NO332500B1 - Immunogene polypeptider, polynukleotider som koder for disse, farmasoytisk sammensetning, ekspresjonsvektor, vertscelle, vaksinesammensetning, anvendelse og fremgangsmate for fremstilling av polypeptidet - Google Patents

Abstract

Den foreliggende oppfinnelse vedrører fusjonsproteiner som inneholder to Mycobacterium tuberkulose antigener. Spesielt, vedrører den bi-rusjonsproteiner som inneholder to individuelle M. tuberkulose antigener, tri-fusjonsproteiner som inneholder tre M. tuberkulose antigener, tetra- fusjonsproteiner som inneholder fire M. tuberkulose antigener, og penta-fusjonsproteiner som inneholder fem M. tuberkulose antigener, og metoder for deres anvendelse i diagnose, behandling og forebygging av tuberkulose- infeksjon.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører immunogent polypeptid som inneholder minst mykobacterium tuberkuloseantigener, polynukleotid som koder for polypeptidene, farmasøytisk sammensetning som omfatter polypeptidene eller polynukleotidene. Videre omfatter oppfinnelsen ekspresjonsvektor som omfatter nevnte polynukleotider, isolert vertcelle, samt en vaksinesammensetning og anvendelse av polypeptidene for fremstilling av et medikament for behandling eller forebygging av M. tuberculosis infeksjon og en fremgangsmåte for å fremstille polypeptidene.

Tuberkulose er en kronisk infeksiøs sykdom forårsaket av infeksjon med M. tuberculosis. Den er en utbredt sykdom i utviklingsland, så vel som et økende problem i utviklede områder i verden, med omtrent 8 millioner nye tilfeller og 3 millioner dødsfall hvert år. Skjønt infeksjonen kan være asymptomatisk i en lengre tidsperiode, blir sykdommen vanligvis manifestert som en akutt inflammasjon i lungene, som resulterer i feber og ikke produktiv hoste. Hvis ubehandlet, er resultatet alvorlig komplikasjoner og død.

Skjønt tuberkulose kan generelt kontrolleres ved å bruke utstrakt antibiotikaterapi, er slik behandling ikke tilstrekkelig for å hindre spredning av sykdommen. Infiserte individer kan være asymptomatisk, men smittsomme i en tidsperiode. I tillegg, skjønt overholdelse av behandlingsregimet er kritisk, er pasient oppførsel vanskelig å måle. Noen pasienter fullfører ikke behandlingen, som kan føre til ineffektiv behandling og utvikling av medikamentresistens.

For å kontrollere spredning av tuberkulose, er effektiv vaksinering og nøyaktig tidlig diagnose av sykdommen svært viktig. For tiden, er vaksinering med levende vaksine den mest effektive metoden for å indusere beskyttende immunitet. Den mest vanlige mycobakterien som anvendes for dette formålet er Bacillus Calmette-Guerin (BCG), og avirulent stamme av M. bovis. Imidlertid, er sikkerheten og effektiviteten til BCG kontroversielt og i noen land, som USA vaksineres ikke befolkningen med dette midlet.

Diagnose for tuberkulose oppnås vanligvis ved å bruke en hudtest, som involverer intradermal eksponering til tuberkulin PPD (proteinrenset derivat). Antigen-spesifikk T-celleresponer resulterer i målbar hevelse på injeksjonstedet ved 48-72 timer etter injeksjon, som indikerer eksponering til myobakterielle antigener. Sensitivitet og spesifisitet har, imidlertid, vært et problem med denne testen, og individer vaksinert med BCG kan ikke skjelnes fra infiserte individer.

WO 9709428 A2 beskriver metoder og forbindelser for immunterapi og diagnostikk w turbekulose. Forbindelsene inkluderer polypeptider som inneholder minst en immunogen del av et M. tuberculosis antigen som omfatter en eller flere aminosyresekvenser kodet for av DNA sekvensene med SEQ ID NO: 26-51 eller den komplementære tråden av disse DNA sekvensene.

Mens makrofager har blitt vist å virke som den prinsipielle effektoren til M. tuberculosis immunitet, er T-cellene de dominerende for å indusere slik immunitet. Den essensielle rollen til T-celler i beskyttelse mot M. tuberculosis infeksjon er vist av den hyppige forekomsten av M. tuberculosis i "Acquired Immunodeficiency Syndrome" pasienter som skyldes nedgang av CD4<+>T-celler assosiert med human immunosvikt-virus (HIV) infeksjon. Mycobakterium-reaktive CD4<+>T-celler har blitt vist å være potente produsenter av gamma-interferon (IFN-y) som igjen, har blitt vist å trigge anti-mycobakterielle effekter av makrofager i mus. Mens rollen til IFN-y i mennesker er mindre klar, har studier vist at 1,25-dihydroksy-vitamin D3, enten alene eller i kombinasjon med IFN-y eller tumornekrosefaktor-alfa, aktivere humane makrofager for å inhibere M. tuberculosis infeksjon. Dessuten, er det kjent at IFN-y stimulerer humane makrofager til å fremstille 1,25-dihydroksy-vitamen D3. På samme måte, har interleukin-12 (IL-12) blitt vist å spille en rolle i å stimulere resistens mot M. tuberculosisinféksjon. For en oversikt over immunologien til M. tuberculosisinféksjon, se Chan and Kaufmann, 1994, Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control, Blomm (utg.), ASM Press, Washington, DC.

Følgelig, er det et behov for forbedrede vaksiner og forbedrede metoder for å diagnostisere, forebygge og behandle tuberkulose.

Foreliggende oppfinnelse omfatter Immunogent polypeptid, kjennetegnet ved at det omfatter: (i) aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, eller en variant av nevnte aminosyresekvens inneholdende én eller flere aminosyredelesjoner, addisjoner eller substitusjoner og som har samme biologiske effekt; (ii) aminosyresekvensen til restene 2-596 ifølge SEQ ID NO: 24, eller en variant av nevnte aminosyresekvens inneholdende én eller flere aminosyredelesjoner, addisjoner eller substitusjoner og som har samme biologiske effekt. (iii) aminosyresekvens kodet for av et polynukleotid som omfatter en første

nukleotidsekvens som hybridiserer under moderate stringente betingelser med en andre nukleotidsekvens som er komplementær med en tredje nukleotidsekvens som koder for aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, der nevnte første nukleotidsekvens koder for et polypeptid som bibeholder immunogenisiteten til aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, eller

iv) aminosyresekvens kodet for av et polynukleotid som omfatter en første nukleotidsekvens som hybridiserer under moderate stringente betingelser med en andre nukleotidsekvens som er komplementær med en tredje nukleotidsekvens som koder for aminosyresekvensrestene 2-596 ifølge SEQ ID NO: 24, der nevnte første nukleotidsekvens koder for et polypeptid som bibeholder immunogenisiteten til aminosyresekvensen til restene 2-596 ifølge SEQ ID NO: 24.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også polynukleotid, kjennetegnet ved at det omfatter en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid i følge et hvert av kravene 1 til 12.

Omfattet av oppfinnelsen er også farmasøytisk sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter:

(i) polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 12 eller 23 eller

(ii) polynukleotid ifølge et hvilket som helst av kravene 13 til 22.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelsen ekspresjonsvektor, kjennetegnet ved at den omfatter et polynukleotid ifølge et hvilket som helst av kravene 13 til 22.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også vaksinesammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter: (i) polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 12 eller 23 og en adjuvant eller,

(ii) polynukleotid ifølge et hvilket som helst av kravene 13 til 22.

Omfattet av foreliggende oppfinnelse er anvendelse av et polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 12 eller 23 for fremstilling av et medikament til behandling eller forebygging av M. tuberculosis-infeksjon.

Foreliggende oppfinnelse omfatter fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 12 eller 23, kjennetegnet ved at det omfatter rekombinant ekspresjon av et polynukleotid ifølge et hvilket som helst av kravene 13 til 22.

Omfattet av oppfinnelsen er også isolert vertscelle, kjennetegnet ved at den rekombinant uttrykker et polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 12 eller 23.

Foreliggende oppfinnelse vedrører fusjonsproteiner fra M. tuberculosisantigener. Spesielt, vedrører den fusjonspolypeptider som inneholder to eller flere M. tuberculosisantigener, polynukleotider som koder for slike polypeptider og fremgangsmåter for å fremstille polypeptider. Foreliggende oppfinnelse kan også anvendes i behandling og forebygging av M. tuberculosisinfeksjon.

Foreliggende oppfinnelse er basert, delvis, på oppfinnernes oppdagelse at polynukleotider som inneholder to til fem M. tuberculosis kodene sekvenser produserer rekombinante fusjonsproteiner som bibeholder immunogeniteten og antigeniteten fra deres individuelle komponenter. Fusjonsproteinene beskrevet heri induserte både T celler og B celleresponser, målt ved T celleproliferering, cytokinproduksjon og antistoff-produksjon. Dessuten, ble fusjonsprotein brukt som et immunogen med adjuvanter in vivo for å fremkalle både celle-formidlet og humoral immunitet mot M. tuberculosis. I tillegg, ble et fusjonsprotein fremstilt av en fusjonskonstruksjon og brukt i en vaksineformulering med en adjuvant for å oppnå en langtidsbeskyttelse i dyrene mot utvikling av tuberkulose. Fusjonsproteinet var et mer effektivt immunogen enn en blanding av dets individuelle proteinkomponenter.

I en spesifikk utførelsesform av oppfinnelsen, kan det isolerte eller isolerte M.føéercw/asispolypeptidene fra oppfinnelsen formuleres som farmasøytiske sammensetninger for administrering til et individ for å hindre og/eller behandle M.føfercw/øsisinfeksjon. Immunogeniteten av fusjonsproteinet kan økes ved å inkludere en adjuvant.

Isolerte eller rensede polynukleotider kan brukes for å produsere rekombinant fusjonspolypeptidantigener in vitro. Alternativt, kan polynukleotidene bli administrert direkte inn i et individ som DNA vaksiner for å forårsake antigenekspresjon i individer, og deretter induksjon av en anti-M tuberculosisAmmuniespons.

Oppfinnelsen kan også anvendes i in vitro analyse for å detektere humorale antistoffer eller cellemediert immunitet mot M. tuberculosis for diagnose av infeksjon eller å måle sykdomsprogresjon. I tillegg, kan polypeptidene bli brukt som et in vivo diagnostisk middel i form av en intradermal hudtest. Alternativt, kan polypeptidene brukes som immunogener for å danne anti-M. tuberculosisanti- sto& er i et ikke humant dyr. Antistoffene kan bli brukt for å detektere målantigenene in vivo og in vitro. Figur IA og IB: Nukleotidsekvensen (SEQ ID NO: 1) og aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 2) av tri-fusjonsproteinet Ral2-TbH9-Ra35 (kalt Mtb32A). Figur 2: Nukleotidseksensen (SEQ ID NO: 3) og aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 4) av tri-fusjonsproteinet Erdl4-DPV-MTl (kalt Mtb39A). Figur 3A - 3D: Nukleotidsekvensen (SEQ ID NO: 5) og aminosyresekvensen

(SEQ ID NO: 6) av tri-fusjonsprotenet TbRa3-38kD-Tb38-l.

Figur 4A - 4D: Nukleotidsekvensen (SEQ ID NO: 7) og aminosyresekvensen

(SEQ ID NO: 8) av bi-fusjonsproteinet TbH9-Tb38-l.

Figur 5A - 5J: Nukleotidsekvensen (SEQ ID NO: 9) og aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 10) av tetra-fusjonsproteinet TbRa3-38kD-Tb38-l-DPEP (kalt TbF-2). Figur 6A og 6B: Nukleotidsekvensen (SEQ ID NO: 11) og aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 12) av penta-fusjonsproteinet Erdl4-DPV-MTl-MSL-MTCC2 (kalt Mtb88f). Figur 7A og 7B: Nukleotidsekvensen (SEQ ID NO: 13) og aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 14) av tetra-fusjonsproteinet Erdl4-DPV-MTl-MSL (kalt Mtb46f). Figur 8A og 8B: Nukleotidsekvensen (SEQ ID NO: 15) og aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 16) av tetra-fusjonsproteinet DPV-MT1-MSL-MTCC2(kaltMtb71f). Figur 9A og 9B: Nukleotidsekvensen (SEQ ID NO: 17) og aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 18) av tri-fusjonsproteinet DPV-MT1-MSL (kalt Mtb31f). Figur 10A og 10B: Nukleotidsekvensen (SEQ ID NO: 19) og aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 20) av tri-fusjonsproteinet TbH9-DPV-MT1 (kalt Mtb61f). Figur 1 IA og 1 IB: Nukleotidsekvensen (SEQ ID NO: 21) og aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 22) av tri-fusjonsproteinet Erdl4-DPV-MTl (kalt Mtb36f). Figur 12A og 12B: Nukleotidsekvensen (SEQ ID NO: 23) og aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 24) av bi-fusjonsproteinet TbH9-Ra35 (kalt Mtb59f). Figur 13A og 13B: Nukleotidsekvensen (SEQ ID NO: 25) og aminosyresekvensen (SEQ ID NO: 26) av bi-fusjonsproteinet Ral2-DPPD (kalt Mtb24). Figur 14A-14F: T celleprolifereringsresponser av seks PPD+ individer når de ble stimulert med to fusjonsproteiner og deres individuelle komponenter. Figur 15A-15F: IFN-y produksjon av seks PPD+ individer når de ble stimulert

med to fusjonsproteiner og deres individuelle komponenter.

Figur 16A-16F: T celleproliferering av mus immunisert med et fusjonsprotein

eller dets individuelle komponenter og en adjuvant.

Figur 17: IFN-y produksjon av mus immunisert med et fusjonsprotein eller

dets individuelle komponenter og en adjuvant.

Figur 18: IL-4 produksjon av mus immunisert med et fusjonsprotein eller

dets individuelle komponenter og en adjuvant.

Figur 19A-19F: Serumantistoffkonsentrasjoner av mus immunisert med et

fusjonsprotein eller dets individuelle komponenter og en adjuvant.

Figur 20A-20C: Overlevelse av marsvin etter aerosolprovosering med M.

tuberculosis. Fusjonsproteinene Mtb32A og Mtb39A, ble

formulert i adjuvant SBASlc (20A), SBAS2 (20B) eller SBAS7 (20C), og brukt som et immunogen i marsvin forutfor for provosering med bakterie. BCG er den positive kontrollen. Figur 2 IA og 21B: Stimulering av proliferering og IFN-y produksjon i TbH9-spesifikke T celler ved fusjonsproteinet TbH9-Tb38-l. Figur 22A og 22B: Stimulering av proliferering og IFN-y produksjon i Tb38-1-spesifikke T celler ved fusjonsproteinet TbH9-Tb38-l. Figur 23A og 23B: Stimulering av proliferering og IFN-y produksjon i T celler tidligere vist å respondere på både TbH-9 og Tb38-1 antigener ved fusjonsproteinet TbH9-Tb38-l.

Foreliggende oppfinnelse vedrører antigener som er nyttig for behandling og forebygging, polynukleotider som koder slike antigener og metoder for deres anvendelse. Antigener fra den foreliggende oppfinnelse er fusjonspolypeptider fra M. tuberculosisantigener og varianter derav. Mer spesifikt, omfatter antigenene fra den foreliggende oppfinnelse minst to polypeptider av M. tuberculosis som settes sammen til et større fusjonspolypeptidmolekyl. Antigenene kan ytterligere omfatte andre komponenter fremstilt for å øke immuniteten til antigenene eller forbedre disse antigenene i andre aspekter, f.eks., isoleringen av disse antigenene gjennom tilsetning av et strekk av histidinresidier i en ende av antigenet.

Antigenene er eksemplifisert i figurene IA til 13B, inklusiv homologer og varianter av disse antigenene. Disse antigenene kan modifiseres f.eks., ved å tilsette linkerpeptidsekvenser som beskrevet under. Disse linkerpeptidene kan settes mellom en eller flere polypeptider som utgjør hvert av fusjonsproteinene presentert i figurene IA til 13B. Andre antigener er antigener beskrevet i figurene IA til 13B som har blitt koblet til et kjent antigen hos M. tuberculosis, slik som tidligere beskrevet 38kD (SEQ ID NO: 27) antigen (Andersen and Hansen, 1989, Infect. Immun. 57:2481-2488; Genbank Aksesjonsnummer M30046).

Antigener beskrevet heri og immunogene deler derav, har evnen til å indusere immunogenrespons. Mer spesifikt, har antigene evnen til å indusere proliferering og/eller cytokinproduksjon (dvs. interferon-y og/eller interleukin-12 produksjon) i T celler, NK celler, B celler og/eller makrofager avledet fra en M. tuberculosis- immunt individ. Seleksjonen av celletype for anvendelse i evaluering av immunogen respons til et antigen vil avhenge av den ønskede responsen. F.eks., blir interleukin-12 produksjonen lettes evaluert ved å bruke fremstillinger som inneholder B celler og/eller makrofager. Et M. tuberculosis- ivcammt individ er en som man betrakter å være resistent for utvikling av tuberkulose i kraft av å ha en effektiv T cellerespons mot M. tuberculosis (dvs. i det vesentlig fri for sykdomssymptomer). Slike individer kan være identifisert basert på en sterk positiv (dvs. større enn 10 mm diameter hevelse) intradermal hudtestrespons for tuberkuloseproteiner (PPD) og et fravær av et hvilket som helst tegn eller symptomer av tuberkulosesykdom. T celler, NK celler, B celler og makrofager avledet fra M. tuberculosis- imraune individer kan fremstilles ved å bruke metoder kjent innen fagfeltet. F.eks., en fremstilling av PBMC (dvs. perifere blod-mononukleærceller) kan anvendes uten ytterligere separasjon av komponentcellene. PBMC kan generelt fremstilles, f.eks., ved å bruke tetthetssentrifugering gjennom "FICOLL" (Winthrop Laboratories, NY). T celler for anvendelse i analysene beskrevet heri kan også renses direkte fra PBMC. Alternativt, kan en anriket T cellelinje som er reaktiv mot mykobakterielle proteiner, eller T cellekloner reaktive for individuelle mykobakterielle proteiner, anvendes. Slike T cellekloner kan fremstilles fra, f.eks., dyrkning av PBMC fra M. tuberculosis- imraune individer med mykobakterielle proteiner i en periode på 2-4 uker. Dette tillater ekspansjon av kun de mykobakterielle protein-spesifikke T celler, som resulterte i en linje sammensatt kun av slike celler. Disse cellen kan deretter klones og testes med individuelle proteiner, ved å bruke metoder kjent for en fagperson, for mer å nøyaktig definere individuell T cellespesifisitet. Generelt, antigener som tester positivt i analyse for proliferering og/eller cytokinproduksjon (dvs. interferon-y og/eller interleukin-12 produksjon) utført ved å bruke T celler, NK celler, B celler og/eller makrofager avledet fra en M. tuberculosis'-immunt individ blir betraktet som immunogen. Slike analyser kan utføres, f.eks., ved å bruke representative prosedyrer som beskrevet under. Immunogene deler av slike antigener kan identifiseres ved å bruke lignende analyser, og kan være tilstede innenfor polypeptidene beskrevet heri.

Evnen til et polypeptid (f.eks. et immunogent antigen, eller en del eller annen variant derav) for å indusere celleproliferering blir evaluert ved å bringe cellene i kontakt (f.eks., T celler og/eller NK celler) med polypeptidet og måle prolifereringen av cellene. Generelt, er mengden av polypeptid som er tilstrekkelig for evaluering av omtrent 10<5>celler, varierer fra omtrent 10 ng/ml til omtrent 100 ug/ml og er fortrinnsvis omtrent 10 ug/ml. Inkuberingen av polypeptidet med celler blir typisk utført ved 37°C i omtrent seks dager. Etter inkubering med polypeptidet, blir cellene analysert for proliferativ respons, som kan evalueres ved kjente metoder innen fagfeltet, slik som å eksponere cellene til en puls av radioaktivt merket tymidin og måle inkorporeringen av innmerking i cellulært DNA. Generelt, blir et polypeptid som resulterer i minst tre gangers økning i prolifereringen over bakgrunnen (dvs. prolifereringer observert for celler dyrket uten polypeptider) betraktet å være i stand til å indusere proliferering.

Evnen til et polypeptid å stimulere produksjonen av interferon-y og/eller interleukin-12 i celler kan evalueres ved å bringe cellene i kontakt med polypeptidet og måle nivået av interferon-y eller interleukin-12 produsert av cellene. Generelt, er mengden av polypeptid som er tilstrekkelig for evaluering av IO<5>celler varierende fra omtrent 10 ng/ml til omtrent 100 ug/ml og fortrinnsvis omtrent 10 ug/ml. Polypeptidet kan være, men behøver ikke å være, immobilisert på et fast støtteunderlag, slik som en kule eller biodegraderbar mikrosfære, slik som de som er beskrevet i U.S. patent nr. 4,897,268 og 5,075,109. Inkubering av polypeptidet med cellene blir utført ved 37°C i omtrent seks dager. Etter inkubering med polypeptidet, blir cellene analysert for interferon-y og/eller interleukin-12 (eller en eller flere subenheter derav), som kan evalueres ved fremgangsmåter kjent innen fagfeltet, slik som et enzymkoblet immunosorbentanalyse (ELISA) eller, i tilfellet av IL-12 P70 subenheten, en bianalyse slik som en analyse som måler proliferering av T celler. Generelt, blir et polypeptid som resulterer i produksjon av minst 50 pg av interferon-y per ml av dyrket supernatant (som inneholder IO<4->10<5>T celler per ml) betraktet å være i stand til å stimulere produksjon av interferon-y. Et polypeptid som stimulerer produksjonen av minst 10 pg/ml av IL-12 P70 subenhet, og/eller minst 100 pg/ml av IL-12 P40 subenhet, per 10<5>makrofager eller B celler (eller per 3 x 10<5>PBMC) blir betraktet å være i stand til å stimulere produksjon av IL-12.

Generelt, er immunogene antigener de antigenene som stimulerer proliferering og/eller cytokinproduksjon (dvs. interferon-y og/eller interleukin-12 produksjon) i T celler, NK celler, B celler og/eller makrofager avledet fra mint 25% av M. tuberkulos- imrmmt individer. Blant disse immunogene antigenene, kan polypeptidene som har overlegne terapeutiske egenskaper bli holdt fra hverandre basert på størrelsen på responsen i de ovenfor nevnte analyser og basert på prosentandelen av individer for hvilke en respons blir observert. I tillegg, vil antigener som har overlegne terapeutiske egenskaper ikke stimulere proliferering og/eller cytokinproduksjon in vitro i celler avledet fra mer enn omtrent 25% av individene som ikke er M. tuberculosis- immune, for derved å eliminere responsene som ikke er spesifikke på grunn av M. tuberculosis- responsive celler. Disse antigenene som induserer en respons i en høy prosentandel av T cellen, NK cellen, B cellen og/eller makrofagprepareringene fra M. tuberculosis- vammnt individer (med en lav insidens av respons i celleprepareringene fra andre individer) har overlegne terapeutiske egenskaper.

Antigener med overlegne terapeutiske egenskaper kan også bli identifisert og basert på deres evne til å minske alvorligheten av M. tuberculosis infeksjon i forsøksdyr, når det blir administrert som en vaksine. Egnede vaksinefremstillinger for anvendelse på forsøksdyr er beskrevet i detalj under. Effektiviteten kan bestemmes ved å se på evnen til antigen og tilveiebringe minst omtrent 50% reduksjon i bakterieantall og/eller minst omtrent en 40% nedgang i mortalitet etter eksperimentell infeksjon. Egnede forsøksdyr inkluderer mus, marsvin og primater.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også nukleinsyremolekyler som koder for fusjonspolypeptidene til M. tuberculosis. I en spesifikk utførelsesform ved eksemplet i eksempeldelen, ble tretten M. tuberculosis fusjonskodene sekvenser konstruert. I overenstemmelse med oppfinnelsen, kan en hvilken som helst nukleotidsekvens som koder for aminosyresekvensen til fusjonsproteinet bli brukt for å danne rekombinante molekyler som dirigerer ekspresjonen av den kodende sekvensen.

For å klone fullengde kodende sekvenser eller homologe varianter for å fremstille fusjonspolynukleotider, kan merkede DNA prober designet fra en hvilken som helst del av nukleotidsekvensene eller deres komplementer beskrevet heri, bli brukt for å screene et genomisk eller cDNA bibliotek fremstilt fra forskjellige stammer av M. tuberculosis for å identifisere den kodende sekvensen til hver individuell komponent. Isolering av kodende sekvenser kan også bli utført ved polymerasekjedereaksjoner (PCR) ved å bruke to degenererte oligonukleotidprimersamlinger designet på basis av de kodende sekvensene beskrevet heri.

Isolater eller rensede polynukleotider komplementære til nukleotidsekvensene fra SEQ ID NO: 1,3, 5, 7, 9,11,13,15, 17,19,21,23 og 25, og polynukleotider som selektivt hybridiserer til slike komplementære sekvenser kan fremstilles.

Et polynukleotid som hybridiserer til sekvensen fra SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17,19, 21,23 og 25 eller den komplementære sekvens under betingelser med lav stringens og koder for et protein som bibeholder immunogeniteten til fusjonsproteinene fra SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18,20, 22, 24 og 26 er fremskaffet. Eksempelbetingelsene for lav stringens kan være som følger (se også Shilo and Weinberg, 1981, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78:6789-6792): filtrene som inneholder DNA blir forbehandlet i 6 timer ved 40°C til en løsning som inneholder 35% formamid, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,1% PVP, 0,1% Ficoll, 1% BSA og 500 ug/ml denaturert laksesperm DNA. Hybridiseringene ble utført i samme løsning med følgende modifiseringer; 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,2% BSA, 100 ug/ml laksesperm DNA, 10% (vekt/volum) dekstransulfat, og 5-20 X IO<6>cpm<32>P-merked probe blir brukt. Filtrene blir inkubert i hybridiseringsblanding i 18-20 timer ved 40°C og deretter vasket i 1,5 timer ved 55°C i en løsning som inneholder 2 X SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA og 0,1% SDS. Vaskeløsningen ble erstattet med fersk løsning og inkubert i ytterligere 1,5 time ved 60°C. Filtrene blir blottet tørre og eksponert for autoradiografi. Hvis nødvendig, blir filtrene vasket en tredje gang ved 65-68°C og reeksponert for filmen. Andre betingelser med lav stringens som kan anvendes er velkjent innen fagfeltet (f.eks. som anvendt for kryss-artshybirdiseringer).

Polynukleotid som hybridiserer til den kodende sekvensen til SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,17, 19, 21, 23 og 25 eller den komplementære sekvens under betingelser med høy stringens og som koder for et protein som bibeholder immunogeniteten til fusjonsproteinene fra SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10,12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 og 26 er tilveiebrakt. Eksempelbetingelsene for høy stringens kan være som følger: prehybridisering av filtrene som inneholder DNA blir utført i 8 timer til over natten ved 65°C i buffer sammensatt av 6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA, og 500 ug/ml denaturert laksesperm DNA. Filtrene ble hybridisert i 48 timer ved 65°C i prehybridiseringsblanding som inneholder 100 ug/ml denaturert laksesperm DNA og 5-20 X IO6 cpm av<32>P-merket probe. Vasking av filtrene blir utført ved 37°C i 1 time i en løsning som inneholder 2X SSC, 0,01% PVP, 0,01% Ficoll og 0,01 BSA. Dette etterfølges av en vask i 0,1X SSC ved 50°C for 45 minutter før autoradiografi. Andre betingelser for høy stringens som kan bli brukt er velkjent innen fagfeltet.

Et polypeptid som hybridiserer til den kodende sekvensen fra SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11,13, 15,17,19,21, 23 og 25 eller deres komplementære sekvens under betingelser for moderat stringens og som koder et protein som bibeholder immunogeniteten av fusjonsproteinene fra SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22,24 og 26 kan fremstilles. Eksempelbetingelser for moderat stringens kan være som følger: filtrene som inneholder DNA blir forbehandlet i 6 timer ved 55°C i en løsning som inneholder 6 X SSC, 5X Denharfs løsning, 0,5% SDS og 100 ug/ml denaturert laksesperm DNA. Hybridiseringene blir utført i samme løsning og 5-20 X IO<6>cpm<32>P-merket probe blir brukt. Filtrene blir inkubert i hybridiserings-blandingen ved 18-20 timer ved 55°C, og deretter vasket to ganger i 30 minutter ved 60°C i en løsning som inneholder IX SSC og 0,1% SDS. Filtrene blir blottet tørre og eksponert for autoradiografi. Andre betingelser for moderat stringens som kan anvendes er velkjent innen fagfeltet. Vasking av filtrene blir utført ved 37°C i 1 time i en løsning som inneholder 2X SSC, 0,1% SDS.

I overensstemmelse med oppfinnelsen, kan et polynukleotid fra oppfinnelsen som koder for et fusjonsprotein, fragmenter derav, eller funksjonelle ekvivalenter derav blir brukt for å fremstille rekombinante nukleinsyremolekyler som dirigerer ekspresjon av fusjonsproteinet, fragmenter derav, eller funksjonelle ekvivalenter derav, i egnede vertsceller. Fusjonspolypeptidproduktene som kodes for av slike polynukleotider kan endres ved molekylær manipulering av den kodende sekvensen.

På grunn av innebygget degenerering av den genetiske kode, kan andre DNA sekvenser som koder for i det vesentlige samme eller funksjonelt ekvivalent aminosyresekvens, bli brukt i utførelse av oppfinnelsen for ekspresjon av fusjonspolypeptidene. Slike DNA sekvenser inkluderer de som er i stand til å hybridisere til de kodene sekvensene eller deres komplementer beskrevet heri under lav, moderat eller stringente betingelser beskrevet i avsnittet over.

Endrede nukleotidsekvenser som kan bli brukt i samsvar med overensstemmelse med oppfinnelsen inkluderer delesjoner, addisjoner og substitusjoner av forskjellige nukleotidresidier som resulterer i en sekvens som koder for det samme eller et funksjonelt ekvivalent genprodukt. Genproduktet i seg selv kan inneholde delesjoner, addisjoner eller substitusjoner av aminosyreresidier, som resulterer i en stille endring som allikevel produserer funksjonelt ekvivalent antigenepitop.

Slike konservative aminosyresubstitusjoner kan gjøres på basis av likhet i polaritet, ladning, løselighet, hydrofobisitet, hydrofilisitet, og/eller amfifatisk egenskap til residiene som er involvert. F.eks., inkluderer negativt ladede aminosyrer asparaginsyre og glutaminsyre; positivt ladede aminosyrer inkuderer lysin, histidin og arginin; aminosyrer med uladede polare hodegrupper som har lik hydrofilisitetsverdier inkluderer følgende: glycin, asparagin, glutamin, serin, treoning og tyrosin; og aminosyrer med nonpolare hodegrupper inkluderer alanin, valin, isoleucin, leucin, fenylalanin, prolin, metionin og tryptofan.

Nukleotidsekvensene fra oppfinnelsen kan fremstilles for å endre fusjonsproteinkodene sekvens for forskjellige ender, inklusiv men ikke begrenset til, endringer som modifiserer prosessering og ekspresjon av genproduktet. F.eks., kan mutasjonene introduseres ved å bruke teknikker som er velkjent innen fagfeltet, f.eks. setedirigert mutagenese, for å sette inn nye restriksjonsseter, for å endre glykosyleringsmønstrene, fosforylering, etc.

I en alternativ utførelsesform av oppfinnelsen, kan den kodene sekvensen til et fusjons-protein bli syntetisert i et hele eller en del, ved å bruke kjemiske metoder velkjent innen fagfeltet. Se f.eks. Caruthers et al, 1980, Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 7:215-233; Crea and Horn, 180, Nuc, Acids Res. 9( 10) :2331; Matteucci and Caruthers, 1980, Tetrahedron Letter 21:719; og Chow and Kempe, 1981, Nuc. Acids Res. P(12):2807-2817. Alternativt, kan polypeptidet i seg selv bli produsert ved å bruke kjemiske metoder for å syntetisere en aminosyresekvens i et hele eller en del. F.eks., kan peptidene syntetiseres ved fast faseteknikker, kuttet fra resin, og renset ved preparativ høyutførelsesflytene kromatografi. (Se Creighton, 1983, Proteins Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman og Co., N.Y. sidene 50-60). Sammensetningen av de syntetiske polypeptidene kan bli bekreftet ved aminosyreanalyse eller sekvensering (f.eks., Edman degraderingsprosedyre; se Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y., sidene 34,49).

I tillegg, kan den kodene sekvensen til et fusjonsprotein bli mutert in vitro eller in vivo, for å danne og/eller ødelegge translasjon, initiering og/eller termineringssekvenser, eller å danne variasjoner i de kodene regionene og/eller danne nye restriksjonendonuklease-seter eller ødelegge allerede eksisterende, for å lette ytterligere in vitro modifisering. En hvilken som helst teknikk for mutagenese kjent innen fagfeltet kan brukes, inklusiv, men ikke begrenset til kjemisk mutagenese, in vitro setedirigert mutagenese (Hutchinson, C, et al, 1978, J. Biol. Chem 253-6551), anvendelse av TAB linkere (Pharmacia) og dets like. Det er viktig av manipuleringene ikke ødelegger immunogeniteten til fusjonspolypeptidene.

I tillegg, kan ikke klassiske aminosyrer eller kjemiske aminosyreanaloger bli introdusert som en substitusjon eller addisjon til sekvensen. Ikke klassiske aminosyrer inkluderer, men er ikke begrenset til, D-isomerer av vanlige aminosyrer, a-aminoisobutyrinsyre, 4-aminobutyrinsyre, Abu, 2-aminobutyrinsyre, y-Abu, e-Ahx, 6-aminohekanoinsyre, Aib, 2-aminoisobutyrinsyre, 3-aminopropionsyre, ornitin, norleucin, norvalin, hydroksy-prolin, sarcosin, sitrulin, cysteinsyre, t-butylglycin, t-butylalanin, fenylglycin, cykloheksylalanin, B-alanin, fluor-aminosyre, designeraminosyre slik som B-metylaminosyres, Ca-metylaminosyrer, Na-metylaminosyre, og aminosyreanaloger i generell. Dessuten, kan aminosyren være D (dekstrorotering) eller L (levorotering).

I en spesifikk utførelsesform, blir de kodene sekvensene til hvert antigen i fusjonsproteinene satt sammen i deres amino- eller karboksy-terminale ende via en peptidbinding i en hvilken som helst rekkefølge. Alternativt, kan peptidlinkersekvensen anvendes for å separere individuelle polypeptider som utgjør et fusjonspolypeptid med en distanse som er tilstrekkelig for å sikre at hvert polypeptid foldes til et sekundært og tertiærstruktur som maksimaliserer dets antigene effektivitet for å forebygge og behandle tuberkulose. En slik peptidlinkersekvens blir inkorporert i fusjonsproteinet ved å bruke standarteknikker velkjent innen fagfeltet. Egnede peptidlinkersekvenser kan bli valgt basert på følgende faktorer: (1) deres evne til å adoptere en fleksibel utstrakt konformasjon; (2) deres evne til å adoptere sekundærstruktur som kan reagere med funksjonelle epitoper på den første og andre polypeptidet; og (3) mangel på hydrofobe eller ladede residier som kan reagere med polypeptidfunksjonelle epitoper. Foretrukket peptidlinkersekvenser inneholder Gly, Asn og Ser residier. Andre nær nøytrale aminosyrer, slik som Thr og Ala, kan også bli brukt i linkersekvensen. Aminosyresekvensene som kan være nyttige å anvende som linkere inkluderer de som er beskrevet i Maratea et al., Gene 40:39-46,1985; Murphy et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:8258-8262, 1986; U.S. patent nr. 4,935,233 og U.S. patent nr. 4,751,180. Linkersekvensen kan være fra 1 til omtrent 50 aminosyrer i lengde. Peptidsekvensene kreves ikke når de første og andre polypeptidene har ikke essensielle N-terminal aminosyreregioner som kan bli brukt for å separere funksjonelle domener og hindre sterisk interferens. F.eks., kan antigenene i et fusjonsprotein bli bundet sammen av en fleksibel polylinker som som Gly-Cys-Gly eller Gly-Gly-Gly-Gly-Ser repertert 1 til 3 ganger (Bird et al, 1988, Science 242:423-426; Chaudhary et al, 1990, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:1066-1070).

I en utførelsesform, blir et slikt protein produsert ved rekombinant ekspresjon av en nukleinsyre som koder for proteinet. Et slikt fusjonsprodukt kan fremstilles ved ligering av egnede nukleinsyresekvenser som koder for ønskede aminosyresekvenser til hverandre, ved metoder kjent innen fagfeltet, i riktig leseramme, og som uttrykker produktet ved fremgangsmåter kjent innen fagfeltet. Alternativt, kan et slikt produkt bli fremstilt ved proteinsyntetiske teknikker, f.eks., ved anvendelse av peptidsyntetiseringsmaskin. Kodene sekvenser for andre molekyler slik som et cytokin eller en adjuvant kan tilsettes til fusjonspolynukleotidet også.

For å produsere et M. tuberculoswfusjonsprotein fra oppfinnelsen, blir nukleotidsekvensen som koder for proteinet eller funksjonelt ekvivalent, satt inn i en egnet ekspresjonsvektor, dvs. en vektor som inneholder de nødvendige elementene for transkripsjon og translasjon av den innsatte kodende sekvens. Vertscellene eller cellelinjene transfektert eller transformert med rekombinante ekspresjonsvektorer kan bli brukt for forskjellige formål. Dette inkluderer, men er ikke begrenset til, storskala-produksjon av fusjonsproteinet.

Fremgangsmåter som er velkjent innen fagfeltet kan bli brukt for å konstruere ekspresjonsvektorer som inneholder en fusjon kodene sekvens og egnet transkripsjon/ translasjonskontrollsignalet. Disse fremgangsmåtene inkluderer in vitro rekombinante DNA teknikker, syntetiske teknikker og in vivo rekombinasjon/genetisk rekombinasjon.

(Se f.eks. teknikkene beskrevet i Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. og Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.). RNA som er i stand til å kode for et polypeptid kan også bli kjemisk syntetisert. (Gait, utg. 1984, Oligonucleoide Synthesis, IRL Press, Oxford). Forskjellige vertscelleekspresjonsvektorsystemer kan utnyttes for å uttrykke en fusjonsproteinkodende sekvens. Disse inkluderer men er ikke begrenset til, mikroorganismer slik som bakterier (f.eks. E. coli, B. subtilis) transformert med rekombinant bakteriofag DNA, plasmid DNA eller cosmid DNA ekspresjonsvektorer som inneholder en kodene sekvens; gjær (f.eks. Saccaromyces, Pichia) transformert med rekombinant gjærekspresjonsvektorer som inneholder en kodene sekvens; insektscellesystemer infisert med rekombinante virusekspresjonsvektorer (f.eks. baculovirus) som inneholder en kodene sekvens; plantecellesystemer infisert med rekombinant virusekspresjonsvektorer (f.eks. blomkål mosaikkvirus, CaMV; tobakk mosaikkvirus, TMV) eller transformert med rekombinante plasmid ekspresjonsvektorer (f.eks. Ti plasmid) som inneholder en kodene sekvens; eller mammalske cellesystemer (f.eks. COS, CHO, BHK, 293, 3T3 celler). Ekspresjonselementene til disse systemene varierer i deres styrke og spesifisitet.

Avhengig av vert/vektorsystemet som benyttes, kan et hvilket som helst antall av egnede transkripsjon og translasjonselementer, inklusiv konstitutive og induserbare promoterer, bli brukt i ekspresjonsvektoren. F.eks., når man kloner i bakterielle systemer, kan induserbare promoterer slik som pL og bakteriofag X, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac hybridpromoter; cytomegaloviruspromoter) og dets like bli brukt; når en kloner i insekts cellesystemer, kan promotere slik som baculoviruspolyhedronpromoter bli brukt; når man kloner i plantecellesystemer, kan promotere avledet fra genomet til plantecellene (f.eks. varmesjokkpromotere; promoteren for lille subenheten til RIBISCO; promoteren for klorofyll a/ R bindingsprotein) eller fra plantevirus (f.eks. 35S RNA promoter fra CaMV; kappeproteinpromoteren til TMV) anvendes; når en kloner i mammalske cellesystemer, kan promotere avledes fra genomet til mammalske celler (f.eks. metallotioneinpromoter) eller fra mammalske virus (f.eks. adenovirussen-promoter; vaksiniavirus 7,5K promoter) anvendes; når det dannes cellelinjer som inneholder mange kopier av en antigenkodende sekvens, kan SV40-, BPV- og EBV-baserte vektorer anvendes med en egnet selekterbar markør.

Bakterielle systemer blir foretrukket for ekspresjon av M. tuberculosisantigener. For in vivo avlevering, kan en bakterie slik som Bacillus- Calmette- Guerrin bli fremstilt for å uttrykke et fusjonspolypeptid fra oppfinnelsen på dets celleoverflate. Et antall av andre bakterielle ekspresjonsvektorer kan med fordel bli selektert avhengig av anvendelsen for de uttrykte produktene. F.eks., når store kvanta av fusjonsprotein blir produsert for formulering for farmasøytiske sammensetninger, blir vektorene som dirigerer høynivå ekspresjonen av fusjonsproteinproduktene som lett kan renses være ønskelig. Slike vektorer, inkluderer men er ikke begrenset til E. coli ekspresjonsvektoren pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), som i en kodende sekvens kan ligeres inn i vektoren i leseramme med lacZ kodene region, slik at et hybridprotein blir produsert; pIN vektorer (Inouye and Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke and Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503-5509); og dets like. pGEX vektorene kan også bli brukt for å uttrykke fremmede polypeptider som fusjonsproteiner med glutation S-transferase (GST). Generelt, er slike fusjonsproteiner løselig og kan renses lett fira lyserte celler ved adsorpsjon ved glutation-agarosekuler etterfulgt av eluering ved tilstedeværelse av fritt glutation. pGEX vektorene er designet for å inkludere trombin eller faktor Xa proteasekuttingseter slik at de klonede fusjons-polypeptidet av interesse kan frigis fra GST delen.

Når et rekombinant protein blir uttrykt, kan det identifiseres ved analyser basert på fysiske eller funksjonelle egenskaper til produktet, inklusiv radioaktiv merking av produktet etterfulgt av analyse ved gelelektroforese, radioimmunoanalyse, ELISA, bianalyser, etc.

Når det kodede proteinet blir identifisert, kan det bli isolert og renset ved standardmetoder inklusiv kromatografi (f.eks. "high performance" flytende kromatografi, ionebytte, affinitet og størrelseskolonnekromatografi), sentrifugering, differensiell løselighet, eller ved en hvilken som helst annen standardteknikk for rensing av proteiner. De aktuelle betingelsene som blir brukt vil avhenge, i delvis, av faktorer slik som nettoladning, hydrofobisitet, hydrofilisitet, etc, og vil være tydelig for den som kjenner fagfeltet. Funksjonelle egenskaper kan evalueres ved å bruke en hvilken som helst egnet analyse, slik som antistoffbinding, induksjon av T celleproliferering, stimulering av cytokinproduksjon slik som IL2, IL-4 og IFN-y. For utførelse av den foreliggende oppfinnelse, kan hvert fusjonsprotein være minst 80% renset fra andre proteiner. Det kan også være minst 90% renset. For in vivo administrering, foretrekkes det at proteinene er mer enn 95% renset.

Fusjonsproteinkodene sekvens fra oppfinnelsen kan brukes for å kode et proteinprodukt for anvendelse som et immunogen for å indusere og/eller forsterke immunresponsen for M. tuberculosis. I tillegg, kan en slik kodende sekvens ligeres med en kodende sekvens fra et annet molekyl slik som cytokin eller adjuvant. Slike polynukleotider kan bli brukt in vivo som en DNA vaksine (U.S. patent nr. 5,589,466; 5,679,647; 5,703,055). I det tilfelle uttrykker polynukleotidet dets kodede protein i en resipient for direkte å indusere en immunrespons. Polynukleotidet kan injiseres inn i et individ for å prime en immunrespons til dets kodede produkt, eller administreres til en infisert eller immunisert individ for å forsterke de sekundære immunresponsene.

Den terapeutiske sammensetningen kan omfatte en fusjons-protein kodene sekvens eller fragmenter derav som er en del av ekspresjonsvektoren. Et slikt polynukleotid kan inneholde en promoter som er operativt koblet til de kodende regionene, hvor nevnte promoter er induserbar eller konstitutiv, og eventuelt vevsspesifikk. Polynukleotid kan også omfatte en kodende sekvens flankert av regioner som fremmer homolog rekombinasjon ved et ønsket sete i genomet, for derved å tilveiebringe intrakromosomal ekspresjon av den kodende sekvensen (Koller and Smithies, 1989, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438).

Avlevering av nukleinsyren i et subjekt kan enten være direkte, i hvilke tilfellet individet blir direkte eksponert til nukleinsyren eller nukleinsyrebærervektoren, eller indirekte, som er tilfellet, blir cellene først transformert med nukleinsyren in vitro deretter transplantert inn i individet. Disse to tilnærmingsmåtene er kjent, henholdsvis som in vivo eller ex vivo genoverføring.

Det er mulig å administrere nukleinsyren direkte in vivo, hvor den blir uttrykt for å produsere det kodede fusjonsproteinproduktet. Dette kan utføres ved hvilken som helst av fremgangsmåtene kjent innen fagfeltet, f.eks., ved å konstruere den som en del av en egnet nukleinsyreekspresjonsvektor og administrere den slik at den blir intracellulær, f.eks. ved infeksjon ved å bruke et defekt eller attenuert retroviralt eller andre virale vektorer (se U.S. patent nr. 4,980,286) eller ved direkte injeksjon av nakent DNA, eller ved anvendelse av mikropartikkelbombardering (f.eks. en genpistol; Biolistic, Dupont), eller overtrekkes med lipider eller celleoverflatereseptorer eller transfekterende midler, innkapslet i liposomer, mikropartikler eller mikrokapsler (USA patent nr. 5,407,609; 5,853,763; 5,814,344 og 5,820,883), eller ved å administrere den i kobling med et peptid som er kjent å inn i kjernen, ved å administrere den sammen med en ligand som utsettes for reseptormediert endocytose (se f.eks. Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432) som kan bli brukt for å målsøke celletyper som spesifikt uttrykker reseptorer, etc. Nukleinsyreligandkompleks kan også dannes hvor i liganden omfatter et fusogenisk viralt peptid som ødelegger endosomene, som tillater nukleinsyrene å unngå lysosomal degradering. Videre kan nukleinsyren bli målrettet in vivo for cellespesifikt opptak og ekspresjon, ved å målsøke en spesifikk reseptor (se f.eks. PCT publikasjon WO 92/06180 datert 16 april 1992; WO 92/22635 datert 3 desember 1992; WO 92/20316 datert 26 november 1992; WO 93/14188 datert 22 juli 1993; WO 93/20221 datert 4 oktober 1993). Alternativt, kan nukleinsyren introduseres intracellulært og inkorporeres i vertscelle DNA for ekspresjon, ved homolog rekombinasjon (Koller and Smithies, 1989, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:8932-8935; Zijilstra et al, 1989, Nature 342:435-438).

En viral vektor slik som en retroviralvektor kan anvendes (se Miller et al, 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599). Retrovirale vektorer har blitt modifisert til og deletere retrovirale sekvenser som ikke er nødvendig for pakking av det virale genomet og integrering inn i vertscelle DNA. En fusjonskodende sekvens blir klonet inn i vektoren, som letter avlevering av nukleinsyren til en resipient. Mer detaljer om retrovirale vektorer kan finnes i Boesen et al., 1994, Biotherapy 6:291-302, som beskriver anvendelsen av retroviral vektor for avlevering av mdrl genet til hematopoetiske stamceller for å fremstille stamceller som er resistente mot kjemoterapi. Andre referanser som illustrerer anvendelse av retrovirale vektorer i genterapi er: Clowes et al, 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651; Kiem et al, 1994, Blood 83:1467-1473; Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141; og Grossman and Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114.

Adenovirus er andre virale vektorer som kan bli brukt i genterapi. Adenovirus er spesielt attraktive bærere for å avlevere gener til respiratorisk epitel. Adenovirus infiserer naturlig respiratorisk epitel hvor de kan forårsake en mild sykdom. Andre mål for adenovirusbasert avleveringssystemer er lever, sentralnervesystemet, endotelceller, og muskler. Adenovirus har den fordel å være i stand til å infisere ikke-delene celler. Adenoassosierte virus (AAV) har også blitt fremstilt for anvendelse i in vivo genoverføring (Walsh et al, 1993, Proe. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300).

En annen tilnærming involverer overføring av en konstruksjon til celler i vevskultur ved slike metoder som elektroporatin, lipofektin, kalsiumfosfatformidlet transfeksjon, eller viral infeksjon. Vanligvis, inkluderer fremgangsmåten for overføring av en selekterbar markør til cellene. Cellene blir deretter plassert under seleksjon for å isolere de cellene som har tatt opp og som uttrykker det overførte genet. Disse cellene blir deretter avlevert til et individ.

I denne utførelsesformen, blir nukleinsyren introdusert i en celle forut for administreringen in vivo av den resulterende rekombinante cellen. Slik introduksjon kan utføres ved en hvilken som helst kjent metode innen fagfeltet, inklusiv men ikke begrenset til transfeksjon, elektroporering, mikroinjeksjon, infeksjon med en viral eller bakteriofag vektor som inneholder nukleinsyresekvenser, cellefusjon, kromosom-formidlet genoverføring, mikrocelleformidlet genoverføring, sferoplastfusjon, etc. Mange teknikker er kjent innen fagfeltet for introduksjon av fremmede gener inn i celler (se f.eks. Loeffler and Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599-618; Cohen et al, 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644; Cline, 1985, Pharmac, Ther. 29:69-92) og kan bli brukt i samsvar med foreliggende oppfinnelse.

Polynukleotidene fra oppfinnelsen kan også bli brukt i diagnose av tuberkulose for deteksjon av polynukleotidsekvenser sepsifikke for M. tuberculosis i en pasient. Slik deteksjon kan fullføres, f.eks., ved å isolere polynukleotider fra biologisk prøve, ervervet fra en pasient som er følsom for å bli infisert med en bakterie. Ved isolering av polynukleotidene fra den biologiske prøven, vil et merket polynukleotid fra oppfinnelsen som er komplementær til en eller flere av polynukleotidene, tillates å hybridisere til polynukleotidene i den biologiske prøve ved å bruke teknikker for nukleinsyrehybridisering som er kjent for en fagperson innen fagfeltet. F.eks., kan en slik hybridisering bli utført i løsning eller med en hybridiseringspartner på et fast støtteunderlag.

Renset eller delvis rensede fusjonsproteiner eller fragmenter derav kan formuleres som en vaksine eller terapeutisk sammensetning. Slik sammensetning kan inkludere adjuvanter for å forsterke immunresponsene. I tillegg, kan slike proteiner ytterligere bli suspendert i en oljeemulsjon for å forårsake en langsommere frigivelse av proteinene in vivo ved injeksjon. De optimale ratio av hver komponent i formuleringen kan bestemmes ved teknikker velkjent for de som kjenner fagfeltet.

En hvilken som helst adjuvant kan anvendes i vaksinene fra denne oppfinnelsen for å forsterke immunresponsen. De fleste adjuvanter inneholder en substans som er designet for å beskytte antigen fra rask katabolisme, slik som aluminiumhydroksid eller mineralolje, og en ikke spesifikk stimulator for immunresponser, slik som lipid A, Bortadalle pertussis eller Mycobacterium tuberkulosis. Egnede adjuvanter er kommersielt tilgjengelig og inkluderer f.eks., fra ufullstendig adjuvant og Freunds fullstendige adjuvant (Difco Laboratories) og Merck adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ). Andre egnede adjuvanter inkluderer alum, biodegraderbare mikrosfærer, monofosforyl lipid A, quil A, SMASlc, SBAS2 (Ling et al., 1997, Vaccine 15:1562-1567), SMAS7 og Al(OH)3.

I vaksinene fra den foreliggende oppfinnelse er det foretrukket at adjuvanten induserer en immunrespons som omfatter Thl aspektene. Egnede adjuvantssystemer inkluderer, f.eks., en kombinasjon av monofosforyllipid A, fortrinnsvis 3-di-O-acylert monofosforyl lipid A (3D-MLP) sammen med et aluminiumsalt. Et forsterket system involverer kombinasjonen av et monofosforyl lipid A og et saponinderivat, spesielt kombinasjonen av 3D-MPL og saponinen QS21 som beskrevet i WO 94/00153, eller en mindre reaktogen sammensetning hvor QS21 blir stoppet med kolesterol som beskrevet i WO 96/33739. Tidligere eksperimenter har vist en klar synergistisk effekt på kombinasjonene av 3D-MLP og QS21 i induksjonen av både humoral og Thl type cellulære immunresponser. En spesiell potent adjuvantdannelse involverer QS21, 3D-MLP og tokoferol i en olje-i-vann emulsjon som beskrevet i WO 95/17210 og er en foretrukket formulering.

Formuleringer som inneholder et antigen fra den foreliggende oppfinnelsen kan administrerer til et individ per se eller i form av et farmasøytisk eller terapeutisk sammensetning. Farmasøytiske sammensetninger som omfatter proteinene kan bli fremstilt ved metoder for konvensjonell blanding, oppløsning, granulering, drage-fremstilling, pulverisering, emulgering, innkapsling, innfanging, eller lyofiliserings-prosesser. Farmasøytiske sammensetninger kan formuleres på konvensjonell måte ved å bruke en eller flere fysiologiske akseptable bærere, diluenter, eksipienter eller hjelpe-midler som letter prosesseringen av polypeptidene inn i fremstillingene som kan bli brukt farmasøytisk. Egnet formulering er avhengig av måten for administrering som velges.

For topisk administrering, kan proteinene bli formulert som løsninger, geler, salver, kremer, suspensjoner, etc., som er vel kjent innen fagfeltet.

Systemiske formulering inkluderer de som er designet for administrering ved injeksjon, f.eks. subkutant, intravenøs, intramuskulær, intratekal eller intraperitonal injeksjon, så vel som de som er designet for transdermal, transmukosal, oral eller pulmonær administrering.

For injeksjon, kan proteinene formuleres i vandige løsninger, fortrinnsvis i fysiologisk kompatible buffere slik som Hanks løsning, Ringers løsning eller fysiologisk saltvanns-buffer. Løsningen kan inneholde formulatoriske midler slik som suspendering, stabilisering og/eller dispergerende midler. Alternativt, kan proteinene være i pulverform for konstituering med et egnet bindemiddel, f.eks. sterilt pyrogen-fritt vann, før anvendelse.

For transmukosal administrering, blir penetranser egnet for barrieren som skal permeeres brukt i formuleringen. Slike penetranser er generelt kjent innen fagfeltet.

For oral administrering kan en sammensetning lett formuleres ved å kombinere proteinene med farmasøytisk akseptable bærere velkjent innen fagfeltet. Slike bærere muliggjør at proteinene kan formuleres som tabletter, piller, drageer, kapsler, flytende midler, geler, sirup, oppslamminger, suspensjoner av det like, for oral inntak hos individet som behandles. For orale faste formuleringer, slik som, f.eks., pulvere, kapsler og tabletter, inkluderer egnede eksipienter fyllere, slik som sukker, slik som laktose, fruktose, mannitol og sorbitol; cellulosefremstillinger slik som maisstivelse, hvetestivelse, risstivelse, potetstivelse, gelatin, gummitragakant, metylcellulose, hydroksypropylmetylcellulose, natriumkarboksymetylcellulose, og/eller polyvinylpyrrolidon (PVP); granulerende midler; og bindingsmidler. Hvis ønskelig, kan disintegreringsmidler tilsettes, slik som kryssbundet polyvinylpyrrolidon, agar, eller algininsyre eller et salt derav, slik som et natriumalginat.

Hvis ønskelig, kan faste doseformer være sukkerbetrukket eller enterisk betrukket ved å bruke standard teknikker.

For orale flytende fremstillinger slik som, f.eks., suspensjoner, eleksirer og løsninger, egnede bærere, eksipienter eller diluenter inkluderer vann, glykoler, oljer, alkoholer, etc. Ytterligere, kan smaksmidler, konserveringsmidler, fargemidler og dets like tilsettes.

For bukal administrering, kan proteinene ta form som tabletter, pastiller, etc. formulert på konvensjonell måte.

For administrering ved inhalering, kan proteinene for anvendelse enkelt avleveres i form av en aerosolspray fra trykkpakninger eller en forstøver, med anvendelse av en egnet propellant, f.eks. diklorodifluorometan, trikloro-fluorometan, diklorotetrafluoroetan, karbondioksid, eller annen egnet gass. I tilfelle av aerosol under trykk, kan doseenheten bli bestemt ved å tilveiebringe en ventil for å avlevere en avmålt mengde. Kapsler og "cartridges" av f.eks. gelatin for bruk som en inhalator eller insufflator kan bli formulert til å inneholde en pulverblanding av proteinet og en egnet pulverbase slik som laktose eller stivelse.

Proteinene kan også bli formulert i rektale eller vaginale sammensetninger slik som suppositorier eller retensjonsklystér, f.eks. å inneholde konvensjonelle suppositorier basert på kakaosmør eller andre glycerider.

I tillegg til formuleringer som tidligere beskrevet, kan proteinene også bli formulert som en depotfremstilling. Slike langtidsvirkende formuleringer kan administreres ved implantasjon (f.eks. subkutant eller intramuskulært) eller ved intramuskulær injeksjon. Derfor, kan f.eks., proteinene bli formulert ved egnet polymer eller hydrofobe materialer (f.eks. som en emulsjon i en akseptabel olje) eller ionebytteresiner, eller som sparsomme løselige derivater, f.eks. som sparsomt løselig salt.

Alternativt, kan andre farmasøytiske avleveringssystemer anvendes. Liposomene og emulsjonene er velkjente eksempler for avleveringsmidler som kan bli brukt for å avlevere et antigen. Visse organiske løsningsmidler slik som dimetylsulfoksid kan også anvendes, skjønt vanligvis vil dette medføre høyere toksisitet. Fusjonsproteinene kan også innkapsles i mikrosfærer (U.S. patent nr. 5,407,609; 5,853,763; 5,814,344 og 5,820,833). I tillegg, kan proteinene bli avlevert ved å bruke et vedvarende frigivelses-system, slik som semipermeable matrikser av faste polymerer som inneholder det terapeutiske eller vaksineringsmidlet. Forskjellige vedvarende frigivningsmaterialer har blitt etablert og er velkjent for de som kjenner fagfeltet. Vedvarende frigivelseskapsler kan, avhengig av deres kjemiske natur, frigi proteiner i noen få uker opptil 100 dager. Avhengig av den kjemiske egenskapen og den biologiske stabiliteten til reagenser, ytterligere strategier for proteinstabilisering kan anvendes.

Bestemmelse av en effektiv mengde av fusjonsproteinet for induserende immunrespons i et individ, er vel innenfor evnen til en fagperson, spesielt i lysest av den detaljerte beskrivelsen tilveiebrakt heri.

En effektiv dose kan esimeres initialt fra in vitro analyse. F.eks., kan en dose formuleres i dyremodeller for å oppnå en induksjon av en immunrespons for å bruke teknikker som er velkjent innen fagfeltet. En som har en ordinær utdannelse innen faget, vil lett optimalisere administrering til mennesker basert på dyredata. Dosemengde og intervall kan justeres individuelt. F.eks., når den blir brukt som en vaksine, kan polypeptidene og/eller polynukleotidene fra oppfinnelsen bli administrert til omtrent 1 til 3 doser for en 1-36 uker periode. Fortrinnsvis, blir 3 doser administrert, i intervaller på omtrent 3-4 måneder, og boostervaksinasj onene kan gis periodisk deretter. Alternative protokoller kan være egnet for individuelle pasienter. En egnet dose er en mengde av polypeptid eller DNA som den blir administrert som beskrevet over, er i stand til å reise en immunrespons i en immunisert pasient tilstrekkelig til å beskytte pasienten fra M. tuberculosisinféksjon for minst 1-2 år. Generelt, varierer mengden av polypeptid tilstede i en dose (eller produsert in situ ved DNA i en dose) fra omtrent 1 pg til omtrent 100 mg per kilo av verten, typisk fra omtrent 10 pg til omtrent 1 mg, og fortrinnsvis fra omtrent 100 pg til omtrent 1 ug. Egnet doseområde vil variere med størrelsen til pasienten, men vil typisk variere fra omtrent 0,1 ml til omtrent 5 ml.

Fusjonspolypeptidene fra oppfinnelsen er nyttige i diagnose av tuberkuloseinfeksjon in vitro og in vivo. Evnen til et polypeptid fra oppfinnelsen er å indusere celleproliferering eller cytokinproduksjon kan analysere ved fremgangsmåtene beskrevet over.

Det er også mulig å anvende fremgangsmåter hvor en eller flere av fusjonspolypeptidene inngår for å diagnostisere tuberkulose ved å bruke en hudtest in vivo. En hudtest, eller en hvilken som helst analyse utført direkte på en pasient hvor i en forsinket type hypersensitivitet (DTH) reaksjon (slik som hevelse, rødme eller dermatitt) blir målt etter intradermal injeksjon av én eller flere polypeptider som beskrevet over er mulig å anvende. Slik injeksjon kan oppnås ved å bruke en hvilken som helst egnet innretning tilstrekkelig for å bringe polypeptidet i kontakt med dermalcellene til pasienten, slik som, f.eks, en tuberkulinsprøyte eller en 1 ml sprøyte. Fortrinnsvis, blir reaksjonen målt minst omtrent 48 timer etter injeksjonen, mer foretrekkbart omtrent 48 til omtrent 72 timer etter injeksjon.

DTH reaksjonen er en celleformidlet immunrespons, som er større i pasientene som har blitt eksponert tidligere til testantigenet (dvs. den immunogene delen av polypeptidet som anvendes, eller en variant derav). Responsen kan bli målt visuelt, ved å bruke en linjal. Generelt, er en respons som er større enn omtrent 0,5 cm i diameter, fortrinnsvis større enn omtrent 1,0 cm i diameter, en positiv respons, indikativ på tuberkuloseinfeksjon, som kan eller ikke kan manifistere seg som en aktiv sykdom.

Fusjonspolypeptidene fra denne oppfinnelsen blir fortrinnsvis formulert, for anvendelse i en hudtest, som farmasøytiske sammensetninger som inneholder et polypeptid og en fysiologisk akseptabel brer. Slike sammensetninger inneholder typisk en eller flere av de ovenfornevnte polypeptidene i en mengde varierende fra omtrent 1 ug til 100 ug, fortrinnsvis fra omtrent 10 ug til omtrent 50 ug til et volum på 0,1 ml. Fortrinnsvis, er en bærer som anvendes i slike farmasøytiske sammensetninger en saltvannsløsning med egnede konserveringsmidler, slik som fenol og/eller Tween 80™.

Ulike fremgangsmåter for anvendelse av polypeptider for diagnose av tuberkulose er mulig. Fremgangsmåtene kan detektere M. tuberculosis infeksjon i en biologisk prøve ved å bruke fusjonspolypeptidene alene eller i kombinasjon. Som brukt heri, er en "biologisk prøve" en hvilket som helst antistoffinneholdene prøve ervervet fra en pasient. Fortrinnsvis, er prøven helblod, sputum, serum, plasma, spytt, cerebrospinalvæske eller urin. Mer foretrekkbart, er prøven blod, serum eller plasmaprøve ervervet fra en pasient eller en blodtilførsel. Polypeptidet eller polypeptidene blir brukt i en analyse, som beskrevet under, for å bestemme tilstedeværelse eller fravær av antistoffene til polypeptidet eller polypeptidene i prøven relativ til en på forhånd bestemt "cut-off' verdi. Tilstedeværelse av slike antistoff indikerer tidligere sensibilisering til mykobakterielle antigener som kan være indikative på tuberkulose.

Der hvor mer enn et fusjonspolypeptid anvendes, er polypeptidene som brukes fortrinnsvis komplementære (dvs. en komponent polypeptid vil tendere og detektere infeksjon i prøvene hvor infeksjonen ikke ville bli detektert av en annen komponent polypeptid). Komplementære polypeptider kan generelt identifiseres ved å bruke hvert polypeptid individuelt for å evaluere serumprøvene ervervet fra en serie av pasienter kjent å være infisert med M. tuberculosis. Etter bestemmelse av hvilke prøver som tester positivt (som beskrevet under) med hver polypeptid, kombinasjoner av to eller flere fusjonspolypeptider kan formuleres som i stand til å detektere infeksjon i de fleste eller alle av prøvene som testes. Slike polypeptider er komplementære. Omtrent 25-30% av sera fra tuberkuloseinfiserte individer er negative for antistoffer til et hvilket som helst enkelt protein. Komplementære polypeptider kan derfor, bli brukt i kombinasjon for å forbedre sensitiviteten til en diagnostisk test.

Det er forskjellige analyseformater kjent for en fagperson innen feltet for anvendelse av en eller flere polypeptider for å detektere antistoffer i en prøve. Se f.eks. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.

I en analyse er det mulig og anvende polypeptid immobilisert på et fast støttemateriale for å binde til å fjerne antistoffer fra prøven. Den bundede antistoffet kan deretter detekteres ved å bruke et deteksjonsreagens som inneholder en reportergruppe. Egnede deteksjonsreagenser inkluderer antistoffer som bindes til antistoff/polypeptidkomplekset og fritt polypeptid merket med en reportergruppe (f.eks. i en semikonkurrerende analyser). Alternativt, kan en konkurrerende analyse benyttes, hvor i et antistoff som bindes til polypeptidet er merket med en reportergruppe å tillater å binde til det immobiliserte antigenet etter inkubering av antigenet med prøven. Graden hvor ved komponentene fra prøven inhiberer binding av det merkede antistoffet til polypeptidet er indikativ på reaktiviteten til prøven med det immobiliserte polypeptidet.

Det faste støttematerialet kan være et hvilket som helst fast materiale kjent for en fagperson innen feltet til hvilket antigenet kan være festet. F.eks., kan støttematerialet være en testbrønn i en mikrotiterplate eller mikrocellulose eller annen egnet membran. Alternativt, kan støttemateriale være en kule eller plate (dise) slik som glass, fiberglass, lateks eller et plastisk materiale slik som polystyren eller polyvinylklorid. Støttematerialet kan også være en magnetisk partikkel eller en fiberoptisk sensor, slik som de som er beskrevet, f.eks., i U.S. patent nr. 5,359,681.

Polypeptidene kan bindes til et fast materiale ved å bruke forskjellige teknikker kjent innen fagfeltet. I sammenheng med den foreliggende oppfinnelse, referer "binding" seg til både ikke kovalent assosiering, slik som absorpsjon, og kovalent binding (som kan være en direkte kobling mellom antigenet og funksjonelle grupper på støttemateriale eller kan være en binding via et kryssbindende middel). Binding ved adsorpsjon til en brønn i en mikrotiterplate eller til en membran er foretrukket. I slike tilfeller, kan absorpsjon oppnås ved å bringe i kontakt polypeptidet, i en egnet buffer, med et fast støttemateriale for en egnet tidsperiode. Kontakttiden varierer med temperaturen, men er typisk mellom 1 time og 1 dag. Generelt, i kontakt en brønn fra en plastisk mikrotiterplate (slik som polystyren eller polyvinylklorid) med en mengde av polypeptid varierende fra omtrent 10 ng til omtrent 1 ug, og fortrinnsvis omtrent 100 ng er tilstrekkelig for å binde en adekvat mengde av antigen.

Kovalent binding av polypeptidet til et fast støttemateriale kan generelt oppnås ved først å reagere støttematerialet med et bifunksjonelt reagens som vil reagere med både støttematerialet og en funksjonell gruppe, slik som hydroksyl eller aminogruppe, på polypeptidet. F.eks., kan polypeptidet bindes til støttemateriale som har en egnet polymerovertrekk ved å bruke benzoquinon eller ved kondensering av en aldehydgruppe på støttematerialet med et amin og et aktivt hydrogen på polypeptidet (se f.eks., Pierce Immunotechonoly Catalog and Handbook, 1991, ved A12-A13).

I visse utførelsesformer, er analysen en enzymkoblet immunosorbentanalyse (ELISA). Denne analysen kan utføres ved først å bringe i kontakt et fusjonspolypeptidantigen som har blitt immobilisert på et fast støttemateriale, vanligvis brønn i en mikrotiterplate, med prøven, slik at antistoffene til polypeptidet i prøven får lov til å binde seg til det immobiliserte polypeptidet. Ubunden prøve blir deretter fjernet fra immobilisert polypeptid og et deteksjonsreagens som er i stand til å binde det immobiliserte antistoffpolypeptidkomplekset blir tilsatt. Mengden av deteksjonsreagens som forblir bundet til det faste støttematerialet blir deretter bestemt ved å bruke en fremgangsmåte som er egnet for det spesifikke deteksjonsreagenset.

Mer spesifikt, når polypeptidet er immobilisert på støttematerialet som er beskrevet over, blir de gjenværende proteinbindingssetene på støttematerialet blokkert. Et hvilket som helst egnet blokkeringsmaterialet kjent for de som kjenner fagfeltet, slik som bovin serum albumin eller Tween 20™ (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) kan anvendes. Det immobiliserte polypeptidet blir deretter inkubert med prøven og antistoffet får lov til å bindes til antigenet. Prøven blir fortynnet med et egnet fortynningsmiddel, slik som fosfatbufret saltvann (PBS) forutfor inkubering. Generelt, er den egnede kontakttiden en periode som er tilstrekkelig for å detektere tilstedeværelse av antistoff i en M. tuberculosisinfisert prøve. Fortrinnsvis, er kontakttiden tilstrekkelig for å oppnå et nivå av binding som er minst 95% av den oppnådde ved likevekt mellom bundet og ubundet antistoff. De som kjenner fagfeltet vil gjenkjenne at tiden som er nødvendig for å oppnå likevekt kan lette bestemmes ved å analysere nivået av binding som forekommer over en tidsperiode. Ved romtemperatur, er en inkuberingstid på omtrent 30 minutter tilstrekkelig.

Ubundet prøve kan deretter fjernes ved å vaske det faste støttemateriale med en egnet buffer, slik som PBS som inneholder 0,1% Tween 20. Deteksjonsreagenser kan deretter bli tilsatt til det faste støttematerialet. Et egnet deteksjonsreagens i en hvilken som helst forbindelse som bindes til immobilisert antistoff-polypeptidkompleks og som kan detekteres ved en hvilken som helst metode kjent for fagpersoner. Fortrinnsvis, inneholder deteksjonsreagenset et bindingsmiddel (f.eks. protein A, protein G, lektin eller fritt antigen) konjugert til en reportergruppe. Reportergrupper kan inkludere enzymer (slik som pepperrotperoksidase), substrater, kofaktorer, inhibitorer, farger, radionukleotider, luminisensgrupper, fluoresensgrupper, biotin og kolloidalpartikler, slik som kolloidalt gull og selenium. Konjugasjon av bindingsmidlet til reportergruppen kan oppnås ved å bruke standardmetoder kjent for de som kjenner fagfeltet. Vanlige bindingsmidler kan også kjøpes konjugert til forskjellige reportergrupper fra mange kommersielle kilder (f.eks. Zymed Laboratories, San Francisco, CA, og Pierce, Rockford. IL).

Deteksjonsreagensene ble deretter inkubert med immobilisert antistoff-polypeptidkompleks for en tidsperiode som er tilstrekkelig for å detektere bundet antistoff. En egnet tidsperiode kan generelt bestemmes ut fra forhandlerens instruksjoner eller ved å analysere nivået av binding som forekommer over en tidsperiode. Ubundet deteksjonsreagens blir deretter fjernet og bundet deteksjonsreagens blir detektert ved å bruke reportergruppen. Metoden som anvendes ved å detektere reportergruppen avhenger av egenskapen til reportergruppen. For radioaktive grupper, er scintillasjonstelling eller autoradiografiske metoder egnet. Spektroskopiske fremgangsmåter kan bli brukt for å detektere farger, luminiscensgrupper og fluorescensgrupper. Biotin kan detekteres ved å bruke avidin, koblet til forskjellige reportergrupper (vanligvis en radioaktiv eller fluoresensgruppe eller et enzym). Enzymreportergrupper kan generelt detekteres ved tilsetning av substrat (generelt for en spesifikk tidsperiode), etterfulgt av spektroskopiske eller andre analyser av reaksjonsproduktene.

For å bestemme tilstedeværelse eller fravær av anti - M. tuberculosis antistoffer i prøven, forblir signalet detektert fra reportergruppen bundet til det faste støttemateriale generelt sammenlignet med et signal som korresponderer til en på forhånd bestemt "cut-off' verdi. "Cut-off er verdien gjennomsnittssignalet ervervet når det immobiliserte antigenet blir inkubert med prøvene fra en uinfisert pasient. Generelt, er en prøve som danner et signal som er tre standardavvik over den på forhånd bestemt "cut-off verdien betraktet positivt for tuberkulose. "Cut-off verdien kan bestemmes ved å bruke en Receiver Operator Curve i samsvar med fremgangsmåten til Sackett et al, 1985, Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., sidene 106-107. Videre kan "cut-off verdien bli bestemt fra et plott av par av positive rater (sensitivitet) og falske positive rater (100% spesifisitet) som korresponderer til hver mulig "cut-off verdi for det diagnostiske testresultatet. "Cut-off verdien til plottet som er nærmest venstre øverste hjørne (dvs. verdien som inneholder det største arealet) er den mest nøyaktige "cut-off verdien, og prøven danner et signal som er høyere enn "cut-off verdien bestemt ved denne metoden kan betraktes som positive. Alternativt, kan "cut-off verdien flyttes til venstre langs plottet, for å minimalisere den falske positive raten, eller til høyre, for å minimalisere den falske negative raten. Generelt, en prøve som danner et signal som er høyere enn "cut-off verdien bestemt ved denne metoden betraktes som positiv for tuberkulose.

Analysen kan utføres i en rask gjennomstrømning eller remsetestformat, hvor i antigenet blir immobilisert på membran, slik som nitrocellulose. I gjennomstrømningstesten, passerer antistoffene i prøven bundet til det immobiliserte polypeptidet i mens prøven passerer gjennom membranen. Et deteksjonsreagens (f.eks. protein A-kolloidal gull) bindes deretter til antistoff-polypeptidkomplekset siden løsningen inneholder deteksjonsreagenset strømmer gjennom membranen. Deteksjonen av bundet deteksjonsreagens kan deretter utføres som beskrevet over. I remsetestformatet, blir en ende av membranen hvor polypeptidet er bundet sunket ned i en løsning som inneholder prøven. Prøven beveger seg langs membranen gjennom en region som inneholder deteksjonsreagenset og til området for det immobiliserte polypeptidet. Konsentrasjonen av deteksjonsreagenset ved polypeptidet indikerer tilstedeværelse av anti - M. tuberculosis antistoffer i prøven. Typisk, danner konsentrasjonen av deteksjonsreagens på det stedet et mønster, slik som en linje, som kan leses visuelt. Fravær av slik mønster indikerer at prøven er negativ. Generelt, blir mengden av polypeptidet immobilisert på membranen selektert for å danne et visuelt mønster som kan skjelnes når den biologiske prøven inneholder et nivå av antistoffer som ville være tilstrekkelig for å danne et positivt signal i en ELISA, som diskutert over. Fortrinnsvis, varierer mengde av polypeptid immobilisert på membranen fra omtrent 5 ng til omtrent 1 ug, og mer foretrekkbart fra omtrent 50 ng til omtrent 500 ng. Slike tester kan typisk utføres med en veldig liten mengde (f.eks. en dråpe) av pasient-serum eller blod.

Oppfinnelsen har blitt beskrevet, de følgende eksemplene fremsettes for å illustrere oppfinnelsen.

EKSEMPEL:FUSJONSPROTEINENE TILM TUBERCULOSISATSTIGETSER

BIBEHOLDER IMMUNIGENITET TIL DE INDIVIDUELLE KOMPONENTENE

MATERIALER OG METODER

KONSTRUKSJON AV FUSJONSPROTEINER

De kodene sekvensene til M. tuberculosisantigener når de blir modifisert ved PCR for å lette deres fusjon og deretter ekspresjon av fusjonsproteinet. DNA amplifiseringen ble utført ved å bruke 10 ul 10X Pfu buffer, 2 |xl 10 mM dNTP, 2 ul av hver PCR primer ved 10 uM konsentrasjon, 81,5 ul vann, 1,5 ul Pfu DNA polymerase (Stratagene, La Jolla, CA) og 1 ul DNA ved enten 70 ng/ml (for TbRa3 antigen) eller 50 ng/ml (for 38 kD og Tb38-1 antigener). For TbRa3 antigen, ble denaturering ved 94°C utført i 2 minutter, etterfulgt av 40 cykler med 96°C i 15 sekunder og 72°C i 1 minutt og til slutt 72°C i 4 minutter. For 38 kD antigen, ble denaturering ved 96°C utført i 2 minutter, etterfulgt av 40 cykler med 96°C i 30 sekunder, 68°C i 15 sekunder og 72°C i 3 minutter, og til slutt ved 72°C i 4 minutter. For Tb38-1 antigen, ble denaturering ved 94°C i 2 minutter etterfulgt av 10 cykler med 96°C i 15 sekunder, 68°C i 15 sekunder og 72°C i 1,5 minutt, 30 cykler ved 96°C i 15 sekunder, 64°C i 15 sekunder og 72°C i 1,5 minutt, og til slutt 72°C i 4 minutter.

Etter kutting med et restriksjonsendonuklease for å gi ønskede kohesive eller butte ender, ble polynukleotid spesifikke for hver fusjonspolypeptid ligert inn i et ekspresjonsplasmid. Hver resulterende plasmid inneholdt de kodene sekvensene for individuelle antigener fra hver fusjonspolypeptid. Ekspresjonsvektoren som ble brukt var pET-12b og pT7<A>L2 ILI 1.

Tre kodende sekvenser for antigenet Ral2, TbH9 og Ra35 ble ligert for å kode for et fusjonsprotein (SEQ ID NO: 1 og 2) (figur IA og 2B). Tre andre kodene sekvenser for antigenene Erdl4 DPV og MTI ble ligert for å kode for et andre fusjonsprotein (SEQ ID NO: 3 og 4) (figur 2). Tre kodende sekvenser for antigenene TbRa3, 38kD og Tb38-1 ble ligert for å kode et fusjonsprotein (SEQ ID NO: 5 og 6) (figur 3A - 3D). To kodende sekvenser for antigene TbH9 og Tb38-1 ble ligert for å kode for et fusjonsprotein (SEQ ID NO: 7 og 8) (figur 4A - 4D). Fire kodende sekvenser for antigenene TbRa3, 38kD, Tb38-1 og DPEP ble ligert for kode for et fusjonsprotein (SEQ ID NO: 9 og 10) (figur 5A - 5J). Fire kodende sekvenser for å antigenene Erdl4, DPC, MT1, MSL og MTCC2 ble ligert for å kode for et fusjonsprotein (SEQ ID NO: 11 og 12) (figur 6A og 6B). Fire kodene sekvenser for antigenene Erdl4, DPV, MTI og MSI ble ligert for å kode for et fusjonsprotein (SEQ ID NO: 13 og 14) (figur 7A og 7B). Fire kodende sekvenser for å antigenene DPV;, MTI, MSL og MTCC2 ble ligert for å kode for et fusjonsprotein (SEQ ID NO: 15 og 16) (figur 8A og 8B). Tre kodende sekvenser for antivenene DPV, MTI og MSL ble ligert for å kode for et fusjonsprotein (SEQ ID NO: 17 og 18) (figur 9A og 9B). Tre kodende sekvenser for antigene TbH9, DPV og MTI ble ligert for å kode for et fusjonsprotein (SEQ ID NO: 19 og 20) (figur 10A og 10B). Tre kodende sekvenser for å angtigenene Erdl4, DPV og MTI ble ligert for å kode for et fusjonsprotein (SEQ ID NO: 21 og 22) (figur 1 IA og 1 IB). To kodende sekvenser for antigenene TbH9 og Ra35 ble ligert for å kode for et fusjonsprotein (SEQ ID NO: 23 og 24) (figur 12A og 12B). To kodende sekvenser for antigenene Ral2 og DPPD ble ligert for å kode for et fusjonsprotein (SEQ ID NO: 25 og 26) (figur 13A og 13B).

Tre rekombinante proteiner ble uttrykt i E. coli med seks histidinresidier ved den amino-terminale delen ved å bruke pET plasmidvektoren (pET-17b) og et T7 RNA polymeraseekspresjonssystem (Novagen, Madison Wi). E. coli stamme BL21 (DE3) pLysE (Novagen) ble brukt før høynivåekspresjon. Den rekombinante (His-Tag) fusjonsprotenene ble renset fra den løselige supernatanten eller den uløselige inklusjons-mengden av 500 ml av IPTG induserte batchkulturer ved affinitets-kromatografi ved å bruke ett trinns QIA ekspress Ni-NTA agarosematrisk (QIAGEN, Chatsworth, CA) med tilstedeværelse av 8M urea. I korthet, ble en 20 ml over natt mettet kultur med BL21 som inneholdt pET konstruksjon tilsatt itl 500 ml 2 x YT medium som inneholdt 50 ug/ml ampicillin og 34 ug/ml kloramfenikol, dyrket ved 37°C ved risting. De bakterielle kulturene ble indusert med 2mM IPTG ved en OD 560 på 0,3 og dyrket i ytterligere 3 timer (OD =1,3 til 1,9). Cellene ble høstet fra 500 ml kulturer ved sentrifugering og resuspendert i 20 ml bindingsbuffer (0,1 M natriumfosfat, pH 8,0; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) som inneholdt 2 mM PMSF og 20 ug/ml leupeptin pluss en fullstendig protease-inhibitortablett (Boehringer Mannheim) per 25 ml. E. coli ble lysert ved frysetining etterfult av en kort sonikering, deretter spunnet ned ved 12 k rpm i 30 minutter for å pelletere inklusjonssamlingene.

Inklusjonssamlingene ble vasket tre ganger i 1% CHAPS i 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). Dette trinnet reduserte heftig nivået av kontaminering av LPS. Inklusjonssamlingen ble til slutt løst i 20 ml bindingsbuffer som inneholdt 8 M urea eller 8 M urea ble tilsatt direkte til den løselige supernatanten. Rekombinante fusjonsproteiner med His-Tag residier ble "baten" bundet til Ni-NTA agarose resin (5 ml resin per 500 ml induksjoner) ved vipping ved romtemperatur i 1 time og deretter ble komplekset satt på en kolonne. Gjennomstrømningen fikk passere to ganger over samme kolonne og kolonnen ble vasket tre ganger med 30 ml hver av vaskebufferen (0,1 M natriumsulfat og 10 mM Tris-HCl, pH 6,3) som også inneholdt 8 M urea. Bundet protein ble eluert med 30 ml 150 mM immidazol i vaskebuffer og 5 ml fraksjoneringer ble samlet sammen. Fraksjonene som inneholdt hvert rekombinant fusjonsprotein ble samlet, dialysert mot 10 mM Tris HC1 (pH 8,0) bundet en eller flere ganger til Ni-NTA matriks, eluert og dialysert i 10 mM Tris-HCl (pH 7,8). Utbytte av det rekombinante proteinet varierte fra 25 til 150 mg per liter av indusert bakteriekultur med mer enn 98% renhet. Rekombinante proteiner ble analysert for endotoksinkontaminering ved å bruke Limulus analyse (BioWhittaker) og var kjent å inneholde < 10 E.U.Img.

T CELLEPROLIFIREIN GS AN AL YSE

Renset fusjonspolypeptider ble testet for evnen til å indusere T celleproliferering i perifere blodmononukleære celle (PBMC) prepareringer. PBMC fra donorene var kjent å være PPD hudtestpositive og hvis T celler ble vist å proliferere som en respons til PPD og råoppløselige proteiner fira M. tuberculosis ble dyrket i RPMI1640 supplert med 10% oppsamlet humant serum og 50 ug/ml gentamicin. Rensede polypeptider ble tilsatt i duplikat ved konsentrasjoner på 0,5 til 10 ug/ml. Etter seks dager med dyrking i 96 brønners rundbundede plater i et volum på 200 ul, ble 50 ul av mediumet fjernet fra hver brønn for å bestemme IFN-y nivåene, som beskrevet under. Platene ble deretter pulset med 1 uCi/per brønn av tritiert tymidin for ytterligere 18 timer, høstet og tritium-opptak ble bestemt ved å bruke en gassscintillasjonsteller. Fraksjoner som resulterte i proliferering i begge replikatene tre ganger større enn prolifereringen observert i celler dyrket i medium alene ble betraktet som positive.

INTERFERON- Y ANALYSE

Milt fra mus ble fjernet aseptisk og enkelcellesuspensjon fremstilt i fullstendig RPMI etter lysis av røde blodceller. 100 ul av celler (2 x 10"<5>celler) ble platet ut per brønn i en 96-brønners flatbunnet mikrotiterplate. Kulturene ble stimulert med et indikerte rekombinante proteinet i 24 timer og supernatanten analysert for IFN-y.

Nivåene av supernatant IFN-y ble analysert ved sandwich ELISA, ved å bruke antistoff-par og prosedyrer tilgjengelig fra PharMingen. Standardkurve ble fremstilt ved å bruke rekombinante muscytokiner. ELISA platene (Corning) ble trukket med 50 (il/brønn (1 ug/ml, i 0,1 M bikarbonat overtrekksbuffer, pH 9,6) av et cytokinoppfangings mAb (rotteantimus IFN-y (PharMingen; Cat. # 1818ID)), og inkubert i 4 timer ved romtemperatur. Rist ut plateinnholdene og blokker med PBS-0,05% Tween, 1,0% BSA (200 ul/brønn) over natten ved 4°C og vask 6 ganger i PBS-0,1% Tween. Standarder (muse IFN-y) og supernatantprøvene fortynnet i PBS-0,05% Tween, 0,1% PBSA ble deretter tilsatt i 2 timer ved romtemperatur. Platene ble vasket som over og deretter inkubert i 2 timer ved romtempertur med 100 fil/brønn av et annet Ab (biotonrotte a muse IFN-y (Cat. # 18112D; PharMingen)) ved 0,5 ug/ml fortynnet i PBS-0,05 Tween, 0,1% BSA. Etter vasking, ble platene inkubert med 100 ug/brønn av streptavidin-HRP (Zymed) ved en 1:2500 fortynning i PBS-0,05% Tween, 0,1% BSA ved romtemperatur i 1 time. Platene ble vasket en siste gang og fremkalt med 100fil/brønn TMB substrat (3,3', 5,5' — tetrametylbenzidin, Kirkegaard og Perry, Gaithersburg, MD) og reaksjonen ble stoppet etter fargefremkalling, med H2SO4, 50 ul/brønn. Absorbansen (OD) ble bestemt ved 450 nm ved å bruke 570 nm som en referansebølgelengde og cytokinkonsentrasjonen evaluert ved å bruke standardkurven.

RESULTATER

TRI- FUSJONSPROTEINER INDUSERTE IMMUNRESPONSER

Tre kodende sekvenser for M. tuberculosisantigener ble innsatt i en ekspresjonsvektor for produksjon av fusjonsprotein. Antigenene som ble kalt Ral2, TbH9 og Ra35 ble produsert som et rekombinant fusjonsprotein (figur IA og IB). Antigenene Erdl4, DPV og MTI ble produsert som et andre fusjonsprotein (figur 2). De to fusjonsproteinene ble affinitetsrenset for anvendelse i in vitro og i in vivo analyse.

De to fusjonsproteinene ble testet for deres evne til å stimulere T celleresponser fra seks PPD<+>individer. Når T celleproliferering ble målt, viste begge fusjonsproteinene et likt reaktivitetsmønster som deres individuelle komponenter (figur 14A-14F). Et lignende resultat ble ervervet når IFN-y produksjonen ble målt (figur 15A-15F). F.eks., responderte individ Dl60 til antigenene TbH9 og MTI individuelt. Individ Dl60 responderte også til fusjonsproteinene som inneholdt disse antigenene (figur 14B og 15B). I motsetning til, ble det ikke observert noen T cellerespons fra D160 til andre antigener individuelt. Et annet individ, D201, som ikke reagerte med antigenene Erdl4, DPV og MTI individuelt, var også ikke responsive til fusjonsproteinet som inneholdt disse antigenene. Det skal bemerkes at når T celleresponsene til individuelle komponenter av de to fusjonsproteinene ikke var spesielt sterk, stimulerte fusjonsproteiner responser som var lik til eller høyere enn den som ble indusert av individuelle antigener i de fleste tilfeller.

Ral2-TbH9-Ra35 tri-fusjonsprotein ble også testet som et immunogen in vivo. I disse eksperimentene, ble fusjonsproteinet injisert inn i fotsålen til mus for immunisering. Hver gruppe på tre mus mottok proteinet i forskjellige adjuvansformuleringer: SB AS le, SBAS2 (Ling et al., 1997, Vaccine 15:1562-1567), SMAS7 og AL(OH)3. Etter to subkutane immuniseringer med tre ukers intervaller, ble dyrene avlivet en uke senere, og deres drenerte lymfeknuter ble høstet for anvendelse som responsceller i T celleproliferering og cytokinproduksjonsanalyser.

Uansett hvilket adjuvans som ble brukt i immunisering, ble det indusert sterk T celleprolifereringsresponser mot TbH9 når den ble brukt som et individuelt antigen (figur 16A). Svakere responser ble indusert mot Ra35 og Ral2 (figur 16B og 16C). Når Ral2-TbH9-Ra35 fusjonsproteinet ble brukt som et immunogen, ble en respons lik den mot de individuelle komponentene observert.

Når cytokinproduksjonen ble målt, produserte adjuvansene SB AS le og SBAS2 likt IFN-y (figur 17) og IL-4 responser (figur 18). Imidlertid, produserte kombinasjonen av SBAS7 og aluminiumshydroksid det sterkeste IFN-y responsene og det laveste nivået av IL-4 produksjonen for alle tre antigenene. Med hensyn til humoral antistoffrespons in vivo, viste figur 19A-19F at fusjonsproteinet reiste både IgGiog IgG2aantigen-spesifikke responser når den ble brukt med en hvilken som helst av de tre adjuvantene.

I tillegg, ble C57BL/6 mus immunisert med en kombinasjon av to ekspresjons-konstruksjoner som hver inneholdt Ral2-TbH9-Ra35 (Mtb32A) eller Erdl4-DPV-MTI (Mtb39A) kodene sekvens som DNA vaksine. De immuniserte dyrene utviste signifikant beskyttelse mot tuberkulose ved en etterfølgende aerosolprovosering med levende bakterier. Basert på disse resultatene, ble en fusjonskonstruksjon av Mtb32A og Mtb39A kodene sekvens fremstilt, og dets kodene produkt testet i marsvin langtids-beskyttende modell. I disse studiene, ble marsvin immunisert med et enkelt rekombinant fusjonsprotein eller en blanding av Mtb32A og Mtb39A proteiner i formuleringer som inneholder et adjuvant. Figur 20A-20C viste at marsvin immunisert med fusjonsproteinet i SB AS le eller SBAS2 var bedre beskyttet mot utvikling av tuberkulose ved etterfølgende provosering, sammenlignet med dyr immunisert med to antigener i en blanding i samme adjuvantformulering. Fusjonsproteinene i SBAS2 formuleringen av den største beskyttelsen i dyrene. Derfor, kan fusjonsproteinene fra forskjellig M. tuberculosisantigener bli brukt som mer effektive immunogener i vaksineformuleringer enn en blanding av de individuelle komponentene.

BI- FUSJONSPROTEIN INDUSERT IMMUNRESPONSER

Et bi-fusjonsprotein som inneholder TbH-9 og Tb38-1 antigener uten en hengselsekvens ble produsert ved rekombinante metoder. Evnen til TbH9-Tb38-l fusjonsprotein til å indusere T celleproliferering og IFN-y produksjon ble undersøkt. PBMC fra tre donorer ble anvendt: en donor hadde tidligere vist å respondere til TbH9 men ikke til Tb38-1 (donor 131); en hadde vist å respondere til Tb38-1 men ikke til TbH9 (donor 184); og en hadde vist å respondere til begge antigenene (donor 201). Resultatene av disse studiene viste den funksjonelle aktiviteten til begge antigenene i fusjonsproteinet (figurene 21A og 2IB, 22A og 22B og 23A og 23B).

ET TETRA- FUSJONSPROTEIN SOM REAGERTE MED TUBERKULOSEPASIENT SERA

Et fusjonsprotein som inneholdt TbRa3, 38KD antigen, Tb38-1 og DPEP ble produsert ved rekombinante metoder. Reaktiviteten til dette tetra-fusjonsproteinet ble referert til som TbF-2 med sera fra M. tuberculosismfisette pasienter ble undersøkt med ELISA. Resultatene til disse studiene (tabell 1) viste at alle fire antigenene fungerte uavhengig i fusjonsproteinet.

En som kjenner fagfeltet vil forstå at rekkefølgen av de individuelle antigenene innenfor hvert fusjonsprotein kan endres og at sammenlignbar aktivitet kan forventes forutsatt at hvert av epitopene fortsatt er funksjonelt tilgjengelig. I tillegg, kan forkortede former av proteinet som inneholder aktive epitoper bli brukt i konstruksjonen av fusj onsprote inene.

Claims (35)

1. Immunogent polypeptid,karakterisert vedat det omfatter: (i) aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, eller en variant av nevnte aminosyresekvens inneholdende én eller flere aminosyredelesjoner, addisjoner eller substitusjoner og som har samme biologiske effekt; (ii) aminosyresekvensen til restene 2-596 ifølge SEQ ID NO: 24, eller en variant av nevnte aminosyresekvens inneholdende én eller flere aminosyredelesjoner, addisjoner eller substitusjoner og som har samme biologiske effekt. (iii) aminosyresekvens kodet for av et polynukleotid som omfatter en første nukleotidsekvens som hybridiserer under moderate stringente betingelser med en andre nukleotidsekvens som er komplementær med en tredje nukleotidsekvens som koder for aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, der nevnte første nukleotidsekvens koder for et polypeptid som bibeholder immunogenisiteten til aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, eller iv) aminosyresekvens kodet for av et polynukleotid som omfatter en første nukleotidsekvens som hybridiserer under moderate stringente betingelser med en andre nukleotidsekvens som er komplementær med en tredje nukleotidsekvens som koder for aminosyresekvensrestene 2-596 ifølge SEQ ID NO: 24, der nevnte første nukleotidsekvens koder for et polypeptid som bibeholder immunogenisiteten til aminosyresekvensen til restene 2-596 ifølge SEQ ID NO: 24.

2. Immunogent polypeptid ifølge krav 1,karakterisertv e d at det omfatter av: (i) aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, eller en variant av nevnte aminosyresekvens inneholdende én eller flere aminosyredelesjoner, addisjoner eller substitusjoner og som har den samme biologiske effekt, eller (ii) aminosyresekvensen til restene 2-596 i følge SEQ ID NO: 24, eller en variant av nevnte aminosyresekvens inneholdende én eller flere aminosyredelesjoner, addisjoner eller substitusjoner og som har samme biologiske effekt.

3. Immunogent polypeptid ifølge krav 2,karakterisertved at det består av: (i) aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, eller en variant av nevnte aminosyresekvens inneholdende én eller flere aminosyredelesjoner, addisjoner eller substitusjoner og som har den samme biologiske effekt, eller (ii) aminosyresekvensen til restene 2-596 i følge SEQ ID NO: 24, eller en variant av nevnte aminosyresekvens inneholdende én eller flere aminosyredelesjoner, addisjoner eller substitusjoner og som har samme biologiske effekt.

4. Immunogent polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 2 eller 3,karakterisert vedat det omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, eller en variant av nevnte aminosyresekvens inneholdende én eller flere aminosyredelesjoner, addisjoner eller substitusjoner og som har samme biologiske effekt.

5. Immunogent polypeptid ifølge er hvilket som helst av kravene 2 eller 3,karakterisert vedat det omfatter aminosyresekvensen til restene 2-596 ifølge SEQ ID NO: 24, eller en variant av nevnte aminosyresekvens inneholdende én eller flere aminosyredelesjoner, addisjoner eller substitusjoner og som har samme biologiske effekt.

6. Immunogent polypeptid ifølge krav 2 eller 3,karakterisertv e d at det omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2.

7. Immunogent polypeptid ifølge krav 2 eller 3,karakterisertv e d at det omfatter aminosyresekvensen til restene 2-596 i følge SEQ ID NO: 24.

8. Immunogent polypeptid ifølge krav 1,karakterisertved at det omfatter (i) aminosyresekvens kodet for av et polynukleotid som omfatter en første nukleotidsekvens som hybridiserer under moderate stringente betingelser med en andre nukleotidsekvens som er komplementær med en tredje nukleotidsekvens som koder for aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, der nevnte første nukleotidsekvens koder for et polypeptid som bibeholder immunogenisiteten til aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, eller ii) aminosyresekvens kodet for av et polynukleotid som omfatter en første nukleotidsekvens som hybridiserer under moderate stringente betingelser med en andre nukleotidsekvens som er komplementær med en tredje nukleotidsekvens som koder for aminosyresekvensrestene 2-596 ifølge SEQ ID NO: 24, der nevnte første nukleotidsekvens koder for et polypeptid som bibeholder immunogenisiteten til aminosyresekvensen til restene 2-596 ifølge SEQ ID NO: 24.

9. Immunogent polypeptid ifølge krav 8,karakterisertv e d at det omfatter en aminosyresekvens kodet for av et polynukleotid som omfatter en første nukleotidsekvens som hybridiserer under moderate stringente betingelser med en andre nukleotidsekvens som er komplementær med en tredje nukleotidsekvens som koder for aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, der nevnte første nukleotidsekvens koder for et polypeptid som bibeholder immunogenisiteten til aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2.

10. Immunogent polypeptid i følge krav 9,karakterisertv e d at det omfatter en aminosyresekvens kodet for av et polynukleotid som omfatter én første nukleotidsekvens som hybridiserer under høyt stringente betingelser med én andre nukleotidsekvens som er komplementær med én tredje nukleotidsekvens som koder for aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, der nevnte første nukleotidsekvens koder for et polypeptid som bibeholder immunogenisiteten til aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2.

11. Immunogent polypeptid i følge krav 8,karakterisertv e d at det omfatter en aminosyresekvens kodet for av et polynukleotid som omfatter én første nukleotidsekvens som hybridiserer under moderat stringente betingelser med én andre nukleotidsekvens som er komplementær med én tredje nukleotidsekvens som koder for aminosyresekvensen til restene 2-596 ifølge SEQ ID NO: 24, der nevnte første nukleotidsekvens koder for et polypeptid som bibeholder immunogenisiteten til aminosyresekvensen til restene 2-596 ifølge SEQ ID NO: 24.

12. Immunogent polypeptid i følge krav 11,karakterisertv e d at det omfatter en aminosyresekvens kodet for av et polynukleotid som omfatter én første nukleotidsekvens som hybridiserer under høyt stringente betingelser med én andre nukleotidsekvens som er komplementær med én tredje nukleotidsekvens som koder for aminosyresekvensen til restene 2-596 ifølge SEQ ID NO: 24, der nevnte første nukleotidsekvens koder for et polypeptid som bibeholder immunogenisiteten til aminosyresekvensen til restene 2-596 ifølge SEQ ID NO: 24.

13. Polynukleotid,karakterisert vedat det omfatter en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid i følge et hvert av kravene 1 til 12.

14. Polynukleotid i følge krav 13,karakterisert vedat det omfatter en nukleotidsekvens valgt fra SEQ ID NO: 1 og 23 eller en sekvens som koder for det samme genproduktet.

15. Polynukleotid i følge krav 14,karakterisert vedat det omfatter en nukleotidsekvens valgt fra SEQ ID NO: 1 og 23.

16. Polynukleotid i følge krav 13,karakterisert vedat det består av en nukleotidsekvens valgt fra SEQ ID NO: 1 og 23 eller en sekvens som koder for det samme genproduktet.

17. Polynukleotid i følge krav 16,karakterisert vedat det består av en nukleotidsekvens valgt fra SEQ ID NO: 1 og 23.

18. Polynukleotid i følge krav 13 ,karakterisert vedat det omfatter: (i) en første nukleotidsekvens som hybridiserer under moderate stringente betingelser med én andre nukleotidsekvens som er komplementær med én tredje nukleotidsekvens som koder for aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, der nevnte første nukleotidsekvens koder for et polypeptid som bibeholder immunogenisiteten til aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, eller ii) en første nukleotidsekvens som hybridiserer under moderate stringente betingelser med én andre nukleotidsekvens som er komplementær med én tredje nukleotidsekvens som koder for aminosyresekvensen til restene 2-596 ifølge SEQ ID NO: 24, der nevnte første nukleotidsekvens koder for et polypeptid som bibeholder immunogenisiteten til aminosyresekvensen til restene 2-596 ifølge SEQ ID NO: 24.

19. Polynukleotid i følge krav 18,karakterisert vedat det omfatter én første nukleotidsekvens som hybridiserer under moderate stringente betingelser med én andre nukleotidsekvens som er komplementær med én tredje nukleotidsekvens som koder for aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, der nevnte første nukleotidsekvens koder for et polypeptid som bibeholder immunogenisiteten til aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2.

20. Polynukleotid i følge krav 19,karakterisert vedat det omfatter én første nukleotidsekvens som hybridiserer under høyt stringente betingelser med én andre nukleotidsekvens som er komplementær med én tredje nukleotidsekvens som koder for aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, der nevnte første nukleotidsekvens koder for et polypeptid som bibeholder immunogenisiteten til aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2.

21. Polynukleotid i følge krav 18,karakterisert vedat det omfatter én første nukleotidsekvens som hybridiserer under moderate stringente betingelser med én andre nukleotidsekvens som er komplementær med én tredje nukleotidsekvens som koder for aminosyresekvensen til restene 2-596 ifølge SEQ ID NO: 24, der nevnte første nukleotidsekvens koder for et polypeptid som bibeholder immunogenisiteten til aminosyresekvensen til restene 2-596 ifølge SEQ ID NO: 24.

22. Polynukleotid i følge krav 21,karakterisert vedat det omfatter én første nukleotidsekvens som hybridiserer under høyt stringente betingelser med én andre nukleotidsekvens som er komplementær med en nukleotidsekvens som koder for aminosyresekvensen til restene 2-596 ifølge SEQ ID NO: 24, der nevnte første nukleotidsekvens koder for et polypeptid som bibeholder immunogenisiteten til aminosyresekvensen til restene 2-596 ifølge SEQ ID NO: 24.

23. Immunogent polypeptid i følge et hvilket som helst av kravene 1 til 12,karakterisert vedat nevnte polypeptid er fusjonert til et andre heterologt polypeptid.

24. Farmasøytisk sammensetning,karakterisert vedat den omfatter: (i) polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 12 eller 23 eller (ii) polynukleotid ifølge et hvilket som helst av kravene 13 til 22.

25. Farmasøytisk sammensetning i følge krav 24,karakterisertv e d at den omfatter et polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 12 eller 23.

26. Farmasøytisk sammensetning i følge krav 24,karakterisertv e d at den omfatter et polynukleotid ifølge et hvilket som helst av kravene 13 til 22.

27. Ekspresjonsvektor,karakterisert vedat den omfatter et polynukleotid ifølge et hvilket som helst av kravene 13 til 22.

28. Ekspresjonsvektor ifølge krav 27,karakterisert vedat den er en viral vektor.

29. Vaksinesammensetning,karakterisert vedat den omfatter: (i) polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 12 eller 23 og en adjuvant eller, (ii) polynukleotid ifølge et hvilket som helst av kravene 13 til 22.

30. Vaksinesammensetning i følge krav 29,karakterisertv e d at den omfatter et polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 12 eller 23 og en adjuvant.

31. Vaksinesammensetning i følge krav 29,karakterisertv e d at den omfatter et polynukleotid ifølge et hvilket som helst av kravene 13 til 22.

32. Anvendelse av et polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 12 eller 23 for fremstilling av et medikament til behandling eller forebygging av M. tuberculosis-infeksjon.

33. Anvendelse av et polynukleotid ifølge et hvilket som helst av kravene 13 til 22 for fremstilling av et medikament for behandling eller forebygging av M. tuberculosis-infeksjon.

34. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 12 eller 23karakterisert vedat det omfatter rekombinant ekspresjon av et polynukleotid ifølge et hvilket som helst av kravene 13 til 22.

35. Isolert vertscelle,karakterisert vedat den rekombinant uttrykker et polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 12 eller 23.