CN100415771C - 激发人体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位及其用途 - Google Patents
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- CN100415771C CN100415771C CNB2006100273112A CN200610027311A CN100415771C CN 100415771 C CN100415771 C CN 100415771C CN B2006100273112 A CNB2006100273112 A CN B2006100273112A CN 200610027311 A CN200610027311 A CN 200610027311A CN 100415771 C CN100415771 C CN 100415771C
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Abstract
本发明涉及分子免疫学领域,近年来结核病在全球范围内又死灰复燃,由于耐药菌株的出现,抗生素治疗常常无效;常用的结核疫苗——卡介苗也具有局限性。本发明的目的是筛选出能激发人体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位的分子模拟肽,研究结核病的保护性免疫反应机制,进一步开发出新型的多联多聚表位结核疫苗。本发明提供了一种能激发人体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位的分子模拟肽,所述肽含有选自SEQ ID NO:2,5,10,12,14,15的氨基酸序列。本发明还提供了上述肽的筛选方法和用途。本发明将更有效地预防和控制结核病的发生和发展。
Description
技术领域:
本发明涉及分子免疫学领域,具体涉及能激发人体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位的分子模拟肽及其筛选方法与用途。
背景技术:
近年来结核病(Tuberculosis,TB)在全球范围内又死灰复燃。据世界卫生组织统计,全世界约有1/3人口约20亿人感染了结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb),每年新发病人约900万,每年死亡人数高达300万。世界卫生组织提出了“全球结核病紧急状态”(global emergency)。由此可见,结核病对人类健康和经济造成的冲击和损害难以简单评估。结核病在我国流行的特点是:高患病率,高耐药率,高死亡率,高感染率和低递降率,严重影响了个人和家庭的生活质量、社会和国家的建设和经济发展。目前控制结核病的策略主要是直接使用抗生素。然而,需联合使用多种抗生素至少达6个月以上,而且由于Mtb耐药菌株的广泛出现,常造成抗生素治疗无效。现今常用的结核疫苗---卡介苗(BCG)具有很大的局限性:(1)对成人结核的效果并不令人满意;(2)可在免疫力低下的个体中引起严重的疾病甚至死亡;(3)可造成皮肤试验阳性,使其失去在结核杆菌感染中的诊断意义。因此,迫切需要开发新型高效的保护性结核疫苗,开发检测、治疗和预防结核病的新方法,以有效控制结核病的发生和病情发展,这一研究领域具有重要意义和广阔的应用前景。
结核杆菌(Mtb)是一种细胞内病原体,机体对其的控制依赖于对受感染细胞的识别和破坏。在小鼠模型中的研究表明,MHC II类限制性CD4+T细胞,MHC I类限制性CD8+T细胞,IFN-γ,TNF-α,γδT细胞和CD1限制性T细胞在体内具有积极的保护性作用。在人体内已鉴定了不同型别的CD8+Mtb特异性T细胞,但其在结核病发病机制中的作用尚不明确。巨噬细胞:巨噬细胞在人体对Mtb的免疫反应中起重要作用。Mtb可存活于未活化的巨噬细胞中。当巨噬细胞被激活,可产生IFN-γ等细胞因子,诱导NO、活性硝酸盐介质(RNI)以及NO合成酶的产生,从而发挥免疫效应作用。巨噬细胞发挥抗微生物活性的另一条途径是吞噬小体的融合。但Mtb感染巨噬细胞可抑制吞噬小体的融合和酸化,而Mtb得以存活于巨噬细胞内。CD4+T细胞:Mtb抗原经MHC II类分子递呈至CD4+T细胞。CD4+T细胞可产生IFN-γ等细胞因子发挥效应作用,也可诱导受染细胞的凋亡,还可协助B细胞、CD8+T细胞的激活。但是,Mtb感染巨噬细胞可导致巨噬细胞MHC II类分子表达下降,从而抑制CD4+T细胞的免疫效应。CD8+T细胞:Mtb被巨噬细胞的吞噬小体吞噬,其抗原或其分泌的蛋白质进入吞噬小体中,再透过吞噬小体膜进入巨噬细胞,进而被消化处理并由MHC I类分子递呈至CD8+T细胞。CD8+T细胞可产生IFN-γ等细胞因子发挥效应作用,也可通过Fas/Fasl途径、granzyme B等直接发挥细胞毒性作用。研究表明,BCG不能充分刺激CD8+T细胞,可能由于BCG失去了关键的溶胞膜素,Mtb抗原不能进入受感染细胞的胞液而被递呈。现有的研究主要是关于CD4+T细胞在结核病中的保护性反应,特异性CD4+T细胞免疫反应与疾病不同阶段的相关性,正在研究中。而结核病中CD8+T细胞的作用机制,尚未明确。CD8+T细胞被单个抗原肽激活依赖于许多因素,其中得到公认的是,APC表面存在高密度的肽/MHC复合物是体内或体外“初始”T细胞激活的关键。树突状细胞(DC)表达高水平MHC,在激活“初始”T细胞中起重要作用。关于激活“初始”T细胞所需的肽/MHC复合物分子数的报道,具有较大差异,从每细胞300个到10000个。但总的来讲,“初始”T细胞的反应需要激活记忆细胞所需肽/MHC复合物分子数的100-1000倍。而且有研究表明,90%被CD8+T细胞识别的肽,与其MHC I类分子高亲合性结合。从HLA I类分子洗脱的肽多为8-10氨基酸。而用合成肽进行的研究表明,长度为15-20氨基酸的肽亦可结合HLA I类分子而激活T细胞。HLA II类分子结合的肽的长度则具有相当的柔性.
目前的TB疫苗可分为4类:亚单位疫苗,DNA疫苗,全细菌疫苗和混合疫苗。亚单位疫苗是基于假设一个或少数几个抗原即足以诱导保护性免疫反应。已有研究在小鼠模型上对亚单位疫苗进行检验,包括培养液滤过蛋白,单个蛋白,蛋白混合物以及融合蛋白。虽然这类疫苗很安全,但这种模式的抗原递呈只能刺激有限数量的特异性T细胞,大多数是CD4+T细胞,而且总的来讲,这类反应比较短暂。DNA疫苗能刺激CD4+和CD8+T细胞反应而且持久,但其安全性仍令人担心,包括基因组整合的风险。迄今经测试,最成功的TB DNA疫苗是Ag85A。也有许多对全细菌疫苗的研究。从Mtb去除单个基因如毒力因子,可能降低细菌毒力但仍保持刺激CD4+、CD8+和非传统T细胞的能力。对于这些突变子的安全性仍有争议。混合疫苗是力图利用上述策略的优势,如BCG可经工程改造,过量表达一个或多个免疫原性/保护性蛋白。如,BCG经工程改造可分泌listerlysin,这使BCG蛋白可进入受感染细胞的胞浆,增强其刺激CD8+T细胞的能力。同样,经工程改造的BCG过量表达Ag85,在豚鼠实验中优于单独用BCG。
当Mtb以及其他一些细胞内病原体生长在培养基中时,也释放蛋白质(培养基滤过蛋白)进入胞外基质中。有学者用双相聚丙烯酰胺琼脂糖电泳分析Mtb培养滤过液,鉴定了200多种不同的蛋白点。将胞内产生的和培养基中生长的Mtb产生蛋白用双相聚丙烯酰胺琼脂糖电泳进行比较分析,可发现显著差异。Horwitz等纯化并鉴定了在Mtb培养滤过液中最丰富的6种蛋白质,包括抗原85A,抗原85B,超氧化物歧化酶,hsp71,Mpt51,Mpt63。用这些纯化蛋白质免疫豚鼠可使之获得对Mtb的免疫力。
尽管许多抗原带有潜在的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte,CTL)表位,但在初次反应中只有少数能产生CTL反应,主要的表位称为免疫优势决定簇,其它的表位称为次要决定簇或结构性决定簇。次要决定簇能被处理和递呈,但在免疫优势决定簇存在时,次要决定簇不能激发CTL反应。结构性表位不能被递呈,可能在抗原处理过程中有问题,包括蛋白小体剪切的特异性以及由于包饶表位的侧面序列。影响免疫优势的因素包括:(1)APC的抗原处理无效;(2)缺乏适当的TCR以识别表位/HLA复合物分子;(3)CD8+T细胞抗原递呈的竞争;(4)由免疫优势CD8+T细胞产生的对其它决定簇反应的抑制。对于TB疫苗而言,尤其应考虑这些影响因素,因为几乎每个人都会暴露于环境中的细菌,BCG和/或Mtb。虽然疫苗研究集中于免疫优势表位,但对次要决定簇的研究可能将免疫反应集中于不能逃避免疫识别的表位。有报道,将ESAT-6的次要决定簇免疫小鼠,可诱导显著的抗TB的保护性免疫反应,而用有的免疫优势表位却不能产生这样的保护性反应。因此,研究激发人体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位,包括免疫优势决定簇和次要决定簇,十分必要和迫切。
发明内容:
本发明的目的是筛选出能激发人体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位的分子模拟肽,研究结核病的保护性免疫反应机制,进一步开发出新型的多联多聚表位结核疫苗,更有效地预防和控制结核病的发生和发展。
综合应用基因组序列、生物信息学、功能基因组学和免疫学研究,本发明提供了一种能激发人体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位的分子模拟肽,所述肽含有选自以下的氨基酸序列:
RLLALLCAAV(SEQ ID NO:2),
KLILTQPFDV(SEQ ID NO:5),
RLSQSADQYL(SEQ ID NO:10),
FLTREMPAWL(SEQ ID NO:12),
KLIANNTRV(SEQ ID NO:14),
GLPVEYLQV(SEQ ID NO:15)。
本发明还提供了一种能激发人体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位的分子模拟肽的筛选方法,其特征在于,它包括以下步骤:
I表位预测和分子模拟肽合成
应用数据库SYFPEITHI对结核杆菌Rv3840c、Rv0309、Rv0129c、Rv0173进行HLA-A*0201限制性CTL表位预测,以F-moc化学法合成上述预测得到的分子模拟肽;
II上述分子模拟肽经亲和力分析、稳定性分析、细胞增殖实验、细胞活性检测和特异性抗体检测,筛选出亲和力强、稳定性好、能产生较强增殖反应、具有较强细胞毒活性和免疫后能产生特异性抗体的分子模拟肽。
本发明还提供了上述的能激发人体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位的分子模拟肽在制备免疫原、免疫动物、或产生免疫保护上的应用。
本发明还提供了上述的能激发人体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位的分子模拟肽在制备多联多聚表位结核疫苗上的用途。
该多联多聚表位结核疫苗,它含有上述分子模拟肽SEQ ID NO:2,5,10,12,14,15中一个或多个直接或间接地连接而成的肽段。
本发明大大有助于对结核病的预防和治疗,尤其是对多耐药性菌株的控制,也有利于研究结核病中的分子、细胞作用机制,促进困扰临床的多耐药性难题的解决。
附图说明
图1 预测抗原肽与HLA-A*0201的亲和力及稳定性分析结果
图2 结核杆菌抗原肽刺激PBMCs产生的增殖反应
图3 结核杆菌抗原肽诱导PBMC产生特异性的CTL杀伤活性
图4 结核抗原肽诱导的体液免疫反应
具体实施方式:
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
实施例1:
1材料与方法
1.1研究对象
肺结核确诊患者200例,其中HLA-A*0201阳性100例,HLA-A*0201阴性100例,均经放射学和临床痰培养检验。100例HLA-A*0201阳性其他慢性肺病患者为疾病对照组,100例HLA-A*0201阳性健康志愿者为正常对照组。
1.2试剂和试剂盒:
淋巴细胞分离液LymphoprepTM购自挪威AXIS-SHIELD公司;
LPS、人重组IL-2、DMSO、BFA、β2-mg均购自Sigma公司;
人重组GM-CSF、人重组IL-4购自R&D公司;
RPMI1640培养基和胎牛血清购自Gibco公司;(Sigma);
FITC标记的抗-CD3、抗-CD8、抗-HLA.A2流式单克隆抗体与检测细胞内因子FITC标记抗体(IFN-γ、TNF-α、IL-10)均为Caltag公司产品;
RNA抽提试剂盒购自Qiagen公司;
时间分辨荧光DELFIA细胞增殖(AD0200)与细胞毒性(AD0016)检测试剂盒均购自Wallac Oy公司;
多肽由上海生工生物工程技术有限公司合成;
T2细胞株购自美国ATCC细胞库。
1.3主要仪器
流式细胞仪(Coulter EPICS XL)
时间分辨荧光检测仪(DELFIA 1235,Perkin Elmer)
1.4表位预测和多肽合成
应用数据库SYFPEITHI对结核杆菌Rv3840c、Rv0309、Rv0129c、Rv0173进行HLA-A*0201限制性CTL表位预测,根据多肽上的氨基酸是否为锚定残基、辅助残基或优势残基进行记分,分值高于21分者有可能是T细胞表位。由上海生工生物工程技术有限公司以F-moc化学法合成上述预测得到的多肽,合成的抗原肽均经高效液相色谱纯化(纯度>95%),并经质谱鉴定。冻干粉保存于4℃,用前以无菌蒸馏水复苏多肽(2μg/ul)。
1.5抗原肽亲和力分析
采用T2细胞株进行抗原肽亲和力分析,其原理主要是利用T2细胞系的特点。T2细胞表面空载的HLA-A2分子表达极不稳定,递呈后很快降解,抗原肽与之结合后稳定了HLA-A2的表达,抗原肽与HLA-A2的结合力越强,T2细胞表面HLA-A2分子的表达量就越高。而且由于T2细胞的内源性抗原递呈途径中必需的抗原多肽转运蛋白(TAP)缺乏,所以T2细胞表面HLA-A2分子的表达量的增加直观的反映了外来抗原肽与HLA-A2的结合力。
具体方法为:T2细胞以pH3.2的柠檬酸钠-磷酸盐缓冲液预处理1min,使细胞表面的MHCI类复合物变性,立即用过量的RPMI1640(Gibco BRL)培养液洗1遍,调节细胞浓度至3×105,以1ml/孔种于24孔细胞培养板。以抗原肽(20ug/ml)刺激,补充Brefeldin(BFA,10ug/ml)和β 2-MG(1ug/ml),37℃5%CO2饱和湿度孵育4h,并以未加抗原肽为空白对照孔。收集细胞,以FACS(含0.2%FCS和0.1%叠氮钠的PBS)洗1遍,用FITC标记的小鼠抗人HLA-A*0201单克隆抗体染色,常温暗处反应30min,FACS液洗2遍,以鞘液悬浮,流式细胞仪(Coulter EPICS XL)检测平均荧光强度。每个实验重复3次,平均荧光强度高于空白对照孔平均荧光强度+3SD的抗原肽具有HLA-A*0201高亲和力。
1.6抗原肽稳定性分析
T2细胞同前预处理,将抗原肽浓度提高至80μg/ml,37℃5%CO2饱和湿度孵育18h,补充BFA至终浓度为10ug/ml,继续孵育3h。收集细胞,同前测平均荧光强度。平均荧光强度高于空白对照孔平均荧光强度+3SD的抗原肽进行细胞增殖反应及细胞毒性实验。
1.7抗原肽诱导CTL制备
密度梯度离心法分离经EDTA抗凝的静脉血中的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),分离得到的PBMCs种于6孔细胞培养板,在含10%FCS的RPMI1640培养基中,37℃5%CO2孵育1.5h。收集悬浮细胞(主要为淋巴细胞),以10%二甲亚砜90%小牛血清保存于液氮备用。贴壁细胞为抗原提呈细胞-树突状细胞(DC),补充含GM-CSF(1000U/ml,R&D)、IL-4(1000U/ml,R&D)及含10%FCS的RPMI1640培养液,37℃5%CO2培养7d,需要时补充新鲜培养液。5d后,加入LPS(1μg/ml,Sigma)培养2d后,γ照射使其失去增殖活性。将经过照射的DC与抗原肽(10μmol/L)在培养液中,37℃5%CO2共孵过夜。将1×105负载有抗原肽的DC与1×106自体PBMCs种于含10%FCS的RPMI1640完全培养液的24孔细胞培养板,37℃C 5%CO2混合培养3d后,加入rIL-2(20U/ml,Sigma)继续培养10d,进行细胞增殖实验和细胞活性检测。
1.8细胞增殖实验
采用时间分辨荧光DELFIA细胞增殖检测试剂盒(AD0200,Wallaroy),将经辐射的5×103负载抗原肽的DC100ul与5×104抗原肽诱导的自体CTL100ul种于96孔细胞培养板,并以未负载抗原肽的DC作为阴性对照。加入20ulBrdU标记液孵育10h,离心1遍,加入Eu标记的抗BrdU单抗,室温孵育2h,洗涤,固定。时间分辨荧光检测仪(DELFIA 1235)检测荧光强度,每个样本设3个复孔,取平均值为检测结果。增殖系数(SI)=含抗原肽的平均荧光强度/阴性对照的平均荧光强度,SI>2的抗原肽视为能诱导淋巴细胞增殖。
1.9细胞毒性分析
采用时间分辨荧光DELFIA EUTDA细胞毒性试验(AD0116,Wallaroy),抗原肽诱导CTL为效应细胞(E),负载抗原肽的T2细胞为靶细胞(T),检测杀伤活性。参照说明书进行操作,效应细胞与靶细胞的比例为40∶1,培养4h。时间分辨荧光检测仪(DELFIA 1235)检测荧光强度,每个样本设3个复孔,取平均值为检测结果。细胞杀伤活性=(待测孔荧光强度-自然释放孔荧光强度)/(最大释放孔荧光强度-自然释放孔荧光强度)×100%。
1.10动物实验
1.10.1动物及分组
C57BL/6小鼠20只,2月龄,体重(18±2)g,雌雄不限,随机分为4组,每组5只。
1.10.2免疫方法
以体外实验筛选出的结核抗原肽为免疫原,共注射3次,每次间隔2周,首次以CFA为佐剂,加强免疫以IFA为佐剂。小鼠首次及加强免疫量为50μg/只,与0.3ml佐剂完全乳化后,在腋窝、腹股沟、腋部皮下及腹腔多点注射。
1.10.3标本的采集与分离
在首次免疫、二次免疫和三次免疫后21天,分别对5只/组小鼠在眼眶采血,分离血清,并冻存于-20℃冰箱备用。
1.10.4检测特异性抗体
采用标准间接ELISA法测定血清中抗体滴度,分别测定每组动物特异性抗体滴度。按100孔包被96孔酶联板,抗原浓度为20μg/ml,4℃过夜;以5%BSA-PBS 37℃封闭120min,洗涤3次,3min/次;加倍比稀释的被测动物血清,100孔,37℃孵育90min。洗涤3次后,加入HRP酶标二抗,37℃ 30min;洗涤3次后,加入DAB底物,37℃ 10min,终止反应。酶联仪于490nm测定吸光度A值,以正常小鼠血清作阴性对照。结果以双复孔A值均值表示。以待测标本A值/阴性对照A值>2为阳性标准,以出现阳性反应的最高稀释度作为该样本中抗体滴度。
1.10.5免疫小鼠的攻毒保护性实验
对每组剩下5只C57BL/6鼠免疫三次后间隔8周攻毒,攻毒注射部位为小鼠尾静脉,注射剂量为1×106CFU,攻毒株为H37Rv。攻毒后8周杀死小鼠,将肺脏、脾脏匀浆稀释接种到固体罗氏培养基上,四周后活菌计数。
2结果
2.1表位预测及多肽合成结果
经生物信息学预测,选择以下肽序列进行合成。合成的多肽经质谱鉴定,纯度经高压液相色谱(HPLC)分析均大于95%。
Rv0309:
VLAPVSLAV(SEQ ID NO:1)
RLLALLCAAV(SEQ ID NO:2)
SLAVVNPWFA(SEQ ID NO:3)
VLAPVSLAVV(SEQ ID NO:4)
Rv0173:
KLILTQPFDV(SEQ ID NO:5)
FLGKLDTFT(SEQ ID NO:6)
VLLVLALLL(SEQ ID NO:7)
RVMVADVWV(SEQ ID NO:8)
YLVGALKLI(SEQ ID NO:9)
RLSQSADQYL(SEQ IDNO:10)
Rv0129c:
GLPVEYLQV(SEQ ID NO:11)
FLTREMPAWL(SEQ ID NO:12)
Rv3 804c:
AIYGPQQFV(SEQ ID NO:13)
KLIANNTRV(SEQ ID NO:14)
GLPVEYLQV(SEQ ID NO:15)
2.2抗原肽亲和力及稳定性分析结果
99%培养的T2细胞都表达HLA-A*0201分子,但平均荧光强度较弱。上述合成的抗原肽与HLA-A*0201结合活性见表1。经抗原肽1-15处理后的细胞平均荧光强度出现升高,其中以抗原肽2和14升高最为明显。T2细胞平均荧光强度经抗原肽处理后的增长倍数=抗原肽处理后的平均荧光强度/无抗原肽的平均荧光强度,以抗原肽14处理的最高,抗原肽1 5其次。抗原肽与HLA-A*0201分子结合的稳定性分析结果显示,抗原肽与T2细胞上的HLA-A*0201分子结合后,抗原肽2、3、5、7、8、10、12、14、15能使T2细胞HLA-A*0201分子表达稳定上调(见图1)。根据结合力和稳定性结果,选择抗原肽2、3、5、7、8、10、12、14、15继续下游实验。
表1 抗原肽刺激后的T2细胞HLA-A*0201平均荧光强度
抗原肽SEQ ID NO | 氨基酸序列 | 模拟来源:氨基酸位置 | 平均荧光强度 |
1 | VLAPVSLAV | Rv0309:aa.20~28 | 10.69 |
2 | RLLALLCAAV | Rv0309:aa.3~12 | 10.86 |
3 | SLAVVNPWFA | Rv0309:aa.25~34 | 10.73 |
4 | VLAPVSLAVV | Rv0309:aa.20~29 | 9.18 |
5 | KLILTQPFDV | Rv0173:aa.302~311 | 11.54 |
6 | FLGKLDTFT | Rv0173:aa.191~199 | 8.08 |
7 | VLLVLALLL | Rv0173:aa.20~28 | 11.32 |
8 | RVMVADVWV | Rv0173:aa.69~77 | 12.46 |
9 | YLVGALKLI | Rv0173:aa.296~304 | 8.12 |
10 | RLSQSADQYL | Rv0173:aa.260~269 | 12.37 |
11 | GLPVEYLQV | Rv0129c:aa.51~59 | 10.65 |
12 | FLTREMPAWL | Rv0129c:aa.144~153 | 11.53 |
13 | AIYGPQQFV | Rv3804c:aa.178~186 | 8.29 |
14 | KLIANNTRV | Rv3804c:aa.242~250 | 13.51 |
15 | GLPVEYLQV | Rv3804c:aa.48~56 | 12.84 |
阴性对照 | - | - | 4.21 |
2.3抗原肽刺激细胞增殖
以细胞增殖反应评价抗原肽2、3、5、7、8、10、12、14和15在结核病患者PBMC中诱导抗原特异性CTL的能力,进一步鉴定其是否为特异性细胞表位。其中,HLA-A*0201阳性结核病患者100例,HLA-A*0201阴性结核病患者100例,100例HLA-A*0201阳性其他慢性肺病患者为疾病对照组,100例HLA-A*0201阳性健康志愿者为正常对照组。设以刺激系数(SI)>3为增殖反应阳性。结果表明,结核病患者(HLA-A*0201阳性和阴性患者)PBMC对抗原肽2、5、10、12、14和15均产生较强的阳性增殖反应,而在疾病对照组和健康对照组未出现显著的增殖反应(见图2)。
2.4抗原肽诱导CTL杀伤毒性
以负载抗原肽的T2细胞为靶细胞,抗原肽诱导的CD8+CTL为效应细胞,效靶比(E/T)为20∶1,经时间分辨荧光DELFIA EUTDA细胞毒性试验分析结核杆菌抗原肽诱导的CTL细胞毒活性。结果表明,经抗原肽2、5、10、12、14和15刺激的CD8+CTL为效应细胞具有较强的细胞毒活性(见图3)。
2.5小鼠抗体滴度的动态测定
首次免疫后2周始,取血1次/周,分离血清,以结核抗原肽为包被抗原,ELISA间接法测定特异性抗体滴度,首次免疫3周后即可检出特异性抗体,抗体滴度在测定时间内,抗体滴度逐渐增高,首次免疫后8周,抗体滴度达最高1∶64。抗体滴度随免疫次数和时间升高,而阴性对照组未检测到抗体(见图4)。
2.6疫苗对免疫鼠的保护效果分析
以攻毒8周后的小鼠为实验材料,研究了各疫苗诱导的保护效力。实验表明,各免疫组小鼠肺脏和脾脏的细菌数显著减少。其保护效率如表2。
表2疫苗诱导的保护性应答能力
*保护率的计算方法为:阴性组细菌数对数值减去疫苗或BCG组的细菌数的对数值而得到。数值越大保护效率越高。
3结论
综合应用基因组序列、生物信息学、功能基因组学和免疫学研究,结果证实,以下抗原表位的分子模拟肽,可以激发人体抗结核杆菌的保护性免疫反应:
1.RLLALLCAAV(SEQ ID NO:2),模拟来源Rv0309:aa.3~12;
2.KLILTQPFDV(SEQ ID NO:5),模拟来源Rv0173:aa.302~311;
3.RLSQSADQYL(SEQ ID NO:10),模拟来源Rv0173:aa.260~269;
4.FLTREMPAWL(SEQ ID NO:12),模拟来源Rv0129c:aa.144~153;
5.KLIANNTRV(SEQ ID NO:14),模拟来源Rv3804c:aa.242~250;
6.GLPVEYLQV(SEQ ID NO:15),模拟来源Rv3804c:aa.48~56。
SEQUENCE LISTING
<110>中国人民解放军第二军医大学
<120>激发人体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位及其用途
<130>说明书,权利要求书
<160>15
<170>PatentIn version 3.1
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<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
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1 5
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<210>4
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>4
Val Leu Ala Pro Val Ser Leu Ala Val Val
1 5 10
<210>5
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>5
Lys Leu Ile Leu Thr Gln Pro Phe Asp Val
1 5 10
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>6
Phe Leu Gly Lys Leu Asp Thr Phe Thr
1 5
<210>7
<211>9
<212PRT
<213>人工序列
<400>7
Val Leu Leu Val Leu Ala Leu Leu Leu
1 5
<210>8
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>8
Arg Val Met Val Ala Asp Val Trp Val
1 5
<210>9
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>9
Tyr Leu Val Gly Ala Leu Lys Leu Ile
1 5
<210>10
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>10
Arg Leu Ser Gln Ser Ala Asp Gln Tyr Leu
1 5 10
<210>11
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>11
Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val
1 5
<210>12
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>12
Phe Leu Thr Arg Glu Met Pro Ala Trp Leu
1 5 10
<210>13
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>13
Ala Ile Tyr Gly Pro Gln Gln Phe Val
1 5
<210>14
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>14
Lys Leu Ile Ala Asn Asn Thr Arg Val
1 5
<210>15
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>15
Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val
1 5
Claims (3)
1. 能激发人体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位的分子模拟肽,其特征在于,所述肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2. 如权利要求1所述的能激发人体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位的分子模拟肽在制备免疫原上的应用。
3. 如权利要求1所述的能激发人体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位的分子模拟肽在制备多联多聚表位结核疫苗上的用途。
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