CN1629185A - 结核杆菌抗原融合蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及至少含有两种结核杆菌抗原的融合蛋白。详细而言，本发明涉及含有两种单一结核杆菌抗原的二体融合蛋白、含有三种结核杆菌抗原的三体融合蛋白、含有四种结核杆菌抗原的四体融合蛋白和含有五种结核杆菌抗原的五体融合蛋白，以及这些蛋白在结核病感染的诊断、治疗和预防中的应用。

Description

结核杆菌抗原融合蛋白及其应用
本申请是申请日为1999年4月7日的中国专利申请9807077.7“结核杆菌抗原融合蛋白及其应用”的分案申请。
1.技术领域
本发明涉及至少含有两种结核杆菌抗原的融合蛋白。详细而言，本发明涉及含有两种单一结核杆菌抗原的二体融合蛋白、含有三种结核杆菌抗原的三体融合蛋白、含有四种结核杆菌抗原的四体融合蛋白和含有五种结核杆菌抗原的五体融合蛋白，以及这些蛋白在结核病感染的诊断、治疗和预防中的应用。
2.背景技术
结核病是一种由结核杆菌感染引起的慢性传染病。它在发展中国家是一种主要的疾病，并且在世界上的发达地区也是一个日益严重的问题，它每年约导致800万的新病例和300万人的死亡。尽管其感染在相当长的一段时间内并不产生症状，但该疾病最常见的表现是肺部的急性炎症，并导致发热和无痰干咳。若不加治疗，通常会导致严重的并发症甚至死亡。
尽管结核病通常可利用广泛的抗生素疗法来加以控制，但这种治疗并不足以防止该疾病的传播。有时被感染的个体并不表现出症状，但却具有触染性。此外，尽管遵守治疗方案十分关键，但患者的行为却难以监控。一些患者没有完成治疗课程，这将会导致治疗无效，甚至产生耐药性。
为了控制结核病的传播，针对该疾病的有效接种以及精确的早期诊断显得至关重要。利用活细菌进行接种是目前诱导保护性免疫的最有效方法。用于此用途的最常见的分支杆菌是卡介苗(BCG)，它是牛型结核菌的一种无致病性菌株。但对BCG的安全性和有效性仍有争议，而美国等一些国家则不用该制剂对公众进行接种。
结核病的诊断通常采用皮肤试验，该试验涉及将结核菌素PPD(纯蛋白衍生物)暴露于真皮内。抗原特异性T细胞应答可在注射48-72小时后导致注射部位产生可测量的硬结。但该试验的灵敏性和特异性是一个问题，并且也不能把BCG接种的个体与感染的个体区分开来。
尽管巨噬细胞表现为结核杆菌免疫的主要效应物，但T细胞却是这种免疫的主要诱发物。在由于与人免疫缺陷病毒(HIV)感染相关的CD4+T细胞缺失而导致获得性免疫缺陷综合症的患者中，利用结核杆菌的经常出现可证明T细胞在预防结核杆菌感染中的基本作用。分支杆菌反应性CD4+T细胞是干扰素-γ(IFN-γ)的有效生产者，而IFN-γ在小鼠中又表现出可触发巨噬细胞的抗分支杆菌效应。IFN-γ在人体内的作用还不是很清楚，但研究显示，单独使用或与IFN-γ或肿瘤坏死因子α联合使用1，25-二羟基-维生素D3可激活人巨噬细胞来抑制结核杆菌感染。此外，已了解IFN-γ可刺激人巨噬细胞产生1，25-二羟基-维生素D3。同样，白细胞介素-12(IL-12)显示出可在刺激对结核杆菌感染的抗性中发挥作用。欲对结核杆菌感染的免疫学进行回顾，可参考Chan and Kaufmann，1994，结核病：发病机理、保护与控制，Bloom(ed.)，ASM Press，Wshington，DC。
因此有必要将用于结核病诊断、预防和治疗的疫苗及方法加以改进。
3.发明内容
本发明涉及结核杆菌抗原的融合蛋白。详细而言，本发明涉及含有两种或多种结核杆菌抗原的融合多肽、编码这些多肽的多聚核苷酸，以及这些多肽和多聚核苷酸在结核杆菌感染的诊断、治疗和预防中的使用方法。
在某种程度上，本发明的基础是该发明人发现，含有2-5种结核杆菌编码序列的多聚核苷酸可产生能够保持其单一组分的免疫原性和抗原性的重组融合蛋白。通过T细胞增殖测定发现，文中所述融合蛋白可诱导T细胞应答和B细胞应答，并导致细胞因子和抗体的产生。而且还用一种融合蛋白作为免疫原与佐剂一同在体内诱导对结核杆菌的细胞介导免疫和体液免疫。此外还由融合构建体产生了一种融合蛋白，并将其与佐剂一同用在疫苗制剂中，以使动物具有长期预防结核病产生的能力。与单一蛋白组分的混合物相比，融合蛋白是一种更有效的免疫原。
在本发明的一项具体实施方案中，分离或纯化的本发明所述结核杆菌多肽可被配制成药用组合物，用于为受试者给药以预防和/或治疗结核杆菌感染。通过加入一种佐剂可增强该融合蛋白的免疫原性。
作为本发明的另一方面，分离或纯化的多聚核苷酸可用于重组融合多肽抗原的体外生产。作为选择，也可将多聚核苷酸作为DNA疫苗直接向受试者给药，以引起受试者的抗原表达，继而诱导抗结核杆菌的免疫应答。
本发明的另一目的是在体外测定中使用这些多肽来检测抗结核杆菌的体液性抗体或细胞介导免疫，以诊断感染或监控疾病的发展。此外，还可将多肽作为体内诊断剂以真皮内皮肤试验的形式加以使用。作为选择，也可将多肽作为免疫原用于在非人类动物体内产生抗结核杆菌抗体。这些抗体则可用于靶抗原的体内和体外检测。
4.附图说明
图1A和1B：三体融合蛋白Ra12-TbH9-Ra35(表示为Mtb32A)的核苷酸序列(序列编号：1)和氨基酸序列(序列编号：2)。
图2：三体融合蛋白Erd14-DPV-MTI(表示为Mtb39A)的核苷酸序列(序列编号：3)和氨基酸序列(序列编号：4)。
图3A-3D：三体融合蛋白TbRa 3-38kD-Tb38-1的核苷酸序列(序列编号：5)和氨基酸序列(序列编号：6)。
图4A-4D：二体融合蛋白TbH9-Tb38-1的核苷酸序列(序列编号：7)和氨基酸序列(序列编号：8)。
图5A-5J：四体融合蛋白TbRa 3-38kD-Tb38-1-DPEP(表示为TbF-2)的核苷酸序列(序列编号：9)和氨基酸序列(序列编号：10)。
图6A和6B：五体融合蛋白Erd14-DPV-MTI-MSL-MTCC2(表示为Mtb88f)的核苷酸序列(序列编号：11)和氨基酸序列(序列编号：12)。
图7A和7B：四体融合蛋白Erd14-DPV-MTI-MSL(表示为Mtb46f)的核苷酸序列(序列编号：13)和氨基酸序列(序列编号：14)。
图8A和8B：四体融合蛋白DPV-MTI-MSL-MTCC2(表示为Mtb71f)的核苷酸序列(序列编号：15)和氨基酸序列(序列编号：16)。
图9A和9B：三体融合蛋白DPV-MTI-MSL(表示为Mtb31f)的核苷酸序列(序列编号：17)和氨基酸序列(序列编号：18)。
图10A和10B：三体融合蛋白TbH9-DPV-MTI(表示为Mtb61f)的核苷酸序列(序列编号：19)和氨基酸序列(序列编号：20)。
图11A和11B：三体融合蛋白Erd14-DPV-MTI(表示为Mtb36f)的核苷酸序列(序列编号：21)和氨基酸序列(序列编号：22)。
图12A和12B：二体融合蛋白TbH9-Ra35(表示为Mtb59f)的核苷酸序列(序列编号：23)和氨基酸序列(序列编号：24)。
图13A和13B：二体融合蛋白Ra12-DPPD(表示为Mtb24)的核苷酸序列(序列编号：25)和氨基酸序列(序列编号：26)。
图14A-14F：当六个PPD+受试者用两种融合蛋白及其单一组分刺激时的T细胞增殖应答。
图15A-15F：当六个PPD+受试者用两种融合蛋白及其单一组分刺激时的IFN-γ产生。
图16A-16F：用一种融合蛋白或其单一组分加佐剂免疫的小鼠的T细胞增殖。
图17：用一种融合蛋白或其单一组分加佐剂免疫的小鼠的IFN-γ产生。
图18：用一种融合蛋白或其单一组分加佐剂免疫的小鼠的IL-4产生。
图19A-19F：用一种融合蛋白或其单一组分加佐剂免疫的小鼠的血清抗体浓度。
图20A-20C：豚鼠经结核杆菌气雾剂攻击后的存活率。融合蛋白Mtb32A和Mtb39A配制于佐剂SBAS1c(20A)、SBAS2(20B)或SBAS7(20C)中，并用作细菌诱发前豚鼠内的免疫原。BCG作为阳性对照。
图21A和21B：融合蛋白TbH9-Tb38-1对TbH9特异性T细胞的增殖和IFN-γ产生的刺激作用。
图22A和22B：融合蛋白TbH9-Tb38-1对Tb38-1特异性T细胞的增殖和IFN-γ产生的刺激作用。
图23A和23B：融合蛋白TbH9-Tb38-1对预先显示出对TbH-9抗原和Tb38-1抗原均产生应答的T细胞的增殖和IFN-γ产生的刺激作用。
5.具体实施方式
本发明涉及具有治疗和预防结核病用途的抗原、编码这些抗原的多肽，及其使用方法。本发明所述抗原为结核杆菌抗原的融合多肽及其变异体。更明确而言，本发明所述抗原至少含有两种结核杆菌多肽，并且这些多肽被融合成更大的融合多肽分子。本发明所述抗原可进一步含有其它组分，这些组分经设计可增强抗原的免疫原性，或可在其它方面对抗原加以改进，如通过在抗原的一端加入一段组氨酸残基来改进这些抗原的分离。
5.1. 结核杆菌特异性抗原
图1A-13B例证了本发明所述抗原，其中包括抗原的同源物和变异体。这些抗原可通过，例如，按下文所述加入衔接肽序列而被修饰。这些衔接肽可插入到构成图1A-13B所示各融合蛋白的一个或多个多肽之间。本发明的其它抗原包括与一种已知结核杆菌抗原，如前人所述的38kD(序列编号：27)抗原(Anderson and Hansen，1989，Infect.Immun.57：2481-2488；Genbank登记号：M30046)，相连接的图1A-13B所述抗原。
5.2. 免疫原性测定
文中所述抗原及其免疫原性部分可诱导免疫应答。更明确而言，这些抗原能够诱导来源于结核杆菌免疫个体的T细胞、NK细胞、B细胞和/或巨噬细胞的增殖和/或细胞因子的产生(即干扰素-γ和/或白细胞介素12的产生)。将根据所需的应答来选择用于评价对抗原的免疫应答的细胞类型。举例来说，使用含有B细胞和/或巨噬细胞的制品最容易对白细胞介素12的产生进行评价。结核杆菌免疫个体是指已建立对结核杆菌的有效T细胞应答，因而被认为可抵抗结核病产生(即基本不表现疾病症状)的个体。根据真皮内皮肤试验中产生对结核病蛋白(PPD)的强阳性(即大于约10mm直径的硬结)应答但又不表现任何结核病迹象或症状即可对这些个体加以鉴别。来源于结核杆菌免疫个体的T细胞、NK细胞、B细胞和巨噬细胞的制备可使用该领域普通技术人员所了解的方法。如PBMCs(即周围血单核细胞)制品无需进一步分离细胞组分即可加以使用。PBMCs的制备通常采用，例如，“FICOLL”(Winthrop Laboratories，NY)的密度离心。也可直接由PBMCs纯化出用于文中所述测定的T细胞。作为选择，还可采用对分支杆菌蛋白起反应的富集T细胞系或对单一分支杆菌蛋白起反应的T细胞克隆。这类T细胞克隆可通过，例如，将来源于结核杆菌免疫个体的PBMCs与分支杆菌蛋白一同培养2-4周而产生。这样可以仅增加分支杆菌蛋白特异性T细胞，从而产生只含有这类细胞的细胞系。然后可将这些细胞克隆，并通过该领域普通技术人员所了解的方法用单一蛋白进行测试，以更加精确地判定单一的T细胞特异性。一般而言，在利用来源于结核杆菌免疫个体的T细胞、NK细胞、B细胞和/或巨噬细胞进行的增殖和/或细胞因子产生(即干扰素-γ和/或白细胞介素12的产生)测定中表现为阳性的抗原可被认为具有免疫原性。这些测定的实施可采用，例如，下文所述的典型方法。通过类似测定可鉴别出这些抗原的免疫原性部分，并可将其加到文中所述的多肽中。
评定多肽(如一种免疫原性抗原或其部分或其它变异体)对细胞增殖的诱导能力是将这些细胞(如T细胞和/或NK细胞)与多肽相接触并测量细胞的增殖。一般而言，足以用来对约105个细胞进行评定的多肽的量约为10ng/mL-100mg/mL，优选的约为10mg/mL。通常是将多肽与细胞在37℃下保温约6天。对与多肽保温后的细胞进行增殖应答测定，其评定可采用该领域普通技术人员所了解的方法，如将细胞暴露于放射性标记的胸腺嘧啶核苷以对细胞进行脉冲标记，然后对掺入细胞DNA的标记进行测量。一般而言，导致增殖至少比本底(即不加多肽培养的细胞所观测到的增殖)高三倍的多肽可被认为能够诱导增殖。
评定多肽对细胞内干扰素-γ和/或白细胞介素12产生的刺激能力是将细胞与多肽相接触，并测量细胞产生干扰素-γ或白细胞介素12的水平。一般而言，足以用来对约105个细胞进行评定的多肽的量约为10ng/mL-100mg/mL，优选的约为10mg/mL。多肽可以被固定在小珠或可生物降解的微球等固体支持物上，如按照美国专利号4,897,268和5,075,109所述进行，但并非必需如此。通常是将多肽与细胞在37℃下保温约6天。对与多肽保温后的细胞进行干扰素-γ和/或白细胞介素12(或其一种或多种亚基)测定，其评定可采用该领域普通技术人员所了解的方法，例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)，或测定IL12P70亚基时采用的T细胞增殖测定等生物测定方法。一般而言，导致每毫升培养物上清液(每毫升含有104-105个T细胞)至少产生50pg干扰素-γ的多肽可被认为能够刺激干扰素-γ的产生。导致每105个巨噬细胞或T细胞(或每3×105个PBMC)至少产生10pg/mL的IL12 P70亚基和/或至少100pg/mL的IL12 P40亚基的多肽可被认为能够刺激IL12的产生。
一般而言，免疫原性抗原是指能够刺激来源于至少约25％的结核杆菌免疫个体的T细胞、NK细胞、B细胞和/或巨噬细胞的增殖和/或细胞因子产生(即干扰素-γ和/或白细胞介素12的产生)的那些抗原。根据上述测定中的应答量和观测到应答的个体的百分率可从这些免疫原性抗原中鉴别出具有较佳治疗性能的多肽。此外，具有较佳治疗性能的抗原将不会刺激来源于约25％以上非结核杆菌免疫个体的细胞的体外增殖和/或细胞因子产生，从而消除了由结核杆菌应答性细胞造成的非特异性应答。能够以高比率诱导来源于结核杆菌免疫个体的T细胞、NK细胞、B细胞和/或巨噬细胞制品产生应答(并且来源于其他个体的细胞制品产生应答的发生率很低)的那些抗原则具有较佳的治疗性能。
具有较佳治疗性能的抗原也可根据其作为疫苗进行给药时使实验动物的结核杆菌感染严重程度减少的能力来加以鉴别。可用于实验动物的适当疫苗制剂将在下文作详细描述。根据抗原在实验性注射后引起细菌数量至少减少约50％和/或死亡率至少下降约40％的能力可对其效能加以测定。适当的实验动物则包括小鼠、豚鼠和灵长类动物。
5.3. 编码序列的分离
本发明还涉及编码结核杆菌融合多肽的核苷酸分子。在下文第6节以实例方式给出的特定实施方案中构建了13种结核杆菌融合编码序列。根据本项发明，任意一种可编码融合蛋白氨基酸序列的核苷酸序列均可用来产生能够控制编码序列表达的重组分子。
为了克隆全长编码序列或同种变异体以产生融合多肽，由文中公开的核苷酸序列或其互补序列的任意部分设计出的标记DNA探针均可用来筛选由不同结核杆菌菌株制备的基因组文库或cDNA文库，以确定各单一组分的编码序列。编码序列的分离也可通过聚合酶链反应(PCR)用两种根据文中公开的编码序列设计出的简并寡核苷酸引物库来实现。
本发明还涉及与序列编号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25的核苷酸序列互补的分离或纯化的多聚核苷酸，以及能够与这些互补序列选择性杂交的多聚核苷酸。在一项优选实施方案中提供了一种多聚核苷酸，该多聚核苷酸能够在低严格条件下与序列编号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25或其互补序列杂交，并编码一种可保持序列编号：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24和26的融合蛋白的免疫原性的蛋白。作为非限定性实例，典型的低严格条件如下(也可参考Shilo and Weinberg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：6789-6792)：将含有DNA的过滤器置于包含35％甲酰胺、5×SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.1％ PVP、0.1％ Ficoll、1％ BSA和500mg/ml变性鲑鱼精DNA的溶液中于40℃预处理6小时。杂交是在具有以下修改的相同溶液中进行：0.02％ PVP、0.02％ Ficoll、0.2％ BSA、100mg/ml鲑鱼精DNA、10％(wt/vol)葡聚糖硫酸酯，并且使用了5-20×106cpm的32P标记探针。将过滤器置于杂交混合液中40℃保温18-20小时，然后置于包含2×SSC、25mM Tris-HCl(pH7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS的溶液中55℃清洗1.5小时。用新溶液替换清洗液，并于60℃再保温1.5小时。过滤器用滤纸吸干，并进行放射自显影。如果需要，也可将过滤器于65-68℃第三次清洗并再暴露于胶片。其它可使用的低严格条件已为该领域所熟知(如种间杂交所采用的条件)。
在另一项优选实施方案中提供了一种多聚核苷酸，该多聚核苷酸能够在高严格条件下与序列编号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25或其互补序列杂交，并编码一种可保持序列编号：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24和26的融合蛋白的免疫原性的蛋白。作为非限定性实例，典型的高严格条件如下：将含有DNA的过滤器置于包含6×SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.02％ PVP、0.03％ Ficoll、0.02％ BSA和500μg/ml变性鲑鱼精DNA的溶液中于65℃预杂交8小时至过夜。将过滤器置于含有100μg/ml变性鲑鱼精DNA和5-20×106cpm32P标记探针的预杂交混合液中于65℃杂交48小时。将过滤器置于包含2×SSC、0.01％ PVP、0.01％Ficoll和0.01％ BSA的溶液中于37℃清洗1小时。再置0.1×SSC中于50℃清洗45分钟，然后进行放射自显影。其它可使用的高严格条件已为该领域所熟知。
在又一项优选实施方案中提供了一种多聚核苷酸，该多聚核苷酸能够在中等严格条件下与序列编号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25或其互补序列杂交，并编码一种可保持序列编号：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24和26的融合蛋白的免疫原性的蛋白。典型的中等严格条件如下：将含有DNA的过滤器置于包含6×SSC、5×Denhart’s溶液、0.5％SDS和100μg/ml变性鲑鱼精DNA的溶液中于55℃预处理6小时。在相同溶液中进行杂交，并使用5-20×106cpm的32P标记探针。过滤器在杂交混合液中于55℃保温18-20小时，然后在含有1×SSC和0.1％ SDS的溶液中于60℃清洗两次，每次30分钟。过滤器用滤纸吸干，并进行放射自显影。其它可使用的中等严格条件已为该领域所熟知。过滤器的清洗是在含有2×SSC和0.1％ SDS的溶液中于37℃进行，时间1小时。
5.4. 由编码序列编码的多肽
根据本项发明，可利用编码融合蛋白、融合蛋白片段或其功能等价物的本发明所述多聚核苷酸来产生能够在适当宿主细胞内控制该融合蛋白、融合蛋白片段或其功能等价物的表达的重组核酸分子。通过对编码序列的分子操作可改变由这些多聚核苷酸编码的融合多肽产物。
由于遗传密码的固有简并性，因而在本发明的实施中可将编码基本相同或功能上等价的氨基酸序列的其它DNA序列用于融合多肽的表达。这些DNA序列包括那些能够在上文5.3节所述的低严格、中等严格或高严格条件下与本文公开的编码序列或其互补序列杂交的序列。
可按照本项发明加以使用的改变了的核苷酸序列包括不同核苷酸残基的缺失、添加或取代，其所得的序列可编码相同的或功能上等价的基因产物。该基因产物本身可含有能够导致沉寂改变从而产生功能上等价的抗原决定簇的氨基酸残基缺失、添加或取代。此类保守氨基酸取代可依据所涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性来进行。举例来说，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸、组氨酸和精氨酸；具有不带电荷的极性头部基团和类似亲水性值的氨基酸包括：甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；具有非极性头部基团的氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。
为了改变融合蛋白的编码序列使其具有不同的末端，可将本发明的核苷酸序列加以设计，其中包括，但不局限于，能够改变基因产物的加工和表达的变化。例如，可采用定点诱变等该领域所熟知的技术来引入突变，以插入新限制性位点，以此来改变糖基化、磷酸化模式等。
在本发明的一项可替代的实施方案中，可利用本领域所熟知的化学方法完整地或部分地合成融合蛋白的编码序列。例如，可参考Caruthers et al.，1980，Nuc.Acids Res.Symp.Ser.7：215-233；Crea and Horn，180，Nuc.Acids Res.9(10)：2331；Matteucci andCaruthers，1980，Tetrahedron Letter 21：719；和Chow and Kempe，1981，Nuc.Acids Res.9(12)：2807-2817。作为选择，也可利用完整地或部分地合成氨基酸序列的化学方法来直接产生多肽。举例来说，可通过固相技术将肽合成，然后由树脂上分离，并通过制备型高效液相色谱加以纯化(参考Creighton，1983，蛋白质结构与分子机理，W.H.Freeman and Co.，N.Y.pp.50-60)。合成的多肽组合物可通过氨基酸分析或测序(如Edman降解法；参考Creighton，1983，蛋白质结构与分子机理，W.H.Freeman and Co.，N.Y.pp.34-49)作进一步验证。
此外，还可对融合蛋白的编码序列进行体外或体内突变，以创建和/或破坏翻译序列、起始序列和/或终止序列，或引起编码区变异并且/或者形成新的限制性内切酶位点或破坏已有的限制性内切酶位点，以此来简化进一步的体外修饰。该领域所了解的任何诱变技术均可使用，其中包括，但不局限于，化学诱变、体外定点诱变(Hutchinson，C.，et al.，1978，J.Biol.Chem 253：6551)、使用TAB联结子(Pharmacia)等。重要的是这些操作不会破坏融合多肽的免疫原性。
另外，也可将非经典氨基酸或氨基酸化学类似物作为取代物或附加物引入该序列。非经典氨基酸包括，但不局限于，常见氨基酸的D型异构体、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸、t-丁基甘氨酸、t-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟氨基酸，以及β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸等设计的氨基酸，和一般的氨基酸类似物。并且氨基酸可以是D型(右旋型)或L型(左旋型)。
在一项特定实施方案中，融合蛋白内各抗原的编码序列可按照任何顺序由肽键将其氨基端或羧基端连接。作为选择，也可使用肽衔接序列来隔离构成融合多肽的各单一多肽，其间的距离足以确保各多肽能够折叠成可最大程度实现其预防和治疗结核病的抗原有效性的二级和三级结构。这种肽衔接序列可通过该领域所熟知的常规技术被掺入到融合蛋白中。适当肽衔接序列的选择可基于以下因素：(1)能够采取一种柔性的伸展构象；(2)不会形成可影响第一和第二多肽上的功能性决定簇的二级结构；以及(3)不含有可能与多肽的功能性决定簇反应的疏水性残基或带电荷的残基。优选的肽衔接序列含有Gly、Asn和Ser残基。其它近中性的氨基酸，如Thr和Ala，也可在衔接序列中使用。可有效用作衔接物的氨基酸序列包括Maratea et al.，Gene40：39-46，1985；Murphy et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：8258-8262，1986；美国专利号4,935,233和美国专利号4,751,180中所描述的那些序列。衔接序列的长度可约为1-50个氨基酸。如果第一和第二多肽具有可隔离功能结构域并防止位阻效应的N端非必需氨基酸区，则可无需使用肽序列。举例来说，融合蛋白中的各抗原可通过柔性衔接物，如重复1-3次的Gly-Cys-Gly或Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(Bird et al.，1988，Science 242：423-426；chaudhary et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：1066-1070)，而相互连接。
在一项实施方案中，这种蛋白是通过将编码该蛋白的核酸进行重组表达而产生的。这种融合产物是利用该领域所了解的方法将编码所需氨基酸序列的适当核酸序列相互连接，并利用该领域所了解的方法将其产物进行表达而得到的。作为选择，也可利用蛋白合成技术，如使用肽合成仪，来制备这种产物。也可将细胞因子或佐剂等其它分子的编码序列加入到融合多肽中。
5.5. 融合蛋白的产生
为了产生本发明的结核杆菌融合蛋白，可在适当的表达载体，即含有对插入编码序列进行转录和翻译所必需的元件的载体，中插入编码该蛋白的核苷酸序列或功能等价物。由重组表达载体转染或转化的宿主细胞或细胞系可用于多种用途。其中包括，但不局限于，融合蛋白的大规模生产。
含有融合编码序列及适当转录/翻译调控信号的表达载体的构建可采用该领域技术人员所熟知的方法。其中包括DNA体外重组技术、合成技术以及体内重组/遗传重组(例如，可参考Sambrook et al.，1989，分子克隆实验手册，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.及Ausubel et al.，1989，新编分子生物学指南，Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience，N.Y.中描述的技术)。也可通过化学方法合成能够编码多肽的RNA(Gait，ed.，1984，寡核苷酸合成，IRL Press，Oxford)。
5.5.1. 表达系统
有多种宿主-表达载体系统可用来表达融合蛋白编码序列。其中包括微生物，如利用含有编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)；利用含有编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(如酵母属、毕赤酵母属)；利用含有编码序列的重组病毒表达载体(如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；利用含有编码序列的重组病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或利用含有编码序列的重组质粒表达载体(如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或哺乳动物细胞系统(如COS细胞、CHO细胞、BHK细胞、293细胞、3T3细胞)，但并不局限于此。这些系统的表达元件在强度和特异性方面各不相同。
表达载体中可使用众多转录和翻译元件，其中包括组成型和诱导型启动子，中的任意一种，这将取决于所使用的宿主/载体系统。举例来说，若在细菌系统中克隆，则可使用λ嗜菌体的pL或plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂交启动子；巨细胞病毒启动子)等诱导型启动子；若在昆虫细胞系统中克隆，则可使用杆状病毒多角体启动子等启动子；若在植物细胞系统中克隆，则可使用来源于植物细胞基因组的启动子(如热休克启动子；RUBISCO小亚基启动子；α/β叶绿素结合蛋白启动子)或来源于植物病毒的启动子(如CaMV的35S RNA启动子；TMV的外壳蛋白启动子)；若在哺乳动物细胞系统中克隆，则可使用源于哺乳动物细胞基因组的启动子(如金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)；若要产生含有多拷贝抗原编码序列的细胞系，则可使用基于SV40、BPV和EBV的带有适当选择标记的载体。
细菌系统是优选的用于结核杆菌抗原表达的系统。为了便于体内传输，可将卡介苗等细菌设计成在其细胞表面表达本发明所述融合多肽。也可根据表达产物的预期用途对其它众多的细菌表达载体进行有利地选择。举例来说，若要产生大量的融合蛋白用于药物的配制，则理想的载体要能够指导便于纯化的融合蛋白产物的高水平表达。此类载体包括，但不局限于，大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther et al.，1983，EMBO J.2：1791)，其中可按照lacZ编码区的读码框将编码序列连接到载体中以产生一种杂交蛋白；pIN载体(Inouye and Inouye，1985，Nucleic Acids Res.13：3101-3109；Van Heeke and Schuster，1989，J.Biol.Chem.264：5503-5509)；等。也可使用pGEX载体将外源多肽作为与谷胱甘肽S转移酶(GST)融合的蛋白加以表达。这些融合蛋白一般为可溶性，并可通过谷胱甘肽琼脂糖小珠吸附然后于存在游离谷胱甘肽的情况下洗脱而方便地从裂解细胞中纯化。pGEX载体被设计成含有凝血酶或Xa因子蛋白酶裂解位点，使得克隆的所需融合多肽可释放GST部分。
5.5.2. 蛋白纯化
一旦重组蛋白被表达，即可根据该产物的物理特性或功能特性测定对其加以鉴定，包括对产物进行放射性标记，然后通过凝胶电泳、放射免疫测定、ELISA、生物测定等进行分析。
一旦编码的蛋白经过鉴定，即可利用标准方法对其加以分离和纯化，其中包括层析法(如高效液相层析法、离子交换层析法、亲和层析法以及填料柱层析法(sizing column chromatography))、离心、差示溶解度，或任何用于蛋白纯化的其它技术。所使用的实际条件在某种程度上取决于净电荷、疏水性、亲水性等因素，这对该领域的技术人员而言是显而易见的。功能特性的评定可使用任何适当的测定方法，如抗体结合、诱导T细胞增殖、刺激IL2、IL-4和IFN-γ等细胞因子产生。就本发明的实施而言，优选的是各融合蛋白自其它蛋白纯化的程度至少达80％。更优选的是其纯化程度至少达90％。对体内给药而言，优选的是该蛋白的纯化程度高于95％。
5.6. 融合蛋白编码序列的应用
本发明的融合蛋白编码序列可用来编码一种蛋白产物，以作为免疫原来诱导和/或增强对结核杆菌的免疫应答。此外，该编码序列可与细胞因子或佐剂等其它分子的编码序列相连接。这些多聚核苷酸可在体内用作DNA疫苗(美国专利号5,589,466；5,679,647；5,703,055)。在本发明的该实施方案中，这种多聚核苷酸可在受者体内表达其编码的蛋白，以直接诱导免疫应答。可将该多聚核苷酸注入首次用于实验的受试者中以诱发对其编码产物的免疫应答，或可向感染的或已免疫的受试者给药以增强其二次免疫应答。
在一项优选实施方案中，治疗性组合物含有一种融合蛋白编码序列或其相当于表达载体一部分的片段。详细而言，该多聚核苷酸含有一种经操作与其编码区相连接的启动子，该启动子可以是诱导型或组成型，作为选择，也可以是组织特异型。在另一项实施方案中，多聚核苷酸含有一种编码序列，序列两侧为能够促进其同源重组到基因组内所需位点，从而使该编码序列能够在染色体内表达的区域(Kollerand Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935；Zijlstra et al.，1989，Nature 342：435-438)。
将核酸输入受试者可采用直接方式或间接方式，直接方式是将受试者直接暴露于核酸或携带有核酸的载体，间接方式是先于体外用核酸转化细胞，然后将细胞移植到受试者体内。这两种方法分别被称作体内基因转移和先体外后体内基因转移。
在一项特定实施方案中，可将核酸直接进行体内给药，核酸则在体内表达以产生其编码的融合蛋白产物。这可通过该领域所了解的众多方法中的任意一种来实现，举例来说，可构建一种将该核酸作为一部分的适当核酸表达载体，并将其给药以使它进入细胞内，其方法可通过，例如，用一种缺损的或减毒的反转录病毒的载体或其它病毒的载体进行感染(参考美国专利号4,980,286)、或将裸露DNA直接注射、或采用微粒轰击(如基因枪；Dupont的Biolistic)、或用脂类或细胞表面受体或转染剂进行包被，或包裹于脂质体、微颗粒或微胶囊(美国专利号5,407,609；5,853,763；5,814,344和5,820,883)、或与已知可进入细胞核的肽相连接而将其给药、或与可进行受体介导的内吞作用的配体相连接而将其给药(例如，参考Wu and Wu，1987，J.Biol.Chem.262：4429-44 32)，该方法甚至可用来定向于特异表达该受体等类型的细胞。在另一项实施方案中，则可形成一种核酸-配体复合物，其中的配体含有一种可破坏内涵体的溶源性病毒肽，使核酸能够避免溶酶体的降解。在又一项实施方案中，可通过导入一段特异受体而定制出可被特定细胞吸收和表达的核酸(例如，参考PCT公开中1992年4月16日的WO 92/06180；1992年12月23日的WO92/22635；1992年11月26日的WO 92/20316；1993年7月22日的WO 93/14188；1993年10月14日的WO 93/20221)。作为选择，也可通过同源重组将核酸引入细胞并使其插入宿主细胞DNA来进行表达(Koller and Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：8932-8935；Zijlstra et al.，1989，Nature 342：435-438)。
在一项特定实施方案中，可使用诸如反转录病毒载体等病毒载体(参考Miller et al.，1993，Meth.Enzymol.217：581-599)。反转录病毒载体经过修饰已去除了那些不是病毒基因组包装和整合至宿主细胞DNA内所必需的反转录病毒序列。将融合编码序列克隆到载体内，该载体使核酸易于输送到受者体内。有关反转录病毒载体的更详细情况可从Boesen et al.，1994，Biotherapy 6：291-302中查明，该文献对使用反转录病毒载体将mdrI基因输送到造血干细胞内以使干细胞对化疗更具有抗性作了描述。说明反转录病毒载体在基因治疗中的应用的其它参考文献有：Clowes et al.，1994，J.Clin.Invest.93：644-651；Kiem et al.，1994，Blood 83：1467-1473；Salmonsand Gunzberg，1993，Human Gene Therapy 4：129-141；和Grossmanand Wilson，1993，Curr.Opin.In genetics and Devel.3：110-114。
腺病毒是其它可在基因治疗中使用的病毒载体。腺病毒是尤其适合于将基因传送到呼吸上皮细胞内的运输工具。在自然状态下，腺病毒可感染呼吸上皮细胞并导致一种轻度的疾病。基于腺病毒的传送系统的其它目标有肝脏、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒的优势在于能够感染不分裂的细胞。也有提议将腺相关病毒(AAV)用于体内基因转移的(Walsh et al.，1993，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300)。
涉及把构建体转移到组织培养物的细胞内的其它方法如电穿孔、脂转染、磷酸钙介导的转染，或病毒感染。转移方法通常包括将选定标记转移到细胞中。再将细胞置于选择环境下，以分离出那些已将转移的基因吸收并正在进行表达的细胞。然后将细胞输送给受试者。
在该实施方案中是将核酸引入细胞，然后将所得重组细胞进行体内给药。其引入的实现可采用该领域所了解的任何方法，其中包括，但不局限于，转染、电穿孔、微注射、用含有核酸序列的病毒或嗜菌体载体进行感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球状体融合等。该领域中有多种方法可用来将外源基因引入细胞(例如，参考Loeffler and Behr，1993，Meth.Enzymol.217：599-618；Cohen et al.，1993，Meth.Enzymol.217：618-644；Cline，1985，Pharmac.Ther.29：69-92)，并且均可根据本发明加以使用。
本发明的多聚核苷酸也可以在结核病的诊断中用来检测患者体内的结核杆菌特异性多聚核苷酸序列。该检测可通过，例如，从来源于疑为细菌感染患者的生物样品中分离多聚核苷酸而实现。一旦从生物样品中分离出多聚核苷酸，即可利用该领域普通技术人员所了解的核酸杂交方法将本发明所述与一种或多种多聚核苷酸互补的标记多聚核苷酸与生物样品中的多聚核苷酸进行杂交。举例来说，这种杂交可在溶液中或使用一种结合在固体支持物上的杂交配对体来实现。
5.7. 融合蛋白的治疗性和预防性应用
纯化或部分纯化的融合蛋白或其片段可作为疫苗或治疗组合物加以配制。该组合物可含有佐剂以加强免疫应答。此外，这些蛋白可进一步悬浮于油乳剂中，使注射后的蛋白在体内更缓慢地释放。配方中各组分的最佳比例可通过该领域所熟知的技术来加以确定。
为了加强免疫应答，可在本发明所述疫苗中使用众多佐剂中的任意一种。大多数佐剂都含有一种用来保护抗原不被快速分解的物质，如氢氧化铝或矿物油，和一种免疫应答的非特异性刺激剂，如脂质A、百日咳博氏杆菌或结核杆菌。适当的佐剂可由商品形式购得，其中包括，例如，弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂(Difco Laboratories)及默克佐剂65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)。其它适当的佐剂有明矾、可生物降解的微球体、单磷酰脂质A、quil A、SBAS1c、SBAS2(Ling et al.，1997，Vaccine 15：1562-1567)、SBAS7和氢氧化铝。
优选而言，本发明所述疫苗中的佐剂可诱导一种涉及Th1的免疫应答。适当的佐剂系统包括，例如，单磷酰脂质A，优选的为3-脱氧酰化单磷酰脂质A(3D-MLP)，与铝盐的组合物。单磷酰脂质A与皂甙衍生物的组合物可作为一种增强的系统，特别是WO 94/00153中公开的3D-MLP与皂甙QS21的组合物，或WO 96/33739中公开的用胆固醇抑制皂甙QS21的较低反应源性组合物。此前的实验已明确证明了3D-MLP与QS21的组合物在诱导体液免疫应答和Th1型细胞免疫应答中的协同作用。WO 95/17210中描述的在水包油型乳剂中含有WS21、3D-MLP和生育酚的强效佐剂配方则为优选的配方。
含有本发明所述抗原的制剂可按照本来形式向受试者给药，或以药用组合物或治疗组合物的形式给药。含有蛋白的药用组合物可利用传统的混合、溶解、粒化、包裹糖衣、粉碎、乳化、封装、包载或冻干方法来制造。药用组合物可按照传统方式用一种或多种有利于将多肽加工成药用制品的生理容许的载体、稀释剂、赋形剂或助剂来进行配制。适当的剂型则取决于所选择的给药途径。
对局部给药而言，可将蛋白配制为溶液、凝胶体、软膏剂、乳膏剂、悬浮液等该领域所熟知的形式。
全身型制剂包括那些计划由皮下、静脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射等注射方式给药的制剂，以及那些计划由穿皮、穿粘膜、经口或经肺方式给药的制剂。
对注射而言，可将蛋白配制在水性溶液中，优选的是配制在Hanks溶液、Ringer溶液或生理盐水缓冲液等生理容许的缓冲液中。溶液可含有悬浮剂、稳定剂和/或分散剂等配剂。作为选择，也可将蛋白制成粉末形式，在使用前则以适当载体，如无热原的无菌水，进行构建。
对穿粘膜给药而言，可在制剂中使用适于透过屏障的渗透剂。这些渗透剂通常为该领域所了解。
对经口给药而言，可通过将蛋白与该领域所熟知的药学容许的载体向混合而很容易地配制组合物。这些载体使蛋白可被配制成适于处理的受试者经口摄入的片剂、丸剂、糖锭、胶囊、流体、凝胶体、糖浆剂、膏剂、悬浮液等。举例来说，对粉末、胶囊和片剂等固体口服制剂而言，适当的赋形剂包括糖类等填充剂，如乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等纤维素制品；成粒剂以及粘合剂。如果需要，也可加入崩解剂，如交连的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂，或海藻酸或其盐，如海藻酸钠。
如果需要，也可利用标准技术将固体剂型包裹糖衣或肠溶衣。
举例来说，对悬浮液、酏剂和溶液等液体口服制剂而言，适当的载体、赋形剂或稀释剂包括水、乙二醇、油类、乙醇等。另外也可加入调味剂、防腐剂、着色剂等。
对口腔给药而言，可按照传统方式将蛋白配制成片剂、锭剂等形式。
对通过吸入给药而言，可利用由加压包装或喷雾器进行喷雾的形式方便地提供用于按本发明所述加以使用的蛋白，其中需使用适当的推进剂，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适当气体。在使用加压喷雾剂的情况下，可通过使用一种阀门来确定剂量单位，以此来显示测量的量。用于在吸入器或吹药器中使用的如明胶的胶囊或药筒可配制成含有蛋白与适当粉基，如乳糖或淀粉，所构成的粉状混合物。
也可将蛋白配制在直肠用或阴道用组合物中，例如含有可可脂或其它甘油酯等传统栓剂主剂的栓剂或滞留灌肠剂。
除上述剂型外，还可将蛋白配制成长效制剂。这种长效制剂可通过植入(如皮下或肌内)或肌内注射方式给药。因此，举例来说，可将蛋白与适当聚合材料或疏水性材料(如在容许的油中形成乳剂)或离子交换树脂或其微溶衍生物，如微溶盐，一同进行配制。
作为选择，也可使用其它的药物递送系统。脂质体和乳剂是公认的可用来传递抗原的递送载体实例。尽管二甲亚砜等某些有机乳剂具有较高毒性，但也可以使用。另外也可将融合蛋白封装在微球体中(美国专利号5,407,609；5,853,763；5,814,344和5,820,883)。此外，还可利用缓释系统来递送蛋白，如含有治疗剂或接种剂的固体聚合物的半透性基体。目前已确定了多种缓释材料，并且为该领域的技术人员所熟知。缓释胶囊释放蛋白的时间可持续数周直至100天以上，这取决于其化学性质。根据试剂的化学性质和生物稳定性情况，可使用额外的策略来稳定蛋白。
根据本文提供的详细公开内容，该领域的技术人员能够很容易地确定该融合蛋白在受试者内诱导免疫应答的有效剂量。
首先可以由体外测定对有效剂量进行估计。例如可使用该领域所熟知的技术来确定能够在动物模型中实现对免疫应答的诱导的一服剂量。根据由动物得到的数据，该领域的普通技术人员则能够很容易地优化向人类的给药方法。剂量和间隔可作个别调整。举例来说，当作为疫苗使用时，可在1-36周的时间内将约1-3服剂量的本发明所述多肽和/或多聚核苷酸给药。优选的是每隔约3-4周给药3服剂量，并在此后定期进行促升接种。个别患者也可使用备用方案。适当剂量是指，当按照上文所述给药时，能够在一个免疫患者体内引发一种足以在至少1-2年内保护该患者不受结核杆菌感染的免疫应答的多肽或DNA的量。一般而言，一服剂量中提供的(或由一服剂量中的DNA原位产生的)多肽的量约为每公斤宿主1pg-100mg，典型的约为10pg-1mg，优选的则约为100pg-1mg。适当的剂量范围将随患者的体重而变化，但典型的约为0.1mL-5mL。
5.8. 融合蛋白的诊断性应用
本发明的融合多肽可用于结核病感染的体外和体内诊断。利用上文5.2节公开的方法可测定本发明所述多肽诱导细胞增殖或细胞因子产生的能力。
另一方面，本发明提供通过皮肤试验用一种或多种融合多肽进行结核病活体诊断的方法。文中使用的皮肤试验是指在经皮注射本发明的一种或多种多肽后对迟发型超敏(DTH)反应(如肿胀、发红或皮炎)进行测量的任何直接对患者实施的测定方法。这种注射的实现可使用任何足以使多肽与患者的真皮细胞相接触的适当装置，举例来说，如结核杆菌注射器或1mL注射器。优选的是至少在注射约48小时后测量其反应，更优选的则在注射约48-72小时后。
DTH反应是一种由细胞介导的免疫应答，此前已暴露于测试抗原(即所用多肽的免疫原性部分或其变异体)的患者体内的该反应较为强烈。该应答可利用标尺进行目测。一般而言，直径约大于0.5cm，优选的则直径约大于1.0cm，的应答为表现出结核病感染的阳性应答，这可能表示一种活动性疾病，也可能不是。
对于在皮肤试验中使用而言，优选的是将本发明的融合多肽配制成含有一种多肽和一种生理容许的载体的药用组合物。此类组合物通常可含有一种或多种上述多肽，其含量约为1μg-100μg，优选的则在0.1mL体积中含有约10mg-50mg。优选而言，此类药用组合物中使用的载体为含有苯酚和/或吐温80TM等防腐剂的盐溶液。
另一方面，本发明提供利用多肽进行结核病诊断的方法。此方面提供的方法是用来以单独的或联合的融合多肽检测生物样品中的结核杆菌感染。文中使用的“生物样品”是指来源于患者的任何含有抗体的样品。优选而言，该样品为全血、痰、血清、血浆、唾液、脑脊液或尿。更优选而言，该样品为来源于患者或供血的血液、血清或血浆样品。如下文所述，可在测定中利用多肽来确定样品中的多肽抗体相对于预定截止值的存在与否。该抗体的存在则表明此前已被分支杆菌抗原致敏，这可表明患有结核病。
在使用一种以上融合多肽的实施方案中，优选的是使用互补的多肽(即样品中倾向于被一种多肽组分检测出的感染则不能被其它多肽组分所检测)。利用每种多肽单独鉴定来源于已知被结核杆菌感染的一系列患者的血清样品，由此通常可鉴定出互补的多肽。在确定利用各种多肽检测出的阳性样品(如下文所述)之后，即可将两种或多种融合多肽配制成组合物，使其能够检测大多数或所有测试样品中的感染。在来源于结核病感染个体的血清中，使用任意一种单一蛋白都显示抗体阴性结果的约占25-30％。因此，结合使用互补多肽可提高诊断测试的灵敏性。
对使用一种或多种多肽来检测样品中的抗体而言，有多种已被该领域普通技术人员所了解的测试形式。例如，见Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，1988，其内容在此引入作为参考。一项优选实施方案中的测试方法涉及利用固定在固体支持物上的多肽来结合抗体，并将抗体从样品中去除。然后可利用含有报告基团的检测试剂来检测结合的抗体。适当的检测试剂包括可与抗体/多肽复合物结合的抗体以及用报告基团标记的游离多肽(如在半竞争性测定中使用)。作为选择，也可使用竞争性测定法，该方法是用报告基团标记能够与多肽结合的抗体，并在抗原与样品保温后使其与固定的抗原结合。样品的组分对标记抗体与多肽结合的抑制程度可表明该样品与固定多肽的反应能力。
固体支持物可以是该领域普通技术人员所了解的能够附着抗原的任何固体材料。举例来说，该固体支持物可以是微量滴定板的测试孔或硝酸纤维素膜或其它适当的膜。作为选择，该支持物也可以是玻璃、玻璃纤维、乳胶或诸如聚苯乙烯或聚氯乙烯等塑料材料的小珠或盘。它也可以是磁性颗粒或光纤传感器，例如美国专利号5,359,681中公开的那些支持物。
将多肽与固体支持物结合可采用该领域普通技术人员所了解的多种技术。本文中的“结合”包括非共价结合，如吸附，和共价结合(可以是抗原与支持物上的功能基团之间的直接连接或经由交联剂的连接)。优选的是通过吸附结合到微量滴定板的孔上或膜上。在此情况下，可通过在适当缓冲液中将多肽与固体支持物接触适当的时间来实现吸附。接触时间随温度而变化，但典型的约为1小时-1天。一般而言，将约为10ng-1mg，优选的则约为100ng，的多肽与塑料微量滴定板(如聚苯乙烯或聚氯乙烯)的一个孔相接触即足以结合足够量的抗原。
多肽与固体支持物共价结合的实现通常可先将支持物与能够同该支持物反应并能够同多肽上的一种功能基团，如羟基或氨基，发生反应的双功能试剂进行反应。例如，可使用苯醌或通过多肽上的胺和活性氢与支持物上醛基的缩合而将多肽结合到带有适当聚合物包被的支持物上(例如，参考Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook，1991，at A12-A13)。
某些实施方案中的测定采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)。该测定法是先将固定在固体支持物，通常是微量滴定板孔，上的融合多肽抗原与样品相接触，使样品中的多肽抗体能够与固定的多肽相结合。然后从固定的多肽中去除未结合的多肽，并加入一种能够与固定的抗体-多肽复合物相结合的检测试剂。然后用适于该特异检测试剂的方法测定仍与固体支持物结合的检测试剂的量。
更详细而言，一旦如上文所述将多肽固定在支持物上，通常要将支持物上剩余的蛋白结合位点阻断。该领域普通技术人员所了解的任何适当阻断剂，如牛血清白蛋白或吐温20TM(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)，均可使用。然后将固定的多肽与样品保温，使抗体能够与抗原结合。样品在保温前可用适当的稀释液，如磷酸缓冲盐溶液(PBS)，进行稀释。一般而言，适当的接触时间是指足以对结核杆菌感染的样品中的抗体存在情况进行检测的一段时间。优选的接触时间是指足以使结合的水平达到结合抗体与未结合抗体间实现平衡的水平的至少95％。该领域的普通技术人员都将认可，通过对一段时间内的结合水平的测定可容易地确定出实现平衡所需的时间。在室温的情况下，约30分钟的保温时间通常已经足够。
然后通过用适当缓冲液，如含有0.1％吐温20TM的PBS，清洗固体支持物来去除未结合的样品。再把检测试剂加到固体支持物上。适当的检测试剂是指能够与固定的抗体-多肽复合物结合，并可利用该领域已知的多种方法中的任意一种加以检测的任何组合物。优选的检测试剂可含有一种与报告基团相连接的结合剂(如蛋白A、蛋白G、外源凝集素或游离抗原)。优选的报告基团包括酶(如辣根过氧化物酶)、底物、协同因子、抑制剂、染料、放射性核素、发光基团、荧光基团、生物素以及胶体金和胶体硒等胶粒。结合剂与报告基团的结合可利用该领域普通技术人员所了解的标准方法来实现。也可由商品形式购得与多种报告基团连接的常用结合剂(如Zymed Laboratories，SanFrancisco，CA，and Pierce，Rockford.IL)。
然后将检测试剂与固定的抗体-多肽复合物保温一段时间，该时间要足以检测出结合抗体。通常由厂商说明或通过测定一段时间内的结合水平即可确定适当的时间长度，然后去除未结合的检测试剂，并利用报告基团检测结合的检测试剂。检测报告基团所使用的方法取决于报告基团的性质。对放射性基团而言，通常适于采用闪烁计数法或放射自显影法。分光镜法可用来检测染料、发光基团和荧光基团。生物素则可利用结合有不同报告基团(通常为放射性基团或荧光基团或酶)的抗生物素蛋白来检测。酶报告基团一般可通过加入底物(通常需保持一段特定的时间)，然后由分光镜或其它分析反应产物的方法来检测。
为了检测样品中抗结核杆菌抗体的存在与否，通常需要将检测与固体支持物保持结合的报告基团所得到的信号与相当于预定截止值的信号进行比较。在一项优选实施方案中，该截止值为固定抗原与未感染患者的样品保温时所得信号的平均值。一般而言，所产生的信号比预定截止值的标准偏差大3倍的样品被认为是结核病阳性。在一项备用的优选实施方案中，该截止值是按照Sackett et al.，1985，Clinical Epidemiology：A Basic Science for Clinical Medicine，Little Brown and Co.，pp.106-107中的方法利用ReceiverOperator Curve来确定。简单地说，该实施方案中的截止值可根据成对的真阳性率(即灵敏度)和假阳性率(100％特异性)的曲线来确定，该曲线相当于诊断测试结果中每种可能的截止值。在最接近左上角的曲线上的截止值(即围有最大面积的值)为最精确的截止值，而所产生的信号大于由该方法确定的截止值的样品可被认为是阳性。作为选择，也可将截止值沿图左移使假阳性率最小化，或右移使假阴性率最小化。一般而言，所产生的信号大于由该方法确定的截止值的样品可被认为是结核病阳性。
在一项相关实施方案中，该测定是以快速流通或条型测试形式进行，其中的抗原被固定在硝酸纤维素等膜上。在流通测试中，样品中的抗体随着样品流过膜而与固定多肽结合。然后是检测试剂(如蛋白A-胶体金)随着含有检测试剂的溶液流过膜而与抗体-多肽复合物结合。然后按上文所述对结合的检测试剂进行检测。在条型测试形式中，将膜上结合有多肽的一端浸没在含有样品的溶液中。样品沿着膜迁移而经过含有检测试剂的区域，并迁移到固定多肽区。检测试剂在多肽区聚集则表明样品中存在抗结核杆菌抗体。检测试剂在该位置的聚集通常会形成一种可见的图案，如一条直线。若没有该图案则表明一种阴性结果。为了产生可从视觉上加以辨别的图案，一般需对固定在膜上的多肽量进行选择，使生物样品所含抗体的水平足以在ELISA测定中产生如上文所述的阳性信号。固定在膜上的优选多肽量约为5ng-1mg，更优选的则约为50ng-500ng。这些测试通常只需使用极少量(如一滴)患者血清或血液即可进行。
以下实施例将作为非限定性例证来对本发明加以描述。
6.实施例：结核杆菌抗原的融合蛋白可保持其单一组分的免疫原性
6.1. 材料与方法
6.1.1. 融合蛋白的构建
利用PCR对结核杆菌抗原的编码序列进行修饰，以促进其融合以及随后的融合蛋白表达。DNA扩增使用10μl 10×Pfu缓冲液、2μl 10mMdNTPs、10μM浓度的每种PCR引物各2μl、81.5μl水、1.5μl PfuDNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)和1μl 70ng/μl浓度(用于TbRa3抗原)或50ng/μl浓度(用于38kD和Tb38-1抗原)的DNA。对TbRa3抗原而言，是在94℃下变性2分钟。然后以96℃下15秒、72℃下1分钟为一个循环，共作40个循环，最后是72℃下4分钟。对38kD抗原而言，是在96℃下变性2分钟。然后以96℃下30秒、68℃下15秒及72℃下3分钟为一个循环，共作40个循环，最后是72℃下4分钟。对Tb38-1抗原而言，是在94℃下变性2分钟。然后以96℃下15秒、68℃下15秒及72℃下1.5分钟为一个循环，共作10个循环，再以96℃下15秒、64℃下15秒及72℃下1.5分钟为一个循环，共作30个循环，最后是72℃下4分钟。
用限制性内切酶进行消化，以产生所需的粘末端或平末端，然后将各融合多肽的特异性多聚核苷酸与表达质粒相连接。所得的各质粒则含有各融合多肽的单一抗原的编码序列。所用的表达载体为pET-12b和pT7^L2 IL1。
连接抗原Ra12、TbH9和Ra35的三种编码序列使其编码一种融合蛋白(序列编号1和2)(图1A和2B)。连接抗原Erd14、DPV和MTI的三种编码序列使其编码第二种融合蛋白(序列编号3和4)(图2)。连接抗原TbRa3、38kD和Tb38-1的三种编码序列使其编码一种融合蛋白(序列编号5和6)(图3A-3D)。连接抗原TbH9和Tb38-1的两种编码序列使其编码一种融合蛋白(序列编号7和8)(图4A-4D)。连接抗原TbRa3、38kD、Tb38-1和DPEP的四种编码序列使其编码一种融合蛋白(序列编号9和10)(图5A-5J)。连接抗原Erd14、DPV、MTI、MSL和MTCC2的五种编码序列使其编码一种融合蛋白(序列编号11和12)(图6A和6B)。连接抗原Erd14、DPV、MTI和MSL的四种编码序列使其编码一种融合蛋白(序列编号13和14)(图7A和7B)。连接抗原DPV、MTI、MSL和MTCC2的四种编码序列使其编码一种融合蛋白(序列编号15和16)(图8A和8B)。连接抗原DPV、MTI和MSL的三种编码序列使其编码一种融合蛋白(序列编号17和18)(图9A和9B)。连接抗原TbH9、DPV和MTI的三种编码序列使其编码一种融合蛋白(序列编号19和20)(图10A和10B)。连接抗原Erd14、DPV和MTI的三种编码序列使其编码一种融合蛋白(序列编号21和22)(图11A和11B)。连接抗原TbH9和Ra35的两种编码序列使其编码一种融合蛋白(序列编号23和24)(图12A和12B)。连接抗原Ra12和DPPD的两种编码序列使其编码一种融合蛋白(序列编号25和26)(图13A和13B)。
利用pET质粒载体(pET-17b)和T7 RNA聚合酶表达系统(Novagen，Madison，WI)于大肠杆菌中表达出在氨基端部分带有6个组氨酸残基的重组蛋白。高水平表达则采用大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysE(Novagen)。根据亲和层析法用单步QLAexpress Ni-NTA琼脂糖填料在存在8M脲的情况下从IPTG诱导的500ml批量培养物的可溶性上清或不溶性包涵体中纯化重组(His标记)融合蛋白。简单地说，将含有pET构建体的BL21的过夜饱和生长培养物共20ml加到500ml含有50μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素的2×YT培养基中，并于37℃下振荡培养。当OD560为0.3时用2mM IPTG诱导细菌培养物，并再培养3小时(OD＝1.3-1.9)。通过离心从500ml批量培养物中收集细胞，并重悬于20ml含有2mM PMSF和20μg/ml亮肽素并且每25ml还加入1片全蛋白酶抑制剂药片(Boehringer Mannheim)的结合缓冲液(0.1M磷酸钠，pH8.0；10mM Tris-HCl，pH8.0)中。将大肠杆菌简短超声后利用冻熔法使其裂解，然后于12k rpm下离心30分钟，使包涵体沉淀。
用溶于10mM Tris-HCl(pH8.0)的1％CHAPS将包涵体清洗3次。该步骤可使LPS污染的水平大大降低。最后将包涵体溶于20ml含有8M脲的结合缓冲液中，或直接将8M脲加到可溶上清液中。将带有His标记残基的重组融合蛋白与Ni-NTA琼脂糖树脂(每500ml诱导物使用5ml树脂)批量结合，方法是将其于室温下摇动1小时并将混合物流经一个层析柱。使流出物再流经相同的柱两次，再用同样含有8M脲的清洗缓冲液(0.1M磷酸钠和10mM Tris-HCl，pH6.3)将柱清洗3次，每次30ml。用30ml溶有150mM咪唑的清洗缓冲液洗脱结合的蛋白，并按每组份5ml进行收集。将含有各重组融合蛋白的组份汇集，并对10mM Tris-HCl(pH8.0)透析，再次与Ni-NTA填料结合，洗脱，并对10mM Tris-HCl(pH7.8)透析。重组蛋白的产量为每升诱导的细菌培养物25-150mg不等，蛋白的纯度在98％以上。利用Limulus测定法(BioWhittaker)测定重组蛋白的内毒素污染，结果显示其含量小于10E.U.Img。
6.1.2. T细胞增殖测定
测定纯化的融合多肽在周围血单核细胞(PBMC)制品中诱导T细胞增殖的能力。已知PBMCs的供体在PPD皮肤试验中显示阳性，并且其T细胞在对PPD的应答中显示出增殖，结核杆菌的粗制可溶蛋白则培养在补加有10％收集的人血清和50μg/ml庆大霉素的RPMI1640中。加入0.5-10μg/ml浓度的纯化蛋白，一式两份。在200μl体积的圆底96孔板中培养6天，然后从每个孔中吸出50μl，用于按下文第6.1.3节测定IFN-γ的水平。然后再用1μCi/孔的氚化胸腺嘧啶核苷将板脉冲标记18小时，收集，并利用气体闪烁计数仪测定吸收的氚。在两份测试中均使增殖比仅在培养基中培养的细胞所观测到的增殖高3倍以上的组份被认为是阳性。
6.1.3.干扰素-γ 测定
在无菌条件下取小鼠脾脏，使红细胞裂解后制备出悬浮于完全RPMI的单细胞悬浮液。在96孔平底微量滴定板中每孔加100μl细胞(2×105细胞)。培养物用标记的重组蛋白刺激24小时，测定上清中的IFN-γ。
利用PharMingen的配对抗体及方法通过夹层ELISA法分析上清液中的IFN-γ水平。利用重组小鼠细胞因子绘制标准曲线。用50μl/孔(以1μg/ml浓度溶于0.1M碳酸氢钠包被缓冲液)的细胞因子捕获mAb(大鼠抗小鼠IFN-γ(PharMingen；目录号18181D))包被ELISA板(Corning)，并在室温下保温4小时。倒出板中的液体，并在4℃下用PBS-0.05％吐温、1.0％BSA(200μl/孔)阻断过夜，再用PBS-0.1％吐温清洗6次。然后加入稀释于PBS-0.05％吐温、0.1％BSA的标准样品(小鼠IFN-γ)和上清液样品，室温下放置2小时。按上文所述清洗板，然后加入100μl/孔以0.5μg/ml浓度稀释于PBS-0.05％吐温、0.1％BSA的二抗(生物素大鼠α小鼠IFN-γ(目录号18112D；PharMingen))，室温下保温2小时。清洗板，然后加入100μl/孔以1∶2500稀释度稀释于PBS-0.05％吐温、0.1％BSA的抗生蛋白链菌素-HRP(Zymed)，室温下保温1小时。最后一次清洗板，然后用100μl/孔的TMB底物(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，Kirkegaard and Perry，Gaithersburg，MD)显色，并在显出颜色后用50μl/孔的H2SO4终止反应。以570nm为参比波长在450nm下测量吸光度(OD)，并利用标准曲线计算细胞因子的浓度。
6.2. 结果
6.2.1. 三体融合蛋白诱导的免疫应答
将三种结核杆菌抗原的编码序列插入表达载体中产生一种融合蛋白。将表示为Ra12、TbH9和Ra35的抗原以一种重组融合蛋白形式产生(图1A和1B)。抗原Erd14、DPV和MTI以第二种融合蛋白形式产生(图2)。将这两种融合蛋白亲和纯化，并用于体外及体内测定。
测试这两种融合蛋白对6个PPD+受试者的T细胞应答的刺激能力。在T细胞增殖测定中，这两种融合蛋白均显示出与其单一组分相类似的反应性模式(图14A-14F)。对IFN-γ产生的测定也获得了类似的结果(图15A-15F)。例如，受试者D160单一的TbH9和MTI抗原均产生应答。该受试者也对含有这些抗原的融合蛋白产生应答(图14B和15B)。相比之下，未观测到D160对其它单一抗原产生T细胞应答。另一受试者D201不对单一的Erd14、DPV和MTI抗原起反应，同时也不对含有这些抗原的融合蛋白起反应。应注意到的是，T细胞对融合蛋白的各单一组分的应答并不是特别强，而在大多数情况下，由融合蛋白刺激的应答要等于或高于由单一抗原诱导的应答。
另外也将Ra12-TbH9-Ra35三体融合蛋白作为免疫原进行了体内测试。在这些实验中是将融合蛋白注射到小鼠脚垫中来进行免疫。以三只小鼠为一组，每组注射与不同佐剂混合的蛋白：SBAS1c、SBAS2(Ling et al.，1997，Vaccine 15：1562-1567)、SBAS 7和AL(OH)3。每隔3周进行一次皮下免疫，如此进行2次，然后于1周后处死小鼠，并收集引流淋巴节，以作为应答细胞在T细胞增殖和细胞因子产生测定中使用。
无论在免疫中使用哪种佐剂，将TbH9作为单一抗原使用时均可诱导出对TbH9的强T细胞增殖应答(图16A)。诱导的对Ra35和Ra12的应答则较弱(图16B和16C)。当把Ra12-TbH9-Ra35融合蛋白作为免疫原使用时，则观测到与其单一组分所诱导的应答相类似的应答。
在细胞因子产生测定中，使用SBAS1c和SBAS2佐剂的样品产生了相似的IFN-γ(图17)和IL-4应答(图18)。而联合使用SBAS7和氢氧化铝的样品却产生了所有三种抗原中最强IFN-γ应答和最低的IL-4产生水平。对体内的体液抗体应答而言，图19A-19F表明融合蛋白与三种佐剂中的如何一种共同使用均可诱导出IgG1及IgG2a抗原特异性应答。
此外，还利用各含有Ra12-TbH9-Ra35(Mtb32A)或Erd14-DPV-MTI(Mtb39A)编码序列的两种表达构建体的联合物作为DNA疫苗对C57BL/6小鼠进行了免疫。免疫动物在随后的以活细菌喷雾剂进行诱发实验中表现出明显的防结核病能力。根据这些结果，还制备了含有Mtb32A和Mtb39A编码序列的融合构建体，并在豚鼠的长期保护模型中测试了其编码产物。这些研究是在含有一种佐剂的制剂中使用单一重组融合蛋白或Mtb32A蛋白与Mtb3A蛋白的混合物对豚鼠进行免疫。图20A-20C表明，利用与SBAS1c或SBAS2混合的融合蛋白免疫的小鼠与利用相同佐剂及两种抗原的混合物免疫的动物相比可在随后的诱发实验中显示出更好的防结核病发生能力。与SBAS2制剂混合的融合蛋白为动物提供了最强的保护。因此，各种结核杆菌抗原的融合蛋白可作为比其单一组分的混合物更有效的免疫原在疫苗制剂中使用。
6.2.2. 二体融合蛋白诱导的免疫应答
利用重组方法产生含有TbH9和Tb38-1抗原并且无连接序列的二体融合蛋白。测定TbH9-Tb38-1融合蛋白诱导T细胞增殖及IFN-γ产生的能力。所使用的PBMC来自三个供体：一个供体此前已显示出可对TbH9应答但不对Tb38-1应答(供体131)；一个供体已显示出可对Tb38-1应答但不对TbH9应答(供体184)；一个供体已显示出对两种抗原均可应答(供体201)。这些研究的结果可表明融合蛋白中两种抗原的功能活性(图21A和21B，22A和22B，及23A和23B)。
6.2.3. 结核病患者的血清与四体融合蛋白的反应
利用重组方法产生含有TbRa3、38KD抗原、Tb38-1和DPEP的融合蛋白。通过ELISA检测该表示为TbF-2的四体融合蛋白与结核杆菌感染患者的血清的反应性。这些研究的结果(表1)说明，所有四种抗原可在该融合蛋白中独立发挥功能。
该领域的技术人员都将认可，单一抗原在各融合蛋白内的顺序可有所改变，并且若每种抗原决定簇仍能够具有功能，则也可获得类似的活性。此外，含有活性抗原决定簇的截尾形式的蛋白也可在融合蛋白的构建中使用。
本发明并不局限于实例性实施方案的范围内，这些实施方案只作为本发明的个别方面的例证，而任何在功能上等价的克隆、核苷酸序列或氨基酸序列均处在本发明的范围之内。事实上，根据上文的描述以及附图，除文中所述之外的其它多种变化形式对该领域的技术人员而言均是显而易见的。附加权利要求将会把这些变化形式均包括在内。还应了解的是，所有核苷酸的碱基数都是近似值，并且使用这些数字的目的是为了进行描述。
文中引用的所有出版物均被全面包含在内以作为参考。
                        表1
TBF-2融合蛋白与TB血清和正常血清的反应性
血清编号 状态 TbFOD450 状态 TbF-2OD450 状态 ELISA反应
38kD TbRa3 Tb38-1 DPEP
B931-40  TB  0.57 + 0.321 + - + - +
B931-41  TB  0.601 + 0.396 + + + + -
B931-109  TB  0.494 + 0.404 + + + ±± -
B931-132  TB  1.502 + 1.292 + + + + ±±
5004  TB  1.806 + 1.666 + ±± ±± + -
15004  TB  2.862 + 2.468 + + + + -
39004  TB  2.443 + 1.722 + + + + -
68004  TB  2.871 + 2.575 + + + + -
99004  TB  0.691 + 0.971 + - ±± + -
107004  TB  0.875 + 0.732 + - ±± + -
92004  TB  1.632 + 1.394 + + ±± ±± -
  97004   TB   1.491   +   1.979   +   + ±±   -   +
  118004   TB   3.182   +   3.045   +   + ±±   -   -
  173004   TB   3.644   +   3.578   +   + +   +   -
  175004   TB   3.332   +   2.916   +   + +   -   -
  274004   TB   3.696   +   3.716   +   - +   -   +
  276004   TB   3.243   +   2.56   +   - -   +   -
  282004   TB   1.249   +   1.234   +   + -   -   -
  289004   TB   1.373   +   1.17   +   - +   -   -
  308004   TB   3.708   +   3.355   +   - -   +   -
  314004   TB   1.663   +   1.399   +   - -   +   -
  317004   TB   1.163   +   0.92   +   + -   -   -
  312004   TB   1.709   +   1.453   +   - +   -   -
  380004   TB   0.238   -   0.461   +   - ±±   -   +
  451004   TB   0.18   -   0.2   -   - -   -   ±±
  478004   TB   0.188   -   0.469   +   - -   -   ±±
  410004   TB   0.384   +   2.392   +   ±± -   -   +
  411004   TB   0.306   +   0.874   +   - +   -   +
  421004   TB   0.357   +   1.456   +   - +   -   +
  528004   TB   0.047   -   0.196   -   - -   -   +
  A6-87   正常   0.094   -   0.063   -   - -   -   -
  A6-88   正常   0.214   -   0.19   -   - -   -   -
  A6-89   正常   0.248   -   0.125   -   - -   -   -
  A6-90   正常   0.179   -   0.206   -   - -   -   -
  A6-91   正常   0.135   -   0.151   -   - -   -   -
  A6-92   正常   0.064   -   0.097   -   - -   -   -
  A6-93   正常   0.072   -   0.098   -   - -   -   -
  A6-94   正常   0.072   -   0.064   -   - -   -   -
  A6-95   正常   0.125   -   0.159   -   - -   -   -
  A6-96   正常   0.121   -   0.12   -   - -   -   -
  截止值   0.284   0.266

Claims (21)

1.一种纯化的多肽，该多肽由选自SEQ ID NOS：4、12、14、16、18、20、22和24的氨基酸序列组成，所述氨基酸序列可以任选包含一个或多个保守氨基酸替代。
2.权利要求1的多肽，该多肽为一种可溶性多肽。
3.权利要求1的多肽，该多肽是经重组DNA方法产生。
4.权利要求1的多肽，该多肽是经化学合成方法产生。
5.权利要求1的多肽，该多肽可诱导一种抗体应答。
6.权利要求1的多肽，该多肽可诱导一种T细胞应答。
7.权利要求1的多肽，该多肽可与异源的第二多肽融合。
8.一种药用组合物，该组合物含有权利要求1的多肽。
9.一种药用组合物，该组合物含有编码权利要求1的多肽的多核苷酸。
10.权利要求8的药用组合物，进一步包含一种佐剂。
11.权利要求10的药用组合物，其中该佐剂包含至少一种选自3D-MPL和QS21的成分。
12.权利要求11的组合物，其中该组合物在水包油乳剂中配制。
13.一种纯化的多肽，该多肽由SEQ ID NO：24的氨基酸序列组成，所述氨基酸序列可以任选包含一个或多个保守氨基酸替代。
14.一种药用组合物，该组合物含有权利要求13的多肽。
15.权利要求14的药用组合物，进一步包含一种佐剂。
16.权利要求15的药用组合物，其中该佐剂包含至少一种选自3D-MPL和QS21的成分。
17.权利要求16的组合物，其中该组合物在水包油乳剂中配制。
18.一种纯化的多核苷酸，该多核苷酸由选自SEQ ID NOS：3、11、13、15、17、19、21和23的核苷酸序列组成，所述核苷酸序列可以任选编码一个或多个保守氨基酸替代。
19.一种纯化的多核苷酸，该多核苷酸由SEQ ID NO：23的核苷酸序列组成，所述核苷酸序列可以任选编码一个或多个保守氨基酸替代。
20.由选自SEQ ID NOS：4、12、14、16、18、20、22和24的氨基酸序列组成的纯化融合蛋白在制备用于预防或治疗结核病的药物中的用途。
21.编码由选自SEQ ID NOS：4、12、14、16、18、20、22和24的氨基酸序列组成的融合蛋白的纯化多核苷酸在制备用于预防或治疗结核病的药物中的用途。
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US09/223040 1998-12-30
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TR (1) TR200002938T2 (zh)
WO (1) WO1999051748A2 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100415771C (zh) * 2006-06-06 2008-09-03 中国人民解放军第二军医大学 激发人体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位及其用途
CN101311189B (zh) * 2006-06-06 2010-09-08 中国人民解放军第二军医大学 激发人体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位及其用途
CN101298471B (zh) * 2006-06-06 2011-01-19 中国人民解放军第二军医大学 激发人体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位及其用途
CN101311190B (zh) * 2006-06-06 2011-08-03 中国人民解放军第二军医大学 激发人体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位及其用途
CN102154324A (zh) * 2010-12-29 2011-08-17 兰州大学 结核分枝杆菌融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的构建、表达和纯化方法及其应用

Families Citing this family (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6592877B1 (en) * 1995-09-01 2003-07-15 Corixa Corporation Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis
US6290969B1 (en) * 1995-09-01 2001-09-18 Corixa Corporation Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis
US6458366B1 (en) 1995-09-01 2002-10-01 Corixa Corporation Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis
CN1163602C (zh) 1998-04-07 2004-08-25 科里克萨公司 结核杆菌抗原融合蛋白及其应用
DE69941545D1 (de) 1998-11-04 2009-11-26 Isis Innovation Tuberkulose diagnose test
US20020061848A1 (en) 2000-07-20 2002-05-23 Ajay Bhatia Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
US6555115B1 (en) 1998-12-08 2003-04-29 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
US6448234B1 (en) 1998-12-08 2002-09-10 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
US6565856B1 (en) 1998-12-08 2003-05-20 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
US6432916B1 (en) 1998-12-08 2002-08-13 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
US6447779B1 (en) 1998-12-08 2002-09-10 Corixa Corporation Compounds for the diagnosis of Chlamydial infection
US20030027774A1 (en) * 1999-03-18 2003-02-06 Ronald C. Hendrickson Tuberculosis antigens and methods of use therefor
US8143386B2 (en) * 1999-04-07 2012-03-27 Corixa Corporation Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses
US7009042B1 (en) 1999-10-07 2006-03-07 Corixa Corporation Methods of using a Mycobacterium tuberculosis coding sequence to facilitate stable and high yield expression of the heterologous proteins
ATE354663T1 (de) * 1999-10-07 2007-03-15 Corixa Corp Eine mycobacterium tuberculosis kodierende sequenz zur expression von heterologen proteinen
WO2001024820A1 (en) 1999-10-07 2001-04-12 Corixa Corporation Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis
US6316205B1 (en) 2000-01-28 2001-11-13 Genelabs Diagnostics Pte Ltd. Assay devices and methods of analyte detection
AU2001241738A1 (en) * 2000-02-25 2001-09-03 Corixa Corporation Compounds and methods for diagnosis and immunotherapy of tuberculosis
GB0006692D0 (en) * 2000-03-20 2000-05-10 Glaxo Group Ltd Epitopes
US6919187B2 (en) 2000-04-21 2005-07-19 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
DE60133190T2 (de) 2000-04-21 2009-04-02 CORIXA CORP., Wilmington Verbindungen und verfahren zur behandlung und diagnose von chlamydia-infektionen
SI1542732T1 (sl) * 2000-06-20 2010-01-29 Corixa Corp Csc The United Sta Fuzijski proteini Mycobacterium tuberculosis
GB0109297D0 (en) 2001-04-12 2001-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
US6841159B2 (en) 2002-01-30 2005-01-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Rapid lateral flow assay for determining exposure to Mycobacterium tuberculosis and other mycobacteria
US7026465B2 (en) 2002-02-15 2006-04-11 Corixa Corporation Fusion proteins of Mycobacterium tuberculosis
GB0321615D0 (en) 2003-09-15 2003-10-15 Glaxo Group Ltd Improvements in vaccination
WO2005061534A2 (en) * 2003-12-23 2005-07-07 Statens Serum Institut Improved tuberculosis vaccines
US8475735B2 (en) 2004-11-01 2013-07-02 Uma Mahesh Babu Disposable immunodiagnostic test system
SG159555A1 (en) 2004-11-16 2010-03-30 Crucell Holland Bv Multivalent vaccines comprising recombinant viral vectors
CN100368437C (zh) * 2005-01-28 2008-02-13 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一种诊断牛结核病的重组抗原蛋白及其制备方法
ATE543832T1 (de) 2005-04-29 2012-02-15 Glaxosmithkline Biolog Sa Verfahren zur vorbeugung oder behandlung einer m.-tuberculosis-infektion
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
CN100999550B (zh) * 2006-01-10 2010-10-06 中国人民解放军第三○九医院 结核分枝杆菌融合蛋白及其应用
AU2007264205B2 (en) * 2006-06-28 2013-04-18 Statens Serum Institut Expanding the T cell repertoire to include subdominant epitopes by vaccination with antigens delivered as protein fragments or peptide cocktails
US20090181078A1 (en) 2006-09-26 2009-07-16 Infectious Disease Research Institute Vaccine composition containing synthetic adjuvant
TR201807756T4 (tr) 2006-09-26 2018-06-21 Infectious Disease Res Inst Sentetik adjuvan içeren aşı bileşimi.
PT2086582E (pt) 2006-10-12 2013-01-25 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacina compreendendo uma emulsão adjuvante óleo em água
SI2086582T1 (sl) 2006-10-12 2013-02-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Cepivo, ki obsega emulzijo olja v vodi kot adjuvans
US9717788B2 (en) 2007-03-02 2017-08-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Method of inducing an immune response against HIV employing HIV immunogens, adenoviral vectors encoding said immunogens, and adjuvant
MX2009009342A (es) 2007-03-02 2009-09-11 Glaxosmithkline Biolog Sa Metodo novedoso y composiciones.
US8486414B2 (en) 2007-04-04 2013-07-16 Infectious Disease Research Institute Immunogenic compositions comprising Mycobacterium tuberculosis polypeptides and fusions thereof
RU2489165C2 (ru) * 2007-10-13 2013-08-10 Корнел Унивесити ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ СТИМУЛИРОВАНИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА К Мусоbacterium avium ПОДВИДА Paratuberculosis
KR101378240B1 (ko) 2008-02-22 2014-03-28 포항공과대학교 산학협력단 결핵 예방용 조성물
PT2315773T (pt) * 2008-07-25 2016-11-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Polipéptidos, polinucleótidos e composições para utilização no tratamento de tuberculose latente
HUE039159T2 (hu) 2008-07-25 2018-12-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Tuberkulózis Rv2386c protein, ezt tartalmazó készítmények és ezek alkalmazása
KR20110060891A (ko) 2008-07-25 2011-06-08 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 신규한 조성물 및 방법
GB0815872D0 (en) 2008-09-01 2008-10-08 Pasteur Institut Novel method and compositions
CN103415534A (zh) * 2009-03-10 2013-11-27 贝勒研究院 靶向抗原呈递细胞的癌症疫苗
EP2406286B1 (en) 2009-03-10 2016-05-18 Baylor Research Institute Anti-cd40 antibodies and uses thereof
BRPI1009458A2 (pt) * 2009-03-10 2016-03-01 Baylor Res Inst vacinas antivirais direcionadas às células de apresentação de antígeno
EP2437753B1 (en) 2009-06-05 2016-08-31 Infectious Disease Research Institute Synthetic glucopyranosyl lipid adjuvants and vaccine compositions containing them
KR20120129927A (ko) 2010-01-27 2012-11-28 글락소 그룹 리미티드 변형된 투베르쿨로시스 항원
ES2651005T3 (es) 2010-03-09 2018-01-23 Biomedical Research Models, Inc. Una nueva estrategia de vacunación mucosa para el virus del herpes simple tipo-2
EP3593813A1 (en) 2010-12-14 2020-01-15 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Mycobacterium antigenic composition
GB201022007D0 (en) 2010-12-24 2011-02-02 Imp Innovations Ltd DNA-sensor
AR085573A1 (es) 2011-03-25 2013-10-09 Baylor Res Inst Composiciones y metodos de inmunizacion contra el virus de la hepatitis c
AU2012243039B2 (en) 2011-04-08 2017-07-13 Immune Design Corp. Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses
US20120288515A1 (en) 2011-04-27 2012-11-15 Immune Design Corp. Synthetic long peptide (slp)-based vaccines
CN102305855A (zh) * 2011-05-19 2012-01-04 中山大学 体外检测结核分枝杆菌感染的试剂和方法
WO2013063059A1 (en) * 2011-10-24 2013-05-02 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Plastid-expressed mycobacterium tuberculosis vaccine antigens esat-6 and mtb72f fused to cholera toxin b subunit
CN104363892A (zh) 2012-02-07 2015-02-18 传染性疾病研究院 包含tlr4激动剂的改进佐剂制剂及其使用方法
MX347154B (es) 2012-02-24 2017-02-21 Centro De Investigación Científica Y De Educación Superior De Ensenada Baja California (Cicese) Prueba de diagnóstico para enfermedades infecciosas en ganado bovino.
RS57420B1 (sr) 2012-05-16 2018-09-28 Immune Design Corp Vakcine za hsv-2
CN102757971B (zh) * 2012-08-07 2013-09-11 中国人民解放军第三O九医院 一种结核分枝杆菌重组蛋白质及其制备方法
IN2015DN03962A (zh) * 2012-10-23 2015-10-02 Statens Seruminstitut
AU2014203873A1 (en) 2013-01-07 2015-07-30 Biomedical Research Models, Inc. Therapeutic vaccines for treating herpes simplex virus type 2 infections
JP2016516075A (ja) * 2013-03-15 2016-06-02 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 結核の予防または治療用の合成免疫原
CA2909221A1 (en) 2013-04-18 2014-10-23 Immune Design Corp. Gla monotherapy for use in cancer treatment
US9463198B2 (en) 2013-06-04 2016-10-11 Infectious Disease Research Institute Compositions and methods for reducing or preventing metastasis
US11801223B2 (en) 2013-12-31 2023-10-31 Access To Advanced Health Institute Single vial vaccine formulations
CA2936833A1 (en) 2014-01-13 2015-07-16 Baylor Research Institute Novel vaccines against hpv and hpv-related diseases
US20190062400A1 (en) * 2016-03-02 2019-02-28 Cue Biopharma, Inc. T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof
WO2017176076A1 (en) 2016-04-06 2017-10-12 Ewha University - Industry Collaboration Foundation A peptide with ability to penetrate cell membrane
CN109562057A (zh) 2016-05-16 2019-04-02 传染病研究所 聚乙二醇化脂质体和使用方法
IL314130A (en) 2016-05-16 2024-09-01 Access To Advanced Health Inst Formulation containing a TLR agonist and methods of use
BR112018074352B1 (pt) 2016-06-01 2021-11-30 Infectious Disease Research Institute Partículas de nanoalume contendo um agente de dimensionamento
KR102673794B1 (ko) 2017-06-15 2024-06-11 액세스 투 어드밴스드 헬스 인스티튜트 나노구조 지질 담체 및 안정적인 에멀션 그리고 이들의 용도
CN111315406A (zh) 2017-09-08 2020-06-19 传染病研究所 包括皂苷的脂质体调配物及其使用方法
US10610585B2 (en) 2017-09-26 2020-04-07 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and compositions for treating and preventing HIV
CN109825497A (zh) * 2019-01-25 2019-05-31 石河子大学 一种新型结核杆菌融合菌株的制备方法及其应用
CN114340665A (zh) 2019-05-25 2022-04-12 传染病研究所 用于对佐剂疫苗乳剂进行喷雾干燥的组合物和方法
WO2024052882A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Access To Advanced Health Institute Immunogenic vaccine composition incorporating a saponin

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
US6024983A (en) 1986-10-24 2000-02-15 Southern Research Institute Composition for delivering bioactive agents for immune response and its preparation
US4897268A (en) 1987-08-03 1990-01-30 Southern Research Institute Drug delivery system and method of making the same
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
AU5741590A (en) 1989-05-04 1990-11-29 Southern Research Institute Improved encapsulation process and products therefrom
AU660629B2 (en) 1990-10-01 1995-07-06 University Of Connecticut, The Targeting viruses and cells for selective internalization by cells
DE69231736T2 (de) 1991-05-14 2001-10-25 The Immune Response Corp., Carlsbad Gerichtete abgabe von genen, die immunogene proteine kodieren
CA2103371C (en) 1991-06-05 2003-09-16 George Y. Wu Targeted delivery of genes encoding secretory proteins
ES2140400T3 (es) * 1991-08-15 2000-03-01 Hoffmann La Roche Cebadores y sondas del micobacterium.
WO1993014188A1 (en) 1992-01-17 1993-07-22 The Regents Of The University Of Michigan Targeted virus
EP0633943A4 (en) 1992-04-03 1997-05-02 Alexander T Young GENTHERAPY USING TARGETED VIRAL VECTORS.
ES2143716T3 (es) 1992-06-25 2000-05-16 Smithkline Beecham Biolog Composicion de vacuna que contiene adyuvantes.
US5330754A (en) * 1992-06-29 1994-07-19 Archana Kapoor Membrane-associated immunogens of mycobacteria
US5359681A (en) 1993-01-11 1994-10-25 University Of Washington Fiber optic sensor and methods and apparatus relating thereto
US5955077A (en) 1993-07-02 1999-09-21 Statens Seruminstitut Tuberculosis vaccine
DK79793D0 (da) * 1993-07-02 1993-07-02 Statens Seruminstitut Diagnostic test
DK79893D0 (da) * 1993-07-02 1993-07-02 Statens Seruminstitut New vaccine
US5679647A (en) 1993-08-26 1997-10-21 The Regents Of The University Of California Methods and devices for immunizing a host against tumor-associated antigens through administration of naked polynucleotides which encode tumor-associated antigenic peptides
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
DE69637879D1 (de) * 1995-09-01 2009-04-30 Corixa Corp Verbindungen und Verfahren zur Immuntherapie und Diagnose von Tuberkulose
WO1997009429A2 (en) * 1995-09-01 1997-03-13 Corixa Corporation Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis
US6544522B1 (en) * 1998-12-30 2003-04-08 Corixa Corporation Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses
US6627198B2 (en) * 1997-03-13 2003-09-30 Corixa Corporation Fusion proteins of Mycobacterium tuberculosis antigens and their uses
CN1163602C (zh) 1998-04-07 2004-08-25 科里克萨公司 结核杆菌抗原融合蛋白及其应用

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100415771C (zh) * 2006-06-06 2008-09-03 中国人民解放军第二军医大学 激发人体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位及其用途
CN101311189B (zh) * 2006-06-06 2010-09-08 中国人民解放军第二军医大学 激发人体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位及其用途
CN101298471B (zh) * 2006-06-06 2011-01-19 中国人民解放军第二军医大学 激发人体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位及其用途
CN101311190B (zh) * 2006-06-06 2011-08-03 中国人民解放军第二军医大学 激发人体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位及其用途
CN102154324A (zh) * 2010-12-29 2011-08-17 兰州大学 结核分枝杆菌融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的构建、表达和纯化方法及其应用
CN102154324B (zh) * 2010-12-29 2012-11-28 兰州大学 结核分枝杆菌融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的构建、表达和纯化方法及其应用

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