CN116063460B - 一种小分子胶原蛋白组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种小分子胶原蛋白组合物及其制备方法和应用，所述小分子蛋白组合物具有溶解性高、经皮吸收率高、经皮透过率高以及稳定性好等突出的优点。同时，本发明所述的小分子蛋白组合物还具有多种胶原蛋白的生物活性，如：促进Ⅲ型胶原蛋白生成、抑制白介素6、提高细胞黏附性能等功能，作为皮肤外用产品原料，具有巨大的发展潜力和应用价值。所述小分子蛋白组合物的制备方法简单，产品的均一性高，可以广泛应用于生物医药和化妆品行业。

Description

一种小分子胶原蛋白组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物领域，涉及一种小分子胶原蛋白组合物及其制备方法和应用。
背景技术
胶原是一种白色、不透明、无支链的纤维蛋白质，它主要存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，是结缔组织极重要的结构蛋白质，起着支撑器官、保护机体的功能。胶原蛋白是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％～30％，人体皮肤中胶原蛋白含量更是超过了70％以上，胶原蛋白含量的多少直接影响着面容的娇嫩与衰老。随着年龄的增长，成纤维细胞的合成能力下降，若皮肤中缺乏胶原蛋白，胶原纤维就会发生联固化，皮肤便会失去柔软、弹性和光泽，发生老化。
传统的胶原蛋白主要是从动物组织中提纯而来，常见的主要是从猪皮、牛跟腱和鱼皮等动物组织中化工提纯而来，但从中提纯出来的胶原蛋白为异种提纯，水溶性差，不易于人体结合，皮肤涂抹容易出现排异过敏反应。而随着基因重组技术的快速发展，微生物发酵重组“人源化胶原蛋白”逐渐成为业内技术发展的新方向。“人源化胶原蛋白”指的是将人体中天然胶原蛋白的全长或功能区基因序列组合，通过生物合成、蛋白纯化得到的胶原蛋白，其氨基酸序列应与人体天然胶原蛋白对应区域序列保持一致，不含非人体胶原蛋白序列，同时具有人体胶原蛋白的典型生物学功能和稳定的三螺旋结构的胶原蛋白，其中三螺旋结构是保证胶原蛋白活性以及功能的基础。
胶原蛋白作为一种有效的化妆品原料，常被添加至许多高档化妆品中。但实际上大分子胶原蛋白并不能被皮肤吸收，通过口服虽然可以通过肠胃吸收，但是最终作用的皮肤上面的量是很少的。超过2KD的胶原蛋白不能渗透到皮肤内，但它具有一定的成膜性，可以在皮肤表面形成一层保护膜，会对皮肤产生良好的滋润保湿作用，达到一定的消皱美容效果。因此，在护肤品中，单纯用作营养性护肤类原料通常要求分子量在2KD以下，从而才可能让水解胶原能渗透入皮肤内。Bos,J.D等人还提出了500Da规则，即化合物的相对分子质量必须低于500Da才能被正常皮肤完全吸收，相对分子质量大于500Da的化合物吸收率会逐步降低。特征性炎症皮肤(AD)、粘膜受损皮肤(M)能吸收800Da、1000 Da以上的化合物。(参考文献：The 500Dalton rule for the skin penetration of chemical compounds anddrugs，Experimental dermatology,9(3),165-169.Wiley-Blackwell.ISSN 0906-6705.)然而水解胶原蛋白的制备亦存在一定的问题——制备步骤繁琐、产品质量不佳等，且其稳定性也不好。因此，开发一种效果好、皮肤吸收率高的胶原蛋白具有重要意义。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种易透皮吸收的小分子胶原蛋白组合物及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种易透皮吸收的小分子胶原蛋白组合物，包括以下小分子胶原蛋白中的至少一种：氨基酸序列如SEQ ID NO：1的小分子胶原蛋白1，氨基酸序列如SEQ ID NO：2的小分子胶原蛋白2，氨基酸序列如SEQ ID NO：3的小分子胶原蛋白3，氨基酸序列如SEQ ID NO： 4的小分子胶原蛋白4，氨基酸序列如SEQ ID NO：5的小分子胶原蛋白5。
本发明人以人Ⅲ型胶原蛋白α1(UniProtKB/Swiss-Prot:P02461.4)为母体模型，并在三螺旋胶原结构域168位-1191位基础上，以保留III型胶原蛋白活性、改善胶原蛋白水溶性、提高经皮吸收率和提高胶原稳定性为目的，并控制胶原蛋白Gly-X-Y三肽特征序列重复数在2-14之间，并将疏水性氨基酸(如Phe、 Tyr、Trp、Ile、Leu、Val、Met等)被替换为亲水性氨基酸(如Glu、Asp、Gln、 Asn等)，设计了一系列的小分子胶原蛋白。本发明中的各小分子胶原蛋白分子量小，制备简单、方便，且都有一定的胶原蛋白活性，具有保湿、抗皱、修复等功能，有效提高肌肤免疫力。由多种小分子胶原蛋白组合得到的组合物不仅能够维持较好的皮肤吸收率，且稳定性、经皮吸收率和生物活性都更佳，可有效解决现有胶原蛋白在外用化妆品应用中存在的问题。
作为本发明的优选实施方式，所述的小分子胶原蛋白组合物包括以下五种小分子胶原蛋白：氨基酸序列如SEQ ID NO：1的小分子胶原蛋白1，氨基酸序列如SEQ ID NO：2的小分子胶原蛋白2，氨基酸序列如SEQ ID NO：3的小分子胶原蛋白3，氨基酸序列如SEQ ID NO：4的小分子胶原蛋白4，氨基酸序列如SEQ ID NO：5的小分子胶原蛋白5。
更优选地，所述的小分子胶原蛋白组合物包括五种小分子胶原蛋白，所述组合物中，小分子胶原蛋白1：小分子胶原蛋白2：小分子胶原蛋白3：小分子胶原蛋白4：小分子胶原蛋白5按摩尔比为1：6：6：5：1。
通过人成纤维细胞功效测试表明，本发明的五种小分子胶原蛋白在上述比例下得到的小分子胶原蛋白组合物胶原蛋白活性较佳，可有效促进Ⅲ型胶原蛋白生成，还具有抗炎修复作用，且其经皮吸收率和透过率及稳定性高。虽然体外测试中所述小分子胶原蛋白组合物的部分生物活性不如市售的重组人源胶原蛋白CGN-1，但差别不大，且由于实际应用时还需考虑皮肤的阻挡、吸收效果。经测试，本发明的小分子胶原蛋白组合物能够有效改善皮肤问题(包括毛孔粗大、炎症、痤疮、斑点等)，减少皮肤皱纹，使得肌肤更年轻。
进一步地，本发明还要求保护所述的小分子胶原蛋白组合物的用途。
作为本发明的优选实施方式，所述用途包括作为皮肤外用产品原料。
本发明的小分子胶原蛋白组合物具有促进Ⅲ型胶原蛋白生成、抗炎修复、经皮吸收率和透过率及稳定性高等特点，可作为皮肤外用产品原料用于制备具有相应功能的皮肤外用产品。
相应地，本发明还要求保护包括所述小分子胶原蛋白组合物的皮肤外用产品。
本领域技术人员可根据本发明所述的小分子胶原蛋白组合物的功能，作为皮肤外用产品原料制备相应的皮肤外用产品，所述皮肤外用产品包括但不限于以下类别：化妆品、护肤品、皮肤类药物(如烧伤、烫伤类等皮肤修复药物)、皮肤敷料(如烧伤、烫伤类等皮肤敷料)等。本领域技术人员根据所属外用皮肤产品的配方及所需的效果(如抗皱、抗衰老、补水、消炎、修复等)，添加本发明所述小分子胶原蛋白组合物，并根据实验调整所述小分子胶原蛋白组合物浓度，从而使其发挥最佳效果。
进一步地，本发明还要求保护所述小分子胶原蛋白组合物的制备方法，所述制备包括化学合成法、生物合成法。
由于本发明提供了所述所述小分子胶原蛋白组合物中各小分子蛋白的氨基酸，本领域技术人员不难通过现有技术即可制备本发明的小分子胶原蛋白组合物。常用的蛋白合成方法包括化学合成法、生物合成法。生物合成法包括：根据提供的氨基酸序列得出相应的核苷酸序列，从而构建相应的表达载体，通过蛋白表达、纯化，从而得到相应的各小分子胶原蛋白。
作为本发明的一种实施方式，本发明提供了所述小分子胶原蛋白组合物的制备方法，步骤如下：
(1)根据所述各小分子胶原蛋白的氨基酸序列合成得到相应的小分子胶原蛋白；
(2)将步骤(1)制备得到的各小分子胶原蛋白按比例混合。
所述制备方法简单、高效，产品的均一性好。
进一步地，所述步骤(1)还包括纯化的过程。
本发明提供了一种小分子胶原蛋白组合物及其制备方法和应用，所述小分子蛋白组合物具有溶解性高、经皮吸收率高、经皮透过率高以及稳定性好等突出的优点。同时，本发明所述的小分子蛋白组合物还具有多种胶原蛋白的生物活性，如：促进Ⅲ型胶原蛋白生成、抑制白介素6、提高细胞黏附性能等功能。作为皮肤外用产品原料，具有巨大的发展潜力和应用价值。所述小分子蛋白组合物的制备方法简单，产品的均一性好，可以广泛应用于生物医药和化妆品行业。
附图说明
图1为受试者使用含有0.1％本发明小分子胶原蛋白组合物的精华液后的皮肤敏感图示例。
图2为受试者使用含有0.1％本发明小分子胶原蛋白组合物的精华液后的皮程度图示例。
图3为受试者使用含有0.1％本发明小分子胶原蛋白组合物的精华液后的皮纹理图示例。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
实施例1小分子胶原蛋白组合物的制备
参考兰州大学博士学位论文《胶原蛋白仿生多肽的设计与性质研究》，采用标准的Fmoc固相合成法逐步合成得到氨基酸序列如SEQ ID NO：1的小分子胶原蛋白1，氨基酸序列如SEQ ID NO：2的小分子胶原蛋白2，氨基酸序列如 SEQ ID NO：3的小分子胶原蛋白3，氨基酸序列如SEQ ID NO：4的小分子胶原蛋白4，氨基酸序列如SEQ ID NO：5的小分子胶原蛋白5。
将各小分子胶原蛋白按摩尔比为小分子胶原蛋白1：小分子胶原蛋白2：小分子胶原蛋白3：小分子胶原蛋白4：小分子胶原蛋白5＝1：6：6：5：1的比例混合，制成得到小分子胶原蛋白组合物。
实施例2对紫外诱导人成纤维细胞的修复作用
实验方法：培养人成纤维细胞，接种于25cm2的细胞培养瓶中，用DMEM 培养基于37℃、5％ CO2、80％湿度的条件下进行培养，当细胞达到80％融合时，用胰酶消化细胞重悬，制备细胞悬液。将细胞悬液接种于24孔细胞培养板中板(设置空白组、模型中和样品组)，培养约24h。培养24h后，去除培养基，用120μL PBS溶液清洗1遍后进行UVB(紫外线)照射处理。其中，空白组不进行UVB(紫外线)照射处理，模型组和样品组进行60mJ/cm3的UVB 照射处理。UVB照射处理后，空白组和模型组加入DMEM培养基，样品组分别用400μL含不同浓度样品的DMEM培养基进行培养。样品为重组人源胶原蛋白CGN-1(市售)或本发明小分子胶原蛋白组合物(实施例1方法制得)。继续培养24h后，吸出培养基溶液，用500μL PBS轻洗2遍后，加入400μL 4％多聚甲醛溶液固定细胞20min，弃去多聚甲醛溶液。在避光条件下加入结晶紫染液染色10min，最后冲洗除去残余的结晶紫染液，干燥后观察细胞染色形态。成像完成后，通过Image-Pro Plus软件计算分析其平均光密度，通过平均光密度评价各组细胞的存活率。细胞活性以空白对照组的细胞活性为100％，计算各组相对细胞活性(Viability)及修复率，实验结果如表1，相对细胞活性及修复率计算方式如下：
相对细胞活性(％)＝A1/A2×100％；
其中：A1为样品组或模型组的细胞存活率，A2为空白组的细胞存活率。
修复率(％)＝(B1-B2)/B2*100％；
其中，B1为样品组的相对细胞活性，B2为模型组的细胞相对活性。
表1对紫外诱导人成纤维细胞的修复作用
由表1可得，重组人源胶原蛋白和本发明小分子胶原蛋白组合物对紫外诱导损伤的人成纤维细胞都具有一定修复作用。其中，200μg/mL重组人源胶原蛋白的修复作用最佳，本发明小分子胶原蛋白组合物在200-400μg/mL的浓度范围内均具有较好的修复作用。
实施例3对紫外诱导人成纤维细胞合成Ⅲ型胶原蛋白的作用
培养成纤维细胞，接种于25cm2的细胞培养瓶中，用常规培养基于37℃、 5％CO2、80％湿度的条件下进行常规培养，当细胞达到80％融合时，用胰酶消化细胞重悬，制备细胞悬液。将细胞悬液接种于24孔细胞培养板中(设置空白组、模型中和样品组)，培养约24h。培养24h后，扣掉培养基，用120μL PBS 溶液轻洗1遍后进行UVB(紫外线)照射处理。其中，空白组不进行UVB照射处理，模型组和样品组进行60mJ/cm3的UVB照射处理。UVB照射处理后，模型组加入常规培养基，样品组分别用400μL含不同浓度样品的培养基进行培养。样品为重组人源胶原蛋白CGN-1(市售)或本发明小分子胶原蛋白组合物 (实施例1方法制得)。培养24h后，吸出培养基上清液，1000g离心20分钟，取上清按照ELISA试剂盒操作说明进行检测。
试剂盒检测原理：试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅢ)捕获抗体的包被微孔中，依次加入样本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的Ⅲ型胶原蛋白呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度 (OD值)，计算样品浓度。根据模型组和样品组对紫外诱导人成纤维细胞合成Ⅲ型胶原蛋白的含量计算样品组合成Ⅲ胶原蛋白的增长率，计算公式如下：
增长率(％)＝(C1-C2)/C2*100％；
其中，C1为样品组的Ⅲ型胶原蛋白含量(pg/mL)，C2为模型组的Ⅲ型胶原蛋白含量(pg/mL)。
重组人源胶原蛋白(CGN-1)和本发明小分子胶原蛋白组合物(实施例1 方法制得)对紫外诱导人成纤维细胞合成Ⅲ型胶原蛋白的作用。结果如表2。
表2促进生成Ⅲ型胶原蛋白生成作用
由表2可得，200μg/mL重组人源胶原蛋白和400μg/mL本发明小分子胶原蛋白组合物可促进紫外诱导人成纤维细胞合成Ⅲ型胶原蛋白，Ⅲ型胶原蛋白的增长率分别为31.93％和23.82％，本发明小分子胶原蛋白组合物的增长率为重组人源胶原蛋白的74.6％。
实施例4对巨噬细胞分泌白介素6的影响
将RAW264.7细胞培养至满后，加入2mL完全培养基，用细胞刮刀将细胞刮打下来，吹打均匀收集至离心管，1000rpm离心3min，消化离心计数，配制2 ×104cells/mL细胞悬液，在96孔板中接种细胞(设置空白组、模型中和样品组)，密度为2000细胞/每孔；培养12-20h至细胞贴壁后弃培养基；加入新培养基，其中空白组、模型组加入完全培养基，样品组加入含不同浓度的样品的完全培养基后放入培养箱，继续培养24h。样品为重组人源胶原蛋白CGN-1(市售) 或本发明小分子胶原蛋白组合物(实施例1方法制得)。细胞培养约24h，吸走96孔板上每个孔的培养基，空白组加入含10％ FBS的1640完全培养基，模型组、样品组加入1μg/mL的LPS溶液；将细胞放入培养箱，继续培养24h；吸取50μL上清，1000g离心20分钟，取上清按照ELISA试剂盒操作说明进行检测。
检测原理：试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被白细胞介素6(IL-6)捕获抗体的包被微孔中，依次加入样本、标准品、 HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠白细胞介素6(IL-6)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。根据模型组和样品组的巨噬细胞白介素6 含量，计算样品组对巨噬细胞白介素6的抑制率，计算公式如下：
增长率(％)＝(D1-D2)/D2*100％；
其中，D1为样品组的白介素6含量(pg/mL)，D2为模型组的白介素6含量(pg/mL)。
重组人源胶原蛋白(CGN-1)和小分子胶原蛋白组合物(实施例1方法制得)对白介素的影响实验结果如表3所示。
表3抑制白介素6效果
由表3可得，重组人源胶原蛋白和本发明小分子胶原蛋白组合物均可以抑制巨噬细胞分泌白介素6，以达到抗炎的效果，且抑制效果与浓度呈量效关系。其中，重组人源胶原蛋白浓度在200μg/mL的抗炎效果最好。本发明小分子胶原蛋白组合物在100μg/mL浓度下效果最好。在各自最优浓度下，本发明小分子胶原蛋白组合物对巨噬细胞白介素6的抑制效果相对于重组人源胶原蛋白更佳。
实施例5对紫外诱导人成纤维细胞粘附性的影响
将重组人源胶原蛋白GGN-1用PBS配制成浓度为50、100、200μg/mL的溶液，将本发明小分子胶原蛋白组合物用PBS配制成浓度为100、200、400μg/mL 的溶液，分别加入96孔板中，每孔20μL，空白组及模型组加入20μL PBS。在无菌操作台中过夜吹干后，接种取对数期生长的人成纤维细胞。培养5h后弃去培养基，用PBS轻轻漂洗3次，再加入培养基继续培养2h。弃去培养基，用PBS轻洗1遍。除空白组外，模型组和样品组分别进行60mJ/cm3的UVB照射处理。最后加入100μL MTT溶液，培养箱孵育2h。去除孔中液体，每孔加入 150μL DMSO，置于振荡器振荡10-15min。在酶标仪490nm波长处测定吸光度，并计算得出细胞粘附率和粘附性的提升率；计算公式如下：
相对细胞粘附率(％)＝E1/E2×100％；
其中，E1为样品组或模型组的吸光度，E2为空白组的吸光度。
提升率(％)＝(F1-F2)/F2*100％；
其中，F1为样品组的相对细胞粘附率，F2为模型组的相对细胞粘附率。
重组人源胶原蛋白(CGN-1)和本发明小分子胶原蛋白组合物对紫外诱导人成纤维细胞粘附性能的影响见表4。
表4细胞粘附效果
由表4可见，50、100、200μg/mL的重组人源胶原蛋白和100、200、400μg/mL 的本发明小分子胶原蛋白组合物对紫外诱导人成纤维细胞均具有一定的粘附效果。在200μg/mL浓度下，本发明小分子胶原蛋白组合物的相对细胞粘附性为重组人源胶原蛋白的87.86％。
实施例6经皮吸收、穿透测试
将重组人源胶原蛋白GGN-1和本发明小分子胶原蛋白组合物分别用0.2M PBS缓冲液(pH7.2)配制成浓度为1、5、20mg/mL的水溶液，作为实验样品。将白条猪小乳猪皮(购自有容生物，厚度0.6-0.8mm，含角质层、表皮层和真皮层)安装到垂直Franz扩散系统(型号：TP-6)。取3mL样品和加入到垂直Franz 扩散系统的供给池中，取15.5mL的0.2M PBS缓冲液(pH7.2)加入到垂直Franz 扩散系统的接受池中，37℃恒温水浴，每个样品进行5次平行实验。空白对照组的供给池和接受池均加入0.2M PBS缓冲液(pH7.2)。实验第4h、6h、8h、 12h、24h分别于从供给池和接受池中取1mL样品，通过高效液相色谱仪分析计算供给池和接受池中样品的胶原蛋白含量。根据供给池中样品的胶原蛋白含量和初始胶原蛋白含量计算经皮吸收率并计算平均值。经皮吸收率计算公式如下：
水溶液配方经皮吸收率(％)＝(C0-C1)/C1*100％；
其中，C0为初始时间点供给池中样品的胶原蛋白含量，C1为各取样时间点供给池中样品的胶原蛋白含量。
检测结果显示，空白组的供给池和接受池中胶原蛋白含量为0，说明在该实验条件下小乳猪皮不会释放胶原蛋白，干扰测试结果。其他组别测试结果见表5。
表5样品水溶液经皮吸收率结果
由表5可得，重组人源胶原蛋白CGN-1和本发明小分子胶原蛋白组合物浓度在5mg/mL时，经皮吸收率最高；且本发明小分子胶原蛋白组合物相对于重组人源胶原蛋白CGN-1经皮吸收率明显更好。
根据接受池中样品的胶原蛋白含量和初始胶原蛋白含量可计算得到经皮穿透率，公式如下：
经皮穿透率(％)＝C2/C0*100％；
其中，C0为初始时间点供给池中样品的胶原蛋白含量，C2为各取样时间点接受池中样品的胶原蛋白含量。
各样品水溶液经皮穿透率结果见表10。
表6样品水溶液经皮穿透率结果
经检测发现，在所有取样时间点接受池样品中均未检出重组人源胶原蛋白，因此其经皮穿透率为0，见表10。而本发明的小分子胶原蛋白组合物具有一定的经皮穿透效果。
进一步将重组人源胶原蛋白或小分子胶原蛋白组合物配制为促吸收配方，作为实验样品，配方见表7。
表7促吸收配方
按照相同的方法测定经皮吸收率，各促吸收配方经皮吸收率结果见表8。
表8促吸收配方经皮吸收率
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由表8可见，本发明小分子胶原蛋白组合物溶液相对于重组人源胶原蛋白 CGN-1溶液，经皮吸收率明显更高。
实施例7稳定性测试
(1)高温高压灭菌稳定性测试
将重组人源胶原蛋白和本发明小分子胶原蛋白组合物用0.2M PBS缓冲液(pH7.2)配制成浓度为50mg/mL的水溶液，作为实验样品。并于121℃，高压蒸汽灭菌20min，然后用高效液相色谱仪分析。结果显示，灭菌后重组人源胶原蛋白GGN-1发生显著降解，降解率为97.6％。本发明小分子胶原蛋白组合物仅发生少量降解，降解率为1.46％。
(2)40℃加速稳定性测试
将本发明小分子胶原蛋白组合物粉末分装于5mL西林瓶中，轧盖密封后，置于40℃恒温箱内，进行加速稳定性测试。并于第0、10、20、30天分别取样进行HPLC检测，分析其胶原蛋白含量与纯度变化，结果见表9。
表9 40℃加速稳定性测试结果
结果表明，在40℃高温条件下放置，本发明小分子胶原蛋白组合物纯度与含量两项指标的变化趋势一致，胶原蛋白含量和纯度下降率为4.3％和3.2％，下降百分比在均5％以内。说明本发明小分子胶原蛋白组合物在40℃下稳定性较好，可在室温条件下运输和室温条件下存放。
实施例8溶解性测试
取小分子胶原蛋白粉末用纯化水溶解，分别配置浓度为40、50、60、70、 80、90、100、110、120mg/mL的溶液，结果显示浓度40-90mg/mL时溶液澄清透明，而100-120mg/L时有少量蛋白析出，说明本发明小分子胶原蛋白组的最大溶解度为90mg/mL。
实施例9人体功效测试
招募年龄29～50岁的志愿者30人，每天早晚各一次在炎症、痘坑部位涂抹使用含有0.1％本发明人小分子胶原蛋白组合物的精华液；并分别于0天、14天、 28天、42天检测。检测使用DJM AI皮肤检测仪(德国维利希)，采用RBX图像技术以及平行偏振光技术加强表面光学反射进行拍照分析。
由测试结果可得，使用含有0.1％本发明人小分子胶原蛋白组合物的受试者皮肤状态好转明显：一方面受试者皮肤更饱满、平滑(水分较充足)，另一方面皮肤炎症降低，红血丝、痤疮明显变少(参考图1敏感图、图2程度图)；进一步由纹理图(参考图3)可见，受试者的皱纹亦有明显减少。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种易透皮吸收的小分子胶原蛋白组合物，其特征在于，包括以下五种小分子胶原蛋白：
氨基酸序列如SEQ ID NO：1的小分子胶原蛋白1，
氨基酸序列如SEQ ID NO：2的小分子胶原蛋白2，
氨基酸序列如SEQ ID NO：3的小分子胶原蛋白3，
氨基酸序列如SEQ ID NO：4的小分子胶原蛋白4，
氨基酸序列如SEQ ID NO：5的小分子胶原蛋白5；
所述小分胶原蛋白组合物中，小分子胶原蛋白1：小分子胶原蛋白2：小分子胶原蛋白3：小分子胶原蛋白4：小分子胶原蛋白5按摩尔比为1：6：6：5：1。
2.如权利要求1所述的小分子胶原蛋白组合物作为皮肤外用产品原料的用途。
3.一种皮肤外用产品，其特征在于，所述皮肤外用产品包括如权利要求1所述的小分子胶原蛋白组合物。
4.如权利要求1所述的小分子胶原蛋白组合物的制备方法，其特征在于，包括化学合成法、生物合成法。
5.如权利要求4所述的小分子胶原蛋白组合物的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)根据所述各小分子胶原蛋白的氨基酸序列合成得到相应的小分子胶原蛋白；
(2)将步骤(1)制备得到的各小分子胶原蛋白按比例混合。
6.如权利要求5所述的小分子胶原蛋白组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)还包括纯化的过程。
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