CN101302255A - 基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子融合蛋白及制备 - Google Patents

Abstract

一种基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子融合蛋白及制备方法，融合蛋白的氨基酸序列由三部分组成：从N－端开始依次为胶原蛋白序列、(一种或一类)人基质金属蛋白酶底物序列和人肿瘤坏死因子－α序列(如图1所示)。当肿瘤坏死因子－α形成三聚体化的活性形式时，胶原蛋白序列形成右手三股螺旋，并与人基质金属蛋白酶底物序列起封闭肿瘤坏死因子－α受体结合部位的作用。在肿瘤组织，融合蛋白能被肿瘤组织分泌的基质金属蛋白酶特异性切割，暴露出肿瘤坏死因子－α的受体结合部位并表现细胞毒活性。而大多数正常组织，融合蛋白不表现出细胞毒活性。这些融合蛋白具备肿瘤靶向特征和杀伤肿瘤细胞作用，在肿瘤治疗方面有好的应用前景。

Description

基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子融合蛋白及制备

技术领域

本发明涉及基因工程蛋白质药物领域，更具体地，本发明涉及基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子融合蛋白及其制备方法，这些融合蛋白的氨基酸序列由三部分组成：从N-端开始依次为胶原蛋白序列、(一种或一类)人基质金属蛋白酶底物序列和人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)序列，进一步涉及这些融合蛋白基因、工程菌、融合蛋白在原核细胞中的表达、融合蛋白的分离纯化，以及对恶性肿瘤细胞具有靶向作用和特异杀伤作用的证据。

背景技术

恶性肿瘤是对人类健康与生命危害最大的疾病之一。随着肿瘤免疫学、分子生物学和基因工程技术的飞速发展，细胞因子疗法成为抗肿瘤的分子治疗学研究热点。而利用生物工程技术在分子水平改造细胞因子结构以增强其抗瘤活性和降低毒性的有效探索，有望为细胞因子治疗肿瘤开辟一条新的途径。

1.肿瘤坏死因子的研究进展

肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)是一种多功能细胞因子，具有广泛的生物活性，参与机体的免疫调节和抗肿瘤作用，它是迄今为止发现的抗肿瘤活性最强的细胞因子。

(1)肿瘤坏死因子的生物学功能

TNF自1975年发现以来，一直受到世界各国学者的重视。TNF有TNF-α和TNF-β两种类型。前者又被称为恶病质素，主要由单核巨噬细胞产生；后者又被称作淋巴细胞毒素，由活化的淋巴细胞产生。1984年获得了人TNF-α的cDNA克隆并在大肠杆菌中成功表达。在此基础上人们对TNF的理化性质、生物活性及临床应用进行了广泛研究。TNF具有广泛的生物活性，其最显著特征是在体内外能特异性地直接杀伤肿瘤细胞，TNF的抗肿瘤作用主要是由于：①TNF为激发性细胞因子，可启动广泛的免疫炎性反应，介导天然细胞毒细胞、单核细胞和巨噬细胞对癌细胞的杀伤和溶瘤作用；②TNF可作用于血管内皮细胞，使肿瘤的血管变形受损或形成血栓，导致肿瘤发生出血性坏死或因营养缺乏而消退；③TNF可通过诱导某些肿瘤细胞凋亡来抑制癌细胞增生。

由于其广泛的抗肿瘤作用和免疫调节作用，故TNF-α治疗肿瘤的动物实验和临床研究已在许多国家进行，美国FDA早在1984年就批准用TNF-α治疗肿瘤的临床试验。动物实验和临床研究表明，TNF-α对神经纤维瘤、肺癌、乳腺癌、肌肉瘤和淋巴瘤等肿瘤细胞具有明显的杀伤作用。但是，由于TNF-α的毒副作用大而严重限制了其临床应用，毒副作用包括发热、头痛、恶心、呕吐、全身倦怠和肌肉酸痛等症状，大剂量使用可导至严重的低血压、休克、DIC形成甚至死亡。TNF-α的上述缺陷，为其直接进入临床应用造成了很大困难。但考虑到TNF-α是迄今为止发现的抗肿瘤活性最强的细胞因子，因此，人们一直在努力开发其潜能。降低TNF-α的毒副作用和增强肿瘤靶向性是解决这一难题的两个关键。

(2)肿瘤坏死因子分子结构与作用机制

人TNF-α基因定位于人类第6号染色体上，与HLA基因连锁。编码产物先是由233个氨基酸残基组成的前体，含有一段由76个氨基酸残基组成的信号肽，切除信号肽后转化成成熟的TNF-α，其分子量为17kD，含157个氨基酸残基，无糖基化位点，第69位的cys和第101位的cys形成分子内二硫健。人TNF-α的活性形式是由三个17kD亚基以同源三聚体的形式存在，每个亚基通过β折叠以边对面的堆积方式形成的外观近似金字塔(三角锥)的三聚体分子。TNF-α的各种生物学效应是通过与靶细胞膜上的TNF受体结合而产生的，其受体存在于多种正常细胞及肿瘤细胞表面，分为两种类型：TNFR1和TNFR2。TNF-α与两种受体的结合并无特异性，其受体结合部位位于金字塔的底部，N末端的(7个)氨基酸序列游离于底部并且可能影响其与受体的结合。TNFR1胞内结构域中含有一个约90个氨基酸组成的“死亡域”(death domain，DD)，而TNFR2没有。TNFR1产生的信号介导细胞凋亡和通过激活核转录因子NF-κB而使细胞增殖、分化；TNFR2则通过不同于TNFR1，但在某些环节可发生交叉反应的信号传导途径激活NF-κB，使细胞增殖和分化。

(3)肿瘤坏死因子融合蛋白的研究进展

通过基因重组技术将TNF-α与其他细胞因子或有导向性的短肽基因连接起来表达具有复合功能的融合蛋白，为TNF-α治疗肿瘤开创了新思路。1995年Yang等构建了抗肿瘤相关抗原TAG72的单链抗体与TNF-α融合的双功能抗体，对表达TAG抗原的肿瘤细胞具有导向杀伤作用。1997年刘丽等针对TNF-α在肿瘤治疗剂量下产生的严重毒副作用及一些肿瘤细胞白细胞介素-6(IL-6)受体明显增高的事实，采用PCR技术将TNF-α突变体与人IL-6成熟肽编码区cDNA通过人工接头进行融合，并将融合蛋白在大肠杆菌中表达，经活性检测结果证实该融合蛋白既具有TNF-α的抗肿瘤活性，又具有对高表达IL-6受体的肿瘤细胞特异性地杀伤作用。范彬等将hTNF-α与hPgnK5基因构建在一起，希望得到既有杀伤肿瘤细胞又可抑制肿瘤新生血管的融合蛋白，结果所获得的新型hTNF-α较天然hTNF-α的活性提高了100倍，而毒性却为天然hTNF-α的1/3，是目前通过抑制肿瘤新生血管生长治疗肿瘤的蛋白质药物中较有前景的一种。以上研究表明TNF-α融合蛋白不失为一种很有前途的抗肿瘤导向制剂。

本发明所设计的基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子融合蛋白的技术背景之一，就是根据人TNF-α的活性形式的上述特点：外观近似金字塔(三角锥)的三聚体分子，且其受体结合部位位于金字塔的底部，N末端的(7个)氨基酸游离于底部并且可能影响其与受体的结合。因此，试图通过基因工程手段产生重组融合蛋白的方式，在hTNF-α的N末端连接一段起封闭受体结合部位作用的胶原蛋白序列——(Gly-X-Y)n，其中X和Y代表除Gly(甘氨酸)以外的任意氨基酸(以脯氨酸最好)，n为任意正整数(代表重复次数)。当TNF-α形成三聚体化的活性形式时，胶原蛋白序列形成右手三股螺旋，起到封闭TNF-α受体结合部位的作用，TNF-α失去与受体结合的能力。

2.基质金属蛋白酶与肿瘤

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是一类具有Zn²⁺依赖性的内源性蛋白水解酶，在细胞外基质代谢中的相互作用是肿瘤细胞侵袭和转移的关键因素，研究MMPs在不同类型肿瘤中的表达和分泌水平，对肿瘤的防治具有重要意义。

(1)MMPs系统的生物学特性

MMPs具有高度的同源性，迄今为止，在人类至少发现有19种之多，按作用底物不同主要分为五大类：①胶原酶，包括间质胶原酶(MMP--1)、中性粒细胞胶原酶(MMP-8)和3型胶原酶(MMP-3)，主要降解I、II、III型等多种类型间质胶原和蛋白多糖的核心蛋白；②明胶酶(IV型胶原酶)，包括明胶酶A(MMP-2)和明胶酶B(MMP-9)，降解明胶和IV、V、VII、X型基底膜胶原；③基质降解素(间质溶素)，分1、2、3与matrilysin(MMP-3、-10、-11、-7)型，降解弹性纤维、纤维连接蛋白、层粘蛋白等基质糖蛋白和蛋白多糖的核心蛋白；④膜型基质金属蛋白酶(MT-MMP)，包括MTI-MMP(MMP-14)、MT2-MMP(MMP-15)、MT3-MMP(MMP-16)、MT4-MMP(MMP-17)，能降解细胞外基质和活化其他MMPs；⑤其他酶类(MMP-12、-18、-19)，作用不详。

(2)MMPs系统与恶性肿瘤

研究发现，MMPs产生于正常组织细胞和肿瘤细胞中，以酶原形式分泌于细胞外间隙，激活后才能降解细胞外基质。一般地，肿瘤组织高分泌一种或几种MMPs，而正常组织不分泌或分泌量少。MMPs的活性调节受酶基因表达与调控、酶原合成与激活及抑制因子等多种因素的作用。MMPs系统紊乱，可出现相应的病理状态，尤其在肿瘤浸润、转移中的作用更为突出。研究发现，MMPs系统是肺癌进展的一个重要因素，MMP-9可作为肺癌进展的预测因素，并有助于治疗方案的选择。胃癌患者血清MMP-2和MMP-9前体物质含量均显著高于正常对照，故认为检测血清MMP-2和MMP-9前体水平可作为肿瘤标志物。结肠直肠癌的组织分化程度与间质胶原酶降解I型胶原蛋白的分解活性有显著相关性。原位杂交研究表明，原发性前列腺癌的上皮细胞和一些上皮增生不良灶内可见matrilysin表达，而基质中无此酶活性。MMPs可调节基质和肿瘤间的相互作用，在肝癌的生长和侵袭中起重要作用。如基质金属蛋白酶A(MMP-2)和基质金属蛋白酶B(MMP-9)已被认为是恶性肿瘤侵袭转移和预后的重要指标。综上所述，MMPs与肿瘤的发生发展、浸润转移密切相关。然而，我们亦可以把MMPs与肿瘤的这种密切关系加以利用，如利用肿瘤组织高分泌一种或几种MMPs，而正常组织不分泌或分泌量少的特点，进行抗肿瘤药物的靶向治疗。

本发明所设计的基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子融合蛋白的技术背景之二，就是利用肿瘤组织高分泌一种或几种MMPs，而正常组织不分泌或分泌量少的特点，在TNF-α与胶原蛋白序列之间，引入一种或一类MMPs的适宜底物序列，起肿瘤靶向作用。在肿瘤组织，融合蛋白能被肿瘤组织分泌的基质金属蛋白酶特异性切割，暴露出TNF-α的受体结合部位，表现出细胞毒作用；而在基质金属蛋白酶活性很低的大多数正常组织，融合蛋白不表现出细胞毒作用。

3.抗肿瘤导向药物的研究进展

由于全身应用抗肿瘤药物有较大的毒副作用，导向治疗(亦称靶向治疗)成为肿瘤治疗的热点。导向治疗就是利用某一载体与抗肿瘤药物结合，将药物特异性地运载到肿瘤靶细胞上，在肿瘤局部释放药物从而充分发挥药物独特的药理作用，针对性地杀死肿瘤细胞。导向治疗的效果依赖于其载体的导向性强弱和“弹头”的杀伤能力大小。目前常用的导向药物是以单克隆抗体为特异性载体制成的抗肿瘤单抗导向药物。1975年Kohler和Milstein建立单克隆抗体制作技术以来，单克隆抗体技术已经超出免疫学及细胞生物学范畴而应用于广泛领域并对推动其进步作出了巨大贡献。抗肿瘤单抗导向药物一般可包括两类：一是以抗肿瘤单抗为治疗剂；二是抗肿瘤单抗偶联物，或称免疫偶联物。免疫偶联物分子由单抗与“弹头”药物两部分构成。这些单抗所针对的靶标通常为肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原或特定的受体。用作“弹头”的物质主要有三类，即放射性核素、药物和毒素。有关单抗导向药物的实验与临床研究结果已为应用于治疗肿瘤展示良好的前景，但仍有些问题需要进一步研究解决。单抗导向药物存在的问题主要涉及免疫学和药理学两方面。免疫学方面问题主要是人抗鼠抗体(HAMA)反应。因为多年来用于临床研究的偶联物多数使用小鼠单抗制备，往往导致HAMA反应。此外，肿瘤细胞群体在抗原性方面的异质性，肿瘤细胞的抗原性弱等也可能影响偶联物的疗效。药理学方面的问题主要是到达肿瘤的药量不足。

为解决单抗导向药物应用中的问题和障碍，当前研究主要趋向包括3方面：①降低单抗偶联物的免疫原性；②提高单抗偶联物在肿瘤的浓度；③导向策略的探索。其中导向策略又包括：①活化酶与前体药物联合使用，在靶肿瘤进行酶活化。前体药物(prodrug)是指该药无治疗活性或仅有较低活性，需在体内经过代谢转化为活性型才显示药物活性。药物前体化策略在药物化学与化疗领域已得到应用，其优越性是可能降低毒性和延长药物体内作用的时间。②以特定受体或特定的基因表达蛋白为靶标。③以血管内皮细胞为靶标。

本发明所设计的基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子融合蛋白同时解决了肿瘤导向性和降低TNF-α毒副作用二个存在的主要问题，具备基质金属蛋白酶导向性的肿瘤靶向特征和杀伤肿瘤细胞作用，具有开发成肿瘤靶向治疗药物的前景。

发明内容

本发明的内容主要涉及一类基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子-α融合蛋白及其制备方法，进一步涉及所述融合蛋白基因、工程菌、融合蛋白在原核细胞中的表达、融合蛋白的分离纯化及体内外活性测定，因此，本发明的内容主要有以下几个方面：

本发明最重要的内容在于提供系列基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子-α融合蛋白，该系列融合蛋白是一类全新的分子，其特征在于氨基酸序列由三部分组成：从N-端开始依次为胶原蛋白序列、(一种或一类)人基质金属蛋白酶底物序列和人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，各序列之间有0～12个起连接作用的甘氨酸或任意氨基酸残基。其特征在于当肿瘤坏死因子-α形成三聚体化的活性形式时，其N-端胶原蛋白序列形成右手三股螺旋，肿瘤坏死因子-α的受体结合部位被胶原蛋白三股螺旋和基质金属蛋白酶底物序列所封闭，失去与肿瘤坏死因子受体(TNFR)识别和结合的能力。在肿瘤组织，融合蛋白能被肿瘤组织分泌的基质金属蛋白酶所切割，从而暴露出肿瘤坏死因子-α的受体结合部位而活化、表现出细胞毒作用；而在不分泌基质金属蛋白酶或活性很低的绝大多数正常组织，该融合蛋白不表现出细胞毒作用。与因为毒副作用过大而无法应用于临床肿瘤治疗的原型肿瘤坏死因子-α相比较，本发明制备的融合蛋白具有肿瘤靶向性、提高肿瘤特异性、减少全身用药量、降低毒副反应等优点，在临床肿瘤治疗方面有很好的应用前景。

本发明的第二个内容在于提供一系列基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子-α融合蛋白基因的原核表达质粒(pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF)，其特征在于每一个原核表达质粒均含编码胶原蛋白序列、(一种或一类)编码基质金属蛋白酶底物序列和编码人肿瘤坏死因子-α序列的融合蛋白基因，并能表达一种基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子-α融合蛋白。

本发明的第三内容在于提供一系列表达基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子-α融合蛋白的工程菌，其特征在于为带有一种pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF质粒的λDE3大肠杆菌，每一种工程菌均能表达一种基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子-α融合蛋白。

本发明的第四个内容在于提供基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子-α融合蛋白对恶性肿瘤细胞具有靶向作用和特异杀伤作用的证据。

本发明第五个内容在于提供一种获得基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子融合蛋白的制备方法，应用基因克隆技术，构建含胶原蛋白序列、基质金属蛋白酶底物序列和肿瘤坏死因子-α序列的融合基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中获得高效表达，再经分离纯化获得融合蛋白。

所述的获得基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子融合蛋白的制备方法，按以下步骤制备：

(1)人肿瘤坏死因子-αcDNA的克隆(pGEM-hTNF-α)

采用RT-PCR法，从LPS诱导的单核细胞扩增hTNF-αcDNA的编码区，并克隆到pGEM-T Easy载体，获得hTNF-α编码区的重组质粒，命名为pGEM-hTNF-α；

(2)胶原蛋白编码序列重组质粒pGEM-collagen的构建

人工合成胶原蛋白编码序列的正负互补链(两端分别加上Nco I和EcoR I半酶切位点)，退火成双链，定向克隆至pGEM-T Easy载体(Nco I和EcoR I双酶切)中，获得胶原蛋白编码序列的重组质粒，命名为pGEM-collagen；

(3)目的融合蛋白基因质粒系列(pGEM-collagen-MMPnm-hTNF)的构建

通过引物5′-端修饰的方式，上游引物引入针对一个或一类人金属蛋白酶的适宜底物序列中的一个，且上游和下游引物分别添加EcoR I和Sac I酶切位点，以pGEM-hTNF-α质粒为模板，通过PCR扩增所需的肿瘤坏死因子-α编码区，PCR产物经双酶切后，定向插入至pGEM-T-collagen重组质粒的相应双酶位点，获得编码胶原蛋白序列、人基质金属蛋白酶底物序列和人肿瘤坏死因子-α序列的目的融合蛋白基因克隆质粒系列，命名为pGEM-collagen-MMPnm-hTNF克隆质粒系列(其中MMPnm对应于相应的MMP及其序列编号)；

(4)目的融合蛋白基因原核表达质粒系列(pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF)的构建

pGEM-collagen-MMPnm-hTNF质粒系列的每一种质粒分别进行NcoI和Sac I双酶切，并将目的片段定向克隆至pET-32a(+)质粒，获得一系列目的融合蛋白基因原核表达质粒，命名为pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF原核表达质粒系列；

(5)目的融合蛋白表达工程菌系列的获得

用编码正确的pET-32a(+)-coll agen-MMPnm-hTNF质粒DNA，转化λDE3感受态大肠杆菌，筛选出经DNA测序确定序列正确的菌落作为工程菌，工程菌系列的每一种工程菌均能表达一种人基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子-α融合蛋白，命名为collagen-MMPnm-hTNF蛋白系列；

(6)目的融合蛋白的诱导表达

工程菌为IPTG诱导型表达菌，所述目的融合蛋白通过IPTG诱导表达；

(7)目的融合蛋白的分离和纯化

工程菌经IPTG诱导表达的融合蛋白，通过细菌裂解释放可溶性蛋白和包涵体；再通过Trx·Tag标签或His·Tag标签或S·Tag标签亲和层析纯化；然后通过肠激酶切除来自载体的标签部分，并通过Sephadex G-100或Sephadex G-75柱层析纯化目的融合蛋白。

所述目的融合蛋白基因原核表达质粒系列(pET-32a(+)-coll agen-MMPnm-hTNF)，为含编码胶原蛋白序列、编码(一种或一类)人基质金属蛋白酶底物序列和编码人肿瘤坏死因子-α序列的融合蛋白基因的一系列质粒。

所述目的融合蛋白表达工程菌系列为一系列带有pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF质粒的大肠杆菌，每一种工程菌均能表达一种基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子-α融合蛋白。

利用基因工程技术，本发明制备的基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子-α融合蛋白具备基质金属蛋白酶导向性的肿瘤靶向特征和杀伤肿瘤细胞作用，具有开发成临床肿瘤靶向治疗药物的前景。

附图说明

图1(即摘要附图)示出基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子融合蛋白的氨基酸序列由三部分组成：从N-端开始依次为胶原蛋白序列、人基质金属蛋白酶底物序列和人肿瘤坏死因子-α序列；

图2示出重组pET-32a(+)-collagen-MMP1，8a-hTNF表达质粒插入基因测序图谱；

图3示出重组pET-32a(+)-collagen-MMP1，8b-hTNF表达质粒插入基因测序图谱；

图4示出重组pET-32a(+)-collagen-MMP2，9a-hTNF表达质粒插入基因测序图谱；

图5示出重组pET-32a(+)-collagen-MMP2，9b-hTNF表达质粒插入基因测序图谱；

图6示出4种工程菌粗蛋白提取物SDS-PAGE电泳图谱，图谱中各泳道分别为：M为分子标准，1和3分别为工程菌(带pET-32a(+)-collagen-MMP1，8a-hTNF表达质粒)经1mM IPTG诱导4h(33℃)的和未经诱导的粗蛋白提取物，2和4分别为工程菌(带pET-32a(+)-collagen-MMP1，8b-hTNF表达质粒)经1mM IPTG诱导4h(33℃)的和未经诱导的粗蛋白提取物，5和6分别为工程菌(带pET-32a(+)-collagen-MMP2，9a-hTNF表达质粒)经1mM IPTG诱导4h(33℃)的和未经诱导的粗蛋白提取物，7和8分别为工程菌(带pET-32a(+)-collagen-MMP1，8b-hTNF表达质粒)经1mM IPTG诱导4h(33℃)的和未经诱导的粗蛋白提取物。

具体实施方式

本发明采用RT-PCR法，从LPS诱导的单核细胞扩增hTNF-αcDNA的编码区，并克隆到pGEM-T Easy载体，获得hTNF-α编码区的重组质粒，命名为pGEM-hTNF-α，基因序列与GenBank数据(GI：25952110)完全一致。

本发明采用人工合成胶原蛋白编码序列的正负互补链(两端分别加上Nco I和EcoR I双酶切位点)，退火成双链，定向克隆至pGEM-T Easy载体(NcoI和EcoRI双酶切)中，获得胶原蛋白编码序列的重组质粒，命名为pGEM-collagen，基因序列与设计一致。

本发明采用通过引物5′-端修饰的方式，上游引物引入金属蛋白酶底物序列，且上下游引物分别添加EcoR I和Sac I双酶切位点，以pGEM-hTNF-α质粒为模板，通过PCR扩增所需的肿瘤坏死因子-α编码区，PCR产物经双酶切后，定向插入至pGEM-T-col lagen重组质粒的相应双酶位点，获得编码胶原蛋白序列、基质金属蛋白酶底物序列和人肿瘤坏死因子-α序列的目的融合蛋白基因克隆质粒，命名为pGEM-collagen-MMPnm-hTNF克隆质粒系列(其中MMPnm对应于相应的MMP及其序列编号)。由于已发现的MMPs有19种之多，可分为5类，因此，对每一种或每一类MMPs均分别设计2-4个相应的适宜底物序列并构建相应的重组质粒，如以胶原酶类(主要包括MMP-1和MMP-8)的2个底物序列构建的质粒分别命名为pGEM-collagen-MMP1，8a-hTNF和pGEM-collagen-MMP1，8b-hTNF，依此类推。

每种pGEM-collagen-MMPnm-hTNF质粒分别进行NcoI和Sac I双酶切，并将目的片段定向克隆至pET-32a(+)质粒，获得一系列目的融合蛋白基因原核表达质粒，命名为pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF原核表达质粒系列，命名规则同前。

本发明采用编码正确的pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF原核表达质粒DNA，分别转化λDE3感受态大肠杆菌，筛选出经DNA测序确定序列正确的菌落作为工程菌，每一种工程菌均能表达一种基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子-α融合蛋白，蛋白质命名为collagen-MMPnm-hTNF蛋白系列。

本发明采用工程菌为IPTG诱导型表达菌，目的融合蛋白通过IPTG诱导表达，目的蛋白占总蛋白的50％左右，其中可溶性蛋白较少(占总蛋白的10％左右)，包涵体蛋白较多(占总蛋白的40％左右)。

工程菌经IPTG诱导表达的融合蛋白，通过细菌裂解释放可溶性蛋白和包涵体；再通过Trx·Tag标签或His·Tag标签或S·Tag标签亲和层析纯化；然后通过肠激酶切除来自载体的标签部分，并通过Sephadex G-100或Sephadex G-75柱层析纯化目的融合蛋白。

对4种基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子-α融合蛋白(collagen-MMP1，8a-hTNF、和collagen-MMP1，8b-hTNF、ollagen-MMP2，9a-hTNF蛋白和collagen-MMP2，9b-hTNF蛋白)进行了酶学分析和体外瘤实验。结果显示，未经相应的MMP活化的融合蛋白对多种肿瘤细胞的细胞毒作用很低(细胞杀伤率20％以下)，而经MMP活化的融合蛋白对L929细胞系具很高的细胞毒作用(细胞杀伤率70％以上)。

本发明的collagen-MMP2，9a-hTNF蛋白和collagen-MMP2，9b-hTNF蛋白是针对MMP-2和MMP-9设计的，分子中含MMP-2和MMP-9识别氨基酸序列。collagen-MMP2，9a-hTNF蛋白和collagen-MMP2，9b-hTNF蛋白对正常培养的HO8910卵巢癌细胞(未抑制MMPs)，最大剂量组细胞杀伤率分别达(74.3±11.2，％)和(81.0±15.0，％)；而对BB294抑制MMP-2和MMP-9活性的HO8910卵巢癌细胞，最大剂量组细胞杀伤率分别仅(26.4±8.1，％)和(25.6±4.0，％)。

以上结果提示，对本发明制备的系列基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子-α融合蛋白具备基质金属蛋白酶导向的肿瘤靶向性特征和杀伤肿瘤细胞作用，具有开发成肿瘤靶向治疗药物的前景。

以下将按实施例详细描述本发明

实施例1.人肿瘤坏死因子-αcDNA(pGEM-hTNF-α)的克隆

1.PCR引物及其序列(扩增产物650bp)

Sense primer：     5′CGGAATTCCTGCTGCACTTTGGAGTGATCG 3′

                   下划线处为EcoR I酶切位点

Anti-sense primer：5′GCGAGCTCGTTTGAGCCAGAAGAGGTTGAGGG 3′

                   下划线处为Sac I酶切位点

2.RT-PCR

按常规方法从人静脉血中分离单核细胞，LPS(100ng/ml)刺激3h后，提取细胞总RNA；以此为模板进行RT-PCR反应，反应总体积50μl。反应条件为：94℃变性1min，65℃退火1min，72℃延伸1min，共30次循环。

3.克隆

PCR产物经纯化后，EcoRI和SacI双酶切，再与双酶切pGEM-T Easy载体(NcoI和EcoRI双酶切)连接，并转化至大肠杆菌DH5α中。阳性克隆经测序确定后，得到hTNF-αcDNA的重组质粒，命名为pGEM-hTNF-α。

实施例2.胶原蛋白编码序列重组质粒pGEM-collagen的构建

1.胶原蛋白重复序列寡核苷酸序列

胶原蛋白序列其特征为氨基酸序列为(Gly-X-Y)n，其中X和Y代表除Gly(甘氨酸)以外的任意氨基酸(以脯氨酸最好)，n为任意正整数(代表重复次数)。因此，有多种符合此特征的序列，举例：正链(65nt)：

5′CATGGGTCGTCGTGGTCCACCTGGTCCACCTGGCCCACCTGGCCCACCTGGTCCACCTGGTCCGG 3′负链(65nt)：

5′AATTCCGGACCAGGTGGACCAGGTGGGCCAGGTGGGCCAGGTGGACCAGGTGGACCACGACGACC 3′

退火形成双链(双链两分别带的Nco I酶位点和EcoR I酶位点)

2.克隆

将退火形成的双链定向连接至pGEM-T Easy载体(NcoI和EcoRI双酶切)，并转化至大肠杆菌DH5α中。阳性克隆经测序确定后，获得胶原蛋白编码序列的重组质粒，命名为pGEM-collagen。

实施例3.目的融合蛋白基因质粒(pGEM-collagen-MMPnm-hTNF)的构建

1.PCR引物及其序列

由于已发现的MMPs有十多种，可分五大类，因此，每一类MMP均分别设计2-4个相应的适宜底物序列(通过引物设计实现)并构建相应的重组质粒，举例：

Anti-sense primer(对应于hTNF-α全长cDNA终止密码子及其后3个碱基位置)：

5′GCGAGCTCTCCTCACAGGGCAATGATCCCAAAG 3′

下划线处为SacI酶切位点

Sense primers(对应于hTNF-α全长cDNA位置410-431)：

5’CGGAATTCGGTGGT…………AGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTG 3’

其中，划线处为EcoR I酶切位，…………代表一类MMP的适宜底物序列(有许多种)。

引物举例(代表胶原酶和胶原酶适宜底物序列)：

1)含I型胶原酶适宜底物序列Sense primers(MMP1，8a和MMP1，8b)：

5’CGGAATTCGGTGGTCCACTGGCACTGTGGGCACGTAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTG 3’

5’CGGAATTCGGTGGTCCACTGGCATATTGGGCACGTAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTG 3’

2)含IV型胶原酶适宜底物序列Sense primers(MMP2，9a和MMP2.9b)：

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2.克隆

通过引物5′-端修饰的方式，上游引物引入金属蛋白酶底物序列，且上下游引物分别添加EcoRI和SacI双酶切位点，以pGEM-hTNF-α质粒为模板，通过PCR扩增所需的肿瘤坏死因子-α编码区，PCR产物经双酶切后，定向插入至pGEM-T-collagen重组质粒的相应双酶位点，获得编码胶原蛋白序列、基质金属蛋白酶底物序列和人肿瘤坏死因子-α序列的目的融合蛋白基因克隆质粒，命名为pGEM-collagen-MMPnm-hTNF(其中MMPnm对应于相应的MMP及其序列编号)。由于已发现的MMPs有十多种，可分五大类，因此，每一类MMP均分别设计2-4个相应的适宜底物序列并构建相应的重组质粒，如胶原酶(主要是MMP-1和MMP-8)的2个适宜底物序列构建的质粒分别命名为pGEM-collagen-MMP1，8a-hTNF和pGEM-collagen-MMP1，8b-hTNF，以明胶酶(主要是MMP-2和MMP-9)的2个适宜底物序列构建的质粒分别命名为pGEM-collagen-MMP2，9a-hTNF和pGEM-collagen-MMP2，9b-hTNF，依此类推。

实施例4.目的融合蛋白基因原核表达质粒(pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF)的构建

每种pGEM-collagen-MMPnm-hTNF质粒分别进行NcoI和Sac I双酶切，并将目的片段定向克隆至pET-32a(+)质粒，获得一系列目的融合蛋白基因原核表达质粒，命名为pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF，命名规则同实施例3。

举例：pET-32a(+)-collagen-MMP1，8a-hTNF和pET-32a(+)-collagen-MMP1，8b-hTNF表达质粒，均能表达带有胶原酶(主要是MMP-1和MMP-8)底物序列融合蛋白，并分别命名为collagen-MMP1，8a-hTNF蛋白和collagen-MMP1，8b-hTNF蛋白；pET-32a(+)-collagen-MMP2，9a-hTNF和pET-32a(+)-collagen-MMP2，9b-hTNF表达质粒，均能表达带有明胶酶(主要是MMP-2和MMP-9)底物序列融合蛋白，并分别命名为collagen-MMP2，9a-hTNF蛋白和collagen-MMP2，9b-hTNF蛋白。

4种原核表达质粒(pET-32a(+)-collagen-MMP1，8a-hTNF、pET-32a(+)-collagen-MMP1，8b-hTNF、pET-32a(+)-collagen-MMP2，9a-hTNF和pET-32a(+)-collagen-MMP2，9b-hTNF)的融合蛋白基因序列分别如序列表之序列1、序列2、序列3和序列4所示，测序图谱分别如图2，图3，图4和图5所示，其表达的融合蛋白(collagen-MMP1，8a-hTNF蛋白、collagen-MMP1，8b-hTNF蛋白、collagen-MMP2，9a-hTNF蛋白和collagen-MMP2，9b-hTNF)氨基酸序列分别如序列表之序列5、序列6、序列7和序列8所示。

实施例5.目的融合蛋白表达工程菌的获得

用实施例4中所述的每一种pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF质粒DNA，分别转化λDE3感受态大肠杆菌，筛选出经DNA测序确定序列正确的菌落作为工程菌，每一种工程菌均能表达一种基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子-α融合蛋白。

实施例6.目的融合蛋白的诱导表达

将测序正确的λDE3工程菌在含适当Amp的LB平板中重新划线后，挑取单克隆，接种入5mL含50μg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃摇床中振荡，培养过夜。取5mL过夜培养物接入500ml含氨苄青霉素(50ug/mL)的LB液体培养基中，37℃，250rpm，培养约3h，至对数生长中期(A₆₀₀＝0.6)，吸出1ml未经诱导的培养物放在一个1.5ml离心管中，14000g离心10min，弃上清，倒置使液体流干，过多的培养基由纸巾吸干。加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，30℃，250rpm继续培养，4h。将菌液置于冰上10min，4℃，10000g离心10min收集菌体。重悬细胞于0.25倍体积的预冷PBS中，4℃，10000g离心10min。

按每克菌体沉淀加入5mL BugBuster Protein Extraction Reagent重悬细胞，用枪尖吸打或涡旋。对于小量培养用1/5菌液量的BugBuster ProteinExtraction reagent(例如：1.5ml菌液用300ul reagent)，没必要提高用液比例以求更好的提取效果。重悬细胞时，每毫升reagent加入1μL BenzonaseNuclease，以降低容菌产物的粘滞度。室温下，摇床上孵育重悬菌液，10-20min。4℃，16,000g离心20min，将上清转移至另一新离心管中(可溶性蛋白部分)，保存沉淀(包涵体)。进行SDS-PAGE分析，结果显示目的蛋白占总蛋白的50％左右(如附图6所示)，进一步分析其中可溶性蛋白较少(约占总蛋白的10％左右)，包涵体蛋白较多(约占总蛋白的40％左右)。

实施例7.目的融合蛋白的纯化

工程菌IPTG诱导表达的融合蛋白，通过细菌裂解释放可溶性蛋白和包涵体；再通His·Tag标签亲和层析纯化；然后通过肠激酶切除载体所带标签部分，并通过Sephadex G-100层析纯化；-70℃冷冻干燥后低温保存。

1.蛋白纯化按Novagen公司BugBuster His.Bind Purification Kits试剂盒方法进行，Novagen Chromatography Columns可容纳2.5ml树脂，即5ml填料，用于20mg目的蛋白的纯化，具体操作步骤：

①首先用去离子水润洗column，轻轻将指帽套在column顶端，用大口径的移液器将适量的填料装入column(加入填料之前要将填料轻轻颠倒数次，充分混匀)，待树脂自然下沉压平，去掉指帽。

②当树脂储存缓冲液刚好流出柱顶时，用3倍体积去离子水、5倍体积1×charge buffer、3倍体积1×binding buffer，依次洗柱，使之平衡。

③当缓冲液刚刚流出柱顶时，上样。注意：最大流速不超过10倍体积/小时。

④用10倍体积1×binding buffer、6倍体积1×wash buffer依次洗柱。

⑤用6倍体积1×elute buffer洗脱目的蛋白。

⑥收集洗脱液，对20mM Tris-HCl(pH8.0)，1mEDTA溶液透析除盐。

2.肠激酶切除载体标签

由于表达产物是带有pET-32a(+)载体的Trx·Tag标签、His·Tag标签和S·Tag标签(标签分子量为17.5KDa)，需要通过肠激酶切除和层析纯化，

具体操作步骤：

肠激酶酶切，按Novagen公司重组肠激酶使用说明书进行，反应体系：融合蛋白1～1.5mg/ml，重组肠激酶2～3U，10×缓冲液10μl，温度(℃)23，时间8～12小时，酶切效果经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

3.Sephadex G-100层析纯化

酶切产物上充分平衡的Sephadex G-100柱，洗脱液为20mMPB(pH6.0)，0.1MNaCl溶液，连续洗脱4-5个柱床体积，收集各洗脱峰(280nm监测)，进行SDS-PAGE电泳检测，分子量20KDa的蛋白峰为目的蛋白(第二个蛋白峰)，-70℃冷冻干燥后低温保存。

举例说明：4种冷冻粉可分别称为collagen-MMP1，8a-hTNF蛋白、collagen-MMP1，8b-hTNF蛋白、collagen-MMP2，9a-hTNF蛋白和collagen-MMP2，9b-hTNF蛋白。

实施例8.金属蛋白酶对融合蛋白的去封闭效果研究

为了解本发明所述融合蛋白对受体结合部位的封闭效果及其MMPs的去封闭效果去，进行了人血清和MMPs酶的酶切融合蛋白实验。

反应体系为0.1mol/L Tris HCl缓冲液(pH 7.1)，0.05mol/L CaCl₂，10mg/L融合蛋白，加终浓度10％血清或10u/L MMP(与融合蛋白底物序列相一致的MMP)，37℃温育10分钟。反应产物称为去封闭融合蛋白。

检测：反应产物通过普通的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳后凝胶经考马斯亮兰染色，通过与蛋白质标准及融合蛋白(未经酶切)对比判断酶切效果，融合蛋白酶切后由原来一条带(20KDa)转变为二条带(17KDa和3KDa)。

举例说明结果：血清对4种融合蛋白均无切割作用；MMP-1和MMP-8均能切割collagen-MMP1，8a-hTNF蛋白和collagen-MMP1，8b-hTNF蛋白，MMP-2和MMP-9底物序列融合蛋白，均能切割collagen-MMP2，9a-hTNF蛋白和collagen-MMP2，9b-hTNF蛋白。

实施例9.基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子-α融合蛋白的TNF-α样活性检测

为了解本发明所述融合蛋白(未被酶切去封闭)和去封闭融合蛋白的TNF-α样生物学活性，进行了Act D致敏的L929细胞系进行细胞毒活性测定。

实验步骤：对数生长期L929细胞，按2×10⁴cells/孔(RPMI-1640培养基)加入96孔板中，37℃5％二氧化碳培养6小时；更换新鲜培养基后每孔加入终浓度1.0μg/ml Act D致敏，并分别加入融合蛋白和去封闭融合蛋白，终浓度为0.08μg/ml、0.4μg/ml、2.0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml，以标准品TNF-α作对照(剂量设置与与融合蛋白相同)，每个剂量3个平行孔，继续培养24小时；每孔均按终浓度500μg/ml加入MTT，继续培养4小时；弃去培养液后，每孔加DMSO 200μl，37℃温育30分钟，于酶标仪测A₅₇₀，换算出细胞杀伤率。

结果：举例说明，4种基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子-α融合蛋白的TNF-α样活性检测结果如表1所示，未被酶切去封闭的4种融合蛋白对L929细胞系的杀伤率均很低，各剂量组细胞杀伤率均低于20％；4种去封闭的融合蛋白对L929细胞系的杀伤率均较标准品TNF-α高：其中最大剂量组细胞杀伤率分别为标准品TNF-α(67.6±12.5，％)、collagen-MMP 1，8a-hTNF蛋白(72.7±202，％)、collagen-MMP 1，8b-hTNF蛋白(752±20.5，％)、collagen-MMP2，9a-hTNF蛋白(832±142，％)和collagen-MMP2，9b-hTNF蛋白(88.9±14.0，％)。

表14种基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子-α融合蛋白的TNF-α样活性(x±s，n＝3)

实施例10.基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子-α融合蛋白杀伤肿瘤细胞与MMP分泌的关系研究

为实验融合蛋白质的靶向性效果，需对融合蛋白杀伤肿瘤细胞与MMP分泌的关系进行研究。由于MMP-2和MMP-9已被认为是恶性肿瘤侵袭转移和预后的重要指标，故选用高分泌MMP-2和MMP-9的HO8910卵巢癌细胞。Batimastat(BB294)是新近研制的一种人工合成的基质金属蛋白酶(MMPs)抑制剂，其化学结构类似于MMPs胶原底物酶切位点附近的三个氨基酸的基本结构，因此，对MMPs起到竞争抑制作用。根据相关报道，本实验使用100mg/L BB294加入HO8910卵巢癌细胞培养液中，抑制MMP-2和MMP-9活性。分别用正常培养的HO8910卵巢癌细胞，及被BB294抑制MMP-2和MMP-9活性的HO8910卵巢癌细胞，进行融合蛋白的杀伤肿瘤细胞的TNF-α样生物学活性实验。

实验方案之细胞培养、融合蛋白使用剂量、细胞杀伤效果检测和细胞杀伤率计算基本上与实施例9相同。

结果：举例说明，本发明的collagen-MMP2，9a-hTNF蛋白和collagen-MMP2，9b-hTNF蛋白是针对MMP-2和MMP-9设计的，分子中含MMP-2和MMP-9识别的氨基酸序列。2种基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子-α融合蛋白对HO8910卵巢癌细胞的杀伤作用，结果如表2所示，collagen-MMP2，9a-hTNF蛋白和collagen-MMP2，9b-hTNF蛋白对正常培养的HO8910卵巢癌细胞(未抑制MMPs)，最大剂量组细胞杀伤率分别达(74.3±11.2，％)和(81.0±15.0，％)；而对BB294抑制MMP-2和MMP-9活性的HO8910卵巢癌细胞，最大剂量组细胞杀伤率分别仅(26.4±8.1，％)和(25.6±4.0，％)。提示融合蛋白分子中的MMP-2和MMP-9识别氨基酸序列具有导向作用。

表22种基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子-α融合蛋白对HO8910卵巢癌细胞的杀伤作用(x±s，n＝3)

广东医学院专利.SEQ

<110>广东医学院

<120>基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子融合蛋白及制备

<160>8

<210>1

<211>557

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gccatgggtc gtcgtggtcc acctggtcca cctggcccac ctggcccacc tggtccacct  60

ggtccggaat tcggtggtcc actggcactg tgggcacgta gtgacaagcc tgtagcccat 120

gttgtagcaa accctcaagc tgaggggcag ctccagtggc tgaaccgccg ggccaatgcc 180

ctcctggcca atggcgtgga gctgagagat aaccagctgg tggtgccatc agagggcctg 240

tacctcatct actcccaggt cctcttcaag ggccaaggct gcccctccac ccatgtgctc 300

ctcacccaca ccatcagccg catcgccgtc tcctaccaga ccaaggtcaa cctcctctct 360

gccatcaaga gcccctgcca gagggagacc ccagaggggg ctgaggccaa gccctggtat 420

gagcccatct atctgggagg ggtcttccag ctggagaagg gtgaccgact cagcgctgag 480

atcaatcggc ccgactatct cgactttgcc gagtctgggc aggtctactt tgggatcatt 540

gccctgtgag gagagct                                                557

<210>2

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<212>DNA

<213>人工序列

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gccatgggtc gtcgtggtcc acctggtcca cctggcccac ctggcccacc tggtccacct  60

ggtccggaat tcggtggtcc actggcatat tgggcacgta gtgacaagcc tgtagcccat 120

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<213>人工序列

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gccatgggtc gtcgtggtcc acctggtcca cctggcccac ctggcccacc tggtccacct  60

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gccctgtgag gagagct                                                557

<210>3

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

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ctcacccaca ccatcagccg catcgccgtc tcctaccaga ccaaggtcaa cctcctctct 360

gccatcaaga gcccctgcca gagggagacc ccagaggggg ctgaggccaa gccctggtat 420

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gccctgt gag gagagct                                               557

<210>4

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

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gccctgtgag gagagct                                                557

广东医学院专利.SEQ

<210>5

<211>182

<212>PRT

<213>人工序列

<400>5

Ala Met Gly Arg Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly

1               5                   10                  15

Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Glu Phe Gly Gly Pro Leu Ala Leu

                20                  25                  30

Trp Ala Arg Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val ValAla Asn Pro

                35                  40                  45

Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala

                50                  55                  60

Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val

                65                  70                  75

Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys

                80                  85                  90

Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile

                95                  100                 105

Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser

                110                 115                 120

Ala Ile Lys Ser Pro Cys GlnArg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu

                125                 130                 135

Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln

                140                 145                 150

Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp

                155                 160                 165

Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile

                170                 175                 180

Ala Leu

<210>6

<211>182

<212>PRT

<213>人工序列

<400>6

Ala Met Gly Arg Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly

1               5                   10                  15

Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Glu Phe Gly Gly Pro Leu Ala Tyr

                20                  25                  30

Trp Ala Arg Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro

                35                  40                  45

Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala

                50                  55                  60

Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val

                65                  70                  75

Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys

                80                  85                  90

Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile

                95                  100                 105

Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser

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Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu

                125                 130                 135

Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln

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Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu SerAla Glu Ile Asn Arg Pro Asp

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Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile

                170                 175                 180

Ala Leu

<210>7

<211>182

<212>PRT

<213>人工序列

<400>7

Ala Met Gly Arg Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly

1               5                   10                  15

Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Glu Phe Gly Gly Pro Leu Gly Leu

                20                  25                  30

Trp Ala Arg Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro

                35                  40                  45

Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala

                50                  55                  60

广东医学院专利.SEQ

Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val

                65                  70                  75

Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys

                80                  85                  90

Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile

                95                  100                 105

Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser

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Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu

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Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln

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Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp

                155                 160                 165

Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile

                170                 175                 180

Ala Leu

<210>8

<211>182

<212>PRT

<213>人工序列

<400>8

Ala Met Gly Arg Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly

1               5                   10                  15

Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Glu Phe Gly Gly Pro Leu Gly Met

                20                  25                  30

Trp Ser Arg Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro

                35                  40                  45

Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala

                50                  55                  60

Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val

                65                  70                  75

Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys

                80                  85                  90

Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile

                95                  100                 105

Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser

                110                 115                 120

Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu

                125                 130                 135

Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln

                140                 145                 150

Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp

                155                 160                 165

Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile

                170                 175                 180

Ala Leu

Claims (8)

1、一种基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子融合蛋白，其特征在于：这些新型融合蛋白的氨基酸序列由三部分组成：从N-端开始依次为胶原蛋白序列、人基质金属蛋白酶底物序列和人肿瘤坏死因子-α序列，各序列之间有0～12个起连接作用的甘氨酸或任意氨基酸残基。

2、据权利要求1所述的基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子融合蛋白，其特征在于：胶原蛋白序列的氨基酸序列为(Gly-X-Y)n，其中X和Y代表除甘氨酸以外的任意氨基酸，n为任意正整数(代表重复次数)；当肿瘤坏死因子-α形成三聚体化的活性形式时，胶原蛋白序列形成右手三股螺旋，并与人基质金属蛋白酶底物序列一起起到封闭肿瘤坏死因子-α受体结合部位的作用，肿瘤坏死因子-α失去与受体结合的能力。

3、据权利要求1所述的基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子融合蛋白，其特征在于：基质金属蛋白酶底物序列的氨基酸序列中含有(一种或一类)人基质金属蛋白酶能识别和切割的氨基酸序列。

4、据权利要求1所述的基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子融合蛋白，其特征在于：人肿瘤坏死因子-α为野生型或突变型人肿瘤坏死因子-α。

5、一种获得基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子融合蛋白的制备方法，其特征在于：应用基因克隆技术，构建含胶原蛋白序列、基质金属蛋白酶底物序列和肿瘤坏死因子-α序列的融合基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中获得高效表达，再经分离纯化获得融合蛋白。

6、据权利要求5所述的获得基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子融合蛋白的制备方法，其特征在于按以下步骤制备：

(1)人肿瘤坏死因子-αcDNA的克隆

采用RT-PCR法，从LPS诱导的单核细胞扩增人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)cDNA的编码区，并克隆到pGEM-T Easy载体，获得hTNF-α编码区的重组质粒，命名为pGEM-hTNF-α；

(2)胶原蛋白编码序列重组质粒pGEM-collagen的构建

人工合成胶原蛋白编码序列的正负互补链(两端分别加上Nco I和EcoR I半酶切位点)，退火成双链，定向克隆至pGEM-T Easy载体(Nco I和EcoR I双酶切)，获得胶原蛋白编码序列的重组质粒，命名为pGEM-collagen；

(3)目的融合蛋白基因质粒系列(pGEM-collagen-MMPnm-hTNF)的构建

通过引物5′-端修饰的方式，上游引物引入针对一个或一类人金属蛋白酶的适宜底物序列中的一个，且上游和下游引物分别添加EcoR I和Sac I酶切位点，以pGEM-hTNF-α质粒为模板，通过PCR扩增所需的肿瘤坏死因子-α编码区，PCR产物经双酶切后，定向插入至pGEM-T-collagen重组质粒的相应双酶位点，获得编码胶原蛋白序列、人基质金属蛋白酶底物序列和人肿瘤坏死因子-α序列的目的融合蛋白基因的克隆质粒系列，命名为pGEM-collagen-MMPnm-hTNF克隆质粒系列(其中MMPnm对应于相应的MMP及其序列编号)；

(4)目的融合蛋白基因原核表达质粒系列(pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF)的构建

pGEM-collagen-MMPnm-hTNF质粒系列的每一种质粒分别进行NcoI和SacI双酶切，并将目的片段定向克隆至pET-32a(+)质粒，获得一系列目的融合蛋白基因的原核表达质粒，命名为pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF原核表达质粒系列；

(5)目的融合蛋白表达工程菌系列的获得

用编码正确的pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF质粒DNA，转化λDE3感受态大肠杆菌，筛选出经DNA测序确定序列正确的菌落作为工程菌，工程菌系列的每一种工程菌均能表达一种人基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子-α融合蛋白，命名为collagen-MMPnm-hTNF蛋白系列；

(6)目的融合蛋白的诱导表达

工程菌为IPTG诱导型表达菌，所述目的融合蛋白通过IPTG诱导表达；

(7)目的融合蛋白的分离和纯化

工程菌经IPTG诱导表达的融合蛋白，通过细菌裂解释放可溶性蛋白和包涵体；再通过Trx·Tag标签或His·Tag标签或S·Tag标签亲和层析纯化；然后通过肠激酶切除来自载体的标签部分，并通过Sephadex G-100或SephadexG-75柱层析纯化目的融合蛋白。

7、据权利要求6所述的获得基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子融合蛋白的制备方法，其特征在于：目的融合蛋白基因原核表达质粒系列(pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF)，为含编码胶原蛋白序列、编码(一种或一类)人基质金属蛋白酶底物序列和编码人肿瘤坏死因子-α序列的融合蛋白基因的一系列质粒。

8、据权利要求6所述的获得基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子融合蛋白的制备方法，其特征在于：目的融合蛋白表达工程菌系列为一系列带有pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF质粒的大肠杆菌，每一种工程菌均能表达一种基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子-α融合蛋白。

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