TWI666221B - 由wjmsc幹細胞萃取具再生修復功效之膠原蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種由瓦頓氏凝膠間葉幹細胞(Wharton’s Jelly mesenchymal stem cells)萃取具再生修復功效之膠原蛋白的方法，包含：將WJMSC幹細胞於一第一培養液中培養16~24小時；移除該第一培養液，並加入一第二培養液培養36~48小時；收集細胞，並加入一細胞裂解液，作用0.5~2小時，加入一無機鹽溶液以獲得一混合液，並於4℃作用24~48小時；離心混合液並收集一沉澱物，並以一保存溶液回溶沉澱物，以獲得膠原蛋白。
Description
本發明係關於一種由瓦頓氏凝膠間葉幹細胞(Wharton’s Jelly mesenchymal stem cells)萃取具再生修復功效之膠原蛋白的方法，尤指一種利用特定培養方法促進細胞產生膠原蛋白並萃取的方法。
膠原蛋白為一種具有伸張能力的蛋白質，存在於人體皮膚、骨骼、軟骨、韌帶、血管壁或結締組織當中，此外膠原蛋白亦是使皮膚保持彈性的重要因子，若皮膚膠原蛋白流失會導致皮膚鬆弛甚至產生皺紋。目前膠原蛋白可以被應用於相當多的產業當中，包含美容保養產品或醫藥產品的製備。
目前膠原蛋白的來源主要為動物組織萃取，例如可由豬皮、魚鱗，動物內臟等組織中萃取；中華民國專利第TW I435881(B)號發明專利係一種自豬肺分離膠原蛋白的方法及應用，係以特定成分的萃取液與豬肺作用，再以胃蛋白酶進行水解，最後利用鹽析法獲得含豬肺膠原蛋白之材料；又中華民國第TW I362393(B)號發明專
利，為一種魚鱗膠原蛋白胜肽產品的製作方法，包含分離魚鱗與魚皮，冷凍硬化處理魚鱗並獲得魚鱗粉末，以酵素水解後再以柑橘類果皮處理以降低萃取物之魚腥味，以獲得具有淡淡柑橘香味的膠原蛋白。但，動物來源之膠原蛋白除了具有腥味或苦味之外，亦可能引起過敏反應。
今，發明人有鑑於現今膠原蛋白主要來自於動物，具有腥味以及誘發過敏之缺失，於是乃一本孜孜不倦之精神，並藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，而加以改善，並據此研創出本發明。
本發明係一種由瓦頓氏凝膠間葉幹細胞(Wharton’s Jelly mesenchymal stem cells，簡稱WJMSC幹細胞)萃取具再生修復功效之膠原蛋白的方法，包含：將WJMSC幹細胞於一第一培養液中培養16~24小時；移除第一培養液，並加入一第二培養液培養36~48小時；收集細胞，並加入一細胞裂解液，作用0.5~2小時，再加入一無機鹽溶液以獲得一混合液，並將混合液於4℃作用24~48小時；離心混合液並收集一沉澱物，並以一保存溶液回溶沉澱物，以獲得一膠原蛋白。
於本發明之一實施例中，第一培養液中含有人類鹼性纖維母細胞生長因子(human basic fibroblast growth factor)。
於本發明之一實施例中，第一培養液中含有2~8ng/mL之人類鹼性纖維母細胞生長因子。
於本發明之一實施例中，第一培養液中含有4ng/mL之人類鹼性纖維母細胞生長因子。
於本發明之一實施例中，第二培養液係包含人類鹼性纖維母細胞生長因子、脯胺酸(proline)與維生素C(ascorbic acid)其中至少之一者。
於本發明之一實施例中，第二培養液係包含4ng/mL之人類鹼性纖維母細胞生長因子，0.2~2mM之脯胺酸與5~50μM之維生素C其中至少之一者。
於本案之一實施例中，第二培養液係包含4ng/mL之人類鹼性纖維母細胞生長因子，0.2mM之脯胺酸與5~50μM之維生素C。
於本發明之一實施例中，無機鹽溶液係為硫酸銨(ammonium sulfate)溶液或是氯化鈉(NaCl)溶液。
藉此，本案WJMSC幹細胞萃取膠原蛋白的方法，提供一種簡易且能大量製備膠原蛋白的方法。
第一圖：胺基酸影響膠原蛋白表現分析圖。
第二圖：生長因子與胺基酸影響膠原蛋白表現分析圖。
第三圖(A)：維生素C與胺基酸影響膠原蛋白表現分析圖。
第三圖(B)：維生素C與胺基酸影響膠原蛋白表現定量分析圖。
第四圖：生長因子、維生素C與胺基酸影響第1型膠原蛋白表現定量分析圖。
第五圖：生長因子、維生素C與胺基酸影響第3型膠原蛋白表現定量分析圖
第六圖：WJMSC幹細胞膠原蛋白促進創傷癒合之顯微鏡觀察圖。
本發明之目的及其功能上的優點，將依據以下圖面所示之結果，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。
本發明為一種由瓦頓氏凝膠間葉幹細胞(Wharton’s Jelly mesenchymal stem cells，簡稱WJMSC幹細胞)萃取具再生修復功效之膠原蛋白的方法，包含：將WJMSC幹細胞於一第一培養液中培養16~24小時；移除該第一培養液，並加入一第二培養液培養36~48小時；收集細胞，並加入一細胞裂解液，作用0.5~2小時，加入一無機鹽溶液以獲得一混合液，將該混合液於4℃作用24~48小時；以及，離心該混合液並收集一沉澱物，並以一保存溶液回溶該沉澱物，以獲得該膠原蛋白。
此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。
一、瓦頓氏凝膠間葉幹細胞(Wharton’s Jelly mesenchymal stem cells，WJMSC幹細胞)之培養方法
WJMSC幹細胞為BCRC編號BCRC H-WJ001之人類瓦頓氏凝膠間葉幹細胞(Wharton’s Jelly mesenchymal stem cells)，係培養於含有10~20%胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)、2~8ng/mL人類鹼性纖
維母細胞生長因子(human basic fibroblast growth factor，bFGF)之α-MEM培養液中；本發明中係將WJMSC幹細胞培養於含有10% FBS、4ng/mL bFGF之α-MEM培養液。另，WJMSC幹細胞皆培養於37℃，5%二氧化碳之培養箱中。
進行試驗時，以5 X 104cells/cm2之密度，將細胞培養於含有10% FBS、4ng/mL bFGF之α-MEM培養液中24小時；24小時之後移除細胞培養液，並以1 X PBS緩衝液清洗細胞2~3次；依照實驗設計，將細胞培養於含有bFGF、脯胺酸(Proline)、精胺酸(Arginine)或是維生素C(L-ascorbic acid)之α-MEM培養液中；於培養後48小時之後收取蛋白質，並測量細胞之第1型膠原蛋白(collagen 1)與第3型膠原蛋白(collagen 3)之表現。其中bFGF係購自ProSpece公司(產品編號cyt-218-b)，維生素C係購自Sigma公司(產品編號SI-A8960)，脯胺酸係購自Calbiochem公司(產品編號分別為#5370)以及精胺酸係購自Merck公司(產品編號為#1.011542)。
二、細胞內膠原蛋白萃取
移除細胞培養基，並以1 X PBS緩衝液清洗2次之後，再加入10mM EDTA-PBS溶液或0.5M乙酸(acetic acid)，並在4℃之溫度下刮下細胞並將混合液置入離心管中以超音波震盪儀，於20Hz之強度震盪15秒，共震盪3次，每次震盪之間隔時間為30秒，以將細胞裂解；再於4℃、2000rpm之作用條件離心30分鐘，以獲得細胞蛋白質粗萃液。
此外，亦可以直接使用細胞裂解液裂解細胞以萃取蛋白質，簡述如下：移除細胞培養基，並以1 X PBS緩衝液清洗2次之後，再加入含有10mM EDTA之RIPA細胞裂解液，並持續於4℃之溫度下持續搖晃至少30分鐘，刮下細胞並將混合液置入離心管中並以12000rpm之轉速離心15分鐘，以獲得細胞蛋白質粗萃液。
將細胞蛋白質粗萃液加入25%之飽和過硫酸銨(ammonium persulfate)溶液或是3M的氯化鈉溶液(NaCl)，於4℃中作用24小時以進行鹽析反應；次日再於4℃、3500g之作用條件離心30分鐘，並移除上清液保留沉澱之團塊；以1 X PBS緩衝液清洗細胞，並於4℃、3500g離心30分鐘，並以0.5M之乙酸溶液(acetic acid)回溶該團塊，以獲得細胞蛋白質液。所得到之蛋白質後續以西方點墨法進行分析，以偵測膠原蛋白之表現；所有實驗至少進行二重複，為避免篇幅過於冗長故以具代表性之結果圖呈現。
三、WJMSC幹細胞膠原蛋白生成之分析
(一)脯胺酸(Proline)促進細胞膠原蛋白表現
請參見第一圖，為添加不同劑量之脯胺酸(Proline)或精胺酸(Arginine)對於WJMSC幹細胞膠原蛋白表現之影響，圖中Control為未添加其他成分之對照組，Pro(2)代表添加2mM之脯胺酸，Arg(0.2)代表添加0.2mM之精胺酸，以此類推。根據第一圖，2mM之脯胺酸能提高WJMSC幹細胞表現第1型膠原蛋白與第3型膠原蛋白，但是更高量的脯胺酸，如5mM~20mM之脯胺酸並無法並無法達成
相同的功效；此外，添加0.2mM~20mM之精胺酸並無法促進細胞表現第1型膠原蛋白與第3型膠原蛋白。
(二)人類鹼性纖維母細胞生長因子對膠原蛋白表現之影響
請參閱第二圖，為人類鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)合併使用脯胺酸或精胺酸對於細胞膠原蛋白表現的影響，圖中bFGF的使用量為4ng/mL，標示為bFGF(4)；脯胺酸的使用量為0.2mM與2mM，分別標示為Pro(0.2)與Pro(2)；精胺酸的使用量為0.2mM，標示為Arg(0.2)。根據第二圖，單獨處理bFGF、0.2mM脯胺酸或2mM之脯胺酸都可以促進細胞表現第1型膠原蛋白與第3型膠原蛋白，且合併使用bFGF與脯胺酸無法使細胞產生更多第1型膠原蛋白，但是合併使用4ng/mL之bFGF與0.2mM之脯胺酸可使細胞產生更多的第3型膠原蛋白。單獨使用精胺酸或是精胺酸與bFGF合併使用都無法使細胞產生較多的膠原蛋白。
(三)維生素C與脯胺酸對於膠原蛋白生成之影響
請參見第三圖(A)，為維生素C(L-ascorbic acid，簡稱AA)以及脯胺酸對於細胞產生膠原蛋白之影響，圖中AA(5)表示給予細胞5μM之維生素C，而Pro(2)代表給予細胞2mM之脯胺酸，而bFGF(4)為給予4ng/mL之bFGF；此外，前第1型膠原蛋白(pro-collagen 1)、第1型膠原蛋白、前第3型膠原蛋白(pro-collagen 3)、第3型膠原蛋白之位置分別以箭號標示之。參見第三圖(A)，添加5μM之維生素C、2mM之脯胺酸或是4ng/mL之bFGF皆會促進細胞表現第1型膠原蛋白與第3型膠原蛋白表現，但是合併使用維生素C與脯胺酸並
無法進一步促進膠原蛋白生成。再請參見第三圖(B)，為第三圖(A)結果之定量圖；將西方點墨法所獲得之結果，以Image J軟體進行定量，並將獲得之數值先以該樣本之β-actin定量數值進行標準化(normalization)，再以Control做為1倍，以與其他組別進行相對蛋白質表現量的倍數比較：圖中顯示5μM之維生素C、2mM之脯胺酸或是4ng/mL之bFGF皆會促進細胞表現前第1型膠原蛋白、第1型膠原蛋白、前第3型膠原蛋白與第3型膠原蛋白之表現，其中又以前第1型膠原蛋白與前第3型膠原蛋白之變化較為明顯。
(四)bFGF、脯胺酸與維生素C對膠原蛋白生成之影響
請參見第四圖與第五圖，為合併使用bFGF、脯胺酸或維生素C對於細胞表現膠原蛋白之影響之定量圖，係先以西方點墨法分析蛋白質的表現情形，再Image J軟體進行定量，並將獲得之數值先以該樣本之β-actin定量數值進行標準化(normalization)，再以Control做為1倍，並與其他組別與之比較。根據第四圖，單獨給予5μM維生素C、2mM脯胺酸、5μM之維生素合併2mM之脯胺酸以及4ng/mL bFGF之組別的第1型膠原蛋白表現量較佳。
請再參見第五圖，僅有4ng/mL bFGF合併50μM之維生素C之組別的第3型膠原蛋白表現較差，其他組別的處理皆能促進第3型膠原蛋白之表現。
四、WJMSC幹細胞膠原蛋白對傷口癒合之影響
將人類纖維母細胞株HS68細胞以密度2 X 104cells/cm2之培養於10% FBS DMEM培養液中，並使其貼附生長於培養盤中，並分為
(1)對照組以及(2)膠原蛋白組，對照組使用的培養盤為無處理之培養盤，而膠原蛋白組使用之培養盤則是將WJMSC幹細胞膠原蛋白以50μg/mL濃度均勻塗佈(coating)於培養盤上，並於37℃培養箱放置隔夜所獲得；HS68細胞於培養盤生長24小時之後，移除培養基並以1 X PBS緩衝液清洗細胞，再於貼附之細胞中製造出一創傷(wound)，並於0、2、4、6與20小時之後以顯微鏡觀察並照相；以Image J軟體進行分析所得之顯微鏡照片，顯微鏡照片中整體未被細胞覆蓋之範圍比例被稱為創傷寬度(wound size)，並計算創傷預合度(wound healing)，以獲得表一之結果；創傷癒合度之計算公式為：(觀測時間之創傷寬度-2hr創傷寬度)/2hr創傷寬度X 100%
根據表一，兩組細胞的創傷皆隨著培養時間增加而漸漸癒合，但是膠原蛋白組的創傷癒合度明顯快於對照組：6小時的觀測結果中，對照組的創傷癒合度僅達到16.1%，但是膠原蛋白組的創傷癒合度已經達到38%；20小時的觀測結果中，對照組的創傷癒合度為81.7%，但是膠原蛋白組的癒合度已達到100%。
另請參閱第6圖，為二組別之顯微鏡觀察之照片，無標示之組別係以4X之物鏡進行觀察之結果，另使用10X物鏡觀察20小時之創傷癒合情形(標示為20hr(10X))；創傷後4小時與6小時，對照組的細胞已有向創傷處生長的狀況，而膠原蛋白組的細胞生長情形更為明顯；20小時之觀察結果中，對照組的創傷還留有一些空間，但膠原蛋白組的創傷已經覆蓋滿細胞，且根據以10X物鏡觀察的照片，膠原蛋白組的細胞密度亦高於對照組，暗示膠原蛋白可能會促進傷口的癒合。
由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點：
1.本發明由WJMSC幹細胞萃取膠原蛋白的方法，利用特定的培養方法提高細胞表現膠原蛋白的含量，操作簡單且所獲得之膠原蛋白為人類膠原蛋白，降低誘發使用者過敏的機率。
2.本發明由WJMSC幹細胞萃取膠原蛋白的方法，所用材料為體外培養之細胞，因此不會如源於動物組織之膠原蛋白具有腥味或異味等缺失。
3.本發明獲得之WJMSC幹細胞膠原蛋白具有促進創傷癒合(wound healing)之功效，後續可應用於製備促進傷口癒合之醫藥美容組成物或是外用敷料。
綜上所述，本發明由WJMSC幹細胞萃取膠原蛋白的方法，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。
惟，上述所揭之說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；其；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。
Claims (3)
- 一種由瓦頓氏凝膠間葉幹細胞(Wharton’s Jelly mesenchymal stem cells)萃取膠原蛋白的方法，包含：步驟一：將瓦頓氏凝膠間葉幹細胞於一第一培養液中培養16~24小時，其中該第一培養液包含2~8ng/mL之人類鹼性纖維母細胞生長因子；步驟二：移除該第一培養液，並加入一第二培養液培養36~48小時以促進膠原蛋白表現，其中該第二培養液包含4ng/mL之鹼性纖維母細胞生長因子，0.2mM之脯胺酸與5~50μM之維生素C；步驟三：收集細胞，並加入一細胞裂解液，作用0.5~2小時，加入一無機鹽溶液以獲得一混合液，將該混合液於4℃作用24~48小時；以及步驟四：離心該混合液並收集一沉澱物，並以一保存溶液回溶該沉澱物，以獲得一膠原蛋白樣品。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該第一培養液中含有4ng/mL之人類鹼性纖維母細胞生長因子。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該無機鹽溶液係為過硫酸銨(ammonium sulfate)溶液或是氯化鈉(NaCl)溶液。
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Non-Patent Citations (1)
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| Amable PR et al., Stem Cell Res Ther. 2014 Apr 16;5(2):53. * |
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