CN103304636A

CN103304636A - 一种结核分枝杆菌候选抗原多肽及其应用

Info

Publication number: CN103304636A
Application number: CN2013100721960A
Authority: CN
Inventors: 于杨; 刘海鹰; 张艳; 金奇
Original assignee: Institute of Pathogen Biology of CAMS
Current assignee: Institute of Pathogen Biology of CAMS
Priority date: 2012-03-09
Filing date: 2013-03-07
Publication date: 2013-09-18
Anticipated expiration: 2033-03-07
Also published as: CN103304636B

Abstract

本发明公开了一种结核分枝杆菌候选抗原多肽及其应用。本发明提供的多肽，是具有如下氨基酸残基序列之一的多肽：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽；（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由（a）衍生的多肽。本发明的实验证明，本发明筛选了一种多肽，其候选为结核杆菌的抗原多肽，该多肽可以促进IFN-γ产生，为开发新型结核疫苗或佐剂成分提供新的思路。

Description

一种结核分枝杆菌候选抗原多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种结核分枝杆菌候选抗原多肽及其应用。

背景技术

据WHO统计，世界上近1/3的人口感染有结核分枝杆菌（Mtb），且随着耐药结核病和结核病与艾滋病混合感染的增多，结核病已经严重危害人民健康，据统计近几年在我国传染病发病数和死亡数中肺结核的排名一直位居前两位。结核病已是一种严重危害人民健康和国民经济的传染病，而中国是结核病的高负担国，那么对于结核病防控策略的制定就成为了关系我国国计民生的重大问题。对于结核病的防治目前应用最多的当属“化疗”，化学药物的治疗对结核病有明显的效果，但随着“耐多药结核”（MDR-TB）和“严重耐药结核”(XDR-TB)发病率的升高，化疗显现出了局限性。那么，新的防治方法就成为了亟待解决的问题。一直以来，利用免疫学方法寻找新的有效预防和治疗结核病的手段都是该领域研究的热点与重点。运用疫苗预防和治疗结核病是最有效的结核病防控策略之一，但是现阶段研究进展缓慢。目前，唯一可用于预防结核病的疫苗――卡介苗（BCG）仅对儿童播散性结核有一定的保护效果，但一般认为对成人结核保护效果比较弱。虽然一些新型的抗结核病疫苗相继被开发，但大多仍处于探索阶段，效果不甚理想。其中重要原因除了结核病免疫保护机理不十分清楚，还有就是在不同感染时期引起免疫反应的结核分枝杆菌有效抗原仍然不明确，这就成为了疫苗设计以及免疫策略制定的障碍。抗原关系到疫苗的成败，那么筛选出与发病密切相关的功能性抗原以及更好地了解其免疫应答机制就可以为研制不同临床需求的疫苗、制定免疫策略提供更多实际应用选择。

在肿瘤研究领域有研究标明，肿瘤细胞表达的分子伴侣蛋白（Hsp70、Gp96等），利用含有Hsp70、Gp96等蛋白的疫苗免疫小鼠后可引起针对肿瘤抗原的特异性免疫反应，推测分子伴侣携带有肿瘤特异性抗原肽；在感染性疾病研究领域，有研究从乙肝病灶组织中提取的Gp96蛋白带有一段HBV特异性抗原。对于肺结核免疫研究领域，目前还没有直接从肺组织内筛选结核杆菌抗原的相关报道。

目前对于分子伴侣蛋白的分离方法有亲和层析，还有一种方法通过Rotofor液相等电聚焦电泳技术得到富集多种分子伴侣的蛋白混合物。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种多肽。

本发明提供的多肽，是具有如下氨基酸残基序列之一的多肽：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽；

（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由（a）衍生的多肽。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述的多肽在制备肺结核疫苗中的应用也是本发明保护的范围。

上述的多肽在制备激活或促进肺结核患者体内特异性IFN-γ产生的产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述的多肽在制备促进或激活结核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ产生的产品中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供一种产品。

本发明提供的产品，其活性成分为多肽；所述产品为如下1）-3）中任一种：1）肺结核疫苗；2）激活或促进肺结核患者体内特异性IFN-γ产生的产品；3）促进或激活结核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ产生的产品。

本发明的实验证明，本发明筛选了一种多肽，其候选为结核杆菌的抗原多肽，该多肽可以促进IFN-γ产生，为开发新型结核疫苗或佐剂成分提供新的思路。

附图说明

图1为Rotofor等电聚焦电泳的实验体系

左图为运行中的仪器状态，右图为等电聚焦电泳收集到的组份

图2为等电聚焦电泳组份的SDS-page电泳结果

上图为非肺结核感染对照组，下图为来自肺结核感染组织的样本

图3为各组分Gp96和Hsp70的western检测结果

图4为IFN-γELISPOT检测结果

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、结核分枝杆菌抗原多肽P5的获得

将已有的Rotofor技术整合液相质谱联用技术，快速筛选出组织内存在的结核分枝杆菌抗原多肽，该多肽的氨基酸序列为DAVAAVVAPVGVLVY（序列1），共15个氨基酸，命名为P5。可以通过人工合成该多肽。

具体筛选过程如下：

1、制备组织裂解液

用Tris base、NaCl、TritonX-100、TritonX-114、NP40（Sigma，USA。货号分别为：T4661、S7653、T9284、X114、I3021）、蛋白酶抑制剂（Roche公司，货号：04693159001）配制组织裂解液（Tris-Cl:10mM<PH7.4>；NaCl：10mM；TritonX-100、TritonX-114、NP40各0.1％<V/V>。）。称取1g组织，在5ml组织裂解液中剪碎置于组织研磨器内，冰浴中充分研磨，离心取上清。已鉴定的肺结核病变肺组织（感染了结核分枝杆菌）的含全蛋白的组织裂解液作为实验组样品，用于液相等电聚焦电泳。见图1。

采用同样的方法提取对照组（已鉴定没有肺结核病变）的肺组织的含全蛋白的组织裂解液，作为对照组样品，用于液相等电聚焦电泳。

2、Rotofor液相等电聚焦电泳

1）、等电聚焦电泳后分离蛋白Hsp70、Gp96

将上述1得到的对照组样品和实验组样品进行Rotofor液相等电聚焦电泳，结果如图2所示，实验组在pH5.4－6.0范围内得到70KD的蛋白为Hsp70，pH5.9-6.5范围内得到94KD的蛋白为Gp96；对照组在pH4.6-6.0范围内得到70KD的蛋白为Hsp70，pH5.8-6.2得到94KD的蛋白为Gp96。

2）、蛋白样品Hsp70、Gp96的Western Blot鉴定

将上述得到的实验组的Hsp70、Gp96和对照组的Hsp70、Gp96分别进行WesternBlot鉴定（抗体为Mouse monoclonal to Hsp70,abcam,货号为ab6535和Mousemonoclonal to GRP94，abcam，货号为ab63469），结果如图3所示，实验组在pH5.4－6.0范围内得到70KD的蛋白为Hsp70，pH5.9-6.5范围内得到94KD的蛋白为Gp96；对照组在pH4.6-6.0范围内得到70KD的蛋白为Hsp70，pH5.8-6.2得到94KD的蛋白为Gp96。

3、合并含有目的蛋白（Hsp70、Gp96）的等电聚焦后组份

将上述经Western Blot鉴定为实验组的Hsp70的各pH值对应的蛋白合并，得到实验组总Hsp70；

将上述经Western Blot鉴定为实验组的Gp96的各pH值对应的蛋白合并，得到实验组总Gp96；

将上述经Western Blot鉴定为对照组的Hsp70的各pH值对应的蛋白合并，得到对照组总Hsp70；

将上述经Western Blot鉴定为对照组的Gp96的各pH值对应的蛋白合并，得到对照组总Gp96。

4、LTQ液质联用离子阱质谱系统分析

1）、质谱前处理

将上述实验组总Hsp70、实验组总Gp96、对照组总Hsp70、对照组总Gp96样品经过10KD超滤管浓缩至100ul，再加入0.2％（W/V）TFA酸化处理（4度，10小时。），得到处理后样本。

酸化处理是为了使联系在伴侣分子上的多肽解离下来。

2）LTQ液质联用离子阱质谱分析混合蛋白样本

将上述得到的处理后各样本经过10KD超滤管离心，收集小于10KD的滤出液体，经过冷冻真空干燥仪浓缩样本至10ul，利用zip－tip（C18反相柱）除盐，然后上机检测，搜集数据。

3）、Bio-work软件搜索结核杆菌全蛋白序列数据库

以蛋白组序列明确的临床菌株：94M4241A、021987、T85、Haarlem、F11、GM1503六株全蛋白序列设立检索数据库进行检索。检索出的可靠性高的序列，其中，实验组即肺结核肺组织样本实验组，检出结核分枝杆菌来源的多肽，如下表1所示，对照组未检出结核分枝杆菌相关多肽。

表1 LTQ液质联用离子阱质谱系统分析出的多肽序列

序号	多肽序列
		P5	DAVAAVVAPVGVLVY（序列1）

上述多肽P5也可以通过合成直接得到。

实施例2、多肽P5的应用

采用IFN-γ的ELISPOT实验验证：抗原特异性IFN-γ释放水平是目前广泛用于临床上的诊断结核分枝杆菌感染的方法，也是筛选能够有效激活免疫反应的结核分枝杆菌抗原的一种方法，因此，为了验证用质谱方法筛选得到的多肽的免疫学功能，进行IFN-γ的ELISPOT实验。

实验样本：临床诊断为活动性肺结核（已经确认感染结核分枝杆菌，患者知情）的患者外周血淋巴细胞和健康的人外周血淋巴细胞（已鉴定没有肺结核病变，没有感染结核分枝杆菌，检测者知情）

由实施例1得到的多肽P5进行结核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ的ELISPOT实验：

外周血细胞分离：采集临床确诊为肺结核患者以及健康人的外周血，并用Ficoll—Hypaque密度梯度离心法分离PBMC（Ficoll-Paque Plus，公司：AmershamBiosciences货号：18-1152-69），将细胞重悬于Lympho-Spot培养基(公司：U-CyTechBioscience,The Netherlands)中。加细胞2x10⁵个细胞/孔于预包被anti-IFN-γ单抗（公司：eBioscience货号：14-7319）的96孔板(MultiScreen-IP;公司Millipore)中，每孔分别加入如下刺激物：TB-A、TB-B和多肽P5，终浓度均为10ug/ml，于温箱37°C,5%CO₂孵育24小时。加入生物素标记anti-IFN-γ检测单抗（公司：eBioscience货号：13-7319）4个小时，再加入streptavidin-alkaline phosphataseconjugatejugate(公司：Pierce Biotechnology)孵育1个小时。洗涤后，加入显色底物nitroblue tetrazolium-BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate，公司：Sigma)，每孔的斑点数通过ELISPOT reader(BioReader4000Pro-X;公司：Biosys,Germany)系统计数。

以TB-A和TB-B抗原为阳性对照刺激抗原。。

结果如下图4所示，黑色柱HD：健康人外周血淋巴细胞对照；灰色柱TB：肺结核患者外周血淋巴细胞，TB-A为ESAT-6（序列2的第21-40氨基酸所示的多肽、序列2的第51-70氨基酸所示的多肽、序列2的第71-90氨基酸所示的多肽混合），TB-B为CFP-10（序列3的第21-40氨基酸所示的多肽、序列3的第51-70氨基酸所示的多肽、序列3的第66-85氨基酸所示的多肽混合）；neg ctrl为空白不加刺激物对照；

neg ctrl的HD组斑点结果为0/2ⅹ10⁵PBMCs（±0），neg ctrl的TB组结果为0/2ⅹ10⁵PBMCs（±0），TB-A刺激的HD组结果为0/2ⅹ10⁵PBMCs（±0），TB-A刺激的TB组结果为427.5/2ⅹ10⁵PBMCs（±9.2），TB-B刺激的HD组结果为0/2ⅹ10⁵PBMCs（±0），TB-B刺激的TB组结果为451/2ⅹ10⁵PBMCs（±14.1），多肽P5刺激的HD组结果为14.5/2ⅹ10⁵PBMCs（±2.1），多肽P5刺激的TB组结果为69/2ⅹ10⁵PBMCs（±7.1）。

从图中可以看出，当用阳性对照多肽作为特异性刺激物时，健康人的IFN-γ斑点数几乎为0，结核病患者的斑点数远远高于健康组，在待检测的多肽中，P5多肽（DAVAAVVAPVGVLVY）刺激后，TB病人的斑点数明显升高，显著高于健康组，说明该多肽具有抗原的潜能，能够产生较强的特异性免疫反应，可以作为结核分枝杆菌抗原的候选多肽。

Claims

1.一种多肽，是具有如下氨基酸残基序列之一的多肽：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽；

2.权利要求1所述的多肽在制备肺结核疫苗中的应用。

3.权利要求1所述的多肽在制备激活或促进肺结核患者体内特异性IFN-γ产生的产品中的应用。

4.权利要求1所述的多肽在制备促进或激活结核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ产生的产品中的应用。

5.一种产品，其活性成分为权利要求1所述的多肽；所述产品为如下1）-3）中任一种：1）肺结核疫苗；2）激活或促进肺结核患者体内特异性IFN-γ产生的产品；3）促进或激活结核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ产生的产品。