CN115154351B - 含熊果苷的皮肤美白用组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含熊果苷或其衍生物的皮肤美白用组合物，具体而言，涉及一种含有α‑熊果苷或β‑熊果苷与间充质干细胞分泌物的组合物，α‑熊果苷或β‑熊果苷与间充质干细胞分泌物联合使用在美白方面取得了预料不到的协同效果。

Description

含熊果苷的皮肤美白用组合物

技术领域

本发明涉及一种含熊果苷或其衍生物的皮肤美白用组合物，具体而言，涉及一种含有α-熊果苷或β-熊果苷与间充质干细胞分泌物的组合物。

背景技术

黑色素是一种生物色素，是酪氨酸或3,4-二羟苯丙氨经过一连串化学反应所形成，动物、植物与原生生物都有这种相同色素。黑色素通常以聚合的方式存在，具体而言，黑色素其实是一种氨基酸衍生物，在每个人的体内都有。但是在20-25岁之间，黑色素会以一种非常活跃的形式加速沉淀。如果这时候再加上遗传因素、紫外线因素、内分泌失调、皮肤炎症、情绪压力、荷尔蒙分泌失调、新陈代谢缓慢等等的外因内因，皮肤很容易变黑，甚至肌肤表皮层会形成雀斑、晒斑、黑斑等等症状。

目前以美白为功效的化妆品或护肤品主要机理是从根源预防黑色素的生成，最主要的就是抑制酪氨酸酶活性，酪氨酸酶活性被抑制后，就无法促使酪氨酸氧化成多巴，也就产生不了新的黑色素。例如：传明酸是一种蛋白酶抑制剂，能抑制蛋白酶对肽键水解的催化作用，从而阻止了如发源性蛋白酶等酶的活性，进而阻断黑色素形成的路径。

熊果苷(Arbutin)是另一种具有美白效果的化合物，熊果苷又名熊果素，化学式为C₁₂H₁₆O₇，是一种由杜鹃花科植物熊果叶中萃取出的成分，能够通过抑制体内酪氨酸酶的活性，阻止黑色素的生成，从而减少皮肤色素沉积，祛除色斑和雀斑，同时还有杀菌、消炎的作用，主要应用于化妆品中。熊果苷又分为β-熊果苷(Beta-熊果苷)、α-熊果苷(alpha-熊果苷)和脱氧熊果苷(D-Arbutin)三种，其中脱氧熊果苷在水溶液中对光和热不稳定，所以目前市面上用它的产品比较少。

目前虽然声称具有美白功效的产品比较多，但是具有确切并显著美白效果的产品并不多，其不能满足人们日益增长的针对该领域产品消费需求；由于黑色素的生成是人体皮肤变黑的主要原因，因此，抑制细胞中黑色素的产生能够达到美白的功效。基于现有技术的缺陷，本发明的发明人考虑到斑马鱼黑色素合成的分子调控机制与人体高度一致，早期胚胎可以通过皮肤和鳃快速吸收介质中的小分子物质，是评估黑色素生成的优秀模型。因此，通过对黑色素形成阶段的斑马鱼进行处理，分析黑色素产量的变化，能够达到评价美白功效评价的目的。

发明人基于上述模型，意外的发现，使用间充质干细胞分泌物(例如：羊脐带间充质干细胞)来源的分泌物与α-熊果苷或β-熊果苷联用，获得显著优于单独使用熊果苷或间充质干细胞分泌物的美白功效，取得了预料不到的效果。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明提供了预防或治疗或缓解黑色素沉积、抑制细胞中黑色素的产生、实现美白功效的一种或多种组合物，包括单独使用和联合使用；

一方面，本发明涉及熊果苷在制备用于与第二种组合物组合用于预防或治疗或缓解黑色素沉积、抑制细胞中黑色素的产生、实现美白功效的药物中的用途，其中所述第二组合物为间充质干细胞分泌物；

另一方面，本发明涉及熊果苷在制备用于与第二种组合物组合用于预防或治疗或缓解黑色素沉积、抑制细胞中黑色素的产生、实现美白功效的化妆品或护肤品中的用途，其中所述第二组合物为间充质干细胞分泌物；

在一些实施方案中，所述熊果苷包括但不限于β-熊果苷、α-熊果苷和脱氧熊果苷；

在一些实施方案中，所述间充质干细胞来源不限于牙髓、骨髓、脐带、脂肪和羊膜；

在一些实施方案中，可以选择牛、羊、猪、兔等哺乳动物来源的间充质干细胞。优选羊脐带间充质干细胞；更优选分离自内蒙古绵羊新鲜脐带组织的羊脐带间充质干细胞；在一些实施方案中，所述间充质干细胞分泌物是指：对间充质干细胞进行复苏和培养，提取的上清液体混合物。

在一些实施方案中，所述间充质干细胞来源的多肽混合物制备方法步骤包括：1.细胞复苏；2.细胞传代及原料收集；3.防腐处理；4.纯化步骤；

在一些实施方案中，所述细胞复苏步骤如下：

①超净台提前灭菌15-30min，PBS、完全培养基室温下预热；

②从液氮罐中取出冻存的羊脐带间充质干细胞，在37℃水浴锅中快速振荡至融化。迅速将种子细胞转移入10ml PBS的离心管中，吹吸混合均匀，1000rpm离心5min，弃去上清。

③向离心后的沉淀中加入10ml完全培养基漂洗，缓缓吹打均匀，1000rpm离心5min，弃去上清。

④向沉淀中加入适量完全培养基，吹吸混合均匀，将细胞悬液转移至培养瓶中，于37℃、5％浓度CO₂培养箱中培养48h左右；

在一些实施方案中，所述细胞传代及原料收集包括：

①超净台提前灭菌15-30min，PBS、完全培养基、胰酶室温下预热；

②从CO₂培养箱中取出需传代的细胞培养瓶/细胞工厂，放置在倒置显微镜下观察，细胞密度大于等于90％时可进行细胞传代以及脐带间充质干细胞分泌物的收集；

③将培养瓶/细胞工厂转入超净台，点燃酒精灯，将细胞培养液缓慢倒入脐带间充质干细胞分泌物收集瓶中。取适量PBS加入培养瓶/细胞工厂，漂洗一遍，弃去PBS；

④用移液管吸取适量胰酶，加入培养瓶/细胞工厂，轻轻晃动使胰酶在其中分布均匀，消化2-3min；

⑤用胰酶1-2倍量的PBS终止消化，轻轻拍打使细胞完全脱落，将细胞悬液转移至离心管内，1000rpm，离心5min；

⑥离心后弃去上清，向细胞沉淀中加入适量完全培养基，根据细胞计数结果决定是否扩增传代；在培养瓶/细胞工厂瓶身上注明代数以及传代时间，转入37℃、5％浓度CO₂培养箱中培养；

在一些实施方案中，所述防腐步骤如下：

1.脐带间充质干细胞分泌物收集满500ml之后，按照2％的添加量添加PHL(其中PHL为1,2-己二醇、辛酰羟肟酸和1,3-丙二醇的混合物)。添加后摇晃均匀，在瓶身标明防腐体系及防腐添加时间。

2.在冰箱内静置观察2-3天，无异常情况后可进行后续处理。

在一些实施方案中，所述纯化步骤如下：

1.从4℃冰箱拿出需要过滤的脐带间充质干细胞分泌物库存，放至常温。在抽滤前后分别取样，做微生物质检；

2.用移液管吸去脐带间充质干细胞分泌物中大颗粒沉淀后，对脐带间充质干细胞分泌物进行抽滤，具体而言使用G6砂滤漏斗，空压机抽滤。其中G6为孔径规格＜2um；

在一些实施方案中，所述熊果苷的含量为：0-10mg/mL范围内，优选0.01-5mg/mL；更优选：0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.09mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL、5mg/mL；最优选：0.01mg/mL和1mg/mL；

在一些实施方案中，所述脐带间充质干细胞分泌物的含量为(质量体积百分比，m/v％)：0％-10％，优选0.1％-10％，更优选：0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％；最优选：2.5％。

在一些实施方案中，所述熊果苷为α-熊果苷，含量为1mg/ml，所述脐带间充质干细胞分泌物含量为2.5％，

在一些实施方案中，所述熊果苷为β-熊果苷，含量为0.01mg/ml，所述羊脐带间充质干细胞分泌物含量为3％。

另一方面，本发明涉及一种组合物，含有1mg/mlα-熊果苷和2.5％脐带充质干细胞分泌物。

另一方面，本发明涉及一种组合物，含有0.01mg/mlβ-熊果苷和3％脐带充质干细胞分泌物。

定义：

术语“间充质干细胞”(mesenchymal stem cells,MSC)存在于由受精卵分裂产生的中胚层分化的软骨，骨组织，脂肪组织，骨髓基质等中，并且可以指具有多能能力的干细胞。

术语“间充质干细胞分泌物”是指通过对间充质干细胞进行复苏和培养，提取的上清液体混合物。

本发明中，术语“组合物”可以是化妆品，也可以是药用组合物或护肤品的成分，其形态没有特别的限制，可以取液态、膏状、凝胶状、固体状、粉末状、泡状等任意的形态。

在本发明所述的化妆品中，除上述熊果苷和脐带间充质干细胞分泌物以外，还可以在不阻碍本发明效果的范围内混合通常能用于化妆品的各种成分。例如可列举油性成分、表面活性剂、氨基酸类、氨基酸衍生物类、低级醇、高级醇、多元醇、糖醇及其烯化氧加成物、水溶性高分子、凝胶化剂、保湿剂、杀菌剂和抗菌剂、抗炎剂、镇痛剂、抗真菌剂、角质软化剥离剂、皮肤着色剂、激素剂、紫外线吸收剂、止汗剂和收敛活性成分、防汗臭剂、维生素剂、血流促进剂(血管扩张剂、血行促进剂)、药材、pH调节剂、金属离子螯合剂、粘度调节剂、珠光剂、天然香料、合成香料、色素、颜料、抗氧剂、防腐剂、乳化剂、脂肪和蜡、硅酮化合物、芳香油等。

本发明所述的药用组合物除了含有熊果苷和脐带间充质干细胞分泌物以外，还可以包含一般被配制到这些类型的组合物中的其他药物学上可接受的组分，诸如离子或非离子增稠剂、软化剂、抗氧剂、不透明剂、稳定剂、润肤剂、防腐剂、填充剂、螯合剂、染料和着色剂。

尽管本发明的广义范围所示的数字范围和参数近似值，但是具体实施例中所示的数值尽可能准确的进行记载。然而，任何数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自的测量中存在的标准偏差所致。另外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如记载的“1至10”的范围应认为包含最小值1和最大值10之间(包含端点)的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值1或更大起始的子范围，例如1至6.1，以及以最大值10或更小终止的子范围，例如5.5至10。

附图说明：

图1：间充质干细胞分泌物质谱鉴定图。

图2A：斑马鱼头颈部黑色素表型图(β-熊果苷)。

图2B：β-熊果苷与间充质干细胞分泌物协同实验效果。

图2C：斑马鱼头颈部黑色素表型图(α-熊果苷)。

图2D：α-熊果苷与间充质干细胞分泌物协同实验效果。

实施例：

实施例1间充质干细胞来源的活性肽混合物的制备

1.1仪器设备与耗材

1.仪器设备：37℃、5％浓度CO₂细胞培养箱，超净台，电动吸液枪，倒置显微镜，200μL量程移液枪，1000μL量程移液枪；

2.耗材：T25培养瓶、T75培养瓶、T175培养瓶、2层细胞工厂(Cell Factory)、4层细胞工厂、10层细胞工厂、5ml移液管、10ml移液管、25ml移液管、多肽收集瓶、15ml离心管、50ml离心管、250ml离心管、200μL吸头、1000μL吸头

3.试剂:PBS缓冲液、0.25％Trypsin-EDTA胰酶、胎牛血清、MEMα培养基、PHL、75％酒精、95％酒精；

具体步骤如下：

细胞复苏

①超净台提前灭菌15-30min，PBS、完全培养基室温下预热；

②从液氮罐中取出冻存的羊脐带间充质干细胞(例如：分离自经过检验检疫的内蒙古绵羊新鲜脐带组织)，在37℃水浴锅中快速振荡至融化。迅速将种子细胞转移入10mlPBS的离心管中，吹吸混合均匀，1000rpm离心5min，弃去上清；

③向离心后的沉淀中加入10ml完全培养基(上海源培)漂洗，缓缓吹打均匀，1000rpm离心5min，弃去上清；

④向沉淀中加入适量完全培养基，吹吸混合均匀，将细胞悬液转移至培养瓶中，于37℃、5％浓度CO₂培养箱中培养48h左右；

细胞传代及原料收集

⑤超净台提前灭菌15-30min，PBS、完全培养基、胰酶室温下预热；

⑥从CO₂培养箱中取出需传代的细胞培养瓶/细胞工厂，放置在倒置显微镜下观察，细胞密度大于等于90％时可进行细胞传代以及脐带间充质干细胞分泌物的收集；

⑦将培养瓶/细胞工厂转入超净台，点燃酒精灯，将细胞培养液缓慢倒入脐带间充质干细胞分泌物收集瓶中。取适量PBS加入培养瓶/细胞工厂，漂洗一遍，弃去PBS；即完成脐带间充质干细胞分泌物初步收集工作；

⑧用移液管吸取适量胰酶，加入培养瓶/细胞工厂，轻轻晃动使胰酶在其中分布均匀，消化2-3min；

⑨用胰酶1-2倍量的PBS终止消化，轻轻拍打使细胞完全脱落，将细胞悬液转移至离心管内，1000rpm，离心5min；

⑩离心后弃去上清，向细胞沉淀中加入适量完全培养基，根据细胞计数结果决定是否继续扩增传代；

在培养瓶/细胞工厂瓶身上注明代数以及传代时间，转入37℃、5％浓度CO₂培养箱中培养；传代结束的细胞可进行可进一步扩增培养和脐带间充质干细胞分泌物下一轮收集工作。

之后，对上述步骤中获得产品进行防腐和纯化处理，具体步骤如下：

1.脐带间充质干细胞分泌物收集满500ml之后，按照2％的添加量添加PHL。添加后摇晃均匀，在瓶身标明防腐剂类型及添加时间。

2.在冰箱内静置观察2-3天，无异常情况后可进行后续处理。

3.若原料含较少大颗粒沉淀，可用移液管吸去；若含有较多细小沉淀，则需进行抽滤。

4.每次过滤前，需提前一天将过滤需要用到的器皿：漏斗、烧杯、玻璃棒、抽滤瓶以及清洗仪器需要用到的水经121℃、20min高压蒸汽灭菌后拿到抽滤间，并用75％酒精喷洒表面；

5.从4℃冰箱拿出需要过滤的脐带间充质干细胞分泌物，放至常温。在抽滤前后分别取样，做微生物质检；

6.用移液管吸去脐带间充质干细胞分泌物中大颗粒沉淀后，对脐带间充质干细胞分泌物进行抽滤，具体而言使用G6砂滤漏斗，空压机抽滤。其中G6为孔径规格＜2um；

将上述步骤获得的脐带间充质干细胞分泌物进行质谱和代谢组学鉴定，具体步骤如下：

1.2液相色谱-质谱联用分析

肽段用液相色谱流动相A相(0.1％(v/v)甲酸水溶液)溶解后使用EASY-nLC 1000超高效液相系统进行分离。流动相A为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液；流动相B为含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液。液相梯度设置：0-90min，5％～25％B；90-112min，25％～35％B；112-116min，35％～80％B；116-120min，80％B，流速维持在500nL/min。

肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离然后进QExactiveTM Plus质谱进行分析。离子源电压设置为2.1kV，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析。一级质谱扫描范围设置为350-1800m/z，扫描分辨率设置为70,000；二级扫描分辨率设置为17,500。数据采集模式使用数据依赖型扫描(DDA)程序，即在一级扫描后选择信号强度最高的前10肽段母离子依次进入HCD碰撞池使用28％的碎裂能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析。为了提高质谱的有效利用率，自动增益控制(AGC)设置为5E4，信号阈值设置为40000ions/s，最大注入时间设置为100ms，串联质谱扫描的动态排除时间设置为30秒以避免母离子的重复扫描。

二级质谱数据使用Maxquant(v1.5.2.8)进行检索。检索参数设置：SwissProtHuman(20380条序列)，添加了反库以计算随机匹配造成的假阳性率(FDR)，并且在数据库中加入了常见的污染库，用于消除鉴定结果中污染蛋白的影响；酶切方式设置为无酶切；漏切位点数设为0；First search和Main search的一级母离子质量误差容忍度分别设为20ppm和5ppm，二级碎片离子的质量误差容忍度为0.02Da。可变修饰为甲硫氨酸的氧化。蛋白鉴定、PSM鉴定的FDR都设置为1％。

结果请参见图1以及表1(肽质谱数据)，表2(代谢组学数据)相关数据。根据上述结果可知：本申请获得的脐带间充质干细胞分泌物含有丰富的多肽和初级和次级细胞代谢物。

表1：肽质谱数据

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表2：代谢组学鉴定数据

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实施例2：脐带充质干细胞分泌物与熊果苷联合使用的协同效果实验

本实验旨在通过分析评价测试产品脐带充质干细胞分泌物+β-熊果苷、脐带充质干细胞分泌物+α-熊果苷的美白功效。通过对黑色素形成阶段的斑马鱼进行处理，分别使用脐带充质干细胞分泌物+β-熊果苷、充质干细胞分泌物+α-熊果苷及空白对照，仪器测试分析斑马鱼使用测试产品和对照组比较的美白效果，验证产品的美白功效。

参照标准：《化妆品美白功效测试斑马鱼胚胎黑色素抑制功效测试方法》团体标准，标准号T/ZHCA 012-2021

样品分组情况说明：

选取受精后正常发育的斑马鱼胚胎进行分组测评。包括空白对照组、0.01mg/mLβ-熊果苷处理组、1.0mg/mLα-熊果苷处理组、3％脐带充质干细胞分泌物+0.01mg/mLβ-熊果苷处理组、2.5％脐带充质干细胞分泌物+1.0mg/mLα-熊果苷处理组。

β-熊果苷和α-熊果苷通过商业途径购买(源自安徽华恒)；

2.1最大耐受浓度(maximum tolerated concentration,MTC)的确定

选取受精后6h正常发育的斑马鱼胚胎，分组测定不同受试物的MTC。

以受精后51h斑马鱼胚胎未出现任何死亡和其它毒性效应的浓度组别确定为MTC。通过上述MTC体系的构建，确认了分组测评的熊果苷和脐带充质干细胞分泌物的浓度在对斑马鱼体系的浓度适用范围内。

2.2美白效果评估试验

1.评估实验步骤

选取受精后6h正常发育的斑马鱼胚胎进行分组测评。分成两个实验组：

1.实验组1：对照control、1mg/mlα-熊果苷、2.5％脐带充质干细胞分泌物、1mg/mlα-熊果苷+2.5％脐带充质干细胞分泌物

2.实验组2：对照control、0.01mg/mlβ-熊果苷、3％脐带充质干细胞分泌物、0.01mg/mlβ熊果苷+3％脐带充质干细胞分泌物

其中，正常对照组不做处理，其它处理组按相应浓度的供试品进行孵育处理。于孵育后的48h对斑马鱼头部及胚胎侧面进行拍照，观察各组斑马鱼体表黑色素的分布情况，并利用图像处理软件对斑马鱼头颈部黑色素信号强度进行定量分析。

2.测试结果统计方法

每组随机挑选4只斑马鱼在体式镜下拍照，所有实验处理组需无明显畸形且发育状态良好。指标评测利用Image J软件分析斑马鱼头颈部光密度值，以此指示黑色素信号强度变化。

3.测试结果

每组随机挑选4只斑马鱼在体式镜下拍照。具体结果请参见表3和表4或图2A-图2D,1.0mg/mLα-熊果苷处理组无明显畸形发育状态良好，与空白对照组相比，体表黑色素变化不明显；2.5％脐带充质干细胞分泌物+1.0mg/mLα-熊果苷处理组以及3％脐带充质干细胞分泌物+0.01mg/mLβ-熊果苷处理组与空白对照组相比，体表黑色素明显减少。由此可见，经过各组斑马鱼对比实验可知，α-熊果苷、β-熊果苷、脐带充质干细胞分泌物+α-熊果苷、脐带充质干细胞分泌物+β-熊果苷、脐带充质干细胞分泌物均具有美白效果。当脐带充质干细胞分泌物与α-熊果苷或β-熊果苷联合使用时，其美白效果均显著强于单独使用α-熊果苷或β-熊果苷或脐带充质干细胞分泌物的美白效果，意味着较为明确的协同效应，取得了预料不到的技术效果。

表3β-熊果苷与脐带充质干细胞分泌物协同效果实验

表4α-熊果苷与脐带充质干细胞分泌物协同效果实验

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化，因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的试验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (2)

1.组合物在制备用于预防或治疗或缓解黑色素沉积、抑制细胞中黑色素的产生、实现美白功效的药物中的用途，所述组合物由1mg/ml α-熊果苷和2.5％脐带间充质干细胞分泌物组成或由有0.01mg/ml β-熊果苷和3％脐带间充质干细胞分泌物组成。

2.组合物在制备用于预防或治疗或缓解黑色素沉积、抑制细胞中黑色素的产生、实现美白功效的化妆品或护肤品中的用途，所述组合物由1mg/ml α-熊果苷和2.5％脐带间充质干细胞分泌物组成或由有0.01mg/ml β-熊果苷和3％脐带间充质干细胞分泌物组成。