CN102675465A - 重组人ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法 - Google Patents

重组人ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白(rhTNFR-Fc)的纯化方法，所述的方法包括步骤：(1)将含有rhTNFR-Fc粗品的溶液和疏水层析介质接触，使rhTNFR-Fc上样到疏水层析介质上；和(2)用洗脱缓冲液将rhTNFR-Fc从疏水层析介质上洗脱下来，得到纯化的rhTNFR-Fc。

Description

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法
技术领域
本发明涉及蛋白质纯化，尤其涉及一种重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法。 
背景技术
类风湿性关节炎的诱因尚在研究之中，可能包括感染、自身免疫及遗传等因素。这种对人体不利的非正常发炎反应与免疫系统中某些细胞生长因子的失衡有密切的关系。TNF(肿瘤坏死因子)是这类细胞生长因子中的重要一员。抑制TNF的活性成为治疗类风湿性关节炎最关键的环节之一。 
TNFR-Fc是TNFR(肿瘤坏死因子受体)与人免疫球蛋白IgG的Fc片段组成的融合蛋白。TNFR可以分为两型：I型TNFR和II型TNFR，它们都可以从细胞表面脱落形成可溶性TNF受体，即sTNFRI与sTNFRII。由于这些可溶性的TNFR可与TNF结合，所以又被称为TNF结合蛋白，两种受体中以II型分布更为广泛，与肿瘤坏死因子的结合力更强。一般认为，可溶性TNFR可以结合TNF，从而抑制TNF的活性，可以作为TNF的拮抗剂。由于TNFR-Fc可以通过Fc形成二聚体结构，比非聚体的sTNFR更加稳定。 
TNFR-Fc通过竞争性地与血中TNF结合，阻断它和细胞表面TNFR的结合，从而减少滑膜细胞的增生，抑制软骨细胞、纤维母细胞等释放基质金属蛋白酶(MMP)，抑制滑膜细胞、内皮细胞、巨噬细胞释放前列腺素，阻止白细胞向炎症部位转移和聚集，同时也通过网络作用使IL-1、IL-6、IL-8相应地减少，因此有抗炎和减缓类风湿关节炎病情恶化发展的作用。 
rhTNFR-Fc的纯化方法一般使用蛋白质化学中常规使用的蛋白纯化方法，例如：使用盐析法、超滤法、等电点沉淀法、电泳法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、亲和层析法等。 
进行rhTNFR-Fc工业生产时，生产过程中形成了由多个rhTNFR-Fc单体以共价或非共价形式聚合在一起的多聚体(“rhTNFR-Fc多聚体)。从医药的安全性角度出发，药用“rhTNFR-Fc”检定规程中对rhTNFR-Fc多聚体含量有严 格要求，因此在制造上，有效去除rhTNFR-Fc多聚体是非常重要的。 
凝胶过滤层析法常用于去除多聚体，在实验室范围使用较多，但在大规模生产中凝胶过滤层析技术有其很大的局限性，具体局限性主要有以下四点：1、处理量小。凝胶过滤层析要达到较好的分离效果，其上样量不能大于柱床体积的5％，上样体积小，所以处理样品量小；2、耗时长。要达到较好的分离效果，其操作流速较慢，线速度一般要小于30cm/h，处理周期长；3、层析柱装填难度大。凝胶过滤层析对柱效要求较高，而大规模层析柱装填要得到装填出高的的理论塔板数和好的对称因子的层析柱会较难；4、样品稀释严重。凝胶层析过程中引起样品的稀释，同时增大了样品体积，增加后续处理难度。 
综上，使用凝胶过滤层析来去除多聚体，如果要达到较好效果，只能通过增加柱高度和分多次处理样品。这样在生产中不仅大大延长了生产周期，降低了生产效率，而且对装柱要求高，增加了生产技术难度。另外，生产过程处理时间过长可能对目标蛋白的稳定性及生物活性等产生不良影响。 
所以，在实际大规模生产中需要找到一种更加有效、方便和快速的方法。 
发明内容
本发明旨在提供一种有效、方便和快速的纯化重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR-Fc)的方法。 
在本发明中，提供了一种重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR-Fc)的纯化方法，所述的方法包括步骤： 
(1)将含有rhTNFR-Fc粗品的溶液和疏水层析介质接触，使rhTNFR-Fc上样到疏水层析介质上；和 
(2)用洗脱缓冲液将rhTNFR-Fc从疏水层析介质上洗脱下来，得到纯化的rhTNFR-Fc。 
上述提供的纯化方法能够有效的去除多聚体，降低其免疫原性。 
在上述提供的纯化方法中，所述步骤(1)是将含有rhTNFR-Fc粗品的溶液流过装载有疏水层析介质的层析柱，使rhTNFR-Fc上样到疏水层析介质上；所述上样量是5-20g/L疏水层析介质。 
在上述提供的纯化方法中，所述的疏水层析介质使用琼脂糖、或聚甲基丙烯酸作为基质，使用苯基配基疏水作用基团、或丁基配基疏水作用基团。 
在上述提供的纯化方法中，步骤(1)中所述含有rhTNFR-Fc粗品的溶液的电导率为80-140ms/cm。 
在上述提供的纯化方法中，步骤(1)中所述疏水层析介质是用平衡缓冲液平衡的；所述平衡缓冲液pH 6-8，电导率为80-140ms/cm；所述平衡缓冲液选自Tris-HCl缓冲液或磷酸缓冲液。 
在上述提供的纯化方法中，步骤(2)中所述洗脱缓冲液pH 6-8，电导率为15-55ms/cm；所述洗脱缓冲液选自Tris-HCl缓冲液或磷酸缓冲液。 
据此，本发明提供了一种在实际大规模生产中，可以有效、方便和快速的纯化重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR-Fc)的方法。 
附件说明 
图1显示了实施例1中上样样品SEC-HPLC分析的图谱。图2显示了实施例1中层析洗脱液SEC-HPLC分析的图谱。 
图3显示了实施例2中上样样品SEC-HPLC分析的图谱。 
图4显示了实施例2中层析洗脱液SEC-HPLC分析的图谱。 
图5显示了实施例3中上样样品SEC-HPLC分析的图谱。 
图6显示了实施例3中层析洗脱液SEC-HPLC分析的图谱。 
图7显示了实施例4中上样样品SEC-HPLC分析的图谱。 
图8显示了实施例4中层析洗脱液SEC-HPLC分析的图谱。 
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，发现了一种能方便应用于工业化生产中，且仅实施单步骤工序即能有效去除rhTNFR-Fc多聚体的方法。即将调节好的含有rhTNFR-Fc多聚体的rhTNFR-Fc溶液与用平衡缓冲液平衡化的疏水层析介质相接触，吸附rhTNFR-Fc，再使用洗脱缓冲液选择性地将吸附在层析柱上的rhTNFR-Fc洗脱，而rhTNFR-Fc多聚体因其疏水性较强而保留吸附在疏水层析介质上，以此达到去除rhTNFR-Fc多聚体的效果。在此基础上完成了本发明。 
具体地，本发明提供的纯化重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR-Fc)的方法包括步骤： 
第一步，是将含有rhTNFR-Fc多聚体的rhTNFR-Fc溶液与用平衡缓冲液平衡化的疏水层析介质相接触，疏水层析介质吸附rhTNFR-Fc； 
第二步，是使用洗脱缓冲液与疏水层析介质相接触，选择性地将吸附在层析柱上的rhTNFR-Fc洗脱，回收流出组分。 
本发明的方法为适当调节含有rhTNFR-Fc多聚体的rhTNFR-Fc溶液的电导率和pH值后，将该rhTNFR-Fc溶液与以相同pH值、电导率的缓冲液平衡化的疏水层析介质相接触，通过疏水层析介质吸附rhTNFR-Fc，再使用适当pH值、电导率的缓冲液与疏水层析介质接触选择性洗脱rhTNFR-Fc，进而回收高纯度的rhTNFR-Fc为特征。通过实施这种方法，能够有效去除rhTNFR-Fc多聚体，得到基本不含有rhTNFR-Fc多聚体的高纯度的rhTNFR-Fc。 
本发明所使用的平衡缓冲液和洗脱缓冲液的种类没有特定的限制，优选使用常规的疏水作用层析时使用的Tris-HCl缓冲液和磷酸缓冲液。缓冲液中缓冲成分的浓度一般根据进行疏水作用层析的条件设定。即优选5-50mM，尤其优选10-30mM。 
平衡缓冲液的pH和电导率设定为能够使rhTNFR-Fc单体吸附到疏水层析介质上为佳。即pH6-8范围和电导率80-140ms/cm范围，优选pH6.5-7.5范围和电导率85-125ms/cm范围(更佳地为100-120ms/cm)。 
洗脱缓冲液的pH和电导率设定为能够选择性地使吸附在疏水层析介质上的rhTNFR-Fc洗脱下来的范围为佳。即，pH6-8范围和电导率15-55ms/cm范围，优选pH6.5-7.5范围和电导率15-35ms/cm范围(更佳地为18-25ms/cm)。 
为调节电导率向平衡缓冲液中添加的盐可以是硫酸铵、氯化钠、氯化钾等，优选使用硫酸铵。该盐在平衡缓冲液中的浓度优选能够吸附rhTNFR-Fc的浓度范围，根据所用的缓冲液的种类、浓度以及pH的组合，适当的进行调整。优选使用硫酸铵在平衡缓冲液中的浓度为0.55-1.00M，尤其优选0.55-1.00M。 
为调节电导率向洗脱缓冲液中添加的盐可以使用硫酸铵、氯化钠、氯化钾等，优选使用硫酸铵。该盐在洗脱缓冲液中的浓度优选能基本洗脱单体的浓度范围，根据所用的缓冲液的种类、浓度以及pH的组合，适当的进行调整。优选使用硫酸铵在平衡缓冲液中的浓度为0.08-0.35M，尤其优选0.08-0.20M。 
只要在该蛋白的溶解浓度范围内，不特殊限定蛋白溶液中的rhTNFR-Fc的浓度，优选3-12mg/ml，尤其优选5-10mg/ml。 
只要在疏水层析介质载量范围内，不特殊限定上样蛋白溶液中的rhTNFR-Fc的总量，优选5-20g/L疏水层析介质的rhTNFR-Fc载量上样，尤其优选10-15g/L疏水层析介质rhTNFR-Fc载量上样。 
不特殊限定疏水层析介质，优选对rhTNFR-Fc无非特异性吸附的基质，如琼脂糖、聚甲基丙烯酸。此外，疏水作用基团既可以使用苯基配基疏水作用基团也可以使用丁基配基疏水作用基团，优选使用苯基配基疏水作用基团。所说的具有苯基配基的疏水层析介质选自Phenyl-600M(TOSOH公司制)，或PhenylSepharoseTM Fast Flow(GE公司制)，不过没有特殊限定。 
作为使用疏水层析介质去除rhTNFR-Fc多聚体的方法，是一种采用通过将含有rhTNFR-Fc多聚体的rhTNFR-Fc溶液加到疏水作用介质上，使疏水层析介质的吸附rhTNFR-Fc，再使用洗脱缓冲液选择性洗脱rhTNFR-Fc组分的方法，使用该方法能使样品中rhTNFR-Fc多聚体含量降至5％以下。该蛋白多聚体的去除程度可以用分子筛高效液相层析(SEC-HPLC)分析的方法进行测定。例如：使用TSKgel G3000SW(TOSOH公司制)分析柱，以0.1M KH2PO4/0.15M Nacl缓冲液进行洗脱，于280nm进行吸光度检测。 
如本文所用，“rhTNFR-Fc的纯度”或“rhTNFR-Fc的SEC-HPLC纯度”可以互换使用，都是指在本发明提供的分子筛高效液相色谱(SEC-HPLC)检测条件下，测得的rhTNFR-Fc的峰面积和所有峰的峰面积之和的百分比。 
如本文所用，“rhTNFR-Fc粗品”是指含有rhTNFR-Fc多聚体的rhTNFR-Fc，在本发明提供的SEC-HPLC检测条件下，rhTNFR-Fc的含量＜90％的混合物。可以使用本领域现有的方法得到rhTNFR-Fc的粗品，例如但不限于通过以下描述的方法得到。将含有重组宿主来源的夹杂物的rhTNFR-Fc溶液通过超滤、亲和层析、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤以及盐析等处理步骤，进行一定程度的纯化。生产rhTNFR-Fc所使用的宿主，没有特殊的限制。例如可以是：酵母、大肠杆菌、枯草杆菌以及动物细胞等，其中较好的是动物细胞。例如：中国仓鼠卵巢细胞。 
如本文所用，“上样”是指将含有rhTNFR-Fc粗品的溶液和疏水层析介质接触，使rhTNFR-Fc粗品吸附到疏水层析介质上的过程。所述的接触包括将疏水层析介质直接投入溶液中，然后搅拌吸附；还有将疏水层析介质装入层析装置中，使溶液流过层析柱。 
“平衡”疏水层析介质，指使合适的缓冲液在疏水层析介质中或上通过。 
如本文所用，“平衡缓冲液”指在洗脱目标重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR-Fc)之前，用来平衡疏水层析介质的缓冲液。方便的，平衡缓冲液和上样缓冲液可以是同一pH值、电导率，但这不是必须的。 
将分子从疏水层析介质上“洗脱”下来，指通过改变疏水层析介质周围的缓冲液极性从疏水层析介质上除下该分子，该极性能使缓冲液与分子竞争疏水层析介质上的吸附位点。 
如本文所用，“洗脱缓冲液”用来将目标蛋白rhTNFR-Fc从固相上洗脱下来。洗脱缓冲液的pH值和电导率能使目标蛋白rhTNFR-Fc从疏水层析介质上洗脱下来。 
从含有目标蛋白rhTNFR-Fc和一种或多种非目标蛋白的组合物中“纯化”rhTNFR-Fc，指通过从组合物中(完全或部分的)除去至少一种非目标蛋白的成分来提高rhTNFR-Fc的纯度。 
在本发明的一个实施例中，所述rhTNFR-Fc的纯化方法包括步骤： 
第一步，使用平衡缓冲液平衡疏水层析柱至与平衡缓冲液电导pH一致，紫外吸收平稳后紫外调零； 
第二步，将含有rhTNFR-Fc粗品的溶液上样至第一步获得的平衡化的疏水层析柱，使含有rhTNFR-Fc粗品的溶液与层析介质相接触，疏水层析介质吸附rhTNFR-Fc；上样流速为130cm/小时(h)； 
第三步，使用平衡缓冲液以130cm/小时(h)的流速淋洗层析柱，至紫外吸收平稳并接近基线； 
第四步，使用洗脱缓冲液洗脱层析柱，选择性地将吸附在层析柱上的rhTNFR-Fc洗脱，回收流出组分；流速110cm/小时(h)。 
上述方法中的平衡缓冲液是含硫酸铵的Tris缓冲液(pH6-8，电导率80-140ms/cm)；洗脱缓冲液是含硫酸铵的Tris缓冲液(pH6-8，电导率15-55ms/cm)； 
上述方法中的层析柱介质是Phenyl-600M(TOSOH公司制)，或PhenylSepharoseTM  Fast Flow(GE公司制)； 
上述方法中的含有rhTNFR-Fc粗品的溶液的电导率在80-140ms/cm。 
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。 
本发明的主要优点在于： 
1、在工业生产上根据本发明，用含有rhTNFR-Fc多聚体的rhTNFR-Fc溶液调制成选定的缓冲液成分，将此溶液与疏水层析介质进行接触，进而有效地除去rhTNFR-Fc多聚体。 
2、根据本发明的方法，能够提供基本不含有可能造成人体用药时引发过敏反应等副作用的rhTNFR-Fc多聚体的高纯度的rhTNFR-Fc。 
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。 
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。 
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。 
实施例1 
材料和系统： 
层析介质：phenyl-600M(TOSOH公司制) 
层析柱：XK16(GE公司制) 
层析柱体积：10mL 
层析系统：AKTA explorer(GE公司制) 
上样样品：rhTNFR-Fc溶液，该蛋白由中国仓鼠卵巢细胞表达，经初步纯化后纯度86.71％，含多聚体13.29％，蛋白总浓度6.2g/L，体积20mL，并调至pH7.0，电导率100ms/cm(使用硫酸铵调节电导率)。 
平衡缓冲液：含硫酸铵的20mM Tris缓冲液(pH7.0，电导率100ms/cm) 
洗脱缓冲液：含硫酸铵的20mM Tris缓冲液(pH7.0，电导率20ms/cm) 
实施方法： 
1.平衡：使用平衡缓冲液平衡层析柱5个柱体积，至电导100ms/cm，pH7.0，紫外吸收平稳后紫外调零； 
2.上样：流速130cm/h完成上样； 
3.流洗：使用平衡缓冲液淋洗层析柱5个柱体积，至紫外吸收平稳并接近基线。流速130cm/h； 
4.洗脱：使用洗脱缓冲液洗脱层析柱，流速110cm/h，，收集蛋白峰为层析洗脱液。 
结果见图1和与其相应的表1，图2和与其相应的表2。 
表1上样样品SEC-HPLC分析结果 
表2层析洗脱液SEC-HPLC分析结果 
层析洗脱液采用体积排阻色谱法进行测定多聚体含量： 
测定条件为：色谱柱TSKgel G3000SW(TOSOH公司制)、色谱柱(30cm*7.8mm，5um)、上样量为30ug、流动相为100mM PB缓冲液(pH7.0，含150mM NaCl)，检测波长为280nm。 
结果表明，多聚体含量由上样样品的13.29％降为洗脱液的3.34％，rhTNFR-Fc纯度由上样样品的86.71％提高到洗脱液的96.66％。 
实施例2 
材料和系统： 
层析介质：phenyl-600M(TOSOH公司制) 
层析柱：XK16(GE公司制) 
层析柱体积：10mL 
层析系统：AKTA explorer(GE公司制) 
上样样品：rhTNFR-Fc溶液，该蛋白由中国仓鼠卵巢细胞表达，经初步纯化后纯度86.71％，含多聚体13.29％，蛋白总浓度6.2g/L，体积30mL，并调节至pH7.5，电导率120ms/cm(使用硫酸铵调节电导率)。 
平衡缓冲液：含硫酸铵的30mM Tris缓冲液(pH7.5，电导率120ms/cm) 
洗脱缓冲液：含硫酸铵的30mM Tris缓冲液(pH7.5，电导率18ms/cm) 
实施方法： 
1.平衡：使用平衡缓冲液平衡层析柱5个柱体积，至电导120ms/cm，pH7.5，紫外吸平稳后紫外调零； 
2.上样：流速130cm/h完成上样； 
3.流洗：使用平衡缓冲液淋洗层析柱5个柱体积，至紫外吸收平稳并接近基线。流速130cm/h； 
4.洗脱：使用洗脱缓冲液洗脱层析柱，流速110cm/h，，收集蛋白峰为层析洗脱液。 
结果见图3和与其相应的表3，图4和与其相应的表4。 
表3上样样品SEC-HPLC分析结果 
Figure BSA00000446635200091
表4层析洗脱液SEC-HPLC分析结果 
Figure BSA00000446635200101
层析洗脱液采用体积排阻色谱法进行测定多聚体含量： 
测定条件为：色谱柱TSKgel G3000SW(TOSOH公司制)、色谱柱(30cm*7.8mm，5um)、上样量为30ug、流动相为100mM PB缓冲液(pH7.0，含150mM NaCl)，检测波长为280nm。 
结果表明，多聚体含量由上样样品的13.29％降为洗脱液的2.65％，rhTNFR-Fc纯度由上样样品的86.71％提高到洗脱液的97.35％。 
实施例3 
材料和系统： 
层析介质：Phenyl SepharoseTM Fast Flow(GE公司制) 
层析柱：XK16(GE公司制) 
层析柱体积：10mL 
层析系统：AKTA explorer(GE公司制) 
上样样品：rhTNFR-Fc溶液，该蛋白由中国仓鼠卵巢细胞表达，经初步纯化后纯度86.71％，含多聚体13.29％，蛋白总浓度6.2g/L，体积20mL，并调节至pH7.8，电导率120ms/cm(使用硫酸铵调节电导率)。 
平衡缓冲液：含硫酸铵的20mM Tris缓冲液(pH7.8，电导率120ms/cm) 
洗脱缓冲液：含硫酸铵的20mM Tris缓冲液(pH7.8，电导率25ms/cm) 
实施方法： 
1.平衡：使用平衡缓冲液平衡层析柱5个柱体积，至电导120ms/cm，pH7.8，紫外吸平稳后紫外调零； 
2.上样：流速130cm/h完成上样； 
3.流洗：使用平衡缓冲液淋洗层析柱5个柱体积，至紫外吸收平稳并接近基线。流速130cm/h； 
4.洗脱：使用洗脱缓冲液洗脱层析柱，流速110cm/h，，收集蛋白峰为层析 洗脱液。 
结果见图5和与其相应的表5，图6和与其相应的表6。 
表5上样样品SEC-HPLC分析结果 
Figure BSA00000446635200111
表6层析洗脱液SEC-HPLC分析结果 
Figure BSA00000446635200112
层析洗脱液采用体积排阻色谱法进行测定多聚体含量： 
测定条件为：色谱柱TSKgel G3000SW(TOSOH公司制)、色谱柱(30cm*7.8mm，5um)、上样量为30ug、流动相为100mM PB缓冲液(pH7.0，含150mM NaCl)，检测波长为280nm。 
结果表明，多聚体含量由上样样品的13.29％降为洗脱液的3.13％，rhTNFR-Fc纯度由上样样品的86.71％提高到洗脱液的96.87％。 
实施例4 
材料和系统： 
层析介质：Phenyl SepharoseTM Fast Flow(GE公司制) 
层析柱：XK16(GE公司制) 
层析柱体积：10mL 
层析系统：AKTA explorer(GE公司制) 
上样样品：rhTNFR-Fc溶液，该蛋白由中国仓鼠卵巢细胞表达，经初步纯化后纯度86.71％，含多聚体13.29％，蛋白总浓度6.2g/L，体积15mL，并调节至pH7.5，电导率90ms/cm(使用硫酸铵调节电导率)。 
平衡缓冲液：含硫酸铵的30mM Tris缓冲液(pH7.5，电导率90ms/cm) 
洗脱缓冲液：含硫酸铵的30mM Tris缓冲液(pH7.5，电导率20ms/cm) 
实施方法： 
1.平衡：使用平衡缓冲液平衡层析柱5个柱体积，至电导90ms/cm，pH7.5，紫外吸平稳后紫外调零； 
2.上样：流速130cm/h完成上样； 
3.流洗：使用平衡缓冲液淋洗层析柱5个柱体积，至紫外吸收平稳并接近基线。流速130cm/h； 
4.洗脱：使用洗脱缓冲液洗脱层析柱，流速110cm/h，，收集蛋白峰为层析洗脱液。 
结果见图7和与其相应的表7，图8和与其相应的表8。 
表7上样样品SEC-HPLC分析结果 
Figure BSA00000446635200121
表8层析洗脱液SEC-HPLC分析结果 
Figure BSA00000446635200122
层析洗脱液采用体积排阻色谱法进行测定多聚体含量： 
测定条件为：色谱柱TSKgel G3000SW(TOSOH公司制)、色谱柱(30cm*7.8mm，5um)、上样量为30ug、流动相为100mM PB缓冲液(pH7.0，含150mM NaCl)，检测波长为280nm。 
结果表明，多聚体含量由上样样品的13.29％降为洗脱液的3.05％，rhTNFR-Fc纯度由上样样品的86.71％提高到洗脱液的96.95％。 
实施例5 
材料和系统： 
层析介质：Phenyl SepharoseTM Fast Flow(GE公司制) 
层析柱：XK16(GE公司制) 
层析柱体积：10mL 
层析系统：AKTA explorer(GE公司制) 
上样样品：rhTNFR-Fc溶液，该蛋白由中国仓鼠卵巢细胞表达，经初步纯化后纯度86.71％，含多聚体13.29％，蛋白总浓度6.2g/L，体积10mL，并调节至pH6.5，电导率135ms/cm(使用硫酸铵调节电导率)。 
平衡缓冲液：含硫酸铵的50mM Tris缓冲液(pH6.5，电导率135ms/cm) 
洗脱缓冲液：含硫酸铵的50mM Tris缓冲液(pH6.5，电导率35ms/cm) 
实施方法： 
1.平衡：使用平衡缓冲液平衡层析柱5个柱体积，至电导135ms/cm，pH6.5，紫外吸平稳后紫外调零； 
2.上样：流速130cm/h完成上样； 
3.流洗：使用平衡缓冲液淋洗层析柱5个柱体积，至紫外吸收平稳并接近基线。流速130cm/h； 
4.洗脱：使用洗脱缓冲液洗脱层析柱，流速110cm/h，，收集蛋白峰为层析洗脱液。 
结果见表9和表10。 
表9上样样品SEC-HPLC分析结果 
Figure BSA00000446635200131
表10层析洗脱液SEC-HPLC分析结果 
Figure BSA00000446635200141
层析洗脱液采用体积排阻色谱法进行测定多聚体含量： 
测定条件为：色谱柱TSKgel G3000SW(TOSOH公司制)、色谱柱(30cm*7.8mm，5um)、上样量为30ug、流动相为100mM PB缓冲液(pH7.0，含150mM NaCl)，检测波长为280nm。 
结果表明，多聚体含量由上样样品的13.29％降为洗脱液的3.31％，rhTNFR-Fc纯度由上样样品的86.71％提高到洗脱液的96.69％。 
实施例6 
材料和系统： 
层析介质：phenyl-600M(TOSOH公司制) 
层析柱：XK16(GE公司制) 
层析柱体积：10mL 
层析系统：AKTA explorer(GE公司制) 
上样样品：rhTNFR-Fc溶液，该蛋白由中国仓鼠卵巢细胞表达，经初步纯化后纯度86.71％，含多聚体13.29％，蛋白总浓度6.2g/L，体积15mL，并调节至pH7.0，电导率85ms/cm(使用硫酸铵调节电导率)。 
平衡缓冲液：含硫酸铵的10mM Tris缓冲液(pH7.0，电导率85ms/cm) 
洗脱缓冲液：含硫酸铵的10mM Tris缓冲液(pH7.0，电导率45ms/cm) 
实施方法： 
1.平衡：使用平衡缓冲液平衡层析柱5个柱体积，至电导85ms/cm，pH7.0，紫外吸平稳后紫外调零； 
2.上样：流速130cm/h完成上样； 
3.流洗：使用平衡缓冲液淋洗层析柱5个柱体积，至紫外吸收平稳并接近基线。流速130cm/h； 
4.洗脱：使用洗脱缓冲液洗脱层析柱，流速110cm/h，，收集蛋白峰为层析 洗脱液。 
结果见表11和表12。 
表11上样样品SEC-HPLC分析结果 
Figure BSA00000446635200151
表12层析洗脱液SEC-HPLC分析结果 
Figure BSA00000446635200152
层析洗脱液采用体积排阻色谱法进行测定多聚体含量： 
测定条件为：色谱柱TSKgel G3000SW(TOSOH公司制)、色谱柱(30cm*7.8mm，5um)、上样量为30ug、流动相为100mM PB缓冲液(pH7.0，含150mM NaCl)，检测波长为280nm。 
结果表明，多聚体含量由上样样品的13.29％降为洗脱液的3.28％，rhTNFR-Fc纯度由上样样品的86.71％提高到洗脱液的96.72％。 
表13 25℃硫酸铵溶液浓度与电导率的关系 
  硫酸铵浓度(mol/L)   电导率(mS/cm)   硫酸铵浓度(mol/L)   电导率(mS/cm)
  0.10   20   0.65   96
  0.15   28   0.70   103
  0.20   36   0.75   109
  0.25   42   0.80   116
  0.30   49   0.85   123
  0.35   55   0.90   130
[0200] 
  0.40   63   0.95   137
  0.45   69   1.00   143
  0.50   76   1.05   150
  0.55   82   1.10   156
       
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。 

Claims (10)

1.一种重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR-Fc)的纯化方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(1)将含有rhTNFR-Fc粗品的溶液和疏水层析介质接触，使rhTNFR-Fc上样到疏水层析介质上；和
(2)用洗脱缓冲液将rhTNFR-Fc从疏水层析介质上洗脱下来，得到纯化的rhTNFR-Fc。
2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)是将含有rhTNFR-Fc粗品的溶液流过装载有疏水层析介质的层析柱，使rhTNFR-Fc上样到疏水层析介质上。
3.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述上样量是5-20g/L疏水层析介质。
4.如权利要求1-3任一所述的纯化方法，其特征在于，所述的疏水层析介质使用琼脂糖、或聚甲基丙烯酸作为基质，使用苯基配基疏水作用基团、或丁基配基疏水作用基团。
5.如权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中所述含有rhTNFR-Fc粗品的溶液的电导率为80-140ms/cm。
6.如权利要求1-3任一所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中所述疏水层析介质是用平衡缓冲液平衡的。
7.如权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，所述平衡缓冲液pH 6-8，电导率为80-140ms/cm。
8.如权利要求7所述的纯化方法，其特征在于，所述平衡缓冲液选自Tris-HCl缓冲液或磷酸缓冲液。
9.如权利要求1-3任一所述的纯化方法，其特征在于，步骤(2)中所述洗脱缓冲液pH 6-8，电导率为15-55ms/cm。
10.如权利要求9所述的纯化方法，其特征在于，所述洗脱缓冲液选自Tris-HCl缓冲液或磷酸缓冲液。
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