JPWO2019017355A1 - 間葉系幹細胞誘引剤 - Google Patents
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Abstract
Description
[2] 項目1に記載の誘引剤を含む、老化因子産生抑制剤。
[3] 項目1に記載の誘引剤、又は項目2に記載の老化因子産生抑制剤を含む、老化改善剤。
[4] 項目1に記載の誘引剤を含む、真皮の再生促進剤。
[5] 間葉系幹細胞の誘因を介して、間葉系幹細胞により治療又は改善される疾患の治療において使用するための、アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも1の抽出液。
[6] 前記疾患が、関節軟骨疾患、例えば変形性関節症等、心臓病、筋ジストロフィー、真皮の創傷又は損傷である、項目5に記載の抽出液。
[7] アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも1を投与することを含み、真皮に存在する間葉系幹細胞を誘引することを介する美容方法又は非治療的方法。
[8]間葉系幹細胞の誘因により、老化因子産生が抑制される、項目7に記載の美容方法又は非治療的方法。
[9]間葉系幹細胞の誘因により、真皮の再生が促進される、項目7に記載の美容方法又は非治療的方法。
[10]間葉系幹細胞を誘引することにより、たるみやしわなどの外観上の老化を改善される、項目7〜9のいずれか一項に記載の美容方法又は非治療的方法。
[11] 老化の治療又は予防において使用するための、間葉系幹細胞の誘引剤。
[12] 真皮の再生治療において使用するための、間葉系幹細胞の誘引剤。
[13] 前記誘引剤が、アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも1の抽出物を含む、項目11又は12に記載の誘引剤。
[14]アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも1の抽出物を、間葉系幹細胞の誘引剤としての非治療的使用。
[15]アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも1の抽出物の、間葉系幹細胞の誘因を介してしわ、たるみなどの外観上の老化を改善するため非治療的使用。
[16] 間葉系幹細胞の誘引を必要とする対象において、アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも1を投与することを含む、老化の抑制方法。
[17] 真皮の再生を必要とする対象において、アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも1を投与することを含む、真皮の再生促進方法。
[18] 真皮に存在する間葉系幹細胞の誘引による老化の治療又は抑制のための製剤の製造のための、アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも1の抽出物の使用。
[19] 真皮に存在する間葉系幹細胞の誘引による真皮の再生剤の製造のための、アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも1の抽出物の使用。
細胞培養
成人(21歳)の背中の皮膚から樹立された真皮線維芽細胞を、10%FBSを添加したダルベッコ改変イーグル培地で培養した。通常の線維芽細胞(若い線維芽細胞)として、1ヶ月未満の培養期間であり、Pdl<30の細胞を用いた。同細胞を、3ヶ月以上培養し、増殖が遅くなった細胞(倍化時間が0.5/週未満、Pdl>50)を老化線維芽細胞として用いた。通常の線維芽細胞を1250細胞/cm2の密度となるように、10%FBSを添加したダルベッコ改変イーグル培地を満たした6ウェルのトランスウェルシステム(Falcon; Franklin Lakes, NJ)の上層に播種した。サブコンストラクト状態の老化線維芽細胞と通常の線維芽細胞を、それぞれトランスウェルシステムの下層の2つのウェルに播種した。トランスウェルシステムの上層及び下層を組み合わせて、37℃5%CO2加湿雰囲気下で2日間培養後、上層の細胞と下層の細胞をそれぞれQiazole(Qiagen)を用いて回収した。
回収した細胞ライセートから、RNeasy Protect Kit(Qiagen)を製品説明書に従い用いてRNAを抽出し、そしてSuperscript VILO(Invitrogen)を製品説明書に従い用いてcDNAへと翻訳した。28SrRNAを内部標準とし、下記の遺伝子についてのプライマー対を用いて、LightCycler(ロッシュ)にてリアルタイムPCRを行った。結果を図1に示す。Lightcycler software ver.3.5により計算されたサイクル閾値(Ct値)を、各サンプルのGAPDHmRNAについて正規化した。
若い線維芽細胞と、老化線維芽細胞とにおける遺伝子発現の違いを、マイクロアレイ分析により調べた。若い線維芽細胞の遺伝子発現量と比較して、2.5倍以上の発現量を示した遺伝子を同定した。下記の表に記載の遺伝子を老化因子の候補とした:
本発明者らにより特定された老化因子(CFD)及び候補老化因子(IGFBP7、RSPO4)の発現を、老化線維芽細胞と若い線維芽細胞とで比較した。老化線維芽細胞及び若い線維芽細胞をそれぞれ培養し、Qiazole(Qiagen)を用いて回収した。回収された細胞ライセートを、上述のRT-PCRと同様の手法を用いて、老化因子の発現を調べた。下記のプライマー対を用いた。結果を図3に示す。本発明で特定された老化因子及び候補老化因子は、ともに老化線維芽細胞で発現が高くなることが示された。
候補老化因子(IGFBP7、RSPO4)のタンパク質(Serotec、R&D SYSTEMSより購入)を若い線維芽細胞を培養する培地に、0μg/ml、10μg/mlの濃度で添加し、2日間培養後、細胞をそれぞれQiazole(Qiagen)を用いて回収した。回収した細胞ライセートについて、定量的RT−PCRの欄で記載したのと同様に、MMP1及びコラーゲンの発現量を調べた。結果を図4に示す。IGFBP7及びRSPO4は、コラーゲンの発現を低下させ、またMMP1の発現を増加させた。これにより、IGFBP7及びRSPO4も老化因子として作用することが示された。
細胞培養
真皮線維芽細胞はLonzaより購入し、1250細胞/cm2の密度となるように、10%FBSを添加したダルベッコ改変イーグル培地を満たした6ウェルのトランスウェルシステム(Falcon; Franklin Lakes, NJ)の上層に播種した。間葉系幹細胞(MSC)はLonzaより購入し、Gibco培地にて培養した。サブコンストラクト状態のMSCを、トランスウェルシステムの下層のウェルに播種した。24時間後に培地を10%FBS、250uMアスコルビン酸を含むDMEMに交換し、共培養を開始した。7日後に上層をパラホルムアルデヒドにて固定し、HE染色を行い観察した(図5A)。上層の厚みを計測して示した(図5B)。対照群としてMSC無しで線維芽細胞単独で培養を行った。MSC存在下では、真皮線維芽細胞が活性化し、細胞の重層程度が増大した(スチューデントt検定:P<0.05)。
細胞培養
Lonzaから取得した線維芽細胞が保持するコラーゲンゲルを、10%FBSを添加したダルベッコ改変イーグル培地を満たした6ウェルのトランスウェルシステム(Falcon; Franklin Lakes, NJ)の上層に配置した。間葉系幹細胞(MSC)はLonzaより購入し、MessenPro培地にて培養した。サブコンストラクト状態のMSCを、トランスウェルシステムの下層のウェルに播種した。24時間後に培地を10%FBS、250uMアスコルビン酸を含むDMEMに交換し、培養を開始した。2日後に上から撮影を行い、コラーゲンゲルの表面積を比較した。対照群としてMSC無しでコラーゲンの培養を行った。結果を図6に示す(スチューデントt検定:P<0.05)。MSCが存在下では、コラーゲンゲルが収縮していることが分かる。この収縮は、コラーゲンが成熟することに伴い、弾力が増した結果と考えられる。
細胞培養
老化線維芽細胞を、1250細胞/cm2の密度となるように、10%FBSを添加したダルベッコ改変イーグル培地を満たした6ウェルのトランスウェルシステム(Falcon; Franklin Lakes, NJ)の上層に播種した。間葉系幹細胞(MSC)はLonzaより購入し、MessenPro培地にて培養した。サブコンストラクト状態のMSCを、トランスウェルシステムの下層のウェルに播種した。24時間後に培地を10%FBS、250μMアスコルビン酸を含むDMEMに交換し、共培養を開始した。2日後にQiazole(Qiagen)を用いて細胞を回収した。回収された細胞ライセートを、上述のRT-PCRと同様の手法を用いて、老化因子(IGFBP7)の遺伝子発現を調べた。結果を図7に示す。対照群としてMSC無しで線維芽細胞単独で培養を行った。MSC存在下では、IGFBP7の遺伝子発現は有意に減少した(スチューデントt検定:P<0.05)。
間葉系幹細胞の誘引試験
間葉系由来幹細胞(Lonza)を、MessenPro RS培地(DMEM;GIBCO/BRL (Carlsbad, CA))を含むフラスコ中で、37℃5%CO2加湿下で培養した。サブコンフルエントになった際にAccutase(PAA (Linz, Austria))を用いて細胞を回収し、そして2μMのPKH67(Sigma-Aldrich (St. Louis, MO))を用いて製品説明書に従い標識化した。3×104標識細胞/wellを24well Fluoroblok plate(Becton Dickinson (Mountain View, CA))の上部ウェルに播種した。6時間のインキュベーション後に、培地をサプリメントを伴わないMessenPro RS培地(DMEM;GIBCO/BRL (Carlsbad, CA))に置き換えた。インキュベーションを12時間続け、試験物質をFluoroblokの下部ウェルに0.1%の濃度で加えた。8時間後、Fluorobolok膜の下側を、蛍光フィルターを備えた顕微鏡を通して写真を撮り、膜を通して誘引された細胞を、Image J. を用いて孔サイズよりも大きい蛍光領域として計数した。脂肪由来幹細胞の誘引活性は、対照ウェルでの蛍光値と、試験ウェルでの蛍光値との比較により評価した。
アイリス抽出物(香栄興業)、オリーブ葉抽出物(丸善製薬)、及びカミツレ抽出物(丸善製薬)が、優れた間葉系幹細胞誘因活性を有することが示された。アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物を添加したウェルは、抽出物を伴わず、抽出溶媒のみを含む対照ウェルと比較して有意に高い蛍光を示した(表1、図5A及びB、スチューデントt検定:P<0.05)。アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物の場合、その抽出溶媒は、50%ブチレングリコールであり、試験抽出物の代わりにこの溶媒のみを対照ウェルに加えた。
Claims (3)
- アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも1を含む、間葉系幹細胞の誘引剤。
- 請求項1に記載の誘引剤を含む、老化因子産生抑制剤。
- 請求項1に記載の誘引剤を含む、真皮の再生促進剤。
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