ES2321948T3 - Tecnica de expresion genetica. - Google Patents

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Abstract

Método para la producción de una proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 µm comprendiendo: (a) el suministro de una célula huésped comprendiendo un plásmido de familia de 2 µm, el plásmido comprendiendo un gen codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de una proteína chaperona y un gen codificante de una proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 µm; (b) el cultivo de la célula huésped en un medio de cultivo en condiciones que permiten la coexpresión de la proteína de gen codificante comprendiendo la secuencia de la proteína chaperona y el gen codificante de una proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 µm; y (c) purificación de la proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 µm expresada a partir de la célula huésped cultivada o del medio de cultivo.

Description

Técnica de expresión genética.
Campo de la invención
La presente aplicación se refiere a técnicas de expresión genética.
Antecedentes de la intención
La clase de proteínas conocidas como chaperonas han sido definidas por Hartl (1996, Nature, 381, 571-580) como una proteína que se enlaza con y estabiliza además otro conformador inestable de otra proteína y, por unión y liberación controlados, facilita su difusión adecuada in vivo, plegado, ensamblaje oligomérico, transporte en un compartimiento subcelular particular, o disposición por degradación.
BiP (también conocida como GRP78, proteína de unión de cadena pesada lg y Kar2p en levadura) es una chaperona abundante de \sim70 kDa de la familia hsp 70, residente en el retículo endoplásmico (ER), la cual, entre otras funciones, sirve para ayudar al transporte en el sistema secretor y las proteínas plegadas.
La proteína disulfuro isomerasa (PDI) es una proteína chaperona, residente en el ER que está implicada en la catálisis de formación de unión de disulfuro durante el proceso postranslacional de proteínas.
Estudios de la secreción de ambas proteínas nativas y foráneas han demostrado que el tránsito del ER hacia el Golgi es la etapa limitante. Puntos evidentes para una asociación transitoria de la BiP con proteínas normales y una interacción más estable con formas mutantes o no plegadas de una proteína. El resultado es que la BiP puede tener un papel doble en la solubilización de precursores de pliegue y en la prevención del transporte de proteínas desplegadas y no ensambladas. Robinson y Wittrup, 1995, Biotechnol. Prog. 11, 171-177, han examinado el efecto de secreción de proteína foránea en BiP (Kar2p) y PDI, los niveles de proteína en Saccharomices cerevisiae y han descubierto que la expresión constitutiva prolongada de proteínas segregadas foráneas reduce el BiP y PDI solubles a niveles no detectables por un análisis Western. La reducción de niveles de chaperona ER y de foldasa como una consecuencia de la secreción de proteína heteróloga tiene implicaciones importantes con respecto a intentos de mejorar los sistemas de expresión/secreción de la levadura.
La expresión de chaperonas está regulada por varios mecanismos, incluyendo la respuesta a proteínas desplegadas (UPR).
Con el uso de técnicas recombinantes, se ha demostrado que unas copias de gen de PDI múltiples pueden incrementar los niveles de proteína PDI en una célula huésped (Farquhar et al, 1991, Gene, 108, 81-89).
La coexpresión del gen codificante de PDI y de un gen codificante de una proteína heteróloga enlazada por disulfuro fue sugerida primero en WO 93/25676, publicado el 23 de diciembre de 1993, como un medio de incremento de la producción de proteína heteróloga. WO 93/25676 revela que la expresión recombinante de proteína anticoagulante de antistasina y de garrapata puede ser incrementada por coexpresión con PDI.
Esta estrategia ha sido explotada para incrementar la expresión recombinante de otros tipos de proteína.
Robinson et al, 1994, Bio/Technology, 12, 381-384 reveló que una copia génica de PDI adicional recombinante en Saccharomices cerevisiae podía ser usada para incrementar la expresión recombinante de un homodímero B de factor de crecimiento derivado de plaquetas humanas (PDGF) diez veces y fosfatasa ácida de Schizosacharomices pombe cuatro veces.
Hayano et al, 1995, FEBS Letters, 377, 505-511 describieron la coexpresión de lisozima humana y de PDI en levadura. Unos incrementos de aproximadamente 30-60% en producción funcional y secreción de lisozima eran observados.
Shusta et al, 1998, Nature Biotechnology, 16, 773-777 revelaron que la expresión recombinante de fragmentos de anticuerpo de cadena única (scFv) en Saccharomyces cerevisiae podía ser incrementada entre 2-8 veces por sobreexpresión de PDI en la célula huésped.
Bao & Fukuhara, 2001, Gene, 272, 103-110 revelaron que la expresión y secreción de albúmina de suero humano recombinante (rHSA) en la levadura Kluyveromices lactis podía ser incrementada de 15 veces o más por coexpresión con una copia recombinante adicional del gen de PDI de levadura (KIPDI1).
Para producir levadura cotransformada comprendiendo ambos gen de PDI y un gen para una proteína heteróloga, WO 93/25676 mostró que los dos genes pueden ser integrados cromosómicamente; uno de ellos puede ser integrado cromosómicamente y el otro estará presente en un plásmido; cada gen puede ser introducido en un plásmido diferente; o ambos genes pueden ser introducidos en el mismo plásmido. WO 93/25676 ejemplificó la expresión de antistasina desde el plásmido pKH4\alpha2 en cepas de levadura que poseen una copia adicional integrada cromosómicamente de un gen de PDI (Ejemplos 16 y 17); expresión de antistasina del vector K991 con una copia génica de PDI adicional presente en un vector transportador de levadura multicopia denominado YEp24 (Botstein et al, 1979, Gene, 8, 17-24) (Ejemplo 20); y expresión de la antistasina y los genes de PDI a partir del vector transportador de levadura pC1/1 (Rosenberg et al, 1984, Nature, 312, 77-80) bajo el control de los promotores GAL10 y GAL1, respectivamente. En efecto, Robinson y Wittrup, 1995, op. cit., utilizaron también la región intergénica GAL1-GAL10 para expresar la eritropoyetina y concluyeron que las cepas de levadura de producción para la secreción de proteínas heterólogas deberían ser construidas mediante el uso de promotores inducibles fuertemente reprimibles, por otra parte los efectos negativos de secreción sostenida (es decir BiP y PDI detectables reducidas) serían predominantes después de las numerosas generaciones de crecimiento celular requerido para rellenar un fermentador de gran escala.
Un trabajo posterior en el campo ha identificado la integración cromosómica de transgenes en forma de clave para maximizar la producción de proteína recombinante.
Robinson et al, 1994, op. cit., obtenía los incrementos observados en la expresión de PDGF y fosfatasa ácida de S. pombe mediante el uso de una copia génica adicional de PDI integrada cromosómicamente. Robinson et al revelaron que los intentos de uso del vector de expresión de 2 \mum multicopia para incrementar los niveles de proteína PDI tenían un efecto perjudicial en la secreción de proteína heteróloga.
Hayano et al, 1995, op. cit. describieron la introducción de genes para lisozima humana y PDI en un huésped de levadura cada una en un vector de integración linealizado separado, para provocar así la integración cromosómica.
Shusta et al, 1998, op. cit., revelaron que en sistemas de levadura, la elección entre la integración de un transgen en el cromosoma huésped contra el uso de vectores de expresión episómicos podía afectar manera importante la secreción y, en referencia a Parekh & Wittrup, 1997, Biotechnol. Prog., 13, 117-122, que la integración estable del gen scFv en el cromosoma huésped usando un vector de integración era superior al uso de un plásmido de expresión basado en 2 \mum. Parekh & Wittrup, op. cit., enseñaron previamente que la expresión del inhibidor de tripsina pancreática bovina (BPTI) era incrementada en un orden de magnitud usando de un vector de integración en lugar de un plásmido de expresión basado en 2 \mum. El plásmido de expresión basado en 2 \mum era considerado contraproductivo para la producción de proteína segregada heteróloga.
Bao & Fukuhara, 2001, op. cit., revelaron que "Primero, se pensaba que el gen KIPDI1 podía ser introducido directamente en el vector multicopia que transportaba el casete de expresión de rHSA. Sin embargo, se descubrió que tales constructos afectaban seriamente el crecimiento de la levadura y la estabilidad del plásmido. Esto confirmó nuestro descubrimiento anterior de que el gen KIPDI1 en un vector multicopia era perjudicial para el crecimiento de células K lactis (Bao et al, 2000)". Bao et. al, 2000, Yeast, 16, 329-341, como referido en el pasaje citado más arriba de Bao & Fukuhara revelaba que el gen KIPDII había sido introducido en K Lactis sobre un plásmido multicopia, plan707, y que la presencia del plásmido causaba el crecimiento pobre de la cepa. Bao et al concluyeron que una sobreexpresión del gen KIPDII era tóxica para las células K lactis. Según las conclusiones anteriores en Bao et al, Bao & Fukuhara eligen la introducción de una única duplicación de klPDII en el cromosoma huésped.
Martzen et al, 1999, Science, 286, 1153-1155 revela que un método para identificar genes de levadura especificando actividades bioquímicas, usando una estrategia genómica que es conocida por ser rápida, sensible, y ampliamente aplicable, fue desarrollada con un conjunto de 6144 cepas de levadura individual, cada una conteniendo un marco de lectura abierto de levadura diferente (ORF) fundida con S-transferasa de glutationa (GST). Para la identificación de actividades asociadas al ORF, las cepas fueron cultivadas en depósitos definidos, y los GST-ORF fueron purificados. Después, los depósitos fueron probados para determinar las actividades, y unos depósitos activos fueron deconvolutados para identificar las cepas de fuente.
Con respecto a estos antecedentes, hemos demostrado de forma inesperada que, al contrario de las sugerencias en la técnica anterior, cuando los genes para una proteína chaperona y una proteína heteróloga son coexpresados en un plásmido multicopia de familia 2 \mum en levadura, la producción de la proteína heteróloga es sustancialmente incrementada.
Descripción de la invención
Un primer aspecto de la presente invención provee un método para la producción de proteína heteróloga comprendiendo:
(a)
el suministro de una célula huésped comprendiendo un plásmido de familia 2 \mum, el plásmido comprendiendo un gen codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de una proteína chaperona y un gen codificante de una proteína heteróloga;
(b)
el cultivo de la célula huésped en un medio de cultivo en condiciones que permiten la coexpresión del gen codificante de la proteína chaperona y del gen codificante de una proteína heteróloga;
(c)
depuración de la proteína heteróloga expresada a partir del medio de cultivo; y
(d)
opcionalmente, liofilización de la proteína purificada.
En una forma de realización, la etapa (c) purifica la proteína heteróloga expresada de esta manera hasta un nivel comercialmente aceptable de pureza o un nivel farmacéuticamente aceptable de pureza.
Preferiblemente, el método comprende también la fase de formulación de la proteína heteróloga purificada con un portador o diluyente, tal como un portador o diluyente aceptable farmacéuticamente que presenta opcionalmente la proteína formulada en forma de dosis unitaria.
Un segundo aspecto de la presente invención provee, para el uso de un plásmido de familia 2 \mum en forma de vector de expresión para incrementar la producción de proteína heteróloga vertebrada o fúngica (preferiblemente levadura) mediante el suministro de un gen codificante de la proteína heteróloga y un gen codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de una proteína chaperona en el mismo plásmido de familia 2 \mum.
Un tercer aspecto de la presente invención provee un plásmido de familia 2 \mum comprendiendo un gen codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de una proteína chaperona y un gen codificante de una proteína heteróloga donde, si el plásmido se basa en el plásmido 2 \mum, entonces es un vector de desintegración.
Un cuarto aspecto de la invención provee una célula huésped comprendiendo un plásmido tal y como se ha definido anteriormente.
La presente invención se refiere a versiones modificadas de recombinación de plásmidos de familia 2 \mum.
Algunas especies relacionadas de cerca de levadura de injerto ha demostrado contener plásmidos de ADN de doble cadena circular producidos naturalmente. Estos plásmidos, llamados colectivamente plásmidos de familia 2 \mum, incluyen pSR1, pSB3 y pSB4 de Zygosaccharomyces rouxii (clasificados anteriormente como Zygosaccharomyces bisporus), plásmidos pSB1 y pSB2 de Zygosaccharomyces bailii, plásmido pSM1 de Zygosaccharomyces fermentati, plásmido pKD1 de Kluyveromyces drosfilarum, un plásmido sin nombre de Pichia membranaefaciens (a continuación "pPM1") y el plásmido 2 \mum y variantes (tales como Scp1, Scp2 y Scp3) de Saccharomyces cerevisiae (Volkert, et al., 1989, Microbiological Reviews, 53, 299; Murray et al, 1988, J. Mol. Biol. 200, 601; Painting, et al., 1984, J. Applied Bacteriology, 56, 331).
Como una familia de plásmidos estas moléculas comparten una serie de características comunes puesto que poseen típicamente dos repeticiones invertidas sobre unos lados opuestos del plásmido, tienen un tamaño similar de aproximadamente 6 kbp (rango de 4757 a 6615 bp), tres marcos de lectura abiertos, de los cuales uno codifica una recombinasa específica de sitio (FLP) y una secuencia de replicación autónoma (ARS), también conocida como un origen de replicación (ori), localizada cerca de la extremidad de una de las repeticiones invertidas. (Futcher, 1988, Yeast, 4, 27; Murray et al., op. cit., and Toh-e et al., 1986, Basic Life Sci. 40, 425). A pesar de estar desprovisto de homología de secuencia de ADN perceptible, su arquitectura molecular compartida y la preservación de la función de los tres marcos de lectura abiertos han demostrado un enlace ancestral común entre los miembros de la
familia.
Mientras que cualquiera de los plásmidos de familia 2 \mum anteriores producidos naturalmente pueden ser usados en la presente invención, esta invención no se limita al uso de plásmidos de familia 2 \mum producidos naturalmente. Para los objetivos de esta invención, un plásmido de familia 2 \mum es tal y como está descrito más abajo.
Un plásmido de familia 2 \mum es un plásmido de ADN de doble cadena, circular. Es típicamente pequeño, entre 3,000 a 10,000 pares de bases, preferiblemente entre 4,500 a 7000 bp, excluyendo las secuencias de recombinación insertadas.
Un plásmido de familiia de 2 \mum comprende típicamente al menos tres marcos de lectura abiertos ("ORF") que codifican cada uno una proteína que funciona en el mantenimiento estable del plásmido de familia 2 \mum como un plásmido multicopia. Las proteínas codificadas por los tres ORF pueden ser denominadas FLP, REP1 y REP2. Cuando un plásmido de familia 2 \mum no comprende los tres ORF completos codificantes de FLP, REP1 y REP2 entonces los ORF codificantes de la(s) proteína(s) faltante(s) deberían estar provistos en trans, en otro plásmido o bien por integración cromosómica.
Una proteína "FLP" es una proteína capaz de catalizar la recombinación específica de sitio entre secuencias de repetición invertidas reconocidas por FLP. Las secuencias de repetición invertidas son denominadas sitios (FRT) de blanco de recombinación de FLP y cada una está presente típicamente como parte de una repetición invertida más grande (ver más abajo). Proteínas FLP preferidas comprenden la secuencia de las proteínas FLP codificadas por uno de los plásmidos pSR1, pSB1, pSB2, pSB3, pSB4, pSM1, pKD1, pPM1 y el plásmido 2 \mum, por ejemplo tal y como está descrito en Volkert et al, op. cit., Murray et al, op. cit., and Painting et al., op. cit. Variantes y fragmentos de estas proteínas FLP están incluidas también en la presente invención. "Fragmentos" y "variantes" son los que retienen la capacidad de la proteína nativa para catalizar la recombinación específica de sitio entre las mismas secuencias FRT. Tales variantes y fragmentos presentarán normalmente al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, o más, homología con una proteína FLP codificada por uno de los plásmidos pSR1, pSB1, pSB2, pSB3, pSB4, pSM1, pKD1, pPM1 y el plásmido 2 \mum. Diferentes proteínas FLP pueden tener diferentes especificidades de secuencia de FRT. Un sitio FRT típico puede comprender una secuencia nucleótida de núcleo flanqueada por secuencias de repetición invertidas. En el plásmido 2 \mum, la secuencia de núcleo de FRT tiene 8 nucleótidos en longitud y las secuencias de repetición invertidas flanqueantes 13 nucleótidos en longitud (Volkert et al, op. cit.). No obstante el sitio FRT reconocido por cualquier proteína FLP provista puede ser diferente del sitio FRT de plásmido 2 \mum.
REP 1 y REP2 son proteínas implicadas en la subdivisión de copias de plásmidos durante la división celular, y pueden tener también un papel en la regulación de la expresión de FLP. Una divergencia importante de secuencia ha sido observada entre proteínas REP1 de distintos plásmidos de familia 2 \mum, mientras que no puede haber ninguna alineación de secuencia entre proteínas REP2 derivadas de distintos plásmidos de familia 2 \mum. Las proteínas REP1 y REP2 preferidas comprenden la secuencia de proteínas REP1 y REP2 codificadas por uno de los plásmidos pSR1, pSB1, pSB2, pSB3, pSB4, pSM1, pKD1, pPM1 y el plásmido 2 \mum por ejemplo tal y como está descrito en Volkert et al, op. cit., Murray et al, op. cit., and Painting et al, op. cit. Variantes y fragmentos de estas proteínas REP1 y REP2 están incluidos también en la presente invención. "Fragmentos" y "variantes" de REP 1 y REP2 son aquellos que, cuando están codificados por el plásmido en lugar del ORF nativo, no perturban esencialmente el mantenimiento de multicopia estable del plásmido en una población de levadura adecuada. Tales variantes y fragmentos de REP1 y REP2 tendrán normalmente una homología de al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, o más, con una proteína REP1 y REP2, respectivamente, codificada por uno de los plásmidos pSR1, pSB1, pSB2, pSB3, pSB4, pSM1, pKD1, pPM1 y el plásmido 2 \mum.
Las proteínas REP1 y REP2 codificadas por los ORF en el plásmido deben ser compatibles. Se prefieren proteínas REP1 y REP2 que tengan las secuencias de proteínas REP1 y REP2 codificadas por el mismo plásmido de familia 2 \mum de origen natural, tal como pSR1, pSB1, pSB2, pSB3, pSB4, pSM1, pKD1, pPM1 y el plásmido 2 \mum o variante o fragmentos de éste.
Un plásmido de familia 2 \mum comprende típicamente dos secuencias de repetición invertidas. Las repeticiones invertidas puede tener cualquier tamaño, siempre que éstas contengan cada una un sitio FRT (ver más arriba). Las repeticiones invertidas son típicamente altamente homólogas. Estas pueden compartir una cantidad superior a 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99. 5% o más identidad de secuencia. En una forma de realización preferida éstas son idénticas. Normalmente las repeticiones invertidas presentan cada una entre 200 a 1000 bp en longitud. Unas secuencias de repetición invertida preferidas pueden presentar cada una longitud de 200 a 300 bp, 300 a 400 bp, 400 a 500 bp, 500 a 600 bp, 600 a 700 bp, 700 a 800 bp, 800 a 900 bp, o 900 a 1000 bp. Unas repeticiones invertidas particularmente preferidas son las de los plásmidos pSR1 (959 bp), pSB1 (675 bp), pSB2 (477 bp), pSB3 (391 bp), pSM1 (352 bp), pKD1 (346 bp), el plásmido 2 \mum (599 bp), pSB4 o pPM1.
Las secuencias de las repeticiones invertidas pueden ser variadas. No obstante, las secuencias del sitio FRT en cada repetición invertida deberían ser compatibles con la especificidad de la proteína FLP codificada por el plásmido, para permitir así que la proteína FLP codificada actúe para catalizar la recombinación específica de sitio entre las secuencias de repetición invertidas del plásmido. La recombinación entre secuencias de repetición invertidas (y en consecuencia la capacidad de la proteína FLP para reconocer los sitios FRT con el plásmido) puede ser determinada por métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, un plásmido en una célula de levadura en condiciones que favorecen la expresión de FLP pueden ser probadas para cambios en el perfil de restricción del plásmido que será producido a partir de un cambio en la orientación de una región del plásmido con respecto o otra región del plásmido. La detección de cambios en el perfil de restricción indica que la proteína FLP es capaz de reconocer los sitios FRT en el plásmido y en consecuencia que el sitio FRT en cada repetición invertida es compatible con la especificidad de la proteína FLP codificada por el plásmido.
En una forma de realización particularmente preferida, las secuencias de repeticiones invertidas, incluyendo los sitios FRT, son derivadas del mismo plásmido de familia 2 \mum que el ORF codificante de la proteína FLP, tal como pSR1, pSB1, pSB2, pSB3, pSB4, pSM1, pKD1, pPM1 o el plásmido 2 \mum.
Las repeticiones invertidas están situadas típicamente con el plásmido de familia 2 \mum para que las dos regiones definidas entre las repeticiones invertidas (por ejemplo definidas como UL y US en el plásmido 2 \mum) tienen un tamaño aproximadamente similar, excluyendo secuencias introducidas exógenamente como los transgenes. Por ejemplo, una de las dos regiones puede tener una longitud equivalente a al menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más, hasta el 100%, de la longitud de la otra región.
Un plásmido de familia 2 \mum comprende típicamente el ORF codificante de FLP y una repetición invertida (denominada "IR1" de forma arbitraria para distinguirla de la otra repetición invertida mencionada en el siguiente párrafo) superpuesto de tal manera que ocurra la IR1 en la extremidad distal del ORF de FLP, sin ninguna intervención de secuencia codificante, por ejemplo como se ha visto en el plásmido 2 \mum. Por "extremidad distal" en este contexto entendemos la extremidad del ORF de FLP opuesta a la extremidad en la que el promotor inicia su transcripción. En una forma de realización preferida, la extremidad distal del ORF de FLP coincide con la IR1.
Un plásmido de familia 2 \mum comprende típicamente el ORF que codifica REP2 y la otra repetición invertida (denominada de manera arbitraria "IR2" para distinguirla de la IR1 mencionada en el párrafo precedente) superpuesta de tal forma que IR2 ocurre en el extremidad distal del ORF de REP2, sin ninguna intervención de secuencia codificante, por ejemplo como se ha visto en el plásmido 2 \mum. Por "extremidad distal" en este contexto definimos la extremidad del ORF de REP2 opuestos a la extremidad donde el promotor inicia su transcripción.
\newpage
En una forma de realización, los ORF codificantes de REP2 y FLP pueden estar presentes en la misma región de las dos regiones definidas entre las repeticiones invertidas del plásmido de familia 2 \mum, la cual región puede ser la más grande o más pequeña de las regiones (si existe alguna desigualdad de tamaño entre las dos regiones).
En una forma de realización, los ORF codificantes de REP2 y FLP pueden estar transcritos a partir de promotores divergentes.
Normalmente, las regiones definidas entre las repeticiones invertidas (por ejemplo definidas como UL y US en el plásmido 2 \mum) de un plásmido de familia 2 \mum no pueden comprender más de dos genes endógenos que codifican una proteína que funciona en el mantenimiento estable del plásmido de familia 2 \mum como un plásmido multicopia. Por consiguiente en una forma de realización preferida, una región del plásmido definida entre las repeticiones invertidas puede comprender menos ORF codificantes de FLP y REP2; FLP y REP1; o REP1 y REP2, como secuencia codificante endógena.
Un plásmido de familia 2 \mum comprende típicamente un origen de replicación (también conocido como una "secuencia de replicación autónoma ARS"), que es típicamente bidireccional. Cualquier secuencia ARS apropiada puede estar presente. Unas secuencias de consenso típicas de orígenes cromosómicos de levadura de replicación pueden ser apropiadas (Broach et al, 1982, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 47, 1165-1174; Williamson, Yeast, 1985, 1, 1-14). Las ARS preferidas incluyen las que son aisladas de pSR1, pSB1, pSB2, pSB3, pSB4, pSM1, pKD1, pPM1 y el plásmido 2 \mum.
De esta manera, un plásmido preferido de familia 2 \mum puede comprender los ORF codificantes de FLP, REP1 y REP2, dos secuencias de repetición invertidas, cada repetición invertida comprendiendo un sitio FRT compatible con la proteína FLP codificada, y una secuencia ARS. Preferiblemente los sitios FRT son derivados del mismo plásmido de familia 2 \mum como la secuencia de proteína FLP codificada. Más preferiblemente las secuencias de las proteínas REP1 y REP2 codificadas son derivadas del mismo plásmido de familia 2 \mum las unas con respecto a las otras. Aún más preferiblemente, los sitios FRT son derivados del mismo plásmido de familia de 2 \mum como la secuencia de proteínas FLP, REP1 y REP2 codificadas. Aún más preferiblemente, las secuencias de los ORF codificantes de FLP, REP1 y REP2, y la secuencia de las repeticiones invertidas (incluyendo los sitios FRT) son derivadas del mismo plásmido de familia 2 \mum. Además, el sitio de ARS puede ser derivado del mismo plásmido de familia 2 \mum como uno o más de los ORF de FLP, REP1 y REP2, y la secuencia de las repeticiones invertidas (incluyendo los sitios FRT).
El término "derivado de" incluye secuencias que poseen una secuencia idéntica a la secuencia de la son derivadas. No obstante variantes y fragmentos de éstas, tal y como se ha definido anteriormente, están incluidos también. Por ejemplo, un gen FLP que posee una secuencia derivada del gen FLP del plásmido 2 \mum puede tener un promotor modificado u otra secuencia reguladora en comparación con la del gen de origen natural.
Además o de forma alternativa, un gen FLP que posee una secuencia derivada del gen FLP del plásmido 2 \mum puede tener una secuencia nucleótida modificada en el marco de lectura abierto que puede codificar la misma proteína como el gen de origen natural, o puede codificar una proteína FLP modificada. Las mismas consideraciones se aplican a otras secuencias en un plásmido de familia 2 \mum que tiene una secuencia derivada de una fuente particular.
Opcionalmente, un plásmido de familia 2 \mum puede comprender una región derivada de la región STB (también conocida como REP3) del plásmido 2 \mum, tal como definido en Volkert et al, op. cit. La región STB en un plásmido de familia 2 \mum de la invención puede comprender dos o más secuencias de doble repetición, así como tres, cuatro, cinco o más. De forma alternativa, ninguna secuencia de doble repetición puede estar presente. Las dobles repeticiones puede tener cualquier tamaño, tal como 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 bp o más en longitud. Las repeticiones en serie en la región STB del plásmido 2 \mum tienen 62 bp en longitud. No es esencial que las secuencias de las dobles repeticiones sean idénticas. Una ligera variación de secuencia puede ser tolerada. Puede ser preferible seleccionar una región STB a partir del mismo plásmido como cada o ambos ORF de REP1 y REP2. Se cree que la región STB es un elemento de acción cis y preferiblemente no está transcrita.
Opcionalmente, un plásmido de familia 2 \mum puede comprender un ORF adicional que codifica una proteína que funciona en el mantenimiento estable del plásmido de familia 2 \mum como un plásmido multicopia. La proteína adicional puede ser denominada RAF o D. Los ORF codificantes del gen de RAF o D pueden estar vistos en, por ejemplo, el plásmido 2 \mum y pSM1. Por lo que un ORF de RAF o D puede comprender una secuencia adecuada para codificar el producto de proteína de los ORF de gen RAF o D codificados por el plásmido 2 \mum o pSM1, o variantes y fragmentos de éstos. Asimismo, variantes y fragmentos de los productos de proteína de los genes de RAF o D del plásmido 2 \mum o pSM1 están incluidos también en la presente invención. Los "fragmentos" y "variantes" de los productos de proteína de los genes de RAF o D del plásmido 2 \mum o pSM1 son los que, cuando están codificados por el plásmido 2 \mum o pSM1 en vez del ORF nativo, no perturban el mantenimiento de multicopia estable del plásmido al interior de una población de levadura adecuada. Tales variantes y fragmentos tienen típicamente una homología de al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, o más, con el producto de proteína de los ORF de gen RAF o D codificados por el plásmido 2 \mum o pSM1.
Un plásmido de familia 2 \mum de origen natural puede ser preferido. Un plásmido de familia 2 \mum de origen natural es cualquier plásmido que posee las características definidas más arriba, dicho plásmido existe naturalmente en la levadura, es decir que no ha sido modificado de forma recombinante para incluir una secuencia heteróloga. Preferiblemente el plásmido de familia 2 \mum producido naturalmente es seleccionado a partir de pSR1 (Nº de registro X02398), pSB3 (Nº de registro X02608) o pSB4 obtenido a partir de Zygosaccharomyces rouxii, pSB1 o pSB2 (Nº de registro NC 002055 o M18274) ambos obtenidos a partir de Zygosaccharomyces bailli, pSM1 (Nº de registro NC 002054) obtenido a partir de Zygosaccharomyces fermentati, pKD1 (Nº de registro X03961) obtenido a partir de Kluyveromyces drosophilarum, pPM1 de Pichia membranaefaciens o, más preferiblemente, el plásmido 2 \mum (Nº de registro NC 001398 o J01347) obtenido a partir de Saccharomyces cerevisiae. Los números de registro en este párrafo se refieren a depósitos NCBI.
El plásmido 2 \mum (figura 1) es un plásmido de ADN de doble cadena de 6,318 bp, endógeno en la mayoría de las cepas Saccharomices cerevisiae en 60-100 copias por genoma haploide. El plásmido 2 \mum comprende una pequeña región única (US) y una gran región única (UL), separadas por dos secuencias de repetición invertida de 599 bp. Una recombinación de sitio específica de las secuencias de repetición invertidas produce una interconversión entre la forma A y la forma B del plásmido in vivo (Volkert & Broach, 1986, Cell, 46, 541). Las dos formas de 2 \mum difieren sólo en la orientación relativa de sus regiones únicas.
Mientras que la secuenciación del ADN de un plásmido 2 \mum clonado (también conocido como Scp1) de Saccharomyces cerevisiae proporcionaban un tamaño de 6,318 bp (Hartley and Donelson, 1980, Nature, 286, 860), otras variantes ligeramente más pequeñas de 2 \mum, Scp2 y Scp3, son conocidas por su existencia como resultado de pequeñas deleciones de 125 bp y 220 bp, respectivamente, en una región conocida como STB (Cameron et al., 1977, Nucl. Acids Res., 4, 1429: Kikuchi, 1983, Cell, 35, 487 and Livingston & Hahne, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 3727). En un estudio, aproximadamente el 80% de cepas Saccharomyces naturales en el mundo contenían ADN homólogo a 2 \mum (por análisis de transferencia de Southern) (Hollenberg, 1982, Current Topics in Microbiology and Immunobiology, 96, 119). Además, una variación (polimorfismo genético) ocurre al interior de la población natural de plásmidos 2 \mum encontrados en S. cerevisiae y S. carlsbergensis, con la secuencia NCBI (número de registro NC 001398) en forma de ejemplo.
El plásmido 2 \mum tiene una localización nuclear y muestra un nivel elevado de estabilidad mitótica (Mead et al, 1986, Molecular & General Genetics, 205, 417). La estabilidad inherente, del plásmido 2 \mum procede de una amplificación del número de copias codificadas a partir de un plásmido y un mecanismo de división, que puede ser comprometido durante el desarrollo de vectores quiméricos (Futcher & Cox, 1984, J. Bacteriol., 157, 283; Bachmair & Ruis, 1984, Monatshefte für Chemie, 115, 1229). Una cepa de levadura, que contiene un plásmido 2 \mum es conocida como [cir^{+}], mientras que una cepa de levadura que no contiene plásmido 2 \mum es conocida como [cir^{0}].
La región US del plásmido 2 \mum contiene los genes de REP2 y FLP, y la región UL contiene los genes de REP1 y D (también conocidos como RAF), la localización STB y el origen de replicación (Broach & Hicks, 1980, Cell, 21, 501; Sutton & Broach, 1985, Mol. Cell. Biol., 5, 2770). El FLP de recombinasa se enlaza con sitios FRT (Blanco de reconocimiento Flp) al interior de las repeticiones invertidas para mediar la recombinación específica de sitio, que es esencial para la amplificación del plásmido natural y el control del número de copias de plásmidos in vivo (Senecoff et al, 1985, Proc. Natl. Acad Sci. U.SA., 82, 7270; Jayaram, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.SA., 82, 5875). El número de copias de plásmidos de familia 2 \mum puede verse afectado de manera importante por cambios en la actividad de recombinasa Flp (Sleep et al, 2001, Yeast, 18, 403; Rose & Broach, 1990, Methods Enzymol., 185, 234). Las proteínas Rep1 y Rep2 median la segregación de plásmidos, aunque su modo de acción sea confuso (Sengupta et al, 2001, J. Bacteriol., 183, 2306). También reprimen 
\hbox{la transcripción del gen FLP (Reynolds  et al ,
1987, mol. Cell.  Biol., 7, 3566).}
Los genes de FLP y REP2 del plásmido 2 \mum son transcritos a partir de promotores divergentes, aparentemente sin ninguna secuencia de intervención definida entre éstos. Las FLP y REP2 transcritas se terminan ambas en los mismos motivos de secuencia al interior de las secuencias de repetición invertidas, en 24 bp y 178 bp respectivamente después de su translación de codones de terminación (Sutton & Broach, 1985 mol. Cell. Biol., 5, 2770).
En el caso de FLP, la secuencia codificante C-terminal se extiende también al interior de la secuencia de repetición invertida. Además, las dos secuencias de repetición invertidas son altamente conservadas por encima de 599 bp, una característica considerada como ventajosa para una replicación de plásmido eficiente y una amplificación in vivo, aunque sólo los sitios FRT (menos de 65 bp) son esenciales para una recombinación específica de sitio in vitro (Senecoff et al, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. E.E.U.U., 82, 7270; Jayaram, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.SA., 82, 5875; Meyer-Leon et al, 1984, Cold Spring Harbor Symposia On Quantitative Biology, 49, 797). Los residuos catalíticos clave de FLP son arginina-308 y tirosina-343 (que es esencial) con un corte de cadena realizado por histidina-309 e histidina 345 (Prasad et al, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 2189; Chen et al, 1992, Cell, 69, 647; Grainge et al, 2001, J. Mol. Biol., 314, 717).
Dos dominios funcionales están descritos en Rep2. Los residuos 15-58 forman un dominio de enlace de Rep1, y los residuos 59-296 contienen una autoasociación y región de unión de STB (Sengupta et al, 2001, J. Bacteriol., 183, 2306).
Derivados de mutantes quiméricos o de gran deleción de 2 \mum que carecen de muchas de las regiones funcionales esenciales del plásmido 2 \mum pero que retienen el elemento cis funcional de ARS y STB, no pueden dividirse eficazmente entre células madre y hijas en un división celular. Tales plásmidos pueden realizarlo si estas funciones están provistas en trans, por ejemplo la provisión de un plásmido 2 \mum funcional al interior del huésped, tal como un huésped [cir^{+}].
\global\parskip0.900000\baselineskip
Los genes de interés han sido insertados previamente en la región UL del plásmido 2 \mum. Por ejemplo, véase el plásmido pSAC3U1 en EP 0 286 424 y el plásmido mostrado en la figura 2, que incluye un (gen \beta-lactamasa (para la resistencia a la ampicilina), un marcador seleccionable LEU2 y un enlazador de oligonucleótidos, éstos dos últimos están insertados en un sitio SnaBI único al interior de la región UL del vector de desintegración similar a 2 \mum, pSAC3 (ver EP 0 286 424). El ADN de E. coli entre los Sitios XbaI que contiene el gen de resistencia a la ampicilina es perdido del plásmido mostrado en la figura 2 después de su transformación en levadura. Este está descrito en Chinery & Hinchliffe, 1989, Curr. Genet., 16, 21 y EP 0 286 424, donde tales vectores son designados "vectores de desintegración". Otras inserciones de polinucleótidos pueden ser realizadas en un sitio NotI dentro de un enlazador (Sleep et al, 1991, Biotechnology (N Y), 9, 183).
Unos sitios de inserción alternativos en el plásmido 2 \mum son conocidos en la técnica, incluyendo aquellos descritos en Rose & Broach (1990, Methods Enzymol., 185, 234-279), como plásmidos pCV19; pCV20, CV_{neo}, que utilizan una inserción de EcoRI en FLP, plásmidos pCV21, pGT41 y pYE que utilizan EcoRI en D como sitio de inserción, el plásmido pHKB52 que utiliza PstI en D como sitio de inserción, plásmido pJDB248 que utiliza una inserción de PstI en D y EcoRI en D, el plásmido pJDB219 donde el PstI en D y EcoRI en FLP son usados como sitios de inserción, el plásmido G18, plásmido pAB18 que utiliza una inserción de atClal en FLP, los plásmidos pGT39 y pA3, plásmidos pYT11; pYT14 y pYT11-LEU que utilizan PstI en D como sitio de inserción, y el plásmido PTY39 que utiliza EcoRI en FLP como sitio de inserción.
Otro plásmidos 2 \mum y incluyen pSAC3, pSAC3U1, pSAC3U2; pSAC300; pSAC310, pSAC3C1, pSAC3PL1, pSAC3SL4, y pSAC3SC1 están descritos en EP 0 286 424 y Chinery & Hinchliffe (1989, Curr. Genet., 16, 21-25), los cuales describieron también PstI, EagI o SnaBI como sitios de inserción 2 \mum apropiados. Otros plásmidos 2 \mum incluyen pAYE255; pAYE316; pAYE443; pAYE522 (Kerry-Williams et al, 1998, Yeast, 14, 161-169), pDB2244 (WO 00/44772), y pAYE329 (Sleep et al, 2001, Yeast, 18, 403-421).
En una forma de realización preferida, uno o más genes son insertados en un plásmido de familia 2 \mum al interior de una región no transcrita alrededor de la secuencia ARS. Por ejemplo, en el plásmido 2 \mum obtenido a partir de S. cerevisiae, la región no transcrita alrededor de la secuencia ARS se extiende desde la extremidad del gen D hasta el inicio de la secuencia ARS. La inserción en SnaBI (cerca del origen de secuencia de ARS de replicación) está descrita en Chinery & Hinchliffe, 1989, Curr. Genet., 16, 21-25. El experto en la materia apreciará el hecho de que las inserciones génicas también pueden ser realizadas en la región no transcrita en posiciones próximas al sitio SnaBI descritas en Chinery & Hinchliffe.
En otra forma de realización preferida, los genes de REP2 y FLP en un plásmido de familia 2 \mum poseen cada uno una repetición invertida adyacente a éstos, y uno o más genes son insertados en un plásmido de familia 2 \mum al interior de la región entre la primera base después del último codón funcional de, o bien el gen de REP2 o el gen de FLP y la última base antes del sitio FRT en la repetición invertida adyacente a dicho gen. El último codón funcional de un gen de REP2 o bien de un gen de FLP es el codón en el marco de lectura abierto del gen que está más alejado abajo del promotor del gen cuya sustitución por un codón de detención producirá una pérdida inaceptable de estabilidad multicopia del plásmido, tal como definida aquí. De esta manera, la ruptura de los genes de REP2 o FLP en cualquier punto hacia abajo del último codón funcional en cualquier gen, por inserción de una inserción de secuencia de polinucleótidos, deleción o 
\hbox{sustitución, no producirá una pérdida inaceptable  de
estabilidad multicopia del plásmido.}
Por ejemplo, el gen de REP2 del plásmido 2 \mum puede ser interrumpido después del codón 59 y el gen de FLP del plásmido 2 \mum puede ser interrumpido después del codón 344, cada uno sin una pérdida de estabilidad multicopia del plásmido. El último codón funcional en genes equivalentes en otros plásmidos de familia 2 \mum puede ser determinado de forma rutinaria mediante la formación de mutantes de los plásmidos, en cualquiera de los genes de FLP o REP2 y siguiendo las pruebas establecidas aquí para determinar si el plásmido retiene la estabilidad multicopia.
Uno puede determinar si un plásmido retiene la estabilidad multicopia mediante el uso de una prueba tal como está definida en Chinery & Hinchliffe (1989, Curr. Genet., 16, 21-25). Para la levadura que no crece en el medio no selectivos (YPD, también designada YEPD) definida en Chinery & Hinchliffe (1989, Curr. Genet., 16, 21-25) otros medios apropiados no selectivos pueden ser usados. La estabilidad del plásmido puede ser definida en forma de células de porcentaje restantes prototróficas para el marcador seleccionable después de un número definido de generaciones. El número de generaciones preferiblemente será suficiente para mostrar una diferencia entre un plásmido de control, tal como pSAC35 o pSAC310, o para mostrar una estabilidad comparable a dicho plásmido de control. El número de generaciones pueden ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más. Los números más elevados son preferidos. La estabilidad de plásmido aceptable puede ser del 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99. 9% o esencialmente del 100%. Unos porcentajes más altos son preferidos. El experto en la materia apreciará el hecho de que, aunque un plásmido pueda tener una estabilidad inferior al 100% cuando ha crecido en medios no selectivos, este plásmido puede seguir en uso cuando es cultivado en medios selectivos. Por ejemplo el plásmido pDB2711 tal y como está descrito en los ejemplos es sólo 10% estable cuando la estabilidad ha sido determinada según la prueba del ejemplo 1, pero provee un incremento de 15 veces en la productividad de transferrina recombinante en un cultivo en vaso de agitación en condiciones de crecimiento selectivas.
De esta manera, una o más inserciones génicas pueden tener lugar entre la primera base después del último codón funcional del gen de REP2 y de la última base antes del sitio FRT en una repetición invertida adyacente a dicho gen, más preferiblemente entre la primera base de la repetición invertida y la última base antes del sitio FRT, incluso más preferiblemente en una posición después del codón de terminación de translación del gen de REP2 y antes de la última base antes del sitio FRT.
Además o de manera alternativa, una o más inserciones génicas pueden tener lugar entre la primera base después del último codón funcional del gen de FLP y de la última base antes del sitio FRT en una repetición invertida adyacente a dicho gen, preferiblemente entre la primera base de la repetición invertida y la última base antes el sitio FRT, más preferiblemente entre la primera base después de la extremidad de la secuencia codificante de FLP y la última base antes del sitio FRT, como en la primera base después de la extremidad de la secuencia codificante de FLP.
En una forma de realización preferida, donde el plásmido de familia 2 \mupm se basa en el plásmido 2 \mum de S. cerevisiae, es un vector de desintegración como se sabe en la técnica (ver por ejemplo EP 286 424). Un vector de desintegración puede ser un vector plásmido 2 \mum comprendiendo una secuencia de ADN destinada a ser perdida por recombinación, tres sitios FRT de 2 \mum, de los cuales un par de sitios está dispuesto en orientación directa y los otros dos pares están en orientación indirecta, y una secuencia de ADN de interés (tal como un origen E. coli de replicación y marcador seleccionable bacteriano), dicha secuencia debe ser perdida estando situada entre dichos sitios que están en orientación directa.
De esta manera, la secuencia que debe ser perdida puede comprender una secuencia de ADN de marcador seleccionable.
Un vector de desintegración preferido comprende un plásmido 2 \mum completo que lleva adicionalmente (i) una secuencia de ADN de plásmido bacteriano necesaria para la propagación del vector en un huésped bacteriano; (ii) un sitio FRT extra de 2 \mum; y una secuencia de ADN de marcador seleccionable para la transformación de la levadura; dicha secuencia de ADN de plásmido bacteriano estando presente y el sitio FRT extra creado en un sitio de restricción, tal como XbaI en una de las dos secuencias de repetición invertidas del plásmido 2 \mum, dicho sitio FRT extra situado en orientación directa en relación con el sitio FRT endógeno de dicha secuencia de repetición, y la secuencia de ADN plásmido bacteriano está encerrada entre el sitio FRT extra y el sitio FRT endógeno de dicha secuencia de repetición. En un vector de desintegración preferido, todas las secuencias de ADN de plásmido bacteriano están encerradas tal y como se ha mencionado. Un vector de plásmido 2 \mum particularmente preferido tiene esencialmente la configuración de pSAC3 tal y como se ha mostrado en EP 286 424.
El término "vector de desintegración" como se utiliza en este caso incluye también plásmidos tales como definidos en US 6,451,559. De esta manera, un vector de desintegración puede ser un vector 2 \mum que, a la diferencia de la secuencia de ADN codificante de polipéptidos sin levadura, no incluye origen bacteriano de replicación (particularmente E. coli), o más preferiblemente ninguna secuencia bacteriana (particularmente E. coli) y preferiblemente todo el ADN en dicho vector, a la diferencia de la secuencia de ADN codificante de polipéptidos sin levadura, es ADN derivado de levadura.
El término "chaperona" como se utiliza en este caso se refiere a una proteína que se enlaza a y estabiliza otro conformador inestable de otra proteína, y mediante un enlace y liberación controlados, se facilita su difusión in vivo adecuada, en plegado, ensamblaje oligomérico, transporte en un compartimiento subcelular particular o disposición por degradación. Por consiguiente una chaperona es también una proteína que está implicada en el plegado de proteínas, o que tiene una actividad chaperona o que está implicada en la respuesta de proteína desplegada. Este tipo de proteínas chaperona es conocido en la técnica, por ejemplo en la base de datos del Genoma Stanford (SGD), http:://db.yeastgenome.org. Las chaperonas preferidas son chaperonas eucarióticas, las chaperonas especialmente preferidas son chaperonas de levadura, incluyendo AHA1, CCT2, CCT3, CCT4, CCT5, CCT6; CC77, CCT8, CNS1, CPR3, CPR6; EP31, ERO1, EUG1, FMO1, HCH1; HSP10; HSP12; HSP104; HSP26; HSP30; HSP42; HSP60; HSP78; HSP82, JEM1, MDJ1, MDJ2, MPD1, MPD2, PD/1, PFD1, ABC1, APJ1; ATP11; ATP12, BTT1; CDC37, CPR7; HSC82, KAR2, LHS1, MGE1; MRS11, NOB1; ECM10, SSA1, SSA2, SSA3, SSA4, SSC1, SSE2, SULI, SLS1, ORM1, ORM2, PER1, PTC2, PSE1; UB14 y HAC1 o una HAC1 truncada sin intrón (Valkonen et al. 2003, Applied Environ. Micro., 69, 2065).
Una chaperona útil en la práctica de la presente invención puede ser:
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una proteína de choque térmico, tal como una proteína que es un elemento de la familia de proteínas hsp70 (incluyendo proteínas Kar2p, SSA y SSB, por ejemplo proteínas codificadas por SSA1, SSA2, SSA3, SSA4, SSB1 y SSB2), una proteína que es un elemento de la familia HSP90, o una proteína que es un elemento de la familia HSP40 o proteínas implicadas en su modulación (por ejemplo Sil1p), incluyendo proteínas en forma de J de ADN y de J de ADN (por ejemplo Jemlp, Mdj2p);
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una proteína que es un elemento de la familia de las carioferinas/importinas de proteínas, como las familias alfa o beta de proteínas de carioferinas/importinas, por ejemplo la proteína beta carioferina PSE1;
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una proteína que es un elemento de la familia ORMDL descrito por Hjelmqvist et al, 2002, Genome Biology, 3(6), research0027.1-0027.16, tal como Orm2p.
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una proteína que está localizada naturalmente en el retículo endoplásmico o en otro lugar en la vía secretora, tal como la golgi. Por ejemplo, una proteína que actúa naturalmente en el lumen del retículo endoplásmico (ER), particularmente en células secretoras. Tal como PDI.
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una proteína que es una proteína transmembrana anclada en el ER, tal como un elemento de la familia ORMDL descrito por Hjelmqvist et al, 2002, supra, (por ejemplo, Orm2p);
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una proteína que actúa en el citosol, tal como las proteínas hsp70, incluyendo proteínas SSA y SSB, por ejemplo una producción de proteínas SSA1, SSA2, SSA3, SSA4, SSB1 y SSB2;
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una proteína que actúa en el núcleo, el revestimiento nuclear y/o el citoplasma, tal como Pse1p;
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una proteína que es esencial para la viabilidad de la célula, tal como PDI o una proteína carioferina esencial, tal como Pse1p;
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una proteína que está implicada en la oxidación de sulfidrilo o en la rotura, la isomerización o la formación del enlace de disulfuro, o una proteína que cataliza tiol: reacciones de intercambio de disulfuro en proteínas, particularmente durante la biosíntesis de proteínas secretoras y de superficie de célula, como las isomerasas de disulfuro de las proteínas (por ejemplo Pdilp, Mpdlp), proteínas homólogas (por ejemplo Euglp) y/o relacionadas (por ejemplo Mpd2p, Fmolp, Erolp);
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una proteína que está implicada en la síntesis, ensamblaje o plegado de proteínas, tal como PDI y Ssa1p;
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una proteína que se enlaza preferible o exclusivamente a una proteína desplegada, en lugar de madura, como las proteínas hsp70, incluyendo proteínas SSA y SSB, por ejemplo proteínas codificadas por SSA1, SSA2, SSA3, SSA4, SSB1 y SSB2;
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una proteína que impide agregar proteínas precursoras en el citosol, como las proteínas hsp70 incluyendo proteínas SSA y SSB, por ejemplo proteínas codificadas por SSA1, SSA2, SSA3, SSA4, SSB1 y SSB2;
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una proteína que se enlaza con y estabiliza proteínas dañadas, por ejemplo Ssalp;
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una proteína que está implicada en la respuesta de una proteína plegada o que provee una resistencia incrementada a agentes (como tunicamicina y ditiotreitol) que inducen la respuesta de una proteína desplegada, tal como un elemento de la familia ORMDL descrito por Hjelmqvist et al, 2002, supra (por ejemplo, Orm2p) o proteínas implicadas en la respuesta a la tensión (por ejemplo Ubi4p);
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una proteína que es una cochaperona y/o una proteína implicada indirectamente en el plegado de proteínas y/o en la respuesta de proteína desplegada (por ejemplo hsp104p, Mdj1p);
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una proteína que está implicada en el transporte nucleocitoplásmico de macromuléculas, tal como Pse1p;
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una proteína que media el transporte de macromuléculas a través de la membrana nuclear por reconocimiento de secuencias de localización nuclear y secuencias de exportación nuclear e interacción con el complejo de poro nuclear, tal como PSE1;
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una proteína capaz de reactivar la actividad de ribonucleasa contra el ARN de ribonucleasa mezclada tal y como está descrito en EP 0 746 611 y Hillson et al, 1984, Methods Enzymol., 107, 281-292, tal como PDI;
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una proteína que tiene un pl ácido (por ejemplo, 4.0-4.5), tal como PDI;
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una proteína que es un elemento de la familia Hsp70, y posee preferiblemente un dominio de enlace de ATP N-terminal y un dominio de enlace de péptidos C-terminal, tal como Ssalp.
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una proteína que es una peptidil-prolil cis-trans isomerasa (por ejemplo Cpr3p, Cpr6p);
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una proteína que es una homóloga de chaperonas conocidas (por ejemplo Hsp10p);
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una proteína que es una chaperona mitocondrial (por ejemplo Cpr3p);
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una proteína que es una chaperona citoplásmica o nuclear (por ejemplo Cns1p);
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una proteína que es una chaperona enlazada a la membrana (por ejemplo Orm2p, Fmo1p);
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una proteína que tiene una actividad activadora de chaperona o actividad reguladora de chaperona (por ejemplo Aha1p, Hac1p, Hch1p);
-
una proteína que se enlaza transitoriamente a unos polipéptidos en su forma inmadura para producir el transporte y/o secreción de plegado apropiados, incluyendo proteínas requeridas para una translocación eficiente en el retículo endoplásmico (por ejemplo Lhs1p) o su sitio de acción al interior de la célula (por ejemplo Pselp);
-
una proteína que está implicada en el ensamblaje de complejo de proteínas y/o ensamblaje de ribosomas (por ejemplo Atp11p, Pselp, Nob1p);
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una proteína del complejo T de chaperoninas (por ejemplo Cct2p); o
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una proteína del complejo de prefoldinas (por ejemplo Pfdlp).
Una chaperona preferida es la proteína disulfuro isomerasa (PDI) o un fragmento o variante de ésta con una capacidad equivalente para catalizar la formación de enlaces de disulfuro al interior del lumen del retículo endoplásmico (ER). Con "PDI" incluimos cualquier proteína que posee la capacidad para reactivar la actividad ribonucleasa contra el ARN de ribonucleasa mezclada tal y como está descrito en EP 0 746 611 y Hillson et al, 1984, Methods Enzymol., 107, 281-292.
La PDI es una enzima que cataliza típicamente tiol: reacciones de intercambio de disulfuro, y es un componente mayor de proteína residente del lumen ER en células secretoras. Un cuerpo de prueba sugiere que posee una función en la biosíntesis de proteínas secretoras (Freedman, 1984, Trends Biochem. Sci., 9, 438-41) y esto está apoyado por estudios de reticulación directos in situ (Roth and Pierce, 1987, Biochemistry, 26, 4179-82). El descubrimiento de que las membranas microsómicas deficientes en PDI exhiben una carencia específica en la formación de enlace de disulfuro de proteínas cotraslacional (Bulleid and Freedman, 1988, Nature, 335, 649-51) implica que la enzima funcione como un catalizador de formación de enlace de disulfuro nativo durante la biosíntesis de proteínas secretoras y de superficie de célula. Esta función concuerda con lo que se sabe de las propiedades catalíticas de enzimas in vitro; ésta cataliza el tiol: las reacciones de intercambio de disulfuro llevando a la formación, rotura o isomerización global de disulfuro de una proteína, y puede catalizar típicamente el plegado de proteínas y la formación de enlaces de disulfuro nativo en una amplia variedad de sustratos de proteína reducida desplegada (Freedman et al., 1989, Biochem. Soc. Symp., 55, 167-192). La PDI funciona también como una chaperona ya que la actividad isomerasa sin PDI mutante acelera el plegado de proteínas (Hayano et al, 1995, FEBS Letters, 377, 505-511). Recientemente, se indicaba la oxidación de sulfidrilo, la no isomerización de disulfuro como la función principal de proteína disulfuro isomerasa en S. cerevisiae (Solovyov et al., 2004, J. Biol. Chem., 279 (33) 34095-34100). La secuencia de ADN y de aminoácidos de la enzima es conocida para diferentes especies (Scherens et al, 1991, Yeast, 7, 185-193; Farquhar et al, 1991, Gene, 108, 81-89; EP074661; EP0293793; EP0509841) y existe una información incrementada sobre el mecanismo de acción de la enzima purificada para la homogeneidad del hígado de mamíferos (Creighton et al, 1980, J Mol Biol., 142, 43-62; Freedman et al, 1988, Biochem. Soc. Trans., 16, 96-9; Gilbert, 1989, Biochemistry, 28, 7298-7305; Lundstrom and Holmgren, 1990, J. Biol. Chem., 265, 9114-9120; Hawkins and Freedman, 1990, Biochem. J., 275, 335- 339). De los muchos factores de proteína implicados habitualmente como mediadores de plegado, ensamblaje y translocación de proteínas en la célula (Rotman, 1989, Cell, 59, 591-601), la PDI tiene una actividad catalítica bien
definida.
La deleción o inactivación del gen de PDI endógeno en un huésped implica la producción de un huésped inviable. En otras palabras, el gen de PDI endógeno es un gen "esencial".
La PDI es aislada fácilmente a partir de tejidos mamíferos y la enzima homogénea es un homodímero (2x57 kD) con un pl ácido de forma característica (4.0-4.5) (Hillson et al, 1984, op. cit.). La enzima también ha sido purificada a partir de trigo y de alga Chlamydomonas reinhardii (Kaska et al, 1990, Biochem. J., 268, 63-68), de rata (Edman et al, 1985, Nature, 317, 267-270), bovino (Yamauchi et al, 1987, Biochem. Biophys. Res. Comm., 146, 1485-1492), humano (Pihlajaniemi et al, 1987, EMBO J., 6, 643-9), levadura (Scherens et al, supra; Farquhar et al, op. cit.) y pollito (Parkkonen et al, 1988, Biochem. J., 256, 1005-1011). Las proteínas de estas especies vertebradas exhiben un alto grado de conservación de secuencia en todas partes y exhiben todas varias características globales determinadas en primer lugar en la secuencia de PDI de rata (Edman et al., 1985, op. cit.).
Secuencias de PDI preferidas incluyen las de seres humanos y de especies de levadura, tales como S. cerevisiae.
Un precursor de proteína disulfuro isomerasa de levadura, PDI1, puede estar presente bajo los nº CAA42373 o BAA00723 de registro GeneBank. Este posee la secuencia siguiente de 522 aminoácidos:
1
Una secuencia de proteína disulfuro isomerasa de levadura alternativa puede estar presente bajo el nº CAA38402 de registro GeneBank. Esta posee la secuencia de 530 aminoácidos siguiente
2
La alineación siguiente de estas secuencias (primero la secuencia de nº CAA42373 o BAA00723 de registro GenBank, en segundo lugar la secuencia de nº CAA38402 de registro GenBank) muestra que las diferencias entre estas dos secuencias son una diferencia única de aminoácidos en la posición 114 (subrayada en negrita) y que la secuencia definida por GenBank: nº CAA38402 de registro contiene los aminoácidos adicionales EADAEAEA en posiciones 506-513.
3
Variantes y fragmentos de las secuencias de PDI anteriores, y variantes de otras secuencias de PDI formadas naturalmente también están incluidas en la presente invención. Una "variante", en el contexto de PDI, se refiere a una proteína donde en una o más posiciones ha habido inserciones, deleciones, o sustituciones de aminoácidos, sean conservadoras o no conservadoras, a condición de que este tipo de cambios produzca una proteína cuyas propiedades básicas, por ejemplo la actividad enzimática (tipo de y actividad específica), termostabilidad, actividad en un rango de pH determinado (estabilidad de pH) no ha cambiado de manera significativa. "De manera significativa" en este contexto significa que una persona experta en la técnica opinará que las propiedades de la variante pueden seguir siendo diferentes pero no serán tan evidentes con respecto a las de la proteína origi-
nal.
Por "sustituciones conservadoras" nos referimos a combinaciones tales como Val, Ile, Leu, Ala, Met; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr, Gly, Ala; Lys, Arg, His; y Phe, Tyr, Trp. Unas sustituciones conservadoras preferidas incluyen Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe, Tyr.
Una "variante" tiene típicamente al menos 25%, al menos 50%, al menos 60% o al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90%, incluso más preferiblemente al menos 95%, aún más preferiblemente al menos 99%, más preferiblemente al menos 99.5% de identidad de secuencia con respecto al polipéptido del cual deriva.
El porcentaje de identidad de secuencia entre dos polipéptidos puede ser determinada usando programas informáticos adecuados, tal como mencionado más abajo. Tales variantes pueden ser naturales o hechas mediante el uso de los métodos de ingeniería proteica y mutagénesis dirigida al sitio bien conocidas en la técnica.
Un "fragmento", en el contexto de PDI, se refiere a una proteína donde se han producido deleciones en una o más posiciones. Por lo que el fragmento puede comprender al máximo 5, 10, 20, 30, 40 o 50%, típicamente hasta el 60%, más típicamente hasta el 70%, más preferiblemente hasta el 80%, más preferiblemente hasta el 90%, incluso más preferiblemente hasta el 95%, aún más preferiblemente hasta el 99% de la secuencia completa de la proteína madura entera PDI. Fragmentos particularmente preferidos de proteína PDI comprenden uno o más dominios completos de la proteína deseada.
Un fragmento o variante de PDI puede ser una proteína que, cuando está expresada de forma recombinante en una célula huésped, puede completar la deleción del gen de PDI codificado endógenamente en la célula huésped, tal como S. cerevisiae, y puede, por ejemplo, ser un homólogo de origen natural de PDI, tal como un homólogo codificado por otro organismo, tal como otra levadura u otro hongo, u otro eucariota tal como un humano u otro vertebrado, o animal o por una planta.
Otra chaperona preferida es SSA1 o un fragmento o variante de ésta con una actividad equivalente similar a la chaperona. La SSA1, también conocida como YG100, está situada en el cromosoma I del genoma de S. cerevisiae y tiene un tamaño de 1.93 kbp.
Una secuencia de proteína publicada de SSA1 es tal como indicada a continuación:
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Una secuencia codificante publicada para la SSA1 es tal como indicada a continuación, aunque se apreciará el hecho de que la secuencia pueda ser modificada por sustituciones degeneradas para obtener secuencias de nucleótidos alternativas que codifican un producto de proteína idéntico:
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6 
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La proteína Ssalp pertenece a la familia Hsp70 de proteínas y es residente en el citosol. Hsp70s posee la capacidad de realizar varias actividades de chaperona; de ayuda en la síntesis, ensamblaje y plegado de proteínas; de mediación para la translocación de polipéptidos en varios lugares intracelulares, y de resolución de agregados de proteína (Becker & Craig, 1994, Eur. J. Biochem. 219, 11-23). Los genes de Hsp70 son muy bien conservados, y poseen un dominio de enlace de ATP N-terminal y un dominio de enlace de péptidos C-terminal. Las proteínas Hsp70 interactúan con el esqueleto peptídico de proteínas esencialmente desplegadas. El enlace y liberación de péptidos por proteínas hsp70 es un proceso dependiente de ATP y acompañado por un cambio conformacional en la hsp70 (Becker & Craig, 1994, supra).
Las proteínas hsp70 citosólicas son implicadas particularmente en la síntesis, plegado y secreción de proteínas (Becker & Craig, 1994, supra). En S. cerevisiae las proteínas hsp70 citosólicas han sido divididas en dos grupos; proteínas SSA (SSA 1-4) y SSB (SSB 1 y 2), que son funcionalmente diferentes entre sí. La familia de SSA es esencial al menos en la medida en que una proteína del grupo debe ser activa para mantener una viabilidad celular (Becker & Craig, 1994, supra). Las proteínas hsp70 citosólicas se enlazan preferiblemente a las proteínas desplegadas y no maduras. Esto indica que éstas previenen la adición de proteínas precursoras, manteniendo estas últimas en un estado desplegado antes de ser ensambladas en complejos multimoleculares en el citosol y/o facilitando su translocación a varios órganos (Becker & Craig, 1994, supra). Las proteínas SSA están implicadas particularmente en la biogénesis postranslacional y en el mantenimiento de precursores para una translocación dentro del retículo endoplásmico y de la mitocondria (Kim et al., 1998, Proc. Natl. Acad Sci. USA. 95, 12860-12865; Ngosuwan et al., 2003, J. Biol. Chem. 278 (9), 7034-7042). Se ha mostrado que la Ssalp se enlaza a proteínas dañadas, estabilizándolas en una forma parcialmente desplegada y permitiendo que se produzca el replegado o degradación (Becker & Craig, 1994, supra; Glover & Lindquist, 1998, Cell. 94, 73-82).
Demolder et al, 1994, J. Biotechnol, 32, 179-189 revelaron que una sobreexpresión de SSA1 en levadura provista para unos incrementos de la expresión de un gen recombinante integrado cromosómicamente codificante de un interferón humano. No existe ninguna teoría de que los incrementos de expresión genética heteróloga puedan ser conseguidos si la SSA1 y el interferón humano deben ser codificados por genes recombinantes en el mismo plásmido. De hecho, a la luz de desarrollos más recientes en el campo de la sobreexpresión de chaperonas en levadura (por ejemplo Robinson et al, 1994, op. cit.; Hayano et al, 1995, op. cit.; Shusta et al, 1998, op. cit, Parekh & Wittrup, 1997, op. cit.; Bao & Fukuhara, 2001, op. cit.; y Bao et al, 2000, op. cit) el experto en la materia no estaría dispuesto en absoluto a expresar la SSA1 a partir de un plásmido de familia 2 \mum, mucho menos a expresar ambas SSA1 y proteína heteróloga a partir de un plásmido de familia 2 \mum para incrementar los niveles de expresión de una proteína
heteróloga.
Variantes y fragmentos de SSA1 también están incluidos en la presente invención. "Variantes", en el contexto de SSA1, se refieren a una proteína que posee la secuencia de SSA1 nativa distinta en una o más posiciones donde ha habido inserciones, deleciones, o sustituciones de aminoácidos sean conservadoras o no conservadoras, siempre que estos cambios produzcan una proteína cuyas propiedades básicas, por ejemplo la actividad enzimática (tipo de y actividad específica), termoestabilidad, actividad en un rango de pH determinado (estabilidad de pH) no haya sido cambiada de manera significativa. "De manera significativa" en este contexto significa que la persona experta en la técnica opinará que las propiedades de la variante pueden seguir siendo diferentes pero no serán tan evidentes con respecto a las de la proteína original.
Con "sustituciones conservadoras" nos referimos a combinaciones tales como Val, Ile, Leu, Ala, Met; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr, Gly, Ala; Lys, Arg, His; y Phe, Tyr, Trp. Sustituciones conservadoras preferidas incluyen Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe, Tyr.
Una "variante" de SSA1 tiene típicamente al menos el 25%, al menos el 50%, al menos el 60% o al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, incluso más preferiblemente al menos el 95%, aún más preferiblemente al menos el 99%, más preferiblemente al menos el 99.5% de identidad de secuencia respecto a la secuencia de SSA1 nativa.
El porcentaje de identidad de secuencia entre dos polipéptidos puede ser determinado usando programas informáticos adecuados, tal como citados más abajo. Tales variantes pueden ser naturales o realizadas usando los métodos de ingeniería proteica y de mutagénesis dirigida al sitio bien conocidas en la técnica.
Un "fragmento" en el contexto de SSA1, se refiere a una proteína que posee la secuencia de SSA1 nativa distinta a la de una o más posiciones donde ha habido deleciones. De esta manera el fragmento puede comprender un máximo de 5, 10, 20, 30, 40 o 50%, típicamente hasta el 60%, más típicamente hasta el 70%, preferiblemente hasta el 80%, más preferiblemente hasta el 90%, incluso más preferiblemente hasta el 95%, aún más preferiblemente hasta el 99% de la secuencia completa de la proteína SSA1 madura entera. Unos fragmentos particularmente preferidos de proteína SSA1 comprenden uno o más dominios enteros de la proteína deseada.
Un fragmento o variante de SSA1 puede ser una proteína que, cuando está expresada de forma recombinante en una célula huésped, tal como S. cerevisiae, pueden completar la deleción del gen de SSA1 codificado endógenamente (o homólogo de éste) en la célula huésped y puede, por ejemplo, ser un homólogo de SSA1 producido naturalmente, tal como un homólogo codificado por otro organismo, como otra levadura u otro hongo u otro eucariota tal como un humano u otro vertebrado, o animal o por una planta.
Otra chaperona preferida es PSE1 o un fragmento o variante de ésta que posee una actividad equivalente similar a la chaperona.
La PSE1, también conocida como KAP121, es un gen esencial, situado en el cromosoma XIII.
Una secuencia de proteína publicada para la proteína pse1p es tal como indicada a continuación:
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Una secuencia codificante de nucleótido de PSE1 publicada es tal y como indicada a continuación, aunque se apreciará el hecho de que la secuencia pueda ser modificada por sustituciones degeneradoras para obtener secuencias nucleótidas alternativas que codifican un producto de proteína idéntico:
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El gen de PSE1 tiene un tamaño de 3.25-kbp. La Pselp está implicada en el transporte nucleocitoplásmico de macromuléculas (Seedorf & Silver, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 8590-8595). Este proceso tiene lugar a través del complejo de poro nuclear (NPC) alojado en la envoltura nuclear y hecho de nucleoporinas (Ryan & Wente, 2000, Curr. Opin. Cell Biol. 12, 361-371). Las proteínas poseen secuencias específicas que contienen la información requerida para la importación nuclear, de una secuencia de localización nuclear (NLS) y, la exportación, de secuencia de exportación nuclear (NES) (Pemberton et al., 1998, Curr. Opin. Cell Biol. 10, 392-399). La Pselp es una carioferina/importina, un grupo de proteínas, que ha sido dividido en familias \alpha y \beta. Las carioferinas son factores de transporte solubles que median el transporte de macromuléculas a través de la membrana nuclear por reconocimiento de NLS y NES, e interactúan con y el NPC (Seedorf & Silver, 1997, supra; Pemberton et al., 1998, supra; Ryan & Wente, 2000, supra). La translocación a través del poro nuclear es dirigida por hidrólisis de GTP, catalizada por la pequeña proteína de enlace de GTP, Ran (Seedorf & Silver, 1997, supra). La Pselp ha sido identificada como una carioferina. 14 proteínas carioferinas han sido identificadas en S. cerevisiae, de las cuales sólo 4 son esenciales. Esto se debe quizás al hecho de que varias carioferinas pueden mediar el transporte de una única macromolécula (Isoyama et al., 2001, J. Biol. Chem. 276 (24), 21863-21869). La Pselp está localizada con respecto al núcleo, en la envoltura nuclear, y en una extensión determinada con respecto al citoplasma. Esto indica que la proteína se mueve dentro y fuera del núcleo debido a su función de transporte (Seedorf & Silver, 1997, supra). La Pselp está implicada en la importación nuclear de factores de transcripción (Isoyama et al., 2001, supra; Ueta et al., 2003, J. Biol. Chem. 278 (50), 50120-50127), histones (Mosammaparast et al., 2002, J. Biol. Chem. 277 (1), 862-868), y proteínas ribosómicas antes de su ensamblaje en ribosomas (Pemberton et al., 1998, supra). También media la exportación de ARNm desde el núcleo. Las carioferinas reconocen y enlazan distintas NES presentes en proteínas de enlace de ARN, que revisten el ARN antes de ser exportadas desde el núcleo (Seedorf & Silver, 1997, Pemberton et al., 1998, supra).
Como el transporte nucleocitoplásmico de macromuléculas es esencial para una progresión apropiada a través del ciclo celular, unos factores de transporte nuclear, tales como pselp son los nuevos blancos candidatos para un control del crecimiento (Seedorf & Silver, 1997, supra).
Una sobreexpresión de Pselp (potenciador de secreción proteica) en S. cerevisiae también ha mostrado que incrementa los niveles de secreción de proteína endógena de un repertorio de proteínas biológicamente activas (Chow et al., 1992; J. Cell. Sci. 101 (3), 709-719). No existe ninguna teoría de que los incrementos de expresión genética heteróloga puedan ser conseguidos si la PSE1 y una proteína heteróloga deben ser codificadas las dos por genes recombinantes en el mismo plásmido. De hecho, en respuesta a desarrollos más recientes de sobreexpresión de chaperonas en levadura (por ejemplo Robinson et al, 1994, op. cit.; Hayano et al, 1995, op. cit.; Shusta et al, 1998, op. cit., Parekh & Wittrup, 1997, op. cit.; BaO & Fukuhara, 2001, op. cit.; y Bao et al, 2000, op. cit) el experto en la materia no intentará en absoluto sobreexpresar la PSE1 a partir de un plásmido de familia 2 \mum, mucho menos para expresar ambas proteínas PSE1 y heteróloga a partir de un plásmido de familia 2 \mum para incrementar los niveles de expresión de una proteína heteróloga.
Variantes y fragmentos de PSE1 también están incluidos en la presente invención. Una "variante", en el contexto de PSE1, se refiere a una proteína que posee la secuencia de PSE1 nativa distinta a la de una o más posiciones donde ha habido inserciones, deleciones, o sustituciones de aminoácidos, sean conservadoras o no conservadoras, a condición de que tales cambios produzcan una proteína cuyas propiedades básicas, por ejemplo la actividad enzimática (tipo de y actividad específica), termoestabilidad, actividad en un rango de pH determinado (estabilidad de pH) no hayan sido cambiadas de manera significativa. "De manera significativa" en este contexto significa que el experto en la técnica opinará que las propiedades de la variante pueden seguir siendo diferentes pero no serán tan evidentes con respecto a las de la proteína original.
Con "substitutiones conservadoras" nos referimos a combinaciones tales como Val, Ile, Leu, Ala, Met; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr, Gly, Ala; Lys, Arg, His; y Phe, Tyr, Trp. Sustituciones conservadoras preferidas incluyen Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gin; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe, Tyr.
Una "variante" de PSE1 tiene típicamente al menos el 25%, al menos el 50%, al menos el 60% o al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, incluso más preferiblemente al menos el 95%, aún más preferiblemente al menos el 99%, más preferiblemente al menos el 99.5% de identidad de secuencia respecto a la secuencia de PSE1 nativa.
El porcentaje de identidad de secuencia entre dos polipéptidos puede ser determinado mediante el uso de programas informáticos adecuados, tal como mencionado más abajo. Tales variantes pueden ser naturales o realizadas usando los métodos de ingeniería proteica y de mutagénesis dirigida al sitio bien conocidas en la técnica.
Un "fragmento", en el contexto de PSE1, se refiere a una proteína que posee la secuencia de PSE1 nativa distinta a la de una o más posiciones donde se han realizado deleciones. De esta manera, el fragmento puede comprender un máximo de 5, 10, 20, 30, 40 o 50%, típicamente hasta el 60%, más típicamente hasta el 70%, preferiblemente hasta el 80%, más preferiblemente hasta el 90%, incluso más preferiblemente hasta el 95%, aún más preferiblemente hasta el 99% de la secuencia completa de la proteína PSE1 madura entera. Fragmentos particularmente preferidos de proteína PSE1 comprenden uno o más dominios enteros de la proteína deseada.
Un fragmento o variante de PSE1 puede ser una proteína que, cuando está expresada de forma recombinante en una célula huésped, tal como la S. cerevisiae, puede completar la deleción del gen de PSE1 endógeno en la célula huésped y puede por ejemplo, ser un homólogo de PSE1 producido naturalmente, tal como un homólogo codificado por otro organismo, tal como otra levadura u otro hongo u otro eucariota tal como un humano u otro vertebrado, o animal o por una planta.
Otra chaperona preferida es ORM2 o un fragmento o variante de ésta que tiene una actividad equivalente similar a la chaperona.
La ORM2, también conocida como YLR350W, está situada en el cromosoma XII (posiciones 828729 a 829379) del genoma de S. cerevisiae y codifica una proteína conservada de forma evolucionaria con una similitud con la proteína de levadura Ormlp. Hjelmqvist et al, 2002, Genome Biology, 3(6), research 0027.1-0027.16 revela que la ORM2 pertenece a la familia de genes comprendiendo tres genes humanos (ORMDL1, ORMDL2 y ORMDL3) así como homólogos en microsporidia, plantas, Drosophila, urocordados y vertebrados. Los genes ORMDL están provistos para codificar proteínas de transmembrana ancladas en el retículo endoplásmico de proteínas (ER).
La proteína Orm2p es requerida para una resistencia a agentes que inducen la respuesta de proteína desplegada. Hjelmqvist et al, 2002 (supra) revelaba que una doble separación de los dos homólogos de ORMDL de S. cerevisiae (ORM1 y ORM2) produce un índice de crecimiento reducido y una mayor sensibilidad a la tunicamicina y ditiotreitol.
Una secuencia publicada de Orm2p es tal como indicada a continuación:
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La proteína anterior es codificada en S. cerevisiae por la secuencia nucleótida de codificación siguiente, aunque se apreciará el hecho de que la secuencia pueda ser modificada por degeneración de sustituciones para obtener secuencias nucleótidas alternativas que codifican un producto de proteína idéntica:
11
Variantes y fragmentos de ORM2 también están incluidos en la presente invención. Una "variante", en el contexto de ORM2, se refiere a una proteína que posee la secuencia de ORM2 nativa distinta a la secuencia en una o más posiciones donde ha habido inserciones, deleciones, o sustituciones de aminoácidos, sean conservadoras o no conservadoras, siempre que estos cambios produzcan una proteína cuyas propiedades básicas, por ejemplo la actividad enzimática (tipo de y actividad específica), termoestabilidad, actividad en un rango de pH determinado (estabilidad de pH) no han sido cambiadas de manera significativa. "De manera significativa" en este contexto significa que un experto en la técnica opinará que las propiedades de la variante pueden seguir siendo diferentes pero no serán tan evidentes con respecto a las de la proteína original.
Con "sustituciones conservadoras" nos referimos a combinaciones tales como Val, Ile, Leu, Ala, Met; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr, Gly, Ala; Lys, Arg, His; y Phe, Tyr, Trp. Sustituciones conservadoras preferidas incluyen Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr Lys, Arg; y Phe, Tyr.
Una "variante" de ORM2 tiene típicamente al menos el 25%, al menos el 50%, al menos el 60% o al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, incluso más preferiblemente al menos el 95%, aún más preferiblemente al menos el 99%, más preferiblemente al menos el 99.5% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de ORM2 nativa.
El porcentaje de identidad de secuencia entre dos polipéptidos puede ser determinado usando programas informáticos adecuados, como mencionado más abajo. Tales variantes pueden ser naturales o hechas mediante el uso de los métodos de ingeniería proteica y de mutagénesis dirigida al sitio bien conocidas en la técnica
Un "fragmento" en el contexto de ORM2, se refiere a una proteína que posee la secuencia de ORM2 nativa distinta a la secuencia en una o más posiciones donde ha habido deleciones. De esta manera el fragmento puede comprender un máximo de 5, 10, 20, 30, 40 o del 50%, típicamente hasta el 60%, más típicamente hasta el 70%, preferiblemente hasta el 80%, más preferiblemente hasta el 90%, incluso más preferiblemente hasta el 95%, aún más preferiblemente hasta el 99% de la secuencia completa de la proteína ORM2 entera madura. Fragmentos particularmente preferidos de proteína ORM2 comprenden uno o más dominios enteros de la proteína deseada.
Un fragmento o variante de ORM2 puede ser una proteína que, cuando está expresada de forma recombinante en una célula huésped, tal como S. cerevisiae, puede complementar la deleción del gen de ORM2 endógeno en la célula huésped y puede por ejemplo, ser un homólogo de ORM2 producido naturalmente, tal como un homólogo codificado por otro organismo, como otra levadura u otros hongos, u otro eucariota tal como un humano u otro vertebrado, o un animal o por una planta.
Un gen codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de una chaperona puede ser producido de una manera similar a la que está mencionada más abajo para genes codificantes de proteínas heterólogas, con un énfasis particular en combinaciones de ORF y regiones reguladoras.
El término "proteína" como se utiliza en este caso incluye todas las proteínas naturales y no naturales, polipéptidos y péptidos. Una "proteína heterologa" es una proteína que no está codificada naturalmente por un plásmido de familia 2 \mum y que puede estar descrito también como una "proteína de plásmido sin familia 2 \mum". Por conveniencia, los términos "proteína heterologa" y "proteína de plásmido sin familia 2 \mum" son usados como sinónimos en toda esta aplicación. Preferiblemente, en consecuencia, la proteína heteróloga no es una proteína FLP, REP1, REP2, o una RAF/D ya que está codificada por cualquier pSR1, pSB3 o pSB4 obtenida a partir de Z. rouxii, pSB1 o pSB2 ambas obtenidas a partir de Z bailli, la pSM1 obtenida a partir de Z. fermentati, pKD1 obtenida a partir de K. drosophilarum, pPM1 obtenida a partir de P. membranaefaciens o el plásmido 2 \mum obtenido a partir de S. cerevisiae.
Un gen codificante de una proteína heteróloga comprende la secuencia de polinucleótidos codificante de la proteína heteróloga (típicamente según un uso de codón estándar para cualquier organismo proporcionado), llamado el marco de lectura abierto ("ORF"). El gen puede comprender también alguna secuencia de polinucleótidos que no codifica un marco de lectura abierto (llamada "región no codificante").
La región no codificante en el gen puede contener una o más secuencias reguladoras, ligadas operativamente al ORF, que permiten la transcripción del marco de lectura abierto y/o la traslación del transcrito resultante.
El término "secuencia reguladora" se refiere a una secuencia que modula (es decir, promueve o reduce) la expresión (es decir, la transcripción y/o traslación) de un ORF al cual está ligado operativamente. Las regiones reguladoras incluyen típicamente promotores, terminadores, sitios de enlace ribosomal y similares. El experto en la materia apreciará el hecho de que la elección de región reguladora depende del sistema de expresión previsto. Por ejemplo, los promotores pueden ser constitutivos o inducibles y pueden ser tipo célula o de un tejido específico o no específico.
Regiones reguladoras adecuadas, pueden ser de 5 bp, 10 bp, 15 bp, 20 bp, 25 bp, 30 bp, 35 bp, 40 bp, 45 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 120 bp, 140 bp, 160 bp, 180 bp, 200 bp, 220 bp, 240 bp, 260 bp, 280 bp, 300 bp, 350 bp, 400 bp, 450 bp, 500 bp, 550 bp, 600 bp, 650 bp, 700 bp, 750 bp, 800 bp, 850 bp, 900 bp, 950 bp, 1000 bp, 1100 bp, 1200 bp, 1300 bp, 1400 bp, 1500 bop o superiores, en longitud.
Los expertos en la técnica reconocerán que el gen codificante de la chaperona, por ejemplo de PDI, puede comprender también regiones no codificantes y/o regiones reguladoras. Tales regiones no codificantes y regiones reguladoras no se limitan a las regiones no codificantes nativas y/o regiones reguladoras asociadas habitualmente al ORF de chaperona.
Cuando el sistema de expresión es levadura, como la Saccharomyces cerevisiae, unos promotores adecuados para la S. cerevisiae incluyen los que están asociados con el gen PGK1, genes GAL1 o GAL10, TEF1, TEF2, PYK1, PMA1, CYC1, PHO5, TRP1, ADHI, ADH2, los genes para deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato, hexoquinasa, decarboailasa de piruvato, fosfofructoquinasa, triosa fosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, glucocinasa, feromona de factor de acoplamiento, feromona de factor de \alpha-acoplamiento, el promotor PRB1, el promotor PRA1, el promotor GPD1, y promotores híbridos que implican híbridos de partes de regiones reguladoras 5' con partes de regiones reguladoras 5' de otros promotores o con sitios de activación arriba (por ejemplo el promotor de EP-A-258 067).
Unas señales de terminación de transcripción adecuadas son conocidas en la técnica. Cuando la célula huésped es eucariótica, la señal de terminación de transcripción deriva preferiblemente de la secuencia flanqueante 3' de un gen eucariótico, que contiene señales apropiadas para la terminación de transcripción y poliadenilación. Unas secuencias flanqueantes 3' adecuadas pueden, por ejemplo, ser las del gen ligado naturalmente a la secuencia de control de expresión usada, es decir que puede corresponder al promotor. De forma alternativa, éstas pueden ser diferentes. En este caso, y en caso de que el huésped sea una levadura, preferiblemente S. cerevisiae, entonces la señal de terminación de S. cerevisiae, los genes ADH1, ADH2, CYC1, o PGK1 son preferidos.
Puede ser provechoso para el promotor y el marco de lectura abierto del gen heterólogo, tal como los de la chaperona PDI1, estar flanqueados por secuencias de terminación de transcripción de tal forma que las secuencias de terminación de transcripción están situadas las dos arriba y abajo del promotor y del marco de lectura abierto, para prevenir una translectura transcripcional en genes vecinos, tales como genes 2 \mum, y viceversa.
En una forma de realización, las secuencias reguladoras preferidas en levadura, tal como la Saccharomyces cerevisiae, incluyen: un promotor de levadura (por ejemplo el promotor PRB1 de Saccharomyces cerevisiae, como mostrado en EP 431 880; y un terminador de transcripción, preferiblemente el terminador de Saccharomyces ADH1, como mostrado en EP 60 057. Preferiblemente, el vector incorpora al menos dos codones de parada de traslación.
Puede ser provechoso para la región no codificante incorporar más de una secuencia de ADN codificante de un codón de parada traslacional, tal como UAA, UAG o UGA, para minimizar la translectura traslacional e impedir así la producción de proteínas de fusión no naturales, alargadas. El codón de parada de traslación UAA es preferido.
El término "ligado operativamente" incluye en su significado que una secuencia reguladora esté dispuesta al interior de cualquier región no codificante en un gen para que ésta forme una relación con un ORF que permita a la región reguladora ejercer un efecto en el ORF de la manera prevista. Así una región reguladora "ligada operativamente" a un ORF está dispuesta de tal forma que la región reguladora sea capaz de influir en la transcripción y/o traslación del ORF de la manera prevista, en condiciones compatibles con la secuencia reguladora.
En una forma de realización preferida, la proteína heteróloga está segregada. En este caso, una secuencia codificante de una secuencia guía de secreción que comprende, por ejemplo, la mayor parte de la guía secretora de HSA natural, más una pequeña parte de la guía secretora de factor de acoplamiento de S. Cerevisiae tal como mostrado en WO 90/01063 puede estar incluida en el marco de lectura abierto.
De forma alternativa, la proteína heteróloga puede ser intracelular.
En otra forma de realización preferida, la proteína heteróloga comprende la secuencia de una proteína eucariótica, o un fragmento o variante de ésta. Eucariotas adecuados incluyen hongos, plantas y animales. En una forma de realización preferida la proteína heteróloga es una proteína fúngica, tal como una proteína de levadura. En otra forma de realización preferida la proteína heteróloga es una proteína animal. Ejemplos de animales incluyen vertebrados e invertebrados. Vertebrados ejemplares incluyen mamíferos, tales como seres humanos, y mamíferos no humanos.
La proteína heteróloga puede comprender así la secuencia de una proteína de levadura. Puede por ejemplo comprender la secuencia de una proteína de levadura del mismo huésped de donde deriva el plásmido de familia 2 \mum. Los expertos en la técnica reconocerán que un método, uso o plásmido del primer, segundo o tercer aspectos de la invención pueden comprender secuencias de ADN codificantes de más de una proteína heteróloga, más de una chaperona, o de más de una proteína heteróloga y más de una chaperona.
En otra forma de realización preferida, la proteína heteróloga puede comprender la secuencia de albúmina, un anticuerpo monoclonal, una etoposida, una proteína sérica (como un factor de coagulación de sangre), antistasina, un péptido anticoagulante de garrapata, transferrina, lactoferrina, endostatina, angiostatina, colágenos, inmunoglobulinas o moléculas basadas en la inmunoglobulina o fragmento de cualquiera (por ejemplo un SmalI Modular ImmunoPharmaceutical^{TM} ("SMIP") o fragmentos de dAb, Fab', F(ab')2, scAb, scFv o fragmento de scFv), una proteína de dominio Kunitz (como aquellas descritas en WO 03/066824, con o sin fusiones de albúmina), interferones, interleukinas, IL10; IL11, IL2, especies y subespecies \alpha de interferón, especies y subespecies \beta de interferón, especies y subespecies \gamma de interferón, leptina, CNTF, CNTF_{Ax15}, antagonista receptor IL1, eritropoyetina (EPO) y imitadores de EPO, trombopoyetina (TPO) e imitadores de TPO, prosaptida, cianovirina-N, 5-helix, péptido T20, péptido T1249, gp41 VIH, gp120 VIH, uroquinasa, prouroquinasa, tPA, hirudina, factor de crecimiento derivado de plaqueta, hormona paratiroidea, proinsulina, insulina, glucagón, péptidos de tipo glucagón, factor de crecimiento de tipo insulina, calcitonina, hormona de crecimiento, factor de crecimiento transfomante, factor de necrosis tumoral, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, FGF, factores de coagulación en ambas formas pre y activas, incluyendo pero sin limitarse a éstos, plasminógeno, fibrinógeno, trombina, pretrombina, pro-trombina, factor de von Willebrand, \alpha_{1}-antitripsina, activadores plasminógenos, Factor VII, Factor VIII, Factor IX, Factor X y Factor XIII, factor de crecimiento de nervio, LACI, factor de crecimiento de la célula endotelial derivado de plaqueta (PD-ECGF), glucosa-oxidasa, colinesterasa sérica, aprotinina, proteína precursora de amiloido, inhibidor de tripsina interalfa, antitrombina III, especies apo-lipoproteínicas, proteína C, proteína S, o una variante o fragmento de cualquiera de los anteriores.
Una "variante", en el contexto de las proteínas citadas anteriormente, se refiere a una proteína donde en una o más posiciones se han producido inserciones, deleciones, o sustituciones de aminoácidos, sean conservadoras o no conservadoras, siempre que este tipo de cambios produzcan una proteína cuyas propiedades básicas, por ejemplo la actividad enzimática o unión de receptor (tipo de y actividad específica), termostabilidad, la actividad en un rango de pH determinado (estabilidad de pH) no han sido cambiadas de manera significativa. "De manera significativa" en este contexto significa que un experto en la técnica opinará que las propiedades de la variante pueden seguir siendo diferentes pero no serán tan evidentes con respecto a la proteína original.
Por "sustituciones conservadoras" nos referimos a combinaciones tales como Val, Ile, Leu, Ala, Met; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr, Gly, Ala; Lys, Arg, His; y Phe, Tyr, Trp. Sustituciones conservadoras preferidas incluyen Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe, Tyr.
Una "variante" tiene típicamente al menos el 25%, al menos el 50%, al menos el 60% o al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, incluso más preferiblemente al menos el 95%, aún más preferiblemente al menos el 99%, más preferiblemente al menos el 99.5% de identidad de secuencia con respecto al polipéptido desde donde ha derivado.
El porcentaje de identidad de secuencia entre dos polipéptidos puede ser determinado usando programas informáticos adecuados, por ejemplo el programa GAP del Grupo de Computación genética de la Universidad de Wisconsin y se apreciará el hecho de que el porcentaje de identidad está calculado en relación con polipéptidos cuya secuencia ha sido alineada de manera óptima.
La alineación puede efectuarse de forma alternativa usando el programa Clustal W (Tompson et al., (1994) Nucleic Acids Res., 22(22), 4673-80). Los parámetros usados pueden ser los siguientes:
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Parámetros de alineación de emparejamiento rápida: tamaño K-tuple(word); 1, tamaño de ventana; 5, penalización de espacio; 3, número de diagonales más elevadas; 5. Método de puntuación: x porcentaje.
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Parámetros de alineación múltiple: penalización de abertura de espacio; 10, penalización de extensión de espacio; 0.05.
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Matriz de puntuación: BLOSUM.
Tales variantes pueden ser naturales o realizadas mediante el uso de los métodos de ingeniería proteica y de mutagénesis dirigida al sitio muy conocidos en la técnica.
Un "fragmento" en el contexto de las proteínas citadas anteriormente, se refiere a una proteína donde se han producido deleciones en una o más posiciones. De esta manera, el fragmento puede comprender un máximo de 5, 10, 20, 30, 40 o del 50% de la secuencia completa del polipéptido maduro entero. Típicamente un fragmento comprende hasta el 60%, más típicamente hasta el 70%, preferiblemente hasta el 80%, más preferiblemente hasta el 90%, incluso más preferiblemente hasta el 95%, aún más preferiblemente hasta el 99% de la secuencia completa de la proteína deseada entera. Fragmentos particularmente preferidos de una proteína comprenden uno o más dominios enteros de la proteína.
En una forma de realización particularmente preferida la proteína heteróloga comprende la secuencia de albúmina o una variante o fragmento de ésta.
Con "albúmina" incluimos una proteína comprendiendo la secuencia de una proteína albúmina obtenida a partir de cualquier fuente. Típicamente la fuente es mamífera. En una forma de realización preferida la albúmina de suero es albúmina de suero humano ("HSA"). El término "albúmina de suero humano" incluye la definición de una albúmina de suero que posee una secuencia de aminoácidos formada naturalmente en seres humanos, y variantes de ésta. Preferiblemente la albúmina posee la secuencia de aminoácidos descrita en WO 90/13653 o una variante de ésta. La secuencia codificante de HSA puede ser obtenida por métodos conocidos para aislar el ADNc correspondiente a genes humanos, y está descrita también en, por ejemplo, EP 73 646 y EP 286 424.
En otra forma de realización preferida la "albúmina" comprende la secuencia de albúmina de suero bovino. El término "albúmina de suero bovino" incluye la definición de una albúmina de suero que posee una secuencia de aminoácidos formada naturalmente en vacas, por ejemplo provista con el número de registro P02769 de Swissprot, y variantes de ésta tal y como está definido más abajo. El término "albúmina de suero bovino" incluye también la definición de fragmentos de 
\hbox{albúmina
de suero bovino de longitud total o  variantes de éstos, tal como
definidos más abajo.}
En otra forma de realización preferida la albúmina comprende la secuencia de una albúmina derivada de una de las albúminas de suero de perro (ver por ejemplo número de registro P49822 Swissprot), de cerdo (por ejemplo ver número de registro P08835 Swissprot), de cabra (por ejemplo disponible en Sigma en forma de producto nº A2514 o A4164), de pavo (por ejemplo ver número de registro 073860 Swissprot), babuino (por ejemplo disponible en Sigma en forma de producto nº A1516), de gato (por ejemplo ver número de registro P49064 Swissprot), de pollo (por ejemplo ver número de registro P19121 Swissprot), de ovalbúmina (por ejemplo ovalbúmina de pollo) (por ejemplo ver número de registro P01012 Swissprot), de burro (por ejemplo ver número de registro P39090 Swissprot), de cobaya (por ejemplo disponible en Sigma en forma de producto nº A3060; A2639, 05483 o A6539), de hámster (por ejemplo disponible en Sigma en forma de producto nº A5409), de caballo (por ejemplo ver número de registro P35747 Swissprot), mono Rhesus (por ejemplo ver número de registro Swissprot Q28522), de ratón (por ejemplo ver número de registro 089020 Swissprot), de paloma (por ejemplo tal como definido por Khan et al, 2002, Int. J. Biol. Macromol., 30(3-4), 171-8), de conejo (por ejemplo ver número de registro P49065 Swissprot), de rata (por ejemplo ver número de registro P36953 Swissprot) y de oveja (por ejemplo ver número de registro P14639 Swissprot) e incluye variantes y fragmentos de éstos tal y como está definido más abajo.
Muchas formas mutantes de albúmina formadas naturalmente son conocidas. Muchas están descritas en Paters, (1996, All About Albumin: Biochemistry, Genetics and Medical Applications, Academic Press, Inc., San Diego, California, p.170-181). Una variante tal y como se ha definido anteriormente puede ser uno de estos mutantes producidos naturalmente.
Una "albúmina variante" se refiere a una proteína de albúmina donde se han producido inserciones, deleciones, o sustituciones de aminoácidos en una o más posiciones, sean conservadoras o no conservadoras, siempre que estos cambios produzcan una proteína de albúmina para la cual al menos una propiedad básica, por ejemplo actividad de unión (tipo de y actividad específica por ejemplo unión a la bilirrubina), osmolaridad (presión oncótica, presión coloidosmótica), el comportamiento en un rango de pH determinado (estabilidad de pH) no ha sido cambiada de manera significativa. "De manera significativa" significa en este contexto que un experto en la técnica opinará que las propiedades de la variante pueden seguir siendo diferentes pero no serán tan evidentes con respecto a las de la proteína original.
Con "sustituciones conservadoras" nos referimos a combinaciones tales como Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe, Tyr. Tales variantes pueden estar hechas por técnicas muy conocidas en la técnica, como por mutagénesis dirigida al sitio tal y como está descrito en la patente estadounidense Nº 4,302,386 publicada el 24 de Noviembre de 1981 para Stevens.
Típicamente una variante de albúmina tendrá más del 40%, normalmente al menos el 50%, más normalmente al menos el 60%, preferiblemente al menos el 70%, más preferiblemente al menos el 80%, aún más preferiblemente al menos el 90%, incluso más preferiblemente al menos el 95%, de la forma más preferible al menos el 98% o más de identidad de secuencia con la albúmina formada naturalmente. El porcentaje de identidad de secuencia entre dos polipéptidos pueden ser determinado mediante el uso de programas informáticos adecuados, por ejemplo el programa GAP del Grupo de Computación Genética de la Universidad de Wisconsin, y se apreciará el hecho de que el porcentaje de identidad está calculado con respecto a unos polipéptidos cuya secuencia ha sido alineada de manera óptima. La alineación puede ser realizada de forma alternativa mediante el uso del programa Clustal W (Thompson et al., 1994). Los parámetros usados pueden ser los siguientes:
Parámetros de alineación rápida de emparejamiento: Tamaño K-tuple(word); 1, tamaño de ventana; 5, penalización de espacio; 3, número de diagonales superiores 5. Método de puntuación: x porcentaje, parámetros de alineación múltiples: penalización de abertura de espacio; 10, penalización de extensión de espacio; 0.05. Matriz de puntuación: BLOSUM.
El término "fragmento" como se ha usado anteriormente incluye cualquier fragmento de albúmina de longitud total o una variante de éste, siempre que al menos una propiedad básica, por ejemplo actividad de enlace (tipo de y actividad específica por ejemplo de unión a la bilirrubina), osmolaridad (presión oncótica, presión coloidosmótica), el comportamiento en un rango de pH determinado (estabilidad de pH) no ha cambiado de manera significativa. "De manera significativa" en este contexto significa que un experto en la técnica opinarán que las propiedades de la variante pueden seguir diferentes pero serán inmediatamente evidentes con respecto a las de la proteína original. Un fragmento tendrá típicamente al menos 50 aminoácidos de largo. Un fragmento puede comprender al menos un subdominio entero de albúmina. Unos dominios de HSA han sido expresados como proteínas recombinantes (Dockal, M. et al., 1999, J. Biol. Chem., 274, 29303-29310), donde el dominio I era definido consistiendo en aminoácidos 1-197, el dominio II era definido consistiendo en aminoácidos 189-385 y el dominio III era definido consistiendo en aminoácidos 381-585. Un recubrimiento parcial de los dominios tiene lugar debido a la estructura \alpha-helix extendida (h10-h1) que existe entre los dominios I y II, y entre los dominios II y III (Peters, 1996, op. cit., Tabla 2-4). HSA comprende también seis subdominios (subdominios IA, IB, IIA, IIB, IIIA y IIIB). Los subdominios IA comprenden aminoácidos 6-105, el subdominio IB comprende aminoácidos 120-177, el subdominio IIA comprende 200-291 aminoácidos, el subdominio IIB comprende 316-369 aminoácidos, el subdominio IIIA comprende 392-491 aminoácidos y el subdominio IIIB comprende 512-583 aminoácidos. Un fragmento puede comprender la totalidad o parte de uno o más dominios o subdominios tal y como se ha definido anteriormente, o cualquier combinación de estos dominios y/o subdominios.
En otra forma de realización particularmente preferida la proteína heteróloga comprende la secuencia de transferrina o una variante o fragmento de ésta. El término "transferina" tal como se utiliza aquí incluye todos los elementos de la familia transferina (Testa, Proteins of iron metabolism, CRC Press, 2002; Harris & Aisen, Iron carriers and iron proteins, Vol. 5, Physical Bioinorganic Chemistry, VCH, 1991) y sus derivados, tal como la transferina, transferinas mutantes (Mason et al, 1993, Biochemistry, 32, 5472; Mason et al, 1998, Biochem. J., 330(1), 35), transferinas truncadas, lóbulos de transferina (Mason et al, 1996, Protein Expr. Purif., 8, 119; Mason et al, 1991, Protein Expr. Purif., 2, 214), lactoferrina, lactoferrinas mutantes, lactoferrinas truncadas, lóbulos de lactoferrina o fusiones de cualquiera de las mencionadas anteriormente para otros péptidos, polipéptidos o proteínas (Shin et al, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 2820; Ali et al, 1999, J. Biol. Chem., 274, 24066; Mason et al, 2002, Biochemistry, 41, 9448).
La transferina puede ser transferina humana. El término "transferina humana" es utilizado aquí para indicar un material que es indistinguible de la transferrina derivada de un humano o que es una variante o fragmento de ésta. Una "variante" incluye inserciones, deleciones y sustituciones, sean conservadoras o no conservadoras donde tales cambios no alteran esencialmente el enlace de ligandos útiles o propiedades inmunogénicas de transferina.
Unos mutantes de transferrina están incluidos en la invención. Tales mutantes pueden haber alterado la inmunogenicidad. Por ejemplo, mutantes de transferrina pueden exponer una glicosilación modificada (por ejemplo reducida). El modelo de glicosilación N-ligada de una molécula de transferrina puede ser modificado por adición/eliminación de secuencias de consenso de glicosilación de aminoácidos tal como N-X-S/T, en cualquiera o todas las posición N, X, o S/T.
Mutantes de transferrina pueden ser alterados en su unión natural a iones metálicos y/u otras proteínas, tales como receptores de transferrina. Un ejemplo de transferrina mutante modificada de esta manera está ejemplificada a continuación.
También incluimos variantes naturales polimórficas de transferrina humana o análogos de transferrina humana. Generalmente, variantes o fragmentos de transferrina humana tendrán al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40% o 50% (preferiblemente al menos 80%, 90% o 95%) de actividad de unión de ligandos de transferrina humana (por ejemplo unión de hierro), peso por peso. La actividad de unión de hierro de transferrina o una muestra de prueba puede ser determinada espectrofotométricamente por indices de absorbencia de 470 nm:280 nm para las proteínas en sus estados sin hierro y totalmente cargadas con hierro. Los reactivos no deberían contener hierro a menos que se indique lo contrario. El hierro puede ser eliminado de la transferrina o de la muestra de prueba por diálisis contra 0.1 M de citrato, 0.1 M de acetato, 10 mM de EDTA pH4.5. La proteína debería estar en aproximadamente 20 mg/ml en 100 mM de HEPES, 10 mM de NaHCO_{3} pH 8.0. Medida del índice de absorbencia 470 nm:280 nm de apo-transferrina (Calbiochem, CN Biosciences, Nottingham, UK) diluida en agua de tal forma que la absorbencia de 280 nm pueda ser determinada con precisión espectrofotométricamente (0% de unión de hierro). Preparación de 20 mM de solución de nitrilotriacetato de hierro (FeNTA) por disolución de 191 mg de ácido nitrotriacético en 2 ml de 1M de NaOH, adición posterior de 2 ml de 0.5M de cloruro férrico. Dilución en 50 ml con agua desionizada. Carga completa de apo-transferrina con hierro (100% de unión de hierro) por adición de un exceso suficiente de 20 mM de FeNTA recién preparado, diálisis posterior de la preparación de holotransferrina de manera completa contra 100 mM de HEPES, 10 mM de NaHCO_{3} pH8.0 para eliminar el FeNTA restante antes de medir el índice de absorbencia a 470 nm: 280 nm. Repetición del procedimiento usando una muestra de prueba, la cual inicialmente no debería contener hierro, y comparación de los índices finales con el control.
Por otra parte, fusiones heterólogas únicas o múltiples comprendiendo cualquiera de las anteriores; o fusiones heterólogas únicas o múltiples para la albúmina, transferrina o immunoglobinas o una variante o fragmento de cualquiera de éstas pueden ser usadas. Tales fusiones incluyen fusiones de N-terminal de albúmina, fusiones de C-terminales de albúmina y fusiones de albúmina de coN-terminal y C-terminal tal como ejemplificados en WO 01/79271, y fusiones de N-terminal de transferrina, fusiones de C-terminal de transferrina, y fusiones de co-N-terminal y C-
terminal.
Ejemplos de fusiones de transferrina son proporcionados en las solicitudes de patentes estadounidenses US2003/
0221201 y US2003/0226155, Shin, et al., 1995, Proc Natl Acad Sci U S A, 92, 2820, Ali, et al., 1999, J Biol Chem, 274, 24066, Mason, et al., 2002, Biochemistry, 41, 9448.
El experto en la materia también apreciará el hecho de que el marco de lectura abierto de cualquier otro gen o variante, o parte o cada, pueda ser utilizado como un marco de lectura abierto para un uso con la presente invención. Por ejemplo, el marco de lectura abierto puede codificar una proteína comprendiendo cualquier secuencia, siendo ésta una proteína natural (incluyendo un zimógeno), o una variante o un fragmento (que puede, por ejemplo, ser un dominio) de una proteína natural; o de una proteína totalmente sintética; o una fusión única o múltiple de diferentes proteínas (naturales o sintéticas). Tales proteínas pueden ser tomadas, aunque no exclusivamente, de las listas provistas por WO 01/79258, WO 01/79271, WO 01/79442, WO 01/79443, WO 01/79444 y WO 01/79480, o una variante o fragmento de éstas.
Aunque estas solicitudes de patente presentan la lista de proteínas en el contexto de socios de fusión para la albúmina, la presente invención no es tan limitada y, para los objetivos de la presente invención, cualquiera de las proteínas catalogadas aquí pueden ser presentadas solas o como parejas de fusión para la albúmina, la región Fc de inmunoglobulina, transferrina, lactoferrina o de cualquier otra proteína o fragmento o variante de cualquiera de las mencionadas anteriormente, en forma de polipéptido deseado.
La proteína heteróloga puede ser una proteína activa terapéuticamente. En otras palabras, puede tener un efecto médico reconocido en individuos, tales como seres humanos. Muchos tipos diferentes de proteínas terapéuticamente activas son muy conocidos en la técnica.
La proteína heteróloga puede comprender una secuencia guía eficiente para producir una secreción en levadura.
Varias secuencias de señal de polipéptidos naturales o artificiales (llamadas también preregiones de secreción) han sido usadas o desarrolladas para secretar proteínas a partir de células huéspedes. La secuencia de señal dirige la proteína naciente hacia la maquinaria de la célula que exporta proteínas desde la célula en el medio circundante o, en algunos casos, en el espacio periplásmico. La secuencia de señal está típicamente, aunque no necesariamente, situada en el término N del producto de traslación primaria y es generalmente, aunque no necesariamente, separada de la proteína durante el proceso de secreción, para producir la proteína "madura".
En el caso de algunas proteínas la entidad que es segregada inicialmente, después de la eliminación de la secuencia de señal, incluye otros aminoácidos en su término N llamado secuencia "pro", la entidad intermedia siendo llamada una "proproteína". Estas secuencias de soporte pueden ayudar a la proteína final a plegarse y a volverse funcional, y éstas son en general separadas posteriormente. En otros ejemplos, la proregión provee simplemente un sitio de ruptura para una enzima con el fin de separar la región prepro y no posee otra función conocida.
La prosecuencia puede ser eliminada durante la secreción de la proteína desde la célula o bien después de la exportación desde la célula dentro del medio circundante o espacio periplásmico.
Las secuencias polipéptidas que dirigen la secreción de proteínas, tanto si éstas se parecen a las secuencias de señal (es decir pre) como a las secuencias de secreción prepro, están indicadas como secuencias guía. La secreción de proteínas es un proceso dinámico que implica la traslación, translocación y tratamiento postranslacional, y una o más de estas fases no deben ser completadas necesariamente antes de empezar o completar otra.
Para la producción de proteínas en especies eucarióticas tales como las levaduras Saccharomyces cerevisiae, especies Zygosaccharomyces, Kluyveromyces lactis y Pichia pastoris, las secuencias guía conocidas incluyen las de la proteína de fosfatasa ácida de S. cerevisiae (Pho5p) (ver EP 366 400), la proteína invertasa (Suc2p) (ver Smith et al. (1955) Science, 229, 1219-1224) y proteína de choque térmico150 (Hsp150p) (ver WO 95/33833). Además, las secuencias guía de la proteína alfa-1 de factor de unión de S. cerevisiae (MF - 1) y de la proteína de lisozima humana y de albúmina de suero humano (HSA) han sido usadas, éstas últimas habiendo sida usadas especialmente, aunque no exclusivamente para la secreción de albúmina humana. WO 90/01063 expone una fusión de las secuencias guía MF\alpha-1 y HSA, que reduce ventajosamente la producción de un fragmento contaminante de albúmina humana con respecto al uso de la secuencia guía MF\alpha-1. Secuencias guía modificadas también están descritas en los ejemplos de esta aplicación y el lector apreciará el hecho de que estas secuencias guía pueden ser usadas con otras proteínas que la transferrina. Además, la secuencia guía de transferrina natural puede ser usada para la secreción directa de transferrina y otras proteínas heterólogas.
Cuando la chaperona es una proteína disulfuro isomerasa, entonces preferiblemente la proteína heteróloga comprende enlaces de disulfuro en su forma madura. Los enlaces de disulfuro pueden ser intramoleculares y/o intermoleculares.
La proteína heteróloga puede ser una proteína comercialmente útil. Algunas proteínas expresadas heterólogamente están destinadas a interactuar con la célula donde éstas son expresadas para provocar un efecto beneficioso en las actividades de células. Estas proteínas no son, en su propio derecho, comercialmente útiles. Unas proteínas comercialmente útiles son proteínas que tienen una utilidad ex vivo de la célula donde están expresadas. Sin embargo, el lector experto en la materia apreciará el hecho de que una proteína comercialmente útil también puede tener un efecto biológico en la célula huésped expresando ésta última en forma de proteína heteróloga, pero que este efecto no es la razón principal o única para la expresión de la proteína.
En una forma de realización se prefiere que la proteína heteróloga no sea \beta-lactamasa. En otra forma de realización se prefiere que la proteína heteróloga no sea antistasina. No obstante, el lector apreciará el hecho de que ninguna de estas condiciones excluyen la presencia de los genes codificantes de \beta-lactamasa o de antistasina en el plásmido de familia 2 \mum de la invención, simplemente, de que el gen codificante de la proteína heteróloga codifica otra proteína que la \beta-lactamasa y/o antistasina.
Unos plásmidos pueden ser preparados por modificación de los plásmidos de familia 2 \mupm conocidos en la técnica por inserción de un gen codificante de una chaperona e inserción de un gen codificante de una proteína heteróloga mediante el uso de técnicas bien conocidas en el arte de la técnica tales como las que son descritas por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2001, 3ª edición. Por ejemplo, tal método implica la ligadura por medio de extremidades cohesivas. Unas extremidades cohesivas compatibles pueden ser generadas en un fragmento de ADN para la inserción y un plásmido por la acción de enzimas de restricción adecuadas. Estas extremidades se fortalecerán rápidamente a través de un apareamiento básico complementario y unos cortes restantes pueden ser cerrados por la acción de ligasa de ADN.
En otro método se usan enlazadores de oligonucleótidos de doble cadena sintéticos y un adaptador. Fragmentos de ADN de extremos romos son generados por una T4 ADN polimerasa bacteriófaga o ADN polimerasa E. coli I que eliminan las terminales 3' salientes y rellenan los extremos 3' ahuecados. Unos enlazadores sintéticos y partes de ADN de doble cadena de extremos romos, que contienen secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción definidas pueden estar ligadas a fragmentos de ADN de extremos romos por una ligasa de ADN T4. Estos son digeridos posteriormente con enzimas de restricción apropiadas para crear extremos cohesivos y ligadas a un vector de expresión con terminales compatibles. Unos adaptadores son también fragmentos de ADN sintetizados químicamente que contienen un extremo romo utilizado para la ligadura pero que posee también un extremo cohesivo preformado. De forma alternativa un fragmento de ADN o fragmentos de ADN pueden estar ligados juntos por la acción de la ligasa de ADN en presencia o ausencia de uno o más oligonucleótidos de doble cadena sintéticos conteniendo opcionalmente unos extremos cohesivos.
Unos enlazadores sintéticos conteniendo una variedad de sitios de endonucleasa de restricción son disponibles comercialmente a partir de varias fuentes incluyendo Sigma-Genosys Ltd, London Road, Pampisford, Cambridge, United Kingdom.
Unos sitios de inserción apropiados en plásmidos de familia 2 \mum incluyen, pero no se limitan a éstos, los que se ham mencionado anteriormente.
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La presente invención provee también una célula huésped comprendiendo un plásmido tal como se ha definido anteriormente. La célula huésped puede ser cualquier tipo de célula. Células huéspedes bacterianas y de levadura son preferidas. Las células huéspedes bacterianas pueden ser útiles con propósitos de clonación. Las células huéspedes de levadura pueden ser útiles para la expresión de genes presentes en el plásmido.
En una forma de realización la célula huésped es una célula de levadura, tal como un elemento del género Saccharomyces, Kluyveromyces o Pichia, tal Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromices lactis, Pichia pastoris y Pichia membranaefaciens, o Zygosaccharomyces rouxii, Zygosaccharomyces bailii, Zygosaccharomyces fermentati, o Kluyveromices drosphilarum como los preferidos.
El tipo de célula huésped puede ser seleccionado para su compatibilidad con el tipo de plásmido que se está usando. Los plásmidos obtenidos a partir de una tipo de levadura pueden ser mantenidos en otros tipos de levadura (Irie et al, 1991, Gene, 108(1), 139-144; Irie et al, 1991, Mol. Gen. Genet., 225(2), 257-265). Por ejemplo, el pSR1 de Zygosaccharomyces rouxii puede ser mantenido en Saccharomyces cerevisiae. Preferiblemente, la célula huésped es compatible con el plásmido de familia 2 \mum usado (ver más abajo para una descripción completa de los plásmidos siguientes). Por ejemplo, cuando el plásmido está basado en pSR1, pSB3 o pSB4 entonces una célula de levadura adecuada es la Zygosaccharomyces rouxii; cuando el plásmido está basado en pSB1 o pSB2 entonces una célula de levadura adecuada es la Zygosaccharomyces bailli; cuando el plásmido está basado en pSM1 entonces una célula de levadura adecuada es Zygosaccharomyces fermentati; cuando el plásmido está basado en pKD1 entonces una célula de levadura adecuada es Kluyveromyces drosophilarum; cuando el plásmido está basado en pPM1 entonces una célula de levadura adecuada es Pichia membranaefaciens; cuando el plásmido está basado en el plásmido 2 \mum entonces una célula de levadura adecuada es Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces carlsbergensis. Se prefiere particularmente el hecho de que el plásmido se base en el plásmido 2 \mum y la célula de levadura sea Saccharomyces cerevisiae.
Un plásmido de familia 2 \mum de la invención puede estar definido por "basado en" un plásmido de origen natural si comprende uno, dos o preferiblemente tres de los genes FLP, REP1 y REP2 con secuencias derivadas de este plásmido de origen natural.
Puede ser particularmente ventajoso usar una levadura deficitaria en una o más transferasas de manosil de proteína implicadas en la O-glicosilación de proteínas, por ejemplo por ruptura de la secuencia codificante de gen.
Las proteínas expresadas de forma recombinante pueden estar sujetas a modificaciones postraslacionales indeseables por la célula huésped de producción. Por ejemplo, la secuencia de proteína de albúmina no contiene ningún sitio para una glicosilación N-ligada y no ha sido provista para ser modificada, en naturaleza, por una glicosilación O-ligada. No obstante, se ha descubierto que la albúmina humana recombinante ("rHA") producida en varias especies de levadura puede ser modificada por glicosilación O-ligada, en general implicando la manosa. La albúmina manosilada es capaz de enlazarse a la lectina Concanavalina A. La cantidad de albúmina manosilada producida por la levadura puede ser reducida mediante el uso de una cepa de levadura deficitaria en uno o más de los genes PMT (WO 94/04687). La forma más apropiada de realizarlo consiste en crear una levadura que tenga una carencia en su genoma para producir un nivel reducido de una de las proteínas Pmt. Por ejemplo, puede ser una deleción, inserción o transposición en la secuencia codificante o las regiones reguladoras (o en otro gen de regulación de la expresión de uno de los genes PMT) para producir una pequeña cantidad de o ninguna proteína Pmt. De forma alternativa, la levadura puede ser transformada para producir un agente anti-Pmt, tal como un anticuerpo anti- pmi.
Si se utiliza otra levadura que S. cerevisiae, la ruptura de uno o más de los genes equivalentes a los genes PMT de S. cerevisiae es también ventajoso, por ejemplo en Pichia pastoris Kluyveromyces lactis. La secuencia de PMT1 (o cualquier otro gen PMT) aislada de S. cerevisiae puede ser usada para la identificación o ruptura de genes que codifican actividades enzimáticas similares en otras especies fúngicas. La clonación del homólogo PMT1 de Kluyveromyces lactis está descrita en WO 94/04687.
La levadura tendrá de manera ventajosa una deleción de los genes HSP150 y/o YAP3 como se ha mostrado respectivamente en WO 95/33833 y WO 95/23857.
Un plásmido tal como definido anteriormente, puede ser introducido en un huésped a través de técnicas estándar. Con respecto a la transformación de células huéspedes procarióticas, ver, por ejemplo, Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad Sci. USA 69, 2110 y Sambrook et al (2001) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed. Cold. Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. La transformation de células de levadura está descrita en Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetic, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. El método de Beggs (1978) Nature 275, 104-109 es útil también. Métodos para la transformación de S. cerevisiae son mostrados generalmente en EP 251 744, EP 258 067 y WO 90/01063. Con respecto a las células de vertebrados, unos reactivos útiles para la transfección de tales células, por ejemplo fosfato cálcico y dextrana DEAE o formulaciones de liposomas, están disponibles en Stratagene Cloning Systems or Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USA.
La electroporación es útil también para transformar células y es muy conocida en la técnica para la transformación de una célula de levadura, células bacterianas y células de vertebrados. Unos métodos para la transformación de levadura por electroporación están descritos en Becker & Guarente (1990) Methods Enzimol. 194, 182.
Generalmente, el plásmido no transformará todos los huéspedes y por consiguiente será necesario seleccionar unas células huéspedes transformadas. De esta manera, un plásmido puede comprender un marcador seleccionable, incluyendo pero sin limitarse a éste, un marcador seleccionable bacteriano y/o un marcador seleccionable de levadura. Un marcador seleccionable bacteriano típico es el gen \beta-lactamasa aunque otros muchos son conocidos en la técnica. Un marcador seleccionable de levadura típico incluye LEU2, TRP1, HIS3, HIS4, URA3, URA5, SFA1, ADE2, MET15, LYS5, LYS2, ILV2, FBA1, PSEI, PDI1 y PGK1. Los expertos en la técnica apreciarán el hecho de que cualquier gen cuya deleción cromosómica o inactivación produce un huésped inviable, también llamados genes esenciales, puede ser usado como un marcador selectivo cuando un gen funcional está provisto en el plásmido, como se ha demostrado para PGK1 en una cepa de levadura pgk1 (Piper and Curran, 1990, Curr. Genet. 17, 119). Unos genes esenciales adecuados pueden estar presentes en la Base de Datos de Genoma Stanford (SGD), http:://db.yeastgenome.org). Cualquier producto genético esencial (por ejemplo PDI1, PSE1, PGK1 o FBA1) los cuales, cuando son eliminados o inactivados, no implican una necesidad auxotrófica (biosintético), puede ser usado en forma de marcador seleccionable en un plásmido en una célula huésped que, en la ausencia del plásmido, es incapaz de producir ese producto genético, para conseguir la estabilidad incrementada de plásmido sin el inconveniente de necesitar la célula que debe ser cultivada en condiciones selectivas específicas. Por "necesidad auxotrófica (biosintética)" incluimos una deficiencia que puede ser complementada por adiciones o modificaciones en el medio de crecimiento. En consecuencia, unos "genes marcadores esenciales" preferidos en el contexto de la presente invención son aquellos que, cuando son eliminados o inactivados en una célula huésped, producen una deficiencia que no puede ser complementada por adiciones o modificaciones en el medio de crecimiento.
Además, un plásmido según cualquier primer, segundo o tercer aspectos de la presente invención puede comprender más de un marcador seleccionable.
Una técnica de selección implica la incorporación en el vector de expresión de un marcador de secuencia de ADN, con cualquier elemento de control necesario, que codifica una característica seleccionable en la célula transformada. Estos marcadores incluyen dihidrofolato-reductasa, G418 o resistencia a la neomicina para el cultivo de células eucarióticas, y genes de resistencia a la tetraciclina, canamicina o ampicilina (es decir \beta-lactamasa) para el cultivo en E. coli y otras bacterias. De forma alternativa, el gen para este tipo de característica seleccionable puede estar en otro vector, utilizado para cotransformar la célula huésped deseada.
Otro método de identificación de células transformadas con éxito implica el crecimiento de las células obtenidas a partir de la introducción de un plásmido de la invención, opcionalmente para permitir la expresión de un polipéptido recombinante (es decir, un polipéptido codificado por una secuencia de polinucleótidos en el plásmido y que es heterólogo a la célula huésped, en la medida en que este polipéptido no es producido naturalmente por el huésped). Las células pueden ser recogidas y lisadas y su contenido de ADN o ARN examinado para determinar la presencia de la secuencia recombinante usando un método tal como el que está descrito por Southern (1975) J. Mol. Biol. 98, 503 or Berent et al (1985) Biotech. 3, 208 u otros métodos de análisis de ADN y ARN comunes en la técnica. De forma alternativa, la presencia de un polipéptido en el sobrenadante de un cultivo de una célula transformada puede ser detectado mediante el uso de anticuerpos.
Además de realizar el ensayo directamente para detectar la presencia de ADN recombinante, una transformación acertada puede ser confirmada por métodos inmunológicos bien conocidos cuando el ADN recombinante es capaz de dirigir la expresión de la proteína. Por ejemplo, unas células transformadas con éxito con un vector de expresión producen proteínas que exhiben una antigenicidad apropiada. Unas muestras de células suceptibles de ser transformadas son recogidas y probadas para determinar la proteína mediante el uso de anticuerpos adecuados.
De esta manera, además de las células huésped transformadas por sí- mismas, la presente invención considera también un cultivo de estas células, preferiblemente un cultivo monoclonal (homogéneo clonalmente), o un cultivo derivado de un cultivo monoclonal, en un medio nutritivo. De forma alternativa, las células transformadas pueden representar un producto industrialmente/comercialmente o farmacéuticamente útil y puede ser usadas sin purificación adicional o pueden ser purificadas a partir de un medio de cultivo, y formuladas opcionalmente con un portador o diluyente de manera apropiada para su uso de destino industrial/comercial o uso farmacéutico, y opcionalmente empaquetadas y presentadas de manera adecuada para dicho uso. Por ejemplo, células enteras podrían ser inmovilizadas; o utilizadas para pulverizar un cultivo celular directamente sobre/dentro de un proceso, cosecha u otro blanco deseado. De manera similar, una célula completa, tal como células de levadura pueden ser usadas en forma de cápsulas para una variedad importante de aplicaciones, tales como fragancias, sabores y fármacos.
Unas células huéspedes transformadas pueden ser cultivadas durante un tiempo suficiente y en condiciones apropiadas conocidas por los expertos en la técnica, y según los enseñamientos descritos aquí, para permitir la expresión de la chaperona y proteína heteróloga codificada por el plásmido.
El medio de cultivo puede ser no selectivo o aplicar una presión selectiva en el mantenimiento del plásmido.
La proteína heteróloga producida de esta manera puede estar presente intracelularmente o, si ha sido segregada, en el medio de cultivo y/o espacio periplásmico de la célula huésped.
La fase de "purificación de proteína heteróloga expresada de esta manera a partir de la célula huésped cultivada o del medio de cultivo" comprende opcionalmente una inmovilización de células, separación de células y/o rotura de células, pero comprende siempre al menos otra fase de purificación diferente a la fase o las fases de inmovilización, separación y/o rotura de células.
Técnicas de inmovilización de célula, como el revestimiento de las células mediante el uso de una membrana de alginato cálcico, son conocidas en la técnica. De manera similar, las técnicas de separación de células, como un centrifugado, filtración (por ejemplo filtración de flujo transversal, cromatografía de lecho expandido y técnicas similares son conocidas en el arte de la técnica. Asimismo, unos métodos de rotura celular, incluyendo molienda de membrana, sonicación, exposición enzimática y similares son muy conocidos en la técnica.
Al menos la otra fase de purificación puede ser cualquier otra fase adecuada de purificación de proteínas conocida en la técnica. Por ejemplo técnicas de purificación para la recuperación de la albúmina expresada de forma recombinante han sido descritas en: WO 92/04367, eliminación de colorante derivado de matriz; EP 464 590, eliminación de colorantes derivados de levadura; EP 319 067, precipitación alcalina y aplicación posterior de la albúmina a una fase lipofílica; y WO 96/37515, US 5 728 553 y WO 00/44772, que describen procesos de purificación completos.
Otras proteínas que la albúmina pueden ser purificadas a partir del medio de cultivo por cualquier técnica considerada útil para purificar tales proteínas.
Unos métodos adecuados incluyen sulfato de amonio o precipitación de etanol, extracción de ácido o de solvente, cromatografía de intercambio de aniones o cationes, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita, cromatografía de lectina, concentración, dilución, ajuste de pH, diafiltración, ultrafiltración, cromatografía líquida de alto rendimiento ("HPLC"), HPLC de fase inversa, ajuste de conductividad y similares.
En una forma de realización, cualquiera o varias de las técnicas mencionadas anteriormente pueden ser usadas para otra purificación de la proteína aislada de tal manera, en un nivel de pureza comercial o industrialmente aceptable. Por nivel de pureza aceptable comercial o industrialmente, incluimos el suministro de la proteína en una concentración de al menos 0.01 g.L^{-1}, 0.02 g.L^{-1}, 0.03 g.L^{-1}, 0.04 g.L^{-1}, 0.05 g.L^{-}1, 0.06 g.L^{-1}, 0.07 g.L^{-1}, 0.08 g.L^{-1}, 0.09 g.L^{-1}, 0.1 g.L^{-1}, 0.2 g.L^{-1}, 0.3 g.L^{-1}, 0.4 g.L^{-}, 0.5 g.L^{-1}, 0.6 g.L^{-1}, 0.7 g-L^{-1}, 0.8 g.L^{-1}, 0.9 g.L^{-1}, 1 g.L^{-1}, 2 g.L^{-1}, 3 g.L^{-1}, 4 g.L^{-1}, 5 g.L^{-1}, 6 g.L^{-1}, 7 g.L^{-1}, 8 g.L^{-1}, 9 g.L^{-1}, 10 g.L^{-1}, 15 g.L^{-1}, 20 g.L^{-1}, 25 g.L^{-1}, 30 g,L^{-1}, 40 g.L^{-1}, 50 g.L^{-1}, 60 g.L^{-1}, 70 g.L^{-1}, 80 g.L^{-1}, 90 g.L^{-1}, 100 g.L^{-1}, 150 g.L^{-1}, 200 g.L^{-1}, 250 g.L^{-1}, 300 g.L^{-1}, 350 g.L^{-1}, 400 g.L^{-1}, 500 g.L^{-1}, 600 g.L^{-1}, 700 g.L^{-1}, 800 g.L^{-1}, 900 g.L^{-1}, 1000 g.L^{-1}, o más.
Se prefiere que la proteína heteróloga sea purificada para conseguir un nivel de pureza aceptable farmacéuticamente. Una proteína tiene un nivel de pureza aceptable farmacéuticamente cuando no contiene esencialmente pirógenos y puede ser administrada en una cantidad eficaz desde un punto de vista farmacéutico sin causar efectos médicos no asociados con la actividad de la proteína.
La proteína heteróloga resultante puede ser usada para cualquiera de sus utilidades conocidas, las cuales, en el caso de la albúmina, incluyen la administración por i.v. a pacientes para tratar quemaduras severas, golpes y pérdidas de sangre, medios de cultivo complementarios, y en forma de excipiente en formulaciones de otras proteínas.
Aunque se pueda administrar individualmente una proteína heteróloga terapéuticamente útil obtenida por un proceso de la invención, es preferible presentarla como una fórmula farmacéutica, junto con uno o más portadores o diluyentes aceptables. El(los) portador(s) o diluyente(s) debe(n) ser "aceptable(s)" en la medida en que deben ser compatible(s) con la proteína deseada y no deletorio(s) para los receptores de ésta. Típicamente, los portadores o diluyentes serán agua o solución salina que será estéril y sin pirógenos.
Opcionalmente la proteína formulada de esta manera será presentada en forma de dosis unitaria, como una pastilla, cápsula, solución inyectable o similar.
Otra forma de realización de la presente invención provee proteínas codificantes de forma recombinante de células huésped comprendiendo las secuencias de PDI y proteínas basadas en transferrina. Por "proteína basada en transferrina" entendemos transferrina o cualquier otro elemento de la familia transferrina (por ejemplo lactoferrina), una variante o fragmento de éstas o una proteína de fusión comprendiendo transferrina, una variante o fragmento de ésta, incluyendo los tipos descritos anteriormente. Así, la presente invención provee también para el uso de un gen de PDI recombinante, el incremento de la expresión de una proteína basada en transferrina.
El gen de PDI puede estar provisto en un plásmido, tal como unplásmido de familia 2 \mum como se ha descrito anteriormente. De manera alternativa, el gen de PDI puede ser integrado cromosómicamente. En una forma de realización preferida, el gen de PDI es integrado cromosómicamente en la localización de un gen de PDI codificado endógenamente, preferiblemente sin interrumpir la expresión del gen de PDI endógeno. En este contexto, "sin romper la expresión del gen de PDI endógeno" significa que, aunque alguna reducción de la producción de proteína del gen de PDI endógeno como resultado de la integración pueda ser aceptable (y preferiblemente no existe ninguna reducción), se incrementa el nivel total de producción de proteína PDI en la célula huésped modificada como resultado del efecto combinado de expresión del endógeno y genes de PDI integrados, con respecto al nivel de producción de proteína PDI por la célula huésped antes del evento de integración.
El gen codificante de la proteína basada en transferrina puede estar provista en un plásmido, como un plásmido de familia 2 \mum tal como descrito anteriormente, o puede estar integrado cromosómicamente, como en la localización de un gen de PDI codificado endógenamente, preferiblemente sin interrumpir la expresión del gen de PDI endógeno.
En una forma de realización el gen de PDI es integrado cromosómicamente y el gen codificante de la proteína basada en transferrina está provista en un plásmido. En otra forma de realización, el gen de PDI está provisto en un plásmido y el gen codificante de la proteína basada en transferrina está integrada cromosómicamente. En otra forma de realización el gen de PDI y el gen codificante de la proteína basada en transferrina están integrados cromosómicamente. En otra forma de realización el gen de PDI y el gen codificante de la proteína basada en transferrina están provistos en un plásmido.
Como se ha mencionado anteriormente, Bao et al, 2000, Yeast, 16, 329-341 revelaba que la sobreexpresión del gen KIPDI1 de PDI K. lactis era tóxico para células K. lactis. Contra estos antecedentes hemos descubierto de manera inesperada que, no sólo es posible sobreexpresar la PDI y otras chaperonas sin los efectos perjudiciales revelados en Bao et al, sino que dos chaperonas diferentes pueden ser sobreexpresadas de forma recombinante en la misma célula y, en vez de ser tóxicas, pueden incrementar la expresión de proteínas heterólogas hasta niveles superiores a los niveles obtenidos por la expresión individual de cualquiera de las chaperonas. Esto no estaba previsto. Al contrario, según las enseñanzas de Bao et al, se podrá pensar que la sobreexpresión de dos chaperonas sería incluso más tóxica que la sobreexpresión de una sola. Además, según las conclusiones anteriores de la presente invención, se esperaba que los incrementos de la expresión de proteína heteróloga obtenidos por coexpresión con una única chaperona llegarían hasta el máximo nivel posible para el sistema de célula empleado. En consecuencia, fue particularmente sorprendente descubrir que incluso otros incrementos de la expresión de proteína heteróloga podían ser obtenidos por coexpresión de dos chaperonas diferentes con la proteína heteróloga.
Por consiguiente, en un quinto aspecto de la presente invención se provee un método para la producción de proteína heteróloga comprendiendo el suministro de una célula huésped (tal como definida anteriormente) comprendiendo un primer gen recombinante codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de una primera proteína de chaperona, un segundo gen recombinante codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de una segunda proteína de chaperona y un tercer gen recombinante codificante de una proteína heteróloga, donde las primera y segunda chaperonas son diferentes; cultivo de la célula huésped en un medio de cultivo en condiciones que permiten la expresión de los primer, segundo y tercer genes; y opcionalmente purificación de la proteína heteróloga expresada a partir de la célula huésped cultivada o el medio de cultivo; y opcionalmente también, liofilización de la proteína purificada.
El método puede comprender además la fase de formulación de la proteína heteróloga purificada con un portador o diluyente y opcionalmente de presentación de la proteína formulada en forma de dosis unitaria, según el modo mencionado anteriormente.
Los términos "gen recombinante" incluyen secuencias de ácidos nucleicos que operan independientemente como secuencias expresables "autónomas" para producir una proteína codificada o, en la alternativa, secuencias de ácidos nucleicos introducidas que operan en combinación con secuencias endógenas (tal como por integración dentro de una secuencia endógena para producir una secuencia de ácidos nucléicos que es diferente a la secuencia endógena) al interior del huésped para causar la expresión incrementada de una proteína blanco.
Las primera y segunda chaperonas pueden ser una chaperona tal como mencionada anteriormente, y son una combinación de chaperonas que, cuando son coexpresadas en la misma célula huésped, proporcionan un efecto aditivo para el incremento de expresión de la proteína heteróloga. Por "efecto aditivo" entendemos que el nivel de expresión de la proteína heteróloga en la célula huésped es más elevado cuando los primer y segundo genes recombinantes son simultáneamente coexpresados con el tercer gen recombinante en comparación con el mismo sistema donde (i) el primer gen recombinante es coexpresado con el tercer gen recombinante en la ausencia de la expresión del segundo gen recombinante y (ii) el segundo gen recombinante es coexpresado con el tercer gen recombinante en la ausencia de la expresión del primer gen recombinante.
Una chaperona preferida es la isomerasa de disulfuro de proteína. Otra chaperona preferida es ORM2 o un fragmento o variante de ésta. En una forma de realización particularmente preferida, las primera y segunda chaperonas son isomerasa de disulfuro de proteína y ORM2 o un fragmento o variante de ésta.
Los primer, segundo y tercer genes recombinantes pueden estar presentes cada uno individualmente en un plásmido al interior de la célula huésped (tal como un plásmido de familia 2 \mum, como se ha citado anteriormente) o estar integrados cromosómicamente al interior del genoma de la célula huésped. Se apreciará el hecho de que cualquier combinación de plásmido y de primer, segundo y tercer genes recombinantes integrados cromosómicamente pueden ser usados. Por ejemplo, los primer, segundo y tercer genes recombinantes integrados cromosómicamente pueden estar presentes cada uno individualmente en un plásmido, y este puede ser o bien ese mismo plásmido o plásmidos diferentes. De forma alternativa, el primer gen recombinante puede estar presente en un plásmido, y los segundo y tercer genes recombinantes integrados cromosómicamente pueden ser integrados cromosómicamente al interior del genoma de la célula huésped. De forma alternativa, los primer y segundo genes recombinantes pueden estar presentes en un plásmido y el tercer gen recombinante puede ser integrado cromosómicamente al interior del genoma de la célula huésped. De forma alternativa, los primer y tercer genes recombinantes integrados cromosómicamente pueden estar presentes en un plásmido y el segundo gen recombinante puede ser integrado cromosómicamente al interior del genoma de la célula huésped. De forma alternativa, los primer y el segundo gen recombinante puede ser integrados cromosómicamente al interior del genoma de la célula huésped y el tercer gen recombinante puede estar presente en un plásmido. De forma alternativa, los primer, segundo y tercer genes recombinantes integrados cromosómicamente pueden ser integrados cromosómicamente cada uno individualmente al interior del genoma de la célula huésped.
Unos plásmidos particularmente preferidos son aquellos definidos anteriormente con respecto a aspectos anteriores de la presente invención. Por consiguiente, la presente invención provee también un plásmido tal como definido anteriormente donde el plásmido comprende dos genes diferentes (los primer y segundo genes recombinantes) codificantes de chaperonas diferentes. En una forma de realización preferida, el plásmido puede comprender además un gen codificante de una proteína heteróloga (el tercer gen recombinante), tal como una proteína heteróloga como se ha descrito anteriormente.
Un sexto aspecto de la presente invención consiste en proveer un método para la producción de una proteína heteróloga, como una proteína heteróloga tal como definida anteriormente para un aspecto anterior de la presente invención, comprendiendo: el suministro de una célula huésped comprendiendo un primer gen recombinante codificante de la proteína comprendiendo la secuencia de ORM2 o una variante de ésta y un segundo gen recombinante codificante de una proteína heteróloga; el cultivo de la célula huésped en un medio de cultivo en condiciones que permiten la expresión de los primer y segundo genes; y la purificación de la proteína heteróloga expresada de esta manera a partir de la célula huésped cultivada o del medio de cultivo; y opcionalmente, liofilización de la proteína purificada; y opcionalmente formulación de la proteína heteróloga purificada con un portador o diluyente; y opcionalmente presentación de la proteína formulada en forma de dosis unitaria.
Según la manera mencionada anteriormente, la célula huésped también puede comprender otro gen recombinante codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de una chaperona alternativa a ORM2 o una variante de ésta.
Cada uno o ambos primer y segundo genes recombinantes pueden ser expresados a partir de un plásmido, y preferiblemente a partir del mismo plásmido. Otro gen recombinante codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de una chaperona alternativa a ORM2 o una variante de ésta puede ser expresado también a partir de un plásmido, preferiblemente del mismo plásmido como cada o ambos primer y segundo genes recombinantes. El plásmido puede ser un plásmido de familia 2 \mum tal como el plásmido 2 \mum
La presente invención provee también, en un séptimo aspecto, para el uso de una secuencia de ácidos nucléicos codificante de la proteína ORM2 o una variante de ésta un incremento de la producción, en una célula huésped, de una proteína heteróloga codificada por un gen recombinante en la célula huésped por coexpresión de la secuencia de ácidos nucléicos y el gen recombinante al interior de la célula huésped. Cada uno o ambos, secuencia de ácidos nucléicos y gen recombinante codificante de la proteína heteróloga, pueden ser expresados a partir de un plásmido al interior de la célula huésped, y preferiblemente a partir del mismo plásmido. Según la manera mencionada anteriormente, la célula huésped puede comprender también un gen recombinante codificante de una chaperona alternativa a ORM2 o una variante de ésta, que puede estar situado en un plásmido al interior de la célula huésped, preferiblemente en el mismo plásmido que cada uno o ambos, secuencia de ácidos nucléicos y gen recombinante codificante de la proteína heteróloga. Unos plásmidos adecuados incluyen un plásmido de familia 2 \mum, como el plásmido 2 \mum tal como mencionado anteriormente.
Un octavo aspecto de la presente invención consiste en proveer también el uso de un plásmido en forma de vector de expresión para incrementar la producción de una proteína heteróloga mediante el suministro de un gen recombinante codificante de la proteína heteróloga y un gen codificante de ORM2 o una variante de éstos en el mismo plásmido. El plásmido también puede comprender un gen codificante de una chaperona alternativa a ORM2 o una variante de ésta según la manera mencionada anteriormente. Unos plásmidos adecuados incluyen un plásmido de familia 2 \mum como el plásmido 2 \mum tal como mencionado anteriormente.
Por consiguiente, en un noveno aspecto, la presente invención provee también un plásmido de familia 2 \mum, preferiblemente un plásmido de expresión, comprendiendo un primer gen codificante de la proteína ORM2 o una variante o fragmento de ésta y un segundo gen codificante de una proteína heteróloga, tal como mencionado anteriormente. El plásmido puede comprender también un tercer gen codificante de una chaperona alternativa a ORM2 o una variante de ésta. En una forma de realización preferida, el tercer gen codifica una proteína comprendiendo la secuencia de proteína disulfuro isomerasa.
También hemos demostrado que un gen transmitido por plásmido codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de una chaperona "esencial", tal como PDI, puede ser usada para mantener de forma estable el plásmido en una célula huésped que, en la ausencia del plásmido, no produce la chaperona, y simultáneamente incrementar la expresión de una proteína heteróloga codificada por un gen recombinante al interior de la célula huésped. Este sistema es ventajoso ya que permite al usuario minimizar el número de genes recombinantes que necesitan ser transportados por un plásmido. Por ejemplo, los plásmidos de técnica anterior típicos transportan genes marcadores (como los que se han descrito anteriormente) que permiten que el plásmido sea mantenido de forma estable durante el proceso de cultivo de células huésped. Estos genes marcadores deben ser retenidos en el plásmido además de cualesquiera otros genes requeridos para conseguir un efecto deseado. No obstante, la capacidad de los plásmidos para incorporar secuencias de ADN exógenas es limitada y en consecuencia ventajosa para minimizar el número de inserciones de secuencias requeridas para conseguir un efecto deseado. Además, algunos genes marcadores (como genes marcadores auxotróficos) requieren la realización del proceso de cultivo en condiciones específicas para obtener el efecto del gen marcador. Estas condiciones específicas no pueden ser óptimas para un crecimiento celular o la producción de proteína, o pueden requerir el uso de sistemas de crecimiento caros ineficientes o indebidos.
Con el fin de incrementar la expresión génica heteróloga, hemos descubierto que se puede usar un gen que codifica de forma recombinante una proteína comprendiendo la secuencia de una chaperona "esencial" para el doble propósito de incremento de la producción de una proteína heteróloga en una célula huésped y en el papel de un marcador seleccionable en un plásmido, donde el plásmido está presente al interior de una célula que, en la ausencia del plásmido, es incapaz de producir la chaperona. Este sistema posee como ventaja de minimizar el número de genes recombinantes que necesitan ser transportados por el plásmido. El sistema posee también como ventaja el hecho de que la célula huésped puede ser cultivada en condiciones que no deben ser adaptadas a ningún gen marcador particular, sin perder la estabilidad del plásmido. Por ejemplo, células huésped producidas a través del uso de este sistema pueden ser cultivadas en medios ricos, que pueden ser más económicos que el medios mínimo usado comúnmente para proporcionar a los genes marcadores auxotróficos su efecto.
Por consiguiente, también describimos una célula huésped comprendiendo un plásmido, el plásmido comprendiendo un gen que codifica una chaperona esencial donde, en la ausencia del plásmido, la célula huésped es incapaz de producir la chaperona. Preferiblemente, en la ausencia del plásmido, la célula huésped es inviable. La célula huésped puede comprender también un gen recombinante codificante de una proteína heteróloga, como los que se han descrito anteriormente con respecto a aspectos anteriores de la invención.
También describimos un plásmido comprendiendo, como el único marcador seleccionable, un gen codificante de una chaperona esencial. El plásmido puede comprender además un gen codificante de una proteína heteróloga. El plásmido puede ser un plásmido de familia 2 \mum.
También describimos un método para la producción de una proteína heteróloga comprendiendo las etapas de: suministro de una célula huésped comprendiendo un plásmido, el plásmido comprendiendo un gen que codifica una chaperona esencial donde, en la ausencia del plásmido, la célula huésped es incapaz de producir la chaperona y donde la célula huésped comprende además un gen recombinante codificante de una proteína heteróloga; el cultivo de la célula huésped en un medio de cultivo en condiciones que permiten la expresión de la chaperona esencial y de la proteína heteróloga; y opcionalmente la purificación de la proteína heteróloga expresada a partir de la célula huésped cultivada o del medio de cultivo; y también opcionalmente, la liofilización de la proteína purificada.
El método puede comprender también la fase de formulación de la proteína purificada heteróloga con un portador o diluyente y opcionalmente la presentación de la proteína formulada en forma de dosis unitaria, según la manera mencionada anteriormente. En una forma de realización preferida, el método implica el cultivo de la célula huésped en medios no selectivos, tal como un medio rico.
Hemos descubierto de forma inesperada también que diferentes genes de PDI tienen la capacidad de incrementar la expresión de proteínas heterólogas mediante distintas cantidades en condiciones de cultivo particular. En particular, como citado en el ejemplo 8, hemos mostrado que el gen PDI1 de SKQ2n provee una expresión de proteína heteróloga más elevada que el gen PDI1 de S288c, cuando las células huéspedes son cultivadas en un medio mínimo.
La única diferencia entre las proteínas codificadas de los genes PDI1 de SKQ2n y PDI1 de S288c es que la SKQ2n comprende los aminoácidos adicionales EADAEAEA en posiciones 506-513 (posiciones definidas en referencia al nº CAA38402 de registro Genbank, como indicado anteriormente).
Las diferencias entre las secuencias de gen usadas son mostradas en la alineación de secuencia proporcionada en la figura 94 y puede ser resumidas de la manera siguiente:
-
el promotor de SKQ2a incluye la ejecución de catorce repeticiones "TA", mientras que el promotor de S288c tiene sólo doce repeticiones "TA":
-
Seer41 es codificado por TCT en SKQ2n, pero por TCC en S288c;
-
Glu44 es codificado por GAA en SKQ2n pero por GAG en S288c;
-
Leu262 es codificado por TTG en SKQ2n pero por TTA en S288c;
-
Asp514 es codificado por GAC en SKQ2n pero el homólogos Asp506 es codificado por GAG en S288c;
-
La secuencia terminadora SKQ2n contiene la realización de 8 bases consecutivas "A", mientras que la secuencia terminadora S288c contiene la realización de 7 bases consecutivas "A" y no incluye una base "A" en el equivalente de posición 1880 en el gen de SKQ2n;
-
La secuencia terminadora SKQ2n tiene un "C" en la posición 1919, mientras que la secuencia terminadora S288c tiene un "T" en la posición equivalente.
Puede ser ventajoso incluir cualquiera o todas las características mencionadas anteriormente del gen de SKQ2n en un gen de PDI seleccionado, para conseguir el incremento observado en la expresión de proteína heteróloga cuando las células huéspedes son cultivadas en un medio mínimo.
Por consiguiente, también describimos una secuencia de nucleótidos codificante de una isomerasa de disulfuro de proteína, para su uso en el incremento de la expresión de una proteína heteróloga en una célula huésped mediante la expresión de la secuencia nucleótida al interior de la célula huésped, la cual célula huésped es cultivada en un medio mínimo, donde la secuencia de nucleótidos codificante de la proteína disulfuro isomerasa se caracteriza por el hecho de tener al menos una de las siguientes características:
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la secuencia nucleótida comprende un promotor que posee la secuencia de un promotor de PDI natural o una variante funcional de ésta y comprende la realización de catorce repeticiones "TA"; o
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la proteína disulfuro isomerasa codificada comprende los aminoácidos EADAEAEA o una variante sustituida de forma conservadora de éstos, típicamente en posiciones 506-513 tal como definido en referencia al nº CAA38402 de registro Genbank; o
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el residuo Ser41 de la proteína disulfuro isomerasa codificada es codificado por el codón TCT; o
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el residuo Glu44 de la proteína disulfuro isomerasa codificada es codificado por el codón GAA; o
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el residuo Leu262 de la proteína disulfuro isomerasa codificada es codificado por el codón TTG; o
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el residuo Asp514 de la proteína disulfuro isomerasa codificada es codificado por el codón GAC; o
-
la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia terminadora que posee la secuencia de un terminador de PDI natural o una variante funcional de ésta y comprende también la realización de 8 bases consecutivas "A" y/o de la base "C" en la posición 1919 (tal como definida en referencia a la posición 1919 de la secuencia terminadora de SKQ2n natural).
También describimos un método para la producción de una proteína heteróloga comprendiendo las etapas de: suministro de una célula huésped comprendiendo un gen recombinante que codifica una proteína disulfuro isomerasa y que posee la secuencia de la secuencia de ácidos nucléicos definida anteriormente, la célula huésped comprendiendo también un gen recombinante codificante de una proteína heteróloga; el cultivo de la célula huésped en un medio de cultivo mínimo en condiciones que permiten la expresión de la proteína disulfuro isomerasa y la proteína heteróloga; y opcionalmente la purificación de la proteína heteróloga expresada a partir de la célula huésped cultivada o del medio de cultivo; y también opcionalmente, la liofilización de la proteína purificada de esta manera; y opcionalmente otra formulación de la proteína heteróloga purificada con un portador o diluyente; y opcionalmente la presentación de la proteína formulada en forma de dosis unitaria, según la manera mencionada anteriormente.
Los genes codificantes de PDI y de proteína heteróloga pueden estar provistos de la manera descrita anteriormente con respecto a otras formas de realización de la presente invención.
También hemos descubierto que los efectos de las chaperonas provistas de forma recombinante según las otras formas de realización de la presente invención pueden ser moduladas por modificación de los promotores que controlan los niveles de expresión de la(s) chaperona(s). Sorprendentemente se ha descubierto que, en algunos casos, unos promotores más cortos producen la expresión incrementada de proteína heteróloga. Sin estar limitados por la teoría, pensamos que esto se debe al hecho de que la expresión de una chaperona recombinante en células huéspedes que ya expresan proteínas heterólogas en niveles elevados, puede causar la sobrecarga de las células por sí-mismas con una proteína expresada heterólogamente, consiguiendo así un pequeño o ningún incremento global de la producción de proteína heteróloga. En estos casos, puede ser beneficioso proveer genes de chaperona recombinante con promotores truncados.
Por consiguiente, también describimos un polinucleótido (como un plásmido tal como definido anteriormente) comprendiendo la secuencia de un promotor conectado operativamente a una secuencia de codificación codificante de una chaperona (como las que se han descrito anteriormente), para un uso para el incremento de la expresión de una proteína heteróloga (como las que se han descrito anteriormente) en una célula huésped (como las se han descrito anteriormente) por expresión de la secuencia de polinucleótidos al interior de la célula huésped, donde el promotor se caracteriza por el hecho de conseguir un nivel de expresión modificado, por ejemplo superior o inferior de la chaperona que se conseguiría si la secuencia codificante estuviera conectada operativamente a su promotor producido naturalmente.
También describimos un método para la producción de una proteína heteróloga comprendiendo las etapas de: suministro de una célula huésped comprendiendo un gen recombinante que comprende la secuencia de promotor conectada operativamente a una secuencia de codificación codificante de una chaperona, el promotor siendo caracterizado por el hecho de que se consigue un nivel de expresión de la chaperona inferior al nivel que se conseguiría si la secuencia codificante estuviera conectada operativamente a su promotor producido naturalmente, y la célula huésped comprende también un gen recombinante codificante de una proteína heteróloga; cultivo de la célula huésped en condiciones que permiten la expresión de la chaperona y de la proteína heteróloga; y opcionalmente purificación de la proteína heteróloga expresada a partir de la célula huésped cultivada o el medio de cultivo; y opcionalmente también, liofilización de la proteína purificada; y opcionalmente otra formulación de la proteína heteróloga purificada con un portador o diluyente; y opcionalmente presentación de la proteína formulada en forma de dosis unitaria, según la manera mencionada anteriormente.
Como es evidente con los ejemplos de la presente aplicación, la combinación de PDI expresada de forma recombinante y de proteínas basadas en transferrina provee un nivel sorprendentemente alto de la expresión de transferrina. Por ejemplo, la expresión de transferrina en una sistema que incluye un gen de PDI recombinante codificado cromosómicamente proveía un incremento de 2 veces (en comparación con un control donde no existe ningún gen de PDI recombinante codificado cromosómicamente). Este incremento era 5 veces superior a un sistema equivalente comprendiendo una albúmina humana codificante de gen recombinante en lugar del gen de transferrina recombinante.
El huésped puede ser cualquier tipo de célula, tal como una célula procariótica (por ejemplo células bacterianas tales como E. coli) o una célula eucariótica. Células eucarióticas preferidas incluyen células micóticas, tales como células de levadura, y células mamíferas. Ejemplos de células de levadura están citados más arriba. Ejemplos de células mamíferas incluyen células humanas.
Las células huéspedes como se han descrito anteriormente pueden ser cultivadas para producir proteínas recombinantes basadas en transferrina. Las proteínas basadas en transferrina producidas de esta manera pueden ser aisladas del cultivo y purificadas, preferiblemente en un nivel de pureza aceptable farmacéuticamente, por ejemplo mediante el uso de técnicas conocidas en la técnica y/o como establecidas más arriba. Las proteínas basadas en transferrina purificadas pueden estar formuladas con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable y pueden estar presentadas en forma de dosis unitaria.
La presente invención será ejemplificada ahora en referencia a los ejemplos y figuras no-limitativos siguientes.
Breve descripción de las figuras
Las figuras 1, 2, 4, 6 a 15, 22, 25, 27 a 52, 57 a 71, 74, 75, 77 a 79, 81 a 83, 85 a 91, 95 y 96 muestran varios mapas de plásmido.
La figura 3 muestra sitios de inserción de plásmido.
La figura 5 muestra una mapa de restricción de un fragmento de ADN conteniendo la secuencia codificante de PDI.
La figura 16 muestra los resultados de determinación de inmunoelectroforesis en cohete (RIE) de una secreción (N413Q, N611 Q) de transferrina recombinante incrementada con una sobreexpresión de PD11. Las reservas de levadura conservadas por crionización fueron cultivadas durante 4 días en 10 ml en BMMD en cultivos en vasos de agitación y los sobrenadantes fueron cargados en 5 \muL por pozo. El antisuero (humano) de anti-transferrina policlonal de cabra (Calbiochem) fue usado en 40 \muL por gel de inmunoelectroforesis en cohete (50 ml). A = cepa de control [pSAC35], vasos dobles; B = cepa de control [pDB2536], vasos dobles; C = cepa de control [pDB2711], puro en diluciones acuosas de 40 veces; D = cepa de control [pDB2931], vasos dobles; E = cepa de control [pDB2929], puro en diluciones acuosas de 40 veces.
La figura 17 muestra los resultados de análisis RIE de secreción (N413Q, N611Q) de transferrina recombinante con y sin sobreexpresión de PDI1. Unas reservas de levadura conservadas por crionización fueron cultivadas durante 4 días en 10 ml en cultivos en vasos de agitación en BMMD y los sobrenadantes fueron cargados en 5 \muL por pozo. Unas cargas dobles estaban hechas de formadas por sobrenadantes de dos cultivos individuales de cada cepa. Un antisuero (humano) de anti-transferrina policlonal de cabra (Calbiochem) fue usado en 40 \muL por gel de inmunoelectroforesis en cohete (50 ml). A = cepa de control [pSAC35]; B = cepa de control [pDB2536]; C = cepa de control [pDB2711]; D = cepa de control [pDB2931]; E = cepa de control [pDB2929].
La figura 18 muestra los resultados de análisis por SDS-PAGE de secreción de transferrina recombinante con y sin sobre expresión de PDI1. Cultivos en vasos de agitación en BMMD fueron cultivados durante 4 días y 10 \muL de sobrenadante analizados en SDS-PAGE no-reducido (4-12% NuPAGE®, tampón MOPS, In Vitrogen) con reactivo azul GelCode® (Pierce). Marcadores SeeBlue Plus2 (In Vitrogen). 1 = pDB2536, 2 = pDB2536, 3 = pDB2711, 4 = pDB2711, 5 = pDB2931, 6 = pDB2931, 7 = pDB2929, 8 = pDB2929, 9 = control pSAC35.
La figura 19 muestra un análisis RIE de secreción de transferrina recombinante de cepas S. cerevisiae con otra copia integrada de PDI1. Unos sobrenadantes de cultivo de 5 días en vaso de agitación en BMMD fueron cargados en 5 \muL por pozo. Las cepas contenían: 1) pSAC35 (control negativo); 2) pDB2536 (transferrina no-glicosilada recombinante (N413Q, N611 Q)) o 3) pDB2506 (el mismo que el plásmido pDB2536 pero el ORF de transferrina codifica la transferrina sin las mutaciones N\rightarrow Q en posiciones 413 y 611, es decir transferrina glicosilada recombinante). Cada pozo contenía una muestra derivada de un transformante individual. Unos estándares eran holotransferrina de plasma humano (Calbiochem) a 100, 50, 20, 10, 5 y 2 mg.L^{-1}.
La figura 20 muestra un análisis RIE de secreción de transferrina recombinante de Cepa A [pDB2536] y Cepa A [pDB2506] crecidas en un cultivo en vaso de agitación. Unos sobrenadantes de cultivo de 5 días en vaso de agitación BMMD o YEPD fueron cargados en duplicado en 5 \muL por pozo.
La figura 21 muestra un análisis por SDS-PAGE de transferrina recombinante segregada a partir de una Cepa A [pDB2536] y cepa A [pDB2506] crecidas en un cultivo en vaso de agitación. Los cultivos fueron cultivados durante 5 días, en BMMD y 30 \mul de sobrenadantes analizados en SDS-PAGE (4-12% NuPAGE^{TM}, tampón MOPS, InVitrogen) teñidos con reactivo azul GelCode (Pierce). 1) Transformante de cepa A [pDB2536] 1; 2) transformante de cepa A [pDB2536] 2; 3) Control de cepa A [pSAC35]; 4) Transformante de cepa A [pDB2506] 1; 5) SeeBlue, estándares de proteína Plus2 (sólo pesos moleculares aproximados).
La figura 23 muestra una RIE de transferrina recombinante segregada a partir de cepas de S. cerevisiae con diferentes números de copias de PDI1. Unos sobrenadantes de cultivo de 3 días en vaso de agitación en BMMD fueron cargados en 5 \muL por pozo. El antisuero (humano) de anti-transferrina policlonal de cabra (Calbiochem) fue usado en 30 \muL por gel de inmunoelectroforesis en cohete (50 ml). (A) El sobrenadante de la cepa de control de S cerevisiae [pDB2711] o [pDB2712]; (B) sobrenadante de Cepa A [pDB2536]; (C) sobrenadante de control de cepa
[pDB2536].
La figura 24 muestra un análisis por SDS-PAGE de transferrina recombinante segregada a partir de cepas de S. cerevisiae con diferentes números de copias de PDI1. 4-12% de gel de reducción NuPAGE (Invitrogen) de tampón MOPS después de una carga con 30 \muL de sobrenadante del cultivo de 3 días en vaso de agitación BMMD por línea; (línea 1) sobrenadante de cepa de control [pDB2536], (línea 2) sobrenadante de cepa A [pDB2536], (líneas 3-6) sobrenadante de cepa de control [pDB2711] o [pDB2712]; (línea 7) marcadores de peso molecular (SeeBlue Plus2, InVitrogen).
La figura 26 muestra una RIE de transferrina recombinante segregada a partir de diferentes cepas de S. cerevisiae con y sin coexpresión de gen de PDI1 adicional. 10 ml de YEPD en vasos de agitación fueron inoculados con levadura e incubados durante 4 días a 30ºC. 5 \muL de sobrenadante del cultivo cargado por pozo de un gel de inmunoelectroforesis en cohete. Unas concentraciones estándar Tf de plasma están indicadas en \mug/ml. 20 \muL de anti-Tf de cabra/50 ml de agragosa. La precipitina fue teñida con azul de Coomassie.
La figura 53 muestras un análisis RIE de expresión de rHA en diferentes cepas de S. cerevisiae cuando son coexpresadas con genes PDI1 que poseen promotores de longitud diferente. 10 ml de YEPD en vasos de agitación fueron inoculados con levadura e incubados durante 4 días a 30ºC. 4 \muL de sobrenadante del cultivo cargado por pozo de un gel de inmunoelectroforesis en cohete. Unas concentraciones estándar de rHA están indicadas en \mug/ml. 400 \muL de anti-HA de cabra (producto Sigma A-1151 resuspendido en 5 ml de agua)/50 ml de agarosa. La precipitina fue teñida con azul de Coomassie.
La figura 54 muestras un análisis RIE de expresión de rHA en diferentes cepas de S. cerevisiae cuando son coexpresadas con genes PDI1 que poseen promotores de longitud diferente. 10 ml de YEPD en vasos de agitación fueron inoculados con levadura e incubados durante 4 días a 30ºC. 4 \muL de sobrenadante de cultivo cargado por pozo de un gel de inmunoelectroforesis en cohete. Unas concentraciones estándar de rHA están indicadas en \mug/ml. 400 \muL de anti-HA de cabra (producto Sigma A-1151 resuspendido en 5 ml de agua)/50 ml de agarosa. La precipitina fue teñida con azul de Coomassie.
La figura 55 muestra un análisis de RIE de expresión de rTF, cuando es coexpresado con diferentes constructos de PDI1. 10 ml en vasos de agitación en BMMD fueron inoculados con levadura e incubados durante 4 días a 30ºC. 5 \muL de sobrenadante del cultivo fue cargado por pozo de un gel de inmunoelectroforesis en cohete conteniendo 25 \muL de anti-Tf de cabra/50 ml. Las concentraciones estándar Tf de plasma están indicadas en \mug/ml. La precipitina fue teñida con azul de Coomassie.
La figura 56 muestra un análisis RIE de expresión de rTF, coexpresado con diferentes constructos de PDI1. 10 ml de YEPD en vasos de agitación fueron inoculados con levadura e incubados durante 4 días a 30ºC. 5 \muL de sobrenadante del cultivo fue cargado por pozo de un gel de inmunoelectroforesis en cohete conteniendo 25 \muL de anti-Tf de cabra/I. Concentraciones estándar de Tf de plasma están indicadas en \mug/ml. La precipitina fue teñida con azul de
Coomassie.
La figura 72 muestra el análisis por RIE de proteínas de fusión de rHA con y sin PDI1 recombinante coexpresada. 10 ml en vasos de agitación en BMMD fueron inoculados con YBX7 transformados con plásmidos de expresión de fusión de albúmina e incubados durante 4 días a 30ºC. 4 \muL de sobrenadante del cultivo cargado por pozo de un gel de inmunoelectroforesis en cohete. Las concentraciones estándar de rHA están indicadas en \mug/ml. 200 \muL de anti-HA de cabra (producto Sigma A-1151 resuspendido en 5 ml de agua)/50 ml de agarosa. La precipitina fue teñida con azul de Coomassie.
La figura 73 muestra un análisis por SDS-PAGE de secreción de fusión de albúmina recombinante con y sin PDI1 presente en el plásmido de expresión. 10 ml en vasos de agitación en BMMD fueron inoculados con levadura e incubados durante 4 días a 30ºC, 200 rpm. 30 \muL de sobrenadante analizados en SDS-PAGE no-reducido (4-12% NuPAGE®, tampón MES, InVitrogen) con reactivo azul GelCode® (Pierce). 1 = marcadores SeeBlue Plus2 (InVitrogen); 2 = 1 \mug rHA; 3 = angiostatina-rHA; 4 = angiostatina-rHA + PDI1, 5 = endostatina-rHA; 6 = endostatina-rHA + PDI1, 7 = DX-890-(GGS)_{4} GG-rHA; 8 = DX- 890-(GGS)_{4} GG-rHA + PDI1, 9 = DPI-14-(GGS)_{4} GG-rHA; 10.= DPI-14-(GGS)_{4}
GG-rHA+ PDI1, 11 = Axokine^{TM} (CNTF_{Ax15})-(GGS)_{4} GG-rHA (Lambert et al, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 4652-4657); 12 = Axokine^{TM} (CNTF_{Ax15}) - (GGS)_{4} GG-rHA + PDI1.
La figura 76 muestras un análisis por RIE demostrando una secreción de transferrina incrementada de S. cerevisiae con coexpresión de ORM2 a partir de un plásmido basado en 2 \mum. Unos sobrenadantes de cultivo de cuatro días en vasos de agitación fueron cargados en 5 \mul por pozo. Unos estándar eran holotransferrina de plasma humano (Calbiochem), en 25, 20, 15, 10, 5 \mug/ml, cargados en 5 \mul por pozo. Antisuero (humano) de anti-transferrina policlonal de cabra (Calbiochem) usado en 20 \mul por gel de inmunoelectroforesis en cohete (50 ml).
La figura 80 muestra un análisis por RIE demostrando una secreción de transferrina incrementada de S. cerevisiae con una coexpresión de PSE1 a partir de un plásmido basado en 2 \mum. Unos sobrenadantes de cultivo en vaso de agitación de cuatro días fueron cargados en 5 \mul por pozo. Unos estándar eran holotransferrina de plasma humano (Calbiochem), en 25, 20, 15, 10, 5 \mug/ml, cargada en 5 \mul por pozo. Antisuero (humano) de anti-transferrina policlonal de cabra (Calbiochem) usado en 20 \mul por gel de inmunoelectroforesis en cohete (50 ml).
La figura 84 muestras un análisis por RIE demostrando una secreción de transferrina incrementada de S. cerevisiae con coexpresión de SSA1 a partir de un plásmido basado en 2 \mum. Unos sobrenadantes de cultivo de cuatro días en vaso de agitación fueron cargados en 5 \mul por pozo. Unos estándar eran holotransferrina de plasma humano (Calbiochem), en 25, 20, 15, 10, 5 \mug/ml, cargadas en 5 \mul por pozo. Antisuero (humano) de anti-transferrina policlonal de cabra (Calbiochem) usado en 20 \mul por gel de inmunoelectroforesis en cohete (50 ml).
La figura 92 muestra los resultados de RIE. 10 ml de YEPD en vasos de agitación fueron inoculados conDXY1 trp1\Delta [pDB2976], DXY1 trp1\Delta [pDB2977], DXY1 trp1\Delta [pDB2978], DXY1 trp1\Delta [pDB2979], DXY1 trp1\Delta
[pDB2980] o DXY1 trp1\Delta [pDB2981] transformados en prototrofía de triptófano con una 1.41 kb NotI/PstI pdi1::
TRP1 de interrupción de fragmento de ADN fueron aislados de pDB3078. Unos transformantes fueron cultivados durante 4 días a 30ºC, 200 rpm. 4 \muL de sobrenadante del cultivo fue cargado por pozo de un gel de inmunoelectroforesis en cohete. Las concentraciones estándar de rHA están indicadas en \mug/ml. 700 \muL de anti-HA de cabra (producto Sigma A-1151 resuspendidas en 52 ml de agua)/50 ml de agarosa. La precipina fue teñida con azul Coomassie. Unos aislados seleccionados para otro análisis están indicados (*).
La figura 93 muestra los resultados de RIE. 10 ml de YEPD en vasos de agitación fueron inoculados con DXY1 [pDB2244], DXY1 [pDB2976], DXY1 trp1\Delta pdi1::TRP1 [pDB2976], DXY1 [pDB2978], DXY1 trp1\Delta pdi1::TRP1 [pDB2978], DXY1 [pDB2980], DXY1 trp1\Delta pdi1::TPP1 [pDB2980], DXY1 [pDB2977], DXY1 trp1\Delta pdi1::TRP1 [pDB2977], DXY1 [pDB2979] DXY1 trp1\Delta pdi1::TRP1 [pDB2979], DXY1 [pDB2981] y DXY1 trp1\Delta pdi1::TRP1 [pDB2981], y fueron cultivados durante 4 días a 30ºC, 200 rpm. 4 \muL de sobrenadante del cultivo cargado por pozo de un gel de inmunoelectroforesis en cohete. Unas concentraciones estándar de rHA están indicadas en \mug/ml. 800 \muL de anti-HA de cabra (producto Sigma A-1151 resuspendidas en 5 ml de agua)/50 ml de agarosa. La precipina fue teñida con azul de Coomassie. Unos aislados seleccionados para otro análisis están indicados (*).
La figura 94 muestra una alineación de secuencia de las secuencias génicas SKQ2n y S288c con promotores largos, tal y como está descrito en el ejemplo 6.
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Ejemplos
Dos tipos de casete de expresión han sido usados para ejemplificar la secreción de un mutante de transferrina humano recombinante (N413Q, N611Q) de S. cerevisiae. Uno tipo usa una secuencia guía HSA(pre)/MF\alpha1(pro) modificada (llamada secuencia "guía de fusión modificada"). El segundo tipo de casete de expresión usa sólo la secuencia guía modificada HSA(pre).
La secuencia de 24 aminoácidos de la "guía de fusión modificada" es MKWVFIVSILFLFSSAYSRSLDKR.
La secuencia de 18 aminoácidos de la secuencia guía HSA(pre) modificada es MKWVFIVSILFLFSSAYS.
La expresión de transferrina (N413Q, N611Q) que usa estos dos casetes ha sido estudiada en S. cerevisiae usando el vector de expresión de 2 \mum con y sin copia adicional del gen de PDI de S. cerevisiae, PD11.
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Ejemplo 1
Construcción de plásmidos de expresión
Un enlace de 52 bp hecho por recocido de 0.5 mM de soluciones de oligonucleótidos CF86 y CF87 (vér más abajo) fue introducido en la región US del plásmido de 2 \mum pSAC35 en los sitios XcmI en las repeticiones invertidas de 599 bp. Un sitio de XcmI corta 51 bp después del codón de terminación de traslación de REP2, mientras que el otro sitio XcmI corta 127 bp antes del final de la secuencia codificante de FLP, debido al recubrimiento con la repetición invertida (ver figura 3). Este enlazador de ADN contenía una región de núcleo "SnaBI-PacI-FseIISfiI-SmaI-SnaBI", que codifica unos sitios de restricción ausentes de pSAC35.
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12 
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El plásmido pSAC35 era digerido parcialmente con XcmI, el fragmento 11 kb lineal era aislado de un gel de agarosa de 0.7%(p/v), ligado con el enlazador de XcmI CF86/CF87 (puro, diluciones 10^{-1} y 10^{-2}) y transformadas en E. coli DH5\alpha. Unos transformantes resistentes a la ampicilina fueron seleccionados y visualizados para determinar la presencia de plásmidos que podían ser linealizados por digestión SmaI. El análisis de enzima de restricción identificaba pDB2688 (figura 4) con el enlazador clonado dentro del sitio XcmI después de REP2. La secuenciación de ADN mediante el uso de cebadores de oligonucleótidos CF88; CF98 y CF99 (Tabla 1) confirmaba que la inserción contenía la secuencia de enlace adecuada.
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TABLA 1 
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13 
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La cepa de levadura fue transformada en prototrofía de leucina usando un método de acetato de litio modificado (Sigma yeast transformation kit, YEAST-1, protocolo 2; (Ito et al, 1983, J. Bacteriol., 153, 163; Elble, 1992, Biotechniques, 13, 18 )). Unos transformantes fueron seleccionados en placas BMMD-agar, y fueron posteriormente separados en placas BMMD-agar. Reservas de trehalosa conservadas por crionización fueron preparadas a partir de 10 ml en cultivos en vaso de agitación en BMMD (24 horas, 30ºC, 200 rpm), por adición de un volumen idéntico de trehalosa estéril a 40% (p/v).
La composición de YEPD y BMMD está descrita por Sleep et al., 2002, Yeast, 18, 403. YEPS y BMMS tienen una composición similar a YEPD y BMMD y admiten que 2% (p/v) de sacarosa sea sustituida por 2% (p/v) de glucosa como única fuente de carbono inicial.
El gen PDI1 de S. cerevisiae fue clonado en el enlazador XcmI de pDB26988. El gen PDI1 (figura 5) fue clonado en un fragmento SacI-SpeI de 1,9-kb a partir de un fragmento más grande de ADN SKQ2n genómico de S. cerevisiae conteniendo el gen PDI1 (como provisto en el plásmido pMA3a:C7 que está descrito en US 6,291,205 y descrito también en forma de Clon C7 en Crouzet & Tuite, 1987, Mol. Gen. Genet., 210, 581-583 and Farquhar et al, 1991, supra), el cual ha sido clonado en YIplac211 (Crietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534), y tenía un enlazador de ADN sintético conteniendo un sitio de restricción SacI insertado en un sitio Bsu36I único en la región 3' no codificante del gen PDI1. El fragmento 1.9 kb de SacI-SpeI fue tratado con T4 ADN polimerasa para rellenar el saliente 5' SpeI y eliminar el saliente 3' SacI. Este fragmento de PDI1 incluía 212 bp del promotor de PDI1 arriba del codón de iniciación de traslación y 148 bp abajo del codón de terminación de traslación. Este fue ligado con fosfatasa alcalina linealizada/intestinal de ternero SmaI tratada pDB2688, para crear el plásmido pDB2690 (figura 6), con el gen PDI1 transcrito en la misma dirección que REP2. Una cepa de S.cerevisiae fue transformada en prototrofía de leucina con pDB2690.
Un casete de expresión para un mutante de transferrina humana (N413Q, N611Q) era clonado posteriormente en el sitio NotI de pDB2690 para crear pDB2711 (figura 7). El casete de expresión en pDB2711 contiene el promotor PRB1 de S. cerevisiae, una secuencia guía de fusión HSA/MF\alpha (EP 387319; Sleep et al, 1990, Biotechnology (N.Y.), 8, 42) seguido de una secuencia codificante para el mutante de transferrina humano (N413Q, N611Q) y el terminador ADH1 de S. cerevisiae. El plásmido pDB2536 era construido de forma similar por inserción del mismo casete de expresión en el sitio NotI de pSAC35.
La secuencia "guía de fusión modificada" usada en pDB2536 y pDB2711 comprende una secuencia pre-HSA modificada y una secuencia pro-MF\alpha1. Una secuencia guía alternativa usada era la secuencia pre-HSA modificada, que era derivada de la secuencia guía de fusión modificada por eliminación de los seis residuos de la secuencia pro-MF\alpha1.
La secuencia guía de fusión modificada en pub2515 (figura 8) fue mutada con oligonucleótidos CF154 y CF155 para eliminar la secuencia codificante para los seis residuos (RSLDKR) de la región pro-MF\alpha1. Esta fue realizada según el manual de instrucciones del Kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange^{TM} de Statagene. pDB2515 es el vector de clonación E. coli pGEM-7Z(-) (Promega) conteniendo el fragmento de ADN (parcial) NotI-HindIII de 2940 bp de pDB2529 (ver más abajo) ligado entre los sitios PspOMI y HindIII.
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CFI 54
5'-GTTCTTGTTCTCCTCTGCTTACTCTGTCCCTGATAAAACTGTGAGATGG-3'
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CF155
5'-CCATCTCACAGTTTTATCAGGGACAGAGTAAG CAGAGGAGAACAAGAAC-3'
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Unas células DH5\alpha de E. coli competentes fueron transformadas con los plásmidos mutados y colonias resistentes a la ampicilina fueron seleccionadas. El plásmido de ADN de estas colonias fueron seleccionadas por digestión doble con EcoRI y BgIII. La secuencia de ADN adecuada para la guía pre-HSA modificada fue confirmada posteriormente en pDB2921 (figura 9) sobre una región de 386 bp entre el sitio AfIII y BamHI en cada sitio de la secuencia guía. Este fragmento AfIII-BamHI de 386 bp fue aislado, y ligado con un fragmento AfIII-BamHI de 6,081 bp a partir de pDB2529 (figura 10), preparado por digestión parcial con BamHI y digestión completa con AfIII y fosfatasa alcalina intestinal de ternero. pDB2529 es el vector de clonación de E. coli pBST(+) (Sleep et al, 2001, Yeast, 18, 403-441) conteniendo el casete de expresión de transferrina de pDB2536 clonado en el sitio NotI único. Esto producía pDB2928 (figura 11), que era aislado de células DH5\alpha de E. coli resistentes a la ampicilina transformadas con los productos de ligadura.
El casete de expresión NotI de 3,256 bp era aislado de pDB2928. Este contenía el promotor PRB1, la región de codificación para la secuencia guía pre-HSA modificada seguida de la transferrina (N413Q, N611Q), y del terminador ADH1. Este era ligado dentro de los sitios NotI de los vectores basados en 2 \mum pSAC35 y pDB2690 para generar los plásmidos de expresión pDB2929; pDB2930; pDB2931 y pDB2932 (Figuras 12-15). En pDB2929 y pDB2931 la secuencia (N413Q, N611Q) de transferrina está transcrita en la misma dirección que LEU2, mientras que en pDB2930 y pDB2932 la transcripción está en la dirección opuesta.
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Ejemplo 2
Expresión de transferrina
Una cepa de control S.cerevisiae era transformada en prototrofía de leucina con todos los plásmidos de expresión (N413Q, N611Q) de transferrina, y la reservas conservadas por crionización eran preparadas.
Unas cepas fueron cultivadas durante cuatro días a 30ºC en cultivos de 10 ml en BMMD en 50 ml de vasos cónicos agitados a 200 rpm. Los títulos de transferrina recombinante segregados en los sobrenadantes de cultivo fueron comparados por inmunoelectroforesis en cohete (RIE tal y como está descrito en Weeke, B., 1976, "Rocket immunoelectrophoresis" In N. H. Azelsen, J. Kroll, and B. Weeke [eds.], A manual of quantitative immunoelectrophoresis. Methods and applications. Universitetsforlaget, Oslo, Norway), de cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa (RP-HPLC) (Tabla 2), y electroforesis de poliacrilamida SDS no reducida teñida conde tinta azul de Coomassie coloidal (SDS-PAGE). Se estimó que el incremento de transferrina recombinante segregada cuando la PDI1 S. cerevisiae era sobreexpresada era superior a 10 veces.
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TABLA 2
14
El análisis de RIE indicó que la mayor secreción de transferrina en presencia de copias adicionales de PDI1 fue de aproximadamente 15 veces (figura 16). Por análisis de RIE el aumento parecía ligeramente más grande para la secuencia pre líder HSA modificada que para la secuencia líder de fusión modificada (figura 17).
Por análisis RP-HPLC se determinó que el aumento de secreción de transferrina era de 18 veces para la secuencia líder de fusión modificada y 15 veces para la secuencia pre líder HSA modificada (Tabla 2).
La figura 18 muestra una comparación de SDS-PAGE de la transferrina recombinante secretada por cepas de S cerevisiae con y sin expresión de PDI1 adicional.
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Método RP-HPLC para Determinar la Expresión de Transferrina
Columna: 50 X 4.6 mm Phenomenex Jupiter C4 300\ring{A}, 5 \mum.
Temperatura de columna: 45ºC.
Velocidad de flujo: 1 mL.min^{-1}.
Detección de pico: absorbencia UV a 214 nm.
Fase móvil de HPLC A:0.1% TFA, 5% Acetonitrilo.
Fase móvil de HPLC B:0.1% TFA, 95% Acetonitrilo.
Gradiente: 0 a 3 minutos 30% B.
3 a 13 minutos 30 a 55% B en un gradiente lineal.
13 a 14 minutos 55% B.
14 a 15 minutos 55 a 30% B en un gradiente lineal.
15 a 20 minutos 30% B.
Inyección: Generalmente 100 \muL de muestra, pero cualquier volumen puede ser inyectado.
Curva estándar: 0.1 a 10 \mug de transferrina humana inyectada vs curva estándar de área de pico usada para los resultados mostrados era lineal hasta 10 \mug.
donde y = área de pico, y x = cantidad en \mug.
(r^{2}): 0.999953, donde el Coeficiente de Correlación = r.
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Ejemplo 3
Sobre-expresión cromosómica de PDI
Se seleccionó la cepa A de S. cerevisiae para investigar la secreción de la expresión de transferrina glicosilada recombinante del plásmido pDB2506 y transferrina no-glicosilada recombinante (N413Q, N611Q) del plásmido pDB2536. La cepa A tiene las características siguientes:
-
gen PDI1 integrado cromosómicamente adicional integrado en la ubicación cromosómica PDI1 huésped.
-
las secuencias de ADN bacteriano y del gen URA3 conteniendo el gen de resistencia a la ampicilina fueron también integradas en el genoma de S. cerevisiae en los sitios de inserción para los genes indicados arriba.
La cepa de control no tenía ninguna de las inserciones mencionadas arriba.
La cepa de control [cir^{0}] y la cepa A [cir^{0}] fueron transformadas en prototrofia de leucina con pDB2506 (transferrina recombinante), pDB2536 (transferrina recombinante no glicosilada (N413Q, N611Q)) o pSAC35 (control). Los transformantes fueron seleccionados sobre BMMD-agar.
Se determinó el nivel relativo de secreción de transferrina en un cultivo en un vaso de agitación BMMD de cada combinación de cepa/plásmido por inmunoelectroforesis en cohete (RIE). La figura 19 muestra que ambas cepas secretaron ambas transferrinas recombinantes glicosilada y no glicosilada en el sobrenadante del cultivo.
Los niveles de ambas transferrinas glicosilada y no glicosilada secretadas de la cepa A [pDB2506] y de la cepa A [pDB2536] fueron respectivamente mayores a los niveles secretados de la cepa de control. Por lo tanto, al menos en cultivo en vaso de agitación, el PDI1 integrado en el genoma huésped en el lugar PDI1 de la cepa A tiene mayor secreción de transferrina.
Además, el aumento en secreción de transferrina observado entre la cepa de control [pDB2536] y la cepa A [pDB2536] pareció ser un aumento del 100% por RIE. Por el contrario, el aumento de secreción del monómero de rHA entre la cepa de control [pDB2305] y la cepa A [pDB2305] fue de aproximadamente el 20% (datos no mostrados). En consecuencia, el aumento en secreción de transferrina debido a la copia adicional de PDI1 en la cepa A fue sorprendentemente grande considerando que la transferrina tiene 19 enlaces de disulfuro, en comparación con rHA con 17 enlaces de disulfuro. Las copias adicionales del gen PDI1 pueden ser particularmente beneficiosas para la secreción de proteínas de la familia de la transferrina y sus derivados, de S. cerevisiae.
Se compararon los niveles de transferrina secretados de la cepa A [pDB2536] y de la cepa A [pDB2506] por RIE para los transformantes cultivados en BMMD y YEPD (Figura 20). Los resultados indicaron que se consiguió aumentar en más de 2 veces los títulos de ambas transferrina no glicosilada recombinante (N413Q, N611Q) y transferrina glicosilada recombinante por cultivo en YEPD (10-20 mg.L^{-1} equivalente de transferrina de suero) en comparación con BMMD (2-5 mg.L^{-1} equivalente de transferrina de suero). El aumento del título de ambas transferrinas glicosilada y no glicosilada observado en YEPD sugirió que ambos plásmidos de expresión de transferrina fueron suficientemente estables bajo condiciones de cultivo no selectivas para permitir la biomasa aumentada prevista que normalmente se produciría en el cultivo en YEPD para ser traducidos en una mayor productividad de transferrina glicosilada y no glicosilada.
En la figura 21 se muestra el análisis de SDS-PAGE de transferrina no glicosilada (N413Q, N611Q) secretada de la cepa A [pDB2536] y transferrina glicosilada de la cepa A [pDB2506] cultivada en un cultivo en un vaso de agitación BMIWID. Las muesetras de la cepa A [pDB2536] mostraron claramente una banda proteínica adicional en comparación con la cepa A [pSAC35] de control. Esta banda extra migró a la posición prevista para la transferrina recombinante (N413Q, N611Q) secretada de la cepa de control [pDB2536]. Los sobrenadantes del cultivo de la cepa A [pDB2506] parecían contener una banda proteínica difusa en la posición prevista para la transferrina. Esto sugirió que la transferrina recombinante secretada fue heterogénea, posiblemente debido a la hipermanosilación en Asp413 y/o Asp611.
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Ejemplo 4
Comparación de la secreción de transferrina de la cepa de control de S. cerevisiae conteniendo pDB2711 con secreción de transferrina de la cepa A de S. cerevisiae
El plásmido pDB2711 es como se ha descrito anteriormente. El plásmido pDB2712 (figura 22) fue también producido con el casete NotI en la dirección opuesta a pDB2711.
La cepa de control de S. cerevisiae [cir^{0}] fue transformada en prototrofia de leucina con pDB2711 y pDB2712. Se seleccionaron los transformantes sobre BMMD-agar y se prepararon caldos de trehalosa conservados por crionización de la cepa de control [pDB2711].
Se comparó la secreción de transferrina recombinante (N413Q, N611Q) por la cepa de control [pDB2711], cepa de control [pDB2712], cepa A [pDB2536], cepa de control [pDB2536] y una cepa de control alternativa [pDB2536] en ambos cultivos en vaso de agitación con BMMD y YEPD. La RIE indicó que se consiguió un aumento significante en la secreción de transferrina recombinante de la cepa de control [pDB2711] con múltiples copias de PDI1 episómicas, en comparación con la cepa A [pDB2536] con dos copias cromosómicas de PDI1, y la cepa de control [pDB2536] con una única copia cromosómica del gen PDI1 (figura 23). Parece ser que la cepa de control [pDB2711] y la cepa de control [pDB2712] segregan niveles similares de rTf (N413Q, N611Q) en los medios de cultivo. Los niveles de secreción fueron relativamente consistentes entre los transformantes de la cepa de control [pDB2711] y la cepa de control [pub2712] en ambos medios BMMD y YEPD, sugiriendo que la estabilidad del plásmido fue suficiente para la secreción de altos niveles de transferrina incluso bajo condiciones no selectivas. Esto contradice los datos precedentes publicados en relación con PDGF-BB y HSA recombinante donde se mostró que la introducción de PDI1 en plásmidos de 2 \mum multicopia era perjudicial para el huésped.
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TABLA 3 Títulos de transferrina recombinante a partir de fermentaciones elevadas de densidad celular 
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15
En la figura 24 se muestra el análisis SDS-PAGE de transferrina secretada a partir de la cepa de control [pDB2711], cepa de control [pDB2712], cepa A [pDB2536], cepa de control [pDB2536] y cepa de control alternativa [pDB2536] en un cultivo en vaso de agitación en BMMD. Esto muestra una abundante banda proteínica en todas las muestras de la cepa de control [pDB2711] y cepa de control [pDB2712] en la posición prevista para la transferrina (N413Q, N611Q). La intensidad de tintura relativa de la banda de transferrina (N413Q, N611Q) de las diferentes cepas sugirió que la cepa A [pDB2536] produjo más que la cepa de control [pDB2536] y la cepa de control alternativa [pDB2536], pero que hubo un aumento incluso más espectacular en la secreción de la cepa de control [pDB2711] y la cepa de control [pDB2712]. La mayor secreción de transferrina recombinante observada fue concomitante con el mayor número de copias de PDI1 en estas cepas. Esto sugirió que los niveles de PDI1 estaban limitando la secreción de transferrina en la cepa de control, en la cepa A y en la cepa de control alternativa, y que el elevado número de copias de PDI1 era responsable del aumento de secreción de transferrina. Un número elevado de copias de PDI1 podría aumentar el nivel de expresión en estado de equilibrio de PDI1 aumentando así la cantidad de actividad de PDI1. Hay varios métodos alternativos por los que esto podría conseguirse sin aumentar el número de copias del gen PDI1, por ejemplo nivel de equilibrio del ARNm del PDI1 podría ser aumentado bien aumentando el nivel de transcripción, es decir, usando un promotor de mayor eficiencia, o reduciendo el nivel de depuración del ARNm del PDI1. De forma alternativa se podría utlizar ingeniería proteínica para aumentar la actividad específica o producción de la proteínal de
PDI1.
En fermentaciones de alta densidad celular se midió la producción de transferrina recombinante (N413Q, N611Q) de la cepa de control [pDB2711] a aproximadamente 3 g.L^{-1} por ambos análisis de GP-HPLC y análisis de SDS-PAGE (Tabla 3). Este nivel de producción es varias veces mayor que la cepa de control, la cepa de control alternativa o la cepa A conteniendo pDB2536. Además, para la producción de proteínas para uso terapéutico en seres humanos, los sistemas de expresión tales como la cepa de control [pDB2711] tiene ventajas sobre aquellos que usan la cepa A, pues no contienen secuencias de ADN bacteriano.
Conclusiones
Se investigó la secreción de transferrina recombinante de un plásmido de expresión multicopia (pDB2536) en cepas de S. cerevisiae conteniendo una copia adicional del gen PDI1 integrado en el genoma de levadura. También se investigó la secreción de transferrina en S. cerevisiae transformada con un plásmido de expresión multicopia, donde el gen PDI1 ha sido insertado en el plásmido de expresión de transferrina episómica multicopia (pDB2711).
Una cepa de S. cerevisiae con una copia adicional del gen PDI1 integrado en el genoma en el lugar endógeno del PDI1, secretó transferrina recombinante y transferrina no glicosilada recombinante (N413Q, N611Q) a un nivel elevado en comparación con las cepas conteniendo una única copia de PDI1. Se consiguió otro aumento en el número de copias de PDI1 usando pDB2711 en fermentación de alta densidad celular de la cepa transformada con pDB2711. La transferrina recombinante (N413Q, N611Q) fue secretada a aproximadamente 3 g.L^{-1}, medida por análisis de SDS-PAGE y de GP-hPLC. En consecuencia, un mayor número de copias del gen PDI1 produjo un mayor aumento de la cantidad de transferrinas recombinantes secretadas de S. cerevisiae.
Se obtuvieron las siguientes conclusiones:
1.
En un análisis en vaso de agitación de la expresión de transferrina recombinante a partir de pDB2536 (transferrina no-glicosilada (N413Q, N611Q) y pDB2506 (transferrina glicosilada) la cepa A de S. cerevisiae secretó niveles superiores de ambas transferrinas recombinantes en el sobrenadante del cultivo que las cepas de control. Esto fue atribuido a la copia extra de PDI1 integrada en el locus de PDI1.
2.
La cepa de control [pDB2711], que contenía el gen PDI1 en el plásmido de expresión multicopia, produjo un aumento de varias veces en la secreción de transferrina recombinante (N413Q, N611Q) en comparación con la cepa A [pDB2536] tanto en el cultivo en vaso de agitación como en la fermentación de alta densidad celular.
3.
Los números elevados de copias de PDI1 en la levadura tal como S. Cerevisiae serán ventajosos durante la producción de proteínas heterólogas como las de la familia de las transferrinas.
4.
Los plásmidos basados en pSAC35 conteniendo copias adicionales de gen PDI1 tienen ventajas para la producción de proteínas de la familia de transferrina, y sus derivados, tal como fusiones, mutantes, dominios y formas truncadas.
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Ejemplo 5
Inserción de un gen PDI1 en una secreción aumentada de plásmido similar a 2 \mum de transferrina recombinante a partir de varias cepas diferentes de S. cerevisiae
La cepa de S. cerevisiae JRY188 cir^{+} (National Collection of Yeast Cultures) y MT302/28B cir^{+} (Finnis et al., 1993, Eur. J. Biochem., 212, 201-210) fue polimerizada del plásmido 2 \mum nativo por sobreexpresión inducida por galactosa de FLP a partir de Yep351-GAL-FLPI, tal y como está descrito por Rose and Broach (1990, Meth. Enzymol., 185, 234-279) para crear las cepas de S. cerevisiae JRi188 cir^{0} y MT302/28B cir^{0}, respectivamente.
Las cepas de S. cerevisiae JRY188 cir^{0}, MT302/28B cir^{0}, S150-2B cir^{0} (Cashmore et al., 1986, mol. Gen. Genet., 203, 154-162 ), CB11-63 cir^{0} (Zealey et al., 1988, Mol. Gen. Genet. 211, 155-159) fueron todas transformadas en prototrofía de leucina con pDB2931 (figura 14) y pDB2929 (figura 12). Los transformantes fueron seleccionados en medios mínimos con suplementos apropiados sin leucina. Los transformantes de cada cepa fueron inoculados en 10 ml de YEPD en 502 ml en vasos de agitación e incubados en un agitador orbital a 30ºC, 200 rpm durante 4 días. Los sobrenadantes de cultivo fueron recogidos y los títulos de transferrina recombinante fueron comparados por inmunoelectroforesis en cohete (figura 26). Los resultados indicaron que los títulos de transferrina en sobrenadantes de todas las cepas de levadura eran más elevados cuando el PDI1 estaba presente en el plásmido 2 \mum (pDB2929) que cuando no lo estaba (pDB2931).
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Ejemplo 6
Construcción de vectores de expresión conteniendo varios genes PDII y los casetes de expresión para varias proteínas heterólogas en el mismo plásmido similar a 2 \mum Amplificación por PCR y clonación de genes PDI1 en YIplac211
Los genes PDI1 de S. cerevisiae S288c y S. cerevisiae SKQ2n fueron amplificados por PCR para producir fragmentos de ADN con diferentes longitudes de la región no trasladada 5' conteniendo la secuencia promotora. Los cebadores de PCR fueron diseñados para permitir la clonación de los productos de PCR en los sitios EcoRI y BamHI de YIplac211 (Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534). Sitios de endonucleasa de restricción adicional fueron incorporados también en cebadores de PCR para facilitar la clonación posterior. La tabla 4 describe los plásmidos construidos y la tabla 5 proporciona las secuencias de cebadores de PCR usadas para amplificar los genes PDI1. Las diferencias de longitud del promotor PDI1 al interior de estos plásmidos basados en YIplac211 están descritas en la tabla 4.
El pDB2939 (figura 27) fue producido por amplificación por PCR del gen PDI1 a partir de ADN genómico de S. cerevisiae S288c con cebadores oligonucleótidos DS248 y DS250 (tabla 5), seguido de una digestión del producto de PCR con EcoRI y BamHI y de una clonación del fragmento de aproximadamente 1.98-kb en YIplac211 (Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534), que ha sido cortado con EcoRI y BamHI. La secuenciación del ADN de pDB2939 identificó un "G" faltante desde el interior de la secuencia DS248, que está indicado en negrita en la tabla 5. Los cebadores oligonucleótidos usados para la secuenciación del gen PDI1 aparecen en una lista en la tabla 6, y fueron diseñados a partir de la secuencia S288c de genes PDI1 publicada (PDI1/YCL043C sobre el cromosoma III a partir de coordenadas 50221 a 48653 más 1000 pares de base de secuencia superior y 1000 pares de base de secuencia inferior. (http://www.yeastgenome.org/Genebank número de acceso NC001135).
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TABLA 4 Plásmidos basados en YIplac211 conteniendo Genes PDI1 
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TABLA 5 Cebadores de oligonucleótidos para una amplificación por PCR de Genes PDI1 de S. cerevisiae 
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TABLA 6 Cebadores de oligonucleótidos para una secuenciación de ADN de genes PDI1 de S cerevisiae 
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Los plásmidos pDB2941 (figura 28) y pDB2942 (figura 29) fueron construidos de forma similar usando los cebadores de la PCR descritos en las tablas 4 y 5, y para la clonación de los fragmentos EcoRI-BamHI de aproximadamente 1.90-kb y 1.85-kb, respectivamente, en YIplac211. Las secuencias de ADN correctas fueron confirmadas para los genes PDI1 en pDB2941 y pDB2942.
La secuencia de gen PDI1 de S. cerevisiae SKQ2n fue amplificada por PCR a partir del ADN plásmido conteniendo el gen PDI1 de pMA3a:C7 (US 6,291,205), también conocido como Clon C7 (Crouzet & Tuite, 1987, supra; Farquhar et al, 1991,supra). El gen PDI1 SKQ2n fue amplificado usando cebadores oligonucleótidos DS248 y DS250 (tablas 4 y 5). El producto de PCR de aproximadamente 2.01-kb fue digerido con EcoRI y BamHI y ligado en YIplac211 (Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534) que ha sido cortado con EcoRI y BamHI, para producir el plásmido pDB2943 (figura 30). El extremo 5' de la secuencia de PDI1 SKQ2n es análogo a un sitio SpeI de extremos romos extendido para incluir los sitios EcoRI, SacI, SnaBI, PacI, FseI, SfiI y SmaI, el extremo 3' se extiende hasta un sitio análogo a un sitio Bsu36I con extremos romos, extendido para incluir sitios SmaI, SnaBI y BamHI. La longitud de promotor PDI1 es de aproximadamente 210 bp. La secuencia de ADN entera fue determinada para el fragmento PDI1 usando los cebadores oligonucleótidos mostrados en la tabla 6. Esto confirmó la presencia de una secuencia codificante para la proteína PDI de cepa S. cerevisiae SKQ2n (número de acceso NCBI CAA38402), pero con un residuo de serina en la posición 114 (no un residuo de arginina como previamente publicado). De forma similar, del mismo modo que en la secuencia S288c de S. cerevisiae en pDB2939; el pDB2943 también tiene un "G" faltante desde el interior de la secuencia DS248, que está indicado en negrita en la tabla 5.
Los plásmidos pDB2963 (figura 31) y pDB2945 (figura 32) fueron construidos de forma similar usando los cebadores de PCR descritos en las tablas 4 y 5, y para la clonación de los fragmentos EcoRI-BamHI de aproximadamente 1.94-kb y 1.87-kb, respectivamente, en YIplac211. Las secuencias de ADN previstas fueron confirmadas para los genes PDI1 en pDB2963 y pDB2945, con un codón de serina en la posición de aminoácido 114.
Construcción de plásmidos de expresión de rHA basados en pSAC35 con diferentes genes PDI1 insertados en el sitio XcmI después de REP2:
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Los plásmidos basados en pSAC35 fueron construidos para la coexpresión de rHA con diferentes genes PDII (tabla 7).
TABLA 7 Plásmidos basados en pSAC35 para una coexpresión de rHA con diferentes genes PDI1
19
El casete de expresión de rHA de pDB2243 (figura 33, tal como descrito en WO 00/44772) fue aislado primero en un fragmento NotI de 2,992-bp, el cual fue clonado posteriormente en el sitio NotI de pDB2688 (figura 4) para producir pDB2693 (figura 34). El pDB2693 fue digerido con SnaBI, tratado con fosfatasa alcalina intestinal de ternero, y ligado con fragmentos de SnaBI conteniendo los genes PDII de pDB2943; pDB2963; pDB2945; pDB2939; pDB2941 y pDB2942. Esto produjo plásmidos pDB2976 a pDB2987 (Figuras 35 a 46). El PDI1 transcrito en la misma orientación que REP2 fue llamado de "orientation A", mientras que el PDI1 transcrito en la orientación opuesta a REP2 fue llamado de "orientation B" (tabla 7).
Construcción de plásmidos de expresión de transferrina basados en pSAC35 con diferentes genes PDI1 insertados en el sitio XcmI después de REP2
Los plásmidos basados en pSAC35 fueron construidos para la coexpresión de transferrina recombinante (N413Q, N611Q) con diferentes genes PDI1 (tabla 8).
TABLA 8 Plásmidos basados en pSAC35 para una coexpresión de transferrina con diferentes genes PDI1
20 
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Para conseguirlo, los casetes de expresión NotI para la expresión de rHA fueron eliminados primero de pDB2976; pDB2978, y pDB2980 por digestión con NotI y la circularización del esqueleto de vector. Esto produjo plásmidos pDB3081 (figura 47), pDB3083 (figura 48) y pDB3084 (figura 49) tal como descritos en la tabla 9.
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TABLA 9 Plásmidos basados en pSAC35 con diferentes genes PDII
21 
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El fragmento NotI de 3,256-bp de pDB2928 (figura 11) fue clonado en los sitios NotI de pDB3081; pDB3083 y pDB3084, de tal forma que la transcripción del gen de transferrina fue en la misma dirección que LEU2. Esto produjo plásmidos pDB3085 (figura 50), pDB3086 (figura 51) y pDB3087 (figura 52) tal como descritos en la tabla
8.
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Ejemplo 7
La inserción y optimización de un gen PDI1 en el plásmido similar a 2 \mum aumentaron la secreción de albúmina de suero humano recombinante por varias cepas diferentes de S. cerevisiae
Las cepas de S. cerevisiae JRi188 cir^{0}, MT302/28B cir^{0}, S150-2B cir^{0}, CB11-63 cir^{0} (todas descritas anteriormente), AH22 cir^{0} (Mead et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 205, 417-421) y DS569 cir0 (Sleep et al., 1991, Bio/Technology, 9, 183- 187) fueron transformadas en prototrofía de leucina con cada pDB2244 (WO 00/44772), pDB2976 (figura 35), pDB2978 (figura 37) o pDB2980 (figura 39) usando un método con acetato de litio modificado (Sigma yeast transformation kit, YEAST-1, protocolo 2; (Ito et al, 1983, J. Bacteriol.,153, 163; Elble, 1992, Biotechniques, 13, 18)). Los transformantes fueron seleccionados en placas BMMD-agar con suplementos apropiados, y fueron posteriormente retirados en placas BMMD-agar con suplementos apropiados.
Los transformantes de cada cepa fueron inoculados en 10 ml de YEPD en 50 ml en vasos de agitación e incubados en un agitador orbital a 30ºC, 200 rpm durante 4 días. Los sobrenadantes de cultivo fueron recogidos y los títulos de albúmina recombinante fueron comparados por inmunoelectroforesis en cohete (figuras 53 y 54). Los resultados indicaron que los títulos de albúmina en los sobrenadantes de cultivo de todas las cepas de levadura eran más elevados cuando el PDI1 estaba presente en el plásmido 2 \mum que cuando no le estaba (pDB2244). El título de albúmina en los sobrenadantes de cultivo en ausencia de PDI1 en el plásmido era dependiente de la cepa de levadura seleccionada como huésped de expresión, no obstante, en la mayoría de los ejemplos de test, el mayor aumento de expresión era observado cuando el PDII estaba presente en el plásmido 2 \mum (pDB2976) con el promotor largo (210-bp). La modificación del promotor PDI1 por recorte, por ejemplo para eliminar sitios de regulación, tiene como efecto el control de la mejora. Para una cepa de levadura, conocida como una cepa de producción de rHA (DS569) elevada, se prefirió un promotor más corto para una expresión óptima.
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Ejemplo 8
Diferentes genes PDII aumentaron la secreción de transferrina recombinante coexpresada sobre un plásmido de base 2 \mum
La secreción de transferrina recombinante (N413Q, N611Q) fue investigada con la coexpresión del gen PDI1 SKQ2n de S. cerevisiae con el promotor largo (210-bp), y el PDI1 de S. cerevisiae S288c con los promotores largo, medio y corto (210 bp, 140 bp y 80 bp respectivamente).
La misma cepa de control usada en ejemplos precedentes (por ejemplo en el ejemplo 2) fue transformada en prototrofía de leucina con pDB2931 (plásmido de control negativo sin PDI1) y pDB2929, pDB3085, pDB3086 y pDB3087 (tabla 8). Los transformantes fueron seleccionados en placas BMMD-agar y cinco colonias fueron seleccionadas para un análisis. Las cepas fueron cultivadas en 10 ml de BMMD y 10 ml de YEPD en cultivos en vasos de agitación durante 4 días a 30°C, 200 rpm y los sobrenadantes de cultivo fueron recogidos para un análisis por inmunoelectroforesis en cohete (RIE).
La figura 55 muestra que en medios mínimos (BMMD) el gen PDI1 SKQ2n de S. cerevisiae con el promotor largo proporcionaba los títulos rTF más grandes (N413Q, N611Q). El gen PDII S288c de S. cerevisiae proporcionaba títulos rTF inferiores (N413Q, N611Q), que se reducían también a medida que la longitud de promotor PDII se reducía.
La figura 56 muestra que en un medio rico (YEPD) los genes PDII SKQ2n de S. cerevisiae y PDII S288c de S. cerevisiae con los promotores largos proporcionaban niveles de producción de rTF similares (N413Q, N611Q). Además, cuanto más corta era la longitud del promotor del gen PDII S288c de S. cerevisiae, menor era el nivel de producción de rTF (N413Q, N611Q).
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Ejemplo 9
El PDI1 en el plásmido de base 2 \mum aumentó la secreción de fusiones de albúmina recombinante
El efecto de coexpresión del gen PDII SKQ2n de S. cerevisiae con el promotor largo (210-bp) sobre la expresión de fusiones de albúmina recombinante fue estudiado.
La construcción de un casete de expresión de endostatina-albúmina de N-terminal NotI (pDB2556) ha sido descrito previamente (WO 03/066085). Las secuencias de vector de levadura apropiadas fueron provistas por un plásmido de "desintegración" pSAC35 descrito generalmente en EP-A-286 424 y descrito por Sleep, D., et al., 1991, Bio/Technology, 9, 183-187. El casete de expresión de endostatina-albúmina de N-terminal NotI de 3.54 kb fue aislado del pDB2556, purificado y ligado en pSAC35 digerido con Notl, el cual fue tratado con fosfatasa intestinal de ternero, creando un plásmido pDB3099 conteniendo el casete de expresión NotI en la misma orientación que el marcador de selección LEU2 (figura 57). Unas secuencias de vector PDII de levadura apropiadas fueron provistas por un plásmido de "desintegración" pDB2690 (figura 6). El casete de expresión de endostatina-albúmina de N-terminal NotI de 3.54 kb fue aislado del pDB2556, purificado y ligado en pDB2690 digerido con NotI, el cual fue tratado con fosfatasa intestinal de ternero, creando un plásmido pDB3100 conteniendo el casete de expresión NotI en la misma orientación con respecto al marcador de selección LEU2 (figura 58).
La construcción de un casete de expresión de angiostatina-albúmina de N-terminal NotI (pDB2556) ha sido descrito previamente (WO 03/066085), como la construcción de un vector de expresión basado en pSAC35, pDB2765 (figura 59). El casete de expresión de angiostatina-albúmina de N-terminal NotI de 3.77 kb fue aislado del pDB2556, purificado y ligado en pDB2690 digerido con NotI, un vector de expresión PDII de levadura apropiado, que ha sido tratado con fosfatasa intestinal de ternero, creando un plásmido pDB3107 conteniendo el casete de expresión NotI en la misma orientación con respecto al marcador de selección LEU2 (figura 60).
La construcción de un casete de expresión de Kringle5-(OGS)_{4}GG-albúmina de N-terminal NotI (pDB2771) ha sido descrita previamente (WO 03/066085), como la construcción de un vector de expresión de levadura basado en pSAC35, pDB2773 (figura 61). El casete de expresión de Kringle5-(GGS)_{4}GG-albúmina de N-terminal NotI de 3.27 kb fue aislado del pDB2771, purificado y ligado en pDB2690 digerido con NotI, un vector de expresión PDII de levadura apropiada, que ha sido tratado con fosfatasa intestinal de ternero, creando un plásmido pDB3104 conteniendo el casete de expresión NotI en la misma orientación con respecto al marcador de selección LEU2 (figura 62).
La construcción de un casete de expresión de DX-890-(GGS)_{4}GG-albúmina de N-terminal NotI (pDB2683) ha sido descrita previamente (WO 03/066824). Unas secuencias de vector de levadura apropiadas fueron provistas por el plásmido de "desintegración" pSAC35. El casete de expresión de DX-890-(GGS)_{4}GG-albúmina de N-terminal NotI de 3.20 kb fue aislado del pDB2683, purificado y ligado en pSAC35 digerido con NotI, el cual fue tratado con fosfatasa intestinal de ternero, creando un plásmido pDB3101 conteniendo el casete de expresión NotI en la misma orientación con respecto al marcador de selección LEU2 (figura 63). Unas secuencias de vector PDII de levadura apropiadas fueron proporcionadas por un plásmido de "desintegración" pDB2690 (figura 6). El casete de expresión de DX-890-(GGS)_{4}GG-albúmina de N-terminal NotI de 3.20 kb fue aislado del pDB2683, purificado y ligado en pDB2690 digerido con NotI, el cual fue tratado con fosfatasa intestinal de ternero, creando un plásmido pDB3102 conteniendo el casete de expresión NotI en la misma orientación con respecto al marcador de selección LEU2 (figura
64).
La construcción de un casete de expresión de DPI-14-(GGS)_{4}GG-albúmina de terminal NotI (pDB2666) ha sido descrita previamente (WO 03/066824), como la construcción de un vector de expresión de levadura basado en pSAC35, pDB2679 (figura 65). El casete de expresión de DPI-14-(GGS)_{4}GG-albúmina de N-terminal NotI de 3.21 kb fue aislado del pDB2666, purificado y ligado en pDB2690 digerido con NotI, un vector de expresión PDI1 de levadura apropiado, que ha sido tratado con fosfatasa intestinal de ternero, creando un plásmido pDB3103 conteniendo el casete de expresión NotI en la misma orientación con respecto al marcador de selección LEU2 (figura
66).
El CNTF fue clonado a partir de ADN genómico humano por amplificación de los dos exones usando los cebadores siguientes para el exón 1 y el exón 2, respectivamente, usando condiciones estándar.
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Cebadores de exón 1
5'-CTCGGTACCCAGCTGACTTGTTTCCTGG-3'; y
5'-ATAGGATTCCGTAAGAGCAGTCAG-3'
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Cebadores de exón 2
5'-GTGAAGCATCAGGGCCTGAAC-3;' y
5'-CTCTCTAGAAGCAAGGAAGAGAGAAGGGAC-3'
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Ambos fragmentos fueron ligados en condiciones estándar, antes de ser reamplificados por PCR usando cebadores 5'-CTCGGTACCCAGCTGACTTGTTTCCTGG-3' y 5'-CTCTCTAGAAGCAAGGAAGAGAGAAGGGAC-3' y clonados en un vector pCR4 (Invitrogen). Para generar Axokine^{TM} (tal como descrito en Lambert et al, 2001, PNAS, 98, 4652-4657), se utilizó una mutagénesis dirigida al sitio para introducir mutaciones C17A (TGT\rightarrow GCT) y Q63R (CAG\rightarrow AGA). La secuenciación del ADN también revelada la presencia de un sustitución de T\rightarrowC silenciosa V85V (GTT GTC) tal como está descrito en WO 2004/015113.
El ADNc de Axokine^{TM} fue amplificado por PCR usando oligonucleótidos de cadena única MH33 y MH36 para crear un fragmento PCR de aproximadamente 0.58 kbp.
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MH33
5'-ATGCAGATCTTTGGATAAGAGAGCTTTCACAGAGCATTCACCGCTGACCCC-3'
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MH36
5'-CACCGGATCCACCCCCAGTCTGATGAGAAGAAATGAAACGAAGGTCATGG-3'
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Este fue conseguido con ADN polimerasa FastStart dirigida por DNA (Roche) en una reacción de 50 \mul, que fue iniciada por una incubación de 4 minutos a 95°C y seguida de 25 ciclos de PCR (95°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 72°C durante 60 segundos). Un producto de PCR del tamaño previsto fue observado en una muestra de 10 \mul siguiendo una electroforesis en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio. El producto de PCR restante fue purificado usando un kit de purificación por PCR QlAquick (Qiagen) y digerido para una finalización con BamHI y BglII. El ADN de aproximadamente el tamaño previsto fue cortado a partir de un gel de agarosa al 1% (p/v) teñido con bromuro de etidio y purificado.
El plásmido pDB2573X proporcionó un promotor y un terminador de transcripción adecuados, con una secuencia líder secretora adecuada y una parte de codificación de secuencias de ADN de un enlazador peptídico (GGS)_{4}
GG soldado al N-término de albúmina humana. La construcción de pDB25733X ha sido descrita previamente (WO 03/066824).
El producto de PCR digerido con BamHI y BglII de 0.57 kb fue ligado con pDB2573X, el cual fue digerido con BamHI, BglII y fosfatasa alcalina intestinal de ternero para crear el plásmido pDB2617 (figura 95) y la secuencia de ADN correcta confirmada para el fragmento generado por PCR y secuencias adyacentes usando cebadores oligonucleótidos CF84; CF85. PRB y DS229.
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CF84
5'-CCTATGTGAAGCATCAGGGC-3'
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CF85
5'-CCAACATTAATAGGCATCCC-3'
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PRB
5'-CGTCCCGTTATATTGGAG-3'
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DS229
5'-CTTGTCACAGTTTTCAGCAGATTCGTCAG-3'
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El plásmido pDB2617 fue digerido con NdeI y NotI, y el casete de expresión NotI de 3.586-kb para una secreción de Axokine^{TM}-(GGS)_{4}GG-albúmina fue purificado a partir de un gel de agarosa.
Unas secuencias de vector de levadura apropiadas fueron provistas por el plásmido de "desintegración" pSAC35. El casete de expresión de Axokine^{TM}-(GGS)_{4}GG-albúmina de N-terminal NotI de 3.586 kb fue aislado del pDB2617, purificado y ligado en pSAC35 digerido con NotI, que fue tratado con fosfatasa intestinal de ternero, creando un plásmido pDB2618 conteniendo el casete de expresión NotI en la misma orientación con respecto al marcador de selección LEU2 (figura 96). Secuencias de vector PDI1 de levadura apropiadas fueron provistas por un plásmido de "desintegración" pDB2690 (figura 6). El casete de expresión de Axokine^{TM}-(GGS)_{4}GG-albúmina de N-terminal NotI de 3.586 kb fue aislado del pDB2617, purificado y ligado en NotI digerido con pDB2690, el cual fue tratado con fosfatasa intestinal de ternero, creando un plásmido pDB3106 conteniendo el casete de expresión NotI en la misma orientación con respecto al marcador de selección LEU2 (figura 68).
Un ADNc humano IL10 (número de acceso NCBI (NM_000572) fue amplificado por PCR usando oligonucleótidos de cadena única CF68 y CF69.
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CF68
5'-GCGCAGATCTTTGGATAAGAGAAGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCAC-3'
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CF69
5'-GCTTGGATCCACCGTTTCGTATCTTCATTGTCATGTAGGCTTCTATGTAG-3'
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El fragmento de ADN de 0.43 kb fue digerido hasta finalización con BamHI y digerido parcialmente con BglII y el fragmento de ADN BglII-BamHI de 0.42 kb fue aislado.
El plásmido pDB2573X proporcionó un promotor y terminador de transcripción adecuados, con una secuencia líder secretora adecuada y unas secuencias de ADN codificantes de una parte de enlazador peptídico (GGS)_{4}GG fusionado en el N-término de albúmina humana. La construcción de pDB2573X ha sido descrita anteriormente (WO 03/066824).
El plásmido pDB2573X fue digerido hasta finalización con BglII y BamHI, el fragmento de ADN de 6.21 kb fue aislado y tratado con fosfatasa intestinal de ternero y ligado después con el ADNc IL10 de N-terminal BglII/BamHI de 0.42 kb para crear pDB2620 (figura 69). Unas secuencias de vector de levadura apropiadas fueron provistas por el plásmido de "desintegración" pSAC35. El casete de expresión de IL10-(GGS)4GG-albúmina de N-terminal NotI de 3.51 kb fue aislado de pDB2620, purificado y ligado en pSAC35digerido con NotI, el cual fue tratado con fosfatasa intestinal de ternero, creando el plásmido pDB2621 conteniendo el casete de expresión NotI en la misma orientación con respecto al marcador de selección LEU2 (figura 70). Unas secuencias de vector PDI1 de levadura apropiada fueron provistas por un plásmido de "desintegración" pDB2690 (figura 6). El casete de expresión IL10-(GGS)_{4}GG-albúmina de N-terminal NotI de 3.51 kb fue aislado de pDB2620, purificado y ligado en NotI digerido con pDB2690, el cual fue tratado con fosfatasa intestinal de ternero, creando el plásmido pDB3105 conteniendo el casete de expresión NotI en la misma orientación con respecto al marcador de selección LEU2 (figura
71).
La misma cepa de levadura de control usada en ejemplos precedentes fue transformada en prototrofía de leucina usando un método con acetato de litio modificado (Sigma yeast transformation kit, YEAST-1, protocolo 2; (Ito et al, 1983, J. Bacteriol., 153, 163; Elble, 1992 Biotechniques, 13, 18)). Los transformantes fueron seleccionados en placas BMMD-agar, y fueron posteriormente retirados en placas BMMD-agar. Las reservas de trehalosa conservadas por crionización fueron preparadas a partir de 10 ml de BMMD en cultivos en vasos de agitación (24 hrs, 30ºC,
200 rpm).
Los transformantes de cada cepa fueron inoculados en 10 ml de BMMD en 50 ml en vasos de agitación e incubados en un agitador orbital a 30ºC, 200 rpm durante 4 días. Los sobrenadantes de cultivo fueron recogidos y los títulos de fusión de albúmina recombinante fueron comparados por inmunoelectroforesis en cohete (figura 72). Los resultados indicaban que el título de fusión de albúmina en los sobrenadantes de cultivo de la cepa de levadura era más elevado cuando el PDI1 estaba presente en el plásmido 2 \mum que cuando no lo estaba.
El aumento de expresión de las fusiones de albúmina detectado por inmunoelectroforesis en cohete fue estudiado también por análisis SDS-PAGE. Unos cultivos en vasos de agitación en BMMD de YBX7 expresando varias fusiones de albúmina fueron cultivados durante 4 días en un agitador orbital a 30ºC, 200 rpm. Una muestra del sobrenadante de cultivo fue analizado por SDS-PAGE (figura 73). Una banda proteínica del tamaño deseado para la fusión de la albúmina bajo estudio reveló un aumento importante.
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Ejemplo 10
Coexpresión de S. cerevisiae ORM2 y transferrina recombinante en un plásmido de base 2 \mum
El gen ORM2 de S. cerevisiae S288c fue clonado en el sitio XcmI después de REP2 en un plásmido basado en pSAC35 conteniendo un casete de expresión para rTF (N413Q, N611 Q) en el sitio Not/I en la región UL.
El plásmido pDB2965 (figura 74) fue construido por inserción del fragmento NotI de 3,256-bp conteniendo el cassette de expresión rTF (N413Q, N611Q) a partir de pDB2928 (figura 11) dentro del sitio NotI de pDB2688 (figura 4). El pDB2688 fue linealizado por digestión con NotI y tratado con fosfatasa alcalina. El casete de expresión rTF de pDB2928 fue clonado en el sitio NotI de pDB2688 para producir pDB2965, con el gen de transferrina transcrito en la misma dirección que LEU2.
El gen ORM2 fue amplificado a partir de ADN genómico S288c de S. cerevisiae por PCR con cebadores oligonucleótidos GS11 y GS12 (tabla 10) usando el Sistema Expand High Fidelity PLUS PCR (Roche).
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TABLA 10 Cebadores de oligonucleótidos para una amplificación por PCR de chaperonas S. cerevisiae 
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22 
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Los cebadores fueron diseñados para incorporar sitios de reconocimiento de restricción SnaBI y PacI en el extremo 5' del cebador directo y sitios de reconocimiento de restricción SnaBI y FseI en el extremo 5' del cebador inverso para una clonación dentro del enlazador en el sitio XcmI del vector, pDB2965. La PCR fue efectuada en las condiciones siguientes: mezcla 200 \muM dNTP, 2.5 U de mezcla enzimática Expand HiFi, tampón de reacción 1 x Expand HiFi, 0.8 \mug de ADN genómico; 1 ciclo a 94ºC durante 2 minutos, 30 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, a 55ºC durante 30 segundos, a 72ºC durante 3 minutos, y 1 ciclo a 72ºC durante 7 minutos. 0.4 \muM de cada cebador fue usado. El producto de PCR requerido de 1,195-bp y el vector pDB2965 fueron digeridos con PacI y FseI, ligados juntos y transformados en células E. coli DH5\alpha competentes. Los transformantes resistentes a la ampicilina fueron seleccionados. Los constructos conteniendo ORM2 fueron identificados por análisis de enzima de restricción de ADN plásmido aislado de los clones resistentes a la ampicilina. Cuatro clones plásmidos fueron preparados pDB3090, pDB3091, pDB3092, y pBD3093, y todos éstos tenían el mismo modelo de fragmento de ADN deseado durante el análisis de restricción (figura 75).
La Cepa de Control de S. cerevisiae y Cepa A (tal como descritas en el ejemplo 3) fueron seleccionadas para investigar el efecto de la secreción de transferrina cuando la transferrina y genes ORM2 fueron coexpresados a partir del plásmido de base 2 \mum. La Cepa de Control y Cepa A fueron transformadas en prototrofia de leucina por plásmidos pDB3090, pDB3092 y pBD3093, así como un plásmido de control pDB2931 (figura 14), conteniendo el casete de expresión rTf (N413Q, N611Q) sin ORM2. Los transformantes fueron seleccionados en BMMD agar y retirados en BMMD agar para un análisis posterior.
Para estudiar el efecto de coexpresión de ORM2 sobre la secreción de transferrina, 10 ml de medio líquido selectivo (BMMD) y no selectivo (YEPD) fueron inoculados con cepas conteniendo los plásmidos de coexpresión de ORM2/transferrina. El cultivo en vaso de agitación fue incubado después a 30ºC en agitación (200 r.p.m.) durante 4 días. El nivel relativo de secreción de transferrina fue determinado por un gel de inmunoelectroforesis en cohete (RIE) (figura 76).
Los niveles de transferrina segregados de la Cepa de Control [pDB3090] y Cepa de Control [pDB3092] fueron superiores a los niveles de la Cepa de Control [pDB2931] en ambos medios BMMD y YEPS. De forma similar, los niveles de transferrina segregados a partir de ambas Cepa A [pDB3090] y cepa A [pDB3093] fueron superiores a los niveles de Cepa A [pDB2931] en ambos medios BMMD y YEPS. La secreción de transferrina de todos los transformantes de Cepa A fue superior a los transformantes de la Cepa de Control cultivados en los mismos medios. La Cepa A contiene una copia adicional de PDI1 en el genoma, que aumenta la secreción de transferrina. Por lo que en la Cepa A, la expresión incrementada de ORM2 y PDI1 tenía un efecto acumulativo sobre la secreción de
transferrina.
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Ejemplo 11
Coexpresión: de PSE1 S. cerevisiae y de transferrina recombinante sobre un plásmido de base 2 \mum
El gen PSE1 de S. cerevisiae S288c fue clonado en el sitio XcmI después de REP2 sobre un plásmido de base pSAC35 conteniendo un casete de expresión para rTf (N413 q, N611Q) en el sitio NotI en la región UL.
El gen PSE1 de tipo salvaje de 3.25-kp fue amplificado a partir del ADN genómico S288c de S. cerevisiae por PCR con cebadores oligonucleótidos CED009 y CED010 (tabla 10) usando el Expand High Fidelity PCR Kit (Roche). Los cebadores fueron diseñados para incorporar sitios de reconocimiento de restricción BamHI en el extremo 5' para facilitar la clonación dentro del vector, pUC19. La PCR fue realizada en las condiciones siguientes: 1 ciclo a 94ºC durante 2 minutos; 10 ciclos a 94ºC durante 15 segundos, a 45ºC durante 30 segundos, a 68ºC durante 4 minutos y 30 segundos; 20 ciclos a 94ºC durante 15 segundos, a 45ºC durante 30 segundos, a 68ºC durante 4 minutos y 30 segundos (con un aumento de 5 segundos por ciclo); y 1 ciclo a 68ºC durante 10 minutos. El producto de PCR requerido fue digerido con BamHI y después ligado en pUC19, que ha sido digerido con BamHI y tratado con fosfatasa alcalina, produciendo el constructo pDB2848 (figura 77). La secuenciación de pDB2848 confirmó que las secuencias amplificadas fueron como previstas para el PSE1 S288c de S. cererisiae, cuando se compara con la secuencia de PSE1/YMR308C sobre el cromosoma XIII de coordenadas 892220 a 888951 más 1000 pares de base de secuencia superior y 1000 pares de base de secuencia inferior (Base de datos del genoma de Saccharomyces en http://www.yeastgenome.org/). El gen PSE1 fue cortado después del pDB2848 por digestión con BamHI, y el fragmento resultante de 4,096-bp de fenol:cloroformo extraído, de etanol precipitado y tratado con un fragmento Klenow de ADN polimerasa para rellenar el saliente 5'. El plásmido pDB2965 (figura 74) fue linealizado por digestión con SnaBI, y la fosfatasa alcalina tratada. El vector pDB2965 linealizado y el inserto PSE1 fueron ligados, y transformados en células E. coli \alphaDH5 competentes. Los transformantes resistentes a la ampicilina fueron seleccionados. Los plásmidos pDB3097 (figura 78) y pDB3098 (figura 79) fueron identificados para contener el gen PSE1 por análisis de enzima de restricción de ADN plásmido aislado de los clones resistentes a la ampicilina. En pDB3097 el gen PSE1 es transcrito en la misma orientación que REP2, mientras que en pDB3098 el gen PSE1 es transcrito en la orientación opuesta a
REP2.
La Cepa de control de S. cerevisiae fue transformada en prototrofía de leucina por plásmidos, pDB3097 y pBD3098, así como un plásmido de control pDB2931 (figura 14), conteniendo el casete de expresión de rTf (N413Q, N611Q) sin PSE1. Los transformantes fueron seleccionados en BMMD agar y retirados en BMMD agar para un análisis
posterior.
Para estudiar el efecto de expresión de PSE1 sobre la secreción de transferrina, unos vasos conteniendo 10 ml de medio líquido selectivo (BMMD) fueron inoculados con cepas conteniendo los plásmidos de coexpresión de PSE1/transferina. El cultivo en vaso de agitación fue incubado después a 30ºC en agitación (200 r.p.m.) durante 4 días. El nivel relativo de secreción de transferrina fue determinado por un gel de inmunoelectroforesis en cohete, (RIE) (figura 80).
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Los niveles de transferrina segregados de la Cepa de Control [pDB3097] y de la Cepa de Control [pDB3098] fueron superiores a los niveles de la Cepa de Control [pDB2931] en medios BMMD. Por lo tanto, la expresión de PSE1 a partir del plásmido de base 2 \mum ha mejorado la secreción de transferrina de S. cerevisiae. La secreción de transferrina fue mejorada con el gen PSE1 transcrito en cada dirección con respecto al gen REP2 en pDB3097 y
pDB3098.
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Ejemplo 12
Coexpresión de SSA1 de S. cerevisiae y de transferrina recombinante: sobre un plásmido de base 2 \muM
El gen SSA1 a partir de S. cerevisiae S288c fue clonado en el sitio XcmI después de REP2 sobre un plásmido de base pSAC35 conteniendo un casete de expresión para rTf (N413Q, N611Q) en el sitio NotI en la región
UL.
El gen SSA1 de 1.93-kb fue amplificado a partir del ADN genómico S288c de S. cerevisiae por PCR con cebadores oligonucleótidos CED037 y CED038 (tabla 10) usando el Expand High Fidelity PCR Kit (Roche). Los cebadores fueron diseñados para incorporar sitios de reconocimiento de restricción SphI en sus extremidades 5' para facilitar la clonación dentro del vector, pUC19. La PCR fue efectuada en las condiciones siguientes: 1 ciclo a 94ºC durante 10 minutos, 35 ciclos a 94ºC durante 1 minuto, a 55ºC durante 1 minuto, a 72ºC durante 5 minutos, y 1 ciclo a 72ºC durante 10 minutos. El producto de PCR requerido fue digerido con SphI y después ligado en pUC19, que ha sido digerido con SphI y tratado con fosfatasa alcalina, produciendo un constructo pDB2850 (figura 81). La secuenciación de pDB2850 confirmó la secuencia deseada de SSA1/YAL005C de S. cerevisiae S288c sobre el cromosoma I a partir de coordenadas 141433 a 139505 más 1000 pares de base de secuencia superior y 1000 pares de base de secuencia inferior publicada en la base de datos del genoma de Saccharomyces (http://www.yeastgenome.org/).
El gen SSA1 fue cortado del pDB2850 por digestión con SphI, y el fragmento resultante de 2,748-bp de fenol:cloroformo extraído, de etanol precipitado y tratado con ADN polimerasa T4 para eliminar el saliente 3'. El plásmido pDB2965 fue linealizado por digestión con SnaBI y tratado con fosfatasa alcalina de ternero. El vector pDB2965 linealizado y el inserto SSA1 fueron ligados y transformados en células E. coli \alphaDH5 competentes. Los transformantes resistentes a la ampicilina fueron seleccionados. Los constructos pDB3094 (figura 82) y pDB3095 (figura 83) de SSA1 fueron identificados por análisis de enzimas de restricción del ADN plásmido aislado de los clones resistentes a la ampicilina. En pDB3094, el gen SSA1 está transcrito en la misma dirección que REP2, mientras que en pDB3095 el gen SSA1 está transcrito en la dirección opuesta a REP2.
La Cepa de control de S. cerevisiae fue transformada en prototrofía de leucina por plásmidos, pDB3094 y pBD3095, así como un plásmido de control pDB2931 (figura 14), conteniendo el casete de expresión de rTf (N413Q, N611Q) sin SSA1. Los transformantes fueron seleccionados en BMMD agar y retirados en BMMD agar para un análisis
posterior.
Para estudiar el efecto de expresión de SSA1 sobre la secreción de transferrina, unos vasos conteniendo 10 ml de medio líquido selectivo (BMMD) fueron inoculados con cepas conteniendo los plásmidos de coexpresión de SSA1/transferrina. Los cultivos en vasos de agitación fueron incubados a 30ºC en agitación (200 r.p.m.) durante 4 días. El nivel relativo de secreción de transferrina fue determinado por un gel de inmunoelectroforesis en cohete (RIE) (figura 84).
Los niveles de transferrina segregados a partir de la Cepa de Control [pDB3095] fueron superiores a los niveles de la Cepa de Control [pDB2931] y de la Cepa de Control [pDB3094] en medios BMMD. En consecuencia, la expresión de SSA1 a partir de los plásmidos de base 2 \muM ha aumentado la secreción de transferrina a partir de S. cerevisiae. La secreción de transferrina fue mejorada con el gen SSA1 transcrito en la dirección opuesta con respecto al gen REP2 en pDB3094.
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Ejemplo 13
La ruptura de gen PDI1, combinada con un gen PDI1 sobre el plásmido de base 2 \mum aumentó la secreción de albúmina recombinante y la estabilidad del plásmido
Los cebadores de ADN de oligonucleótidos de cadena única indicados en la tabla 11 fueron diseñados para amplificar una región superior de la región de codificación del PDI1 de levadura y otra región inferior de la región de codificación del PDII de levadura.
TABLA 11 Cebadores de oligonucleótidos 
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Los cebadores DS299 y DS300 amplificaron la región 5' de PDI1 por PCR, mientras que los cebadores DS301 y DS302 amplificaron una región 3' de PDI1, usando el ADN genómico derivado S288c en forma de molde. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 1 \muL de ADN de molde S288c (en 0.01 ng/uL, 0.1 ng/\muL, 1 ng/\mul, 10 ng/\muL y 100 ng/\muL), 5 \muL de tampón 10X (Fast Start Taq+Mg, (Roche)), 1 \muL de 10 mM dNTP, 5 \muL de cada cebador (2 \mum), 0.4 \muL Fast Start Taq, formado en 50 \muL con H_{2}O. Las PCR fueron realizadas usando un Perkin-Elmer Thermal Cycler 9700. Las condiciones fueron: desnaturalización a 95ºC durante 4 min [HOLD], después [CYCLE] desnaturalización a 95ºC durante 30 segundos, recocimiento a 45ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 45 segundos durante 20 ciclos, después [HOLD] a 72ºC durante 10 min y después [HOLD] a 4ºC. El producto de PCR 5' PDI1 de 0.22 kbp fue cortado con NotI y HindIII, mientras que el producto de PCR 3' PDI1 de 0.34 kbp fue cortado con HindIII y
PstI.
El plásmido pMCS5 (Hoheisel, 1994, Biotechniques 17, 456-460) (figura 85) fue digerido hasta la finalización con HindIII, de extremo romo con T4 ADN polimerasa más dNTPs y religado para crear el pDB2964 (figura
86).
El plásmido pDB2964 fue digerido con HindIII, tratado con fosfatasa intestinal de ternero, y ligado con el producto de PCR 5' PDI1 de 0.22 kbp digerido con NotI y HindIII y el producto de PCR 3' PDI1 de 0.34 kbp digerido con HindIII y PstI para crear el pDB3069 (figura 87) que fue secuenciado con cebadores hacia adelante e inversos universales y los cebadores de secuenciación de ADN DS303, DS304, DS305 y DS306 (tabla 11).
Los cebadores DS234 y DS235 (tabla 12) fueron usados para amplificar el gen marcador TRP1 modificado de YIplac204 (Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534), incorporando sitios de restricción HindIII en cada extremo del producto de PCR. Las condiciones de PRC fueron las siguientes: 1 \muL en molde YIplac204 (en 0.01 ngl/\muL, 0.1 ng/\muL, Ing/\muI, 10 ng/\muL y 100 ng/\muL), 5 \muL de tampón 10X (Fast Start Taq+Mg, (Roche), 1 \muL de 10 mM de dNTP, 5 \mupL de cada cebador (2 \mum), 0.4 \muL de Fast Start Taq, formado en 50 \muL con H_{2}O. Las PCR fueron realizadas usando un Perkin-Elmer Thermal Cycler 9600. Las condiciones fueron: desnaturalización a 95ºC durante 4 min [HOLD], después [CiCLE] desnaturalición a 95ºC durante 30 segundos, recocimiento durante 45 segundos a 45ºC, extensión a 72ºC durante 90 segundos durante 20 ciclos, después [HOLD] a 72ºC durante 10 min y después [HOLD] a 4ºC. El producto de PCR de 0.86 kbp fue digerido con HindIII y clonado en el sitio HindIII de pMCS5 para crear pDB2778 (figura 88). Las digestiones de enzima de restricción y la secuenciación con cebadores universales anteriores e inversos así como DS236, DS237, DS238 y DS239 (tabla 12) confirmaron que la secuencia del gen TRP1 modificado era
correcta.
TABLA 12 Cebadores de oligonucleótidos 
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El gen TRP1 de 0.86 kbp fue aislado de pDB2778 por digestión con HindIII y clonado en el sitio HindIII de pDB3069 para crear pDB3078 (figura 89) y pDB3079 (figura 90). Un fragmento de ADN de ruptura PDI1::TRP1 de 1.41 kb fue aislado de pDB3078 o pDB3079 por digestión con NotI/PstI.
Las cepas de levadura que incorporan una deleción TAP1 (trp1\Delta) fueron construidas de tal forma para no dejar en el genoma ninguna homología al gen marcador TRP1 (pDB2778) una vez creado el trp1\Delta, para impedir así la recombinación homóloga entre el TRP1 futuro conteniendo constructos y el locus TRP1. Para conseguir la eliminación total de la secuencia TRP1 nativa del genoma de las cepas huésped elegidas, los oligonucleótidos fueron diseñados para amplificar áreas de las UTR 5' y UTR 3' del gen TRP1 al exterior del gen marcador TRP1 presente en el vector de integración YIplac204 (Gietz:& Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534). El gen marcador TRP1 YIplac204 difiere del gen TRP1 nativo/cromosómico en la medida en que los sitios internos HindIII, PstI y XbaI fueron eliminados por mutagénesis dirigida al sitio (Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534). El gen marcador TRP1 modificado YIplac204 fue construido a partir de un fragmento EcoRI de fragmento genómico de extremos romos de 1.453 kbp, que contenía el gen TRP1 y sólo 102 bp del promotor TRP1 (Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534). Aunque esto fue una secuencia promotora relativamente corta, de toda evidencia fue suficiente complementar las mutaciones auxotróficas de trp1 (Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534). Sólo las secuencias de ADN superiores del sitio EcoRI, de posición 102 bp 5' con respecto al inicio del ORF de TRP1 fueron usadas para crear la UTR 5' de TRP1. La selección de la UTR 3' fue menos crítica cuando estaba al exterior del extremo 3' del marcador TRP1 modificado funcional, que fue seleccionado para ser de 85bp inferior del codón de parada de traslación.
Los cebadores de ADN de oligonucleótidos de cadena única fueron diseñados y construidos para amplificar las regiones UTR 5' y UTR 3' del gen TRP1 de tal forma que durante la amplificación por PCR, los sitios de enzima de restricción serían añadidos en las extremidades de los productos de PCR que deben ser usados en etapas de clonación más tarde. Los cebadores DS230 y DS231 (tabla 12) amplificaron la región 5' de TRP1 por PCR, mientras que los cebadores DS232 y DS233 (tabla 12) amplificaron una región 3' de TRP1, usando el ADN genómico S288c en forma de molde. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: \mul de ADN genómico S288c de molde (en 0.01 ng/\muL, 0.1 ng/\muL, 1 ng/\mul, 10 ng/\muL y 100 ng/\muL), 5 \muL de tampón 10X (Fast Start Taq+Mg, (Roche), 1 \muL, 10 mM de dNTP, 5pL de cada cebador (2 \mum), 0.4 \muL de Fast Start Taq, formado para 50 \muL con H_{2}O. Las PCR fueron realizadas usando un Perkin-Elmer Thermal Cycler 9600. Las condiciones fueron: desnaturalización a 95ºC durante 4 min [HOLD], después [CYCLE] desnaturalización a 95ºC durante 30 segundos, recocimiento durante 45 segundos a 45ºC, extensión a 72ºC durante 90 segundos durante 20 ciclos, después [HOLD] a 72ºC durante 10 min y después [HOLD] a
4ºC.
El producto de PCR de la UTR 5' de TRP1 0.19 kbp fue cortado con EcoRI y HindIII, mientras que el producto de PCR de la UTR 3' de TRP1 0.2 kbp fue cortado con BamHI y HindIII y ligado en pAYE505 linealizado con BamHI/EcoRI para crear el plásmido pDB2777 (figura 91). La construcción de pAYE505 está descrita en WO 95/33833. La secuenciación de ADN usando cebadores anteriores e inversos, diseñados para cebarse a partir del esqueleto plásmido y secuenciar los insertos clonados, confirmó que en ambos casos las secuencias UTR 5' y 3' clonadas del gen TRP1 tenían la secuencia de ADN deseada. El plásmido pDB2777 contenía un fragmento de ruptura del TRP1 que comprendía una fusión de secuencias derivadas de las UTR 5' y 3' de TRP1. Este fragmento de ruptura del TRP1 de 0.383 kbp fue cortado a partir de pDB2777 por digestión completa con EcoRI.
La cepa de levadura DXY1 (Kerry-Williams et al., 1998, Yeast, 14, 161- 169) fue transformada en prototrofía de leucina con el plásmido de expresión de albúmina pDB2244 usando un método con acetato de litio modificado (Sigma yeast transformation kit, YEAST-1, protocol 2; (Ito et al, 1983, J. Bacteriol., 153, 163; Elble, 1992 Biotechniques 13, 18)) para crear la cepa de levadura DXY1 [pDB2244]. La construcción del plásmido de expresión de albúmina pDB2244 está descrita en WO 00/44772. Los transformantes fueron seleccionados en placas BMMD-agar, y fueron posteriormente retirados en placas BMMD-agar. Las reservas de trehalosa conservadas por crionización fueron preparadas a partir de 10ml de cultivos en vaso de agitación en BMMD (24 hrs, 30ºC, 200 rpm).
La DXY1 [pDB2244] fue transformada en autotrofia de triptófano con el fragmento de ADN de ruptura TRP1 EcoRI de 0.383 kbp a partir de pDB2777 usando un agar nutritivo incorporando el análogo triptófano selectivo de contador, ácido 5-fluoroantranílico (5-FAA), tal y como está descrito por Toyn et al., (2000 Yeast 16, 553-560). Las colonias resistentes a los efectos tóxicos de 5-FAA fueron escogidas y rayadas sobre una segunda serie de placas de 5- FAA para confirmar que eran realmente resistentes a 5-FAA y seleccionarlas lejos de cualquier crecimiento anterior. Estas colonias que crecieron fueron después reagrupadas sobre BMMD y BMMD con triptófano para identificar cuáles fueron auxótrofos de triptófano.
Posteriormente, las colonias que demostraron ser auxótrofos de triptófano fueron seleccionadas para otro análisis por transformación con YCplac22 (Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534) para averiguar que los aislados eran trp1.
La amplificación por PCR a través del locus de TRP1 fue usada para confirmar que el fenotipo trp^{-} se debió a una deleción en esta región. El ADN genómico fue preparado a partir de aislados identificados como resistentes al 5-FAA e incapaces de crecer sobre medios mínimos sin la adición de triptófano. La amplificación por PCR del locus de TRP1 genómico con cebadores CED005 y CED006 (tabla 12) fue conseguida como indicado a continuación: 1 \muL de ADN genómico de molde, 5 \muL de tampón 10X (Fast Start Taq+Mg, (Roche), 1 \muL de 10 mM de dNTP, 5 \muL de cada cebador (2 \mum), 0.4 \muL de Fast Start Taq, formado hasta 50 \muL con H_{2}O. Las PCR fueron realizadas usando un Perkin-Elmer Thermal Cycler 9600. Las condiciones fueron: desnaturalización a 94ºC durante 10 min [HOLD], después [CYCLE] desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, recocimiento durante 30 segundos a 55ºC, extensión a 72ºC durante 120 segundos durante 40 ciclos, después [HOLD] a 72ºC durante 10 min y después [HOLD] a 4ºC. La amplificación por PCR del locus de TRP1 de tipo salvaje produjo un producto de PCR de un tamaño de 1.34 kbp, mientras que la amplificación a través de la región de TRP1 eliminada produjo un producto de PCR de 0.84 kbp a 0.50 kbp más pequeño. El análisis por PCR identificó una cepa trp^{-} derivada de DXY1 (DXY1 trp1\Delta [pDB2244]) que posee el evento de deleción deseado.
La cepa de levadura DXY1 trp1\Delta [pDB2244] fue polimerizada del plásmido de expresión pDB2244 tal como descrito por Sleep et al., (1991, Bio/Technology, 9, 183-187). La DXY1 trp1\Delta cir^{0} fue retransformada en prototrofía de leucina con cada pDB2244, pDB2976, pDB2977, pDB2978, pDB2979, pDB2980 o pDB2981 usando un método con acetato de litio modificado (Sigma yeast transformation kit, YEAST-1, protocol 2; (Ito et al, 1983, J. Bacteriol., 153, 163; EIble, 1992 Biotechniques 13, 18)).
Los transformantes fueron seleccionados en placas BMMD-agar con un suplemento de triptófano, y fueron posteriormente separadas en placas BMMD-agar con un suplemento de triptófano.
Las reservas de trehalosa conservadas por crionización fueron preparadas a partir de 10 ml de cultivos en vasos de agitación en BMMD con un suplemento de triptófano (24 horas, 30ºC, 200 rpm).
Las cepas de levadura DXY1 trp1 [pDB2976], DXY1 trp1_[pDB2977], DXY1 trp1_ [pDB2978], DXY1trp1_ [pDB2979], DXY1 trp1_ [pDB2980] or DXY1 trp1_ [pDB2981] fueron transformadas en prototrofa de triptófano usando el método con acetato de litio modificado (Sigma yeast transformation kit, YEAST-1, protocol 2; (Ito et al, 1983, J. Bacteriol.,153, 163; Elble, 1992, Biotechniques, 13, 18)) con un fragmento de ADN de ruptura PDI1::TRP1 de 1.41 kb aislado de pDB3078 por digestión con NotI/PstI. Los transformantes fueron seleccionados en placas BMMD-agar y fueron retirados posteriormente en placas BMMD-agar.
Seis transformantes de cada cepa fueron inoculados en 10 ml en YEPD en 50 ml en vasos de agitación e incubados en un agitador orbital a 30ºC, 200 rpm durante 4 días. Los sobrenadantes de cultivo y biomasas celulares fueron recogidas. El ADN genómico fue preparado ((Lee, 1992, Biotechniques, 12, 677) a partir de los prototrofos de triptófano y DXY1 [pDB2244]. El locus de PDI1 genómico amplificado por PCR con cebadores DS236 y DS303 (tabla 11 y 12) fue obtenido como indicado a continuación: 1 \muL de ADN genómico de molde, 5 \muL de tampón 10X (Fast Start Taq+Mg, (Roche), 1 \muL 10 mM de dNTP, 5 \muL de cada cebador (2 \mum), 0.4 \muL de Fast Start Taq, formado hasta 50 \muL con H_{2}O. Las PCR fueron realizadas usando un Perkin-Elmer Thermal Cycler 9700. Las condiciones fueron: desnaturalización a 94ºC durante 4 min [HOLD], después [CYCLE] desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, recocimiento durante 30 segundos a 50ºC, extensión a 72ºC durante 60 segundos durante 30 ciclos, después [HOLD] a 72ºC durante 10 min y después [HOLD] a 4ºC. La amplificación por PCR del locus de PDI1 de tipo salvaje produjo un producto de PCR, mientras que una amplificación a través de la región de PDI1 eliminada produjo un producto de PCR de 0.65 kbp. El análisis de PCR identificó que todas las 36 cepas pdi1::TRP1 potenciales probadas tenían la deleción pdi1::TRP1 deseada.
Los títulos de albúmina recombinante fueron comparados por inmunoelectroforesis en cohete (figura 92). Dentro de cada grupo, los seis disociadores pdi1::TRP1 totales de DXY1 trp1\Delta [pDB2976], DXY1 trp1\Delta [pDB2978], DXY1 trp1\Delta [pDB2980], DXY1 trp1\Delta [pDB2977] y DXY1 trp1\Delta [pDB2979] tienen productividades de rHA muy similares. Sólo los seis disociadores pdil1::TRP1 de DXY1 trp1\Delta1 [pDB2981] mostraron una variación en el título de expresión de rHA. Los seis pdi1::TRP1 indicados en la figura 92 fueron extendidos en YEPD agar para aislar colonias individuales y después reagrupadas en BMMD agar.
Tres aisladores celulares únicos de DXY1 trp1\Delta pdi1::TRP1 [pDB2976], DXY1 trp1\Delta pdi1::TRP1 [pDB2978], DXY1 trp1\Delta pdi1::TRP1 [pDB2980], DXY1 trp1\Delta pdi1::TRP1 [pDB2977], DXY1 trp1\Delta pdi1::TRP1 [pDB2979] y DXY1 trp1\Delta pdi1::TRP1 [pDB2981] con DXY1 [pDB2244], DXY1 [pDB2976], DXY1 [pDB2978], DXY1
[pDB2980], DXY1 [pDB2977], DXY1 [pDB2979] y DXY1 [pDB2981] fueron inoculados en 10 ml en YEPD en 502 ml en vasos de agitación e incubados en un agitador orbital a 30ºC, 200 rpm durante 4 días. Los sobrenadantes de cultivo fueron recogidos y los títulos de albúmina recombinante fueron comparados por inmunoelectroforesis en cohete (figura 93). Los trece disociadores PDI1 de tipo salvaje y pdi1::TRP1 indicados en la figura 93 fueron extendidos en YEPD agar para aislar las colonias individuales. Cien colonias celulares únicas de cada cepa fueron reagrupadas después en BMMD agar o YEPD agar conteniendo un anticuerpo anti-HSA de cabra para detectar la expresión de albúmina recombinante (Sleep et al., 1991, Bio/Technology, 9, 183-187) y el fenotipo Leu+/rHA+, Leu+/rHA, Leu-/rHA+ o Leu-/rHA de cada colonia marcada (tabla 13).
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TABLA 13 
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Estos datos indican que la retención de plásmidos es aumentada cuando el gen PDI1 es usado como un marcador seleccionable sobre un plásmido en una cepa huésped que no tiene ningún PDI codificado cromosómicamente, incluso en un medio no selectivo tal como el medio rico ejemplificado.
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Referencias citadas en la descripción
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Claims (71)

1. Método para la producción de una proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum comprendiendo:
(a)
el suministro de una célula huésped comprendiendo un plásmido de familia de 2 \mum, el plásmido comprendiendo un gen codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de una proteína chaperona y un gen codificante de una proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum;
(b)
el cultivo de la célula huésped en un medio de cultivo en condiciones que permiten la coexpresión de la proteína de gen codificante comprendiendo la secuencia de la proteína chaperona y el gen codificante de una proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum; y
(c)
purificación de la proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum expresada a partir de la célula huésped cultivada o del medio de cultivo.
2. Método según la reivindicación 1 comprendiendo también la etapa de formulación de la proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum purificada con un portador o diluyente y opcionalmente presentación de la proteína formulada de esta manera en forma de dosis unitaria.
3. Uso de un plásmido de familia de 2 \mum en forma de vector de expresión para aumentar la producción de una proteína fúngica o de vertebrado de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum mediante el suministro de un gen codificante de una proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum y de un gen codificante de una proteína chaperona en el mismo plásmido de familia de 2 \mum.
4. Uso según la reivindicación 3 donde la proteína fúngica de plásmido no perteneciente a la familia 2 \mum es una proteína de plásmido de levadura no perteneciente a la familia de 2 \mum.
5. Plásmido de familia de 2 \mum comprendiendo un gen codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de una proteína chaperona y un gen codificante de una proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum-131, donde si el plásmido se basa en el plásmido de 2 \mum entonces es un vector de desintegración.
6. Método, uso o plásmido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la chaperona tiene una secuencia de chaperona fúngica o de chaperona de mamífero.
7. Método, uso o plásmido según la reivindicación 6 donde la chaperona tiene una secuencia de chaperona de levadura.
8. Método, uso o plásmido según la reivindicación 6, donde la chaperona tiene una secuencia de chaperona humana.
9. Método, uso o plásmido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la chaperona comprende la secuencia de una proteína codificada por cualquier AHA1, CCT2, CCT3, CCT4, CCT5, CCT6, CCT7, CCT8, CNS1, CPR3, CPR6, EPS1, ENRO1, EUG1, FMO1, HCH1, HSP1O, HSP12, HSP104, HSP26, HSP30, HSP42, HSP60, HSP78, HSP82, JEM1, MDJ1, MDJ2, MPD1, MPD2, PDI1, PFD1, ABC1, APJ1, ATP11, ATP12, BTT1, CDC37, CPR7, HSC82, KAR2, LHS1, MGE1, MRS11, NOB1, ECM10, SSA1, SSA2, SSA3, SSA4, SSC1, SSE2, SIL1, SLS1, UBI4, ORM1, ORM2, PER1, PTC2; PSE1 y HAC1 o HAC1 truncado sin intrón.
10. Método, uso o plásmido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la chaperona es una proteína disulfuro isomerasa, o comprende la secuencia de una proteína codificada por POSE1, ORM2 o SSA1 o una variante o fragmento de éstos, variante o fragmento que posee la misma actividad enzimática.
11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, o 5 a 10 donde la célula huésped expresa también un segundo gen recombinante codificante de una chaperona que es diferente a la primera chaperona codificada por el plásmido.
12. Método según la reivindicación 11 donde el segundo gen recombinante codificante de una chaperona es integrado cromosómicamente.
13. Método, uso o plásmido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 donde el plásmido comprende dos genes diferentes codificantes de chaperonas diferentes, uno de dichos genes es el segundo gen recombinante codificante de una chaperona tal como definido por la reivindicación 11.
14. Método, uso o plásmido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 donde una de las chaperonas es una proteína disulfuro isomerasa.
15. Método, uso o plásmido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 donde una de las chaperonas es ORM2.
16. Método, uso o plásmido según la reivindicación 11 a 15 donde las dos chaperonas son una proteína disulfuro isomerasa y ORM2.
17. Método, uso o plásmido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum comprende una secuencia líder eficaz para producir la secreción en la levadura.
18. Método, uso o plásmido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum es una proteína eucariótica, o un fragmento o variante de ésta, preferiblemente un proteína de vertebrado o fúngica.
19. Método, uso o plásmido según la reivindicación 18 donde la proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum es una proteína de levadura.
20. Método, uso o plásmido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum es una proteína usada comercialmente.
21. Método, uso o plásmido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum comprende una secuencia seleccionada a partir de albúmina, un anticuerpo monoclonal, un etopósido, una proteína de suero, un factor de coagulación de sangre, antistasina, un péptido anticoagulante de garrapata, transferrina, lactoferrina, endostatina, angiostatina, colágeno, una inmunoglobulina o fragmento de ésta, una molécula a base de inmunoglobulina o fragmento de ésta, una proteína de dominio Kunitz, interferones, interleuquinas, IL10, IL11, IL2, especies y sub-especies \alpha de interferón, especies y sub-especies \beta de interferón, especies y sub-especies y de interferón, leptina, CNTF, CNTF_{Ax15}, antagonista de receptor de IL1, eritropoyetina y mímicas de eritropoyetina trombopoyetina y mímicas de trombopoyetina, prosaptida, cianovirina-N, 5-Helix, péptido T20, péptido T1249, gp41 de VIH, gp120 de VIH, uroquinasa, prouroquinasa, tPA, hirudina, factor de crecimiento derivado de plaquetas, hormona paratiroidea, proinsulina, insulina, glucagón, péptidos de tipo glucagón, factor de crecimiento de tipo insulina, calcitonina, hormona de crecimiento, factor de crecimiento transfomante \beta, factor de necrosis tumoral, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, FGF, factores de coagulación en ambas formas preactiva y activa, incluyendo pero sin limitarse a éstos, plasminógeno fibrinógeno, trombina, pretrombina, pro-trombina, factor de von Willebrand, \alpha_{1}-antitripsina, activadores plasminógenos, Factor VII, Factor VIII, Factor IX, Factor X y Factor XIII, factor de crecimiento de nervios, LACI, factor de crecimiento de la células endoteliales derivado de las plaquetas, glucosa-oxidasa, colinesterasa de suero, aprotinina, proteína precursora de amiloido, inhibidor de tripsina interalfa, antitrombina III, especies apolipoproteínicas, proteína C, proteína S, o una variante o fragmento de cualquiera de éstos.
22. Método, uso o plásmido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum comprende la secuencia de una molécula a base de inmunoglobulina o fragmento de ésta, donde la molécula a base de inmunoglobulina es seleccionada a partir de un dAb, un fragmento Fab', F(ab')_{2}, scAb, scFv o un fragmento scFv.
23. Método, uso o plásmido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum comprende la secuencia de albúmina o una variante o fragmento de ésta.
24. Método, uso o plásmido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum comprende la secuencia de un elemento de familia de las transferrinas, o una variante o fragmento de ésta.
25. Método, uso o plásmido según la reivindicación 24 donde la proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum comprende la secuencia de transferrina o lactoferrina, o una variante o fragmento de éstas.
26. Método, uso o plásmido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum comprende una proteína de fusión.
27. Método, uso o plásmido según la reivindicación 26 donde la proteína de fusión es una proteína de fusión de albúmina o un elemento de familia de transferrina o una variante o fragmento de cada, fusionado directa o indirectamente en la secuencia de otra proteína.
28. Célula huésped comprendiendo un plásmido tal como definido por cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
29. Célula huésped según la reivindicación 28 donde una chaperona codificada por el plásmido es un gen esencial.
30. Célula huésped según la reivindicación 29 donde, en la ausencia del plásmido, la célula huésped no produce la chaperona.
31. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30 que es una célula de levadura.
32. Célula huésped según la reivindicación 31, donde el plásmido se basa en pSR1, pSB3 o pSB4 y la célula de levadura es Zygosaccharomyces rouxii, el plásmido se basa en pSB1 o pSB2 y la célula de levadura es Zygosaccharomyces bailli, el plásmido se basa en pSM1 y la célula de levadura es Zygosaccharomyces fermentati, el plásmido se basa en pKD1 y la célula de levadura es Kluyveromyces drosofilarum, o el plásmido se basa en el plásmido 2 \mum y la célula de levadura es Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces carlsbergensis.
33. Célula huésped según la reivindicación 32 donde el plásmido se basa en el plásmido 2 \mum y la célula de levadura es Saccharomices cerevisiae o Saccharomyces carlsbergensis.
34. Método según la reivindicación 1 donde la célula huésped es una célula huésped tal como definido por cualquiera de las reivindicaciones 28 a 33.
35. Método según la reivindicación 34 donde la célula huésped es una célula huésped tal como definida por la reivindicación 30, o cualquier otra reivindicación dependiente de ésta.
36. Método según la reivindicación 34 donde la etapa (b) incluye el cultivo de la célula huésped en medios no selectivos, como medios ricos.
37. Método para la producción de una proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum comprendiendo:
(a)
el suministro de una célula huésped comprendiendo un primer gen recombinante codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de una primera proteína de chaperona, un segundo gen recombinante codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de una segunda proteína de chaperona y un tercer gen recombinante codificante de una proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum, donde las primera y segunda chaperonas son diferentes;
(b)
el cultivo de la célula huésped en un medio de cultivo en condiciones que permiten la expresión de los primero, segundo y tercer genes; y
(c)
opcionalmente la purificación de la proteína de plásmido no perteneciente a la familia 2 \mum expresada así a partir de la célula huésped cultivada o del medio de cultivo; y
(d)
opcionalmente, la liofilización de la proteína purificada.
38. Método según la reivindicación 37 comprendiendo también la etapa de formulación de la proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum purificada con un portador o diluyente y opcionalmente presentación de la proteína formulada en forma de dosis unitaria.
39. Método según la reivindicación 37 o 38 donde las primera y segunda chaperonas comprenden la secuencia de una proteína codificada por cualquier AHA1. CCT2, CCT3, CCT4, CCT5, CCT6, CCT7, CCT8, CNS1, CPR3, CPR6, EPS1, ERO1, EUG1, FMO1, HCH1, HSP10, HSP12, HSP104, HSP26, HSP30, HSP42, HSP60, HSP78, HSP82, JEM1, MDJ1, MDJ2, MPD1, MPD2, PDl1, PFD1, ABC1, APJ1, ATP11, ATP12, BTT1, CDC37, CPR7, HSC82, KAR2, LHS1, MGE1, MRS11, NOBI, ECM10, SSA1, SSA2, SSA3, SSA4, SSC1, SSE2, SIL1, SLS1, UBI4, ORM1, ORM2, PER1, PTC2, PSE1 y HAC1 o HAC1 truncado sin intrón.
40. Método según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 39 donde la primera chaperona es una proteína disulfuro isomerasa.
41. Método según cualquiera de las reivindicaciones 38 a 40 donde la segunda chaperona es ORM2.
42. Método según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 41 donde al menos una de las primera o segunda chaperonas es codificada por un gen recombinante integrado cromosómicamente.
43. Método según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 42 donde al menos una de las primera o segunda chaperonas es codificada por un gen sobre un plásmido.
44. Método según la reivindicación 43 donde el plásmido es un plásmido tal como definido por cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33.
45. Célula huésped comprendiendo un primer gen recombinante codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de una proteína disulfuro isomerasa (PDI) y un segundo gen recombinante codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de una proteína a base de transferrina.
46. Uso de un gen recombinante codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de una proteína disulfuro isomerasa (PDI) para aumentar la expresión de una proteína a base de transferrina.
47. Célula huésped según la reivindicación 45 o uso según la reivindicación 46 donde la proteína a base de transferrina comprende la secuencia de transferrina o cualquier otro elemento de la familia de las transferrinas, una variante o fragmento de éstos o una proteína de fusión comprendiendo transferrina, una variante o fragmento de ésta.
48. Célula huésped o uso según la reivindicación 47 donde la proteína basada en transferrina comprende la secuencia de lactoferrina, o una variante o fragmento de ésta.
49. Célula huésped o uso según cualquiera de las reivindicaciones 45 a 48 donde el primer gen recombinante codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de una proteína disulfuro isomerasa (PDI) está provisto en un plásmido.
50. Célula huésped o uso según la reivindicación 49 donde el plásmido es un plásmido de familia de 2 \mum
51. Célula huésped o uso según cualquiera de las reivindicaciones 45 a 48 donde el primer gen recombinante codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de una proteína disulfuro isomerasa (PDI) es integrado cromosómicamente.
52. Célula huésped o uso según la reivindicación 51 donde el primer gen recombinante codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de una proteína disulfuro isomerasa (PDI) es integrado cromosómicamente en el locus de un gen PDI codificado endógenamente.
53. Célula huésped o uso según la reivindicación 52 donde el primer gen recombinante codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de una proteína disulfuro isomerasa (PDI) es integrado cromosómicamente en el locus de un gen PDI codificado endógenamente sin ruptura de la expresión del gen PDI endógeno.
54. Célula huésped o uso según cualquiera de las reivindicaciones 45 a 53 donde el segundo gen recombinante codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de una proteína a base de transferrina está provisto sobre un plásmido.
55. Célula huésped o uso según la reivindicación 54 donde el plásmido es un plásmido de familia de 2 \mum.
56. Célula huésped o uso según cualquiera de las reivindicaciones 45 a 52 donde el segundo gen recombinante codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de una proteína a base de transferrina es integrado cromosómicamente.
57. Célula huésped o uso según la reivindicación 55 donde el segundo gen recombinante codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de una proteína a base de transferrina es integrado cromosómicamente en el locus de un gen PDI codificado endógenamente.
58. Célula huésped o uso según la reivindicación 57 donde el segundo gen recombinante codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de una proteína a base de transferrina es integrado cromosómicamente en el locus de un gen PDI codificado endógenamente sin ruptura de la expresión del gen PDI endógeno.
59. Método para la producción de una proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum comprendiendo:
(a)
el suministro de una célula huésped comprendiendo un primer gen recombinante codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de ORM2, o una variante o fragmento de éstos que posee la misma actividad enzimática que ORM2, y un segundo gen recombinante codificante de una proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum; y
(b)
el cultivo de la célula huésped en un medio de cultivo en condiciones que permiten la expresión de los primer y segundo genes.
60. Método según la reivindicación 59 comprendiendo también la etapa de formulación de la proteína de plásmido no perteneciente a la familia 2 \mum purificada con un portador o diluyente y, presentando opcionalmente la proteína formulada en forma de dosis unitaria.
61. Método según la reivindicación 59 o 60 donde el primer gen recombinante codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de ORM2, o una variante o fragmento de ésta que posee la misma actividad enzimática que ORM2, es integrado en el cromosoma de la célula huésped.
62. Método según la reivindicación 59 o 60 donde el primer gen recombinante codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de ORM2, o una variante o fragmento de éstos que posee la misma actividad enzimática que ORM2, está situado sobre un plásmido.
63. Célula huésped comprendiendo un primer gen recombinante codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de ORM2, o una variante o fragmento de éstos que posee la misma actividad enzimática que ORM2, y un segundo gen recombinante codificante de una proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum.
64. Uso de un gen recombinante codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de ORM2, o una variante o fragmento de ésta que posee la misma actividad enzimática que ORM2, para aumentar la expresión de una proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum en una célula huésped.
65. Plásmido de familia de 2 \mum comprendiendo un primer gen recombinante codificante de una proteína comprendiendo la secuencia de ORM2, o una variante o fragmento de éstos que posee la misma actividad enzimática que ORM2; y un segundo gen recombinante codificante de una proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum.
66. Método, uso, célula huésped o plásmido según cualquiera de las reivindicaciones 59 a 65 donde la proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum es tal como definida en cualquiera de las reivindicaciones 17 a 27.
67. Método según la reivindicación 1 comprendiendo también la fase de liofilización de la proteína purificada de esta manera.
68. Método según la reivindicación 59 comprendiendo también la fase de purificación de la proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum expresada a partir de la célula huésped cultivada o del medio de cultivo.
69. Método según la reivindicación 68 comprendiendo también la etapa de liofilización de la proteína purificada de esta manera.
70. Método según la reivindicación 68 o 69 comprendiendo también la etapa de formulación de la proteína de plásmido no perteneciente a la familia de 2 \mum purificada o liofilizada con un portador o diluyente.
71. Método según la reivindicación 70 comprendiendo también la etapa de presentación de la proteína formulada en forma de dosis unitaria.
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