359/152 (nº CBS
289.91)
- K. lactis MW98-8C (nº
CBS 579.88)
- K. lactis CBS 293.91
La secuencia representada en la figura 1, se ha
obtenido por selección de un banco de ADN genómico total de
Kluyveromyces lactis CBS2359/152 por medio de una sonda
heteróloga procedente del gen ADH2 de S. cerevisiae.
De una manera más precisa, el banco ha sido obtenido por clonación
en el punto BamHI del vector de substitución
Lambda-L47 del producto de una digestión parcial con
el enzima Sau3A del ADN de K. lactis CBS2359/152. La sonda
utilizada para la hibridación es un fragmento
EcoRV-BamHI de 980 bp, que comprende la región que
codifica el gen de estructura ADH2 de S. cerevisiae, a
excepción de los 70 primeros pb (sonda A). Este fragmento se
obtiene por digestión enzimática a partir de un plásmido denominado
pBR322.ADR2.BSa (Williamson et al., Cell 23 (1981)
605-614; Russell et al., J. Biol. Chem. 258
(1983) 2674-2682).
De este modo se ha aislado un fragmento de 8 kb y
se ha subclonado en el punto BamHI del plásmido pBR322 para generar
el plásmido p6-4-98 (figura 4). El
inserto BamHI portado por este plásmido se ha cartografiado a
continuación por medio de enzimas de restricción, y se ha
localizado la región promotora del gen KlADH4 sobre este fragmento
mediante hibridaciones diferenciales utilizándose la sonda A así
como una segunda sonda correspondiente al fragmento
BamHI-EcoRV de 1100 pb aproximadamente del plásmido
pBR322.ADR2.BSa (sonda B).
En una segunda etapa, se ha digerido el plásmido
p6-4-98 por el enzima HindIII y se
ha aislado un fragmento de 2,2 kb. Este fragmento se ha purificado a
continuación mediante las técnicas normalizadas y se ha subclonado
en el p unto HindIII del plásmido pTZ19 para generar el plásmido
p6-2200-2 (figura 4). El análisis
del fragmento subclonado revela que contiene los 14 primeros codones
del gen KlADH4 y la región situada aguas arriba de este,
comprende los elementos de regulación de la expresión.
La parte comprendida entre el punto BgIII y el
codón de inicio de la traducción ATG (fragmento de 1,2 kb
aproximadamente) se ha secuenciado utilizándose el método de
transmisión de cadena (Sanger et al., Proc. Nat. Acad. Sci.
74 (1977) 5 463). La secuencia de este fragmento está
representada en la figura 1.
Se ha preparado un promotor portátil por
inserción sobre el fragmento HindIII de 2,2 kb presente sobre el
plásmido p6-2200-2 de un punto de
restricción BamHI en posición 16 con relación al codón ATG del gen
KlADH4.
La inserción de este punto permite generar un
fragmento BgIII-BamHI de 1,2 kb, que comprende,
exclusivamente, la región promotora KlADH4. Esta permite,
igualmente, introducir aguas abajo del promotor, obtenido de este
modo, cualquier gen que se desee expresar.
El punto BamHI ha sido introducido en la posición
-16 con relación al punto de inicio de la traducción (ATG) del gen
KlADH4 por mutagénesis dirigida utilizándose la técnica de
doble iniciador (Sambrook, Fritsch, Maniatis, Molecular Cloning
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab Press, 1989). La secuencia
de los oligodesoxinucleótidos sintéticos, utilizados para esta
mutagénesis está dada más adelante. El punto BamHI generado está
subrayado, el ATG está indicado en letra cursiva y los asteriscos
designan las bases modificadas con relación a la secuencia inicial.
SI = secuencia inicial; SM = secuencia modificada.
El plásmido, obtenido de este modo, se denomina
pP4-33 (figura 4).
La tabla 1 muestra las construcciones descritas
en este ejemplo.
Se ha digerido el ADN del plásmido
pP4-33 (véase el ejemplo 2) con BgIII y BamHI para
generar el fragmento de 1,2 kb que contiene el promotor
KlADH4. Este fragmento ha sido introducido a continuación en
el punto BamHI del plásmido pSK- Kan401, aguas arriba del gen
indicador aph, que codifica la
aminoglicósido-3'-fosfotransferasa
(I) (Oka et al., J. Mol. Biol. 147 (1981) 217) desprovisto
de su propio promotor, que, cuando es expresado, confiere a la
levadura la resistencia a la geneticina (G418) (Jimenez et Davies,
ref). Tras amplificación en el caso de E.coli, se han
obtenido 2 plásmidos recombinantes, que se diferencian al nivel de
la orientación del inserto. En el plásmido pP4-Kan,
el fragmento de 1,2 kb está en la misma orientación con relación al
gen aph que la observada en el contexto ADH4, mientras
que se encuentra en la orientación opuesta en el plásmido
pP4R-Kan (véase la figura 5).
El plásmido pP4R-Kan ha sido
utilizado para construir un vector de expresión en el que 2 genes
heterólogos privados de sus promotores respectivos han sido
colocados a uno y otro lado del promotor KlADH4 de 1,2 kb.
Los genes heterólogos utilizados son, más específicamente:
- el gen aph, cuya expresión confiere la
resistencia al G418, y
- el gen de la
\beta-glucoronidasa de E.coli (gen
GUS), cuya expresión puede ponerse en evidencia por reacción
enzimática.
Para realizar esta construcción, el plásmido
pP4R-Kan ha sido digerido por EcoRI y BamHI. Por
otra parte, a partir del plásmido pBI221, el gen de la
\beta-glucoronidasa de E.coli ha sido
aislado en forma de un fragmento BamHI-EcoRI de 2,1
kg. Este último ha sido introducido a continuación por ligación en
el plásmido pP4R-Kan linealizado como se ha indicado
para generar el plásmido pP4-GUS (véase la figura
6). Paralelamente se ha preparado un plásmido control por inserción
del fragmento BamHI-EcoRI de 2,1 kb procedente del
plásmido pBI221, que porta el gen GUS en el plásmido
pSK-Kan401 previamente digerido con BamHI y EcoRI.
El plásmido, obtenido de este modo, se ha denominado
pSK-GUS (figura 6). Esta construcción difiere del
plásmido pP4-GUS únicamente por la ausencia del
promotor KlADH4 de 1,2 kb.
Para construir diferentes vectores de expresión
de la suero-albúmina humana, se ha preparado un
derivado del plásmido pYG404 (Cf EP 361 991), que contiene:
- un replicón de levadura (secuencia casi entera
del plásmido natural pKD1).
- el gen que codifica la
prepro-albúmina humana (HSA) bajo el control del
promotor del gen LAC4 de K. lactis y seguido del
terminador del gen PGK de S. cerevisiae; el gen de
estructura que codifica la HSA va precedido por una secuencia de 25
nucleótidos, que corresponden a la región directamente aguas arriba
del gen PGK de S. cerevisiae.
- El gen aph que confiere la resistencia a
la geneticina (G418) a la levadura, y
- un replicón y un marcador de selección (gen
bla que confiere la resistencia a la ampicilina) para
E.coli.
Este plásmido, nominado pYG404\DeltaH, difiere
del pYG404 únicamente en la destrucción del punto HindIII,
localizado en el gen aph, por mutagénesis dirigida. Esta
modificación ha permitido a continuación, substituir el promotor
LAC4, presente en el plásmido pYG404\DeltaH en forma de un
fragmento SalI-HindIII por diferentes variantes del
promotor KlADH4 igualmente construidos como promotores
portátiles en forma de fragmentos SalI-HindIII.
Para efectuar la deleción del punto HindIII en el
vector de clonación pYG404, se han efectuado diferentes etapas de
subclonación, que dan lugar a una construcción intermedia: pYG72
(figura 9). Este vector corresponde al plásmido pKan707 (EP 361
991) en el que se ha eliminado el fragmento SacI, que contiene el
gen URA3 así como el punto único HindIII presente en el gen
aph. Para efectuar la mutagénesis dirigida sobre este sitio,
ha sido subclonado el fragmento PstI de 1,3 kb, que porta el gen
aph, a partir del plásmido pKan707 en el bacteriófago M13mp7
para dar el vector pYG64 (figura 7). El sitio HindIII ha sido
destruido por mutagénesis dirigida (véanse las técnicas generales
de clonación) utilizándose el oligodesoxinu-cleótido
siguiente: 5'-GAA ATG CAT AAG CTC TTG CCA
TTC TCA CCG-3', permite la substitución del triplete
CTT, que codifica la leucina 185, por el triplete CTC. Este cambio
no modifica la secuencia proteica resultante. El plásmido obtenido
ha sido denominado pYG65 (figura 7). Para construir el plásmido
pYG72, se ha aislado la parte que contiene el replicón bacteriano
del vector pKan707 por digestión con el enzima EcoRI y
recircularización con la T4 DNA ligasa, que genera el plásmido
intermedio pYG69. El fragmento PstI presente en el mismo, que
contiene el gen aph, se ha reemplazado a continuación por el
fragmento equivalente mutado procedente del plásmido pYG65. Esta
construcción ha sido denominada pYG70 (figura 8). La secuencia de
pKD12 de 4,7 kb comprendida entre los sitios EcoRI y SacI ha sido
introducida a continuación en este vector para obtener pYG72
(figura 9).
El vector pYG404\DeltaH ha sido obtenido
insertando la caja de expresión procedente del plásmido pYG404 (EP
361 991) en forma de un fragmento SalI-SacI en los
sitios correspondientes de pYG72 (figura 10).
El promotor KlADH4, portado sobre el
fragmento BgIII-BamHI, que procede del plásmido
pP4-33 (ejemplo 2) ha sido modificado de la manera
siguiente, para adaptarlo a la utilización en vectores de expresión
derivados del plásmido pYG404\DeltaH:
Tras digestión del plásmido
pP4-33 por los enzimas BglII y BamHI seguido de un
tratamiento con la nucleasa "Mung Bean" para que sean francas
las extremidades, el fragmento de 1,2 kb, que porta el promotor
KlADH4 ha sido aislado a partir de un gel de agarosa y se ha
subclonado en el vector pBC SK + (Stratagene, La Jolla, CA, USA),
previamente linealizado con el enzima ClaI y tratado con la
nucleasa "Mung Bean" así como con la fosfatasa alcalina de vaca
(CIP). El plásmido obtenido de esta manera (pYG128, figura 11)
permite el aislamiento del promotor KlADH4 en forma de un
fragmento SalI-HindIII de 1,2 kb.
La digestión del vector de expresión
pYG404\DeltaH (ejemplo 3.3.1) por los enzimas SalI y HindIII
permite la substitución del promotor LAC4 por el promotor
KlADH4 anteriormente descrito.
Para efectuar esta clonación, se han aislado el
fragmento SalI-HindIII de 8,7 kb, que contiene la
parte pKD1 y los marcadores de selección así como el fragmento
HindIII-HindIII de 1,9 kb que porta el gen que
codifica la prepro-HSA a partir del vector
pYG404\DeltaH y se han vuelto a ligar en presencia del fragmento
SalI-HindIII de 1,2 kb procedente del plásmido
pYG128 y que porta el promotor KlADH4. De estas manera se
han obtenido dos plásmidos:
- pYG131 (figura 12), que corresponde a un vector
de clonación que permite la inserción en el sitio HindIII único de
cualquier gen que se quiera expresar bajo el control del promotor
KlADH4, y
- pYG132 (figura 12), que es idéntico al plásmido
pYG131 salvo en que contiene el gen de la
prepro-HSA introducido en el sitio HindIII.
La tabla 2 muestra las construcciones descritas
en este ejemplo.
Se han utilizado los plásmidos
pP4-Kan y pP4R-Kan (ejemplo 3.1).
Para preparar construcciones que contienen formas reducidas del
promotor. Para ello se han digerido los plásmidos
pP4-Kan y pP4R-Kan por el enzima
SacI y a continuación se han vuelto a ligar, según el esquema
descrito en la figura 13.
Esta manipulación ha permitido:
- escindir del plásmido pP4-Kan
el fragmento SacI de 0,7 kb aproximadamente, situado en el lado
opuesto al del gen aph. En el plásmido obtenido
(pP4-15Kan) el gen aph se encuentra por lo
tanto bajo el control de un promotor reducido, que corresponde al
fragmento SacI-BamHI de 0,5 kb, cuya secuencia está
dada en la figura 2, en la misma orientación que la que se ha
observado en el contexto ADH4.
- escindir del plásmido pP4R-Kan
el fragmento SacI de 0,5 kb aproximadamente, situado en el lado
opuesto al del gen aph. En el plásmido obtenido
(pP4-60Kan) el gen aph se encuentra, por lo
tanto, bajo el control de un promotor reducido, que corresponde a
la hebra complementaria del fragmento BglII-SacI de
0,7 kb (nucleótidos 1 hasta 723) que forma parte de la secuencia
dada en la figura 1.
Se ha obtenido un derivado truncado del fragmento
BglII-BamHI de 1,2 kb, que procede del plásmido
pP4-33 y que porta el promotor KlADH4 entero
mediante amplificación enzimática (PCR) de una parte de este
promotor, situada entre el sitio BsmAI en posición 541 sobre la
secuencia dada en la figura 1, y el sitio BamHI en la posición -16
con relación al ATG del gen ADH4. Los oligodesoxinucleótidos
utilizados para la reacción PCR fueron:
-
5'-GGGGTCGACGCGAGACAACACTATTGTGAG-3',
introduciendo un sitio SalI (secuencia subrayada)
justo hasta aguas arriba del sitio BsmAI, y
-
5'-GGGAAGCTTTGTGTTGTTGATGGGGGAG-3',
que reemplaza al sitio BamHI presente en la
construcción pP4-33 por un sitio HindIII (secuencia
subrayada).
Se ha digerido el fragmento de 672 bp obtenido
por PCR por los enzimas SalI y HindIII, se ha purificado a partir
de un gel de agarosa y se ha ligado con el fragmento
SalI-HindIII de 8,7 kb, que contiene la parte pKD1 y
los marcadores de selección procedentes del vector pYG404\DeltaH.
Esta ligación se ha efectuado en presencia del fragmento
HindIII-HindIII de 1,9 kg, que porta el gen que
codifica la prepro-HSA aislado a partir del mismo
vector. De esta manera se han obtenido dos plásmidos:
- pYG129 (figura 14), que corresponde a un vector
de clonación que permite la inserción en el sitio HindIII único de
cualquier gen que se quiera expresar bajo control del promotor
truncado KlADH4, y
- pYG130 (figura 14), que es idéntico al plásmido
pYG129 salvo en que contiene el gen de la
prepro-HSA introducido en el sitio HindIII.
La secuencia nucleotídica del fragmento
SalI-HindIII de 0,7 kb aproximadamente, que
corresponde al promotor KlADH4 truncado utilizado en estas
dos construcciones, está dada en la figura 3.
Este estudio se ha realizado con las cepas K.
lactis MW98-8C y K. lactis 2359/152.
La cepa MW98-8C presenta un
fenotipo Rag2^{-} debido a una mutación (rag2) al nivel
del gen que codifica la fosfoglucosa isomerasa (PGI), que le
hace incapaz de producir etanol sobre un medio glucosa. La cepa
2359/152 es Rag2^{+}.
La actividad del promotor ADH4 ha sido
determinada en diferentes condiciones de cultivo, por puesta en
evidencia de la actividad ADHIV utilizándose la técnica descrita
por Lutstorf y Megnet (Archiv. Biochem. Biophys. 126 (1968)
933). Los resultados obtenidos están indicados en la tabla 3.
Estos resultados indican que la actividad del
promotor KlADH4 está específicamente inducida por el etanol
y no deprimida en ausencia de glucosa. En efecto, hemos encontrado,
de una manera sorprendente que, en contra de lo que ocurre con los
promotores de otras alcohol deshidrogenasas tal como ADH2 de
S. cerevisiae o alcA de A. nidulans, el
promotor KlADH4 no está reprimido por la glucosa (tabla 3).
El etanol inductor puede añadirse bien al medio de cultivo o bien
puede ser producido intracelularmente por fermentación de una cepa
carbonada tal como la glucosa o la fructosa (tabla 3).
Igualmente hemos mostrado que una cepa mutada en
un gen implicado en la glicólisis y, por esta razón, incapaz de
producir etanol a partir de glucosa, puede utilizarse
ventajosamente como huésped para los vectores de expresión de la
invención. En efecto, el promotor KlADH4 es inactivo en un
medio que contenga glucosa como única fuente de carbono en cepas
tales como MW98-8C (rag2), cuyo gen, que
codifica la fosfoglucosa isomerasa, es defectivo. En esta cepa, la
activación del promotor KlADH4 se efectúa por la adición de
etanol al medio de cultivo.
Por otra parte, hemos encontrado, de manera
sorprendente, que en las cepas CBS2359/152 y
MW98-8C el promotor KlADH4 es inactivo en un
medio que contenga glicerol como única fuente de carbono. Este
resultado difiere de aquello que se conoce para el promotor del gen
del alcohol deshidrogenasa II de S. cerevisiae
(ADH2), que es activo sobre diferentes fuentes de carbono no
fermentables, incluyendo el glicerol.
Estos resultados muestran, por lo tanto, que
algunas cepas, tales como CBS2359/152, incluso con un fenotipo
Rag^{+}, pueden permitir la obtención de una expresión regulada
del promotor KlADH4: las células cultivadas en presencia de
glicerol como única fuente de carbono no producen la proteína cuyo
gen está colocado bajo el control del promotor KlADH4
(promotor no inducido) mientras que pueden ser inducidas para la
producción de esta proteína añadiendo etanol al medio de
cultivo.
\newpage
Pueden utilizarse diferentes técnicas que
permiten la introducción de ADN en la levadura.
Ventajosamente, las diferentes cepas de
Kluyveromyces utilizadas, han sido transformadas tratando
las células enteras en presencia de acetato de litio y de
polietilenglicol, según la técnica descrita por Ito et al. (J.
Bacteriol, 153 (1983) 163-168). Igualmente
se ha utilizado la técnica de transformación descrita por Durrens
et al. (Curr. Genet. 18 (1990) 7), que utiliza el
etilenglicol y el dimetilsulfóxido. También es posible transformar
las levaduras por electroporación, por ejemplo según el método
descrito por Karube et al. (FEBS Letters 182 (1985) 90).
Se ha descrito con detalle un protocolo
alternativo en la solicitud EP 361 991.
Se han utilizado los plásmidos de expresión
pP4-Kan y pP4R-Kan (ejemplo 3.1)
así como el plásmido de clonación pSK-Kan401
(testigo) para transformar la levadura K. lactis
MW98-8C. Las células transformadas por
pP4-Kan et pP4R-Kan tienen la
resistencia al G418 en un medio YPD (extracto de levadura 10 g/l;
peptona 20 g/l; glucosa 20 g/l) que contiene un 2% de etanol y dosis
de geneticina que van desde 200 hasta 400 \mug/ml, mientras que
las células transformadas por el plásmido
pSK-Kan401 son sensibles a la geneticina.
Este resultado indica:
- que el gen aph está expresado en las
levaduras transformadas por los plásmidos pP4-Kan y
pP4R-Kan, lo que demuestra que el fragmento de 1,2
kb porta perfectamente una actividad promotora fraccional, y
- que este fragmento porta, por lo tanto,
perfectamente, una actividad promotora bidireccional, puesto que el
gen aph está expresado en las dos construcciones, es decir
independientemente de la orientación del fragmento
BamHI-BglII de 1,2 kb que contiene l promotor
KlADH4.
Los plásmidos pP4-15Kan y
pP4-60Kan confieren, después de la transformación,
la resistencia a las geneticina a la cepa MW98-8C
cultivada en un medio YPD que contiene 2% de etanol y dosis de
geneticina mayores que 200 \mug/ml.
Este resultado indica claramente que pueden
obtenerse por fragmentación derivados activos del promotor
KlADH4 portado por el fragmento 1,2 kb. Esto confirma la
actividad bidireccional de este promotor.
Se han utilizado los plásmidos
pP4-GUS y pSK-GUS (ejemplo 3.2) para
transformar la cepa K. lactis MW98-8C
(ura3 lysA argA) seleccionando las células
recombinadas por su prototrofía frente al uracilo sobre un medio
sintético SD ("yeast nitrogen base w/o amino acids" 0,67%,
glucosa 2%) suplementado con arginina (20 mg/l) y con lisina
\hbox{(30 mg/l).}
Las células recombinadas han sido cultivadas en
10 ml de YPD hasta la fase estacionaria. A continuación se han roto
las células por medio de bolas de vidrio en tubos Eppendorf,
centrifugadas, y los sobrenadantes se han analizado por
electrofóresis sobre minigel (5% de acrilamida) en condiciones no
desnaturalizantes. Los geles y los tampones utilizados están
descritos por Williamson et al. (Nature 283 (1980)
214-216).
Se han separado muestras que corresponden a
20-40 \mug de proteínas por electrofóresis sobre
gel de acrilamida (5%). La migración se ha realizado a 4ºC durante
60 minutos bajo una corriente de 20 mA.
La actividad
\beta-glucuronidasa se ha puesto en evidencia
sumergiéndose los geles en una solución colorante que contiene50 mM
de Na2HPO4, pH 7,0 y 50 g/ml de
bromo-5-cloro-4-indol-3-
glucuronido (X-Glu) en 5 mg/ml de dimetilformamida
(Jefferson R.A., Plant. Mol. Biol. Report 5 (1987)
387-405).
Los geles se han mantenido a 37ºC en esta
solución hasta la aparición de las bandas.
Los resultados obtenidos están representados en
la figura 15. El gel representado muestra claramente una banda en
las líneas 1 a 6, que corresponde a las células
MW98-8C transformadas por el plásmido
pP4-GUS, y ninguna señal en las líneas C que
corresponden a las células MW98-8C transformadas por
el plásmido pSK-GUS, que no contiene región
promotora de la invención.
Por otra parte, las células transformadas con los
plásmidos pP4-GUS y pSK-GUS se han
cultivado igualmente sobre un medio YPD suplementado con geneticina
(200 mg/l). Los transformantes que contienen
pP4-GUS han adquirido la resistencia contra este
antibiótico mientras que la cepa controlada, que contiene
pSK-GUS permanece sensible.
Estos resultados confirman la actividad promotora
bidireccional del fragmento 1,2 kb. Esto demuestra, además, que
este fragmento puede ser utilizado para la expresión simultánea de
dos genes heterólogos insertados a uno y otro lado del promotor
KlADH4 en las 2 orientaciones opuestas.
Se ha utilizado el plásmido de expresión pYG132
para transformar las cepas de levaduras K. lactis
MW98-8C (Rag2^{-}, incapaz de producir etanol a
partir de glucosa) y CBS 293.91 (Rag2^{+}, que metaboliza la
glucosa para producir etanol). Tras la selección de las células
recombinantes sobre medio YPD suplementado con geneticina (200
mg/l), los transformantes se han precultivado durante 20 horas
aproximadamente en frascos Erlenmeyers en un medio M9EL10 (medio M9
[Maniatis et al., precitado] suplementado con 10 g/l de extracto de
levadura) en presencia de glucosa (20 g/l) a 28ºC bajo agitación.
Este cultivo previo ha sido utilizado a continuación para inocular,
con una dilución de 10^{-3}, Erlenmeyers de 300 ml, que contienen
50 ml del medio M9EL10 en presencia de diferentes fuentes de
carbono, ya sea glucosa sola [20 g/l], ya sea glucosa [20 g/l] más
etanol [20 g/l], ya sea glicerol solo [20 g/l], ya sea glicerol [20
g/l] más etanol [20 g/l].
Tras el cultivo de las células recombinantes
durante 5 días a 28ºC bajo agitación, se han tomado muestras del
sobrenadante de cada cultivo, desprovista de células y se han
mezclado con un volumen equivalente de tampón Laemmli 2X (Laemmli,
Nature 227 [1970] 680). Tras calentamiento a 96ºC, durante 10
minutos, se han separado las proteínas contenidas en un equivalente
de 25 \mul de sobrenadante (25 mA) sobre gel de poliacrilamida
SDE al 8,5%. A continuación se ha revelado la secreción de albúmina
por coloración del gel con el azul de Coomássie, y se ha evaluado
por densitometría (densitómetro Shimazu CS930).
La figura 16 muestra el resultado obtenido, con
la cepa MW98-8C/pYG132 par ala cual se observa una
secreción de albúmina de elevado nivel cuando las células han sido
cultivadas en presencia de etanol añadido al mismo cultivo. Por el
contrario, no se detecta HSA en el sobrenadante cuando las células
han sido cultivadas en presencia de glucosa o de glicerol.
En contra de lo que ocurre con los resultados
obtenidos con la cepa MW98-8C/pYG132, los
transformantes CBS293.91/pYG132 son capaces de producir HSA en
todas las condiciones de cultivo evocadas anteriormente (figura 17).
Sin embargo, la producción de albúmina es 2 a 3 veces mayor en un
cultivo que contenga etanol añadido al medio con relación a un
cultivo en el que el etanol sea el producto del metabolismo
celular.
Estos resultados confirman la capacidad de las
paredes huésped/vectores descritos en los ejemplos precedentes para
producir con niveles elevados, en condición de inducción, una
proteína recombinante, independientemente del origen bacteriano o
mamífero. Por ejemplo, la producción de albúmina en Erlenmeyers en
la cepa CBS 293.91/pYG132 en un medio que contenga glicerol o
glucosa en presencia de etanol (figura 17) ha sido estimada por
densitometría con 190 - 200 mg/l.
Estos resultados confirman, igualmente, la
ausencia de represión del promotor KlADH4 por la glucosa
puesto que la producción de albúmina no queda reducida en presencia
de la misma.
Se ha utilizado el plásmido de expresión pYG130
para transformar la cepa K. lactis CBS 293.91 (Rag2^{+}).
Tras selección de las células recombinantes sobre medio YPD
suplementado con geneticina (200 mg/l), los transformantes han sido
precultivados y cultivados como se ha descrito en el ejemplo
precedente. La secreción de albúmina ha sido evaluada por
electrofóresis de muestras de sobrenadantes de cultivo como se ha
descrito en 7.2.1. El resultado obtenido con el derivado truncado
del promotor KlADH4 está indicado en la figura 18: el par
huésped/vector CBS293.91/pYG130 es claramente capaz de producir y
de secretar albúmina recombinante. Como en el ejemplo del plásmido
pYG132 (promotor KlADH4 entero) se observa una producción de
albúmina en el medio que contiene glucosa como única fuente de
carbono, pero con un nivel menos elevado con relación al promotor
entero. Por el contrario, el cultivo de las células en un medio que
contenga glucosa más etanol, aumenta la producción de HSA de un
factor de 2 a 3 (figura 18).
Se ha depositado una muestra de la cepa K.
lactis 2359/152 el 4 de Junio de 1991 ante el Centraalbureau
voor Schimmelkulturen (CBS) à Baarn, de los Países Bajos en las
condiciones del Tratado de Budapest, bajo el número CBS 289.91. La
cepa K. lactis CBS 293.91 corresponde a la cepa CBS1065
depositada el 11 de Junio de 1991 según las condiciones del Tratado
de Budapest.
| Vector | Plásmido naveta | Caja de expresión | |
| PPa-Kan | PSK-Kan401 | 1,2 > aph | |
| PP4r-Kan | PSK-Kan401 | aph | 1,2 > |
| PP4-GUS | PSK-Kan401 | aph | 1,2 > GUS |
| PYG131 | pYG404D | 1,2 > NADA | |
| PYG132 | pYG404D | 1,2 > HSA |
| Vector | Plásmido naveta | Caja de expresión | |
| P4-15Kan | pSK-Kan401 | 0,5 > aph | |
| PP4-60Kan | pSK-Kan401 | aph | 0,7 > |
| PYG129 | pYG404D | 0,67 > NADA | |
| PYG130 | pYG404D | 0,67 > HSA |
| Cepa/Medio | Glucosa | Etanol | Glucosa + etanol | Fructosa | Glicerol |
| 2359/152 (Rag2+) | + | + | + | + | - |
| MW98-8C (Rag2-) | - | + | + | + | - |
Claims (17)
1. Secuencia de ADN constituida por la totalidad
o una parte de la secuencia representada en la figura 1, o por su
hebra complementaria, o por un derivado de ésta, y que tiene una
actividad de promotor de transcripción.
2. Secuencia de ADN según la reivindicación 1,
constituida en su totalidad o en parte por el fragmento
SacI-BamHI de 0,5 kb aproximadamente, representado
en la figura 2, o del fragmento SalI-HindIII de 0,7
kb aproximadamente, representado en la figura 3.
3. Secuencia de ADN según la reivindicación 1,
constituida totalmente o en parte por el fragmento
BgIII-SacI de 0,7 kg aproximadamente, que
corresponde al fragmento comprendido entre los nucleótidos 1 y 723
de la hebra complementaria de la secuencia dada en la figura 1.
4. ADN recombinante que comprende una secuencia
de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y uno o
varios genes de estructura con la excepción del gen KIADH4 de K.
lactis.
5. ADN recombinante según la reivindicación 4,
caracterizado porque contiene también señales que permiten
la secreción del producto de expresión del o de los citados genes
de estructura.
6. ADN recombinante según las reivindicaciones 4
y 5, caracterizado porque el o los genes de estructura
codifican proteínas de interés farmacéutico o agroalimentario.
7. ADN recombinante según la reivindicación 6,
caracterizado porque el o los genes de estructura codifican
proteínas elegidas entre los enzimas (tales como principalmente la
superóxidodismutasa, la catalasa, las amilasas, las lipasas, las
amidasas, la quimosina etc.), los derivados de la sangre (tales como
el suero-albúmina, la alfa- o la
beta-globina, el factor VIII, el factor IX, el
factor de Willebrand, la fibronectina, la
alfa-1-antitripsina, etc.), la
insulina y sus variantes, las linfoquinas (tales como las
interleukinas, los interferones, los factores de estimulación de
las colonias [G-CSF, GM-CSF,
M-CSF...], el TNF, el TRF, etc.), los factores de
crecimiento (tales como la hormona de crecimiento, la
eritropoyetina, el FGF, el EGF, el PDGF, el TGF, et.), las
apolipoproteínas, polipéptidos antigénicos para la realización de
vacunas (hepatitis, citomegalovirus, Eppstein-Barr,
herpes, etc.), o incluso fusiones de polipéptidos tales como
principalmente, fusiones que comprenden una parte activa fusionada
con una parte estabilizante (por ejemplo fusiones entre la albúmina
o fragmentos de albúmina y el receptor o una parte de un receptor de
virus [CD4, etc.]).
8. ADN recombinante según una cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 7, caracterizado porque forma parte de
un plásmido de expresión, que puede ser de replicación autónoma o
por integración.
9. Célula recombinada que contiene una secuencia
de ADN o un ADN recombinante según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes.
10. Célula recombinada según la reivindicación 9,
caracterizada porque se trata de una levadura.
11. Célula recombinada según la reivindicación
10, caracterizada porque se trata de una levadura del género
Kluyveromyces.
12. Utilización de una secuencia de ADN según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para la expresión de
genes recombinados.
13. Utilización según la reivindicación 12, para
la expresión simultánea de genes recombinados insertados a uno y
otro lado del promotor en las dos orientaciones opuestas.
14. Utilización según una de las reivindicaciones
12 ó 13, para la expresión de genes que codifican proteínas de
interés farmacéutico o agroalimentario.
15. Procedimiento para la producción de proteínas
recombinantes, caracterizado porque se cultiva una célula
recombinada según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, y
se recuperan las proteínas producidas.
16. Procedimiento según la reivindicación 15,
para la producción de proteínas de interés farmacéutico o
agroalimentario.
\newpage
17. Procedimiento según la reivindicación 16,
caracterizado porque la proteína es preferentemente la
suero-albúmina humana o una de sus variantes
moleculares.
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