ES2203619T3 - Celulas de hongos modificadas y metodo para producir productos recombinantes. - Google Patents
Celulas de hongos modificadas y metodo para producir productos recombinantes.Info
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Abstract
ESTA INVENCION SE REFIERE A CELULAS FUNGALES PERFECCIONADOS Y METODOS PARA OBTENER PRODUCTOS RECOMBINANTES DE CALIDAD PERFECCIONADA Y GRANDES RENDIMIENTOS. MAS ESPECIFICAMENTE, LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A CELULAS FUNGALES QUE TIENEN MODIFICACIONES ESPECIFICAS DENTRO DE SUS SECUENCIAS DEL DNA, Y QUE ORIGINAN LA EXHIBICION EN ELLAS DE, AL MENOS, UNA CAPACIDAD REDUCIDA PARA PROTEINAS HOMOLOGAS Y/O HETEROLOGAS, Y EL USO DE ESTAS CELULAS COMO CELULAS HUESPEDES PARA OBTENER GRANDES RENDIMIENTOS DE PRODUCTOS RECOMBINANTES.
Description
Células de hongos modificadas y método para
producir productos recombinantes.
Esta invención se refiere a células de hongos
mejoradas y métodos para producir productos recombinantes de
calidad mejorada y de altos rendimientos. Más específicamente, la
presente invención se refiere a células de hongos que portan
modificaciones específicas dentro de sus secuencias de ADN que les
causan que exhiban al menos una reducida capacidad para
O-glicosilar proteínas homólogas y/o heterólogas, y
el uso de estas células como células huéspedes para producir altos
rendimientos de productos recombinantes.
El desarrollo de la tecnología de ADN
recombinante ha hecho posible la preparación de productos externos
en células huéspedes en las que se han introducido secuencias de
ADN exógeno que codifican esos productos. La ventaja de esta
tecnología es que pueden prepararse productos con altos
rendimientos, en forma muy purificada, sin ningún riesgo de
contaminación como la contaminación vírica (SIDA, hepatitis B,
etc.). Estas técnicas recombinantes se han usado ampliamente para
la preparación de proteínas recombinantes en células huéspedes
procarióticas así como eucarióticas. Las células huéspedes
procarióticas incluyen E. coli [Nagata et al., Nature
284 (1980), 316; EP 001 929], Bacillus subtilis
[Saunders et al., J. Bacteriol. 169 (1987), 2917],
Streptomyces, y Corynebacterium (EP 433 117). Las
células huéspedes eucarióticas incluyen células vegetales, células
animales y células de hongos.
Sin embargo, la preparación a gran escala de
productos recombinantes por estas técnicas es todavía limitada,
debido a problemas de eficacia de la expresión de estas secuencias
de ADN exógeno, debido también a la inestabilidad del vector y a
degradación intracelular de los productos recombinantes por la
célula huésped en la que se hacen. Considerando la eficacia de la
expresión, se han hecho esfuerzos para aislar fuertes promotores,
que llevan a niveles de expresión incrementados de secuencias de
ADN exógeno y, por tanto, niveles incrementados de preparación de
los productos recombinantes. Se han desarrollado varios sistemas
para incrementar la estabilidad de los vectores dentro de las
células huéspedes, los más frecuentemente usados de los cuales
consisten en la inserción en el vector de un gen con resistencia a
los antibióticos que permite células huéspedes recombinantes para
sobrevivir y crecer en un medio selectivo. Con respecto a la
degradación intracelular, se han descrito varias células mutantes
que pierden o que tienen una actividad proteasa reducida, limitando
de ese modo la capacidad de dichas células para degradar productos
recombinantes.
Sin embargo, problemas adicionales limitan
todavía la producción a gran escala y el uso farmacéutico de
productos recombinantes. Uno de éstos resulta del hecho de que los
productos producidos de forma recombinante son a menudo diferentes
de sus duplicados naturales. Por ejemplo, las células huéspedes
bacterianas no poseen todos los mecanismos postraslacionales
requeridos para maduración de polipéptidos de mamíferos. En
consecuencia, dichos polipéptidos de mamíferos producidos en
bacterias son a menudo inmaduros o no correctamente replegados.
Además, las células huéspedes bacterianas introducen, generalmente,
una metionina adicional en el extremo N de los productos.
Los productos recombinantes producidos en
huéspedes eucarióticos heterólogos se diferencian, también,
normalmente, de sus duplicados que aparecen de forma natural en su
contenido de glicosilación. Esto puede afectar a la presencia
frente a la ausencia de cualquier estructura hidrocarbonada, a la
localización de dicha estructura hidrocarbonada en el producto, así
como a la naturaleza del hidrocarburo. Más específicamente, se ha
demostrado que los productos recombinantes derivados de la
levadura, a menudo portan O-glicanos adicionales no
naturales comparados con su duplicado natural. Por ejemplo, se ha
demostrado que, mientras el factor I de crecimiento similar a la
insulina (IGF-I, en inglés)en suero humano
no está glicosilado, su forma recombinante producida en S.
cerevisiae es O-glicosilada y, más exactamente,
O-manosilada [Hard et al., FEBS Letters 248
(1989), 111]. De la misma forma, se ha demostrado que el factor de
crecimiento derivado de trombocitos (PDGF, en inglés) humanos y
GM-CSF humano presentan estructuras
O-manosilo no naturales cuando se producen en S.
cerevisiae [Biomedic. Environ. Mass Spectrometry 19
(1990), 665; BIO/TECHNOLOGY 5 (1987), 831]. Esta
O-glicosilación anormal es el resultado de
importantes diferencias entre los mecanismos de glicosilación de
células de mamíferos (humanos) y aquellas de otras células
eucarióticas, tales como levaduras. A este respecto, se ha observado
que la O-glicosilación en células de hongos
(incluidas levaduras y hongos filamentosos) continúa de una manera
similar e inusual hasta ahora no observada en ningún otro
organismo.
La aparición de esta indeseable
O-glicosilación en productos recombinantes derivados
de hongos constituye un importante inconveniente para esta
tecnología para la preparación de productos farmacéuticos.
La primera razón es que glicanos específicos de
hongos pueden introducir nuevos determinantes inmunológicos en una
proteína, y una glicoproteína con tales hidrocarburos no naturales
puede, por tanto, ser antigénica cuando se administra a seres
humanos. A este respecto, se sabe, por ejemplo, que la mayor parte
de los seres humanos tienen anticuerpos dirigidos contra cadenas de
manosanos de levadura enlazados en N [Feizi y Childs, Biochem. J.
245 (1987), 1].
Otra razón es que las proteínas sin las
estructuras hidrocarbonadas apropiadas pueden haber alterado,
también, las propiedades farmacocinéticas. Se ha demostrado que las
estructuras hidrocarbonadas de las glicoproteínas influyen y
participan en definir su velocidad de eliminación in vivo,
que es esencial en determinar la eficacia de un producto
farmacéutico. Más exactamente, se ha identificado un receptor de
manosa en la superficie de células endoteliales de hígado y de
macrófagos residentes que aparentemente representa un medio para
eliminar glicoproteínas que presentan oligosacáridos de tipo manosa
[Stahl, Cell. Mol. Biol. 2 (1990), 317]. Por tanto, la
presencia de estructuras de manosa no naturales adicionales y en
una proteína puede incrementar su velocidad de eliminación y
disminuir, así, su vida media en el plasma.
Todavía otra razón es que se ha demostrado,
también, que la actividad biológica de una glicoproteína varía con
el contenido, la posición y la naturaleza de su hidrocarburo. Por
ejemplo, se ha demostrado que la glicosilación afecta las
propiedades biológicas de la EPO humana recombinante [Takeuchi et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86 (1989), 7819] y de la
tPA humana recombinante [Parekh et al., Biochemistry 28
(1989), 7644].
Por las razones mencionadas anteriormente, está
claro que la O-glicosilación no natural de
productos recombinantes derivados de hongos puede afectar
gravemente sus propiedades inmunológicas, biológicas y
farmacocinéticas y, por tanto, puede impedir su desarrollo para uso
terapéutico en el ser humano.
La presente invención resuelve el problema de
O-glicosilación anormal referida anteriormente
proporcionando células de hongos modificadas que portan
modificación o modificaciones genéticas dentro de sus secuencias de
ADN que causan que éstas tengan al menos una capacidad reducida de
O-glicosilación de proteínas nativas o
externas.
El solicitante ha encontrado que es posible
obtener células de hongos modificadas genéticamente con reducida
capacidad de O-glicosilación que son todavía
viables y muestran buenas características de crecimiento en
condiciones de fermentación industriales. Inesperadamente, el
solicitante ha demostrado, también, que dichas modificaciones
genéticas no afectan a la estabilidad de estas células de hongos
cuando se transforman con ADN exógeno. Las células de hongos
modificadas de la presente invención pueden ser utilizadas
ventajosamente como células huéspedes para la preparación de
productos recombinantes de alta calidad, con
O-glicanos reducidos o no indeseables.
Un objeto de la presente invención es una célula
de hongos que porta modificación o modificaciones genéticas que
están situadas en la región codificante o en regiones responsables
de o involucradas en la expresión y/o en la regulación
transcripcional del gen que codifica una proteína con actividad
Dol-P-Man:Proteína (Ser/Thr)
manosil- transferasa (PMT1) seleccionada del grupo constituido
de
(a) moléculas de ADN que comprenden la secuencia
de nucleótidos representada en la Figura 4A o fragmentos de la
misma;
(b) moléculas de ADN que codifican una proteína
con la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 4B o
fragmentos de la misma; o
(c) moléculas de ADN que comprenden la secuencia
del fragmento de 126 pb del gen PMT1 de Kluyveromyces lactis
representado en la Figura 7 o fragmentos del mismo;
que causa o causan que dicha célula tenga al
menos una reducida capacidad de O- glicosilación comparada con una
célula de hongos que porta la correspondiente molécula de ADN no
modificada como se define en (a) a (c).
Objetos adicionales de la presente invención
son
la molécula de ADN que comprende un gen que
codifica la Dol-P-Man:Proteina
(Ser/Thr) manosil-transferasa de una especie de
Saccharomyces, teniendo dicho gen la secuencia dada en la
Figura 4A;
una molécula de ADN que comprende un gen que
codifica la Dol-P-Man:Proteina
(Ser/Thr) manosil-transferasa de una especie de
Kluyveromyces, conteniendo dicho gen la secuencia del
fragmento de 126 pb del gen PMT1 de Kluyveromyces lactis
dado en la Figura 7; y
una molécula de ADN que comprende un gen que
codifica una proteína que exhibe propiedades de la
Dol-P-Man:Proteína (Ser/Thr)
manosil-transferasa:
(a) que hibrida con la secuencia de ADN como se
ha mencionado anteriormente, y/o
(b) representa fragmentos o derivados de la
secuencia de ADN como se ha mencionado anteriormente.
La célula de hongos de la presente invención
puede escogerse de hongos filamentosos y levaduras por lo que
Kluyveromyces y Saccharomyces son géneros de
levaduras preferidos. Cepas ejemplares de Kluyveromyces que
constituyen realizaciones preferidas de esta invención incluyen
K. lactis, K. fragilis, K. waltii, K. drosophilarum y
similares. La cepa preferida de Saccharomyces es S.
cerevisiae.
En el significado de la presente invención,
modificación genética significa, preferiblemente, cualquier
supresión, sustitución, deleción o adición de una o más bases o de
un fragmento de las secuencias de ADN de células de hongos. Tales
modificaciones genéticas pueden ser obtenidas in vitro
(directamente sobre ADN aislado) o in situ, por ejemplo por
técnicas de ingeniería genética o exponiendo las células de hongos
a agentes mutagénicos. Agentes mutagénicos incluyen, por ejemplo,
agentes físicos tales como rayos energéticos (rayos X, rayos \mu,
UV, etc.) o agentes químicos capaces de reaccionar con diferentes
grupos funcionales de ADN, como agentes alquilantes (EMS, NQO,
etc.),
agentes bis-alquilantes, agentes de intercalación, etc. También pueden obtenerse modificaciones genéticas por disrupción genética, por ejemplo según el método descrito por Rothstein et al. [Meth. Enzymol. 194 (1991), 281-301].
agentes bis-alquilantes, agentes de intercalación, etc. También pueden obtenerse modificaciones genéticas por disrupción genética, por ejemplo según el método descrito por Rothstein et al. [Meth. Enzymol. 194 (1991), 281-301].
Según este método, parte o todo el gen es
reemplazado, por recombinación homóloga, por una versión modificada
in vitro.
También pueden obtenerse modificaciones genéticas
mediante cualquier inserción mutacional en secuencias de ADN, como
elementos que pueden experimentar transposición (transposons, en
inglés), fagos, etc.
Además, se sabe que ciertas modificaciones tales
como las mutaciones puntuales pueden ser invertidas o atenuadas por
mecanismos celulares. Tales modificaciones pueden no proporcionar
las formas de células de hongos modificadas más útiles de esta
invención ya que sus propiedades fenotípicas pueden no ser muy
estables. La presente invención proporciona también un
procedimiento para preparar células de hongos modificadas en las que
las modificaciones (y, por tanto, las propiedades fenotípicas) son
estables durante la segregación y/o no inversión y/o no permeación.
Tales células de hongos modificadas son particularmente ventajosas
como huéspedes para la producción de productos recombinantes.
En consecuencia, una realización preferida de la
invención es una célula de hongos que porta una modificación o
modificaciones genéticas que son estables durante la segregación
y/o no inversión y/o no permeación. Estas modificaciones se
obtienen generalmente por deleción o deleciones o disrupción o
disrupciones.
La reducida capacidad de las células de hongos de
la invención para O-glicosilar proteínas puede
resultar, por tanto, de la producción de enzimas inactivas debido a
cambios estructurales y/o conformacionales, de la producción de
enzimas con propiedades biológicas alteradas, de la ausencia de
producción de dichas enzimas, o de la producción de dichas enzimas
a bajos niveles.
El camino de la O-glicosilación
de células de hongos implica la unión de un primer resto manosilo
al grupo hidroxilo de aminoácidos serilo y/o treonilo de proteínas
o péptidos y, después, la extensión a di- y
oligo-sacáridos O-enlazados por
adición posterior de restos manosilo. El primer resto manosilo se
transfiere desde
dolicol-monofosfasto-manosa
(Dol-P-Man) a la proteína en el
retículo endoplásmico, y los restos manosilo adicionales se
transfieren desde GPD-Man en el Golgi. Por el
contrario, las células eucarióticas (no fúngicas) superiores
O-glicosilan siguiendo un mecanismo diferente,
porque la etapa inicial es la unión covalente de
N-acetil-galactosamina a aminoácidos
serilo o treonilo, sin que ningún donante oligosacárido acoplado a
lípidos esté implicado en esta primera reacción, la etapa inicial
se produce en el Golgi, las estructuras de hidrocarburos son
diferentes, etc.
En la presente invención, las células de hongos
modificadas portan modificación o modificaciones genéticas en un
gen cuyo producto de expresión está involucrado en la unión de un
resto manosilo al grupo hidroxilo de los aminoácidos serilo o
treonilo.
Más específicamente, las células de hongos
modificadas portan modificación o modificaciones genéticas en un
gen cuyo producto de expresión está involucrado en la transferencia
de un resto manosilo desde el precursor
Dol-P-Man al grupo hidroxilo de los
aminoácidos serilo o treonilo. Por ello, este gen es el gen que
codifica la Dol-P-Man:Proteína
(Ser/Thr) manosil-transferasa [DPM2 - también
designada PMT1] cuya secuencia está representada en la Figura 4A, o
que codifica una proteína representada en la Figura 4B o cuya
secuencia o fragmentos de la misma está representada o están
representados en la Figura 7.
Además de la modificación o de las modificaciones
en el gen involucrado en la unión de restos manosilo al grupo
hidroxilo de aminoácidos serilo o treonilo como se ha mencionado
anteriormente, las células de hongos de la invención pueden portar,
también, modificación o modificaciones en los genes involucrados en
adiciones posteriores de restos manosilo que llevan a di- u
oligosacáridos, o en la síntesis de donantes de restos manosilo
(Dol-P-Man).
Ejemplos específicos de tales células de hongos
se describen en los ejemplos.
Otro objeto de la invención reside en una célula
de hongo como se ha descrito anteriormente en la que se ha
introducido una secuencia de ADN exógeno.
En el significado de la presente invención, la
expresión secuencia de ADN exógeno incluye cualquier secuencia de
ADN que comprende uno o más genes que codifican una proteína deseada
para ser expresada y/o secretada en dicha célula. Una secuencia de
ADN de este tipo puede ser una secuencia de ADN complementario
(cADN), una secuencia artificial de ADN, una secuencia de ADN
genómico, una secuencia de ADN híbrido o una secuencia de ADN
sintética o semisintética, incluida en una expresión cassete que
permite la síntesis en las células de hongos de dichas proteínas.
La expresión cassete comprende, preferiblemente, una región de
iniciación de transcripción y traducción unida al extremo 5' de la
secuencia que codifica dicha proteína o proteínas deseadas para
dirigir, y opcionalmente regular, la transcripción y traducción de
dicha secuencia. La elección de estas regiones puede variar según
la célula de hongo utilizada. Generalmente, estas secuencias se
escogen de promotores y o finalizadores derivados de genes de
células de hongos, y, cuando se busca la expresión en huéspedes de
levadura, de genes de levadura. De especial interés son ciertas
regiones de promotores y/o finalizadores derivados de genes
glicolíticos de células de hongos tal como, para las levaduras, los
genes que codifican la fosfoglicerato-quinasa
(PGK, en inglés),
gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa
(GDP, en inglés), enolasas (ENO, en inglés) o
alcohol-deshidrogenasas (ADH, en inglés), y
para los hongos filamentosos, los genes que codifican la
triosa-fosfato-isomerasa
(tpi, en inglés). Las regiones promotoras y/o finalizadoras
pueden derivar, también, de otros genes fuertemente expresados
tales como, para las levaduras, el gen lactasa (LCA4, en
inglés), el gen ácido-fosfatasa (PH05, en
inglés), el gen alcohol-oxidasa (AOX, en inglés) o
el gen metanol-oxidasa (MOX, en inglés), y,
para hongos filamentosos, el gen celobiohidrolasa (CBHI, en
inglés), el gen alcohol-deshidrogenasa (alcA,
alcC, en inglés), el gen glucoamilasa (GAM, en
inglés), o el gen acetamidasa (amds), y similares. Estas regiones
de iniciación de la transcripción y de la traducción pueden ser,
además, modificadas, por ejemplo, mediante mutagénesis in
vitro, por introducción de elementos de control o secuencias
sintéticas adicionales, o mediante deleciones. Por ejemplo, los
elementos que regulan la transcripción, tales como los denominados
UAS, que se originan de otros promotores pueden ser usados para
construir promotores híbridos que permiten la fase de crecimiento
del cultivo de células de hongos que han de separarse de la fase de
expresión de la proteína o proteínas deseadas que codifican la
secuencia o secuencias. También puede ser colocada en el extremo 3'
de la secuencia codificante una región de finalización de la
transcripción o de la traducción, funcional en la célula de hongos
proyectada. Además, en el extremo N de la secuencia de la proteína,
puede introducirse un péptido señal (pre-secuencia)
para dirigir la proteína naciente al camino secretor de la célula
de hongo usada. Esta pre-secuencia puede
corresponder a la pre-secuencia natural de la
proteína si esta proteína es secretada de forma natural, o puede
ser de otro origen, por ejemplo obtenida de otro gen, o incluso
artificial.
Preferiblemente, la secuencia del ADN exógeno es
parte de un vector, que puede replicarse de forma autónoma en la
célula de hongos usada o integrarse en sus propias secuencias de
ADN (cromosoma). Los vectores que se replican de forma autónoma
pueden contener secuencias que se replican de forma autónoma
derivadas del ADN cromosómico de la célula de hongos (ARS) o de
plásmidos de célula de hongos que aparecen en la naturaleza tal
como pGK1 [de Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154 (1982),
737], pKD1 (documento EP 241 435), plásmido de 2 \mum (Broach,
Cell 28 (1982), 203-204) y similares. Los
vectores integradores contienen, normalmente, secuencias homólogas
a regiones del cromosoma de la célula de hongos que, después de ser
introducidas en dicha célula, permiten la integración por
recombinación in vivo. En una realización específica de la
invención, dichas secuencias homólogas corresponden a la región del
cromosoma que va a ser modificado en la célula de hongos, que
permite un mecanismo de modificación-integración en
una etapa. La integración puede darse también por recombinación no
homóloga.
La secuencia de ADN exógeno puede ser introducida
en la célula de hongos por cualquier técnica conocida en la técnica
y, por ejemplo, por técnicas de ADN recombinante, cruzamientos
genéticos, fusiones de protoplastos, etc. Con relación a las
técnicas de ADN recombinante, pueden usarse transformación,
electroporación o cualquier otra técnica descrita en la literatura.
Más específicamente, cuando la célula de hongos es una célula de
levadura, la transformación puede ser realizada según los métodos
de Ito et al., [J. Bacteriol. 153 (1983), 163], Durrens et
al. [Curr. Genet. 18 (1990), 7] o siguiendo el método
descrito en el documento EP 361 991. La electroporación puede
realizarse según Karube et al. [FEBS Letters 82 (1985),
90].
Las células de hongos de la presente invención
pueden utilizarse ventajosamente como células huéspedes para la
preparación de productos recombinantes tal como proteínas
heterólogas con interés farmacéutico y/o agroalimentario. Las
células de hongos de esta invención son particularmente ventajosas
ya que permiten la preparación y/o secreción de productos de alta
calidad, y ya que sus modificaciones genéticas no afectan a la
estabilidad mitótica o genética de dichos vectores de expresión de
los productos. Las células de esta invención son más
particularmente adecuadas para la producción de proteínas con usos
terapéuticos humanos y que son susceptibles de
O-glicosilación por la célula huésped.
En consecuencia, un objeto adicional de esta
invención radica en un procedimiento para la preparación de
productos recombinantes en el que una célula de hongos como la
definida anteriormente se cultiva en condiciones en las que se
expresa la secuencia de ADN exógeno y el producto se recupera. En
una realización preferida, dicho producto es secretado en el medio
de cultivo. En otra realización preferida, dicho producto es
susceptible de O-glicosilación por la célula
huésped.
Las siguientes proteínas se citan como ejemplos
de proteínas heterólogas que pueden ser preparadas con las células
de hongos de la presente invención: enzimas (tales como
superóxido-dismutasa, catalasa, amilasas, lipasas,
amidasas, quimosina, etc., o cualquier fragmento o derivado de las
mismas), hemoderivados (tal como seroalbúmina humana, alfa- o
betaglobina, factor VIII, factor IX, factor de van Willebrand,
fibronectina, alfa-1 antitripsina, etc., o
cualquier fragmento o derivado de los mismos], insulina y sus
variantes, linfoquinas [tales como interleuquinas, interferones,
factores de estimulación de colonias (G-CSF,
GM-CSF, M-CSF...), TNF, TRF, etc.,
o cualquier fragmento o derivado de los mismos], factores del
crecimiento (tales como hormona del crecimiento, eritropoyetina,
FGF, EGF, PDGF, TGF, etc., o cualquier fragmento o derivado de los
mismos), apolipoproteínas, polipéptidos antigénicos para la
preparación de vacunas (hepatitis, citomegalovirus,
Eppstein-Barr, herpes, etc.), o cualquier
polipéptido de fusión tal como, por ejemplo, fusiones que
comprenden un resto activo ligado a un resto estabilizante.
Otro objeto de la invención radica en un
fragmento de ADN que codifica una enzima involucrada en la unión de
restos de manosilo al grupo hidroxilo de aminoácidos serilo o
treonilo de proteínas. El solicitante ha proporcionado fragmentos
de ADN que codifican por primera vez tales enzimas. Más
específicamente, dicho fragmento de ADN comprende el gen
Dol-P-Man:Proteína (Ser/Htr)
manosil-transferasa cuya secuencia se representa en
la Figura 4A, que codifica una proteína representada en la Figura
4B o cuya secuencia se representa en la Figura 7, o fragmentos de
la misma.
En el significado de la presente invención, gen
homólogo significa cualquier otro gen de cualquier célula de hongos
que codifica una enzima con la actividad requerida. Dichos otros
genes pueden obtenerse, por ejemplo, por complementación de una
célula de hongos mutante, deficitaria en dicha actividad, con ADN
preparado a partir de una célula de hongos capaz de dicha actividad,
selección de los transformantes con la actividad recuperada, y
aislar su secuencia de ADN insertada. Estos otros genes pueden,
también, ser aislados de librerías de ADN por hibridación con sonda
o sondas (incluidos cebadores con PCR) que comprenden toda o parte
de la secuencia presentada en la Figura 4. A este respecto, es
también un objeto de esta invención usar los fragmentos de ADN
proporcionados, o cualquier parte de los mismos, como sonda o sondas
de hibridación o para la complementación de fenotipos mutantes, para
la obtención de genes homólogos de células de hongos.
El término derivado significa cualquier otro
fragmento de ADN preparado por cualquier modificación o
modificaciones genéticas y/o químicas de los genes mencionados
anteriormente. Dicha modificación o modificaciones genéticas y/o
químicas pueden ser cualquier supresión, sustitución, deleción o
adición de una o más bases o de una región de dichos genes, que
conducen o a una incrementada actividad de la enzima o al mismo
nivel de actividad o a una actividad de la enzima disminuida o nula
después de transformación en una célula huésped de hongos.
Figura 1: Mapa de restricción de plásmidos pDM3,
pMT4 y pMT1.
Figura 2: Subclonación del plásmido pDM3.
Figura 3: Estrategia de secuenciación del gen
PMT1.
Figura 4a: Secuencia de nucleótidos del gen
PMT1 (ID. SEC. nº 1).
Figura 4b: Secuencia de aminoácidos del gen
PMT1 (ID. SEC. nº 2)
Figura 5: Estructura y mapa de restricción de
pMT1.1/URA3.
Figura 6: Actividad de
O-glicosilación de S. cervisiae WT (panel A)
y MT (panel B).
Figura 7: Secuencia parcial de nucleótidos del
gen PMT1 de K. lactis (ID. SEC. nº 3).
Figura 8: Comparación de secuencias de
nucleótidos (Panel A) y de aminoácidos previstos (Panel B) entre el
gen PMT1 de S. cerevisiae (secuencias superiores) y el
homólogo de K. lactis (secuencias inferiores) aislados por
multiplicación con PCR del ADN genómico de K. lactis. Los
puntos representan identidad de secuencia, los signos de
interrogación indican ambigüedad de secuencia. La secuencia de
nucleótidos complementaria al cebador Sq3910 está subrayada.
La actividad manosiltransferasa se solubilizó de
membranas totales de levadura y se purificó en hidroxilapatito
según Strahl-Bolsinger y Tanner (Eur. J. Biochem.
196 (1991), 185). La proteína tenía que ser entonces
enriquecida, además, por precipitación con
(NH_{4})_{2}SO_{4} antes de que se realizara la
purificación adicional mediante cromatografía de afinidad. El
material eluido se separó luego en SDS/PAGE. La banda de 92 kDa
resultante se cortó del gel. La digestión con tripsina (en el gel)
produjo varios péptidos no solapantes, permitiendo el diseño de
sondas.
100 ml de fracciones de la columna de
hidroxilapatito conteniendo actividad manosiltransferasa se
mezclaron con (NH_{4})_{2}SO_{4} hasta una
concentración final del 30% (peso/volumen) y se agitaron suavemente
durante 1 h en un baño de hielo/sal. La mezcla se centrifugó
durante 30 minutos (a 8.000 x g). El gránulo resultante se
resuspendió en 8 ml de tampón-AB (Tris/HCl 10 mM,
pH 7,5, glicerol al 15% (% en vol), lubrol al 0,1% (% en vol), NaCl
150 mM) y se dializó durante 1 h contra el mismo tampón.
Almacenamiento: -20ºC.
0,5 g de polvo liofilizado de Proteína
A-Sefarosa Cl 4B se hincharon en 10 ml de NaPi 100
mM, pH 7,0, durante 15 minutos y se lavaron en un filtro de vidrio
sinterizado (G3) con 200 ml del mismo tampón. La proteína
A-Sefarosa Cl 4B se equilibró en NaPi 100 mM, pH
7,0. Aproximadamente 3 a 6 ml de suero
anti-manosiltransferasa se dializaron durante 2 h
frente a 1 l de NaPi (100 mM), pH 7,0. El suero dializado se incubó
con el material de la columna durante 16 h a 4ºC. El suero se
retiró usando un filtro de vidrio sinterizado (G3). El material de
la columna se lavó dos veces con 10 ml de NaPi 100 mM, pH 8,5, y se
resuspendió en 50 ml del mismo tampón.
Para acoplamiento covalente, se añadieron 0,75
mg/ml de dimetilsuberimidato. El pH se ajustó a pH 8,5 añadiendo
5-6 gotas de NaOH 1 M. El material se incubó
durante 1 h a temperatura ambiente. Por una segunda vez, se añadió
dimetilsuberimidato y el pH se ajustó a pH 8,5 con NaOH 1M. El
material de la columna se lavó consecutivamente sobre un filtro de
vidrio sinterizado (G3) con:
a) 50 ml de NaPi 100 mM, pH 8,0
b) 25 ml de NaPi 100 mM, pH 8,0, rodanina amónica
3 M
c) 100 ml de NaPi 100 mM, pH 8,0
El material se lavó y se equilibró en
tampón-AB.
8 ml de la proteína precipitada con
(NH_{4})_{2}SO_{4} y dializada (E.1.1) se incubaron
con el material de la columna de afinidad (E.1.2.1.) durante 16 h a
4ºC con suave agitación. Una columna (2 cm x 0,5 cm) se rellenó y se
lavó con 15 ml de tampón- AB. La columna se eluyó con glicina/HCl
100 mM, pH 3,0, lubrol al 0,05% (% en vol.), glicerol al 15% (% en
vol.). Se recogieron fracciones de 0,9 ml y se neutralizaron
inmediatamente con Tris 1M (15 \mul/ fracción de 0,9 ml).
Para detectar la proteína de 92 kDa, 40 \mul de
cada fracción eluida se analizaron por SDS/PAGE y análisis por
transferencia Western como se ha descrito
(Strahl-Bolsinger y Tanner, 1991). Las fracciones
que contienen proteína de 92 kDa (fracciones 2-6)
se reunieron y se concentraron hasta 100 \mul mediante
microconcentradores (Centricon/Amicon) por centrifugación a 5.000 x
g. Se añadieron 0,9 ml de EtOH al 98% y la proteína se precipitó
durante 16 h a -20ºC. La proteína precipitada se granuló por
centrifugación durante 30 minutos a 10.000 x g.
La proteína precipitada (E.1.2.2.) se resuspendió
en 150 \mul de tampón SDS-muestra
(Na_{2}CO_{3} 0,07 M, \beta-EtSH al 0,07%, SDS
al 2%, sacarosa al 12%, azul de bromofenol al 0,07%). La
electroforesis en SDS-gel según Lämli y Favre [J.
Mol. Biol. 80 (1973), 575] se llevó a cabo a
50-70 V usando la celda
BIORAD-Mini-Protean. Proteínas
estándares: Estándares de alto peso molecular (HMW, en
inglés)/Gibco BRL.
La proteína se detectó por coloreado con
Coomassie R250 al 0,05% (peso/volumen), isopropanol al 25% (% en
volumen), ácido acético al 10% (% en volumen), y decolorando en
ácido acético al 7,5% (% en volumen).
Después de la SDS-PAGE (E.1.3.),
se recortó la banda de la proteína de 92 kDa (aproximadamente 10
\mug de proteína). El fragmento de gel se cortó en pequeñas
piezas y se agitó tres veces durante 30 minutos en 5 ml de metanol
al 50%/ácido acético al 10% y una vez durante 30 minutos en 5 ml de
metanol al 50%. El gel se liofilizó durante 3 h. La digestión con
tripsina se llevó a cabo en 0,3 ml de carbonato de amonio e
hidrógeno 0,2 M/2 \mug de tripsina durante 16 h a 37ºC. El
sobrenadante se separó. La elución de los péptidos se hizo tres
veces durante 1 h a 37ºC en 0,2 ml de carbonato de amonio e
hidrógeno 0,2 M y una vez durante 1 h a 37ºC en 0,2 ml de carbonato
de amonio e hidrógeno 0,2 M/acetonitrilo al 30%. El material eluido
se reunió, se liofilizó y se resolvió en 0,2 ml de hidrocloruro de
guanidino 1 M/Tris/HCl 50 mM, pH 7,5. Los péptidos se separaron
usando una columna RP18 de fase inversa equilibrada en TFA al
0,13%. Los péptidos se eluyeron mediante acetonitrilo
(0-70%). Pudieron detectarse hasta 40 picos de
péptidos diferentes. Cinco de los picos principales se secuenciaron
via análisis secuencial automatizado según Edman (G. Allen en:
Sequencing of proteins and peptides, Laboratory Techniques en
Biochem. and Mol. Biol. 9, redactores: Burdon, R.H. y
Knippenberg, P.H.; Elsevier (1989)). Entre las secuencias obtenidas
de ese modo, tres fueron adecuadas para el diseño de
oligonucleótidos, que se presentan en la Tabla 1, siguiente.
| Pico | Secuencia peptídica |
| 15 | I S Y K P A S F I S K |
| 23 | E V S P Y G Y S G F D G D A |
| 34 | N L V E P H V Y E S |
Sobre la base de estas secuencias, se
sintetizaron químicamente los oligonucleótidos A-C,
usando el empleo del codón de S. cerevisiae (Guthrie y
Abelson en: The molecular biology of the yeast Saccharomyces;
redactores: J.N. Strathern, E.W. Jones, J.R. Broach (1982)). Los
oligonucleótidos A-C tienen las siguientes
características:
Oligonucleótido
A
Pico: 23
Secuencia de aminoácidos: G F D G D A
Oligodesoxinucleótido:
5'-G^{T}/_{C}GTCACCGTCGAANCC-3'
Degenerado 8 veces, trenza codificante, 17
nucleótidos
Oligonucleótido
B
Pico: 34
Secuencia de aminoácidos: E P H V Y E
Secuencia de ADN: 5'-
^{C}/_{T}TCGTAGAC^{G}/_{A}TG^{A}/_{T}GG^{T}/_{C}TC-3'
Degenerado 16 veces, trenza codificante, 18
nucleótidos
Oligonucleótido
C
Pico: 15
Secuencia de aminoácidos: I S Y K P A S F I S
K
Secuencia de aminoácidos: 5'-
ATTTC^{T}/_{A}TA^{T}/_{C}AA^{A}/_{G}CC^{A}/_{T}
GCTTC^{T}/_{A}
TT^{T}/_{A}AAA-3'
Degenerado 128 veces, trenza codificante, 33
nucleótidos
Los oligodesoxinucleótidos A-C
(E.1.4.) sintetizados químicamente se usaron para examinar la
librería de plásmidos del pCS19 del ADN genómico de levadura
(Sengstag y Hinnen, Nucl. Acids Res. 15 (1987), 233). Esta
librería se preparó mediante digestión parcial de ADN genómico de
levadura con Sau3A, y la clonación en el punto de restricción Bc1I
del pCS19 vector.
Los oligonucleótidos A-C se
marcaron por reacción quinasa, llevada a cabo según Maniatis et al.
(T. Maniatis, J. Sambrook, E.F. Fritsch (1989), Molecular cloning:
A Laboratory manual, C.S.H. Press). 40 pmol de
Oligodesoxinucleótidos se marcaron usando 50 \muCi
[\gamma-^{32}P]-ATP. Nucleótidos
exentos de radioactividad se retiraron usando "columnas NUC de
empuje con trampa" (Stratagene) según el manual de instrucción
del fabricante.
La librería de ADN (4.992 diferentes colonias
sencillas) se transfirió de microplacas de titulación a
nitrocelulosa. La hibridación de la colonia se realizó según
Grunstein y Hogness (PNAS 72 (1975), 3961) en las siguientes
condiciones:
- Prehibridación: Los filtros se incubaron a 44ºC
en 200 ml de 5 x Denhardt, 6 x NET, SDS al 0,1% (peso/volumen), 0,1
mg/ml de ADN de esperma de salmón, durante al menos 4 h (5 x
Denhardt: ficoll al 0,1%, polivinilpirrolidona al 0,1%, BSA al
0,1%; 6 x NET: NaCl 0,9 M, Tris-HCl 90 mM, pH 8,3,
AEDT 6 mM, pH 8,0).
- Hibridación: Los filtros se incubaron a 44ºC en
100 ml de 5 x Denhardt, 6 x NET, SDS al 0,1% (peso/volumen), 0,1
mg/ml de ADN de esperma de salmón, oligodesoxinucleótidos A y C
marcados (40 pmol cada uno). La hibridación se realizó durante 16
h.
- Condiciones de lavado: Los filtros se lavaron
tres veces en 50 ml 6 x SSC, SDS al 0,1% (peso/volumen) a 0ºC
durante 15 minutos.
Para detectar colonias positivas, los filtros se
expusieron a películas de rayos X durante 16 h, -70ºC. En estas
condiciones, se pudieron identificar 12 clones que reaccionan
positivamente.
Los 12 clones positivos se analizaron por
transferencia Southern usando tres diferentes
oligodesoxinucleótidos. Este análisis condujo a la identificación
de un clon positivo que reacciona con todos los tres
oligonucleótidos. Este clon se denominó pDM3.
Los 12 clones positivos se desarrollaron en 5 ml
de medio LB suplementado con ampicilina y su ADN se aisló según el
método de Birnbaum y Doly (Nucl. Acid. Res. 7 (1979),
1513).
1/10 de cada ADN plásmido aislado (plásmidos:
pDM1-pDM12) se digirieron con enzimas de
restricción EcoRI-XhoI (cada una 5 U), 1 x tampón
"uno para todos" (Pharmacia) en un volumen total de 20 \mul
durante 1 h a 37ºC. Los fragmentos de ADN se separaron en un gel de
agarosa al 1% y se transfirieron a nitrocelulosa según Maniatis et
al. (citado anteriormente). El análisis Southern se realizó usando
oligos A y B usando las mismas condiciones descritas por el examen
de la librería. La temperatura de hibridación para oligo A fue de
48ºC, para oligo B de 42ºC. Los clones 1, 2, 3, 5, 6, 7 y 11
reaccionaron positivamente con ambos oligodesoxinucleótidos. Estos
siete clones se analizaron además por análisis por transferencia
Southern. Tres manchas idénticas se prepararon por consiguiente, en
las que el ADN de los clones 1, 2, 3, 5, 6, 7 y 11 se digirió con
EcoRI-XhoI y se transfirió a nitrocelulosa como se
ha descrito. Las manchas 1, 2 y 3 se prehibridaron en 20 ml de 5 x
Denhardt, 6 x NET, SDS al 0,1% (peso/volumen), 0,1 mg/ml de ADN de
esperma de salmón a 50ºC durante 4 h. Cada mancha se hibridó luego
en 10 ml de 5 x Denhardt, 6 x NET, SDS al 0,1% (peso/volumen), 0,1
mg/ml de ADN de esperma de salmón, 40 pmol de oligonucleótidos
marcados durante 16 h. La temperatura de hibridación se indica en
la Tabla 2, a continuación. El lavado se realizó durante 10 minutos
a cada temperatura en 50 ml 2 x SSC, SDS al 0,1% (peso/volumen).
| Mancha | Hibridación con oligo | Temperatura de hibridación | Condiciones de lavado | Clones con |
| reacción positiva | ||||
| Mancha 1 | A | 25 | 2x10 min/25ºC | 1, 2, 3, 5, 6, 7, 11 |
| 1x10 min/35ºC | ||||
| Mancha 2 | B | 25 | 2x10 min/25ºC | 3, 5 |
| 1x10 min/35ºC | ||||
| Mancha 3 | C | 45 | 2x10 min/45ºC | 3 |
| 1x10 min/55ºC |
El clon 3 era el único clon que reacciona con
oligo A, B y C. El clon se denominó pDM3 y se analizó
posteriormente.
La digestión analítica con endonucleasas se
realizó en 1 x tampón "uno para todos" ("one for all", en
inglés) (Pharmacia), 0,2-0,5 \mug de ADN,
1-5 U de enzima de restricción en un volumen total
de 20 \mul durante 1 h a 37ºC.
La digestión preparativa se realizó en un volumen
total de 40-80 \mul con 1-10
\mug de ADN, 5-20 \mul de enzima de restricción,
1 x tampón "uno para todos" durante 2 h a 37ºC.
La separación de fragmentos de ADN se realizó
según Maniatis et al. (citado anteriormente).
Después de la separación, los fragmentos de ADN
se aislaron usando el "Estuche Geneclean" (Stratagene) según
el manual de instrucción del fabricante.
Los fragmentos de ADN se desfosforilaron con
fosfatasa alcalina según Maniatis et al. (citado
anteriormente).
Los fragmentos de ADN se ligaron en 1 x
T4-tampón de ligadura (Tris/HCl 50 mM, pH 7,5,
MgCl_{2} 10 mM, DTT 5 mM, ATP 1 mM) con 1 U de
T4-ADN ligasa (volumen total 10-15
\mul). La relación molar de ADN del vector: el inserto era 1:4 o
1:8. La cantidad absoluta de ADN era 20-50 ng.
Tiempo de incubación: 16 h a 14ºC o 5 h a 25ºC.
Se prepararon células competentes DH5\alpha\ de
E. coli según Hanahan (J. Mol. Biol. 166 (1983),
557). La transformación se realizó como se describe por Maniatis et
al. (citado anteriormente).
El ADN plásmido se preparó según Birnbaum y Doly
(citado anteriormente).
El análisis por transferencia Southern se realizó
usando las mismas condiciones descritas en E.3.
La secuenciación del ADN se hizo según el método
de Sanger et al. ( PNAS 74 (1977), 5463). Sólo se secuenció
ADN plásmido. Se usó el estuche de secuenciación de
T4-ADN Polimerasa (Pharmacia); el nucleótido
radiactivo era
[\alpha-^{35}S]-dATP (actividad
específica de 600 Ci/mmol).
Este ejemplo describe un análisis de restricción
de pDM3, la identificación de diferentes fragmentos de ADN
reconocidos por oligonucleótidos A, B o C y su subclonación. La
secuenciación de estos subclones permitió la identificación de un
ORF.
El ADN pDM3 se digirió con EcoRI, XhoI y
EcoRI-XhoI. El análisis por transferencia Southern
se realizó usando oligos A, B o C como diana.
El oligo A reconoce un fragmento EcoRI de 3,0 kb,
los oligos B y C reconocen un fragmento EcoRI-XhoI
de 1,1 kb. El fragmento EcoRI de 3,0 kb se subclonó en pUC19 (se
linealizó con EcoRI y se desfosforiló). El fragmento
EcoRI-XhoI de 1,1 kb se subclonó en pUC18 (se
linealizó con EcoRI-Sa1I, y se desfosforiló).
Subclones correctos se identificaron mediante análisis de
restricción y análisis por transferencia Southern usando oligos A o
B/C, respectivamente.
El subclon EcoRI de 3,0 kb se denominó pMT4, el
subclon EcoRI-XhoI de 1,1 kb se denominó pMT1. El
adicional análisis por restricción de pMT4 y pMT1 se realizó usando
diversas endonucleasas de restricción diferentes (por ejemplo:
PstI, HindIII y Bg1II). El análisis por transferencia Southern que
usa oligos A o B/C se llevó a cabo para definir la región exacta
de un posible ORF.
Mapas de restricción de pDM3, pMT4 y pMT1 se
muestran en la Figura 1.
Desde ambos extremos, los insertos ADN de
plásmidos pMT4 y pMT1 se secuenciaron usando cebadores universal e
inverso, cebando cerca del polienlazador de pUC19/pUC18. También,
como cebadores de secuenciación se usaron los oligos A, B y C. Los
datos de secuenciación dieron como resultado un ORF de
aproximadamente 400 pb en ambos lados del inserto de pMT1. También,
pMT4 mostró un ORF de aproximadamente 200 pb cuando se secuenciaron
con el cebador inverso. Usando estos datos de secuenciación, puede
deducirse una secuencia de aminoácidos. Esta secuencia de AA mostró
secuencias de péptidos conocidos del análisis de péptidos de la
proteína de 92 kDa (se encontraron péptidos correspondientes a los
picos 15, 23 y 34). Según estos datos, podía predecirse la
orientación 5'/3' del gen.
Otros varios subclones se estructuraron y
secuenciaron usando los cebadores universal e inverso de pUC18/19
(Figura 2).
Para la secuenciación se usaron también los
siguientes oligodesoxinucleótidos:
| Oligo | Secuencia (5'-3') | vector secuenciado |
| Oligo 6 | CCAACCAGACAACCACTGGG | pMT1 |
| 2713 | ||
| Oligo 7 | GACAGGCCACTAACAGCTTC | pMT4 |
| 697 | ||
| Oligo 8 | GATGTTGTATGCTGGTGTG | pMT4 |
| 840 | ||
| Oligo 9 | CATTGAGCGAGTTGGCAGGG | pMT4 |
| 1178 | ||
| Oligo 4 | GAACCTCATGTTTATGAA | pMT1 |
| 2189 |
Estos oligodesoxinucleótidos representan partes
de fragmentos de ADN nuevamente secuenciados.
Para secuenciar la región 5' del gen, se hicieron
deleciones con exoIII/judía mung del pMT4 vector. El pMT4 se
linealizó usando SphI (solapamiento 3'). El plásmido se cortó
después usando BamHI (solapamiento 5').
La deleción con exonucleasa III se realizó según
Roberts y Lauer (Meth. Enzymol. 68 (1979), 473), Henikoff
(Meth. Enzymol. 155 (1987), 156).
Los extremos superpuestos se retiraron mediante
nucleasa de judía mung. Los plásmidos resultantes se analizaron por
análisis de restricción usando HindIII y EcoRI.
El análisis de la secuencia de los clones se
llevó a cabo usando el cebador inverso de pUC19. La estrategia de
la secuencia se muestra en la Figura 3. Los datos de la secuencia
se dan en la Figura 4.
El ARN total se aisló de la cepa SEY2101 de
levadura (Mat. a, ade2-1, leu2-3,
112, ura3-52 (Emr et al. PNAS 80 (1983),
7080) según Domdey et al. (Cell 39 (1984), 611).
El ARN total se separó usando un gel de agarosa
formaldehído y se transfirió a nitrocelulosa como se describe por
Maniatis et al. (citado anteriormente).
El inserto de 1,1 kb de pMT1 se aisló por
digestión con EcoRI-PstI. El fragmento se purificó
usando el "Estuche Gene-clean"
(Stratagene).
200 ng del fragmento de ADN se marcaron con
[\alpha-^{32}P]-dCTP (50
\muCi) usando el juego de marcado "megaprime" (Amersham)
según el manual de instrucciones del fabricante.
El filtro de nitrocelulosa se prehibridó durante
2 h a 42ºC en 20 ml de 5 x Denhardt, 2 x SSC, SDS al 0,1%
(peso/volumen), formamida al 50% (vol/vol), 0,1 mg/ml de ADN de
esperma de salmón. La hibridación se realizó a 42ºC durante 16 h en
10 ml de 1 x Denhardt, 2 x SSC, SDS al 0,1% (peso/volumen),
formamida al 50% (vol/vol), 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmón,
200 \mug de fragmento EcoRI-PstI de 1,1 kb de
pMT1 marcado con
[\alpha\-^{32}P]-dCTP. El lavado
se hizo dos veces a temperatura ambiente y dos veces a 50ºC en 50
ml de 0,1 x SSC, SDS al 0,1% (peso/volumen). La hibridación de la
diana se detectó por exposición a película de rayos X (- 70ºC, 16
h). Se detectó un único mARN (ARN mensajero) con el tamaño de 3
kb.
Este procedimiento puede repetirse fácilmente por
la persona experta en la técnica con otras sondas derivadas de la
secuencia de la Figura 4 y con el ARN de otras fuentes (otras
células de hongos).
Una célula de S. cerevisiae deficiente en
actividad de O-glicosilación se preparó por
disrupción del gen, por inserción del gen URA3 en el lugar de
restricción HindIII del ORF identificado, en 1595 pb de la
secuencia de codificación.
El inserto de pMT1 de 1,1 kb se aisló como
fragmento EcoRI-PstI y se subclonó en un vector
pUC18 (se linealizó con EcoRI/PstI y se desfosforiló, sin sitio de
restricción HindIII en el polienlazador). El vector resultante se
denominó pMT1.1.
El pMT1.1. se linealizó con HindIII y se
desfosforiló. El fragmento HindIII de 1.1 kb de YEp24 (Julius et
al., Cell 37 (1984), 1075) que contiene el gen URA3
de S. cerevisiae se aisló y se subclonó en el pMT1.1. vector
linealizado con HindIII y desfosforilado. Los clones se
identificaron por análisis de restricción y se denominaron
pMT1.1/URA3 (Figura 5).
El pMT1.1/URA3 tiene una secuencia codificante de
PMT1 de 0,24 kb flanqueando un lado del gen URA3 y una
secuencia codificante de PMT1 de 0,86 kb flanqueando el otro. El
CsCl-ADN de pMT1.1/URA3 se preparó según Maniatis
et al. (citado anteriormente).
40 \mug de CsCl-ADN pMT1.1/URA3
se digirieron con SphI/EcoRI. Para comprobar que la digestión era
completa, parte del ADN digerido se analizó sobre un gel de agarosa
ADN. El digesto se trató, después, con fenol y el ADN se precipitó
con EtOH al 98% (Maniatis et al., citado anteriormente). El ADN se
resolvió en 10 \mul de TE, pH 8,0.
Las cepas SEY2101/2102 de S. cerevisiae
(Mat a/\alpha\, ura3-52, leu2-3,
112 (Emr et al., citado anteriormente) y SEY2101 (Mat a,
ura3-52, leu2-3, 112,
ade2-1) se transformaron con 5 \mul de pMT1.1/URA3
vector se digirió con EcoRI/SphI según el método de Ito et al. (J.
Bacteriol. 153 (1983), 163).
Los transformantes SEY2101/2102 se seleccionaron
en medio mínimo + Leu; los transformantes SEY2101 se seleccionaron
en medio mínimo + Leu + Ade.
Después de 3-4 días a 30ºC, los
transformantes pueden ser recogidos y puestos en placas en el mismo
medio por una segunda vez.
El ADN genómico de tres transformantes haploides
y células de tipo salvaje se aisló como se describe por Hoffmann y
Winston (Gene, 57 (1987), 267). 1\mug del ADN genómico se
digirió con XhoI/EcoRI, se separó en un gel de agarosa y se
transfirió a nitrocelulosa como se describe por Maniatis et al.
(citado anteriormente).
El transferido se prehibridó en 20 ml de 5 x
Denhardt's, 2 x SSC, SDS al 0,1% (peso/volumen), 0,1 mg/ml de ADN
de esperma de salmón, formamida al 50% (peso/volumen) durante 4 h a
42ºC.
La hibridación se permitió en 10 ml de la misma
solución añadiendo 200 ng de fragmento EcoRI/PstI de pMT1.1 de 1.1
kb marcado con
[\alpha\-^{32}P]-dCTP (véase
E.5.1.3) durante 16 h a 42ºC. El lavado se hizo dos veces a
temperatura ambiente en 50 ml de 2 x SSC, SDS al 0,1% (peso/volumen)
y dos veces a 68ºC en 50 ml de 1 x SSC, SDS al 0,1% (peso/volumen).
La detección de la señal por películas de rayos X. Las células de
tipo salvaje mostraron una única señal a 1.1 kb, reflejando el
fragmento EcoRI/XhoI sin inserción de URA3. En las cepas
fragmentadas no aparecía esta señal. En lugar de ésta, se reconoció
un nuevo fragmento de 2.2 kb por la diana de 1.1 kb, que representa
el fragmento EcoRI/XhoI de 1.1 kb que transporta la inserción de
URA3 de 1.1 kb.
Las células de tipo salvaje SEY2101 se
desarrollaron o sobre YPD (extracto de levadura 10 g/l; peptona10
g/l; dextrosa 20 g/l) o en medio mínimo + Ade, + Leu, + Ura. Las
células mutantes PMT1::URA3 SEY2101 se desarrollaron o en YPD o en
medio mínimo + Ade, + Leu. Las células se desarrollaron a 30ºC en un
agitador al baño María. La OD578 se midió cada 30 minutos después
de someter las células a ultrasonidos. Las células de tipo salvaje
y las mutantes muestran casi idéntico crecimiento en ambos medios
aunque, en algunos casos, las células mutantes pueden pegarse. Sin
embargo, tales células pueden separarse fácilmente por tratamiento
con ultrasonidos (someter durante 30 segundos a ultrasonidos en
baño de agua). Las características de crecimiento de estas células
se listan a continuación:
Tiempo de
generación:
- WT (de tipo salvaje): 99 min
- MT (de tipo mutante): 93 min
Número de
células:
- WT: 1 OD = 1,9 x 10^{7}
- MT: 1 OD = 1,9 x 10^{7}
Velocidad de
duplicación:
- WT: 0,61/h
- MT: 0,65/h
En un cultivo de crecimiento en forma
logarítmica, el 54,7% de las células de tipo salvaje y el 56% de
las células mutantes muestran brotes. Después de crecer durante 24
h en YPD, las células de tipo salvaje alcanzaron una OD578 de 11,4
y las células mutantes de 12,3.
La SEY2101 se desarrolló en 100 ml de medio
mínimo + Ade + Leu + Ura para OD578 = 0,5. La PMT1::URA3 SEY2101 se
desarrolló en 100 ml de medio mínimo + Ade, Leu para OD578 =
0,5.
Se llevaron a cabo dos preparados de cada cepa.
El trabajo se realizó en hielo; todos los tampones estaban a 4ºC.
40 OD de células se granularon y lavaron en 25 ml de TMA (Tris/HCl
50 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 7,5 mM). Las células se resuspendieron
en 100 \mul de TMA y se transfirieron a un tubo violax, se
añadieron 0,3 g de perlas de vidrio y las células se rompieron en un
vórtex atro veces durante 30 minutos (enfriando con hielo entre
intervalos de ruptura). El extracto se separó de las perlas de
vidrio usando una pipeta Pasteur. Las perlas de vidrio se lavaron
tres veces con 250 \mul de TMA. Todas las soluciones de lavado se
reunieron en una copa Eppendorf. La solución se centrifugó urante
15 segundos (10.000 x g). El sobrenadante se retiró y el gránulo se
resuspendió en 40 \mul de TMA (1 OD = 1 \mul)
Se ensayó la actividad de la enzima para 1 y 5
\mul de las membranas en bruto (E.7.2.1.) como se describe por
Strahl-Bolsinger y Tanner (citado anteriormente).
Se midieron dos muestras paralelas de células de tipo salvaje y
mutantes. Se muestran los valores medios de estas dos medidas
independientes.
| \mul de membranas | cpm/incubación^{1)} | |
| WT | 1 | 2786 |
| WT | 5 | 10289 |
| MT | 1 | 563 |
| MT | 5 | 1135 |
| ^{1)} Los valores de control (sin péptido) fueron 506 y 1031, respectivamente. |
En contraste con las células de tipo salvaje, las
células mutantes no muestran actividad manosiltransferasa in
vitro.
Las membranas (1 \mul de E.7.2.1) se incubaron
en 20 \mul de tampón SDS-muestra durante 1 h a
temperatura ambiente. Después, la SDS/PAGE y la transferencia
Western se realizaron como se describe por
Strahl-Bolsinger y Tanner (citados anteriormente).
Para la detección de anticuerpos, se usó el estuche ECL peroxidasa
(Amersham) según el manual de instrucciones del fabricante. Los
anticuerpos frente a la proteína de 92 kDa reaccionan
específicamente con una proteína de 92 kDa de membranas de tipo
salvaje. En las membranas mutantes, esta señal de 92 kDa no
aparece.
Para investigar glicosilación in vivo, se
dejaron crecer células de tipo salvaje y mutantes en presencia de
[^{3}H]-manosa. Después de que una pared celular
en bruto mas membrana se aislaron y se
O-glicosilaron, el material se liberó por
\beta-eliminación.
Células de tipo salvaje y mutantes se dejaron
crecer durante la noche en medio mínimo que contenía sacarosa como
única fuente de C. Un OD 7,5 del cultivo (OD578 =
1-2) se granuló y se lavó con 5 ml de H_{2}O
(precalentada a 30ºC). Las células se dejaron crecer en 5 ml de
YP/sacarosa al 0,5%/250 \muCi de [^{3}H]-manosa
en un agitador al baño María durante 2 h a 30ºC.
Un OD 5 de las células tratadas con
[^{3}H]-manosa se centrifugaron y se lavaron
tres veces con 1 ml de TMA. Las células se resuspendieron en 200
\mul de TMA y se rompieron con perlas de vidrio como se describe
en E.7.2.1. (10 \mul de muestra se usaron para el recuento de la
radioactividad correspondiente a la incorporación total). El
extracto se centrifugó luego durante 15 minutos (10.000 x g) y el
sobrenadante se retiró (100 \mul de muestra se usaron para el
recuento de la radioactividad correspondiente al material
soluble).
El gránulo se resuspendió en 1 ml de NaOH 0,1 N
(una muestra de 10 \mul se usó para el recuento de la
radioactividad correspondiente al material antes de la
\beta-eliminación). La incubación se mantuvo
durante 24 h a 30ºC.
El material \beta-eliminado se
desalinizó mediante una columna Dowex 50WS8/H^{+} (0,5 cm x 6
cm). La columna se saturó con manosa 0,5 M y se equilibró en agua.
La muestra con \beta-eliminación se cargó en la
columna y se lavó interiormente con 1,5 \mul de H_{2}O. El
flujo a su través se recogió (se usó una muestra de 100 \mul para
el recuento de la radioactividad correspondiente al material
\beta-eliminado) y se concentró hasta 10 \mul en
el speed-vac. Se realizó cromatografía de capa fina
sobre Silicagel 60 (Merck) en acetona:butanol:agua 75:15:15.
Patrones: manosa, sacarosa, estaquiosa y rafinosa. La prueba
cromatográfica se repitió una vez. Los azúcares se detectaron con
0,5 g de KMnO_{4} en 100 ml de NaOH 1 N. La radioactividad se
detectó mediante un escáner de capa fina (Berthold) (véase la Figura
6).
| Célula/cpm | Incorporación total | Material soluble | Material antes de la | Radioactividad del material |
| \beta-eliminación | \beta-eliminado | |||
| WT | 1,46 x 10^{7} | 2,23 x 10^{6} | 1,2 x 10^{7} | 1,2 x 10^{6} |
| MT | 1,46 x 10^{7} | 1,84 x 10^{6} | 0,79 x 10^{7} | 4,0 x 10^{5} |
Las células mutantes muestran glicosilación
reducida en comparación con las células de tipo salvaje. La
O-glicosilación en células mutantes es aproximadamente 40-50% menor que en las células de tipo salvaje.
O-glicosilación en células mutantes es aproximadamente 40-50% menor que en las células de tipo salvaje.
Se usó la S. cerevisiae de levadura que ha
de ser el sistema de preferencia cuando se desea preparar una
proteína heteróloga en una célula huésped de hongos. Sin embargo,
en los últimos años se ha demostrado que la productividad de la
levadura de panaderos es, a menudo, limitada, especialmente cuando
se requiere la secreción del producto al medio de cultivo. El uso de
sistemas de hongos distintos de S. cerevisiae es, por tanto,
preferible en numerosos casos [véanse Romanos et al., Yeast
8 (1992), 423-488; Fleer, Curr. Opinion
Biotechnol. 3 (1992), 486-496]. Uno de los
huéspedes de levadura alternativos está representado por el género
Kluyveromyces para el que se han encontrado superiores
rendimientos de secreción con respecto a varias proteínas de
interés comercial [por ejemplo, Van de Berg et al., Bio/Technology
8 (1990) 135-139]. El siguiente ejemplo
demuestra que la presente invención no se limita a levadura de
panaderos, ya que la secuencia del gen PMT1 aislado de S.
cerevisiae puede usarse entajosamente para la identificación de
genes que codifican actividades enzimáticas similares en otras
especies de hongos. Además, la información de la secuencia revelada
en la presente invención puede usarse también para la
identificación de genes relacionados que codifican la
manosiltransferasa en S. cerevisiae.
La región de la secuencia de nucleótidos de PMT1
que corresponde a la región central hidrófila de la proteína
manosiltransferasa se escoge para diseñar cebadores con PCR
[Polymerase-catalized Chain
Reaction, Saiki et al., Science 230 (1985),
1350-1354; Mullis y Faloona, Meth. Enzymol.
155 (1987), 335-350] para la multiplicación
de genes homólogos. La multiplicación requiere hi bridación,
también denominada reasociación, de estos ligonucleótidos
sintéticos con su ADN diana. La especificidad con la que se
multiplican las regiones individuales del ADN genómico depende de
las condiciones de la reacción PCR y del grado de homología entre
los cebadores y la secuencia de nucleótidos que ha de ser
multiplicada. Después de la etapa de reasociación, los cebadores
son extendidos usando una ADN-polimerasa
termoestable. Una vez que la trenza complementaria ha sido
polimerizada, las dos trenzas se separan mediante desnaturalización
por calor y puede comenzar un nuevo ciclo de reasociación y de
polimerización.
En la Tabla 2 siguiente, se presentan cuatro
ejemplos de oligonucleótidos adecuados como cebadores para la
multiplicación con PCR de homólogos PMT1.
| Designación del cebador | Secuencia de nucleótidos |
| Sq3908 | 5'-ATGGAYGCNAAYAAYGAYTGG-3' |
| Sq3909 | 5'-GAYGCNAAYGAYGAYTGGGT-3' |
| Sq3910 | 5'-TCYTGYTGYTCRAANCCCCA-3' |
| Sq3911 | 5'-CTRTTRTTYTCNCCCCARTA-3' |
El diseño de estos oligonucleótidos
"degenerados" tiene en cuenta que varios codones pueden
contener la información para la incorporación del mismo aminoácido
en una cadena polipeptídica naciente, lo más frecuentemente variando
en la tercera posición ("rotación fuera del plano") de un
triplete. Cada cebador representa, por tanto, una mezcla de
oligonucleótidos en la que Y significa C o T, R significa A o G, y
N significa A, C, G o T.
El ADN genómico de la cepa CBS2359 de K.
lactis se preparó como se describe por Sherman et al.
["Methods in Yeast Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory
Presss (1986), pág. 127]. Se usaron 10 ng de ADN genómico en una
reacción estándar con PCR [Sambrook et al., "Molecular Cloning -
A Laboratory Manual", segunda edición, Cold Spring Harbor
Laboratory Press (1989)] en presencia de 1 \mug de cada uno de
los cebadores y formamida desionizada al 5%. La multiplicación se
realizó usando un "DNA Termal Cycler" (Perkin Elmer Cetus) y
"AmpliTag DNA Polymerase" (Perkin Elmer Cetus, 5 unidades por
cada tubo de reacción). Las condiciones de la desnaturalización, de
la reasociación y de la polimerización (30 ciclos) fueron 91ºC (1
min), 42ºC (2 min) y 72ºC (3 min), respectivamente, excepto para el
primer ciclo en el que la desnaturalización era durante 5 min. Los
resultados de las multiplicaciones con PCR usando los cebadores
descritos anteriormente se presentan en la Tabla 3 siguiente.
| Combinaciones de iniciadores | Tamaño aproximado de fragmentos de ADN multiplicados (pb) | |
| esperado para el homólogo | observado | |
| PMT1 | ||
| Sq3908+Sq3910 | 400 | 400 |
| Sq3908+Sq3911 | 600 | 600 |
| Sq3909+Sq3910 | 170 | 170 |
| 300 | ||
| Sq3909+Sq3911 | 400 | 400 |
| 800 |
Estos resultados demuestran que no sólo es
posible obtener fragmentos que exhiben el mismo tamaño que el
esperado para el homólogo de K. lactis del gen PMT1 de S.
cerevisiae sino que, además, los fragmentos de ADN pueden
multiplicarse con gran especificidad que lo más probable corresponde
a otro gen que codifica una actividad enzimática estrechamente
relacionada.
El fragmento de 400 pb, multiplicado con la
combinación de cebador Sq3908+Sq3910, se subclonó en el pCRII vector
(TA Cloning^{®}, Invitrogen Corp.) siguiendo las indicaciones del
suministrador, y se secuenció parcialmente según el método descrito
en E.4.1.9. usando el cebador universal. La secuencia obtenida se
presenta en la Figura 7. La comparación de secuencias entre el gen
PMT1 de S. cerevisiae y el fragmento aislado del ADN genómico
de K. lactis mediante ultiplicación con PCR revela
identidad del 75% y del 80,5% en el nivel de nucleótidos y de
aminoácidos, respectivamente (Figura 8). El fragmento de ADN de 400
pb multiplicado puede usarse para convertir en diana un gen
marcador seleccionable para el lugar cromosómico PMT1 de K.
lactis en analogía con el experimento descrito en E.6. que
conduce a un gen fragmentado. Esto producirá una cepa de K.
lactis con actividad de manosiltransferasa específica Ser/Thr
reducida. Además, el fragmento multiplicado puede usarse como sonda
de hibridación homóloga para la clonación del gen PMT1 de K.
lactis completo usando procedimientos normalizados.
Claims (23)
1. Célula de hongos que porta una modificación o
modificaciones genéticas que están localizadas en la región
codificante o en regiones responsables de o involucradas en la
expresión y/o regulación transcripcional del gen que codifica una
proteína con actividad
Dol-P-Man:Proteína (Ser/Thr)
manosil-transferasa (PMT1) seleccionada del grupo
consistente en
- (a)
- moléculas de ADN que comprenden la secuencia de nucleótidos representada en la Figura 4A o fragmentos de la misma;
- (b)
- moléculas de ADN que codifican una proteína con la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 4B o fragmentos de la misma; o
- (c)
- moléculas que comprenden la secuencia del fragmento de 126 pb del gen PMT1 de Kluyveromyces lactis representado en la Figura 7, o fragmentos del mismo;
que causa o causan que dicha célula tenga al
menos una capacidad reducida de O-glicosilación
comparada con una célula de hongos que lleva la correspondiente
molécula de ADN no modificada como se define en (a) a (c).
2. Célula de hongos según la reivindicación 1, en
la que dicha modificación o modificaciones comprenden cualquier
supresión, sustitución, deleción, adición, disrupción y/o inserción
mutacional.
3. Célula de hongos según la reivindicación 2, en
la que dicha modificación o modificaciones son estables durante la
segregación y/o no inversión y/o no permeación.
4. Célula de hongos según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que la reducida capacidad de
O-glicosilación resulta de la producción de enzimas
inactivas, de la producción de enzimas con propiedades biológicas
alteradas, de la ausencia de producción de dichas enzimas o de la
producción de dichas enzimas a bajos niveles.
5. Célula de hongos según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, que comprende, además, modificación o
modificaciones en uno o más genes involucrados en adiciones
posteriores de residuos manosilo, o en la síntesis de donantes de
residuos manosilo (Dol-P-Man).
6. Célula de hongos según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que se ha introducido una
secuencia de ADN exógeno.
7. Célula de hongos según la reivindicación 6, en
la que la secuencia de ADN exógeno comprende uno o más genes que
codifican una proteína deseada que ha de ser expresada y/o
secretada en dicha célula.
8. Célula de hongos según la reivindicación 7, en
la que dicha secuencia de ADN está incluida en una cassete de
expresión que comprende una región de iniciación de la
transcripción y de la traducción unida al extremo 5' de dicha
secuencia de ADN que codifica la proteína o proteínas deseadas.
9. Célula de hongos según la reivindicación 8, en
la que dicha región de iniciación de la transcripción y de la
traducción se escoge de promotores derivados de genes de células de
hongos.
10. Célula de hongos según las reivindicaciones 8
ó 9, en la que dicha cassete de expresión comprende, además, una
región de terminación de la transcripción y de la traducción en el
extremo 3' de la secuencia de ADN que codifica la proteína o
proteínas deseadas.
11. Célula de hongos según una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10, en la que dicha cassete de expresión
comprende, además, un péptido señal (pre-secuencia)
en el extremo N de la secuencia de la proteína deseada para dirigir
la proteína naciente al camino secretor de dicha célula de
hongos.
12. Célula de hongos según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 11, en la que la secuencia de ADN exógeno es
parte de un vector que puede replicarse de forma autónoma en dicha
célula de hongos o integrarse en sus propias secuencias de ADN
(cromosoma).
13. Célula de hongos según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que ésta se escoge de hongos
filamentosos y levaduras.
14. Célula de hongos según la reivindicación 13,
en la que la levadura se escoge del grupo constituido de
Kluyveromyces y Saccharomyces.
15. Procedimiento para preparar productos
recombinantes, en el que una célula de hongos según una cualquiera
de las reivindicaciones 6 a 14 se cultiva en condiciones en las que
se expresa la secuencia de ADN exógeno y el producto se
recupera.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que dicho producto se secreta en el medio de cultivo.
17. Procedimiento según la reivindicación 15 ó
16, en el que dicho producto es susceptible de
O-glicosilación por la célula de hongos.
18. Una molécula de ADN que comprende un gen que
codifica la Dol-P- Man:Proteína (Ser/Thr)
manosil-transferasa de una especie de
Saccharomyces, teniendo dicho gen la secuencia dada en la
Figura 4A.
19. Una molécula de ADN que comprende un gen que
codifica la Dol-P- Man:Proteína (Ser/Thr)
manosil-transferasa de una especie de
Kluyveromyces, conteniendo dicho gen la secuencia del
fragmento de 126 pb del gen PMT1 de Kluyveromyces lactis
dado en la Figura 7.
20. Una molécula de ADN que comprende un gen que
codifica la Dol-P- Man:Proteína (Ser/Thr)
manosil-transferasa:
- (a)
- que hibrida con la secuencia ADN de la reivindicación 18 ó 19; y/o
- (b)
- que representa fragmentos o derivados de la secuencia de ADN de la reivindicación 18 ó 19.
21. El uso de una molécula de ADN según una
cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 o cualquier parte de la
misma como sonda o sondas de hibridación o para complementar
fenotipos mutantes para la obtención de genes homólogos de células
de hongos.
22. Fragmento de ADN que es un fragmento o
fragmento degenerado debido al código genético del gen según la
reivindicación 18 y tiene la secuencia siguiente:
- 5'ATGGAYGCNAAYAAYGAYTGG-3',
- 5'-GAYGCNAAYGAYGAYTGGGT-3',
- 5'-TCYTGYTGYTCRAANCCCCA-3', o
- 5'-CTRTTRTTYTCNCCCCARTA-3'.
23. Uso del fragmento de ADN o del fragmento
degenerado según la reivindicación 22 como un cebador con PCR.
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