CN103641896B - 明胶样单元的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及明胶样单元的用途,提供了一类新型重组融合蛋白,其基本结构为{GLK}p-R-{GLK}q,其中R是有生物学功能的蛋白或多肽,GLK为重组明胶样蛋白(gelatin-like protein,GLK),具有(Gly-X-Y)n明胶结构特征的蛋白序列。与未融合有GLK片段的原始蛋白/多肽相比较,这类重组明胶样融合蛋白具有更高的亲水性,在体内具有更长的半衰期。本发明也包括编码该融合蛋白的核苷酸序列,含核苷酸序列的表达载体,转化有该类载体的宿主细胞以及制备本发明所涉及的融合蛋白的方法。此外,还包含含有该类融合蛋白的药用组合物以及用于治疗、预防或缓解疾病的方法。
Description
本发明是申请号为200980103870.9的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及蛋白质领域,更具体地,涉及一类新型的、具有生物活性和更长半衰期的重组融合蛋白及其制备和应用。
背景技术
由于肾脏和肝脏以及降解等多种因素的作用,大部分临床应用的生物活性多肽/蛋白在体内经常快速的被清除,一般半衰期只有几分钟到几个小时。在治疗过程中,需要很大的量以及频繁的注射来获得保持有效的药物浓度,不仅给病人带来痛苦,而且因为血药浓度波动带来疗效下降,毒副作用增加。
目前已经有多种方法报道可以延长这些生物活性多肽/蛋白在体内的半衰期。如利用水溶性高分子聚合物(例如:聚乙二醇,葡聚糖等)来修饰生物活性多肽/蛋白,并已经成功应用,如PEG-ADA,PEG-IFNα等。修饰后可以提高体内半衰期,增加稳定性和溶解度,降低免疫原性等。但是不幸的是这些修饰方法仍然存在很多问题。首先,化学修饰蛋白质/多肽后一般均会使这些生物大分子的活性显著下降甚至完全消失(Veronese FM,Biomaterials,22:405-417,2001)。其次,高分子化合物都是与蛋白质/多肽表面的氨基、巯基、咪唑基等基团反应,以共价键形式连接到蛋白质/多肽分子上。但是,由于蛋白质/多肽分子量巨大,结构复杂,因此其潜在的可与活性PEG反应的基团也是数目众多。在不同的位点结合PEG,其产物的稳定性,生物学活性等性质都是不同的。更甚者,大部分化学合成的高聚物,如PEG等不能被生物体降解。例如,已经发现当长期大剂量注射PEG-干扰素(PEG-IFNα2a)后会在肾脏中积累(Conover CD et al.,ArtificialOrgans.,21:369-378,1997;Bendele A et al.,Toxicol Sci.,42:152-157,1998)。从药物设计角度而言,没有这些积累的药物显然是更为安全的。另一方面,已经发现PEG修饰的蛋白能产生一种PEG抗体(被定义为多效半抗原),从而影响药物的半衰期(Caliceti P&Veronese FM,Adv Drug Deliv Rev.,55:1261-1277,2003)。
正是因为这些技术问题,虽然通过化学修饰的方法来改善蛋白质/多肽体内药代特性的技术已经面世很久,但是真正能在临床中应用的产品极少。
也有通过与一些特定的载体蛋白融合来增加生物活性多肽/蛋白的体外稳定性或体内半衰期的方法。如通过与白蛋白,抗体Fc片段,转铁蛋白(转铁蛋白突变体及其片段)融合来延长生物活性多肽/蛋白的半衰期,如美国专利5,876,969和5,766,88及7,176,278所述。之所以与这些蛋白质融合后能延长半衰期,主要是这些蛋白质都可以通过FcRn受体介导的循环作用,来提高其自身在体内的稳定性从而延长半衰期。理想的作为融合蛋白载体的蛋白质应该具备如下特征:1.自身在体内具有较长的半衰期;2.不具有免疫原性;3.不具有任何与延长半衰期无关的生物学效应;4.不影响治疗蛋白的生物学活性。但是,目前已经公开的技术方案都无法全部满足以上要求。其存在的首要问题是免疫原性的增加,如Fc片段结构本身并不保守,具有多种序列结构,很容易产生免疫原性。另外,这些载体蛋白本身通常具有一些生物学效应,如抗体片段Fc具有结合补体,与Fc受体结合后导致的变态反应,调理吞噬,抗体依赖的细胞杀伤作用等广泛的生理功能;HSA本身具有许多正常的体内生理功能,参与许多物质的运输和代谢。这些生物学特性的存在,对于作为融合蛋白载体来说都是不利的。而且,这些载体蛋白质本身具有复杂的空间结构,与活性蛋白融合后都会因为空间位阻效应而使活性蛋白生物学活性显著下降(Baggio LL et al.,Diabetes.,53:2492-2500,2004;Huang YS et al.,Eur J PharmBiopharm.,67:301–308,2007)。
综上所述,现有改善活性蛋白体内半衰期的方案存在如下弊端:1.产物不均一,工艺要求复杂;2.修饰物不被生物体降解,会在体内蓄积;3.增加了免疫原性;4.导致蛋白生物学活性显著下降甚至完全丧失;5.有可能引入了本身不需要的生物学活性功能。无论化学修饰,还是通过蛋白融合来改变活性蛋白体内外半衰期的方案,都无法完全避免上述弊端。
为了避免白蛋白,Fc片段这些天然载体蛋白存在的弊端,也进行了人工构建氨基酸序列作为载体蛋白的尝试,如构建富含Gly,Glu的氨基酸聚合物,将其作为融合载体来延长蛋白药物半衰期,David W.Leung等模仿化学合成的聚谷氨酸,人工合成聚谷氨酸序列用于作为融合载体来延长蛋白药物半衰期(US20080176288),或者人工合成多聚甘氨酸序列作为融合载体,(Schlapschy M et al.,Protein Eng Des Sel.,20:273-284,2007),也有完全人工设计,选取一些亲水性氨基酸,如Gly,Asp,Glu,Ser等人工构建氨基酸聚合物,将其作为融合载体来延长蛋白药物半衰期。但是这些完全重新设计的氨基酸聚合物作为融合载体实际效果很难预测,存在诸多问题。例如,1:人工设计的序列,虽然理论上含有很多亲水性氨基酸,但是鉴于蛋白质结构与功能之间关系的复杂性,现有技术上很难预测完全人工设计序列的空间结构(如二级结构,三级结构等),因此其潜在的生物学功能和免疫原性是未知的;2人工设计重复序列不同于天然进化所产生的蛋白序列,特别是那些重复序列极高的片段,很难进行重组表达,实际表达量往往极低而无法实际应用。发明人曾按照David W.Leung等(US20080176288)提供的方法通过重组表达聚谷氨酸用于作为融合载体来延长蛋白药物,但是实际上按其所提供的方法,根本无法表达获得其所声称的序列。
因此,本领域迫切需要开发一种有效简便地改善蛋白质/多肽的体内外稳定性,且无或几乎无其他副作用的技术方案。
发明内容
本发明的目的就是提供一种有效简便地改善蛋白质/多肽的体内半衰期的方法,与现有技术相比较,该方法具有更多的优势。
在本发明的第一方面,提供了一种可用于延长蛋白体内半衰期的重组的明胶样单元,所述的明胶样单元是结构如下的多肽:
(Gly-X-Y)n
式中,
Gly为甘氨酸残基;
X和Y分别为20种天然氨基酸除了Cys之外的任意氨基酸残基;
n为20-300;
并且,所述的明胶样单元具有以下特征:
(a)所述明胶样单元中以下亲水性氨基酸Asn,Asp,Gln,Glu,Lys,Pro,Ser,Hyp,Arg的氨基酸百分比含量总和为40%至2/3(66.7%);
(b)所述明胶样单元中,Pro和Hyp的数量之和与n的比值≥0.6;
(c)Gly的数量之和与n的比值≤1.15(更佳地≤1.05);
附加条件是,所述的明胶单元不是天然的明胶蛋白。
在另一优选例中,所述的明胶样单元还具有以下特征:
(d)等电点为3-7(较佳地为3.2-6,更佳地为3.2-5.5);
(e)根据Kolaskar-Tongaonkar法计算平均抗原指数不高于0.98;
(f)根据ProtParam公式计算,代表亲水性的GRAVY值小于-1.1(较佳地小于-1.4,更佳地小于-1.5)。
在另一优选例中,所述的明胶样单元的序列来源于或衍生自明胶。例如,在X,Y位上进行取代,将部分或全部天然明胶中的疏水性氨基酸Ile,Leu,Met,Phe,Val等突变为亲水性氨基酸,优选的是突变为Ala,Asn,Gln,Glu,Lys,Pro,Ser,Hyp,Arg中任意一种和/或几种,使得GRAVY值小于-1.4。
在另一优选例中,所述的明胶样单元的分子量为10-100kDa。
在本发明的第二方面,提供了一种多核苷酸,它编码第一方面中所述的明胶样单元。
在本发明的第三方面,提供了一种重组的融合蛋白,其特征在于,所述的融合蛋白由生物活性多肽和第一方面中所述的明胶样单元融合而形成。
在另一优选例中,与不含所述明胶单元的生物活性多肽相比,所述融合蛋白在体内的半衰期至少延长1倍;更佳地,半衰期延长至少2、3、4、5、6、或10倍。
在另一优选例中,所述融合蛋白的表观分子量(分子筛测定法)与理论分子量之比≥1.25,更佳地≥1.5,最佳地≥2。
在另一优选例中,生物活性多肽的分子量为0.5-70Kda,更佳地为1-66Kda。
在另一优选例中,所述的明胶单元位于所述融合蛋白中的氨基端、羧基端、两端、或中间。
在另一优选例中,所述的融合蛋白为单体或多聚体形式。
在另一优选例中,所述融合蛋白是如式I所示的单体或其多聚体形式,
{GLK}p-R-{GLK}q 式I
式中,
GLK表示如本发明第一方面中所述的明胶单元;
p和q独立地为0或1,且p和q不同时为0;
R为不含所述的明胶单元的、具有生物学功能的蛋白,且所述的R不是明胶蛋白;和
“-”表示肽键。
在另一优选例中,所述融合蛋白内所有(Gly-X-Y)n片段包含的n总和大于20,小于300。
在另一优选例中,所述融合蛋白的分子量为20-500Kda。
在另一优选例中,所述的融合蛋白为多聚体,且式I中的各R和GLK可相同或不同。
在本发明的第四方面,提供了一种多核苷酸,所述的多核苷酸编码第三方面中所述重组的融合蛋白。
在本发明的第五方面,提供了含有第四方面所述的多核苷酸的序列的表达载体。
在本发明的第六方面,提供了一种重组的宿主细胞,所述宿主细胞含有第五方面所述的表达载体、或者染色体中整合有第四方面所述的多核苷酸。
在本发明的第七方面,提供了一种制备所述的重组融合蛋白的方法,包括步骤:
(1)培养第六方面所述的宿主细胞,从而表达所述的重组融合蛋白;和
(2)分离出所述的重组融合蛋白。
附图说明
图1为重组明胶样融合蛋白几种典型基本结构。
图2为pPIC-GLK1164表达质粒的构建流程图。
图3为pPIC-GLK1164/G-CSF表达质粒的构建流程图。
图4为rGLK1164/G-CSF纯化过程中SDS-PAGE电泳(8%)分析,纯化最终产品为单一条带,表观分子量介于66KD-97KD之间。左起:泳道1.低分子量蛋白Marker,泳道2.发酵液上清,3.SP柱洗脱峰,4.Q柱洗脱峰。
图5为SEC-HPLC分析纯化的rGLK1164/G-CSF,采用TSK Gel G3000Swxl柱,缓冲液为50mM PB,0.25M NaCl,pH7.0,检测波长为214nm,流速为0.8ml/min。
图6为反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析纯化的rGLK1164/G-CSF,RP-HPLC采用VYDACprotein C4TP5415柱,流动相A为:含0.1%TFA的水溶液,流动相B采用含0.1%TFA的9:1乙腈:水溶液,检测波长为214nm,流速为0.8ml/min。
图7为rGLK1164/G-CSF免疫印迹分析结果,所用一抗为抗G-CSF鼠多抗。
图8显示了利用rhG-CSF依赖株NSF60测定rGLK1164/G-CSF融合蛋白的体外生物学活性。
图9SEC-HPLC分析rhG-CSF和rGLK1164/G-CSF体外稳定性研究结果。
图10rGLK1164和rGLK1164/G-CSF小鼠连续注射后血清抗体检测结果。A为G-CSF包被,B为rGLK1164包被。
图11不同剂量rGLK1164/G-CSF融合蛋白,rhG-CSF,rHSA/G-CSF和rGLK1164在正常成年SD大鼠体内的药效学研究结果。
图12不同剂量rGLK1164/G-CSF融合蛋白,rhG-CSF和rHSA/G-CSF在正常成年SD大鼠体内的药代动力学研究结果。
图13为pPIC-GLK1164/IFNα表达质粒的构建流程图。
图14为rGLK1164/IFNα纯化过程中SDS-PAGE电泳(8%)分析,纯化最终产品为单一条带,表观分子量约为85KD。左起:泳道1.低分子量蛋白Marker,泳道2.发酵液上清,3.Q柱洗脱峰。
图15rGLK1164/IFNα在猕猴体内药代动力学研究结果。
图16pPIC-Exendin-4/GLK1046和pPIC-Exendin-4/GLK1076表达质粒的构建流程图。Exendin-4为艾塞那肽。
图17为rExendin-4/GLK1046纯化过程中SDS-PAGE电泳(10%)分析,表观分子量介于66KD-97KD之间。左起:泳道1.低分子量蛋白Marker,泳道2.发酵液上清,3.SP柱洗脱峰,4.Q柱洗脱峰。
图18利用稳定转染有GLP-1R的BHK细胞测定rExendin-4/GLK1046和rExendin-4/GLK1076融合蛋白的体外生物学活性。
图19rExendin-4/GLK1046和rExendin-4/GLK1076在正常成年猕猴体内的药代动力学研究结果。
图20pCEP4-EPO/GLK1074表达质粒的构建流程图。
图21不同剂量rEPO/GLK1074融合蛋白和rhEPO在正常BALB/c小鼠体内药效的药效学研究结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,通过大量筛选,首次发现重组明胶样蛋白(gelatinlike protein,GLK)及其突变体非常适合作为融合蛋白的融合载体。本发明人将明胶样单元作为融合载体,使其与活性蛋白融合后,可以显著延长生物活性多肽/蛋白在机体内的体内半衰期。在此基础上完成了本发明。
具体而言,试验表明,将明胶样单元与具有生物活性的蛋白融合表达后获得的重组明胶样融合蛋白,可以显著改善生物活性蛋白的体外稳定性,更重要的是可以明显降低融合蛋白在体内被清除的速度,改变活性蛋白在体内的药代分布,从而延长活性蛋白在体内的半衰期。
在描述本发明所涉及的蛋白质,核苷酸序列和各种方法学之前,可以理解的是本发明不局限于这些特定的方法,操作规程,细胞株,载体和试剂,因为这些是可以有所变动的。另外,在这里所使用的术语只是为了描述特定的实例,不是故意限定本发明的范围。除非特别限定,否则这里所有的技术以及使用的科学术语与本领域一般技术人员所理解的相同。本发明描述的只是一些优选的方法,设备和材料,其他一些方法和材料相似或相当于本发明中的一些描述,也可用于实践或测试本发明。
明胶样单元
如本文所用,术语“明胶样单元”、“明胶样蛋白”、或“GLK(gelatin-like protein)”可互换使用。
天然明胶是来源于胶原的一类蛋白质,它是经胶原变性获得的产物,其基本结构有多个Gly-X-Y重复,结构通式为(Gly-X-Y)n,其中X和Y经常是脯氨酸和羟脯氨酸残基,而且,脯氨酸和羟脯氨酸残基的含量比例会影响其结构和熔点。X,Y位氨基酸组成的不同,会影响胶原的亲水性,等电点,二级结构,免疫原性等特性。
明胶可通过处理动物的骨头和毛皮而提取。然而,动物来源的明胶常常残存的具有侵染能力的病毒。此外,动物源性明胶施用于人还存在生物相容性的问题。
分子生物学技术发展使得利用基因重组技术获得基于人源明胶的生理特性稳定、均一性高的重组明胶成为可能。目前,已有较多关于人源的重组胶原或明胶在微生物、动物细胞或者植物中表达的报道(美国专利US.5,593,859;US.6,428,978;US.6,617,431;Werten MW et al.,Yeast,15:1087-1096,1999)。利用胶原基因不同的片段可以获得具有不同生化特性的重组明胶,而众多的研究结果表明,毕赤酵母表达系统可以用来生产不同来源的具有独特生化特性的重组明胶或类明胶(Olsen D et al.,Adv Drug DelivRev.,55:1547-1567,2003)。重组明胶同胶原水解获得的天然明胶一样具有稳定蛋白的作用,已被用来作为疫苗的稳定剂(US2006/0204511A1)。
在本发明中,明胶样单元指序列源自或衍生自天然明胶的且通过重组表达的多肽片段,也包含具有天然明胶(Gly-X-Y)n结构特征的经过突变的明胶样序列。
在本发明中,明胶样单元的长度或分子量没有特别限制。按长度计,每个明胶单元通常含60-1500个氨基酸残基,较佳地200-1000个氨基酸残基;按分子量计,每个明胶单元通常为6-150KDa,较佳地为20-80KDa。
重组明胶样融合蛋白
本发明涉及一类新型的重组明胶样融合蛋白,它由一个/数个来自于天然或人造的具有生物学功能的蛋白与明胶样单元组成,使其具有诊断/治疗/靶向作用。重组明胶样融合蛋白的基本结构是具有{GLK}p-R-{GLK}q结构的单体或其多聚体形式。其中GLK表示明胶样单元;p和q为0或1,且p和q不同时为0;R为不含所述的明胶单元的、具有生物学功能的蛋白,且所述的P不是明胶蛋白;重组明胶样融合蛋白如果成为多聚体形式,则成为{GLK1}p-R1-{GLK2}q-{GLK3}p-R2,{GLK1}p-R1-{GLK2}q-{GLK3}p-R2-{GLK4}q,{GLK1}p-R1-{GLK2}q-{GLK3}p-R2-{GLK4}q-{GLK5}p-R1-{GLK6}q等结构形式,其中R1-4可以是相同的或不同的,GLK1至GLK6可以是相同的或不同的,但是至少包含一段GLK结构和一段具有生物学活性功能的蛋白/多肽单元(如R1或R2)。图1显示了几种典型重组明胶样融合蛋白的结构。)
本发明是通过将一个或几个生物活性蛋白及其片段与一段或几段具有一定分子量的明胶样蛋白GLK(gelatin-like protein)融合表达来实现的。用于融合表达的GLK不具有免疫原性,在生理条件下具有极好的水溶性。根据本发明制备的重组明胶样融合蛋白,不仅体现出更好的体外稳定性和体内半衰期,而且与现有的蛋白质修饰或融合方案相比,其结构是均一的,而且出人意外地具有更高的生物学活性。并且,作为融合载体的GLK部分是生物相容的,具有无免疫原性,可被机体降解,不会在体内蓄积等优点。
在这里,“重组明胶样融合蛋白”指具有基本结构为{GLK}p-R-{GLK}q的融合蛋白,蛋白/多肽R与(Gly-X-Y)n之间是直接通过肽键连接的。进一步的,R与GLK之间还可以通过间隔物相连。术语“间隔物”指一个或多个分子,例如氨基酸,核酸或化学分子,例如聚乙二醇(PEG),即可以插入一个或多个组分结构域。间隔物可以用于提供需要组分之间的目标位点,以方便操作,也可以是为了利于保持活性蛋白的空间结构,或者活性蛋白与靶分子的相互作用。最适用于本发明的间隔物是短的连接肽,如一些富含Gly,Ser的短连接肽,如(GlyGlyGlyGlySer)n,n介于1-10之间;连接肽也可以采用其他目前已在广泛应用的连接肽,如Daming Shan所提及的肽段(Shan D et al.,JImmunol.,162:6589-6595,1999)。当然,GLK本身也可以作为一段连接肽使用。可以容易理解的是,蛋白/多肽部分还可以重复出现,从而充当一个间隔物的作用,形成如R1-R1-GLK,R1-R1-GLK-R2,GLK-R1–R1,R1-GLK-R2-R2,R1-R1-GLK-R2-R2等结构。图1提供的仅是一些重组明胶样融合蛋白的典型结构,但是根据本发明的精神,并不仅限于图1的结构。
重组明胶样融合蛋白中包含的GLK是具有(Gly-X-Y)n明胶结构特征的高度重复蛋白序列,其序列可以是完全或者部分来源于天然明胶,也可以是天然明胶部分序列片段的简单重复,也可以是经过优化的具有Gly-X-Y特征的人工序列。由于不同种属间明胶序列的同源性差异较小,GLK的序列来源可以是非人源性的明胶序列,也可以是来源于人源性的明胶序列,如David Olsen(Olsen D et al.,Adv Drug Deliv Rev.,55:1547-1567,2003)文中所提及的α1(I)胶原的序列片段;GLK序列可以完全是与天然序列一致的,也可以是选取其中一段天然序列,然后通过简单重复来达到本发明所需要的大小。可以选用的GLK序列来源是极其广泛的,不管是天然来源序列或者人工合成来源的具有(Gly-X-Y)n特征的明胶样序列,如US5801045,US6150081,US6428978,WO01/34646A2等所涉及的明胶片段。只要是没有免疫原性,在<40℃时水相中可溶的序列均可用于重组明胶样融合蛋白的制备。
进一步的,为了更好的达到本发明的效果,发明者还根据如下原则在天然明胶Gly-X-Y重复单元基础上重新设计了一类重组明胶样序列:
1.尽量选取天然明胶序列中出现频率高的Gly-X-Y重复单元,如Gly-Pro-Hyp,Gly-Pro-Ala,Gly-Ala-Hyp,Gly-Glu-Lys,Gly-Pro-Lys,Gly-Glu-Hyp,Gly-Ser-Hyp,Gly-Gln-Hyp,Gly-Glu-Arg和Gly-Pro-Arg等单元将其重新组合;
2.尽量选取富含亲水性氨基酸的Gly-X-Y重复单元将其重新组合,优选的X,Y是亲水性氨基酸,更优选的,是Ala,Asn,Gln,Glu,Lys,Pro,Ser,Hyp,Arg中任意一种和/或几种;
3.重新设计的GLK序列中尽量不含已知的具有免疫原性的序列。根据现有公开的技术文件已经表明有免疫原性的位点,如H.Hori等报导的Ile-Pro-Gly-Glu-Phe-Gly-Leu-Pro-Gly-Pro(Hori H et al.,J.Allergy Clin Immunol.,110:652-657,2002);
4.重新设计的GLK序列中尽量不含已知的蛋白酶作用位点的序列,如信号肽酶KEX-2位点等这类目前已知的蛋白酶作用位点。
5.重新设计的重组明胶样序列经Kolaskar-Tongaonkar法计算,平均抗原指数(Average antigenic propensity)不高于0.98
改构后的人工序列富含亲水性氨基酸,其典型序列包括但并不限于SEQ ID NO:2,19,21等。
重组明胶样融合蛋白{GLK}p-R-{GLK}q中,GLK的基本结构Gly-X-Y重复单元数目(n)的大小,也就是GLK的分子量范围是可变的。为了达到本发明的目的,首先重组明胶样融合蛋白必须具有合适的分子量大小,以保证不被肾脏过滤清除。重组明胶样融合蛋白分子量是由蛋白/多肽部分R和GLK共同决定的,对于一种特定的活性重组明胶样融合蛋白,活性蛋白质R的分子量是确定的,而且数目也是确定的话,重组明胶样融合蛋白分子量是由GLK的大小和数目决定的。当蛋白/多肽R部分分子量较小的时候(如<20KD),为了避免重组明胶样融合蛋白被肾小球滤过,GLK的分子量应该至少在15-70KD之间,更大的分子量并不一定有利于延长重组明胶样融合蛋白在机体内的半衰期,反而不利于重组表达,而且容易被蛋白酶降解,意外的免疫原性也难以控制,因此合适的GLK分子量介于6-150KD之间,更优的是介于20-80KD之间。当R部分本来就比较大,或者可以形成二聚或多聚体,则GLK分子量范围可以进一步放宽,可以是介于1kDa-150KDa之间,例如约1000-2000Da,约2-20kDa之间,约20-50kDa之间,约50-100kDa之间,约100-150kDa之间,约150-200kDa之间。
重组明胶样融合蛋白的分子量没有特别限定,通常为20-500KDa,较佳地为25-300KDa。
生物活性蛋白/多肽
“生物活性蛋白/多肽”指的是蛋白质,抗体,多肽及其片段和变异体,具有一种或者多种药理学和/或生物学活性,或靶向引导,多聚化等功能。它们可以是天然就存在的,也可以是人工构建的。“生物活性蛋白/多肽”包括酶,酶抑制剂,抗原,抗体,激素,凝血因子,干扰素,细胞因子,生长因子,分化因子,骨组织生长有关的因子,与骨质因子吸收相关的因子,趋化因子(chemotactic factors),细胞运动因子(cell motilityfactors),移动因子(migration factors),静止因子(cytostatic factors),杀(细)菌因子,抗真菌因子,血浆黏附分子,间质黏附分子和细胞外基质,受体配基及其片段等。
本发明所涉及的生物学活性蛋白/多肽,更特指表现出“治疗活性”的蛋白/多肽,或者“治疗上有活性”的蛋白/多肽,这种蛋白/多肽拥有一种或者更多已知的生物和/或治疗活性。这些活性与一种或更多种在这里描述的,或者其他已知的治疗蛋白相关。作为一个非限制性例子,“治疗蛋白”是指一种对于治疗,预防或者改善疾病,状况,或者机能絮乱有用的蛋白。作为一个非限制性例子,“治疗蛋白”可以是一种特异性的结合到特定细胞类型(正常(例如淋巴细胞)或者异常(例如癌细胞))并且用于将化合物(药物,或者细胞毒性剂)特异性定位于该细胞类型的蛋白。
在另外的非限制性例子中,“治疗蛋白”是指有生物活性的蛋白,特别是一种对于治疗,防止和改善疾病有用的生物活性蛋白。非限制性的治疗蛋白包括拥有以下生物活性的蛋白:如增加血管新生,抑制血管新生,调节造血功能,促进神经发育,提高免疫反应,抑制免疫反应等。
正如上述提及中的一样,“治疗活性”或者“活性”可以指在人类、非人哺乳动物或其他种属生物体中,得到与理想的治疗结果一致的效果的活性。治疗活性可以在体内或者体外测量。
本发明中与重组明胶样融合蛋白的治疗性蛋白部分相应的治疗性蛋白,包括,但并不限于:VEGF受体,TNF受体,HER-2/神经膜受体,人ErbB3受体分泌形态异构体,转化生长因子bⅢ型受体胞外区,转化生长因子bⅡ型受体胞外区,IL-1受体,IL-4受体,尿激酶,β-葡糖脑苷脂酶,精氨酸脱亚胺酶,Arginase,herstatin,表皮生长因子,FGF-1,纤维原细胞生长因子-2,普通纤维细胞生长因子,神经生长因子,血小板来源生长因子,VEGF-1,IL-1,IL-2,IL-3,IL-4,IL-6,IL-8,IL-10,IL-11,IL-12,IL-18,IL-21,IL-24,IL-1RA,RANKL,RANK,OPG,LEPTIN,干扰素α,干扰素β,干扰素γ,干扰素Ω,TGF-β,TGF-β-1,TGF-β-3,TNFα,心房钠尿多肽,B型钠尿肽,促性腺激素,人黄体生成素,促卵泡激素,人生长激素,EPO,G-CSF,GM-CSF,TPO,M-CSF,SCF,VEGF,EPO模拟肽,TPO模拟肽,FLT3配体,Apo2配体,骨细胞抑止因子,BMP-2,BMP-7,GLP-1及其类似物,Exendin-3,Exendin-4,胰岛素及其类似物,GIP,胰高血糖素,内皮抑制素(endostatin),plasminogen kringle1domain,plasminogen kringle5domain,angiostatin等。治疗性蛋白也还可以是抗体及其片段,单链抗体scFv等。这些蛋白以及编码这些蛋白的核酸序列都是大家熟知的,并且在如Chemical AbstractsServices Databases(例如CAS Registry),GenBank和GenSeq这样的公共数据库中可以找到。对于本专业人员来说,根据本发明的精神,容易理解的是现有已经发现的绝大部分生物活性蛋白都适用于本发明。当然,同样应理解的是,在此发明以后新发现的具有生物学活性的蛋白/多肽,也同样适用于本发明。
本发明中重组明胶样融合蛋白中的生物活性蛋白,可以是非糖基化的,也可以是糖基化的,例如部分细胞因子,细胞表面蛋白和分泌性蛋白,经常会被修饰,如结合一个或多个的寡糖基团。糖基化一般有两种主要类型:O-连接的寡糖糖基化,连接位点在丝氨酸或苏氨酸残基上;N-连接的寡糖糖基化,连接位点在Asn-X-Ser/Thr序列的天冬酰胺酸残基位点上,在此,X可以是除了脯氨酸以外的任何氨基酸。
糖基化异构体可以通过去除或者引入糖基化位点获得,比如替换或者去除氨基酸残基,象用谷氨酸代替天冬酰胺酸那样,或者在不产生这种糖基化蛋白的宿主细胞中表达非糖基化重组蛋白,例如在大肠杆菌或者糖基化缺陷的酵母中表达。
作用机制
多肽/蛋白质在体内迅速被清除的机制是多样的,包括肾小球过滤,受体介导内吞,蛋白酶作用,淋巴系统清除,肝脏清除等多种机制。活性蛋白与IgG的Fc片段或白蛋白融合后之所以可以保持较长的半衰期,是因为体内存在特殊的FcRn介导的循环作用保护。
将明胶序列与活性蛋白融合表达后延长活性蛋白半衰期的确切机制尚未清楚。到目前为止尚未发现有类似的受体起作用。GLK序列本身不会与FcRn结合。本发明人将人血清包被酶标板,加入GLK/G-CSF融合蛋白(同时以G-CSF作为阴性对照),保温孵育洗涤后用生物素标记的G-CSF(Abcam plc.)抗体结合,经HRP显色证明GLK融合蛋白并没有与血清中的任何组分有结合作用,因此排除了这种“GLK融合蛋白与血清中某些组分相互结合”的可能性。另外,可以肯定的是并不是纯粹因为融合后增加了分子量而导致半衰期的延长,现有的研究已经发现,纯粹的增大融合蛋白分子量并不一定能延长其体内半衰期,如Carlos A.(Buscaglia CA et al.,Blood.,93:2025-2032,1999)研究发现分子量大的TSac蛋白(76KD)体内半衰期(约几小时)远小于比它分子量小的GST-Ag36(60KD)(约30小时)。实施例7的数据也显示,同样的活性多肽,选用不同序列,但是分子量接近的明胶样单元作为融合载体,最终获得的融合蛋白却具有不同的半衰期。
应理解,本发明的保护范围并不受作用机理的限制。本发明人提供以下机理是为了便于更好地理解本发明。融合后重组明胶样融合蛋白能增加活性蛋白在体内外稳定性和半衰期的可能原因有:
(1)GLK的Gly-X-Y结构中Y位Pro(Hyp)的大量存在,使其在生理环境中保持了一种松散的结构,从而形成了一道屏障保护了活性蛋白不被体内蛋白酶降解。
(2)GLK结构中富含亲水性氨基酸,因此有很大的水合分子半径,也避免了其在肾脏过滤排出。理论分子量约为55KD的rGLK1164/G-CSF融合蛋白,用分子筛分析其表观分子量约为154KD(表观分子量:理论分子量=2.8)。
(3)融合蛋白中GLK特别的带电性质导致了重组明胶样融合蛋白在体内更长时间的驻留。本发明的GLK具有较低的等电点,在正常生理条件下带负电荷。很多血浆蛋白大多带负电荷且具有运输功能,带有负电荷的重组明胶样融合蛋白减少了与这些血浆蛋白相互结合的可能性,因此可以在血浆中存留更长的时间。
(4)血管壁上内皮细胞表面覆盖的多糖-蛋白质复合物(glycocalyx)的存在降低了重组明胶样融合蛋白的清除率。血管壁上的多糖-蛋白质控制着血管内与周围基质间的物质运输(Simionescu M,Simionescu N,Annu.Rev.Physiol.,48:279-293,1986)。多糖-蛋白质复合物在正常生理状态下带负电荷,而重组明胶样融合蛋白也带负电荷,由于同种电荷的排斥,也减少了重组明胶样融合蛋白与glycocalyx的相互作用,从而减少了重组明胶样融合蛋白从血管向组织中的渗透。
重组明胶样融合蛋白的制备
本发明的融合蛋白可用固相技术通过直接合成肽而加以生产,也可以分别化学合成本发明蛋白的各片段,然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。在优选方案中,本发明的融合蛋白用重组方法来制备。
重组方法来制备明胶融合蛋白涉及在原核宿主,真核宿主,植物或者动物中表达编码重组目标明胶融合蛋白核苷酸,以及获得重组明胶样融合蛋白的过程。任何可以表达重组蛋白的系统,包括原核,真核,转基因动植物系统,都可应用于本发明。例如,美国专利US6548653所提及的所有用于表达融合蛋白的方法,都适合于本专利。
更详细的说,通过重组方法来获得目标重组明胶样融合蛋白,首先需要获得编码所需重组明胶样融合蛋白的核苷酸,编码目标核苷酸序列可用多种不同的常规方法制备。此外,为了得到上述序列的衍生或变异序列,可以对核苷酸序列进行修饰或改动,例如通过基因工程技术。
更优选地,在本发明的过程中,核苷酸序列是包含有转录起始区(启动子序列)的表达框的一部分,在宿主细胞中,此转录起始区控制核苷酸序列的表达,并编码本发明中的多肽。此区域可来自在所用的宿主菌中高度表达的,组成型或调控型基因的启动区。例如对于酵母,可以是甲醇氧化酶(AOX),磷酸甘油酸酯激酶(PGK)以及类似基因的启动子。表达框也可以包括在所使用的宿主菌中有功能的转录终止区,紧密的连接在编码本发明中多肽的核苷酸序列下游。
在优选的方案中,编码本发明中多肽的核苷酸序列之前带有一段信号肽序列,用于引导新生的多肽在其宿主中进入分泌途径。
除了表达框,一个或几个可用于筛选重组宿主菌的标签(Tag)都可以加入,例如酵母S.cerevisiae的URA3基因,pichia酵母中G418抗性基因,或其他任何选择性标签。表达框和筛选标记形成的单位可被直接引入到宿主细胞中,或者预先插入到功能性自我复制的表达载体中。可选用的表达载体来源是极其广泛的,包括但并不限于:Kluyveromyces酵母常用的表达质粒pKD1;Saccharomyces属酵母优选的2μ质粒;pichia系统常用的pPIC9,pPIC9K,pPICZα表达质粒等。
在构建了上述重组表达质粒以后,可以根据常见的分子生物学文献,如《分子克隆实验指南》第三版(Sambrook J,Russell DW,Molecular cloning:A laboratory manual.3rd edition,New York:Cold Spring Harkbor Laboratory Press,2001)或商业公司提供的常规技术,将重组质粒引入到所选的宿主细胞中,并筛选成功整合有重组质粒的宿主菌细胞。可以实用任何可将外源DNA引入到细胞中的常规方法,如转化,电转化,接合等。任何可以表达重组蛋白的系统,包括原核,真核,转基因动植物系统,都可应用于本发明。
在转化细胞筛选后,表达上述融合蛋白的细菌或细胞会被接种培养。融合蛋白的收获会在连续培养过程的细胞生长阶段,也可以是在生长末期的培养阶段,视宿主细胞的表达特性而定。融合蛋白可以表达在宿主菌内部,如绝大部分原核表达系统,也可以分泌在培养基中,如酵母、动物细胞表达系统,一般都是胞外分泌的。通过相应的离心,破菌,超滤,沉淀,层析等多种方法的组合,可以获得高度纯化的重组明胶样蛋白或重组明胶样样-活性蛋白融合蛋白。纯化后的融合蛋白可用于结构鉴定,体内外生物学活性测定,或者药物代谢动力学等用途。
由于表达载体和宿主菌的差异,通过有些真核系统表达的重组明胶样蛋白结构中的Pro可能会被部分或者全部转化为Hyp,但是这个变化并不影响本发明的实施效果。虽然酵母中一般不存在脯氨酰-4-羟化酶(P4H),但通过某些特殊的手段,在酵母系统中也可以实现Pro部分或者全部转化为Hyp,例如,Vuorela(Vuorela et al.,EMBO J.,16:6702-6712,1997)及Vaughan(Vaughan et al.,DNA cell Biol.,17:511-518,1998)的研究结果表明,在酿酒酵母或毕赤酵母中共同表达明胶和脯氨酰-4-羟化酶(P4H)基因可以获得羟基化的明胶。
重组明胶样融合蛋白的性质
(a)理化性质
本发明的融合蛋白中的所述明胶样单元(Gly-X-Y)n具有以下部分或全部理化特性:
(1)亲水性氨基酸Asn,Asp,Gln,Glu,Lys,Pro,Ser,Hyp,Arg的氨基酸百分比含量较高,总和为40%至2/3(66.7%);
(2)Pro和Hyp的数量之和与n的比值≥0.6;
(3)Gly的数量之和与n的比值≤1.15(更佳地≤1.05);
(4)等电点为3-7(较佳地为3.2-6,更佳地为3.2-5.5);
(5)根据Kolaskar-Tongaonkar法计算平均抗原指数不高于0.98;
(6)根据ProtParam公式计算,代表亲水性的GRAVY值小于-1.1(较佳地小于-1.4,更佳地小于-1.5)。
表1.实施例1-12中涉及的部分明胶单元的特性
a.GRAVY值:多肽或蛋白中所有氨基酸亲水值的平均值(亲水值总和除以氨基酸数目的总和)(Kyte J,Doolittle RF,J Mol Biol.,157:105-132,1982)。
b.SGly/n为GLK序列中Gly的总数和与n的比值
c.S(Pro+Hyp)/n:为GLK序列中Pro和Hyp的总数与n的比值。
d.根据每个氨基酸出现在部分已知的表位上的机率来计算。最少预测的残基数目为8个。
根据报道,预测的准确性大约为75%(Kolaskar AS,Tongaonkar PC报道方法计算(FEBSLett.,276:172-174,1990)。
(b)生物活性
以往通过融合表达来延长活性蛋白体外稳定性的方案,往往是以牺牲活性蛋白的生物学活性作为代价的。这是因为作为融合载体的蛋白质如白蛋白,Fc片段,往往分子量大,具有很大的空间位阻,因此融合后阻碍了生物活性蛋白与其效应配体的结合。如HuangYS等(Huang YS et al.,Eur J Pharm Biopharm.,67:301–308,2007)制备的HSA/IFNα融合蛋白,仅保留了IFNα原有活性的1.7%(按摩尔比计算)。但是,本发明的重组明胶样融合蛋白,却出人意料的保留了很高的生物学活性。如实施例3所描述的,融合表达的rGLK1164/G-CSF融合蛋白体外活性约是未融合的G-CSF的146%。另外,本发明rGLK1164/IFNα融化蛋白的体外活性是现有“白蛋白-IFNα”融合蛋白体外活性的7倍以上。
更好的体外活性意味着临床更小的剂量,从而带来成本,疗效方面的改善。重组明胶样融合蛋白能够保留更多的体外活性的机理尚未研究,可能与GLK序列在生理状态下保持了松散的结构,而不形成高级结构,因此其空间位阻较小有关。
(c)体外稳定性
本发明的重组明胶样融合蛋白,除了改善体内的半衰期,还意外发现融合后提高生物活性蛋白的体外稳定性。如实施例3所描述的,未融合的rhG-CSF与rGLK1164/G-CSF融合蛋白溶液都在40℃震荡48小时后,分子筛分析发现rhG-CSF样品中出现大量聚体,而且总蛋白含量也显著下降,但是rGLK1164/G-CSF融合蛋白在这些指标改变很少,表明与GLK融合后显著提高了生物活性蛋白的体外稳定性。
重组明胶样融合蛋白提高生物活性蛋白的体外稳定性的作用机制可能是:明胶序列可以与部分去折叠的蛋白质暴露部分相互作用,避免了去折叠生物活性蛋白质的聚集。融合后提高体外稳定性,减少制备和贮存期间蛋白聚体的形成,从而减少治疗用蛋白药物的免疫原性,是极其具有临床意义的。
由于与明胶融合后活性蛋白体外稳定性显著提高,避免了制剂中添加HSA等稳定剂,因此也减少了因加入HSA而导致的风险,例如产生抗体或者中和抗体。
(d)免疫原性
对于用于提高半衰期的融合蛋白的载体蛋白,必须是没有免疫原性的,否则,产生针对载体蛋白的抗体会形成抗体-融合蛋白免疫复合物,加速融合蛋白在体内的清除,并带来其他不良反应。明胶已经广泛用于制剂辅料,已经证明是不具有免疫原性的,实施例4也证明了无论是重组明胶样本身,还是明胶融合蛋白,都不会诱导机体产生抗体。更为优越的是由于明胶序列本身没有种属差异问题,跟以往的融合表达方案相比较,可以更方便的在各种动物模型中评价期疗效和安全性。
(f)体内生物学活性和半衰期
根据本发明制备的重组明胶样融合蛋白,显著改善体内的半衰期。实施例5比较了rhG-CSF,rHSA/G-CSF和rGLK1164/G-CSF三种蛋白在SD大鼠体内的药代和药效情况。单次皮下给予不同剂量的rGLK1164/G-CSF,有显著促进白细胞增加的效果,而且其体内半衰期远超过rhG-CSF,与rHSA/G-CSF基本相同。实施例10也表明与胶原融合后Exendin-4在猕猴体内半衰期得到显著增加。
重组明胶样融合蛋白的用途
由于融合蛋白中明胶部分本身不具有生物学或药理学活性,根据本发明所制备的重组明胶样融合蛋白的用途是由融合蛋白中的非胶原部分决定的,也就是说重组明胶样融合蛋白{GLK}p-R-{GLK}q的生物学功能是由R部分决定的,GLK部分的加入仅仅是改变了其体外稳定性和体内的清除速度。生物活性蛋白/多肽R的性质决定了重组明胶样融合蛋白的用途,用法和剂量。如生血因子EPO,G-CSF,IL-11,M-CSF分别用于红细胞,中性粒细胞,血小板和干细胞的增殖,与GLK融合后所制备的EPO/GLK,GLK/G-CSF,GLK/GM-CSF,GLK/M-CSF同样具有这些功效。这些对于本领域技术人员而言是显而易见的。
药用组合物
本发明的重组明胶样融合蛋白虽然本身具有很好的稳定性,但是为了便于保存,运输和临床应用,本发明也公开了包含上述重组明胶样融合蛋白和药学上可接受的载体的药用组合物。当然,药物组合物中还可包含常规的添加剂,例如稀释剂,保护剂,防腐剂获得的药用组合物用于治疗,预防,缓解或者诊断机体,特别是人体的疾病或不适症状。为了提高药用效果,本发明的融合蛋白也可以与其他药物共同使用,以达到更好的治疗效果。
本发明的主要优点包括:
1.不同于高分子聚合物(如PEG)修饰的方法,通过重组表达制备的明胶融合蛋白,结构均一,制备方法简单,而且可以被机体降解而不会在体内积蓄;
2.不同于载体蛋白(如Fc或白蛋白)融合方案,本发明的明胶样单元的亲水性增加、等电点降低、没有或基本没有免疫原性,且没有额外的生物学活性;
3.GLK不具有复杂结构,而具有类似于线性高分子聚合物(如PEG等)一样的线性结构,与其融合后空间位阻很小,因此与以前的融合方案相比较,重组明胶样融合蛋白更有利于保留活性蛋白的生物学活性。
本发明方案具有高分子化合物修饰和蛋白质融合技术两者的优点,但又避免了两者的缺点,是一种更优的改变重组蛋白药物体内半衰期的方法。
下面结合具体实施例,进一步阐明本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述,本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术,这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述:例如,《分子克隆实验指南》第三版(Sambrook J,Russell DW,Molecular cloning:A laboratory manual.3rd edition,New York:Cold Spring HarkborLaboratory Press,2001);《蛋白质纯化:原理和实践》第3版(Scopes RK,ProteinPurification:Principles and Practice,3rd edition,New York:Springer-Verlag,1994),或者,可按照试剂生产商所提供的说明书进行。关于Pichia pastor的操作,如果没有特别指出,均按照Invitrogen公司Pichia Expression Kit和Pichia FermentationProcess Guidelines操作说明进行。另外,以下所有序列中,如没有特别说明,下划线部分皆为酶切识别位点,斜体部分为信号肽序列。
实施例1:rGLK1164蛋白的表达,纯化
1.GLK1164基因的克隆
本发明中GLK1164基因由4个相同的单体(序列参见SEQ ID NO:1)串联所组成,单体命名为GLK1161,编码116个氨基酸(序列参见SEQ ID NO:2),由上海英骏生物技术有限公司(Invitrogen)合成。合成时在5'端加入了酵母GS115的α-factor信号肽序列(SEQ ID NO:1中第1-24位,带Xho I位点),紧接着为内切酶DraIII的识别位点,3'端则带有Van91I及EcoRI识别位点,并连接在克隆载体pMD18-T(TaKaRa公司)上,构建成质粒pGLK1161-T。
为了获得GLK1162二聚体,首先将质粒pGLK1161-T用Van91I/Dra III双酶切。1%琼脂糖胶进行电泳,切胶回收约330bp大小目的片段(即GLK1161),用柱离心式小量胶回收试剂盒纯化(上海华舜生物工程有限公司),-20℃保存待用。同时,pGLK1161-T质粒用Van91I单酶切。酶切的质粒如上割胶回收,溶于30μl的TE溶液。然后用碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase,BAP,TaKaRa公司)处理。
磷酸化处理后的pGLK1161-T与Van91I/DraIII双酶切回收的GLK1161片段用T4DNA连接酶按1:10摩尔比进行连接。连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。
在转化平板上挑取单克隆至氨苄抗性的LB液体培养基培养,按常规方法提取质粒,用XhoI/EcoRI双酶切鉴定。酶切阳性克隆测序鉴定。
同上,将GLK1162连接于pGLK1162-T上,即可构建成含4个GLK1161单体的目的基因GLK1164(序列参见SEQ ID NO:3)。
2.表达质粒pPIC-GLK1164的构建
参见图2。采用pPIC9(Invitrogen)为表达质粒,用XhoI/EcoRI双酶切后,1%琼脂糖胶电泳,回收片段。pGLK1164-T用XhoI/EcoRI双酶切,回收约1200bp的GLK1164目的片段。GLK1164与pPIC9的酶切片段用T4DNA连接酶连接。连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞并鉴定。
3.rGLK1164蛋白表达工程酵母的构建
以甲醇酵母Pichia pastor GS115(His-)为表达宿主菌,通过电转化将线性化的pPIC-GLK1164质粒转化到GS115中。30℃培养3天,至单菌落出现。
4.rGLK1164蛋白的表达筛选
将上述转化的重组酵母单菌落接种至10ml BMGY液体培养基中,30℃,250rpm培养24小时后,静置过夜,弃上清,加入10ml含1%甲醇的BMMY液体培养基,30℃,250rpm诱导表达。选取相对表达较高菌株作为表达株。
5.rGLK1164蛋白的发酵和纯化
将步骤4中获得的表达株接种于液体YPD培养基中,于30℃,250rpm振荡培养过夜至OD600约为20左右,作为上罐种子液。将培养好的种子液接入B.BRAUN BIOSTAT C-10发酵罐,培养基按Invitrogen公司Pichia Fermentation Process Guidelines配置。接种量为10%,设定发酵温度30℃,pH5.0,待甘油耗尽,开始流加甲醇进行诱导表达。表达阶段控制发酵温度25℃,诱导72小时放罐。
高速离心去除菌体,取1升发酵上清液,4℃下加入冰预冷的丙酮至终浓度为40%,搅拌30分钟,离心,弃沉淀。上清液中再加入冰预冷的丙酮至终浓度为80%,搅拌30分钟,离心收集沉淀。获得的重组明胶样融合蛋白沉淀重悬至100毫升纯水里,对20mM PB,pH7.0,4℃透析过夜。
透析完成的明胶融合蛋白溶液,上样于预先用缓冲液A(20mM PB,pH7.0)平衡好的QSepharose FF柱(GE Healthcare,XK26/20,柱体积50ml),上样完成后以2倍柱体积的缓冲液A洗脱未结合的蛋白,然后以线性梯度,10个柱体积,0-100%缓冲液B(20mM PB,0.5MNaCl,pH7.0)洗脱。
洗脱的rGLK1164经超滤浓缩(Millipore,MWCO10KD)至蛋白浓度约10mg/ml,然后用Sephadex G25柱(GE Healthcare,XK26/20;柱体积50ml)脱盐,缓冲液为10mM PB,pH7.0,冷冻干燥。
蛋白浓度测定采用Bradford法,经检测,每升酵母发酵液可制备rGLK1164约40mg,纯化收率为20%左右,经RP-HPLC分析纯度为98%。
实施例2:rGLK1164/G-CSF融合蛋白的表达,纯化和鉴定
1.hG-CSF基因的合成
hG-CSF基因(序列参见SEQ ID NO:4)由上海泽衡生物技术有限公司合成,并克隆到pMD18-T载体上,构建成质粒pG-CSF-T。G-CSF的5'端为DraIII识别位点,3'端则为EcoRI识别位点。
2.表达质粒pPIC-GLK1164/G-CSF的构建
基本同实施例1,表达质粒的构建流程参见图3,GLK1164/G-CSF DNA编码序列及成熟的GLK1164/G-CSF融合蛋白氨基酸序列分别参见SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。
3.rGLK1164/G-CSF融合蛋白表达工程酵母的构建
pPIC-GLK1164/G-CSF转化甲醇酵母Pichia pastor GS115(His-),质粒线性化处理,GS115感受态细胞的制备以及电转化方法同实施例1。
4.rGLK1164/G-CSF融合蛋白的表达
将转化的重组酵母单菌落接种至10ml BMGY液体培养基中,诱导表达过程同实施例1。
5.rGLK1164/G-CSF融合蛋白的纯化
参照实施例1进行发酵,发酵液离心去除菌体,离心后取1升上清液用0.45μm的过滤器过滤除菌。除菌后的上清液调节pH至3.0,用注射用水稀释至电导﹤5ms/cm。上样于预先用缓冲液A(20mM NaAc,pH3.0)平衡好的SP Sepharose FF柱(GE Healthcare,XK26/20,柱体积50ml),上样完成后以2倍柱体积的缓冲液A洗脱未结合的蛋白,然后用缓冲液B(20mM NaAc,0.3M NaCl,pH3.0)洗脱,收集洗脱峰。
洗脱的rGLK1164/G-CSF经Sephadex G25柱(GE Healthcare,XK50/30;柱体积600ml)脱盐,缓冲液为20mM Tris,pH8.5,脱盐后的GLK1164/G-CSF溶液上样于预先用缓冲液C(20mM Tris,pH8.5)平衡好的Q Sepharose FF柱(GE Healthcare,XK16/20,柱体积20ml),上样完成后以2倍柱体积的缓冲液C洗脱未结合的蛋白,然后以线性梯度,10个柱体积,0-100%缓冲液D(20mM Tris,0.5M NaCl,pH8.5)洗脱GLK1164/G-CSF。
洗脱的GLK1164/G-CSF超滤浓缩(Millipore,MWCO10KD)至蛋白浓度10mg/ml,然后用Sephadex G25柱(GE Healthcare,XK26/20;柱体积50ml)脱盐,缓冲液为10mM PB,pH7.0,冷冻干燥。
蛋白浓度测定采用Bradford法,每升发酵上清可制备GLK1164/G-CSF30mg,纯化收率约为28%。分析结果见表4。
实施例3:rGLK1164/G-CSF的分析鉴定
1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
用8%SDS-PAGE电泳分析获得的rGLK1164/G-CSF的纯度,可见其表观分子量介于66KD-97KD之间,为单一条带(参见图4)。
2.分子筛层析—高效液相色谱(SEC-HPLC)
SEC-HPLC采用TSK Gel G3000Swxl柱,缓冲液为50mM PB,0.25M NaCl,pH7.0。结果参见图5,表观分子量约为154KD(表观分子量:理论分子量=2.8)。
3.反相层析—高效液相色谱(RP-HPLC)
RP-HPLC采用VYDAC protein C4TP5415柱,流动相A为:含0.1%TFA的水溶液,流动相B采用含0.1%TFA的9:1乙腈:水溶液,结果参见图6。
4.Western blot分析
以G-CSF做对照,所用一抗为抗G-CSF鼠多抗(ANTIGENIX),对所获得的GLK1164/G-CSF的免疫印迹分析。
实验结果表明(图7),在90KD附近呈现阳性条带。
5.体外活性测定
rGLK1164/G-CSF的体外活性测定选用G-CSF依赖细胞株NFS60,以MTT法测定生物学活性(中华人民共和国药典,2005版,三部)。
其中一个典型的活性检测结果参见图8。
rGLK1164/G-CSF活性约为3.3×107IU/mg,按摩尔比计算,约相当于G-CSF的生物学活性146%左右。
6.体外稳定性
rhG-CSF标准品和rGLK1164/G-CSF溶于20mM PB,pH6.0的溶液中至蛋白浓度1mg/ml。无菌过滤,分装至无菌西林瓶中,40℃震荡48小时后,用SEC-HPLC法分析聚体和含量。结果表明(参见表2和图9),rhG-CSF样品中出现大量聚体,并且总蛋白含量也显著下降,但是rGLK1164/G-CSF融合蛋白在这些指标改变很少。这表明与GLK融合后显著提高了生物活性蛋白的体外稳定性。
表2SEC-HPLC分析不同结构G-CSF加速试验结果
实施例4.rGLK1164和rGLK1164/G-CSF融合蛋白在小鼠体内免疫原性研究
动物免疫:采用Balc/C小鼠4组,每组3只,体重在25g左右。背部一点皮下注射4次,每周1次。给药量为rGLK1164/G-CSF融合蛋白和rGLK1164均为2.5nmol,空白对照组注射同体积的生理盐水。免疫第4周和第8次免疫完成后一周取血,分离获得血清后-70℃保存待测。
给药4次后抗体血清滴度分析
rGLK1164或G-CSF蛋白用0.2M的碳酸盐缓冲液(pH9.6)配制成1μg/ml,ELISA板中每孔加入100μl,4℃包被过夜,PBST洗涤3次每次5分钟,然后用5%的脱脂奶粉震荡封闭1小时后,用PBST洗涤3次每次5分钟。取各组血清按照1:50、1:200、1:800在37℃孵育1小时,然后加上HRP标记的羊抗鼠二抗孵育1小时,甩干后PBST洗涤,TMB-HCL显色,在450nm波长下酶标仪检测。同时,以200ng/ml的兔抗人G-CSF抗体作为阳性对照。
结果如图10所示。G-CSF包被组,只有rGLK1164/G-CSF融合蛋白给药组和阳性对照组有较高吸收值,rGLK1164包被组,所有血清样本吸收值都很低,表明给药4周后所生成抗体都是抗G-CSF的,没有抗rGLK1164抗体产生。这提示,本发明的明胶样单元的没有免疫原性。
实施例5:rGLK4/G-CSF融合蛋白的药效学和药代动力学研究
将rhG-CSF对照品(Filgrastim,Amgen,USA),rHSA/G-CSF(根据美国专利5,876,969制备),rGLK1164/G-CSF和rGLK1164四种蛋白在SD大鼠体内的药代和药效情况进行比较。
SPF级成年SD大鼠(约300-350克)来自中科院上海动物试验中心,参照表3进行分组,注射,尾静脉采集血样,进行白细胞计数;3000rpm离心5分钟后分离血清,-20℃保存待测。
药代动力学的测定:采用双抗体夹心ELISA法检测样品中rhG-CSF,rGLK1164/G-CSF和rHSA/G-CSF的血药浓度,具体操作参见Human G-CSF DuoSet试剂盒Human G-CSF ELISAConstruction Kit(ANTIGENIX)的操作手册。用MicroCal Origin软件中的四参数逻辑曲线绘制标准曲线,并求回归方程及相关统计参数;用Microsoft Excel2003软件将样品数据代入标准曲线的回归方程计算相关数值;最后用3P87软件进行曲线拟合并计算主要药代动力学参数。
表3不同结构G-CSF药代及药效分组及给药表
药效学的结果参见图11,相比于单次注射Filgrastim,rGLK1164/G-CSF组和rHSA/G-CSF在给药后48小时后白细胞明显升高,而且其升高的幅度和持续时间远大于rhG-CSF组。不同rGLK1164/G-CSF剂量组间,随着剂量的增加,白细胞升高幅度明显增加,白细胞升高持续时间也更长;相同剂量组之间rGLK1164/G-CSF和rHSA/G-CSF对于升高白细胞的效果和持续的时间没有明显的区别。
药代学结果参见图12,从血药浓度-时间曲线图看,rhG-CSF皮下注射后迅速被代谢,24小时候后就无法被检出,而rGLK1164/G-CSF组和rHSA/G-CSF在72小时仍能被检出。皮下给药rGLK1164/G-CSF在大鼠体内末端半衰期在10小时左右,略长于rHSA/G-CSF。
实施例6:不同结构的GLK/G-CSF蛋白性质比较
用相似的方法,构建了不同结构的GLK/G-CSF蛋白,并比较了其活性,半衰期(SD大鼠)等相关数据。
表4不同结构的GLK/G-CSF蛋白性质特性
其中,GLK420是选自源自于人的COL5A1型胶原序列中1150-1569位序列,完整序列参见SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,编码GLK420/G-CSF的DNA以及氨基酸序列分别参见SEQID NO:9,SEQ ID NO:10。
实施例7:rGLK1164/IFNα融合蛋白表达和纯化
1.Interferonα2b(IFNα)基因的合成
IFNα基因由上海泽衡生物有限公司合成(序列参见SEQ ID NO:11),并克隆到pMD18-T载体上,构建成质粒pIFNα-T,IFNα的5'端为DraIII识别位点,3'端则为EcoRI识别位点。
2.表达质粒pPIC-GLK1164/IFNα的构建
构建流程图参见图13,完整的GLK1164/IFNαDNA序列和成熟的rGLK1164/IFNα融合蛋白氨基酸序列分别参见SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13。
3.rGLK1164/IFNα融合蛋白表达工程酵母的构建和筛选
用与实施例1类似的方法。
4.rGLK1164/IFNα融合蛋白在甲醇酵母GS115中的表达和纯化
发酵与纯化方法与实施例1相似,纯化产物采用8%SDS-PAGE电泳分析,结果参见图14。
5.体外活性测定
rGLK1164/IFNα融合蛋白的体外生物学活性测定采用常规的细胞病变抑制法(WISH细胞)(中华人民共和国药典,2005版,三部)。
细胞病变抑制法测得的rGLK1164/IFNα融合蛋白体外活性约为2.2×107IU/mgIFNα,按摩尔比折算,约为未融合时的11%,是对照“白蛋白-IFNα”融合蛋白体外活性(仅为1.4%)的7倍以上。
6.药效学研究
研究在猕猴体内进行,15只猕猴,雌雄各半(3-4年龄,4.2-4.8公斤),购于中国军事医学研究院动物中心。3只一组,分成5组,皮下注射。样品用PBS稀释,rGLK1164/IFNα融合蛋白3组,剂量分别为0.36,1.0和3.6pmol/kg,IFNα组,剂量为0.36pmol/kg,空白对照组rGLK1164蛋白,剂量为0.36pmol/kg。分别在0,1,2,4,8,10,14小时取血清,用2',5'-OAS放射免疫试剂盒(Eiken Chemical Co.,Tokyo,Japan)测定血清中2',5'-OAS活性。
如图15所示,实验猕猴体内2',5'-OAS浓度呈明显剂量依赖性。2',5'-OAS体内活性2天后达到峰值。rGLK1164/IFNα融合蛋白组在体内14天后还能检测到,而IFNα组6天后接近于空白值,相同剂量的rGLK1164/IFNα2',5'-OAS活性明显高于IFNα。这表明融合蛋白的半衰期显著延长。
采用不同性质的GLK序列,用相似的方法构建获得了不同性质的GLK/IFNα融合蛋白,并比较了其结构特点,半衰期(SD大鼠)等相关数据,如表5所示。
表5.不同GLK结构融合IFNα后获得产物性质比较
上表中四条GLK序列长度相似,但是融合后最终半衰期不一样:
GLK1162P-与GLK1162相比,将原序列所有的Pro和Hyp都替代为Ser后,虽然亲水性变化不大,但是半衰期明显下降;
GLK302序列不含有Pro和Hyp,基本序列为GGSGGS重复,与GLK1162P-相比,含有更多的Gly(Gly总数与n的比值2.02),两者分子量和等电点相近,但是GLK302疏水性更强(GRAVY值增大),其体内半衰期也比GLK1162P-短。这提示,Gly总数与n的比值宜≤1.5,较佳地≤1.15,更佳地≤1.05。
GLK1162N-与GLK1162相比,将原序列所有的Asn都替代为Glu后,虽然亲水性变化不大,但是等电点明显下降,其体内半衰期明显延长。
GLK1162/IFNα,GLK1162P-/IFNα,GLK302/IFNα,GLK1162N-/IFNα的构建方法同实施例1和实施例2中相似,成熟肽氨基酸序列分别参见SEQ ID NO:14-17。
实施例8:rExendin-4/rGLK的表达和纯化
GLK1046基因由6个相同的单体GLK1041(单体序列参见SEQ ID NO:18)串联所组成,单体命名为GLK1041,编码104个氨基酸(序列参见SEQ ID NO:19);GLK1076基因由6个相同的单体GLK1071(单体序列参见SEQ ID NO:20)串联所组成,单体命名为GLK1071,编码107个氨基酸(序列参见SEQ ID NO:21)DNA均由上海英骏生物技术有限公司(Invitrogen)合成。构建方法与实施例1相似:把GLK1042和GLK1072分别连接于pGLK1044-T、pGLK1074-T上,即可构建成含6个GLK1041和GLK1071单体的质粒pGLK1046-T,pGLK1074-T。
1.Exendin-4基因的克隆
Exendin-4基因由上海泽衡生物技术有限公司合成,其DNA序列见SEQ ID NO:22:
合成后克隆到pMD18-T载体上,构建成质粒pExendin-4-T。Exendin-4的5'端带有α-factor信号肽序列(含Xho I位点),3'端为Dra III识别位点。
2.表达质粒pPIC-Exendin-4/GLK1046和pPIC-Exendin-4/GLK1076的构建参见图16
SEQ ID NO:23-26分别是Exendin-4/GLK1046和Exendin-4/GLK1076DNA序列和成熟融合蛋白的氨基酸序列。
3.rExendin-4/GLK1046、rExendin-4/GLK1076融合蛋白表达工程酵母的构建和筛选
同实施例1。
4.rExendin-4/GLK1046、rExendin-4/GLK1076融合蛋白的发酵和纯化
发酵方法与纯化方法与实施例1相似洗脱,纯化获得的rExendin-4/GLK1046和rExendin-4/GLK1076分别经超滤浓缩(Millipore,MWCO10KD)至蛋白浓度10mg/ml,然后用Sephadex G25柱(GE Healthcare,XK26/20;柱体积50ml)脱盐,缓冲液为10mM PB,pH7.0,冷冻干燥。电泳分析结果参见图17。
实施例9:rExendin-4/GLK1046和rExendin-4/GLK1076融合蛋白的生物学活性
稳定转染有GLP-1R的BHK细胞(baby hamster kidney cell)能接受GLP-1及其激动剂的信号刺激,使胞内cAMP含量升高,因此测定cAMP的释放量可以间接反应rExendin-4融合蛋白的生物学活性。BHK-GLP-1R细胞的培养方法参照Li Y等之前所述的方法(Li Y etal.,J Biol Chem.,278:471-478,2003)。
结果表明:rExendin-4/GLK在BHK-GLP-1R中能够按剂量依赖性刺激胞内cAMP的产生;与Exendin-4标准品具有相似的体外受体结合活性,(图18;Exendin-4EC50=0.017nM,rExendin-4/GLK1046EC50=0.095nM,rExendin-4/GLK1076,EC50=0.113nM)。
实施例10:rExendin-4/GLK1046和rExendin-4/GLK1076的药代动力学
融合蛋白的药代动力学研究在猕猴体内进行,6只猕猴,雌雄各3只(3-4年龄,4.2-4.8公斤),购于中国军事医学研究院动物中心。动物采用实验动物常规饲养(浙江大学实验动物中心)。3只一组,采用皮下注射,样品用PBS稀释,4mg/kg。分别在0.5,1,4,8,12,24,48,72,96,120,144,192,240,288,和336小时采集血样,血样收集于预先装有EDTA的采集管中。采用超灵敏Ex-4RIA试剂盒(Phoenix pharmaceuticals,Inc.,USA)。检测血浆中融合蛋白的浓度。实验用空白血浆做稀释校准。
结果如图19所示,rExendin-4/GLK1046与rExendin-4/GLK1076皮下注射后在猴子体内的末端半衰期分别为70.4小时,45.4小时。rExendin-4/rGLK1046皮下注射48小时,达到最大浓度,浓度为36980ng/ml。半衰期提高了15倍以上(注:Exendin-4的半衰期仅2.4小时。)
实施例11:rEPO/GLK1074融合蛋白的表达和纯化
1.EPO基因的克隆
EPO基因由上海泽衡生物技术有限公司合成,其DNA序列为参见SEQ ID NO:27。
合成后克隆到pMD18-T上,构建成质粒pEPO-T。EPO5'端带有Nhe I识别位点及Kozak序列,3'则带Dra III识别位点。斜体部分为EPO的天然信号肽序列。
2.GLK1074基因的克隆
根据GLK1074基因的序列,合成引物GLK1074/P1(SEQ ID NO:28),和GLK1074/P2(SEQ IDNO:29)。引物GLK10741带有DraIII识别位点,引物GLK10742则带NotI识别位点。以pGLK1074-T为模板。通过常规PCR获得扩增产物。
3.表达质粒pCEP4-EPO/GLK1074的构建
构建流程参见附图20。rEPO/GLK1074DNA序列和成熟融合蛋白的氨基酸序列分别参见SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31。
4.rEPO/GLK1074重组蛋白表达细胞株的构建
pCEP4-EPO/GLK1074质粒用超纯质粒提取试剂盒(购自Marligen公司)抽提。采用中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO)为宿主细胞,常规的脂质体转染。转染后,用ELISA法检测EPO活性。阳性克隆经甲氨蝶呤(MTX)加压筛选。选取其中一株阳性细胞逐渐用CD CHO无血清培养基(购自GIBCO公司)培养(Debeljak N et al.,Anal Biochem.,359:216-223,2006)。
5.rEPO/GLK1074重组蛋白的表达
将步骤4中获得的表达细胞株,复苏于无血清培养基中,细胞依次经过125ml,500ml,1000ml细胞培养用旋转瓶扩增,然后接种于B.Braun Biostart培养罐中,当活细胞密度大于1.5×106/ml时,每天补加10%10倍浓缩培养基,培养15天左右,每天取样计数细胞密度并用lowry法检测目的蛋白表达量。发酵培养结束后,收集重组表达细胞,6000r/min,离心5分钟,收集上清。8%SDS-PAGE电泳分析。
6.rEPO/GLK1074重组蛋白的纯化
纯化方法同类似于实施例1。
实施例12:rEPO/GLK1074融合蛋白在正常小鼠体内的促红细胞生成作用
在小鼠体内比较了rEPO/GLK1074融合蛋白与rEPO标准品(AMGEN公司)的促红细胞生成活性。实验采用BALB/c小鼠(雄性,6-8周龄,18~20g/只),来自中科院上海动物试验中心。参照下表进行分组,注射,尾静脉采集血样。比色测定血红蛋白(Hb)含量。
表6不同结构EPO药效分组及给药剂量表
每周一次皮下给药研究rEPO/GLK1074的促红细胞生成作用,结果如图21所示,不同rEPO/GLK1074剂量组间,随着剂量的增加,Hb水平也相应增高。rEPO也同样显示了促红细胞生成作用,但相似摩尔数条件下活性明显低于rEPO/GLK1074。因此相比于rEPO,rEPO/GLK1074不仅能延长给药周期,而且能增强促红细胞生成作用。
实施例13:药物组合物
如下制备含有rGLK1164/G-CSF融合蛋白的注射用水剂:
取200毫升rGLK1164/G-CSF融合蛋白原液,蛋白浓度为15.5mg/mL,并含10mmol/L磷酸缓冲液(pH6.5),称取7.13克甘氨酸加入到原液中完全溶解,再加入2.2毫升pH为6.5的0.5mol/L的磷酸缓冲液,用10%Na0H调节pH至6.5,最后加入适量的注射用水至310毫升,混合均匀后用0.22微米的滤膜对该制剂进行无菌过滤并分装于西林瓶中。最终制剂组成为:rGLK1164/G-CSF融合蛋白浓度为10mg/mL,磷酸缓冲液的浓度为10mmol/L,pH6.5,甘氨酸含量为2.3%(重量比)。
表6序列说明
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (4)
1.明胶样单元的用途,用于作为融合载体,延长生物活性多肽在机体内的体内半衰期;其中,所述的明胶样单元是结构如下的多肽:
(Gly-X-Y)n
式中,
Gly为甘氨酸残基;
X和Y分别为20种天然氨基酸除了Cys之外的任意氨基酸残基,以及Hyp;
n为20-300;
并且,所述的明胶样单元具有以下特征:
(a)所述明胶样单元中以下亲水性氨基酸Asn,Asp,Gln,Glu,Lys,Pro,Ser,Hyp,Arg的氨基酸百分比含量总和为40%至2/3;
(b)所述明胶样单元中,Pro和Hyp的数量之和与n的比值≥0.6;
(c)Gly的数量之和与n的比值≤1.15;
且,根据ProtParam公式计算,代表亲水性的GRAVY值小于-1.5;
附加条件是,所述的明胶样单元不是天然的明胶蛋白。
2.如权利要求1所述的明胶样单元,其特征在于,所述的明胶样单元还具有以下特征:
(d)等电点为3-7;
(e)根据Kolaskar-Tongaonkar法计算平均抗原指数不高于0.98。
3.如权利要求1所述的明胶样单元,其特征在于,所述的明胶样单元的分子量为10-100kDa。
4.如权利要求1所述的明胶样单元,其特征在于,所述的明胶样单元的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,或所述的明胶样单元的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
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