CN102653554A - 功能性结核分枝杆菌抗原多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了功能性结核分枝杆菌抗原多肽及其应用。本发明所提供的多肽，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。该多肽可刺激H37Rv感染小鼠脾脏细胞和淋巴细胞显著增殖，并可以与感染小鼠血清发生抗原-抗体反应，说明此多肽具有抗原性，可用于开发新型结核病预防性和治疗性疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及功能性结核分枝杆菌抗原多肽及其应用。
背景技术
据WHO统计，世界上近1/3的人口感染有结核分枝杆菌(M.tb)，且随着耐药结核病和结核病与艾滋病混合感染患者的增多，结核病已经严重危害人民健康，据统计近几年在我国传染病发病数和死亡数中肺结核的排名一直位居前两位。结核病已是一种严重危害人民健康和国民经济的传染病，而中国是结核病的高负担国，那么对于结核病防控策略的制定就成为了关系我国国计民生的重大问题。结核病的治疗目前应用最多的当属“化疗”，化学药物的治疗对结核病有明显的效果，但随着“耐多药结核”(MDR-TB)和“严重耐药结核”(XDR-TB)发病率的升高，化疗显现出了局限性。那么，新的防治方法就成为了亟待解决的问题。一直以来，利用免疫学方法寻找新的有效预防和治疗结核病的手段都是该领域研究的热点与重点。运用疫苗预防和治疗结核病是最有效的结核病防控策略之一，但是现阶段研究进展缓慢。目前，唯一可用于预防结核病的疫苗——卡介苗(BCG)仅对儿童播散性结核有一定的保护效果，但一般认为对成人结核保护效果比较弱。虽然一些新型的抗结核病疫苗相继被开发，但大多仍处于探索阶段，效果不甚理想。其中重要原因除了结核病免疫保护机理不清楚，就是在不同感染时期引起免疫保护反应的结核分枝杆菌有效抗原仍然不明确，这就成为了疫苗设计以及免疫策略制定的障碍。抗原关系到疫苗的成败，那么筛选出与发病密切相关的功能性抗原以及更好地了解其免疫应答机制就可以为研制不同临床需求的疫苗、制定免疫策略提供更多实际应用选择。
在肿瘤研究领域有研究表明，利用含有Hsp70、Gp96(肿瘤细胞表达的分子伴侣蛋白)等蛋白的疫苗免疫小鼠后可引起针对肿瘤抗原的特异性免疫反应，推测分子伴侣携带有肿瘤特异性抗原肽；在感染性疾病研究领域，有研究从乙肝病灶组织中提取的Gp96蛋白带有一段HBV特异性抗原。对于肺结核病研究领域，目前还没有直接从肺组织内筛选结核杆菌抗原的相关报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种具有促进淋巴细胞增殖功能的多肽。
本发明所提供的多肽，名称为Pep1，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。
其中，序列表中的序列1由16个氨基酸残基组成。
编码Pep1的基因、以及含有该基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。
Pep1是本发明的发明人将Rotofor技术整合液相质谱联用技术，直接从病人病变肺组织筛选出的结核分枝杆菌抗原多肽。实验证明，Pep1可以特异性刺激H37Rv感染小鼠脾脏淋巴细胞和淋巴结淋巴细胞显著增殖，可以用于制备淋巴细胞增殖剂和研制结核病疫苗。
附图说明
图1为Pep1和Pep2刺激小鼠脾脏和淋巴结细胞增殖实验结果。
右上图为小鼠脾脏细胞增殖实验。
右下图为小鼠淋巴结细胞增殖实验。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、功能性结核分枝杆菌抗原多肽刺激小鼠脾脏和淋巴结细胞增殖
本实施例采用的功能性结核分枝杆菌抗原多肽是Pep1(fadB5-1)和Pep2(fadB5-2)，Pep1的氨基酸序列如序列表中序列1所示；Pep2的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
1、Pep1和Pep2的制备
Pep1和Pep2采用固相多肽合成法(Fmoc法)由羧基端向氨基端方向合成。其中，所采用的树脂是取代度为0.5的2-CL-Trt。合成的多肽采用高效液相色谱进行纯化得到纯度为98％的Pep1和Pep2。纯化的Pep1和Pep2经质谱鉴定，Pep1的氨基酸序列如序列表中序列1所示；Pep2的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
2、刺激小鼠脾脏和淋巴结细胞增殖实验
实验流程如图1所示，包括以下步骤：
2.1结核分枝杆菌H37Rv感染小鼠模型的制备
结核分枝杆菌H37Rv(结核分枝杆菌实验株，ATCC，25618)解冻后在7H9液体培养基复苏一周后检测液体培养基OD值，当细菌增长处于对数增长期时OD580＝0.5-0.8(10.D＝108CFU)，用无菌0.9％生理盐水(含0.05％Tween-80)稀释细菌菌体制备成5×105CFU/mL的接种液。每只小鼠(C57Black/B6，购自中国医学科学院实验动物研究所)尾静脉注射细菌1×105CFU。小鼠感染H37Rv 8周后处死，分离组织细胞进行实验。
2.2刺激小鼠脾脏和淋巴结细胞增殖实验
处死的小鼠(同龄的健康C57Black/B6对照小鼠和感染H37Rv的C57Black/B6小鼠)75％乙醇浸泡消毒后用眼科剪剪开腹腔和胸腔无菌分离脾脏和淋巴结，浸泡在10ml预冷的无血清RPMI-1640培养基中，取出组织用注射器的活塞研磨组织，尼龙网过滤掉脂肪组织和结缔组织制备成单细胞匀浆，该操作在低温下完成。单细胞悬液4℃1500rpm，5min离心，弃上清，无菌1×PBS重悬细胞后再次离心。加入500μL体积的红细胞裂解液裂解红细胞后加入10ml预冷的无菌1×PBS终止反应，再次离心，得到小鼠脾脏淋巴细胞和淋巴结淋巴细胞。弃上清后加入2mL含10％FBS的RPMI-1640培养液重悬细胞，用台盼蓝染料对细胞进行细胞计数，同时观察细胞的存活率。共设以下四个实验组和培养基本底对照组：健康C57Black/B6小鼠脾脏淋巴细胞组，健康C57Black/B6小鼠淋巴结淋巴细胞组，H37Rv感染C57Black/B6小鼠脾脏淋巴细胞组，H37Rv感染C57Black/B6小鼠淋巴结淋巴细胞组。前四组每组均设如下四个处理：反应体系中加入鼠抗人CD3CD28抗体至终浓度为1ug/ml，反应体系中分别将Pep1和Pep2加入10％FBS的RPMI-1640培养液至终浓度为10ug/ml。同时，反应体系中仅含10％FBS的RPMI-1640培养液的细胞作为阴性对照。
用无抗体及多肽的含10％FBS的RPMI-1640培养液调整细胞浓度到1×106细胞/ml，上述四个实验组中每组细胞悬液各分4份加入平底96孔板中，每孔细胞总数为2×105个。其中一份加入10μL鼠抗人CD3CD28抗体溶液(mouse anti-human CD3：BD，Cat.No.555336；mouse anti-human CD28：BD，Cat.No.555725))至鼠抗人CD3CD28抗体终浓度为1μg/ml(表1中阳性对照)，一份加入10μL Pep1溶液至Pep1终浓度为10ug/ml(表1中Pep1)，一份加入10μL Pep2溶液至Pep2终浓度为10ug/ml(表1中Pep2)，一份加入10μL的无抗体及多肽的含10％FBS的RPMI-1640培养液(表1中阴性对照)。上述四个实验组的每个处理各设3个复孔。37℃5％CO2温箱孵育72小时；向培养板每孔中加入10μL CCK-8(CellCounting Kit-8)溶液，37℃5％CO2温箱孵育4小时；用酶标仪测定在450nm处的吸光度。计算刺激指数Stimulation Index＝(刺激孔OD值-培养基本底OD值)/(未刺激孔OD值-培养基本底OD值)。其中，刺激孔OD值是指加入鼠抗人CD3CD28抗体、Pep1或Pep2刺激细胞读取的OD值；未刺激孔OD值是指加入无抗体及多肽的含10％FBS的RPMI-1640培养液细胞读取的OD值。
实验设三次重复，结果如表1所示，鼠抗人CD3CD28抗体对健康C57Black/B6小鼠脾脏淋巴细胞的刺激指数是1.21，鼠抗人CD3CD28抗体对H37Rv感染C57Black/B6小鼠脾脏淋巴细胞的刺激指数是6.43；Pep1对健康C57Black/B6小鼠脾脏淋巴细胞的刺激指数是0.94，Pep1对H37Rv感染C57Black/B6小鼠脾脏淋巴细胞的刺激指数是2.71；Pep2对健康C57Black/B6小鼠脾脏淋巴细胞的刺激指数是0.90，Pep2对H37Rv感染C57Black/B6小鼠脾脏淋巴细胞的刺激指数是3.24。鼠抗人CD3CD28抗体对健康C57Black/B6小鼠淋巴结淋巴细胞的刺激指数是1.75，鼠抗人CD3CD28抗体对H37Rv感染C57Black/B6小鼠淋巴结淋巴细胞的刺激指数是3.74；Pep1对健康C57Black/B6小鼠淋巴结淋巴细胞的刺激指数是0.13，Pep1对H37Rv感染C57Black/B6小鼠淋巴结淋巴细胞的刺激指数是1.04；Pep2对健康C57Black/B6小鼠淋巴结淋巴细胞的刺激指数是0.73，Pep2对H37RvH37Rv感染C57Black/B6小鼠淋巴结淋巴细胞的刺激指数是1.34(图1)。说明Pep1和Pep2可以特异性刺激H37Rv感染小鼠脾脏淋巴细胞和淋巴结淋巴细胞，两组多肽刺激的细胞显著增殖。
其中，Pep1溶液和Pep2溶液的溶剂均为溶剂为PBS(TAKARA公司，货号：T900。)
表1.各处理复孔的450nm平均吸光度
注：表中数据为5只健康C57Black/B6小鼠和5只H37Rv感染C57Black/B6小鼠的三次重复实验的平均值。
其中，Pep1和Pep2是发明人将已有的Rotofor技术整合液相质谱联用技术，从肺结核感染病灶组织内筛选出来的结核分枝杆菌抗原多肽。
Claims (9)
1.一种多肽，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。
2.权利要求1所述多肽的编码基因。
3.含有权利要求2所述编码基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。
4.权利要求1所述的多肽在制备淋巴细胞增殖剂中的应用。
5.权利要求2所述的编码基因在制备淋巴细胞增殖剂中的应用。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述淋巴细胞为被H37Rv结核分枝杆菌感染的小鼠脾脏淋巴细胞。
7.权利要求1所述的多肽或权利要求2所述的编码基因在制备抗结核病疫苗中的应用。
8.一种抗结核病疫苗，其活性成分为权利要求1所述的多肽或/和权利要求2所述的编码基因。
9.一种淋巴细胞增殖剂，其活性成分为权利要求1所述的多肽或/和权利要求2所述的编码基因。
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