CN118021646A - 一种牛肝菌肽及其衍生物在化妆品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牛肝菌肽、牛肝菌肽盐、或牛肝菌肽衍生物在化妆品中的用途,该牛肝菌肽包含选自由以下组成的组的氨基酸:亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、苯丙氨酸(Phe)、丝氨酸(Ser)和赖氨酸(Lys)。在化妆品中,为了达成多种功效,往往需要同时使用多种功效肽,不仅使配方复杂化也提高了成本,并且功效肽例如蓝铜肽的适用范围有一定局限性,本发明的牛肝菌肽、牛肝菌肽盐、或牛肝菌肽衍生物具有促进透明质酸生成、促进AQP3蛋白合成,在UVA照射下抑制MMP‑1生成并保护I型胶原,促进角质形成细胞增殖、迁移的作用,从而对皮肤同时发挥一定的保湿、抗衰、修复方面的功效。
Description
技术领域
本发明涉及化妆品、皮肤病学产品行业以及卫生和个人护理产品行业,具体涉及一种牛肝菌肽在化妆品中的用途。
背景技术
随着年龄的增长,皮肤会出现一系列衰老迹象,包括表皮更新速度下降、皮肤屏障功能弱化、角质形成细胞活跃性降低和角质层的水合能力减弱,这些变化导致皮肤脱屑、干燥。同时,皮脂分泌减少和水分流失增加,使得皮肤细胞更容易发生皱缩和老化。
市场上的抗衰老产品种类繁多,其功能包括抗氧化、抗糖基化、补充胶原蛋白等。然而,所有的这些产品要想充分发挥其功效,前提是皮肤要有充足的水分,以便这些产品能深入皮肤。因此,皮肤的含水量减少,不仅本身会导致皮肤干燥,皮肤暗黄、松弛和出现皱纹等现象,还会影响其他产品的功效。因此,如果想要改善肌肤的抗衰老状态,补充水分和保持皮肤湿润是必不可少的一步。
皮肤角质层是皮肤表面的最外层,主要功能是防止水分蒸发以及避免外部有害物质和微生物的入侵。不同个体的角质层厚度和密度可能会因遗传、环境、年龄等多种因素不同而有所不同。角质层薄弱或角质层损伤会让皮肤变得更加敏感和干燥,容易受到损伤和感染。此外,角质层的丧失还会导致皮肤水分的迅速蒸发,使皮肤失去柔软度和弹性,加速皮肤的衰老过程。
在化妆品领域,一种被用来补水保湿的方案是,通过可以增加水通道蛋白3含量的多肽与具有促进透明质酸生成或/和胶原蛋白生成作用的多肽结合使用:
水通道蛋白3(AQP3)可以将水、甘油等小分子跨膜运输至表皮,参与角质层的水合作用,透明质酸(HA)可以加强真皮内水的滞留,形成水分储存库。同时使用促进水通道蛋白3生成的成分和促进透明质酸生成的成分,多靶点协同发挥作用,可以全方位、即时且高效持久的为皮肤补水保湿,对于抗衰老、维护皮肤健康同样有着积极作用。
除了随着年龄增长而不断老化,皮肤还会因暴露于紫外线而加速老化。当皮肤暴露在紫外线(特别是UVA)下时,会增加皮肤细胞中MMP-1的生成。基质金属蛋白酶-1(MMP-1)是皮肤中的一种重要酶,主要功能是分解真皮层中的胶原蛋白。胶原蛋白本身是维持皮肤弹性和平滑的重要物质。因此,过多的MMP-1会引发皮肤松弛,出现细纹、皱纹等衰老迹象。
在化妆品领域,一种被广泛用来解决角质层薄弱和抵抗紫外线照射下基质金属蛋白酶MMP-1生成的肽是蓝铜肽(Copper Tripeptide)。蓝铜肽具有强大的愈合和再生能力,能刺激肌肤产生胶原蛋白和弹性蛋白,增强肌肤的紧致度和弹性,有助于增强角质层的厚度,并防止因MMP-1过度生成而导致的胶原蛋白损失。
但是,因为蓝铜肽本身的结构特点,依然存在皮肤透过率低的局限性。蓝铜肽虽然分子质量小于500Da,但其亲水性和带电状态导致了它相对较低的渗透性,不易通过皮肤。蓝铜肽不能和一些其他活性成分(如维他命C)同时使用,因为它们可能会相互抵消功效。蓝铜肽和一些其他成分(如抗氧化剂)配合使用可能会造成不稳定性,使产品的有效期缩短。一定程度上限制了配方组成。相较于其他更常见的成分,蓝铜肽的制造成本较高,因此含有蓝铜肽的产品价格通常较贵。
现有技术中未报道或公开本发明所要求保护的如SEQ ID NO:1所示的Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys的氨基酸序列、或该氨基酸序列的衍生物的所述功效或作用。
发明内容
基于此,本发明提供了一种牛肝菌肽、牛肝菌肽盐、或牛肝菌肽衍生物在化妆品中的用途,其特征在于,所述牛肝菌肽包含选自由以下组成的组的氨基酸:亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、苯丙氨酸(Phe)、丝氨酸(Ser)和赖氨酸(Lys),其中所述牛肝菌肽衍生物为R1-所述牛肝菌肽-R2,R1是未被取代的或者选自以下的一种:乙酰基(Ac)、棕榈酰基(Pal)和式CH3-(CH2)m-CO-的酰基(m=1~13、15~22);R2是未被取代的或者选自以下的一种:-NH2、-NH-(CH2)x-CH3(x=11~15)、序列为Lys-Arg-Arg-Lys-Arg的肽段、序列为Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg的肽段和序列为Arg-Arg-Arg-Arg的肽段。
根据本发明的另一个方面,提供了一种牛肝菌肽、牛肝菌肽盐、或牛肝菌肽衍生物作为活性组分在皮肤和/或其附属物的非治疗性美容处理中的用途,其特征在于,所述牛肝菌肽包含选自由以下组成的组的氨基酸:亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、苯丙氨酸(Phe)、丝氨酸(Ser)和赖氨酸(Lys),其中所述牛肝菌肽衍生物为R1-所述牛肝菌肽-R2,R1是未被取代的或者选自以下的一种:乙酰基(Ac)、棕榈酰基(Pal)和式CH3-(CH2)m-CO-的酰基(m=1~13、15~22);R2是未被取代的或者选自以下的一种:-NH2、-NH-(CH2)x-CH3(x=11~15)、序列为Lys-Arg-Arg-Lys-Arg的肽段、序列为Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg的肽段和序列为Arg-Arg-Arg-Arg的肽段。
进一步地,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个亮氨酸(Leu)。
进一步地,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个异亮氨酸(Ile)。
进一步地,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个酪氨酸(Tyr)。
进一步地,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个丙氨酸(Ala)。
进一步地,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个谷氨酰胺(Gln)。
进一步地,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个甘氨酸(Gly)。
进一步地,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个苯丙氨酸(Phe)。
进一步地,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个丝氨酸(Ser)。
进一步地,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个赖氨酸(Lys)。
进一步地,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个Leu-Ile-Tyr的序列。
进一步地,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个Ile-Tyr-Ala的序列。
进一步地,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个Tyr-Ala-Gln的序列。
进一步地,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个Ala-Gln-Gly的序列。
进一步地,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个Gln-Gly-Phe的序列。
进一步地,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个Gly-Phe-Ser的序列。
进一步地,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个Phe-Ser-Lys的序列。
进一步地,该牛肝菌肽包含8~10个氨基酸,例如9个氨基酸。
进一步地,该牛肝菌肽包含如SEQ ID NO:1所示的Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys的氨基酸序列,可选地为取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的SEQID NO:1所示的氨基酸序列,可选地为与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列同一性程度为约88.9%的氨基酸序列。
本发明的如SEQ ID NO:1所示的Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys(LIYAQGFSK)的氨基酸序列来源于商购,或者来源于肽链合成。
进一步地,该SEQ ID NO:1所示的Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys的氨基酸序列是通过肽链人工合成而获得的。
进一步地,该牛肝菌肽衍生物是通过肽链人工合成而获得的。
进一步地,该牛肝菌肽衍生物包括以下的一种:
Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH2,
Pal-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH2,
CH3-(CH2)m-CO-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH2(m=1~13、
15~22),
Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH-(CH2)x-CH3
(x=11~15),
Pal-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH-(CH2)x-CH3
(x=11~15),
CH3-(CH2)m-CO-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH-(CH2)x-CH3(m=1~13、15~22,x=11~15),
Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg,
Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Arg-Arg-Arg,
Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg,
Pal-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg,
Pal-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Arg-Arg-Arg,
Pal-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg,
CH3-(CH2)m-CO-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Arg-Arg-Arg(m=1~13、15~22),
CH3-(CH2)m-CO-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg(m=1~13、15~22),和
CH3-(CH2)m-CO-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg(m=1~13、15~22)。
进一步地,该牛肝菌肽衍生物包括以下的一种:
Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH2,
Pal-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH2,
CH3-(CH2)10-CO-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH2,
Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH-(CH2)13-CH3,
Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Arg-Arg-Arg,
Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg,
Pal-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg,和
CH3-(CH2)16-CO-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Arg-Arg-Arg。
进一步地,该用途包括对皮肤具有保湿的用途、抗皮肤衰老的用途和/或对皮肤具有修复的用途。
进一步地,该保湿包括促进透明质酸(HA)生成和/或促进水通道蛋白3(AQP3)合成。
进一步地,该抗皮肤衰老包括抑制紫外线照射下基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的生成和/或在紫外线照射下保护皮肤成纤维细胞生成的Ⅰ型胶原蛋白。
进一步地,该修复包括促进角质形成细胞增殖和/或迁移。
进一步地,该美容处理包括改善皮肤的干燥、改善皮肤的脱皮、改善皮肤的角质层薄弱、减轻皮肤细纹、减轻皮肤皱纹和/或预防皮肤老化。
根据本发明的另一个方面,提供了一种包含牛肝菌肽、牛肝菌肽盐、或牛肝菌肽衍生物的化妆品组合物在皮肤和/或其附属物的非治疗性美容处理中的用途,其特征在于,以所述化妆品组合物的总重量计,所述牛肝菌肽、牛肝菌肽盐、或牛肝菌肽衍生物的重量范围为0.000001%~10%,优选地0.000001%~5%,例如0.000001%~1%,其中所述牛肝菌肽包含选自由以下组成的组的氨基酸:亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、苯丙氨酸(Phe)、丝氨酸(Ser)和赖氨酸(Lys),其中所述牛肝菌肽衍生物为R1-所述牛肝菌肽-R2,R1是未被取代的或者选自以下的一种:乙酰基(Ac)、棕榈酰基(Pal)和式CH3-(CH2)m-CO-的酰基(m=1~13、15~22);R2是未被取代的或者选自以下的一种:-NH2、-NH-(CH2)x-CH3(x=11~15)、序列为Lys-Arg-Arg-Lys-Arg的肽段、序列为Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg的肽段和序列为Arg-Arg-Arg-Arg的肽段。
进一步地,该化妆品组合物进一步包含用于增强所述牛肝菌肽的效果的活性剂。
进一步地,该活性剂选自以下的一种或多种:肽类、维生素C及其衍生物、来自于B族的维生素类、脱氢表雄甾酮(DHEA)、植物甾醇类、水杨酸及其衍生物、类视黄醇类、类黄酮类、氨基糖类、唑类和金属盐类。
进一步地,该化妆品进一步包含化妆品用辅料。
进一步地,该化妆品用辅料选自以下的一种或多种:增稠剂、表面活性剂、助表面活性剂、皮肤调理剂、防腐剂、香精、润滑剂、崩解剂、湿润剂、粘合剂和填充剂。
根据本发明的另一个方面,提供了一种改善皮肤的美学外观的方法,其特征在于,所述方法包括局部应用有效量的包含牛肝菌肽、牛肝菌肽盐、或牛肝菌肽衍生物的化妆品组合物,以所述化妆品组合物的总重量计,所述牛肝菌肽、牛肝菌肽盐、或牛肝菌肽衍生物的重量范围为0.000001%~10%,优选地0.000001%~5%,例如0.000001%~1%,其中所述牛肝菌肽包含选自由以下组成的组的氨基酸:亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、苯丙氨酸(Phe)、丝氨酸(Ser)和赖氨酸(Lys),其中所述牛肝菌肽衍生物为R1-所述牛肝菌肽-R2,R1是未被取代的或者选自以下的一种:乙酰基(Ac)、棕榈酰基(Pal)和式CH3-(CH2)m-CO-的酰基(m=1~13、15~22);R2是未被取代的或者选自以下的一种:-NH2、-NH-(CH2)x-CH3(x=11~15)、序列为Lys-Arg-Arg-Lys-Arg的肽段、序列为Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg的肽段和序列为Arg-Arg-Arg-Arg的肽段。
本发明的有益效果:
在化妆品中,为了达成多种功效,往往需要同时使用多种功效肽,不仅使配方复杂化也提高了成本,并且功效肽例如蓝铜肽的适用范围有一定局限性,本发明的如SEQ IDNO:1所示的Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys的氨基酸序列或该氨基酸序列的衍生物具备多功效的单肽替代多个肽,其具有促进透明质酸(HA)生成、促进AQP3蛋白合成、保护I型胶原(UVA照射)与抑制MMP-1生成(UVA照射),促进角质形成细胞增殖、角质形成细胞迁移的作用,从而对皮肤同时发挥一定的保湿、抗衰、修复方面的功效。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,还可以根据这些附图获得其他的附图,而并不超出本发明要求保护的范围。
图1为本发明的牛肝菌肽促进透明质酸(HA)合成结果示意图。其中,BC:空白对照(HaCaT细胞),PC:阳性对照(0.0001mg/mL TGF-β1),与BC相比,*代表P<0.05,**代表P<0.01。
图2为本发明的牛肝菌肽以及牛肝菌肽衍生物促进透明质酸(HA)合成结果示意图。其中,BC:空白对照(HaCaT细胞),PC:阳性对照(0.0001mg/mL TGF-β1),与BC相比,*代表P<0.05,**代表P<0.01;F1代表0.05mg/mL的Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys;F2代表0.05mg/mL的Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH2;F3代表0.05mg/mL的Pal-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH2;F4代表0.05mg/mL的CH3-(CH2)10-CO-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH2;F5代表0.05mg/mL的Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH-(CH2)13-CH3;F6代表0.05mg/mL的Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Arg-Arg-Arg;F7代表0.05mg/mL的Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg;F8代表0.05mg/mL的Pal-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg;F9代表0.05mg/mL的CH3-(CH2)16-CO-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Arg-Arg-Arg。
图3为本发明的牛肝菌肽促进水通道蛋白3(AQP3)合成结果示意图。其中,BC:空白对照(HaCaT细胞),PC:阳性对照(0.375mol/mLCaCl2),与BC相比,*代表P<0.05,**代表P<0.01。
图4为本发明的牛肝菌肽以及牛肝菌肽衍生物促进水通道蛋白3(AQP3)合成结果示意图。其中,BC:空白对照(HaCaT细胞),PC:阳性对照(0.375mol/mLCaCl2),与BC相比,*代表P<0.05,**代表P<0.01;F1~F9所代表内容与图2相同。
图5为本发明的牛肝菌肽保护I型胶原蛋白(UVA)合成结果示意图。其中,BC:空白对照(HFF-1细胞),NC:阴性对照(9J/cm2UVA),PC:阳性对照(100μg/mL VC+7μg/mL VE),与BC相比,#代表P<0.05,*代表P<0.05,**代表P<0.01。
图6为本发明的牛肝菌肽以及牛肝菌肽衍生物保护I型胶原蛋白(UVA)合成结果示意图。其中,BC:空白对照(HFF-1细胞),NC:阴性对照(9J/cm2 UVA),PC:阳性对照(100μg/mLVC+7μg/mL VE),与BC相比,#代表P<0.05,*代表P<0.05,**代表P<0.01;F1~F9所代表内容与图2相同。
图7为本发明的牛肝菌肽抑制MMP-1合成(UVA)结果示意图。其中,BC:空白对照(HFF-1细胞),NC:阴性对照(9J/cm2 UVA),PC:阳性对照(100μg/mL VC+7μg/mL VE),与BC相比,#代表P<0.05,*代表P<0.05,**代表P<0.01,***代表P<0.001。
图8为本发明的牛肝菌肽以及牛肝菌肽衍生物抑制MMP-1合成(UVA)结果示意图。其中,BC:空白对照(HFF-1细胞),NC:阴性对照(9J/cm2 UVA),PC:阳性对照(100μg/mL VC+7μg/mL VE),与BC相比,#代表P<0.05,*代表P<0.05,**代表P<0.01,***代表P<0.001;F1~F9所代表内容与图2相同。
图9为本发明的牛肝菌肽促进角质形成细胞增殖结果示意图。其中,BC:空白对照(HaCaT细胞),PC:阳性对照(10% FBS),与BC相比,*代表P<0.05,**代表P<0.01。
图10为本发明的牛肝菌肽以及牛肝菌肽衍生物促进角质形成细胞增殖结果示意图。其中,BC:空白对照(HaCaT细胞),PC:阳性对照(10% FBS),与BC相比,*代表P<0.05,**代表P<0.01;F1~F9所代表内容与图2相同。
图11为本发明的牛肝菌肽促进角质形成细胞迁移结果示意图。其中,BC:空白对照(HaCaT细胞),PC:阳性对照(10% FBS),与BC相比,*代表P<0.05,**代表P<0.01。
图12为本发明的牛肝菌肽以及牛肝菌肽衍生物促进角质形成细胞迁移结果示意图。其中,BC:空白对照(HaCaT细胞),PC:阳性对照(10% FBS),与BC相比,*代表P<0.05,**代表P<0.01;F1~F9所代表内容与图2相同。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
除非另外说明,本文所用的所有技术和科学术语和缩略语具有本发明领域或该术语应用领域中普通技术人员通常所理解的含义。虽然本发明实施过程中可使用类似于或等价于本文公开的那些的任何方法、条件、物质或材料,但本文描述了优选的方法、条件物质或材料。
本发明包含多个方面、特征和实施方案,其中这样的多个方面、特征和实施方案可以以任意期望的方式组合和变型。本发明的这些和其它方面、特征和实施方案在参照本发明的其余部分包括如下详细描述时变得显而易见。
除非上下文清楚地指明,如本文所用,单词的单数形式包括复数,反之亦然。因此,“一”、“一个”和“该”通常包括相应术语的复数。例如,“一种牛肝菌肽或其盐”包括所述“牛肝菌肽或其盐”的复数。类似的,术语“例如”,特别是位于一系列术语前面时,仅表示示范性和解释性的,不应被视为是排除性的或综合性的。
本发明有预期地涵盖所有的选择余地、变体和同等物,这些可能如权利要求所定义的那样包含在现有发明领域。所属领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述的方法和物质,这些可以应用于本发明的实践中去。本发明绝非限于方法和物质的描述。
需指出的是,以下若有未特别详细说明之过程,均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂和仪器未注明生产厂商者,视为可以通过市售购买得到的常规产品。
除非特别说明,本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
在一定程度上,具体实施方式和/或权利要求中使用术语“包含”、“包括(including,includes)”和“具有(having,has,with)”或其变体,这些术语意在包括与术语“包含(comprising)”类似的方式。
正如背景技术部分所描述的,随着年龄的增长,皮肤存在着角质层薄弱、紫外线引起的皮肤损伤、皮肤缺水的技术问题,并且功效肽例如蓝铜肽的适用范围有一定的局限性。为了解决上述问题,本发明提供了一种牛肝菌肽、牛肝菌肽盐、或牛肝菌肽衍生物在化妆品中的用途,该牛肝菌肽包含选自由以下组成的组的氨基酸:亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、苯丙氨酸(Phe)、丝氨酸(Ser)和赖氨酸(Lys),其中所述牛肝菌肽衍生物为R1-所述牛肝菌肽-R2,R1是未被取代的或者选自以下的一种:乙酰基(Ac)、棕榈酰基(Pal)和式CH3-(CH2)m-CO-的酰基(m=1~13、15~22);R2是未被取代的或者选自以下的一种:-NH2、-NH-(CH2)x-CH3(x=11~15)、序列为Lys-Arg-Arg-Lys-Arg的肽段、序列为Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg的肽段和序列为Arg-Arg-Arg-Arg的肽段。
根据本发明的另一个方面,提供了一种牛肝菌肽、牛肝菌肽盐、或牛肝菌肽衍生物作为活性组分在皮肤和/或其附属物的非治疗性美容处理中的用途,其特征在于,所述牛肝菌肽包含选自由以下组成的组的氨基酸:亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、苯丙氨酸(Phe)、丝氨酸(Ser)和赖氨酸(Lys),其中所述牛肝菌肽衍生物为R1-所述牛肝菌肽-R2,R1是未被取代的或者选自以下的一种:乙酰基(Ac)、棕榈酰基(Pal)和式CH3-(CH2)m-CO-的酰基(m=1~13、15~22);R2是未被取代的或者选自以下的一种:-NH2、-NH-(CH2)x-CH3(x=11~15)、序列为Lys-Arg-Arg-Lys-Arg的肽段、序列为Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg的肽段和序列为Arg-Arg-Arg-Arg的肽段。
在一种优选的实施方式中,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个亮氨酸(Leu)。
在一种优选的实施方式中,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个异亮氨酸(Ile)。
在一种优选的实施方式中,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个酪氨酸(Tyr)。
在一种优选的实施方式中,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个丙氨酸(Ala)。
在一种优选的实施方式中,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个谷氨酰胺(Gln)。
在一种优选的实施方式中,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个甘氨酸(Gly)。
在一种优选的实施方式中,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个苯丙氨酸(Phe)。
在一种优选的实施方式中,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个丝氨酸(Ser)。
在一种优选的实施方式中,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个赖氨酸(Lys)。
在一种优选的实施方式中,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个Leu-Ile-Tyr的序列。
在一种优选的实施方式中,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个Ile-Tyr-Ala的序列。
在一种优选的实施方式中,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个Tyr-Ala-Gln的序列。
在一种优选的实施方式中,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个Ala-Gln-Gly的序列。
在一种优选的实施方式中,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个Gln-Gly-Phe的序列。
在一种优选的实施方式中,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个Gly-Phe-Ser的序列。
在一种优选的实施方式中,该牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个Phe-Ser-Lys的序列。
在一种优选的实施方式中,该牛肝菌肽包含8~10个氨基酸,例如9个氨基酸。
在一种优选的实施方式中,该牛肝菌肽包含如SEQ ID NO:1所示的Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys的氨基酸序列,可选地为取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,可选地为与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列同一性程度为约88.9%的氨基酸序列。
相较于蓝铜肽,本发明的牛肝菌肽或牛肝菌肽衍生物不会因带电导致较低的渗透性。牛肝菌在食品行业中的相关研究较多,已被充分证明了安全性,目前国内尚没有将国王牛肝菌小分子活性肽应用于化妆品领域。
本发明的SEQ ID NO:1所示的Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys的氨基酸序列来源于商购,或者来源于肽链人工合成。
人工合成方案:将2mmol CTC树脂置于100mL的固相合成反应器中,加入氨基酸4mmol Fmoc-Lys(Boc)-OH,加入20mL DCM,2mL DIEA,在25℃条件下反应3小时,加入3mL甲醇,反应5分钟。过滤,将树脂分别用20mL DCM、甲醇、DMF各洗涤2次。加入20% Pip/DMF溶液20mL,搅拌反应30min,抽滤,除去脱保护液,然后用20mL DMF溶液洗涤6次,抽干待用。
取4mmol Fmoc-Ser(tBu)-OH,4mmol HOBt于50mL烧杯中,降温至2-8℃,加入2mLDMF,4mmolDIC静置反应10-20分钟,将烧杯中溶液加入到固相合成反应器中,搅拌反应1.5小时,反应完成。树脂用DMF溶液洗涤三次,每次20mL。洗涤后,加入20% Pip/DMF溶液20mL,搅拌反应30min,抽滤,除去脱保护液,然后用DMF溶液5mL洗涤6次,抽干待用。依据上述操作,顺序地偶联Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Leu-OH。
然后依次加入5mL甲醇洗涤2次,DCM洗涤2次,甲醇洗涤2次。真空干燥,得到肽树脂H-Leu-Ile-Tyr(tBu)-Ala-Gln(Trt)-Gly-Phe-Ser(tBu)-Lys(Boc)-CTC。
将获得的肽树脂用40mL切割液TFA/茴香硫醚/PhOH/H2O/EDT=87.5/5/2.5/2.5/2.5在30℃下切割2.5小时,将切割液加入到800mL乙醚(2-8℃)溶液中,析出白色固体,离心,得到白色固体粗肽,真空干燥后得到粗肽粉末H-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-OH。
在一种优选的实施方式中,该牛肝菌肽衍生物是通过肽链人工合成而获得的。
在一种优选的实施方式中,该牛肝菌肽衍生物包括以下的一种:
Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH2,
Pal-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH2,
CH3-(CH2)m-CO-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH2(m=1~13、
15~22),
Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH-(CH2)x-CH3
(x=11~15),
Pal-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH-(CH2)x-CH3
(x=11~15),
CH3-(CH2)m-CO-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH-(CH2)x-CH3(m=1~13、15~22,x=11~15),
Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg,
Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Arg-Arg-Arg,
Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg,
Pal-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg,
Pal-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Arg-Arg-Arg,
Pal-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg,
CH3-(CH2)m-CO-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Arg-Arg-Arg(m=1~13、15~22),
CH3-(CH2)m-CO-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg(m=1~13、15~22),和
CH3-(CH2)m-CO-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg(m=1~13、15~22)。
在一种优选的实施方式中,该牛肝菌肽衍生物包括以下的一种:
Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH2,
Pal-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH2,
CH3-(CH2)10-CO-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH2,
Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH-(CH2)13-CH3,
Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Arg-Arg-Arg,
Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg,
Pal-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg,和
CH3-(CH2)16-CO-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Arg-Arg-Arg。
其中,Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Arg-Arg-Arg如SEQ ID NO:2所示;Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg如SEQ ID NO:3所示;Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg如SEQ ID NO:4所示。
在一种优选的实施方式中,该用途包括对皮肤具有保湿的用途、抗皮肤衰老的用途和/或对皮肤具有修复的用途。
在一种优选的实施方式中,该保湿包括促进透明质酸(HA)生成和/或促进水通道蛋白3(AQP3)合成。
其中,透明质酸(HA),也被称为玻尿酸或者透明质酸钠,存在于人体的许多组织和液体中,包括皮肤。透明质酸以其极强的蓄水能力而闻名,能够与水形成氢键而结合大量的水分,形成凝胶状基质,可吸收并锁住多达自身1000倍的水分,是整个皮肤重要的水分储存库,对于保持皮肤的水分非常有效。除此以外,透明质酸也有改善皮肤细纹和皱纹的功效,通过补充皮肤的水分,可以帮助皮肤完善并保持其结构,从而让皮肤看起来更加饱满,减轻细纹和皱纹;水通道蛋白3(AQP3)在皮肤保湿中起着至关重要的作用。AQP3是一种特殊的跨膜蛋白,大部分位于表皮基底层和棘层,主要负责调节和控制水分子和甘油在细胞之间的运输,功能是帮助维持皮肤的水分平衡。它可以将水分子从体内传输到表皮,促进角质层的水合作用,从而帮助维持皮肤的湿润度,防止皮肤干燥和脱皮。此外,AQP3还可以帮助维持皮肤的屏障功能。皮肤的屏障功能是防止水分流失和外界有害物质侵入的重要机制。AQP3通过调节皮肤细胞内外的水分平衡,可以帮助维持皮肤屏障的完整性,从而保护皮肤免受外界环境的伤害。
在一种优选的实施方式中,该抗皮肤衰老包括抑制紫外线照射下基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的生成和/或在紫外线照射下保护皮肤成纤维细胞生成的Ⅰ型胶原蛋白。
其中,紫外线照射会引发皮肤细胞产生过多的基质金属蛋白酶MMP-1,这导致胶原蛋白的降解,加速皮肤老化和皱纹的形成。本发明的包含如SEQ ID NO:1所示的Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys的氨基酸序列或该氨基酸序列的衍生物的应用能够抑制紫外线照射下MMP-1的生成,可防止胶原蛋白被酶解;直接测试I型胶原含量也证明了可以保护皮肤的胶原蛋白,从而预防皮肤老化和皱纹的形成,解决紫外线照射引起的皮肤皱纹产生的技术问题。
在一种优选的实施方式中,该修复为促进角质形成细胞增殖和/或迁移。
其中,皮肤细胞的增殖和迁移是角质形成的关键过程。然而,由于年龄、环境因素以及其他因素的影响,皮肤常常会出现角质层薄弱的问题。本发明的包含如SEQ ID NO:1所示的Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys的氨基酸序列或该氨基酸序列的衍生物的应用能够刺激皮肤细胞的增殖和迁移,从而促进角质层的形成和加厚,修复角质层屏障,解决角质层薄弱的技术问题。由于角质层的厚度和健康状况也会影响皮肤的保湿能力。该多肽通过促进角质形成细胞的增殖和迁移,可以侧面帮助维护皮肤的保湿能力,缓解皮肤干燥等问题。
在一种优选的实施方式中,该美容处理包括抑制皮肤松弛、使皮肤保持紧致、改善皮肤的干燥、改善皮肤的脱皮、改善皮肤的角质层薄弱、减轻皮肤细纹、减轻皮肤皱纹和/或预防皮肤老化。
根据本发明的另一个方面,提供了一种包含牛肝菌肽、牛肝菌肽盐、或牛肝菌肽衍生物的化妆品组合物在皮肤和/或其附属物的非治疗性美容处理中的用途,其特征在于,以所述化妆品组合物的总重量计,所述牛肝菌肽、牛肝菌肽盐、或牛肝菌肽衍生物的重量范围为0.000001%~10%,优选地0.000001%~5%,例如0.000001%~1%,其中所述牛肝菌肽包含选自由以下组成的组的氨基酸:亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、苯丙氨酸(Phe)、丝氨酸(Ser)和赖氨酸(Lys),其中所述牛肝菌肽衍生物为R1-所述牛肝菌肽-R2,R1是未被取代的或者选自以下的一种:乙酰基(Ac)、棕榈酰基(Pal)和式CH3-(CH2)m-CO-的酰基(m=1~13、15~22);R2是未被取代的或者选自以下的一种:-NH2、-NH-(CH2)x-CH3(x=11~15)、序列为Lys-Arg-Arg-Lys-Arg的肽段、序列为Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg的肽段和序列为Arg-Arg-Arg-Arg的肽段。
在一种优选的实施方式中,该化妆品组合物进一步包含用于增强所述牛肝菌肽的效果的活性剂。
在一种优选的实施方式中,该活性剂选自以下的一种或多种:肽类、维生素C及其衍生物、来自于B族的维生素类、脱氢表雄甾酮(DHEA)、植物甾醇类、水杨酸及其衍生物、类视黄醇类、类黄酮类、氨基糖类、唑类和金属盐类。
在一种优选的实施方式中,该化妆品组合物进一步包含化妆品用辅料。
在一种优选的实施方式中,该化妆品用辅料选自以下的一种或多种:增稠剂、表面活性剂、助表面活性剂、皮肤调理剂、防腐剂、香精、润滑剂、崩解剂、湿润剂、粘合剂和填充剂。
根据本发明的另一个方面,提供了一种改善皮肤的美学外观的方法,其特征在于,所述方法包括局部应用有效量的包含牛肝菌肽、牛肝菌肽盐、或牛肝菌肽衍生物的化妆品组合物,以所述化妆品组合物的总重量计,所述牛肝菌肽、牛肝菌肽盐、或牛肝菌肽衍生物的重量范围为0.000001%~10%,优选地0.000001%~5%,例如0.000001%~1%,其中所述牛肝菌肽包含选自由以下组成的组的氨基酸:亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、苯丙氨酸(Phe)、丝氨酸(Ser)和赖氨酸(Lys),其中所述牛肝菌肽衍生物为R1-所述牛肝菌肽-R2,R1是未被取代的或者选自以下的一种:乙酰基(Ac)、棕榈酰基(Pal)和式CH3-(CH2)m-CO-的酰基(m=1~13、15~22);R2是未被取代的或者选自以下的一种:-NH2、-NH-(CH2)x-CH3(x=11~15)、序列为Lys-Arg-Arg-Lys-Arg的肽段、序列为Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg的肽段和序列为Arg-Arg-Arg-Arg的肽段。
“有效”量取决于多种因素,例如年龄,状况的严重程度以及施用的方式。有效量是指足以实现所需效果的无毒量。
根据本发明的组合物可以应用于身体的所有部分,并且更具体地根据适应症推荐的,应用于面部、身体、领口或头皮上,在本领域技术人员已知的任何形式或媒介物中,特别是以溶液、分散液、乳剂、糊剂或粉末的形式,单独地或以预混合的或者单独运输或与载体(例如大胶囊、微胶囊或纳米胶囊,大球、微球或纳米球,脂质体,油体或乳糜微粒,大颗粒、微粒或纳米颗粒,大海绵、微海绵或纳米海绵,微乳液或纳米乳液,或吸附在粉状有机聚合物、滑石、膨润土、孢子或外壁以及其他矿物或有机运载体上)预混合。
特别是在化妆品中,尤其可以提出在面部,身体,头发和头皮的皮肤护理范围以及在化妆护理范围中的应用。
通常,根据本发明的牛肝菌肽可以以任何形式,以结合形式、掺入或吸附在大颗粒、微颗粒和纳米颗粒上或者大胶囊、微胶囊和纳米胶囊上,用于处理纺织品、天然或合成纤维、羊毛以及任何打算与皮肤接触并且可用于服装、内衣(白天或黑夜)、手帕或纸巾(tissues)中的材料,以通过这种皮肤/纺织品接触发挥其美容或治疗性作用并允许连续局部递送。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提到的上述特征,或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用,说明书中所揭示的各个特征,可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明,所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
实施例
制备实施例
制备实施例1H-Leu-Ile-Tyr(tBu)-Ala-Gln(Trt)-Gly-Phe-Ser(tBu)-Lys(Boc)-CTC肽树脂的合成与制备
根据现有技术中已知的描述的通用方案:将CTC树脂(1.78g,2mmol)置于100mL的固相合成反应器中,加入氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH(1.88g,4mmol),加入二氯甲烷(DCM)20mL,在加入DIEA(2.0mL),25℃条件下反应3小时,加入甲醇3mL,反应5分钟。过滤,将树脂用二氯甲烷(DCM)20mL洗涤2次,甲醇20mL洗涤2次,DMF20mL洗涤2次。
加入20% Pip/DMF溶液20mL,搅拌反应30min,抽滤,除去脱保护液,然后用DMF溶液20mL洗涤6次,抽干待用。
取Fmoc-Ser(tBu)-OH(1.52g,4mmol),HOBt(0.56g,4mmol)于50mL烧杯中,降温至2-8℃,加入DMF溶液2mL,DIC(0.63mL,4mmol)静置反应10-20分钟,并将50mL烧杯中溶液加入到100mL固相合成反应器中,搅拌反应1.5小时,反应完成。树脂用DMF溶液洗涤三次,每次20mL。洗涤完成后,进行下一步反应。
加入20% Pip/DMF溶液20mL,搅拌反应30min,抽滤,除去脱保护液,然后用DMF溶液5mL洗涤6次,抽干待用。
按照所描述的方案,每次偶联中存在0.56g HOBt(4mmol),2mL DMF溶液,0.64mLDIC(4mmol),并且每次偶联后都如一般方法中所描述,洗涤该树脂并且重复Fmoc基团的脱保护处理以便偶联以下氨基酸的情况下,顺序地偶联Fmoc-Phe-OH(1.56g,4mmol),Fmoc-Gly-OH(1.20g,4mmol),Fmoc-Gln(Trt)-OH(2.44g,4mmol),Fmoc-Ala-OH(1.24g,4mmol),Fmoc-Tyr(tBu)-OH(1.64g,4mmol),Fmoc-Ile-OH(1.50g,4mmol),Fmoc-Leu-OH(1.41g,4mmol);
每次反应合成、洗涤后,加入20% Pip/DMF溶液5mL,搅拌反应30min,抽滤,除去脱保护液,然后用DMF溶液5mL洗涤6次,抽干待用。
然后加入甲醇5mL洗涤2次,DCM溶液5mL洗涤2次,甲醇5mL洗涤2次。真空干燥,得到H-Leu-Ile-Tyr(tBu)-Ala-Gln(Trt)-Gly-Phe-Ser(tBu)-Lys(Boc)-CTC树脂的肽树脂。
制备实施例2用于将R1基团引入至实施例1中所获得的肽树脂上的方法
(1)用于将R1乙酰基基团引入肽树脂上的方法
配置25mL溶液(Ac2O:DMF:DIEA=10:84:6)加入到100mL固相合成反应器中,搅拌反应0.5小时,反应完成。树脂用DMF溶液洗涤三次,每次20mL。洗涤完成后,进行下一步反应。然后加入甲醇20mL洗涤2次,DCM溶液20mL洗涤2次,甲醇20mL洗涤2次。真空干燥,得到Ac-Leu-Ile-Tyr(tBu)-Ala-Gln(Trt)-Gly-Phe-Ser(tBu)-Lys(Boc)-CTC树脂的肽树脂。
(2)用于将R1棕榈酰基基团引入肽树脂上的方法
取Palmitic acid(1.04g,4mmol),HOBt(0.56g,4mmol)于25mL容器中,降温至2-8℃,加入DMF溶液8mL,加入DIEA(0.68mL,4mmol),DIC(0.64mL,4mmol)静置反应10-20分钟,并将25mL容器中溶液加入到100mL固相合成反应器中,搅拌反应1.5小时,反应完成。树脂用DMF溶液洗涤三次,每次20mL。洗涤完成后,进行下一步反应。然后加入甲醇20mL洗涤2次,DCM溶液20mL洗涤2次,甲醇20mL洗涤2次。真空干燥,得到Pal-Leu-Ile-Tyr(tBu)-Ala-Gln(Trt)-Gly-Phe-Ser(tBu)-Lys(Boc)-CTC树脂的肽树脂。
(3)用于将R1 CH3-(CH2)-m-CO基团引入肽树脂上的方法
取CH3-(CH2)10-COOH(0.80g,4mmol)或CH3-(CH2)16-COOH(1.12g,4mmol),HOBt(0.56g,4mmol)于25mL容器中,降温至2-8℃,加入DMF溶液8mL,加入DIEA(0.68mL,4mmol),DIC(0.64mL,1mmol)静置反应10-20分钟,并将25mL容器中溶液加入到100mL固相合成反应器中,搅拌反应1.5小时,反应完成。树脂用DMF溶液洗涤三次,每次20mL。洗涤完成后,进行下一步反应。
然后加入甲醇20mL洗涤2次,DCM溶液20mL洗涤2次,甲醇20mL洗涤2次。真空干燥,得到CH3-(CH2)10-CO-Leu-Ile-Tyr(tBu)-Ala-Gln(Trt)-Gly-Phe-Ser(tBu)-Lys(Boc)-CTC树脂或得到CH3-(CH2)16-CO-Leu-Ile-Tyr(tBu)-Ala-Gln(Trt)-Gly-Phe-Ser(tBu)-Lys(Boc)-CTC树脂的肽树脂。按照所描述的方案,被引入的R1也可以是CH3-(CH2)8-CO-,CH3-(CH2)12-CO-,CH3-(CH2)18-CO-,CH3-(CH2)20-CO-。
制备实施例3制备实施例1、2中所获得的肽树脂从聚合物支撑体上裂解的方法。
将制备实施例1中所获得的肽树脂用40mL TFA/茴香硫醚/PhOH/H2O/EDT=87.5/5/2.5/2.5/2.5在30℃下切割2.5小时,将切割液加入到800mL乙醚(2-8℃)溶液中,析出白色固体,离心,得到白色固体粗肽。将白色固体粗肽在真空干燥下干燥得到粗肽粉末H-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-OH(1.46g),收率72.3%。
将制备实施例2中所获得的肽树脂用40mL TFA/茴香硫醚/PhOH/H2O/EDT=87.5/5/2.5/2.5/2.5在30℃下切割2.5小时,将切割液加入到800mL乙醚(2-8℃)溶液中,析出白色固体,离心,得到白色固体粗肽。将白色固体粗肽在真空干燥下干燥得到粗肽粉末Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-OH(1.54g),收率71.9%;Pal-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-OH(1.90g),收率76.1%;CH3-(CH2)10-CO-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-OH(1.70g),收率71.0%;CH3-(CH2)16-CO-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-OH(1.86g)收率72.2%。
制备实施例4制备实施例1、2中所获得的肽树脂从聚合物支撑体上裂解并将R2基团引入所获得的肽上的方法。
将制备实施例2中所获得的肽树脂Ac-Leu-Ile-Tyr(tBu)-Ala-Gln(Trt)-Gly-Phe-Ser(tBu)-Lys(Boc)-CTC用40mL 30%TFE/DCM 30℃切割0.5小时,将树脂过滤,滤液旋干,得到全保护多肽Ac-Leu-Ile-Tyr(tBu)-Ala-Gln(Trt)-Gly-Phe-Ser(tBu)-Lys(Boc)-OH 2.50g,收率81.9%。称取Ac-Leu-Ile-Tyr(tBu)-Ala-Gln(Trt)-Gly-Phe-Ser(tBu)-Lys(Boc)-OH(2g),用DMF溶液,加入十二胺(0.24g)、或者十四胺(0.27g)、或者十六胺(0.31g),HOBT(0.17g),冰浴降温至0℃,滴加DIC(0.16g),NMM(0.13g),滴加完毕后控温25℃搅拌2小时,TLC点板反应完全,反应液直接旋干得到Ac-Leu-Ile-Tyr(tBu)-Ala-Gln(Trt)-Gly-Phe-Ser(tBu)-Lys(Boc)-NH-(CH2)11-CH3(1.96g)旋干后的中间体加入95% TFA与5%H2O(22mL),控温30摄氏度,搅拌2小时,MS检测反应完全,将反应液一边搅拌一边缓慢倒入-20℃甲基叔丁基醚中(220mL),析出白色固体,沉降离心洗涤3次,固体烘干得到Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH-(CH2)11-CH3(1.04g),收率72.4%、或者Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH-(CH2)13-CH3(0.94g),收率64.5%、或者Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH-(CH2)15-CH3(1.12g),收率74.6%。
按照所描述的方案,制备实施例1、2中所获得的肽树脂同样可以引入选自-NH-(CH2)11-CH3、-NH-(CH2)13-CH3以及-NH-(CH2)15-CH3的R2基团。
制备实施例5R1-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH2的合成与制备的方法,其中R1选自H-、乙酰基、棕榈酰基、CH3-(CH2)m-CO-。
以Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH2的合成和制备为例:
根据现有技术中已知的描述的通用方案:将AM树脂(0.53g,0.5mmol)置于25mL的固相合成反应器中,加入20%Pip/DMF溶液5mL,搅拌反应30min,抽滤,除去脱保护液,然后用DMF溶液5mL洗涤6次,抽干待用。
取Fmoc-Linker(0.54g,1mmol),HOBt(0.14g,1mmol)于10mL容器中,降温至2-8℃,加入DMF溶液2mL,DIC(0.16mL,1mmol)静置反应10-20分钟,并将10mL容器中溶液加入到25mL固相合成反应器中,搅拌反应1.5小时,反应完成。树脂用DMF溶液洗涤三次,每次5mL。洗涤完成后,进行下一步反应。
加入20%Pip/DMF溶液5mL,搅拌反应30min,抽滤,除去脱保护液,然后用DMF溶液5mL洗涤6次,抽干待用。
取Fmoc-Lys(Boc)-OH(0.47g,1mmol),HOBt(0.14g,1mmol)于10mL容器中,降温至2-8℃,加入DMF溶液2mL,DIC(0.16mL,1mmol)静置反应10-20分钟,并将10mL容器中溶液加入到25mL固相合成反应器中,搅拌反应1.5小时,反应完成。树脂用DMF溶液洗涤三次,每次5mL。洗涤完成后,进行下一步反应。
加入20%Pip/DMF溶液5mL,搅拌反应30min,抽滤,除去脱保护液,然后用DMF溶液5mL洗涤6次,抽干待用。
按照所描述的方案,每次偶联中存在0.14g HOBt(1mmol),2mL DMF溶液,0.16mLDIC(1mmol),并且每次偶联后都如一般方法中所描述,洗涤该树脂并且重复Fmoc基团的脱保护处理以便偶联以下氨基酸的情况下,顺序地偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH(0.38g,1mmol),Fmoc-Phe-OH(0.39g,1mmol),Fmoc-Gly-OH(0.30g,1mmol),Fmoc-Gln(Trt)-OH(0.61g,1mmol),Fmoc-Ala-OH(0.31g,1mmol),Fmoc-Tyr(tBu)-OH(0.46g,1mmol),Fmoc-Ile-OH(0.35g,1mmol),Fmoc-Leu-OH(0.35g,1mmol);
每次反应合成、洗涤后,加入20%Pip/DMF溶液5mL,搅拌反应30min,抽滤,除去脱保护液,然后用DMF溶液5mL洗涤6次,抽干待用。
配置5mL溶液(Ac2O:DMF:DIEA=10:84:6)加入到25mL固相合成反应器中,搅拌反应0.5小时,反应完成。树脂用DMF溶液洗涤三次,每次5mL。洗涤完成后,进行下一步反应。
然后加入甲醇5mL洗涤2次,DCM溶液5mL洗涤2次,甲醇5mL洗涤2次。真空干燥,得到Ac-Leu-Ile-Tyr(tBu)-Ala-Gln(Trt)-Gly-Phe-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Linker-AM树脂的肽树脂。
将上述肽树脂用TFA/茴香硫醚/PhOH/H2O/EDT=87.5/5/2.5/2.5/2.5(20mL)切割2.5小时,将切割液加入到200mL乙醚(2-8℃)溶液中,析出白色固体,离心,得到白色固体粗肽。将白色固体粗肽在真空干燥下干燥得到粗肽粉末Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH2(0.39g),收率72.8%。
R1选自H-、乙酰基、棕榈酰基、CH3-(CH2)m-CO-。调整所描述的方案中加入溶液(Ac2O:DMF:DIEA=10:84:6)反应的部分,可以引入选自H-、Pal-、CH3-(CH2)m-CO-的R1基团。
制备实施例6R1-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-R2的合成与制备的方法,其中R1选自H-、乙酰基、棕榈酰基、CH3-(CH2)m-CO-。R2选自-KRRKR、-RKRRKR或-RRRR。其中,Lys-Arg-Arg-Lys-Arg为KRRKR;Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg为RKRRKR;Arg-Arg-Arg-Arg为RRRR。
以Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-KRRKR的合成与制备为例
根据现有技术中已知的描述的通用方案:将Wang树脂(0.52g,0.625mmol)置于25mL的固相合成反应器中,加入氨基酸Fmoc-Arg(pbf)-OH(0.81g,1.25mmol),加入二氯甲烷(DCM)5mL,在加入吡啶(0.4mL),DBU(0.36mL),25℃条件下反应3小时,抽滤,用DMF溶液5mL洗涤3次,加入封端液(Ac2O:DMF:DIEA=10:84:6)5mL反应15min。过滤,将树脂用二氯甲烷(DCM)5mL洗涤2次,甲醇5mL洗涤2次,DMF5mL洗涤2次。
加入20% Pip/DMF溶液5mL,搅拌反应30min,抽滤,除去脱保护液,然后用DMF溶液5mL洗涤6次,抽干待用。
取Fmoc-Lys(Boc)-OH(0.47g,1mmol),HOBt(0.14g,1mmol)于10mL容器中,降温至2-8℃,加入DMF溶液2mL,DIC(0.16mL,1mmol)静置反应10-20分钟,并将10mL容器中溶液加入到25mL固相合成反应器中,搅拌反应1.5小时,反应完成。树脂用DMF溶液洗涤三次,每次5mL。洗涤完成后,进行下一步反应。
加入20%Pip/DMF溶液5mL,搅拌反应30min,抽滤,除去脱保护液,然后用DMF溶液5mL洗涤6次,抽干待用。
按照所描述的方案,每次偶联中存在0.14g HOBt(1mmol),2mL DMF溶液,0.16mLDIC(1mmol),并且每次偶联后都如一般方法中所描述,洗涤该树脂并且重复Fmoc基团的脱保护处理以便偶联以下氨基酸的情况下,顺序地偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH(0.65g,1mmol),Fmoc-Arg(Pbf)-OH(0.65g,1mmol),Fmoc-Lys(Boc)-OH(0.47g,1mmol),Fmoc-Ser(tBu)-OH(0.38g,1mmol),Fmoc-Phe-OH(0.39g,1mmol),Fmoc-Gly-OH(0.30g,1mmol),Fmoc-Gln(Trt)-OH(0.61g,1mmol),Fmoc-Ala-OH(0.31g,1mmol),Fmoc-Tyr(tBu)-OH(0.46g,1mmol),Fmoc-Ile-OH(0.35g,1mmol),Fmoc-Leu-OH(0.35g,1mmol)。
每次反应合成、洗涤后,加入20% Pip/DMF溶液5mL,搅拌反应30min,抽滤,除去脱保护液,然后用DMF溶液5mL洗涤6次,抽干待用。
配置5mL溶液(Ac2O:DMF:DIEA=10:84:6)加入到25mL固相合成反应器中,搅拌反应0.5小时,反应完成。树脂用DMF溶液洗涤三次,每次5mL。洗涤完成后,进行下一步反应。
然后加入甲醇5mL洗涤2次,DCM溶液5mL洗涤2次,甲醇5mL洗涤2次。真空干燥,得到Ac-Leu-Ile-Tyr(tBu)-Ala-Gln(Trt)-Gly-Phe-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Wang树脂的肽树脂。
将上述肽树脂用TFA/茴香硫醚/PhOH/H2O/EDT=87.5/5/2.5/2.5/2.5(25mL)切割2.5小时,将切割液加入到250mL乙醚(2-8℃)溶液中,析出白色固体,离心,得到白色固体粗肽。将白色固体粗肽在真空干燥下干燥得到粗肽粉末Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg-OH(0.68g),收率76.8%。
R1选自H-、乙酰基、棕榈酰基、CH3-(CH2)m-CO-。调整所描述的方案中加入溶液(Ac2O:DMF:DIEA=10:84:6)反应的部分,可以引入选自H-、Pal-、CH3-(CH2)m-CO-的R1基团。
R2选自-KRRKR、-RKRRKR或-RRRR。调整所描述的方案中偶联氨基酸的顺序,可以引入选自-KRRKR、-RKRRKR、-RRRR的R2基团。
药效实施例
1、促进透明质酸(HA)合成(保湿)---透明质酸含量测定
1.1、实验仪器与试剂
酶标仪、涡旋混合器、细胞计数仪、荧光倒置显微镜、低速离心机等仪器。
DMEM培养液、胰酶、PBS、牛血清、二甲基亚砜、ELISA检测试剂盒、TGF-β1、bFGF等试剂。
1.2、实验方法
样品制备:细胞消化、接种、实验设置空白对照组、阳性对照组与样品组。配置不同浓度的样品溶液。其中,称取5mg的纯度>95%的牛肝菌肽样品粉末,溶于10mL去离子水中,配制成0.5mg/mL的样品溶液,再用去离子水分别稀释至0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.001mg/mL浓度。
给药:弃掉24孔板中的培养液,开展给药操作。样品组加入含有样品的培养液,阳性对照组需要加入含有阳性对照的培养液,空白对照组加入细胞培养液,每孔1mL。给药完毕后将24孔板放置在培养箱中培养。细胞上清收集。
标准品制备:按照试剂盒的说明,制备HA的标准品。标准品会用于建立HA含量与吸光值之间的标准曲线。
样品加载:在预先包被HA抗体的微孔板孔中,添加待测样品和标准品。通常以重复对照做多次实验。
孵育:按照试剂盒说明进行孵育,过程中HA抗原与微孔板上的抗体结合,形成抗原-抗体复合物。
洗板:利用洗涤液洗去未结合的物质,以减少背景干扰。加入酶标二抗:将带有酶标签的二抗添加到每个孔中,该二抗可以与原样品中的HA结合。
再次孵育和洗板:将微孔板在适当温度孵育一段时间后,再次用洗涤液洗去未结合的酶标二抗。
加入底物:添加底物,使其与酶标签物发生反应,形成可见的色谱。底物的颜色变化与抗原浓度成正相关关系。
终止反应:加入终止液,使反应停止,减少误差。
酶标读数:使用酶标仪度量每个微孔的光吸收值。通过比较吸光值与标准曲线,即可计算出样品中HA的含量。
1.3、实验结果
如图1所示,与BC组相比,PC组HaCaT细胞分泌的HA含量显著提升,说明实验体系有效。与BC组相比,本发明的如SEQ ID NO:1所示的Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys的氨基酸序列在0.05mg/mL、0.1mg/mL浓度下HaCaT细胞分泌的HA含量均提高,表示该牛肝菌肽具有促进透明质酸合成能力,从而证明该牛肝菌肽具有保湿功效。
如图2所示,与BC组相比,PC组HaCaT细胞分泌的HA含量显著提升,说明实验体系有效。与BC组相比,本发明的如SEQ ID NO:1所示的Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys的氨基酸序列以及衍生物在0.05mg/mL浓度下HaCaT细胞分泌的HA含量均提高、在相同浓度下加入牛肝菌肽衍生物时HA含量更高,表示该牛肝菌肽的衍生物具有更优秀的促进透明质酸合成能力,从而证明该牛肝菌肽衍生物具有更强的保湿功效。
2、促进水通道蛋白3(AQP3)合成(保湿)---水通道蛋白3含量测定
2.1、实验仪器与试剂
PCR实验仪器、毛细管电泳仪器、蛋白免疫印迹设备、荧光倒置显微镜、低速离心机等仪器。
DMEM培养液、免疫印迹试剂、PBS、牛血清、二甲基亚砜、免疫荧光染色试剂、CaCl2等试剂。
2.2、实验方法
细胞接种:接种细胞至24孔板,培养箱(37℃、5%CO2)中孵育过夜;配液:配置受试物工作液;加入受试物:在培养箱(37℃,5%CO2)中培养24h后,加入受试物,继续培养24h;收样:弃去上清,PBS润洗细胞3遍;免疫荧光染色:加入甲醇固定细胞,用PBS润洗3遍,每孔再加1mL BSA封闭1h;弃掉封闭液,每孔加一抗,放入4℃冰箱过夜。弃去一抗,用PBS润洗3遍;每孔加二抗,作用2小时,弃去二抗,用PBS润洗3遍;每孔加入DAPI进行核染,作用10min,弃去DAPI,用PBS润洗3遍,然后利用荧光显微镜进行拍照;结果分析:利用Image Pro Plus软件对AQP3荧光强度进行定量分析。
2.3、实验结果
如图3所示,与BC组相比,PC组中,HaCaT细胞所合成的AQP3经检测发现相对荧光强度显著提升,说明实验体系有效。与BC组相比,本发明的如SEQ ID NO:1所示的Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys的氨基酸序列在0.05mg/mL、0.1mg/mL浓度下荧光强度提升,表示该牛肝菌肽具有促进AQP3蛋白合成能力,从而证明该牛肝菌肽具有保湿功效。
如图4所示,与BC组相比,PC组中,HaCaT细胞所合成的AQP3经检测发现相对荧光强度显著提升,说明实验体系有效。与BC组相比,本发明的如SEQ ID NO:1所示的Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys的氨基酸序列以及衍生物在0.05mg/mL浓度下荧光强度提升、在相同浓度下加入牛肝菌肽衍生物时荧光强度更高,表示该牛肝菌肽的衍生物具有更优秀的促进AQP3蛋白合成能力,从而证明该牛肝菌肽衍生物具有更强的保湿功效。
3、保护Ⅰ型胶原蛋白(UVA)(抗衰)---UVA刺激成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白含量测定
3.1、实验仪器与试剂
可调节式移液枪、CO2培养箱、酶标仪、生物安全柜、微量振荡器、分析天平、恒温培养箱、细胞计数仪、超低温冰箱(-80℃)、倒置显微镜、低速离心机等仪器。
DMEM培养液、牛血清、PBS、二甲基亚砜、ELISA检测试剂盒、I型胶原蛋白一抗、二抗、TGF-β1等试剂。
3.2、实验方法
Ⅰ型胶原蛋白含量的测定采用酶联免疫方法(ELISA),开展Ⅰ型胶原蛋白含量检测,具体原理为:Ⅰ型胶原与包被在酶标板上的胶原蛋白抗体特异性结合后,与带有底物标记的抗体结合,底物被酶催化后,生成有色产物,Ⅰ型胶原蛋白含量与有色产物颜色的深浅呈正相关。用酶标仪450nm波长下测定吸光度(OD值),计算Ⅰ型胶原蛋白含量。
3.3、实验结果
如图5所示,与BC组相比,NC组Ⅰ型胶原含量显著降低,PC组Ⅰ型胶原含量显著提升,说明实验体系有效。与NC组相比,本发明的如SEQ ID NO:1所示的Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys的氨基酸序列在0.05mg/mL、0.1mg/mL浓度下Ⅰ型胶原含量提升,表示该牛肝菌肽具有保护并促进细胞I型胶原再生的能力,从而证明该牛肝菌肽具有抗皱功效。
如图6所示,与BC组相比,NC组Ⅰ型胶原含量显著降低,PC组Ⅰ型胶原含量显著提升,说明实验体系有效。与NC组相比,本发明的如SEQ ID NO:1所示的Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys的氨基酸序列以及衍生物在0.05mg/mL浓度下Ⅰ型胶原含量提升、在相同浓度下加入牛肝菌肽衍生物时Ⅰ型胶原含量提升更多,表示该牛肝菌肽的衍生物具有更优秀的保护并促进细胞I型胶原再生的能力,从而证明该牛肝菌肽衍生物具有更强的抗皱功效。
4、抑制MMP-1合成(UVA)(抗衰)---UVA刺激成纤维细胞MMP-1含量测定
4.1、实验仪器与试剂
可调节式移液枪、CO2培养箱、酶标仪、生物安全柜、微量振荡器、分析天平、恒温培养箱、细胞计数仪、超低温冰箱(-80℃)、倒置显微镜、低速离心机等仪器。
DMEM培养液、牛血清、PBS、二甲基亚砜、ELISA检测试剂盒、VC、VE等试剂。
4.2、实验方法
样品制备:取待测样品(如细胞培养基、血清、组织溶液等)进行适当稀释。如果是实验室制备的样品,处理过程中可能需要将样品稀释到合适的浓度范围内。样品加载:在预先包被有MMP-1抗体的微孔板上,逐孔加入样品以及对照品,并在37℃恒温孵育。这个过程中,抗体会与样品中的MMP-1抗原结合。洗板:利用洗涤液洗去未结合的物质,减少背景干扰。加入酶标二抗:通常用于ELISA的酶标二抗是带有酶标签的抗体,它可以与原样品中的MMP-1结合。再次孵育和洗板:将微孔板在37℃恒温孵育一段时间后,再次用洗涤液洗去未结合的酶标二抗。加入底物:酶标记的底物与酶反应产生可见的色谱。通常,底物的颜色变深表示抗原浓度更高。终止反应:加入反应终止液以停止反应过程。酶标读数:使用酶标仪对每个微孔进行读数。测量的光吸收值可以表示每个样品中的MMP-1水平。
4.3、实验结果
如图7所示,与BC组相比,NC组MMP-1含量显著提升,PC组MMP-1含量显著降低,说明实验体系有效。与NC组相比,本发明的如SEQ ID NO:1所示的Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys的氨基酸序列在0.05mg/mL浓度下MMP-1含量降低、在0.1mg/mL浓度下MMP-1含量显著降低,表示该牛肝菌肽具有抑制MMP-1生成的能力,也证明了该牛肝菌肽具有一定的抗皱功效。
如图8所示,与BC组相比,NC组MMP-1含量显著提升,PC组MMP-1含量显著降低,说明实验体系有效。与NC组相比,本发明的如SEQ ID NO:1所示的Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys的氨基酸序列以及衍生物在0.05mg/mL浓度下MMP-1含量降低、在相同浓度下加入牛肝菌肽衍生物时MMP-1含量降低更明显,表示该牛肝菌肽的衍生物具有更优秀的抑制MMP-1生成的能力,从而证明该牛肝菌肽衍生物具有更强的抗皱功效。
5、促进角质形成细胞增殖(修复)---角质形成细胞增殖测定
5.1、实验仪器与试剂
培养箱、超净工作台、显微镜、MTT检测仪、高速离心机等仪器。
DMEM培养液、MTT试剂、PBS、牛血清、二甲基亚砜、FBS等试剂。
5.2、方法:
细胞培养:将角质形成细胞在适合其生长的培养基中培养;添加样品:在细胞增殖到适当的密度后,添加不同浓度的样品进行处理;测定细胞增殖:使用CCK-8或MTT方法测定样品处理后的角质形成细胞增殖情况,通常在设定的时间点(如24小时、48小时等)后加入CCK-8或MTT试剂,经过一段时间的培养,利用光度计读取吸光值,按照公式计算出细胞增殖情况;数据分析:将所有数据进行统计分析,得出样品对角质形成细胞增殖的影响情况。
5.3、结果
如图9所示,与BC组相比,PC组细胞活力显著提升,说明实验体系有效。与BC组相比,本发明的如SEQ ID NO:1所示的Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys的氨基酸序列在0.05mg/mL、0.1mg/mL浓度下细胞活力提升,表示该牛肝菌肽有促进角质形成细胞增殖的能力,从而证明该牛肝菌肽有一定的修复功效。
如图10所示,与BC组相比,PC组细胞活力显著提升,说明实验体系有效。与BC组相比,本发明的如SEQ ID NO:1所示的Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys的氨基酸序列以及衍生物在0.05mg/mL浓度下细胞活力显著提升、在相同浓度下加入牛肝菌肽衍生物时细胞活力提升更明显,表示该牛肝菌肽的衍生物具有更优秀的促进角质形成细胞增殖的能力,从而证明该牛肝菌肽衍生物具有更强的修复功效。
6、促进角质形成细胞迁移(修复)---角质形成细胞迁移测定
6.1、实验仪器与试剂
培养箱、超净工作台、显微镜、MTT检测仪、高速离心机等仪器。
DMEM培养液、MTT试剂、PBS、牛血清、二甲基亚砜、FBS等试剂。
6.2、实验方法
刮痕试验:该试验通过在细胞单层培养中创建一个“刮痕”或裸露的区域,并随后观察细胞迁移到该区域的速度来评估细胞迁移。转移能力实验:使用Boyden Chamber设备进行。细胞被置于设备的一个室中,而样品被放在另一个室中。设备的两个室之间有一个具有微孔的膜将其隔开,然后观察细胞是否可以通过迁移到样品的位置。数据统计:使用图像分析系统,通过数字化技术对比处理组和对照组的图片,评估细胞迁移的情况。
6.3、实验结果
如图11所示,与BC组相比,PC组愈合率显著提升,说明实验体系有效。与BC组相比,本发明的如SEQ ID NO:1所示的Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys的氨基酸序列在0.001mg/mL、0.05mg/mL浓度下愈合率提升、在0.1mg/mL浓度下愈合率显著提升,表示该牛肝菌肽有促进角质形成细胞迁移的能力,从而证明该牛肝菌肽有一定的修复功效。
图12所示,与BC组相比,PC组愈合率显著提升,说明实验体系有效。与BC组相比,本发明的如SEQ ID NO:1所示的Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys的氨基酸序列以及衍生物在0.05mg/mL浓度下愈合率提升、在相同浓度下加入牛肝菌肽衍生物时愈合率提升提升更多,表示该牛肝菌肽的衍生物具有更优秀的促进角质形成细胞迁移的能力,从而证明该牛肝菌肽衍生物具有更强的修复功效。
此外,与Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys相比较,Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Arg-Arg-Arg在促进AQP3合成,抑制MMP1生成,促进角质细胞增殖,角质细胞迁移方面,具有P值差异(P<0.05);与Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys相比较,CH3-(CH2)16-CO-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Arg-Arg-Arg在促进AQP3合成,抑制MMP1生成,促进角质细胞迁移方面,具有P值差异(P<0.05)。
以上对本发明实施例进行了详细介绍,本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述,以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。同时,本领域技术人员依据本发明的思想,基于本发明的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处,都属于本发明保护的范围。综上所述,本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (10)
1.一种牛肝菌肽、牛肝菌肽盐、或牛肝菌肽衍生物在化妆品中的用途,其特征在于,所述牛肝菌肽包含选自由以下组成的组的氨基酸:亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、苯丙氨酸(Phe)、丝氨酸(Ser)和赖氨酸(Lys),其中所述牛肝菌肽衍生物为R1-所述牛肝菌肽-R2,R1是未被取代的或者选自以下的一种:乙酰基(Ac)、棕榈酰基(Pal)和式CH3-(CH2)m-CO-的酰基(m=1~13、15~22);R2是未被取代的或者选自以下的一种:-NH2、-NH-(CH2)x-CH3(x=11~15)、序列为Lys-Arg-Arg-Lys-Arg的肽段、序列为Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg的肽段和序列为Arg-Arg-Arg-Arg的肽段。
2.一种牛肝菌肽、牛肝菌肽盐、或牛肝菌肽衍生物作为活性组分在皮肤和/或其附属物的非治疗性美容处理中的用途,其特征在于,所述牛肝菌肽包含选自由以下组成的组的氨基酸:亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、苯丙氨酸(Phe)、丝氨酸(Ser)和赖氨酸(Lys),其中所述牛肝菌肽衍生物为R1-所述牛肝菌肽-R2,R1是未被取代的或者选自以下的一种:乙酰基(Ac)、棕榈酰基(Pal)和式CH3-(CH2)m-CO-的酰基(m=1~13、15~22);R2是未被取代的或者选自以下的一种:-NH2、-NH-(CH2)x-CH3(x=11~15)、序列为Lys-Arg-Arg-Lys-Arg的肽段、序列为Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg的肽段和序列为Arg-Arg-Arg-Arg的肽段。
3.根据权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个亮氨酸(Leu);
优选地,所述牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个异亮氨酸(Ile);
优选地,所述牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个酪氨酸(Tyr);
优选地,所述牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个丙氨酸(Ala);
优选地,所述牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个谷氨酰胺(Gln);
优选地,所述牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个甘氨酸(Gly);
优选地,所述牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个苯丙氨酸(Phe);
优选地,所述牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个丝氨酸(Ser);
优选地,所述牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个赖氨酸(Lys);
更优选地,所述牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个Leu-Ile-Tyr的序列;
更优选地,所述牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个Ile-Tyr-Ala的序列;
更优选地,所述牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个Tyr-Ala-Gln的序列;
更优选地,所述牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个Ala-Gln-Gly的序列;
更优选地,所述牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个Gln-Gly-Phe的序列;
更优选地,所述牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个Gly-Phe-Ser的序列;
更优选地,所述牛肝菌肽包含至少1个例如1~2个Phe-Ser-Lys的序列;
特别优选地,所述牛肝菌肽包含8~10个氨基酸,例如9个氨基酸。
4.根据权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述牛肝菌肽包含如SEQ ID NO:1所示的Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys的氨基酸序列,可选地为取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,可选地为与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列同一性程度为约88.9%的氨基酸序列;
优选地,所述SEQ ID NO:1所示的Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys的氨基酸序列是通过肽链人工合成而获得的。
5.根据权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述牛肝菌肽衍生物是通过肽链人工合成而获得的;
优选地,所述牛肝菌肽衍生物包括以下的一种:
Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH2,
Pal-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH2,
CH3-(CH2)m-CO-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH2(m=1~13、
15~22),
Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH-(CH2)x-CH3
(x=11~15),
Pal-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH-(CH2)x-CH3
(x=11~15),
CH3-(CH2)m-CO-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH-(CH2)x-CH3(m=1~13、15~22,x=11~15),
Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg,
Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Arg-Arg-Arg,
Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg,
Pal-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg,
Pal-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Arg-Arg-Arg,
Pal-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg,
CH3-(CH2)m-CO-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Arg-Arg-Arg(m=1~13、15~22),
CH3-(CH2)m-CO-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg(m=1~13、15~22),和
CH3-(CH2)m-CO-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg(m=1~13、15~22);
优选地,所述牛肝菌肽衍生物包括以下的一种:
Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH2,
Pal-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH2,
CH3-(CH2)10-CO-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH2,
Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-NH-(CH2)13-CH3,
Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Arg-Arg-Arg,
Ac-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg,
Pal-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg,和
CH3-(CH2)16-CO-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gln-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-Arg-Arg-Arg。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的用途,其特征在于,所述用途包括对皮肤具有保湿的用途、抗皮肤衰老的用途和/或对皮肤具有修复的用途;
优选地,所述保湿包括促进透明质酸(HA)生成和/或促进水通道蛋白3(AQP3)合成;
更优选地,所述抗皮肤衰老包括抑制紫外线照射下基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的生成和/或在紫外线照射下保护皮肤成纤维细胞生成的Ⅰ型胶原蛋白;
又优选地,所述修复包括促进角质形成细胞增殖和/或迁移;
尤其优选地,所述美容处理包括改善皮肤的干燥、改善皮肤的脱皮、改善皮肤的角质层薄弱、减轻皮肤细纹、减轻皮肤皱纹和/或预防皮肤老化。
7.一种包含牛肝菌肽、牛肝菌肽盐、或牛肝菌肽衍生物的化妆品组合物在皮肤和/或其附属物的非治疗性美容处理中的用途,其特征在于,以所述化妆品组合物的总重量计,所述牛肝菌肽、牛肝菌肽盐、或牛肝菌肽衍生物的重量范围为0.000001%~10%,优选地0.000001%~5%,例如0.000001%~1%,其中所述牛肝菌肽包含选自由以下组成的组的氨基酸:亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、苯丙氨酸(Phe)、丝氨酸(Ser)和赖氨酸(Lys),其中所述牛肝菌肽衍生物为R1-所述牛肝菌肽-R2,R1是未被取代的或者选自以下的一种:乙酰基(Ac)、棕榈酰基(Pal)和式CH3-(CH2)m-CO-的酰基(m=1~13、15~22);R2是未被取代的或者选自以下的一种:-NH2、-NH-(CH2)x-CH3(x=11~15)、序列为Lys-Arg-Arg-Lys-Arg的肽段、序列为Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg的肽段和序列为Arg-Arg-Arg-Arg的肽段。
8.根据权利要求7所述的化妆品组合物,其特征在于,所述化妆品组合物进一步包含用于增强所述牛肝菌肽的效果的活性剂;
优选地,所述活性剂选自以下的一种或多种:肽类、维生素C及其衍生物、来自于B族的维生素类、脱氢表雄甾酮(DHEA)、植物甾醇类、水杨酸及其衍生物、类视黄醇类、类黄酮类、氨基糖类、唑类和金属盐类。
9.根据权利要求7或8所述的化妆品组合物,其特征在于,所述化妆品进一步包含化妆品用辅料;
优选地,所述化妆品用辅料选自以下的一种或多种:增稠剂、表面活性剂、助表面活性剂、皮肤调理剂、防腐剂、香精、润滑剂、崩解剂、湿润剂、粘合剂和填充剂。
10.一种改善皮肤的美学外观的方法,其特征在于,所述方法包括局部应用有效量的包含牛肝菌肽、牛肝菌肽盐、或牛肝菌肽衍生物的化妆品组合物,以所述化妆品组合物的总重量计,所述牛肝菌肽、牛肝菌肽盐、或牛肝菌肽衍生物的重量范围为0.000001%~10%,优选地0.000001%~5%,例如0.000001%~1%,其中所述牛肝菌肽包含选自由以下组成的组的氨基酸:亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、苯丙氨酸(Phe)、丝氨酸(Ser)和赖氨酸(Lys),其中所述牛肝菌肽衍生物为R1-所述牛肝菌肽-R2,R1是未被取代的或者选自以下的一种:乙酰基(Ac)、棕榈酰基(Pal)和式CH3-(CH2)m-CO-的酰基(m=1~13、15~22);R2是未被取代的或者选自以下的一种:-NH2、-NH-(CH2)x-CH3(x=11~15)、序列为Lys-Arg-Arg-Lys-Arg的肽段、序列为Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg的肽段和序列为Arg-Arg-Arg-Arg的肽段。
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