JPH0391486A - 新規遺伝子、ベクター、それを用いた形質転換体、及びその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、サツカロミセス・セレビジアエ（Ｓａ−ｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から得ら
れた第９番染色体上に位置するキラーＫＨＲ遺伝子、こ
れを含むベクター、そのベクターをサツカロミセス・セ
レビジアエ等の菌体に移入した形質転換体およびその利
用に関するものである。

（従来の技術） サツカロミセス属酵母のキラーについては、その多くが
細胞質依存の二重鎖リボ核酸（ｄｓ　ＲＮＡ）プラスミ
ツドに遺伝的に支配されている。

しかしながらこのようなキラーとは全く別に、染色体Ｄ
ＮＡに支配されるキラー因子（ＫＨＲ）が発見された。

このキラー毒素は最適ｐＨ及び温度安定性等に関して従
来のサツカロミセス・セレビジアエの二重鎖リボ核酸プ
ラスミツドに遺伝的に支配される毒素とは異なり、濃縮
することにより広範な酵母に対し致死作用を示し、タン
パク化学的にも新規なものである。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は、上記したような、染色体ＤＮＡに支配され高
温、高ｐＨに比較的安定なキラー毒素（ＫＨＲ）を支配
する遺伝子を解明する目的でなされたものである。

（問題点を解決するための手段） そこで、上記目的達成のため、本発明者らは当毒素を支
配する遺伝子の分離について種々の検討をした結果、そ
の遺伝子を単離することに成功し。

その構造について検討を加えた結果１本遺伝子がサツカ
ロミセス・セレビジアエにおいて優れた発現・分泌機能
を持ち、さらにキラー性という優性標識をも同時に兼ね
備えるものであることを確認し１本発明を完成した。

すなわち、本発明は、分子量が約１５．８ｋｂｐ（キロ
ベースペアー）の第１図の制限酵素開裂地図によって特
徴づけられる新規なプラスミツドであり、内部にＫＨＲ
キラー構造遺伝子（約０．９ｋｂｐ）を含む４．７ｋｂ
のＤＮＡで、構造遺伝子の上流域にはこのキラー毒素を
サツカロミセス属酵母において発現させるプロモーター
を持ち、キラー毒素を分泌させる分泌機構を持つ新規な
遺伝子を含むものである。また、ＫＨＲ遺伝子を優性標
識としてもしくはＫＨＲ遺伝子内の制限酵素部位を利用
し酵母内において外来遺伝子の挿入を確認できるベクタ
ーとしても利用することが可能である。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明に係るＫＨＲ遺伝子については上記に概説したと
おりであるが、そのクローニングは以下に述べる方法に
よって行う。

先ず、ＫＨＲ遺伝子を染色体上に含む株を用意する。好
適な株としては例えば、サツカロミセスセレビジアエＮ
ｎ１１株ないしＮα１８ρ−株が挙げられる。これらの
菌株から全ＤＮＡを調整し、制限酵素により部分分解し
て、電気泳動的に例えば５〜１０ｋｂ程度の断片を回収
する。

回収したＤＮＡ数片は、大腸菌−酵母シャトルベクター
に連結する。シャトルベクターとしては当業界において
既知のものが適宜使用され、例えばＹＥｐ１３、ＹＣｐ
Ｇｌｌ等が挙げられる１回収したＤＮＡ断片とシャトル
ベクターとの連結体は大腸菌例えばＪＡ２２１株に導入
し、遺伝子バンクを作成する。

上記遺伝子バンクからベクターを回収し、これを受容菌
例えばＳ、セレビジアよりＢＹ７４６株に導入して形質
転換を行う。これらの形質転換株について、栄養要求性
で１次選択を行った後、キラー活性検出培地上で指標菌
１例えばＣａｎｄｉｄａ　ｇｌａｂｒａｔａに対するキ
ラー性の有無により２次選択を行い、目的とする形質転
換株をスクリーニングする。

このようにして得た形質転換株から、前述したのと同じ
方法によって、全ＤＮＡを回収し、これを大腸菌に導入
してプラスミドを回収し、そして目的とするＫＨＲ遺伝
子を回収するのである。

以下、実施例によって本発明を更に具体的に詳述する。

実施例 本発明に用いたゲノムＤＮＡはＫＨＲ遺伝子を染色体上
に持つサツカロミセス・セレビシアエ由来のものであり
、具体的には例えば＆１１株である。

本菌からゲノムＤＮＡを抽出するには１例えばＣｒｙｅ
ｒらのＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃａ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ、　Ｖｏｌ、１２，３９−４４（１９７３）に記載さ
れたサツカロミセス・セレビジアエの染色体ＤＮＡの抽
出に関する方法に準じて行なわれる。

次に、得られたゲノムＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ　３Ａで
処理し、部分分解を行った後、アガロース電気泳動法に
より５−１０ｋｂｐの核酸断片を分取して、第１図に示
す様にベクターに連結した。このＹＣｐＧ１１ベクター
はＡｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、Ｖｏｌ、５０．
１１７７−１１８２（１９８６）に記載され、酵母で複
製可能なＡＲ３１，大腸菌で複製可能なｐＢＲ３２２ｏ
ｒｉ、標識遺伝子として酵母ＴＲＰＩ、大腸菌クローニ
ング部位としてＢａｗｌ（１部位を含むテトラサイクリ
ン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子及び酵母内での
ベクター数を１−２に制限するｃｅｎ４遺伝子により構
成されている。異種ＤＮＡの挿入部位はＢａｍ）Ｉ　１
部位である。ＹＣｐＧ１］ベクターを制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ分解後、断片化したゲノムＤＮＡを加え、混合し、Ｔ
４リガーゼで連結し。

大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＡ２２１に導入し、アンピシリ
ン耐性で、かつテトラサイクリン耐性能を失った大腸菌
を選択し、酵母遺伝子を含む組換ベクターとし、さらに
酵母由来の核酸を含むベクターを増幅させた。

上記で得られたベクターを回収し、酵母サツカロミセス
・セレヴイジアよりＢＹ７４６株に導入し、ベクター上
のトリプトファン要求性標識の相補性で形質転換株を選
択し、その中からＫＨＲキラー性の発現を確認できるＰ
Ｈ６のキラー検出培地上で増殖させ、指標菌としてキャ
ンディダ・グラブラータＩＦ００６２２株を噴霧し、Ｄ
ＢＹ７４６株の回りにキャンディダ・グラブラータの生
育阻害が認められる株を選択し、第１表のような性質を
示すＫＨＲ（Ｃ）株を取得した。この形質転換株（Ｓ、
ｃａｒｅｖｉｓｉａｅ　ＫＨＲ（Ｃ））はＦＥＲＭ ている。

Ｐ−１０９２７として微工研に寄託されＳ、ｃｅｒｅｖ
ｉｓＬａｅ ＱＩＩ Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹ７４６ Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＫＨＲ（Ｃ） Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋　：　Ｌｅｕ２、Ｔｒｐｌ、　Ｕｒａ３にツイては各
々にツイて要求しないことを示す。ＫＨＲについてはキ
ラー活性のあることを示す。

この酵母株より前出のＣｒｙｅｒらの方法に基づき全核
酸を抽出し、大腸菌にその核酸を導入して、アンピシリ
ン耐性のクローンを回収した。その大腸菌菌体よりベク
ターを回収し、種々の制限酵素で制限酵素開裂地図作成
した結果を第１図に示した。なお、本大腸菌形質転換株
（Ｅ、ｃｏｌｉ　ＫＨＲ−ＹＣＰ）はＦＥＲＭ　Ｐ−１
０９２６として微工研に寄託されている。

挿入した酵母核酸由来の部分の詳細な制限酵素切断部位
について第２図に示した。

この制限酵素切断部位を利用し、当核酸を制限酵素Ｂａ
ｍ１１１及びＳａｌ　Ｉで分断し、酵母由来の核酸を含
む断片を酵母内でのコピー数の増えるベクターに組替え
た結果も同時に示す。使用したベクターはＢｏｔｓｔｅ
ｉｎ　らのＧｅｎｅ　Ｖｏｌ、８．１７−２４　（１９
７９）に記載のＹＥｐ２４である。本ベクターは酵母で
の複製可能な２ミクロンＤＮＡ、大腸菌で複製可能なρ
ＢＲ３２２の○ｒｉ、標識遺伝子として酵母ＵＲＡ３、
大腸菌テトラサイクリン耐性遺伝子及びアンピシリン遺
伝子で構成されている。このテトラサイクリン遺伝子内
の唯一の制限酵素切断部位であるＢａｍ１ｌ　Ｉ及びＳ
ａｌ　Ｉ部位を持つ。

このベクターをＢａｍＨＩ及び５ａｉｌで２重分解し。

これにＫＨＲ遺伝子を含むＢａｍＨＩ−５ａｌＩＩＩｒ
ｒ片を加え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結し、ベクターＫ
）ＩＲ−ＹＥｐを得る。次にこのＫｌ（Ｒ−ＹＥＰを大
腸１ＪＡ２２１に移入、常法により大量に精製した。本
形質転換株（Ｅ、ｃｏｌｉＫＨＲ−ＹＥｐ）はＦＥＲＭ
Ｐ−１０９２９として微工研に寄託されている。

続いて精製ベクターＫ）ＩＲ−ＹＥｐをＩｔｏらのＪ　
、　Ｂａｃ。

１５３．１６３−１６８　（１９８３）記載の方法にし
たがって酵母宿主ＤＢＹ７４６（αｔｒｐｌ−２８９ｈ
ｉｓ　３Δ１１ｅｕ２−３−１１２ｕｒａ３−５２）に
移入し、ウラシル要求性が相補されたことによりウラシ
ルを含まない培地において生育可能な形質転換体を得る
。同様にして適当な制限酵素で分断後、ＫＨＲ遺伝子を
含むＤＮＡ断片を挿入したベクターからＫＨＲキラー性
の発現を見て、ＫＨＲキラー遺伝子の発現に必要な部分
について検討した結果を第２表に示す。キラー活性発現
に必要なりＮＡは、制限酵素ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩで切
断される１、７ｋｂに存在することが発見された。

第２表 キラー形質発現に必要なりＮＡ （ＫＨＲ−ＹＣｐ）　　　　　　　　　　　４．７　　
　　　　　　＋（ＹＥｐ２４）　　　　　　　　　　　
　０．０　　　　　　　−ＢａｍＨＩ−３ａＩ　Ｉ　（
ＫＨＲ−ＹＥｐ）　　　３．７　　　　　　　　＋Ｘｈ
ｏＩ−５ａｌＩ　　２．７　＋ ＮｃｏＩ−５ａｌ　Ｉ　　　　　　　　　　　　　２．
４　　　　　　　　　−ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ　　２
．６　＋ＢａｍＨＩ−Ｐｓｔ　Ｉ　　　　　　　　　　
　１．８キラー活性の有るものを十とした。

第２表に示した形質転換株でキラー活性を有するものは
ほとんど同じ強さを示すが、そのうち最もキラー性の強
い株（以下、ＫＨＲ（Ｅ）株という）にいて説明する０
本菌株　（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｋ　ＨＲ（Ｅ）
）はＦＥＲＭ　Ｐ−１０９２８として微工研に寄託され
ている。第３表に示すようにＫＨＲ（Ｅ）株のキラー活
性はＫＨＲ遺伝子を染色体上に遺伝子を持つ株（Ｈａｌ
１株）もしくは単コピー系ベクター上に持つ株（例えば
Ｋ　ＨＲ（Ｃ）株）の培養上清中に分泌されるキラー活
性において約３−４倍の強さが認められた。

第３表 形質転換体のキラー毒素生成 キラー活性は培地上清を凍結乾燥後、緩衝液に適宜希釈
し、寒天培地上で２００μｍの試料を直径８．５ｕｗの
ペニシリンカップに入れ、指示菌の繁殖を抑えた場合を
１　ｕｎｉｔとした。なお、Ｎ、Ｄ、は活性が検出され
ないものを示す。

ＫＨＲ（Ｅ）株のようなＫＨＲ遺伝子を複数持つ形質転
換体はキラー性の最も強く発現する条件（ｐＨ６，０，
２０℃、静置培養）で極度に生育阻害が認められた。そ
こで酵母菌体の増殖を図るためにウラシルを除いた培地
に０．１Ｍとなるようクエン酸−燐酸緩衝液（ｐＨ４，
０）を添加し、３０℃振どう培養を行ない生育阻害効果
を取り除き回収した。キラー毒素調製には回収した菌体
をｌＯ倍容の０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６，０）を
含むウラシルを除いた培地で２０℃４−５日間静置培養
を行ない、その培養上清を使用した。

この菌株より生成・分泌されたキラー毒素は凍結乾燥に
よる濃縮、ゲル濾過（ＴＳＫ−ｇｅｌ　Ｇ３０００Ｓ１
（ＴＯ３ＯＨ）　）及び疎水クロマトグラフィ（Ｓｙｎ
Ｃｈｒｏｐａｋｐ　ｒ　ｏ　ｐ　ｙ　ｌ　（ＳｙｎＣｈ
ｒｏｍ））を使用し、部分精製することができる。毒素
の諸性質は第４表に示したとおりで、等電点ｐ　１５．
２−５．６、最適ｐＨ５，５のタンパク質であることが
発見された。

至適ｐＨ安定性　　　　　等電点 分離したキラー毒素を濃縮使用した場合、第５表に示す
ような多くの酵母菌属にキラー活性を示した。これらの
結果及び菌体レベルでのキラー活性の性質はＰＨ，温度
安定性や至適ｐＨ及び限外ろ過によるろ過性等において
ＤＮＡ供給株（Ｎａ　１１株）と同じ結果となり、同一
のキラー毒素を生産していることが示されている。

第５表　キラースペクトラム Ｓ、ｅｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＱＩＩＩ Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹ７４６ Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｋｙｏｋａｉ　＆７ Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａ６ Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａａ Ｃ２ Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｌ８８ Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＮＣＹＣ７６１ Ｄ、ｖａｎｒｉｊｉ ＮＣＹＣ５７７ Ｐ、ｍｅ＋５ｂｒａｎａｅｆａ− ｃｉｅｎｓ　ＮＣＹＣ３３３ Ｈ，ａｎｏｍａｌａ ＮＣＹＣ４３５ ＋ 十 ＋ ＋ ＋８０ 十 ０ 十 ０ ６０ ６０ ＋ ０ ＋ ＋ 十 ０ 〉２００ に＋ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ− ｒｕｍ　ＮＣＹＣ５７５ Ｃｏｇｌａｂｒａｔａ ＩＦＯＯ６２２ Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＡ２２１ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 〉２００ Ａ、ｏｒｙｓａｅ 〉２００ ｕｎｉｔｓ使用時での結果及び数字は指標菌生育阻害最
少ユニット数。

第２表に示したＫＨＲキラー遺伝子を含む最小ユニット
である制限酵素Ｘｈｏ　ＩとＥｃｏＲＩによって切断さ
れる約し７ｋｂｐ断片を中心とした核酸配列の決定を常
法にもとづき、配列決定用ベクターｐＵｃ１１８及び１
１９用い、欠損変異ベクターの作成とその配列をダイデ
オキシ法により決定を行なった。

具体的には第１図に示すＫＨＲ活性の存在するベクター
を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌ　Ｉ分解し生ずる断片
をｐＵｃ１１８．１１９に挿入した。このベクターをＧ
ｅｎｅ、　Ｖｏｌ、２８．３５１−３５９　（１９８４
）及びＧｅｎｅ、　Ｖｏｌ。

３３、１０３−１１９　（１９８５）の方法に従って挿
入部分をエキソヌクレアーゼ■及び、マングビーンヌク
レアーゼで処理して短鎖化し、当該挿入断片の一部が脱
落し、異なる鎖長を持った種々のクローンを作成した。

この工程はキロシーフェンス用デレージョンキット（宝
酒造（株））を使用した。得られた種々のクローンの挿
入断片について、蛍光プライマー（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ　Ｖｏｗ、　５．７５４−７６５（１９８７
））を利用したダイデオキシ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　Ｖ
ｏｌ、　２１４．１２０５−１２１０（１９８１）によ
りＤＮＡの配列決定を行なった。

なお、この決定にはＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌ−
ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　（株）ＡＢＩ　３７０
Ａ）を使用した。その結果、サツカロミセス・セレビジ
アエのＫＨＲ遺伝子のコーディング領域の全部ならびに
隣接する上流及び下流領域の一部のＤＮＡ配列について
。

第３図に示す全長１０８０ｂｐの配列が決定された。

第３図に示す核酸配列中にはアミノ末端が疎水性の高い
アミノ酸が約２０前後存在し、分泌配列を形成し、２９
６のアミノ酸残基より構成されるタンパク質をコードし
ていることが発見された。さらに、アミノ酸の読みださ
れる核酸配列の上流約８０ｂＰにプロモーターとなるＴ
ＡＴＡ配列とアデニン、チミンを多く含む領域が存在す
ることが発見された。

このように当該発明の核酸配列には新規な分泌配列、酵
母菌に作用する毒素の配列及び当毒素を発現させるプロ
モーターの配列を含んでいることが明らかとなった。

つまり、第３図に示す配列により、分泌配列の中に制限
酵素部位Ｐｖｕ　Ｕを含んでおり、この下流域に構造遺
伝子を組み込むことにより酵母菌においてタンパク質と
して発現・分泌させることが可能である。例えば、大腸
菌由来のＬａｃＺ遺伝子をつなぎ、酵母内での発現をＸ
−Ｇａ１　（５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒ。

−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒ
ａｎｏｓｉｄｅ）を含む寒天培地上で青色コロニーの出
現及び液体培地でのガラクトシダーゼ活性の測定により
発現の確認ができる。

また、ＫＨＲ−ＹＥｐベクターの中にはクローニング部
位となり得る制限酵素部位が数カ所存在し、酵母サツカ
ロミセス・セレビジアエでウラシル要求性もしくはキラ
ー活性の２種の標識を利用することができる。例えば、
　ＫＨＲ−ＹＥｐベクターのＫＨＲ遺伝子内に唯一存在
する制限酵素Ｍｌｕ　１部位に外来遺伝子を挿入し、キ
ラー活性の最適条件で酵母を生育させることにより選択
的にキラー性の消失した株を回収し、外来遺伝子の効率
的回収ができる。

（発明の効果） 本発明によってはじめて、キラー因子ＫＨＲを支配する
遺伝子の単離に成功し、その構造決定も行われた。

その結果１本発明によれば染色体依存性キラー蛋白質を
量産できるだけでなく、ＫＨＲ遺伝子を優性標識として
もしくはＫＨＲ遺伝子内の制限酵素部位を利用し酵母内
において外来遺伝子の挿入を確認できるベクターとして
も利用することができ、遺伝子操作の技術分野において
本発明は重要な役割を果すものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＹＣｐＧｌｌのテトラサイクリン遺伝子の中
にあるＢａｍＨ１部位に酵母由来のＤＮＡを挿入したベ
クターを示したものである。キラー活性の存在する部分
、ＥｃｏＲＩ側のＢａｍ８１部位は破壊されている。な
お、ＫＨＲ遺伝子を含む挿入断片の大きさは約４．７ｋ
ｂである。 第２図は、第１図のＫＨＲ部分を含むＢａｍＨＩ、Ｓａ
ｌ　Ｉ断片を回収後、種々の制限酵素で分解し、それぞ
れの切断部位を推定したＫＨＲ遺伝子の開裂マツプであ
る。 なお、これらの図面において、アルファベットの略語は
、それぞれ次の制限酵素による切断位置を示す。 Ｂ　：　ＢａｍＨＩ　　Ｂｇ　：　Ｂｇｌ　ＩＩ　　Ｅ
　：　ＥｃｏＲＩ　　Ｅｖ　：　ＥｃｏＲＶＭ　：　Ｍ
ｌｕ　Ｉ Ｎ　：　Ｎｅｏ　Ｉ　　Ｐ　：　Ｐｓｔ　Ｉ　　Ｐｖ　
：　Ｐｖｕ　ＩＩ　　Ｓ　：　Ｓａ　ｌ　ＩＸ：Ｘｈｏ
Ｉ Ｓ　ａｕ　：　５ａｕａＡ　１ 第３図は、ＫＨＲ遺伝子周辺の塩基配列を示したもので
ある。なお、下にアミノ酸記号を付した部分にＫＨＲキ
ラー遺伝子が存在する。１３９番目のＡＴＧのメチオニ
ンから始まる２９６個のアミノ酸をコードしている。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）染色体ＤＮＡ依存性キラーＫＨＲ遺伝子のプロモ
   ーター領域及び蛋白質コード領域を含むＤＮＡ配列。
2. （２）サッカロミセス・セレビジアエ由来の染色体ＤＮ
   Ａ依存性キラーＫＨＲ遺伝子のプロモーター領域及び蛋
   白質コード領域を含むＤＮＡ配列を有し、第１図で示さ
   れる制限酵素切断地図で特徴づけられたベクター。
3. （３）特許請求の範囲第１項に記載のプロモーター系及
   び又は分泌系を含有してなるベクター。
4. （４）特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ配列を優性
   標識としてなることを特徴とするキラー性を有するベク
   ター。
5. （５）特許請求の範囲第２項に記載のキラー遺伝子内の
   唯一の制限酵素部位を利用した選択的な組換えベクター
   。
6. （６）特許請求の範囲第２項又は第３項に記載のベクタ
   ーを菌体に移入せしめてなることを特徴とするキラー活
   性を有する形質転換体。