CN116327631B - 四聚蛋白组合物及其应用、制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种四聚蛋白组合物，所述组合物包括：组分A：弹性蛋白；组分B：胶原蛋白肽；组分C：纤连蛋白和组分D：血清蛋白。本发明考虑到弹性蛋白、胶原蛋白肽和纤连蛋白的特点，以及皮肤吸收后的皮肤自主修复能力等特点，采用分子肽结合络合物的特点事先在皮肤方面的优势；本发明采用多种酶、结合酶解工艺，且设定使用酶的先后顺序，从而使得制备得到的胶原蛋白肽的透明质酸酶抑制率具有很高的优势，从而实现由外到内的抗衰老；本发明结合了四种蛋白组合物，弹性蛋白、胶原蛋白肽、纤连蛋白、血清蛋白从组织、填充、提高自身修复等多角度实现了紧致抗皱、舒缓修护的效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种四聚蛋白组合物及其应用、制备工艺。
背景技术
皮肤衰老是一类生理退行性改变，在皮肤老化过程中，随着胶原蛋白的减少或者成分分配的改变，防护能力减弱，皮肤外观逐渐发生变化，出现暗淡、色斑、干燥和皱纹等皮肤。
除了外界原因之外，例如紫外线等，人体内的自由基、内分泌等原因是造成皮肤衰老的内部原因之一。近期有实验证明，口服胶原蛋白可以修复皮肤衰老。
胶原蛋白在动物体内以胶原纤维的形式存在于结缔组织中，占总蛋白含量的20％以上，是一类重要的结构蛋白。胶原蛋白具有特殊的三螺旋结构，由三股单链螺旋交联而成，该生物结构使胶原蛋白不易分解，难以被人体分解吸收，这种情况下的胶原蛋白生物利用率极低。弹性蛋白是一种重要的细胞外基质蛋白，在生物体内的含量仅次于胶原蛋白，在组织伸缩运动、抗外力形变等方面发挥着不可替代的作用。
专利CN113527523A公开了一种重组蛋白，由透皮肽通过连接肽连接纤连蛋白构成重组透皮纤连蛋白。
专利CN110090166A公开了一种抗皱组合物、抗皱乳液及其制备方法，该抗皱组合物，以重量份计，包括以下组分：乙酰基六肽-8 0.1-5份、纤连蛋白0.1-5份和大麻二酚0.5-4.5份。上述抗皱组合物通过采用乙酰基六肽-8、纤连蛋白和大麻二酚按特定的质量比混合，各组分相互协同作用，不仅可以有效地减少已有的面部皱纹，还具有深度滋养肌肤，加速细胞新陈代谢的作用，提高肌肤抗性，防止新的皱纹产生。
现有的技术只是将弹性蛋白、胶原蛋白肽和纤连蛋白进行复配混合，但是并未考虑到三者混合复配之后皮肤的吸收率，已经长期保持率等问题。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种四聚蛋白组合物，所述组合物包括：
组分A：弹性蛋白；
组分B：胶原蛋白肽；
组分C：纤连蛋白；
组分D：血清蛋白。
作为本发明的一种实施方式，所述组分A、组分B和组分C的比例为20-30：1-10：1-10。
作为本发明的一种实施方式，所述组分A、组分B和组分C的比例为25：6：3。
作为本发明的一种实施方式，所述胶原蛋白肽的制备方法如下：
S01将鱼鳔进行脱脂烘干；将烘干后的鱼鳔进行碱性预处理；
S02将S01中预处理后的鱼鳔和酶溶液进行混合、浸泡；随后离心取上清液；
S03将上清液进行处理得胶原蛋白肽。
作为本发明的一种实施方式，所述S02中酶包括木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜复合胰蛋白酶中的一种或多种。
作为本发明的一种实施方式，所述弹性蛋白采用生物发酵工艺制备得到；所述组分A的pH值为6.0-8.0。
作为本发明的一种实施方式，所述纤连蛋白采用生物发酵工艺制备得到；所述组分C的1％水溶液的pH值为5.0-8.0。
本发明第二方面提供一种四聚蛋白制品，其由所述组合物制备得到。
本发明第三方面提供所述的四聚蛋白组合物，其用于护肤品领域。
本发明第四方面提供一种制备所述的一种四聚蛋白制品的方法，步骤如下：
(1)分别准备组分A、组分B、和组分C；
(2)将组分B和铜盐进行螯合；
(3)将组分A和组分C加入到步骤(2)得到的螯合物中，即得。
采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：
1.本发明考虑到弹性蛋白、胶原蛋白肽和纤连蛋白的特点，以及皮肤吸收后的皮肤自主修复能力等特点，采用分子肽结合络合物的特点事先在皮肤方面的优势；
2.本发明采用多种酶、结合酶解工艺，且设定使用酶的先后顺序，从而使得制备得到的胶原蛋白肽的透明质酸酶抑制率具有很高的优势，从而实现由外到内的抗衰老。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为DPPH自由基清除率；
图2为透明质酸酶抑制率；
图3-图6为实施例1的实际功效图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中所述四聚蛋白组合物是指由四种蛋白类物质组合在一起。
本发明提供一种四聚蛋白组合物，所述组合物包括：
组分A：弹性蛋白；
组分B：胶原蛋白肽；和
组分C：纤连蛋白。
作为本发明的一种实施方式，所述弹性蛋白、胶原蛋白肽和纤连蛋白的比例为20-30：1-10：1-10。
作为本发明的一种实施方式，所述弹性蛋白、胶原蛋白肽和纤连蛋白的比例为25：6：3。
作为本发明的一种优选方式，所述组合物包括：
组分A：弹性蛋白、氯化钠、1,2-戊二醇、1,2-己二醇、精氨酸、海藻糖、水；
组分B：胶原蛋白肽；和
组分C：纤连蛋白、甘油、1,3-丙二醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、水。
作为本发明的一种实施方式，所述胶原蛋白肽的制备方法如下：
S01将鱼鳔进行脱脂烘干；将烘干后的鱼鳔进行碱性预处理；
S02将S01中预处理后的鱼鳔和酶溶液进行混合、浸泡；随后离心取上清液；
S03将上清液进行处理得胶原蛋白肽。
作为本发明的一种优选方式，所述胶原蛋白肽的制备方法如下：
S01取鱼鳔，用正己烷和去离子水交替洗涤脱脂后，于30℃下烘干后，进行切块；并浸泡在0.1mg/mL的NaOH溶液中浸泡48h后，过滤收集固形物，并用蒸馏水洗至中性；
S02分别制备0.1wt％胃蛋白酶的0.5mg/mL醋酸溶液(溶液1)；0.2wt％胰蛋白酶的磷酸缓冲液pH值为11.0(溶液2)；0.1wt％木瓜蛋白酶的磷酸缓冲液pH值为11.0(溶液3)；2wt％碱性蛋白酶的水溶液(溶液4)；
S03将S01处理后的鱼鳔按照固体和溶液的比例为1：50(g/mL)进行混合，将S01处理后的鱼鳔先后浸泡在S02的溶液1、溶液2、溶液3和溶液4中，浸泡时间分别为18h、24h、12h和6h；每次取上清液，加入NaCl混合均匀后，静置24h，收集沉淀物、干燥，即得胶原蛋白粗品；
S04将S03收集到的胶原蛋白粗品，将胶原蛋白粗品溶解于40℃水中(23％，m/v)，加入胶原蛋白酶(0.01％，m/v)，在40℃条件下置于震荡水浴摇床，酶解1h；然后灭酶、离心，取上清，冷冻干燥后所得即胶原蛋白肽。
作为本发明的一种实施方式，所述弹性蛋白采用生物发酵工艺制备得到；所述组分A的pH值为6.0-8.0。
作为本发明的一种实施方式，所述纤连蛋白采用生物发酵工艺制备得到；所述组分C的1％水溶液的pH值为5.0-8.0。
本发明第二方面提供一种四聚蛋白制品，其由所述组合物制备得到。
本发明第三方面提供所述的四聚蛋白组合物，其用于护肤品领域。
本发明第四方面提供一种制备所述的一种四聚蛋白制品的方法，步骤如下：
(1)分别准备组分A、组分B、和组分C；
(2)将组分B和铜盐进行螯合；
(3)将组分A和组分C加入到步骤(2)得到的螯合物中，即得。
作为本发明的一种实施方式，所述的一种四聚蛋白制品的制备方法，步骤如下：
(1)分别准备组分A、组分B、和组分C；
(2)将组分B、去离子水和硫酸铜混合搅拌，水浴加热至50℃反应0.5h；
(3)反应后，加入无水乙醇，过滤取沉淀；
(4)将组分A、组分C和步骤(3)中的沉淀物混合均匀，即得。
作为本发明的一种实施方式，所述四聚蛋白组合物还包括组分D：
组分A：弹性蛋白0.1％、氯化钠0.2％、1,2-戊二醇0.2％、1,2-己二醇0.5％、精氨酸0.5％、海藻糖3％、水余量；
组分B：胶原蛋白肽；和
组分C：纤连蛋白0.05％、甘油40％、1,3-丙二醇10％、磷酸氢二钠0.01％、磷酸二氢钠0.01％、水余量；
组分D：血清蛋白1％、海藻糖2％、甘露糖醇93％、水4％。
所述组分A、组分B、组分C和组分D的比例为25：6：3：1。
下面结合具体的实施方式对本发明做进一步的解释说明。
实施例1
本实施例提供的一种四聚蛋白制品，其包括：质量百分比，
组分A：弹性蛋白0.1％、氯化钠0.2％、1,2-戊二醇0.2％、1,2-己二醇0.5％、精氨酸0.5％、海藻糖3％、水余量；
组分B：胶原蛋白肽；和
组分C：纤连蛋白0.05％、甘油40％、1,3-丙二醇10％、磷酸氢二钠0.01％、磷酸二氢钠0.01％、水余量；
组分D：血清蛋白1％、海藻糖2％、甘露糖醇93％、水4％。
所述组分A、组分B、组分C和组分D的比例为25：6：3：1。
其中，组分A购买自江苏创健医疗科技股份有限公司；组分C购买上海纤连生物技术有限公司，组分D购买自武汉禾元生物科技股份有限公司。
所述胶原蛋白肽的制备方法如下：
S01取鱼鳔，用正己烷和去离子水交替洗涤脱脂后，于30℃下烘干后，进行切块；并浸泡在0.1mg/mL的NaOH溶液中浸泡48h后，过滤收集固形物，并用蒸馏水洗至中性；
S02分别制备0.1wt％胃蛋白酶的0.5mg/mL醋酸溶液(溶液1)；0.2wt％胰蛋白酶的磷酸缓冲液pH值为11.0(溶液2)；0.1wt％木瓜蛋白酶的磷酸缓冲液pH值为11.0(溶液3)；2wt％碱性蛋白酶的水溶液(溶液4)；
S03将S01处理后的鱼鳔按照固体和溶液的比例为1：50(g/mL)进行混合，将S01处理后的鱼鳔先后浸泡在S02的溶液1、溶液2、溶液3和溶液4中，浸泡时间分别为18h、24h、12h和6h；每次取上清液，加入NaCl混合均匀后，静置24h，收集沉淀物、干燥，即得胶原蛋白粗品；
S04将S03收集到的胶原蛋白粗品，将胶原蛋白粗品溶解于40℃水中(23％，m/v)，加入胶原蛋白酶(0.01％，m/v)，在40℃条件下置于震荡水浴摇床，酶解1h；然后灭酶、离心，取上清，冷冻干燥后所得即胶原蛋白肽。
所述的一种四聚蛋白制品的制备方法，步骤如下：
(1)分别准备组分A、组分B、和组分C；
(2)将组分B、去离子水和硫酸铜混合搅拌，水浴加热至50℃反应0.5h；
(3)反应后，加入无水乙醇，过滤取沉淀；
(4)将组分A、组分C、组分D和步骤(3)中的沉淀物混合均匀，即得。
实施例2
本实施例提供的一种四聚蛋白制品，其包括：
组分A：弹性蛋白、氯化钠、1,2-戊二醇、1,2-己二醇、精氨酸、海藻糖、水；
组分B：胶原蛋白肽；和
组分C：纤连蛋白、甘油、1,3-丙二醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、水；
所述组分A、组分B和组分C的比例为25：6：3。
其中，组分A购买自江苏创健医疗科技股份有限公司；组分C购买上海纤连生物技术有限公司，组分D购买自武汉禾元生物科技股份有限公司。
所述胶原蛋白肽的制备方法如下：
S01取鱼鳔，用正己烷和去离子水交替洗涤脱脂后，于30℃下烘干后，进行切块；并浸泡在0.1mg/mL的NaOH溶液中浸泡48h后，过滤收集固形物，并用蒸馏水洗至中性；
S02分别制备0.1wt％胃蛋白酶的0.5mg/mL醋酸溶液(溶液1)；0.2wt％胰蛋白酶的磷酸缓冲液pH值为11.0(溶液2)；0.1wt％木瓜蛋白酶的磷酸缓冲液pH值为11.0(溶液3)；2wt％碱性蛋白酶的水溶液(溶液4)；
S03将S01处理后的鱼鳔按照固体和溶液的比例为1：50(g/mL)进行混合，将S01处理后的鱼鳔先后浸泡在S02的溶液1、溶液2、溶液3和溶液4中，浸泡时间分别为18h、24h、12h和6h；每次取上清液，加入NaCl混合均匀后，静置24h，收集沉淀物、干燥，即得胶原蛋白粗品；
S04将S03收集到的胶原蛋白粗品，将胶原蛋白粗品溶解于40℃水中(23％，m/v)，加入胶原蛋白酶(0.01％，m/v)，在40℃条件下置于震荡水浴摇床，酶解1h；然后灭酶、离心，取上清，冷冻干燥后所得即胶原蛋白肽。
所述的一种四聚蛋白制品的制备方法，步骤如下：
(1)分别准备组分A、组分B、和组分C；
(2)将组分B、去离子水和硫酸铜混合搅拌，水浴加热至50℃反应0.5h；
(3)反应后，加入无水乙醇，过滤取沉淀；
(4)将组分A、组分C和步骤(3)中的沉淀物混合均匀，即得。
实施例3
本实施例提供的一种四聚蛋白制品，其包括：
组分A：弹性蛋白0.1％、氯化钠0.2％、1,2-戊二醇0.2％、1,2-己二醇0.5％、精氨酸0.5％、海藻糖3％、水余量；
组分B：胶原蛋白肽；和
组分C：纤连蛋白0.05％、甘油40％、1,3-丙二醇10％、磷酸氢二钠0.01％、磷酸二氢钠0.01％、水余量；
组分D：血清蛋白1％、海藻糖2％、甘露糖醇93％、水4％。
所述组分A、组分B、组分C和组分D的比例为25：6：3：1。
其中，组分A购买自江苏创健医疗科技股份有限公司；组分C购买上海纤连生物技术有限公司，组分D购买自武汉禾元生物科技股份有限公司。
所述胶原蛋白肽的制备方法如下：
S01取鱼鳔，用正己烷和去离子水交替洗涤脱脂后，于30℃下烘干后，进行切块；并浸泡在0.1mg/mL的NaOH溶液中浸泡48h后，过滤收集固形物，并用蒸馏水洗至中性；
S02分别制备0.1wt％胃蛋白酶的0.5mg/mL醋酸溶液(溶液1)；0.2wt％胰蛋白酶的磷酸缓冲液pH值为11.0(溶液2)；0.1wt％木瓜蛋白酶的磷酸缓冲液pH值为11.0(溶液3)；
S03将S01处理后的鱼鳔按照固体和溶液的比例为1：50(g/mL)进行混合，将S01处理后的鱼鳔先后浸泡在S02的溶液1、溶液2、溶液3中，浸泡时间分别为18h、24h、12h和6h；每次取上清液，加入NaCl混合均匀后，静置24h，收集沉淀物、干燥，即得胶原蛋白粗品；
S04将S03收集到的胶原蛋白粗品，将胶原蛋白粗品溶解于40℃水中(23％，m/v)，加入胶原蛋白酶(0.01％，m/v)，在40℃条件下置于震荡水浴摇床，酶解1h；然后灭酶、离心，取上清，冷冻干燥后所得即胶原蛋白肽。
所述的一种四聚蛋白制品的制备方法，步骤如下：
(1)分别准备组分A、组分B、和组分C；
(2)将组分B、去离子水和硫酸铜混合搅拌，水浴加热至50℃反应0.5h；
(3)反应后，加入无水乙醇，过滤取沉淀；
(4)将组分A、组分C、组分D和步骤(3)中的沉淀物混合均匀，即得。
实施例4
本实施例提供的一种四聚蛋白制品，其包括：
组分A：弹性蛋白0.1％、氯化钠0.2％、1,2-戊二醇0.2％、1,2-己二醇0.5％、精氨酸0.5％、海藻糖3％、水余量；
组分B：胶原蛋白肽；和
组分C：纤连蛋白0.05％、甘油40％、1,3-丙二醇10％、磷酸氢二钠0.01％、磷酸二氢钠0.01％、水余量；
组分D：血清蛋白1％、海藻糖2％、甘露糖醇93％、水4％。
所述组分A、组分B、组分C和组分D的比例为25：6：3：1。
其中，组分A购买自江苏创健医疗科技股份有限公司；组分C购买上海纤连生物技术有限公司，组分D购买自武汉禾元生物科技股份有限公司。
所述胶原蛋白肽的制备方法如下：
S01取鱼鳔，用正己烷和去离子水交替洗涤脱脂后，于30℃下烘干后，进行切块；并浸泡在0.1mg/mL的NaOH溶液中浸泡48h后，过滤收集固形物，并用蒸馏水洗至中性；
S02分别制备0.1wt％胃蛋白酶的0.5mg/mL醋酸溶液(溶液1)；0.2wt％胰蛋白酶的磷酸缓冲液pH值为11.0(溶液2)；0.1wt％木瓜蛋白酶的磷酸缓冲液pH值为11.0(溶液3)；2wt％碱性蛋白酶的水溶液(溶液4)；
S03将S01处理后的鱼鳔按照固体和溶液的比例为1：50(g/mL)进行混合，将S01处理后的鱼鳔先后浸泡在S02的溶液4、溶液3、溶液2和溶液1中，浸泡时间分别为18h、24h、12h和6h；每次取上清液，加入NaCl混合均匀后，静置24h，收集沉淀物、干燥，即得胶原蛋白粗品；
S04将S03收集到的胶原蛋白粗品，将胶原蛋白粗品溶解于40℃水中(23％，m/v)，加入胶原蛋白酶(0.01％，m/v)，在40℃条件下置于震荡水浴摇床，酶解1h；然后灭酶、离心，取上清，冷冻干燥后所得即胶原蛋白肽。
所述的一种四聚蛋白制品的制备方法，步骤如下：
(1)分别准备组分A、组分B、和组分C；
(2)将组分B、去离子水和硫酸铜混合搅拌，水浴加热至50℃反应0.5h；
(3)反应后，加入无水乙醇，过滤取沉淀；
(4)将组分A、组分C、组分D和步骤(3)中的沉淀物混合均匀，即得。
实施例5
本实施例提供的一种四聚蛋白制品，其包括：
组分A：弹性蛋白0.1％、氯化钠0.2％、1,2-戊二醇0.2％、1,2-己二醇0.5％、精氨酸0.5％、海藻糖3％、水余量；
组分B：胶原蛋白肽；和
组分C：纤连蛋白0.05％、甘油40％、1,3-丙二醇10％、磷酸氢二钠0.01％、磷酸二氢钠0.01％、水余量；
组分D：血清蛋白1％、海藻糖2％、甘露糖醇93％、水4％。
所述组分A、组分B、组分C和组分D的比例为25：6：3：1。
其中，组分A购买自江苏创健医疗科技股份有限公司；组分C购买上海纤连生物技术有限公司，组分D购买自武汉禾元生物科技股份有限公司。
所述胶原蛋白肽的制备方法如下：
S01取鱼鳔，用正己烷和去离子水交替洗涤脱脂后，于30℃下烘干后，进行切块；并浸泡在0.1mg/mL的NaOH溶液中浸泡48h后，过滤收集固形物，并用蒸馏水洗至中性；
S02分别制备0.1wt％胃蛋白酶的0.5mg/mL醋酸溶液(溶液1)；0.2wt％胰蛋白酶的磷酸缓冲液pH值为11.0(溶液2)；0.1wt％木瓜蛋白酶的磷酸缓冲液pH值为11.0(溶液3)；
S03将S01处理后的鱼鳔按照固体和溶液的比例为1：50(g/mL)进行混合，将S01处理后的鱼鳔先后浸泡在S02的溶液3、溶液2、溶液1中，浸泡时间分别为18h、24h、12h和6h；每次取上清液，加入NaCl混合均匀后，静置24h，收集沉淀物、干燥，即得胶原蛋白粗品；
S04将S03收集到的胶原蛋白粗品，将胶原蛋白粗品溶解于40℃水中(23％，m/v)，加入胶原蛋白酶(0.01％，m/v)，在40℃条件下置于震荡水浴摇床，酶解1h；然后灭酶、离心，取上清，冷冻干燥后所得即胶原蛋白肽。
所述的一种四聚蛋白制品的制备方法，步骤如下：
(1)分别准备组分A、组分B、和组分C；
(2)将组分B、去离子水和硫酸铜混合搅拌，水浴加热至50℃反应0.5h；
(3)反应后，加入无水乙醇，过滤取沉淀；
(4)将组分A、组分C、组分D和步骤(3)中的沉淀物混合均匀，即得。
实施例6
本实施例提供的一种四聚蛋白制品，其包括：
组分A：弹性蛋白0.1％、氯化钠0.2％、1,2-戊二醇0.2％、1,2-己二醇0.5％、精氨酸0.5％、海藻糖3％、水余量；
组分B：胶原蛋白肽；和
组分C：纤连蛋白0.05％、甘油40％、1,3-丙二醇10％、磷酸氢二钠0.01％、磷酸二氢钠0.01％、水余量；
组分D：血清蛋白1％、海藻糖2％、甘露糖醇93％、水4％。
所述组分A、组分B、组分C和组分D的比例为25：6：3：1。
其中，组分A购买自江苏创健医疗科技股份有限公司；组分C购买上海纤连生物技术有限公司，组分D购买自武汉禾元生物科技股份有限公司。
所述胶原蛋白肽的制备方法如下：
S01取鱼鳔，用正己烷和去离子水交替洗涤脱脂后，于30℃下烘干后，进行切块；并浸泡在0.1mg/mL的NaOH溶液中浸泡48h后，过滤收集固形物，并用蒸馏水洗至中性；
S02分别制备0.1wt％胃蛋白酶的0.5mg/mL醋酸溶液(溶液1)；0.2wt％胰蛋白酶的磷酸缓冲液pH值为11.0(溶液2)；0.1wt％木瓜蛋白酶的磷酸缓冲液pH值为11.0(溶液3)；2wt％碱性蛋白酶的水溶液(溶液4)；
S03将S01处理后的鱼鳔按照固体和溶液的比例为1：50(g/mL)进行混合，将S01处理后的鱼鳔先后浸泡在S02的溶液1、溶液2、溶液3和溶液4中，浸泡时间分别为18h、24h、12h和6h；每次取上清液，加入NaCl混合均匀后，静置24h，收集沉淀物、干燥，即得胶原蛋白粗品；
S04将S03收集到的胶原蛋白粗品，将胶原蛋白粗品溶解于40℃水中(23％，m/v)，加入胶原蛋白酶(0.01％，m/v)，在40℃条件下置于震荡水浴摇床，酶解1h；然后灭酶、离心，取上清，冷冻干燥后所得即胶原蛋白肽。
所述的一种四聚蛋白制品的制备方法，步骤如下：分别准备组分A、组分B、和组分C、组分D；并将组分A、B、C、D进行混合即可。
性能测试
测试1：DPPH自由基清除法：采用DPPH自由基清除法测定鱼鳞胶原蛋白肽的抗氧化活性。准确称取3.94mgDPPH溶于100mL无水乙醇中，将实施例1-实施例6制备得到的制剂，溶解于水溶液中，得到质量分数为0.1％的溶液；取2mL待测样品与等体积DPPH溶液充分混合，室温下避光静置30min后在517nm下测定吸光值，以蒸馏水作空白对照。
DPPH自由基清除率(％)＝(Ao-As)/Ao×100
式中：As为样品组吸光值；Ao为空白组吸光值。
测试结果见表1和图1。
表1试验结果表
测试2：透明质酸酶抑制率
检测依据，按照HMC-W1-029透明质酸酶抑制率进行测试。
实施例1-6：用纯水稀释至样品浓度为0.2％；
阳性对照物(甘草酸二钾，纯度≥98％)：用水稀释至阳性对照物浓度为3％；
阴性对照物：纯水。
试验操作步骤：
设计样品组、样品本底组、溶剂组和溶剂本底组，每个组别设立需设立3个平行，分别在四组中加入不同试剂溶液，摇匀，室温放置30min显色，用紫外分光光度计测定波长为528nm处吸光度值。
计算公式
透明质酸酶抑制率(％)＝(1-(C-D)/(A-B))×100
其中，A为不含样品的反应溶液的吸光度；B为不含样品和酶的反应溶液的吸光度；C为含有样品和酶的反应溶液的吸光度；D为含有样品和不含酶的反应溶液的吸光度。
统计分析软件为SPSS，试验样品、阳性对照物和阴性对照物透明质酸酶抑制率之间的比较采用独立样板t检验。上述统计分析均为双尾检验，显著性水平为α＝0.05，P＞0.05，表示两组之间无显著性差异；P＜0.05，表示两组之间具有显著性差异。
表2试验结果表
透明质酸酶抑制率保留三位小数，P＜0.05，表示样品和阳性对照与阴性对照相比有显著性差异。
测试3：人体功效实验：抗皱紧致
试验目的：通过招募一定合格的受试者，采用图像采集的方式来观察产品使用前后受试者面部皱纹的变化；通过受试者使用产品后填写问卷，反应总体的受试者满意度。从而评价使用该产品后的抗皱紧致的功效，为化妆品的抗皱紧致功效宣传提供依据。用仪器VISIA-CR进行拍照，搭配ipp进行分析。。
受试者
(1)挑选35-60岁，健康男性或者女性，60名，平均每组10名；(2)无过敏性疾病，无化妆品或其他外用制剂过敏史；
(3)既往无光感性疾病史，近期内未使用影响光感性的药物；(4)面部明显有皱纹。
方案设计
测试周期：4期；环境条件：温度21±1℃；相对湿度50±10％。
测试结果：
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (3)
1.一种四聚蛋白制品，其特征在于，所述制品包括：
组分A：弹性蛋白0.1%、氯化钠0.2%、1,2-戊二醇0.2%、1,2-己二醇0.5%、精氨酸0.5%、海藻糖3%、水余量；
组分B：胶原蛋白肽；和
组分C：纤连蛋白0.05%、甘油40%、1,3-丙二醇10%、磷酸氢二钠0.01%、磷酸二氢钠0.01%、水 余量；
组分D：血清蛋白1%、海藻糖2%、甘露糖醇93%、水4%；
所述组分A、组分B、组分C和组分D的比例为25：6：3：1；
所述胶原蛋白肽的制备方法如下：
S01 取鱼鳔，用正己烷和去离子水交替洗涤脱脂后，于30℃下烘干后，进行切块；并浸泡在0.1mg/mL的NaOH溶液中浸泡48h后，过滤收集固形物，并用蒸馏水洗至中性；
S02 分别制备溶液1：0.1wt%胃蛋白酶的0.5mg/mL醋酸溶液；溶液2：0.2wt%胰蛋白酶的磷酸缓冲液pH值为11.0；溶液3：0.1wt%木瓜蛋白酶的磷酸缓冲液pH值为11.0；溶液4：2wt%碱性蛋白酶的水溶液；
S03 将S01处理后的鱼鳔按照固体和溶液的比例为1：50 g/mL进行混合，将S01处理后的鱼鳔先后浸泡在S02的溶液1、溶液2、溶液3和溶液4中，浸泡时间分别为18h、24h、12h和6h；每次取上清液，加入NaCl混合均匀后，静置24h，收集沉淀物、干燥，即得胶原蛋白粗品；
S04 将S03收集到的胶原蛋白粗品溶解于40℃水中，加入胶原蛋白酶，在40℃条件下置于震荡水浴摇床，酶解1 h；然后灭酶、离心，取上清，冷冻干燥后所得即胶原蛋白肽；
制备所述的一种四聚蛋白制品的步骤如下：
(1)分别准备组分A、组分B、和组分C；
(2)将组分B和铜盐进行螯合；
(3)将组分A、组分C和组分D加入到步骤(2)得到的螯合物中，即得。
2.根据权利要求1所述的制品，其特征在于，所述弹性蛋白采用生物发酵工艺制备得到；所述组分A的pH值为6.0-8.0。
3.权利要求1或2所述的四聚蛋白制品，其用于护肤品领域。
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