CZ302870B6 - Polynukleotid, polypeptid, farmaceutický prostredek, vakcínový prostredek a jejich použití k lécbe a prevenci infekce tuberkulózou - Google Patents
Polynukleotid, polypeptid, farmaceutický prostredek, vakcínový prostredek a jejich použití k lécbe a prevenci infekce tuberkulózou Download PDFInfo
- Publication number
- CZ302870B6 CZ302870B6 CZ20003652A CZ20003652A CZ302870B6 CZ 302870 B6 CZ302870 B6 CZ 302870B6 CZ 20003652 A CZ20003652 A CZ 20003652A CZ 20003652 A CZ20003652 A CZ 20003652A CZ 302870 B6 CZ302870 B6 CZ 302870B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- nucleotide sequence
- polypeptide
- polynucleotide
- encodes
- tuberculosis
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 133
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 127
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 127
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 title claims abstract description 88
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 46
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims abstract description 46
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 46
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 29
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 16
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 58
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 57
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 25
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 claims abstract description 18
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000014828 interferon-gamma production Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 27
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 19
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 18
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 13
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 claims description 11
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims description 8
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 claims description 8
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 claims description 7
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 4
- 108091008717 AR-A Proteins 0.000 claims 1
- 101000831256 Oryza sativa subsp. japonica Cysteine proteinase inhibitor 1 Proteins 0.000 claims 1
- 235000005658 Spondias pinnata Nutrition 0.000 claims 1
- 244000025012 Spondias pinnata Species 0.000 claims 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 claims 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 claims 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 100
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 100
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 100
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 88
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 87
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 69
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 58
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 description 49
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 31
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 31
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 29
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 25
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 25
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 25
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 18
- 230000004044 response Effects 0.000 description 18
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 17
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 15
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 15
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 15
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 13
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 12
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 10
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 10
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 9
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 9
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 9
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- -1 protine Chemical compound 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 229920006316 polyvinylpyrrolidine Polymers 0.000 description 7
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 7
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 6
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 6
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 6
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 6
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 5
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 5
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 3
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 3
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 3
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 3
- 101100224410 Solanum tuberosum DPEP gene Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N alpha-aminobutyric acid Chemical compound CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 3
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GMRQFYUYWCNGIN-UHFFFAOYSA-N 1,25-Dihydroxy-vitamin D3' Natural products C1CCC2(C)C(C(CCCC(C)(C)O)C)CCC2C1=CC=C1CC(O)CC(O)C1=C GMRQFYUYWCNGIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 101001044384 Mus musculus Interferon gamma Proteins 0.000 description 2
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 2
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 2
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 2
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 2
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- GMRQFYUYWCNGIN-NKMMMXOESA-N calcitriol Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](CCCC(C)(C)O)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)C[C@H](O)C1=C GMRQFYUYWCNGIN-NKMMMXOESA-N 0.000 description 2
- 229960005084 calcitriol Drugs 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 2
- 230000017307 interleukin-4 production Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 2
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 210000001533 respiratory mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-(tert-butylamino)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(C)(C)C MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N (2s)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N (2s)-2-amino-3,3-dimethylbutanoic acid Chemical compound CC(C)(C)[C@H](N)C(O)=O NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 1
- HZLCGUXUOFWCCN-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxynonadecane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCC(C(O)=O)C(O)(C(O)=O)CC(O)=O HZLCGUXUOFWCCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 108010088365 B6 peptide Proteins 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000581364 Clinitrachus argentatus Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000004338 Dichlorodifluoromethane Substances 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- CEXINUGNTZFNRY-BYPYZUCNSA-N Gly-Cys-Gly Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC([O-])=O CEXINUGNTZFNRY-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 1
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N L-alpha-phenylglycine zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 125000000773 L-serino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])*)C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 240000007472 Leucaena leucocephala Species 0.000 description 1
- 235000010643 Leucaena leucocephala Nutrition 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 1
- UTGQNNCQYDRXCH-UHFFFAOYSA-N N,N'-diphenyl-1,4-phenylenediamine Chemical compound C=1C=C(NC=2C=CC=CC=2)C=CC=1NC1=CC=CC=C1 UTGQNNCQYDRXCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 235000004338 Syringa vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000297179 Syringa vulgaris Species 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- FHICGHSMIPIAPL-HDYAAECPSA-N [2-[3-[6-[3-[(5R,6aS,6bR,12aR)-10-[6-[2-[2-[4,5-dihydroxy-3-(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]ethoxy]ethyl]-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]oxy-5-hydroxy-2,2,6a,6b,9,9,12a-heptamethyl-1,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-tetradecahydropicene-4a-carbonyl]peroxypropyl]-5-[[5-[8-[3,5-dihydroxy-4-(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]octoxy]-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxyoxan-2-yl]propoxymethyl]-5-hydroxy-3-[(6S)-6-hydroxy-2,6-dimethylocta-2,7-dienoyl]oxy-6-methyloxan-4-yl] (2E,6S)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-methylocta-2,7-dienoate Chemical compound C=C[C@@](C)(O)CCC=C(C)C(=O)OC1C(OC(=O)C(\CO)=C\CC[C@](C)(O)C=C)C(O)C(C)OC1COCCCC1C(O)C(O)C(OCC2C(C(O)C(OCCCCCCCCC3C(C(OC4C(C(O)C(O)CO4)O)C(O)CO3)O)C(C)O2)O)C(CCCOOC(=O)C23C(CC(C)(C)CC2)C=2[C@@]([C@]4(C)CCC5C(C)(C)C(OC6C(C(O)C(O)C(CCOCCC7C(C(O)C(O)CO7)OC7C(C(O)C(O)CO7)O)O6)O)CC[C@]5(C)C4CC=2)(C)C[C@H]3O)O1 FHICGHSMIPIAPL-HDYAAECPSA-N 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229940040563 agaric acid Drugs 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000001355 anti-mycobacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 239000003914 blood derivative Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 1
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 1
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 229940099112 cornstarch Drugs 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N dichlorodifluoromethane Chemical compound FC(F)(Cl)Cl PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019404 dichlorodifluoromethane Nutrition 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008298 dragée Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 1
- 229940079360 enema for constipation Drugs 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- UHCBBWUQDAVSMS-UHFFFAOYSA-N fluoroethane Chemical compound CCF UHCBBWUQDAVSMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 230000001279 glycosylating effect Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003979 granulating agent Substances 0.000 description 1
- 238000011554 guinea pig model Methods 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 238000012623 in vivo measurement Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000019734 interleukin-12 production Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000006674 lysosomal degradation Effects 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 125000000250 methylamino group Chemical group [H]N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000003883 ointment base Substances 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000016412 positive regulation of cytokine production Effects 0.000 description 1
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 1
- 229940116317 potato starch Drugs 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000029983 protein stabilization Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229940100486 rice starch Drugs 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 235000015424 sodium Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000007909 solid dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000002511 suppository base Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 1
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N trichlorofluoromethane Chemical compound FC(Cl)(Cl)Cl CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940029284 trichlorofluoromethane Drugs 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 229940100445 wheat starch Drugs 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
- A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Rešení se týká polynukleotidu obsahujícího prvou nukleotidovou sekvenci, která za mírne stringentních podmínek hybridizuje s druhou nukleotidovou sekvencí, jež je komplementární k tretí nukleotidové sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvenci uvedenou v nároku 1, pricem uvedená prvá nukleotidová sekvence kóduje polypeptid, který je schopen indukce imunogenní odpovedi na TbRa12, TbH9 a TbRa35 v testu proliferace T bunek, nebo v testu produkce interferonu gama, nebo hybridizuje za mírne stringentních podmínek s druhou nukleotidovou sekvencí, jež je komplementární k tretí nukleotidové sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvenci uvedou v nároku 1, pricemž uvedená prvá nukleotidová sekvence kóduje polypeptid, který je schopen indukce imunogenní odpovedi na TbH9 a TbRa35 v testu proliferace T bunek nebo v testu produkce interferonu gama. Dále se rešení týká polypeptidu kódovaného uvedeným polynukleotidem, jakož i farmaceutického prostredku a vakcínového prostredku, který uvedený polynukleotid ci polypeptid obsahuje, a jejich použití k lécbe a prevenci infekce tuberkulózou.
Description
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká fuzních proteinů, obsahujících alespoň dva antigeny Mycobacterium tuberculosis. Zejména se týká bi - fuzních proteinů, které obsahují dva samostatné antigeny M. tuberculosis, tri - fuzních proteinů, které obsahují tri antigeny M. tuberculosis, tetra - fuzních proteinů, které obsahují čtyři antigeny M. tuberculosis a penta - fuzních proteinů, které obsahují pět antigenů Af tuberculosis, a způsobů jejich použití pri diagnóze, léčbě a prevenci infekce tuberkulózy.
Dosavadní stav techniky
Tuberkulóza je chronické infekční onemocnění, způsobené infekcí M. tuberculosis. V rozvojových zemích to je závažné onemocnění a v rozvojové části světa jde o rostoucí problém, s přibližně 8 miliony nových případů a 3 miliony úmrtí každý rok. Ačkoliv infekce může být bez příznaků po značně dlouhou dobu, nemoc se obvykle projeví jako akutní zápal plic, mající za následek horečku a neproduktivní kašel. Jestliže je neléčena, typickým následkem jsou vážné komplikace a smrt.
Ačkoliv tuberkulóza může být obecně zvládnuta použitím širokospektrální antibiotické léčby, taková to léčba není postačující k prevenci rozšíření onemocnění. Infikovaní jednotlivci můžou být nějakou dobu bez příznaků, ale nakažliví. Dále, ačkoliv dodržení léčebného způsobu je rozhodující, chování pacienta je těžké sledovat. Někteří pacienti nedokončí léčebnou kůru, což může vést k neefektivnosti léčby a vytvoření rezistence na léky. Pro kontrolu rozšíření tuberkulózy má největší význam účinné očkování a správná včasná diagnóza nemoci. Nyní je očkování živými bakteriemi nejúčinnější pro získání imunity. Nej obvyklejší Mycobacterium, používané pro tento účel, je Bacillus Calmette - Guerin (BCG), avirulentní kmen M. bovis. Nicméně bezpečnost a účinnost BCG je zdrojem polemiky a některé země jako Spojené státy tímto agens širokou veřejnost neočkují. Diagnóza tuberkulózy je obvykle ukončena kožním testem, který zahrnuje podkožní expozici tuberkulinu PPD (proteinový purifikovaný derivát). Odpověď antigen - specifických T lymfocytů má za následek měřitelné zatvrdnutí v místě injekce za 48 až 72 hodin po injekci, které ukazuje expozici mykobakteriální antigeny. Nicméně citlivost a specifita jsou problémem tohoto testu a jednotlivci očkovaní BCG nemůžou být významně odlišeni od infikovaných jednotlivců.
Zatímco makrofágy byly ve skutečnosti dokázány jako hlavní efektory imunity proti M. tuberculosis, T lymfocyty jsou převládající induktory této imunity. Nezbytná role T lymfocytů pri ochraně proti infekci M. tuberculosis je dokázána častým výskytem M. tuberculosis u pacientů se syndromem získaného selhání imunity z důvodu zničení CD4+ T lymfocytů asociovaných s virem způsobujícím AIDS (HIV). Na Mycobacterium reagující CD4+ T lymfocyty se ukázaly být silným producentem gama - interferonů (IFN - γ), které se, v tomto případě, ukázaly být v myších spouštěčem anti - mykobakteriálního účinku makrofágů. Zatímco úloha IFN - γ u lidí je málo jasná, studie ukázaly, že 1,25 - dihydroxy - vitamín D 3, buď samotný nebo v kombinaci s IFN - γ nebo s faktorem alfa potlačujícím nádor, aktivuje lidské makrofágy k inhibici infekce M. tuberculosis. Kromě toho je známo, že IFN - γ podněcuje lidské makrofágy k tvorbě 1,25 dihydroxy - vitamínu D 3. Podobně bylo ukázáno, že interleukín - 12 (IL - 12) hraje roli pri výtvorem rezistence proti infekci M. tuberculosis. Pro přehled imunologie infekce M. tuberculosis viz. Chán a Kaufmann, 1994, Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control, Bloom (ed.), ASM Press, Washington, DC.
- 1 CZ 302870 B6
Proto je potřeba zlepšit očkování a zdokonalit metody pro diagnózu, prevenci a léčení tuberkulózy.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu polynukleotid obsahující prvou nukleotidovou sekvenci, která za mírně stringentních podmínek hybridizuje s druhou nukleotidovou sekvencí, jež je komplementární k třetí nukleotidové sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvenci:
mhhhhhhtaasdkfcisggc I »1 tol?0 G Γ A I P 1 G Ů A b A I A G 0 I 8 S C G G S P T Y Η 1 C P T A f -Tb to!2 - —— iGLCYYDNXGbGARVQRVYCSAPAASLGlSlCO -,- Ib Rol2VlIAVSGAPINSAfAUAOAlNCHHPCOytSVTWO
-Tb ftjl2TKSGCTRTCNVILAEGPPAEFKYDfGAlPPEIM -Ib Bel2-1 I-ft »SARIIYAGPGSASLVAAAQMROSVASOLFSAASA .— ' Tb » ' -----fOSV¥»GLTVGS»ICSSACLM¥AAASPY¥Af«SY
-Tb»I A C 0 A E L T A A 0 ¥ R ¥ A A A A Y f T A Y G L f V P P P V t A —— ..............Tb» ............
ENRAELRltlATNlLCORTPAlAVNEAEYCEUV -Tb »
AÚDAAAKFGYAAATAÍATaTIIPFEEAPEIIYSAG Tb» CLLEOAAAYEIASDTAAAROíBMRYPŮALOOIA ' Ib» '
OPTOGTTPSSKtGCLIKTVSPHftSPISNUYSUA — Tb »HNHUSUlHSCVSHrNTLSSULXCrAPAAAAOAVq -Ib »lAAQRGYRAHSSLCSSlGSSCLCCCVAAMLGRA tb»
ASVGSLSYPOA1AAAHOAYIPAARALPLTSITS — tb» ------AAE8CP5G«tGGLPVCQHGARAGGCLS6¥LRVPP
-tb»RPYVUPHSPAAGOIAPPAISQORFAGFPALPLD
-Tb »-1 -Ib faBPSAUVAGVGPOV¥ltIRTKLCY»IIA¥GAGrGI¥l Ibftdž
D P N G V V L T Μ « K ¥ t A G A T O 1 N A F S V G $ G O Γ Y G ¥ 8 V -TbRaB-—-ycydrtobvayiolrcagglpsaaiccgyavge“ ...... ' ?b Rais ——
PF¥AMG»SGC(1CGTPRA¥PG8¥¥AICO1YOASĎ
-TbRoB ----St TCAEFTLKCL lOFOAAlOPCDSGCPVYNClGG —--TbfoS—---V V G Η Η T A A S —tb fa#—- -2 CZ 302870 B6 přičemž uvedená prvá nukleotidové sekvence kóduje polypeptid, který je schopen indukce imunogenní odpovědi na TbRal2, TbH9 a TbRa35 v testu proliferace T buněk nebo testu produkce interferonu gama nebo hybridizuje za mírně stringentních podmínek s druhou nukleotidovou sek5 věnci, jež je komplementární k třetí nukleotidové sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvenci:
MHHHHHHMVDFCALPPE INSARMYAGPGSASl . » -> . - - -.....t ----I . . . ......I ........
| V A A A 0 M | ........... ...............1............................1 .............. »DSVASDirSAA5AfOSVVIGltVGS»l |
| G S 5 A G L | MVAAASPYVAWUSVTAGOAELTAAQVR ............................ ............... ..... . .... .......„1. ........ 1^.. ..... 1 |
| V A A A A Y | ETAYGLÍVPPPYIAENRAEIMILIATM |
| L L G 0 N T | PAIAVNEAEYGEMNAQDAAAMFGYAAAÍ |
| A T A T A T | L L P F E E A P Ε N Γ S A G G L L E Q A A A V E E A S |
| 0 l A A A N | QLHMNVPOALQOtAOPTOCTTPSSKLG |
| G L W K Τ V | SPHRSPISNMVSMANNHMSUINSGVSMT |
| N I L S S | LKCFAPAAAAQAVQTAAQNGVRAMSSL |
| G S S L G S | SGtGGGVAANLCftAASVGSLSVPOAWA |
| A A M 0 A V | TPAARALPITSITSAAERCPCQMLGCLP |
| V G Q U G | raggglsgvlrvpprpyvmphspaago |
| I A P P A L | SQDRFADFPALPLOPSAMVAQVGPQVV |
| N 1 Η Τ K L | GYNNAVGAGTGIVIOPNGVVLÍNNHVIA |
| G A T 0 1 x . .......ř.... I . | 1AFSVGSG0TYGVDVVGYDRTQDVAVL0 |
| L R G A G G | IPSAAIGGGVAVGEPVVAUGKSCGOGG |
| 1 P R A V P | GRVVALGQTVOASOStIGAEETLMGLIO |
| F 0 A A 1 | PGDSGGPVVNGIGOVVGMNTAAS • ........... . .1 ................................................ |
io přičemž uvedená prvá nukleotidové sekvence kóduje polypeptid, který je schopen indukce imunogenní odpovědi na TbH9 a TbRa35 v testu proliferace T buněk nebo testu produkce interferonu gama.
Dalším aspektem vynálezu je polynukleotid obsahující prvou nukleotidovou sekvenci podle náro15 ku 1, která hybridizuje za vysoce stringentních podmínek s druhou nukleotidovou sekvencí, jež je komplementární k třetí nukleotidové sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvenci:
-3CZ 302870 B6
MHHHHHHIAASDHFCtSQGG |-lb Rol?0 C F A I P 1 G 0 A U A I A G Q 1 R S G C G S P l ¥ Η 1 G P 1 A F
-Tb RolítGtCVVDHMGHCARVORVVCSAPAASLCISÍGD ................. .......... Ib Rol? .......
¥ i IAVDGAPIN$AIAJIADALNGKHPGDVISVTVQ -fo ft,|2 .....
TKSGCIRTCNVTlAECPPAEFMVDFCAÍPPfíH
-Ib R„]2-1 I-Ib H9SARWYAGPGSA$lVAAAQM1lD$VASDlF$AA$A . ......... ffc» — —........................
fosvvwgltvcswicssagluvaaaspyvawmsv
-tbtelAGOAEtTAAQVRVAAAAYFTAYGlTVPPPVIA
-Ib H9 —————EKRAELUIllATNLlCQXTPAlAVNEAEYGEM»
-Ib WAQDAAAUFGYAAAIATKTATIIPFEEAPEUTSAG -Tb tft...........
GtlFQAAAVEEASOTAAAHOLIIHHVPOAlOQLA
-TbHS
QPTQGTÍPSSKtCCtlKÍVSPHRSPISMilVSlIA
-Tb w —....................................
NNHMSUINSCVSIflNIlSSUlKGfAPAAAAQAVQ -TbHŽ ...........
TAAONGVftAMSSLCSSlGSSClGGGVAAMLGRA
-Tb H9
ASVG$LS¥POA«AAAHQA¥IPAA8ALP11SL1S ' ............................ TbHS
AAERGPGOULGGLPVGOMGAHAGGGLSCVtRVPP -Tb«fiPYVHPHSPAACOIAPPAlSOORFAĎFPALPLO
-Tb H9-1 .........Tb Ba&·
PSAUVAQVGPQVVRIKTKLGYNHAVGAGTGIVt .........- — -.................. TbRoB......................
OPMGVVLTXHHVIACAÍOIHAFSVCSCOTYCVĎV
-Ib Ro35vcyorioovaviqlrcagglpsaaiggcvavge“
..... ...................ib Ru» ........
pfvamcrsccqcgtpravpcrvvalcqívqaso 1 ------ ---------Tb Ra35St ICAFEÍtHCLIQFĎAAiOPGOSGCPVVNGLGG — Tb Ro35 - ..............—
VVGUHTAAS -fb ffo35— přičemž uvedená prvá nukleotidová sekvence kóduje polypeptid, který je schopen indukce imu5 nogenní odpovědi na TbRal2, TbH9 a TbRa35 v testu proliferace T buněk nebo testu produkce interferonu gama nebo hybrid i zuje za vysoce stringentních podmínek s druhou nukleotidovou
-4CZ 302870 B6 sekvencí, jež je komplementární k třetí nukleotidové sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvenci:
UHHHHHHUVOFGALPRE INSARUYAGPGSASL
- - ....... -----------i ....... ..i.........1. ........I........................1.,..1.--.......
VAAAOMHDSVASOLFSAASAFOSVVVGLTVCSWI * V ‘ ......i..- - .1-----[b-. .----... ...I. . .
GSSAGLMVAAASPYVARMSVTAGOAElTAAQYR
-----------------------------*...................I·-.·.........................I.....................1
V A A A A Y E ϊ A Y G l T V P P P V I A E R R A E l Μ 1 L I Λ T R
......... . ..........»-----1 — -1.-..1.. -I—.·.-. ...... ..............ί.....^...1.......1.1. 1
LLGONTPAlAVNEAEYGEMRAQDAAAUrCYAAAÍ
......... I ...... ...I.,-...........................1.............1-.-.,--..1....1....1.........I
ATATATLLPFEEAPERTSAGCltEOAAAVEEAS
......... .........>----------1..................-i-..................1....,.-..1....1....1....1.-^1
DTAAANQIMNNVPQALQQLAQPIQGTTPSSKlG
.......... ··-.--<- ..............1 ....I1 ... -.....I.....- ..........I ..........
GLWKTVSPHRSPISNMVSMANMHWSUIHSCVSMŤ
- ....... ,....1 ......1.............................I. ....... .1 ...1..-.1. ... I. .........I
NTLSSULKGFAPAAAAQAYQTAAQNGVRAMSSL
......... ...... .... I .... 1 .... f 1.........‘.........1....1....1 ............ ....1
CSSLCSSCLGGGVAANLGRAAS/CSLSWPQAWA
......1......... ..........I·.·.·... .1 ...... .............I.........1. ..... ...1................... I
AANQAVTPAARALPtTSíTSAAERCPCOMLCCLP
......---I 1 ... ................ ±. I .... 1...................1 . ...-1
VGGMGARAGGGLSGVtRVPPRPYVUPHSPAAGD
............................................................... I 1.1........................i. 1.1.11 iAPPALSGDRFAOFPALPLOPSAMVAQVGPQVV
.........I.....mil.........Ifci...................... I li ml nl I mA·· ..........ml· m„ln.i.l
NINTKLGYNNAYGAGTGIVIDPNGVVLTNNHVIA
.......I.-.- .--- I. .. ... ....................................... .
GAlDINAFSYGSGQTYCVDVVGYĎRTQDVAVlG
...............i - .1. .................. I .... i . ... i .. ..1. ... i .... I ..1.1....1-. . . . l....1. -........
iRGAGGLPSAAiGGGVAVGtPVVAUGHSGCOGG iiiiHkiIiihUiiiIi ιιιΙι·ιιΙιιιιΙιηιΙιιιιΙ.μι1ιι lllN<.«l'l<llllllll >l»il I I I lllxi^tl « I > » fcl.lil ^lil.l ϊ P R A V P G R V v A L G O ϊ V O A S O S ί I G A E E Ϊ L N C L 1 Q · .............................................................I. .1..-1.11,1.-..1-...1.........I
F&AAlQPGOSGGPVVRGlGQVVGUNTAAS
....1....1,,,...,.,1.........I.........1....1-,. ...1....11...1....1...,1 přičemž uvedená prvá nukleotidové sekvence kóduje polypeptid, který je schopen indukce imunogenní odpovědi na TbH9 a TbRa35 v testu proliferace T buněk nebo testu produkce interferonu gama.
Předmětem vynálezu je také polynukleotid obsahující prvou nukleotidovou sekvenci, která hybridizuje s druhou nukleotidovou sekvencí, ježje komplementární k třetí nukleotidové sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvenci:
-5CZ 302870 B6
MHHHHHHlAASOHFCtSQGC |-íb Bel?O 5 F A 1 P ! C O A U A I A C Q I li S C C C S P I V Η I C P T A F —....... Tb «ol2— 1 tCLCVVOHIGHCARVGRVVCSAPAASLCIStCO ------- ----------- Ib Rd!2— — VITAYDGAPIHSAÍAMAOAtKGHHPGOVISVTIQ
- — ........... lbBo)2 i K S C G I R T C « V 1 t A E C P P A E f Μ V Ď f C A l P P Ε I N -íb fřoi2-1 I-Tb »SARUYAGPGSASLVAAAQUIDSVASDtFSAASA -Ib H9 fQSVVWGLlVGSlfCSSACLUVAAASPYVAtHSY -ib H9 TACOAEllAAQYRVAAAAYfFAYGLTVPPPVlA
--ThWÍURAElUlLlArNLLCQíITPAlAVNEAEYGEHK -TbH8 aodaaawfgykaatatatatilpfeeapeutsac —........... lb togliegaaaveeasotaaanolknkvpoaíoqla -IbH9QPTOGTTPSSKICCtIKTVSPHRSPISHBVSUA Tb Hl .............. - '
NNHUSUlMSGVSHlNllSSUlKGfAPAAAAQAVQ -lb «iaaohgyramssigsslgsscíccgvaahlgra n> H9 ...........
ASVGSLSVPOAIAAAHOAVIPAARAIPIISIÍS ' ........... n>H9
AAERGPGOaLGCtPVCOMCARACGCLSGYLfiYPP -Tb H5JÍPYVMPHSPAACĎIAPPAISOORFADFPALPLO -Tb H9 — — | -Tb Bag·
PSAMVAOVGPQVVdlHTKLGYNHAVCAfiTGIVi -TbRoiSBPMCVVLTMHHVlAGAlOiHAFSVGSGOlYCVOY ” IbRagVGYBBlOĎVAYLOllíCAGGLPSAAIGGCVAVCE“ — -FbíaKPFVAUfiHSGGOGGTPIlAYPCRVYALGOTVQASD
---Tb Rd5------S t T C A Ε Ε T t K C t 1 Q F O A A I O P G O S G C P V Y H G l G Q ’--Tb RaJ5VVCUHTAAS ........... fb Βοώ——
Polynukleotid obsahující prvou nukleotidovou sekvenci podle nároku 1 nebo 2, která hybridizuje 5 s druhou nukleotidovou sekvencí, jež je komplementární k třetí nukleotidové sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvenci:
-6CZ 302870 B6
UHHHHHHUVOFGALPPE IHSARMYAGPGSASL ................·.............................*..............................................
| .........i.........·.......................................................................... V * λ *0 MHO S V A S 0 l r S * * S A F OS MIC l I v c s | uaxL N 1 |
| GSSAGLMVAAASPYVAWMSVTAGOAELrAAQ | V R |
| vaaaavetaygltvpppviaenraelmilia | N |
| llgqnipaiavneaeycfmwaqoaaaufcyaa | A í |
| ATATATLIPFEEAPEHTSAGCLLEOAAAVEE | A S |
| 0TAAANQLMNNVPOALOQLAOPTOCTTPSSK | G |
| GIWKTVSPHRSPISNUVSMANNHMSMTNSGVS | U T K . . . 1 |
| NTLSSULKGFAPAAAAOAVQTAAQNCVRAUS | S L |
| GSSLGSSGLGCGVAARIGRAASVGSLSVPOAI | A |
| A A M 0 A V ϊ P A A R A L P l T S L T S A A E R G P C 0 « L G C | l P |
| VGQUGARACGGLSCVtRVPPRPYVMPHSPAA | G 0 |
| iAPPALSQDRFADFPALPLOPSAMVAQVGPQ | Y v |
| NIKTKLGYHKAVGACTGIVIOPNGVVLrNNHV | I A |
| G A I 0 1 H A F S V G S G Q ϊ Y G V D V Y G Y 0 R I 0 0 V A V | l 0 - - . - 1 |
| LRGAGCIPSAAIGGGYAVGEPVVAUCNSGGO | G G A . . . 1 |
| TPRAVPGRVVALCOTVQASOSlTGAEETLNGílO FOAAIQPGDSGGPVVNGLGOVVGUNTAAS |
Dalším aspektem je polypeptid kódovaný póly nukleotidem viz výše.
lezu se jedná o farmaceutický nebo vakcínový prostředek, který obsahuje polypeptid nebo polynukleotid. Polypeptid předkládaného vynálezu lze použít při léčbě nebo prevenci infekce M tuberculosis a pro výrobu léčiva pro léčení nebo prevenci infekce M. tuberculosis.
io
Dalším předmětem vynálezu je způsob výroby polypeptidů vynálezu, který zahrnuje rekombinantní expresi polynukleotidu. V dalším provedení je předmětem vynálezu izolovaná hostitelská buňka, která rekombinantně exprimuje polypeptid. Dále bude předkládaný vynález, týkající se fúzních proteinů antigenů M tuberculosis popsán podrobněji v širších souvislostech. Částečně se vynález týká fúzních polypeptidů, které obsahují dva nebo více antigenů M. tuberculosis, polynukleotidů kódující takové polypeptidy, metod použití polypeptidů a polynukleotidů v diagnóze, léčbě a prevenci infekce M tuberculosis. Předkládaný vynález je částečně založen na objevu vynálezců, že polynukleotidy, které obsahují dvě až pět sekvencí M. tuberculosis, kódujících
-7 CZ 302870 B6 produkované rekombinantní fúzní proteiny, si uchovávají imunogenitu a antigenitu jejich jednotlivých částí. Fúzní proteiny, popsané zde, indukují odpověď T a B lymfocytů, jak bylo změřeno proliferaci T lymfocytů, produkcí cytokinů a protilátek. Kromě toho fúzní protein byl použit jako imunogen s pomocnou látkou in vivo k vyvolání obou imunit, a sice buněčné a humorální imunity proti M. tuberculosis. Dále fúzní protein může být vytvořen fúzí konstruktu a použit v očkovací látce s pomocnou látkou k zajištění dlouhodobé ochrany zvířat proti rozšíření tuberkulózy. Fúzní protein byl více účinný imunogen než směs jeho jednotlivých proteinových částí.
Specifická část vynálezu, izolované nebo purifikované polypeptidy Ní. tuberculosis podle vynále10 zu mohou být připraveny jako farmaceutický prostředek pro podávání subjektu pro prevenci a/nebo léčbu infekce M tuberculosis. Imunogen icita fúzního proteinu může být zvýšena přidáním pomocné látky.
Jiný aspekt vynálezu, izolace nebo purifikace póly nukleotidů, je používán pro produkování rekombinantních fúzních polypeptidových antigenů in vitro. Volitelně polynukleotidy mohou být podávány přímo subjektu jako DNA očkování v případě exprese antigenu uvnitř subjektu a následné indukci imunitní odpovědi proti Ní. tuberculosis.
Další předmět vynálezu je, že polypeptidy jsou používány při in vivo analýze pro detekci humo20 rálních protilátek nebo buněčné imunity proti Ní. tuberculosis pro diagnózu infekce nebo sledování průběhu nemoci. Dále polypeptidy mohou být použity jako in vivo diagnostická látka ve formě podkožního testu. Volitelně polypeptidy mohou být použity jako imunogeny pro přípravu protilátek proti M. tuberculosis na zvířatech. Protilátky mohou být použity k detekci cílových antigenů in vivo a in vitro.
Předkládaný vynález se týká antigenů, užitečných pro léčbu a prevenci tuberkulózy, polynukleotidů, kódujících takové antigeny, a způsobů jejich využití. Antigeny v předkládaném vynálezu jsou fúzní polypeptidy antigenů Ní. tuberculosis a jejich varianty. Přesněji, antigeny podle předkládaného vynálezu obsahují alespoň dva polypeptidy M tuberculosis, které jsou spojeny ve větší fúzní polypeptidovou molekulu. Antigeny podle předkládaného vynálezu mohou dále obsahovat jiné složky, navržené ke zvýšení imunogenity antigenů nebo pro zlepšení těchto antigenů v jiných směrech, například při izolaci těchto antigenů prodloužením jednoho konce antigenu h i stidi novými zbytky.
Specifické antigeny M. tuberculosis - Antigeny podle předkládaného vynálezu jsou doloženy na obrázcích 1A až 13B, včetně homologie a variant těchto antigenů. Tyto antigeny mohou být modifikovány, například připojením peptidových sekvencí, popsaných níže. Tyto připojené peptidy mohou být vloženy mezi jeden nebo více polypeptidů, které vytvoří všechny fúzní proteiny, ukázané na obrázcích 1A až 13B. Jiné antigeny podle předkládaného vynálezu jsou antigeny po40 psané na obrázcích 1A až 13B, které mohou být spojeny do známého antigenu Ní. tuberculosis tak, jak byl dříve popsán 38 kD (SEQ ID NO:27) antigen (Andersen and Hansen, 1989, Infect. Immun. 57: 2481 - 2488; Genbank Accesion No. M30046).
Měření imunogenicity - Antigeny zde popsané, a jejich imunogenícká část, mají schopnost vyvo45 lat imunitní reakci. Přesněji, antigeny mají schopnost vyvolat proliferaci a/nebo produkci cytokinu (například produkci interferonu - γ a/nebo interleukinu - 12) v T lymfocytech, NK lymfocytech a/nebo makrofázích získaných od jednotlivců s imunitou proti Ní. tuberculosis. Výběr typu lymfocytů pro použití k vyhodnocení imunitní odpovědi na antigen bude záviset na očekávané odpovědi. Například produkce interleukinu - 12 je snadněji vyhodnocená při použití preparátu, který obsahuje B lymfocyty a/nebo makrofágy. Jedinec s imunitou proti M. tuberculosis je ten, u něhož se bere v úvahu rezistence vůči rozvoji tuberkulózy díky větší efektivitě T lymfocytámí reakce proti Ní. tuberculosis (například podstatně slabší symptomy nemoci). Tito jedinci mohou být určeni na základě silné pozitivity (například více než přibližně 10 mm průměru zatvrdnutí tkáně) pří reakci na podkožní test na tuberkulózní proteiny (PPD) a absenci jakýchkoliv znaků nebo symptomů nemoci tuberkulózy. T lymfocyty, NK lymfocyty, B lymfocyty a makrofágy,
-8CZ 302870 B6 získané od jedinců s imunitou proti M. tuberculosis, mohou být připraveny použitím metod, známým pracovníkům v oboru. Například příprava PBMCs (například periferních krevních mononukleámích buněk) může být provedena bez další separace buněčných komponent. PBMCs může být obecně připravena například gradientovou centrifugací přes „FICOLL“ (Winthrop Laborato5 ries, NY). T lymfocyty pro použití pro měření zde popsané mohou být také purifikovány přímo z PBMCs. Volitelně mohou být připraveny obohacené T lymfocytámí linie, reagující proti mykobakteriálním proteinům, nebo T lymfocytní klony, reagující na jednotlivé mykobakteriální proteiny. Tyto T lymfocytní klony mohou být připraveny například kultivací PBMCs od jednotlivců s imunitou proti M. tuberculosis a mykobakteriálními proteiny po dobu 2 až 4 týdny. To umožní io rozvoj pouze T lymfocytů specifických na mykobakteriální proteiny, jehož výsledkem jsou linie složené výhradně s takovýchto lymfocytů. Tyto lymfocyty pak mohou být klonovány a testovány s jednotlivými proteiny použitím metod, známých pracovníkům v oboru, pro přesnější určení jednotlivé T lymfocytní specifiky. Obecně antigeny, které jsou pozitivně testovány při měření na proliferaci a/nebo produkci cytokinu (například produkce interferonu - γ a/nebo interleukinu 15 12) s použitím T lymfocytů, B lymfocytů a/nebo makrofágů získaných od jedinců s imunitou proti M. tuberculosis, jsou pokládány za imunogenní. Takové měření může být dostatečné například s použitím uvedených postupů popsaných níže. Imunogenické části takových antigenů mohou být identifikovány použitím podobných měření a mohou být přítomny v polypeptidech zde popsaných.
Schopnost polypeptidu (například imunogenní antigeny nebo jejich část nebo jejich jiná obměna) indukovat proliferaci lymfocytů je určená kontaktem lymfocytů (například T lymfocytů a/nebo NK lymfocytů) s polypeptidem a měřením proliferace lymfocytů. Obecně, množství polypeptidu, které je dostatečné pro určení přibližně 105 lymfocytů, je v rozmezí od přibližně 10 ng/ml do přibližně 100 pg/ml a přednostně je přibližně 10 pg/ml. Inkubace polypeptidu s lymfocyty obvykle probíhá při 37 °C přibližně šest dní. Po inkubaci s polypeptidem je následně reakce lymfocytů měřena proliferaci, která může být určena metodami známými pracovníkům v oboru, jako je expozice buněk dávkám radioaktivně značeného thymidinu a měření jeho inkorporace do buněčné DNA. Obecně polypeptidy, které mají za následek alespoň trojnásobné zvýšení proliferace nad pozadí (například proliferace pozorovaná u kultur lymfocytů bez polypeptidu), jsou považovány za schopné indukovat proliferaci.
Schopnost polypeptidu stimulovat produkci interferonu — γ a/nebo interleukinu - 12 v lymfocytech může být určena kontaktem lymfocytů s polypeptidem a měřením hladiny produkce interfe35 ronu — γ a/nebo interleukinu — 12 lymfocyty. Obecně množství polypeptidu, které je dostatečné pro určení přibližně 105 lymfocytů, je v rozmezí od přibližně 10 ng/ml do přibližně 100 pg/ml a přednostně je přibližně 10 pg/ml. Polypeptid může, ale nemusí, být imobilizován na pevném povrchu, jako jsou korálky nebo biodegradovatelné mikrokuličky, takové, jaké jsou popsány v U.S. Patent Nos. 4,897,268 a 5,075,109. Inkubace polypeptidu s lymfocyty obvykle probíhá při
37 °C šest dní. Následuje inkubace s polypeptidem, v lymfocytech je měřen interferon - γ a/nebo interleukin — 12 (nebo jedna nebo více jeho subjednotek), který může být určen metodami, které jsou pracovníkům v oboru známé, jako je měření pomocí enzymu navázaného na imunosorbent (ELISA) nebo, v případě IL - 12 P70 subjednotky, bioměření, jako je měření proliferace T lymfocytů. Obecně polypeptid, který má výsledky produkci alespoň 50 pg interferonu - γ v ml super45 natantu kultury (obsahující 104 až 105 T lymfocytů v ml), je považován za schopného stimulovat produkci interferonu - γ. Polypeptid, který stimuluje produkci alespoň 10 pg/ml subjednotky IL 12 P70 a/nebo alespoň 100 pg/ml subjednotky IL - 12 P40 v 105 makrofágů nebo B lymfocytů (nebo v 3 x 105 PBMC), je považován za schopného stimulovat produkcí IL - 12.
Obecně imunogenické antigeny jsou takové antigeny, které stimulují proliferaci a/nebo produkci cytokinu (například produkci interferonu - γ a/nebo interleukinu - 12) v T lymfocytech, NK lymfocytech, B lymfocytech a/nebo makrofázích u alespoň přibližně 25 % jedinců s imunitou vůči M tuberculosis. Mezi těmito imunogenickými antigeny mohou být rozlišeny polypeptidy, které mají lepší terapeutické vlastnosti, na základě velikosti reakce při výše uvedených měření a na
-9 CZ 302870 B6 základě procentuálního zastoupení jedinců, u nichž je reakce pozorována. Navíc antigeny, které mají lepší terapeutické vlastnosti, nebudou stimulovat proliferaci a/nebo produkci cytokinů in vitro v lymfocytech získaných od více než přibližně 25 % jedinců, kteří nemají imunitu proti M. tuberculosis, z důvodu nepřítomnosti odpovědi, která není u lymfocytů, odpovídajících na M. tuberculosis, specifická. Tyto antigeny, které indukují reakci u vysokého procenta T lymfocytů, NK lymfocytů, B lymfocytů a/nebo makrofágů, připravených z jedinců s imunitou proti M. tuberculosis (s nízkým výskytem odpovědi v lymfocytech připravených z jiných jedinců), mají lepší terapeutické vlastnosti.
Antigeny s lepšími terapeutickými vlastnostmi mohou být také identifikovány na základě jejich schopnosti snížit sílu infekce M tuberculosis u experimentálních zvířat, jestliže jsou jim podávány jako očkování. Vhodná příprava očkování pro použití na experimentálních zvířatech je popsáno podrobně níže. Účinnost může být určena na základě schopnosti antigenů zajistit alespoň přibližně 50 % snížení počtu bakterií a/nebo alespoň přibližně 40 % pokles úmrtnosti při následné pokusné infekci. Vhodné pokusná zvířata zahrnují myši, guinejská prasata a primáty.
Izolace kódujících sekvencí - Předkládaný vynález se také týká molekul nukleových kyselin, které kódují fúzní polypeptidy M. tuberculosis. V Části příklad provedení vynálezu bylo sestaveno třináct fúzních kódujících sekvencí M. tuberculosis. Podle vynálezu nukleotidová sekvence, která kóduje aminokyselinovou sekvenci fúzního proteinu, může být připravena rekombinací molekul, kteréjsou přímo exprimovány podle kódující sekvence.
Pro klonování zcela dlouhých kódujících sekvencí nebo homologních variant pro přípravu fúzních póly nukleotidů, mohou být značené DNA sondy, sestrojené z části nukleotidových sekvencí nebo komplementů zde uvedených, ověřeny v genomické nebo cDNA knihovně, připravené z různých kmenů M. tuberculosis pro identifikování kódujících sekvencí nebo jejich jednotlivých částí. Izolace kódujících sekvencí může být také provedena polymerázovými řetězovými reakcemi (PCR) použitím dvou degenerovaných oligonukleotidových primerů zdrojů na základě kódujících sekvencí zde uvedených.
Vynález se také týká izolace nebo purifikace polynukleotidů komplementárních k nukleotidovým sekvencím SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 a 25 a polynukleotidům, které jsou selektivně hybridizované na takové komplementární sekvence. Upřednostňovaná Část poskytuje polynukleotid, který hybridizuje na sekvenci SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 a 25 nebo její komplementární sekvenci v podmínkách nízké přesnosti a který kóduje protein, který si uchovává imunogenitu fúzních proteinů SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 a 26. Podle nezkráceného příkladu, vhodné podmínky nízké přesnosti jsou následující (viz také Shilo and Weinberg, 1981, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78:6789 - 6792): filtry obsahující DNA jsou připraveny 6 hodin při 40 °C v roztoku obsahujícím 35 % formamidu, 5 x SSC, 50 mM Tris - HCI (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,1 % PVP, 0,1 % Ficollu, 1 % BSA a 500 pg/ml denaturované lososové spermové DNA. Hybridizace proběhne ve stejném roztoku s následujícími modifikacemi: 0,02 % PVP, 0,02 % Ficollu, 0,2 % BSA, 100 pg/ml lososové spermové DNA, 10 % roztok síranu dextranu a je použita 5 až 20 x 106 cpm 32P značená sonda. Filtry jsou inkubovány v hybridizační směsi 18 až 20 hodin při 40 °C a pak jsou promývány 1,5 hodiny při 55 °C v roztoku obsahujícím 2 x SSC, 25 mM Tris - HCI (pH 7,4), 5 mM EDTA a 0,1 % SDS. Promývací roztok je nahrazen čerstvým roztokem a další inkubace trvá 1,5 hodiny pri 60 °C. Filtry jsou odsáty do sucha a autoradiograficky vyvolány. Jestliže je to nezbytné, filtry jsou promyty potřetí při 65 až 68 °C a znovu vyvolány. Ostatní podmínky nízké přesnosti, které mohou být použity, jsou v oboru dobře známy (například zařízení pro mezidruhovou hybridizaci).
Jiná upřednostňovaná část poskytuje polynukleotid, který hybridizuje na kódující sekvenci SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 a 25 nebo její komplementární sekvenci v podmínkách vysoké přesnosti a který kóduje protein, který si uchovává imunogenitu fúzních proteinů SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 a 26. Podle nezkráceného příkladu, vhodné podmínky vysoké přesnosti jsou následující: pre - hybridizace filtrů, obsahujících DNA, se pro- 10CZ 302870 B6 vádí od 8 hodin až přes noc při 65 °C v pufru, skládajícího se z 6 x SSC, 50 mM Tris - HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02 % PVP, 0,02 % Ficollu, 0,02 % BSA a 500 pg/ml denaturované lososové spermové DNA. Filtry jsou hybridizovány 48 hodin při 65 °C v pre - hybridizační směsy, obsahující 100 pg/ml denaturované lososové spermové DNA a 5 až 20 x 106 cpm 32P značené sondy. Promytí filtrů se provádí při 37 °C 1 hodinu v roztoku obsahujícím 2 x SSC, 0,01 % PVP, 0,01 % Ficoll a 0,01 % BSA. Dále následuje před autoradiografií promytí v 0,1 x SSC při 50 °C při 45 minut. Ostatní podmínky vysoké přesnosti, které mohou být použity, jsou v oboru dobře známy.
Další upřednostňovaná část poskytne polynukleotid, který hybridizuje na kódující sekvenci SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 a 25 nebo její komplementární sekvenci v podmínkách mírné přesnosti a který kóduje protein, který si uchovává imunogenitu fuzních proteinů SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 a 26, Vhodné podmínky mírné přesnosti jsou následující: filtry obsahující DNA se připravují 6 hodin při 55 °C v roztoku obsahujícím 6x SSC, 5x Denhartův roztok a 100 pg/ml denaturované lososové spermové DNA. Hybridizace proběhne ve stejném roztoku a je použita 5 až 20 x 106 cpm 32P značená sonda. Filtry jsou inkubovány v hybridizační směsi 18 až 20 hodin při 55 °C a pak promyty dvakrát 30 minut při 60 °C v roztoku obsahujícím 1 x SSC a 0,1 % SDS. Filtry jsou odsáty do sucha a autoradiograficky vyvolány. Ostatní podmínky mírné přesnosti, které mohou být použity, jsou v oboru dobře známy. Promytí filtrů probíhá při 37 °C 1 hodinu v roztoku, obsahujícím 2 x SSC, 0,1 % SDS.
Polypeptidy kódované kódující sekvencemi - V souladu s vynálezem, polynukleotid podle vynálezu, který kóduje fúzní protein, jeho fragmenty nebo jeho funkční ekvivalenty, může být použit k přípravě rekombinantních molekul nukleových kyselin, který přímo expresují fúzní protein, jeho fragmenty nebo jeho funkční ekvivalenty, ve vhodných hostitelských buňkách. Fúzní polypeptidové produkty, kódované takovými polynukleotidy, mohou být pozměněny molekulární manipulací kódující sekvence.
Z důvodu vlastní degenerace genetického kódu, ostatní sekvence DNA, které kódují v podstatě stejné nebo funkční ekvivalenty aminokyselinové sekvence, mohou být použity při praktickém užití vynálezu pro expresi fózních polypeptidů. Tyto sekvence DNA obsahují takové sekvence, které jsou schopné hybridizovat na kódující sekvence nebo jejich komplementy, zde uvedené, při nízké, mírné nebo vysoké přesnosti při podmínkách popsané v oddílu izolace kódujících sekvencí.
Pozměnění nukleotidových sekvencí, kterých může být použito v souladu s vynálezem, zahrnující delece, vložení nebo substituce odlišných nukleotidových zbytků, které mají za důsledek sekvenci, která kóduje stejný nebo funkčně ekvivalentní genový produkt. Genový produkt sám o sobě může obsahovat delece, vložení nebo substituce aminokyselinových zbytků, které mají za následek neúčinnou výměnu, a tak produkují funkční ekvivalent antigenového epitopu. Takové konzervativní aminokyselinové substituce mohou být připraveny na základě podobné polarity, náboje, rozpustnosti, hydrofobicity, hydrofílicity a/nebo amfipatického charakteru zahrnutých zbytků. Například aminokyseliny s negativním nábojem zahrnují kyselinu aspartátovou a kyselinu glutamovou; aminokyseliny s pozitivním nábojem zahrnují lysin, histidin a arginin; aminokyseliny s nenabitými polárními hlavními skupinami, které mají podobné hodnoty hydrofobicity, zahrnují následující: glycin, asparagin, glutamin, šeřin, treonin a tyrosin; a aminokyseliny s nepolárními hlavními skupinami zahrnují alanin, valin, isoleucin, leucin, fenylalanin, protin, metionin a tryptofan.
Nukleotidové sekvence podle vynálezu mohou být navrženy jako sekvence kódující pozměněný fúzní protein s různými konci, zahrnující také změny, které pozměňují zpracování a expresi genového produktu. Například mutace mohou být způsobeny použitím technik, které jsou v oboru dobře známy, například cílená lokální mutageneze, vložení nového restrikčního místa, pozměnění glykosylační látky, fosfoiylace a tak dále. V alternativní části vynálezu kódující sekvence fúzního
- li CZ 302870 B6 proteinu může být syntetizována, celá nebo část, použitím chemických metod v oboru dobře známých. Viz. například Caruthers et al., 1980, Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 7 : 215 - 233; Crea and Hom, 180, Nuc. Acids Res. 9 (10): 2807 - 2817. Volitelně polypeptid sám o sobě může být připraven použitím chemických metod syntetizováním aminokyselinové sekvence celé nebo části. Například peptidy mohou být syntetizovány technikami na pevné fázi, odštěpeny z nosiče a purifíkovány preparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografii. (Viz. Creighton, 1983, Proteins Structures And Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., N. Y. pp. 50 - 60). Složení syntetických polypeptidů může být potvrzena aminokyselinovou analýzou nebo sekvenováním (například degradačním procesem podle Edmana; viz. Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principles, W. H, Freeman and Co., N. Y. pp. 34 - 49).
Dále kódující sekvence fúzního proteinu může být mutována in vitro nebo in vivo k vytvoření a/nebo zabránění trans lační, iniciační a/nebo terminační sekvence nebo k vyvolání změn v kódujících oblastech a/nebo k vytvoření nových restrikčních míst endonukleázy nebo k zabránění jejich odstranění k usnadnění další in vitro modifikace. Techniky pro mutageneze známé v oboru zahrnují také chemické mutageneze, in vitro cílené lokální mutageneze (Hutchinson, C., et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551), použití TAB® linkrů (Pharmacia) a podobně. Je důležité, že manipulace nezabraň ují imunogenitě fúzních polypeptidů.
Dále mohou být netypické aminokyseliny nebo chemické aminokyselinové analogy zavedeny do sekvence jako substituce nebo přídavek. Netypické aminokyseliny zahrnují také D - izomery obvyklých aminokyselin, a - aminoisobutánovou kyselinu, 4 - aminobutánovou kyselinu, Abu, 2 - aminobutánovou kyselinu, γ - Abu, ε - Ahx, 6 — aminohexanovou kyselinu, Aib, 2 - aminoisobutánovou kyselinu, 3 -aminopropionovou kyselinu, omitin, norleucin, norvalin, hydroxyprolin, sarcosin, citmlin, cysteinovou kyselinu, t - butylglycin, t - butylalanin, fenylglycin, cyklohexyalanin, β - alanin, fluoroaminokyseliny, uměle vytvořené aminokyseliny jako jsou β methylaminokyseliny, a - C - methylaminokyseliny, α - N - methylaminokyseliny a aminokyselinové analogy obecně. Kromě toho aminokyselina může být D (pravotočivá) nebo L (levotočivá).
V některém případě ve specifické částí vynálezu jsou kódující sekvence každého antigenů ve fúzním proteinu spojeny v N nebo C konci přes peptidovou vazbu. Volitelně může být vytvořena sekvence peptidového můstku k oddělení jednotlivých polypeptidů, které tvoří fúzní polypeptid, dostatečnou vzdáleností k zabezpečení toho, aby se každý polypeptid složil do sekundární a terci ální struktury, která maximalizuje jeho antigenickou účinnost pro prevenci a léčbu tuberkulózy. Takové sekvence peptidového můstku jsou začleněny do fúzního proteinu použitím standardních technik v oboru dobře známých. Vhodné sekvence peptidového můstku mohou být vybrány na základě následujících faktorů: (1) schopnosti získat flexibilní prodlouženou konformaci; (2) neschopnosti získat sekundární strukturu, která může interagovat s funkčním epitopem prvního a druhého polypeptidů; a (3) nedostatek hydrofóbních nebo nabitých zbytků, které silně reagují s polypeptidovým funkčním epitopem. Upřednostňované sekvence peptidového můstku obsahují Gly, Asn a Ser zbytky. Ostatní téměř neutrální aminokyseliny, jako je Thr a Ala, mohou být také použity v sekvenci můstku. Aminokyselinové sekvence, které mohou být výhodně použity jako obsahující můstky, byly uvedeny v Maratea et al., Gene 40 : 39 - 46, 1985; Murphy et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83: 8258 - 8262, 1986; U. S. Patent 4,751,180. Sekvence můstku mohou být od 1 do 50 aminokyselin dlouhé. Peptidové sekvence nejsou potřeba, když první a druhý polypeptid má neesenciální N-koncové aminokyselinové oblasti, které mohou být použity k oddělení funkčních domén a k zabránění stérické interference. Například antigeny ve fúzním proteinu mohou být spojeny flexibilním polylinkerem, jako jsou Gly-Cys-Gly nebo Gly-Gly~ Gly-Gly-Ser, opakující se 1 až 3 krát (Bird et al., 1988, Science 242: 423 - 426; Chaudhary et al., 1990, Proč. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 87: 1066- 1070).
V jedné části vynálezu je takový protein připraven expresí rekombinantní nukleové kyseliny, kódující protein. Takový fúzní produkt může být ligo ván vhodnými sekvencemi nukleových kyselin, kódujících navzájem vhodné aminokyselinové sekvence, metodami známými v oboru, ve
- 12CZ 302870 B6 vlastním kódujícím rámci a exprimovat produkt metodami známými v oboru. Volitelně takový produkt může být připraven technikami proteinové syntézy, například použitím peptidové ho syntetizátoru. Kódující sekvence pro ostatní molekuly, jako je cytokin nebo pomocná látka, mohou být také přidány do fúzního polynukleotidů.
Produkce fúzních proteinů - K produkci fúzního proteinu podle vynálezu je nukleotidová sekvence, kódující protein nebo jeho funkční ekvivalent, vložena do vhodného expresního vektoru, například do vektoru, který obsahuje nezbytné části pro transkripci a translaci vložené kódující sekvence. Hostitelské buňky nebo buněčné linie transfekované nebo transformované rekombiio nantními expresními vektory mohou být použity k různým cílům. Ty zahrnují také velkou míru produkce fúzního proteinu.
Metody, které jsou dobře známy odborníkům, mohou být použity pro konstrukci expresních vektorů, které obsahují fúzní kódující sekvence a vhodné transkripční/trans lační kontrolní signály.
Tyto metody zahrnují in vitro rekombinantní DNA techniky, syntetické techniky a invivo rekombinace/genetické rekombinace. (Viz., například, techniky popsané v Sambrook et al., 1989, Molecutar Cloning A Laboratory Manual, Cold Sping Harbor Laboratory, N. Y. a Ausubel et aí, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pubtishing Associates and Wiley Interscience, N. Y.). RNA schopná kódovat polypeptid může být také chemicky syntetizovaná (Gait, ed, 1984, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford).
Expresní systémy - Různé hostitelské expresní vektorové systémy mohou být použity pro expresi sekvence kódující fúzní protein. Ty zahrnují také mikroorganismy, jakou jsou bakterie (Například E. coli. B. subtilis) transformované bakteriofágem, s rekombinantní DNA, expresními vekto25 ry splasmidovou DNA nebo kosmidovou DNA, které obsahují kódující sekvenci; kvasinky (například Saccharomyces, Pichiá) transformované rekombinantními kvasinkovými expresními vektory, které obsahují kódující sekvenci; hmyzí buněčné systémy, infikované rekombinantními virovými expresními vektory (například baculovirus); rostlinné buněčné systémy infikované rekombinantními expresními vektory (například virus květákové mozaiky, CaMV; virus tabákové mozaiky, TM V) nebo transformované rekombinantními plasmidovými expresními vektory (například Ti plasmid), které obsahují kódující sekvenci; nebo savčí buněčné systémy (například COS, CHO, BHK, 293, 3T3 buňky). Expresní složky těchto systémů se liší silou a specifitou.
V závislosti na použitém hostitelském/vektorovém systému, některé z množství vhodných trans35 kripčních a translačních složek, které obsahují konstitutivní a inducibilní promotory, mohou být použity v expresním vektoru. Například když klonujeme v bakteriálním systému, mohou být použity inducibilní promotory, jako jsou pL z bakteriofágu λ, plac, ptrp, ptač (ptrp - lac hybridní promotor; cytomegalovirus promotor) a podobně; když klonujeme v hmyzím buněčném systému, mohou být použity promotory jako je baculovirus polyhedron promotor; když klonujeme v rost40 linném buněčném systému, mohou být použity promotory odvozené z genomu rostlinných buněk (například heat shok promotory; promotor pro malé subjednotky RUBISCA; promotor pro protein vázající chlorofyl α/β) nebo z rostlinných virů (například 35S RNA promotor CaMV; promotor obalujícího proteinu TMV); když klonujeme v savčím buněčném systému, mohou být použity promotory odvozené z genomu savčích buněk (například metalothioninový promotor) nebo ze savčích virů (například pozdní adenovirový promotor; 7,5 K promotor viru neštovic); když připravujeme buněčné linie, které obsahují více kopií sekvence kódující antigen, mohou být použity vektory na základě SV 40-, BPV- a EBV- s vhodným selektivním markrem.
Pro expresy antigenů M. tuberculosis jsou upřednostňovány bakteriální systémy. Pro dodání in vivo, bakterie jako Bacillus - Calmette - Guerrin mohou být využity pro expresy fúzních polypeptidů podle vynálezu na jejich buněčném povrchu. Množství jiných bakteriálních expresních vektorů může být vhodně vybráno v závislosti na zamýšlené expresi produktů. Například jestliže má být produkováno velké množství fúzního proteinu pro vytvoření farmaceutických směsí, mohou být vhodné ty vektory, které přímo expresují vysokou hladinu fúzních proteinových produk55 tů, které se snadno purifikují. Takové vektory zahrnují také expresní vektor E. coli pUR278
- 13 CZ 302870 B6 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791), ve kterém kódující sekvence může být ligována do vektoru v konstruktu s lacZ kódující oblastí, takže hybridní produkt je produkován; ρΓΝ vektory (Inouye and Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3 101 - 3109; Van Heeke and Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264: 5503 - 5509); a podobně. pGEX vektory mohou být také použity pro expresi cizích póly pept idů jako jsou fúzní proteiny s glutathíon S — transferázou (GST). Obecně takové fúzní proteiny jsou rozpustné a mohou být snadno purifíkovány z lyzátu buněk absorpcí na glutathion - agarosové korálky, po které následuje eluce v přítomnosti volného glutathionu. pGEX vektory jsou sestrojeny tak, že obsahují trombin nebo faktor štěpících míst Xa proteázy, takže sledovaný klonovaný fúzní polypeptid může být uvolněn z GST části.
Proteinová purifikace - Jestliže probíhá exprese rekombinantního proteinu, může být identifikován měřením na základě fyzikálních nebo funkčních vlastností produktu, které zahrnují radioaktivní značení produktu, po kterém následuje gelová elektroforéza, radioimunoanalýza, ELISA, bioměření a tak dále.
Jakmile je jednou kódovaný protein identifikován, může být isolován a purifikován standardními metodami, které zahrnují chromatografii (například vysokotlakou kapalinovou chromatografii, iontovou chromatografii, afinitní a kolonovou chromatografii), odstřeďování, rozdílnou rozpustnost nebo jinou standardní techniku pro purifikaci proteinů. Skutečné podmínky, které budou použity, částečně závisí na faktorech, jako je celkový náboj, hydrofobicita, hydrofilicita a tak dále, a jsou zřejmé těm, kteří jsou kvalifikovaní v oboru. Funkční vlastnosti mohou být určeny použitím vhodných měření jako je navázání protilátek, indukce proliferace T lymfocytů, stimulace produkce cytokinů, jako je IL 2, IL - 4, IFN - γ. Pro praxi podle předkládaného vynálezu je upřednostňováno, aby každý fúzní protein byl alespoň z 80 % purifikován od ostatních proteinů.
V íce je upřednostňováno, aby byly purifíkovány alespoň z 90 %. Pro podávání in vivo je upřednostňováno, aby proteiny byly purifíkovány z více než 95 %.
Použití sekvence kódující fúzní protein - Sekvence kódující fúzní protein podle vynálezu mohou být použity ke kódování proteinového produktu pro jeho použití jako imunogen k indukci a/nebo zvýšení imunitních reakcí proti ΛΤ. tuberculosis. Navíc taková kódující sekvence může být ligována s kódující sekvencí jiné molekuly, jako je cytokin nebo pomocná látka. Tyto molekuly mohou být použity in vivo jako DNA očkovací látka (U. S, Patent 5,589,466; 5,679,647; 5,703,055). V této Části vynálezu exprese polynukleotidu v příjemci přímo indukuje imunitní reakci. Póly nukleotidy mohou být podány injekčně do subjektu, se kterým ještě nebyl podniknut žádný pokus, pro navození primární imunitní reakce na jeho kódovaný produkt nebo pro zvýšení sekundární imunitní odpovědi infikovaného nebo imunizovaného subjektu.
V upřednostňované části vynálezu terapeutický prostředek obsahuje sekvenci kódující fúzní protein nebo fragmenty, které jsou částí expresního vektoru. Zvláště takový polynukleotid obsahuje promotor schopný spojení s kódující oblastí, vedený promotor je inducibilní nebo konstitutivní a, volitelně, tkáňově specifický. V jiné části polynukleotid obsahuje kódující sekvenci ohraničenou oblastmi, které podporují homologní rekombinaci ve vhodném místě v genomu, takže způsobují intrachromozomální expresi kódující sekvence (Koller and Smithies, 1989, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 8932 - 8935; Zijlstra et aí, 1989, Nátuře 342: 435 - 438).
Podání nukleové kyseliny do subjektu může být provedeno buď přímo, v tom případě subjekt je přímo vystaven nukleové kyselině nebo vektoru nesoucího nukleovou kyselinu, nebo nepřímo, v tom případě jsou buňky nejdříve transformovány nukleovou kyselinou in vitro a pak přeneseny do subjektu. Tyto dva přístupy jsou známy jako in vivo nebo ex vivo genový přenos.
Ve specifické části vynálezu nukleová kyselina je přímo podávána in vivo, kde probíhá exprese a produkce kódovaného fůzního proteinového produktu. To může být dosaženo některými z množství metod známými v oboru, například konstrukcí části vhodného expresního vektoru nukleové kyseliny a jeho podáním tak, že se stane intracelulámím, například infekcí použitím defektního nebo zeslabeného retrovirálního nebo jiného virálního vektoru (viz. U. S. patent
- 14 CZ 302870 B6
980 286), nebo přímo injekčně podané samotné DNA nebo použitím ostřelováním mikročásticemi (například genového těla; Biolisticu; Dupontu) nebo potaženým lipidy nebo povrchovými buněčnými receptory nebo transfekovanými nosiči, opouzdřenými v liposomech, mikročásticích nebo mikrokapsulích (U. S. patent 5 407 609; 5 814 344 a 5 820 883), nebo jejím podáním ve spojení s peptidem, který je nezbytný pro vstup do jádra, jejím podáním ve spojení s ligandovým subjektem přes receptorem zprostředkovanou endocytózou (viz. například Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429 - 4432), která může být použita na cílové buněčné typy specificky expresí receptorů, a tak podobně. V jiné části vynálezu komplex nukleová kyselina - ligand může být tvořen tak, že ligand obsahuje fuzogenní virální peptid pro rozbití endosomů, což dovoluje nukleové kyselině vyhnout se lysozomální degradaci. V další části vynálezu nukleová kyselina může být cílena in vivo do buněk specifickou absorpcí a expresí přes cílové specifické receptory (viz. například PCT Publications WO 92/06180 dated Apríl 16, 1992; WO 92/22635 dated December 23, 1992; WO 92/20316 dated November 26, 1992; WO 93/14188 dated July 22, 1993; WO 93/20221 dáte October 14, 1993). Volitelně nukleová kyselina může být zavedena intracelulámě a inkorporována do hostitelské buněčné DNA pro expresi přes homologní rekombinaci (Koller and Smithies, 1989, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 8932 - 8935; Zijlstra et al., 1989, Nátuře 342: 435-438).
Ve specifické části vynálezu může být použit virální vektor, jako je retrovirální vektor (viz. Miller et al., 1993, Meth. Enzymol. 217: 581 - 599). Retrovirální vektory byly modifikovány delecí retrovirálních sekvencí, které nejsou nezbytné pro sbalení virální ho genomu a integraci do DNA hostitelské buňky, Fúzní kódující sekvence je klonována do vektoru, který usnadňuje podání nukleové kyseliny příjemci. Více detailů o retrovirálních vektorech lze nalézt v Boesen et al., 1994, Biotherapy 6: 291 - 302, kde je popsáno použití retrovirálního vektoru pro podání mdr 1 genu do hematopoietických kmenových buněk pro zvýšení rezistence kmenových buněk při chemoterapii. Ostatní odkazy, které ukazují použití retrovirálních vektorů v genové terapii, jsou: Clowes et út/,,1994, J. Clin. Invest. 93: 644 - 651; Kiem et al., 1994, Blood 83: 1467 - 1473; Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4: 129-141; and Grossman and Wilson, 1993, Curr. Opion. in Genetics and Devel. 3> 110 — 114.
Adenoviry jsou ostatní virální vektory, které mohou být použity v genové terapii. Adenoviry jsou zvláště vhodný prostředek pro podání genů do dýchacího epitelu. Adenoviry přirozeně infikují dýchací epitel, kde způsobují mírné onemocnění. Jinými cílovými místy pro podávači systémy založených na adenovirech jsou játra, centrální nervový systém, endotelní buňky a svalové buňky. Adenoviry mají tu výhodu, že jsou schopné infikovat nedělící se buňky. Adeno — asociovaný vir (AVV) může být také navržen pro použití in vivo genového transferu (Walsh et al., 1993, Proč. Soc. Exp. Biol. Med 204: 289 - 300).
V této části je nukleová kyselina zavedena do buňky přednostně podáním in vivo výsledné rekombinantní buňce. Takové zavedení může být provedeno nějakou metodou známou v oboru, zahrnující také transfekci, elektroporaci, mikroinjekci, infekci virálním nebo bakteriofágovým vektorem, který obsahuje sekvence nukleové kyseliny, buněčnou fúzí, genovým transferem chromozomálního nosiče, genovým transferem mikrobuněčného nosiče, fúzí sféroplastů a podobně.
V oboru je známo množství technik pro zavedení cizích genů do buněk (viz. například Loeffler and Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217: 599 - 618; Cohen et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:618 — 644; Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29: 69 -92) a mohou být použity v souladu s předkládaným vynálezem.
Polynukleotidy podle vynálezu mohou být také použity v diagnostice tuberkulózy pro detekci specifických polynukleotidových sekvencí Λί tuberculosis u pacienta. Tato detekce může být provedena například izolací polynukleotidů z biologického vzorku získaného od pacienta s podezřením na bakteriální infekci. Pro izolaci polynukleotidů z biologického vzorku, značený polynukleotid podle vynálezu, který je komplementární k jednomu nebo více polynukleotidům, dovoluje hybridizaci na polynukleotidy v biologickém vzorku použitím technik hybridízace nukleo-15 CZ 302870 B6 vých kyselin, které jsou známy odborníkům. Například tato hybridizace může být provedena v roztoku nebo s hybridizačntm partnerem na pevném povrchu.
Terapeutické a profýlaktické použití fúzního proteinu - Purifikované nebo částečně purifikované fúzní proteiny nebo jejich fragmenty mohou být připraveny jako očkování nebo terapeutický prostředek. Takové složení může obsahovat pomocné látky ke zvýšení imunitní reakce. Navíc takové proteiny mohou být dále rozptýleny v olejové emulzi pro případ pomalého uvolnění proteinů in vivo po injekčním podání. Optimální podíl každé složky v přípravku může být určen technikami dobře známými odborníkům.
Některé z různých pomocných látek mohou být použity v očkovacích látkách podle vynálezu ke zvýšení imunitní reakce. Většina pomocných látek obsahuje složky navržené k ochraně antigenů před rychlým ketabolismem, jako je hydroxid hlinitý nebo minerální olej, a nespecifické stimulátory imunitní reakce, jako je lipid A, Bortadella pertusis nebo Mycobacterium tuberculosis. Vhodné pomocné látky jsou komerčně dostupné a zahrnují například Freundovou neúplnou pomocnou látku a Freundovou úplnou pomocnou látku (Difco Laboratories) a pomocnou látku Merck 65 (Merck and Company, lne., Rahway, NJ). Jiné vhodné podpůrné látky zahrnují kamenec, biodegradovatelné mikrokuličky, monofosforyl lipid A, obal A, SBASlc, SBAS2 (Ling et al., 1997, Vaccine 15: 1562- 1567), SBAS7 a AI(OH)3.
V očkovacích látkách podle předkládaného vynálezu je upřednostňováno, aby pomocná látka způsobovala imunitní reakci, zahrnující Thl aspekt. Vhodné soustavy pomocných látek obsahují například kombinaci monofosforyl lipidu A, přednostně 3 - de - O - acylovaného monofosforyl lipidu A (3 D - MLP) společně s hlinitou solí. Vylepšená soustava obsahuje kombinaci monofosforyl lipidu A a saponinového derivátu, zvláště kombinaci 3 D - MLP a saponinu QS 21, jak je uvedeno v WO 94/00153, nebo méně reaktivní složení, kde QS 21 je potlačena cholesterolem, jak je uvedeno v WO 96/33739. Předešlé experimenty ukázaly čistý synergický efekt kombinace 3 D - MLP a QS 21 při indukci humorální imunitní reakce a buněčné imunitní reakce typu Th 1. Zvláště silný přípravek pomocné látky obsahuje QS 21,3 D - MLP a tocoferol v emulzi oleje ve vodě, jak je popsáno v WO 95/17210, aje upřednostňovaným přípravkem.
Přípravky, obsahující antigen podle předkládaného vynálezu, mohou být podány do subjektu per se nebo ve formě farmaceutického nebo terapeutického prostředku. Farmaceutické prostředky, obsahující proteiny, mohou být vyrobeny prostřednictvím tradičních procesů míchání, rozpouštění, granu láce, přípravy dražé, rozmělňování, emulzifíkace, opouzdření, zachycení nebo lyofilizace. Farmaceutické prostředky mohou být připraveny tradičním způsobem s použitím jednoho nebo více fyziologicky přijatelných nosičů, naředění, masťových nebo podpůrných látek, které usnadňují vstup polypeptidů do preparátu, který může být použit farmaceuticky. Vhodná příprava závisí na vybrané cestě použití.
Pro aktuální použití proteiny mohou být připraveny jako roztoky, gely, mastě, krémy, suspenze a tak dále, jak je velmi dobře známo v oboru.
Systémové přípravky obsahují ty, které jsou navržené pro podávání injekčně, například podkožně, nitrožilně, nitrosvalově, do hrudní dutiny, do břišní dutiny, nebo ty, které jsou navrženy pro podání přes kůži, sliznice, ústy nebo plícemi.
Pro injekční podání proteiny mohou být připraveny ve vodných roztocích, přednostně ve fyziologicky slučitelných pufrech, jako je Hanksův roztok, Ringerův roztok nebo fyziologický roztok. Roztok může obsahovat směsné nosiče jako jsou suspendované, stabilizované a/nebo dispergované nosiče. Volitelně proteiny mohou být v práškové formě a před použitím smíchány s vhodným nosičem, například sterilní vodou bez pyrogenu.
Pro podání přes sliznice jsou v přípravku použity vhodné látky prostupující bariéry. Takové prostupující látky jsou obecně známy v oboru.
- 16CZ 302870 B6
Pro ústní podání směs může být snadno připravena kombinací proteinů s farmaceuticky přijatelnými nosiči dobře známými v oboru. Takové nosiče umožňují proteinům být připraveny jako tablety, pilulky, dražé, kapsle, tekutiny, gely, sirupy, řídké kaše, suspenze a podobně, pro ústní užívání subjektem, který je bere. Pro ústní pevné přípravky, jako jsou například prášky, kapsle a tablety, vhodný masťový základ zahrnuje plnidla jako jsou cukry, jako je laktosa, sacharóza, manitol a sorbitol; celulózové přípravky jako je kukuřičný škrob, pšenicový škrob, rýžový škrob, bramborový škrob, želatina, klovatina, metylcelulóza, hydroxypropylmetylcelulóza, sodná sůl karboxy mety lcelulózy a/nebo polyvinylpyrolidin (PVP); granulovaná činidla a vázající činidla, i o Jestliže je to vhodné, mohou být přidána rozkladná činidla, jako je zesítěný polyvinylpyrolidin, agar nebo alginová kyselina nebo její sůl, jako je sodná sůl kyseliny alginové.
Jestliže je to vhodné, pevné dávkové formy mohou být potaženy cukrem nebo střívkem použitím standardních technik.
Pro ústní tekuté přípravky, jako jsou například suspenze, tinktury a roztoky, vhodné nosiče, masťový základ nebo ředidla zahrnují vodu, glykoly, oleje, alkoholy a tak dále.
Pro ústní podání proteiny mohou být ve formě tablet, pastilek a tak dále, připraveny obvyklým způsobem.
Pro inhalační podání proteiny pro použití v souladu s předkládaným vynálezem jsou bez obtíží dodávány ve formě aerosolového spreje v tlakových obalech nebo rozprašovači s použitím vhodného hnacího plynu, například dichlorodífluorometanu, trichlorofluorometanu, dichlorotetra25 fluoroetanu, oxidu uhličitého nebo jiného vhodného plynu. V případě tlakovaného aerosolu dávková jednotka může být zajištěna poskytnutím ventilu k dodání měřitelného množství. Kapsle a náplně, například želatiny, pro použití v inhalátoru nebo insuflátoru mohou být připraveny s obsahem práškové směsi proteinů a vhodného práškového základu, jako je laktosa nebo škrob.
Proteiny mohou být také připraveny ve složení pro podání do konečníku nebo pochvy, jako jsou čípky nebo zadržovací klystýr, obsahující například obvyklý základ čípku, jako je kakao vé máslo nebo jiné glyceridy.
Navíc pro přípravu, popsanou dříve, mohou být proteiny také připraveny jako skladiště příprav35 ku. Takové dlouhodobě působící přípravky mohou být podávány implantací (například podkožně nebo nitrosvalově) nebo nitrosvalově injekčním podáním. Tak například proteiny mohou být připraveny s vhodnými polymemími nebo hydrofobními látkami (například jako emulze v přijatelném oleji) nebo iontoměničová pryskyřice, nebo jako pomalu rozpustné deriváty, například jako pomalu rozpustná sůl.
Volitelně mohou být využity jiné farmaceutické systémy podání. Liposomy a emulze jsou velmi známé příklady prostředků podání, které mohou být použity k podání antigenů. Některá organická rozpouštědla, jako dimetylsulfoxid, také mohou být využita, ačkoliv obvykle zvyšují toxicitu. Fúzní proteiny mohou také být zapouzdřeny do mikrokuliček (U. S. patent 5,407,609;
5,853,763 ; 5,814,344 a 5,820,883). Dodatečně proteiny mohou být podány použitím postupně uvolňujícího systému, jako je semipermeabilní matrice tuhých polymerů, obsahující terapeutickou nebo očkovací látku. Byly nalezeny různé postupně uvolňující materiály a jsou dobře známy odborníkům. Postupně uvolňující kapsle mohou, v závislosti na jejich chemickém složení, uvolňovat proteiny několik týdnů až více než 100 dnů. V závislosti na chemickém charakteru a bio50 logické stabilitě složek mohou být využity další strategie pro stabilizaci proteinů.
Ve schopnostech odborníků je určení účinného množství fúzního proteinu pro indukci imunitní reakce v subjektu, zvláště v případě zde poskytnutého detailního objasnění.
- 17CZ 302870 B6
Účinná dávka může být nejprve odhadnuta z měření in vitro. Například dávka může být připravena na zvířecích modelech k dosažení indukce imunitní reakce použitím technik, které jsou dobře známy v oboru. Každý pracovník v oboru může snadno co nejlépe upravit podávání lidem na základě údajů ze zvířat. Dávkové množství a intervaly mohou být přizpůsobeny individuálně. Například jestliže jsou použity jako očkovací látky, polypeptidy a/nebo polynukleotidy podle vynálezu mohou být podány v přibližně 1 až 3 dávkách v 1 až 36 týdenním období. Přednostně jsou podány tři dávky v intervalech přibližně 3 až 4 městce a zvýšené očkovací dávky mohou být podány opakovaně poté. Pro jednotlivé pacienty může být vhodné střídat léčebné postupy. Vhodná dávka je množství polypeptidů nebo DNA, které, jestliže je podáno jak je uvedeno výše, je schopné zvýšit u imunizovaného pacienta imunitní reakci dostatečně k ochraně pacienta před infekcí M. tuberculosis po dobu alespoň 1 až 2 let. Obecně množství polypeptidů obsaženého v dávce (nebo produkovaného in šitu DNA v dávce) je v rozmezí od přibližně 1 pg do přibližně 100 mg na kg tělesné hmotnosti, obvykle od přibližně 10 pg do přibližně 1 mg a přednostně od přibližně 100 pg do přibližně 1 pg. Vhodné rozmezí dávky se bude lišit s velikostí pacienta, ale obvykle rozmezí bude od přibližně 0,1 ml do přibližně 5 ml.
Diagnostické použití fúzního proteinu - Fúzní polypeptidy podle vynálezu jsou užitečné při diagnóze infekce tuberkulózy in vitro a in vivo. Schopnost polypeptidů podle vynálezu indukovat proliferaci lymfocytů nebo cytokinovou produkci může být měřena metodami uvedenými v části měření imunogenicity.
Z jiného pohledu vynález poskytuje způsoby pro použití jednoho nebo více fúzních polypeptidů při diagnostikování tuberkulózy použitím kožního testu in vivo. Jak je použit zde, kožní test je měření fungující přímo na pacientovy, u kterého je pozdější typ hypersensitivní (DTH) reakce (jako je otok, zčervenání nebo zánět kůže) měřen následujícím podkožním injekčním podáním jednoho nebo více polypeptidů, které jsou popsány výše. Takové injekční podání může být provedeno použitím vhodného zařízení, dostačujícího ke kontaktu polypeptidů s kožními buňkami pacienta, jako je například tuberkolínová stříkačka nebo 1 ml stříkačka. Přednostně je reakce měřena alespoň přibližně 48 hodin po injekčním podání, ještě lépe přibližně 48 až přibližně 72 hodin po injekčním podání.
DTH reakce je buněčná imunitní reakce, která je vyšší u pacientů, kteří byli dříve podrobeni antigenovému testu (například imunogenickou částí použitého polypeptidů nebo jeho obměn). Reakce může být měřena vizuálně, s použitím stupnice. Obecně je reakce, která je větší než přibližně 0,5 cm v průměru, přednostně více než přibližně 1,0 cm v průměru, pozitivní reakce, svědčící o tuberkulózové infekci, která se může nebo nemusí projevit aktivní chorobou.
Fúzní polypeptidy podle tohoto vynálezu jsou přednostně připraveny, pro použití při kožním testu, jako farmaceutické prostředky obsahující polypeptid a fyziologicky přijatelný nosič. Takové prostředky obvykle obsahují jeden nebo více výše uvedených polypeptidů v množství v rozmezí přibližně od 1 pg do přibližně 100 pg, přednostně od přibližně 10 pg do přibližně 50 pg v objemu 0,1 ml. Přednostně použitý nosič v takových farmaceutických prostředcích je fyziologický roztok s vhodnými konzervačními přísadami, jako je fenol a/nebo Tween 80 .
Z jiného pohledu předkládaný vynález poskytuje způsoby pro použití polypeptidů pro diagnostiku tuberkulózy. Z tohoto pohledu jsou metody využity pro zjištění infekce M. tuberculosis v biologickém vzorku použitím fúzních polypeptidů samotných nebo v kombinaci. Jak je použit zde, „biologický vzorek“ je vzorek, obsahující protilátku, získaný od pacienta. Přednostně je vzorek samotná krev, hlen, sérum, plasma, sliny, mozkomíšní mok nebo moč. Ještě lépe vzorek je krevní, sérový nebo plasmový vzorek, získaný od pacienta, nebo krevní derivát. Polypeptid(y) je používán v měření, jak je popsáno níže, k určení přítomnosti nebo nepřítomnosti protilátek proti polypeptidu(ům) ve vzorku ve vztahu k běžným hodnotám. Přítomnost takových protilátek ukazuje na předcházející zcitlivění proti mykobakteriálním antigenům, které může svědčit o tuberkulóze.
- 18 CZ 302870 B6
V částech vynálezu, ve kterých je použito více než jednoho fúzního polypeptidu, použité peptidy jsou přednostně komplementární (například, jedna část polypeptidu bude mít sklon ke zjištění infekce ve vzorcích, kde infekce nebude zjištěna jinou částí polypeptidu). Komplementární polypeptidy mohou obecně být určeny použitím každého polypeptidu jednotlivě k určení sérových vzorků, získaných od řady pacientů, o kterých je známo, že jsou infikovány Λί tuberculosis. Po určení, které testované vzorky jsou pozitivní (jak je popsáno níže) sjakým polypeptidem, mohou být připraveny kombinace dvou nebo více fúzních polypeptidů, kteréjsou schopné zjistit infekci ve většině nebo ve všech testovaných vzorcích. Takové polypeptidy jsou komplementární. Přibližně 25 až 30 % sér od tuberkulózy infikovaných jedinců jsou negativní na protilátky proti samotnému proteinu. Komplementární polypeptidy mohou tedy být použity ve spojení se zvýšením citlivosti diagnostického testu.
Odborníkům jsou známy různé druhy měření pro použití jednoho nebo více polypeptidů ke zjištění protilátek ve vzorku. Viz. například Harlow and Lané, Antibodies: A Laboratory Mcmual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, který je zde zahrnut do odkazů. V upřednostňované části měření zahrnuje použití polypeptidu, imobilizovaného na pevném podkladě, k navázání a odstranění protilátky ze vzorku. Navázaná protilátka může pak být určena použitím detekční látky, která obsahuje detekční skupinu. Vhodné detekční látky zahrnují protilátky, kteréjsou navázané na protilátka / polypeptidový komplex a volný polypeptid značený detekční skupinou (například při semikompetitivním měření). Volitelně může být použito kompetitivní měření, při kterém je protilátka, která je navázána na polypeptid, značena detekční skupinou a dovoluje navázání na imobilizovaný antigen po inkubaci antigenů se vzorkem. Rozsah, ve které složky vzorku zabraňují navázání značené protilátky na polypeptid, svědčí o schopnosti reakce vzorku s (mobilizovaným polypeptidem.
Pevný podklad může být pevná látka, známá odborníkům, se kterou antigen může být spojen. Pevný podklad může být například testovací jamka na mikrotitrační destičce nebo na nitrocelulóze nebo jiné vhodné membráně. Volitelně podklad mohou tvořit korálky nebo kotoučky, skleněné, laminátové, latexové nebo z plastických materiálů, jako je polystyren nebo polyvinylchlorid. Podklad mohou také tvořit magnetické částice nebo senzory z optických vláken, jak je uvedeno například v U. S. patent 5,359,681.
Polypeptidy mohou být navázány na pevný podklad použitím různých technik známých odborníkům. V souvislosti s předkládaným vynálezem se termín „navázané“ vztahuje jak k nekovalentním vazbám, jako je adsorpce, tak ke kovalentním vazbám (které mohou být přímým spojením mezi antigenem a funkčními skupinami na podkladě nebo mohou být spojením přes spojující činidlo). Upřednostňováno je navázání adsorpct do jamky na mikrotitrační desce nebo na membráně. V takových případech adsorpce může být dosaženo kontaktem polypeptidu, ve vhodném pufru, s pevným podkladem po vhodnou dobu. Doba kontaktu se liší podle teploty, aleje obvykle mezi přibližně 1 hodinou a 1 dnem. Obecně kontakt jamky mikrotitrační desky z plastu (jako je polystyren nebo polyvinylchlorid) s množstvím polypeptidu v rozmezí od přibližně 10 ng do přibližně 1 pg, přednostně přibližně 100 ng, je dostatečný k navázání odpovídajícího množství antigenu.
Kovalentní vazby polypeptidu na pevný podklad může být obecně dosaženo jednou reakcí podkladu s bifunkčním činidlem, které bude reagovat s podkladem a funkční skupinou, jako je hydroxy 1 nebo amino skupina, na polypeptidu. Například polypeptid může být navázán na povrchy, které mají vhodný polymemí povlak, použitím benzochinonu nebo kondenzací aldehydové skupiny na povrchu s aminem a na polypeptidu s aktivním vodíkem (viz. například Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook. 1991, at A 12-A 13).
V některých částech jek měření použito enzymu navázaného na imunosorbent (ELISA). Toto měření může být uskutečněno prvním kontaktem fúzního polypeptidového antigenů, který byl imobilizován na pevný povrch, obvykle do prohlubně mikrotitrační desky, se vzorkem, jakým jsou protilátky proti polypeptidu ve vzorku, kteréjsou schopné navázat se na imobilizovaný poly- 19CZ 302870 B6 peptid. Nenavázaný vzorek je pak odstraněn z imobilizovaného polypeptidu a je přidáno detekční Činidlo, schopné navázání na i mobilizovaný komplex protilátka - polypeptid. Množství detekčního činidla, které se nenavázalo na pevný povrch, je pak určeno použitím metody vhodné ke specifické detekci činidla.
Přesněji, jakmile je polypeptid imobilizován na povrchu, jak je popsáno výše, zbývající proteinová vazebná místa jsou obvykle blokována. Může být využito vhodné blokující činidlo, známé odborníkům, jako je hovězí sérový albumin nebo Tween 20™ (Signa Chemical Co., St. Louis, MO). Imobilizovaný polypeptid je pak inkubován se vzorkem a protilátka se může navázat na antigen. Vzorek může být před inkubací rozpuštěn ve vhodném rozpouštědle, jako je fyziologický roztok pufrovaný fosfáty (phosphate - buffered šalině, PBS). Obecně vhodná doba kontaktu je časový úsek, který je dostatečný ke zjištění protilátky ve vzorku infikovaném M tuberculosis. Přednostně je doba kontaktu dostatečná, jestliže je dosaženo hladiny navázání alespoň 95 % z navázání, kterého je dosaženo při rovnováze mezi navázanou a nenavázanou protilátkou. Odborníci uznají, že doba nezbytná k dosažení rovnováhy může být snadno určena z měření hladiny navázání v průběhu času. Při pokojové teplotě je obecně dostatečná doba inkubace přibližně 30 minut.
Nenavázaný vzorek pak může být odstraněn promytím pevného povrchu vhodným pufrem, jako je PBS obsahující 0,1 % Tween 20™. Pak může být detekční činidlo přidáno k pevnému povrchu. Vhodné detekční činidlo je sloučenina, která se váže na imobilizovaný komplex protilátka - polypeptid a která může být detekována různými způsoby známými v oboru. Přednostně detekční činidlo obsahuje složku (například protein A, protein G, lectin nebo volný antigen), konjugovanou s detekční skupinou. Upřednostňované detekční skupiny zahrnují enzymy (jako je peroxidáza křenu selského), substráty, kofaktory, inhibitory, barviva, radionuklidy, luminiscentní skupiny, fluoroscentní skupiny, biotik a koloidní částice, jako je koloidní zlato nebo selen. Konjugace vázající složky na detekční skupinu může být dosaženo použitím standardních metod, které jsou známy odborníkům. Obvykle vázající složka může být také zakoupena konjugovaná na různé detekční skupiny z komerčních zdrojů (například Zymed Laboratories, San Francisco, CA, and Pierce, Rockford. IL).
Detekční činidlo je pak inkubováno s imobilizovaným komplexem protilátka - polypeptid po dobu dostatečnou k detekci navázané protilátky. Vhodná doba může být obecně určena z pracovního protokolu nebo měřením hladiny navázání v časovém intervalu. Nenavázané detekční činidlo je pak odstraněno a detekční činidlo je detekováno pomocí detekční skupiny. Použitá metoda pro detekci detekční skupiny závisí na charakteru detekční skupiny. Pro radioaktivní skupiny je obecně vhodné scintilační měření nebo autoradiografické metody. Spektroskopické metody mohou být použity pro detekci barviv, luminiscentních skupin a fluorescentních skupin. Biotin může být detekován použitím avidinu, spojeného s jinou detekční skupinou (obvykle radioaktivní nebo fluorescentní skupina nebo enzym). Enzymové detekční skupiny mohou být obecně detekovány přídavkem substrátu (obecně během specifického časového úseku) a následující spektroskopické nebo jiné analýzy reakčních produktů.
K určení přítomnosti nebo absence protilátek proti M. tuberculosis ve vzorku je signál, detekovaný od detekční skupiny, která je navázána na pevném povrchu, obecně srovnatelný se signálem, který odpovídá běžným hodnotám. V jedné upřednostňované části vynálezu je běžná hodnota průměrný střední signál, získaný, když imobilizovaný antigen je inkubován se vzorky od neinfikovaného pacienta. Obecně vzorek, který generuje signál, který je tri standardní odchylky nad běžnou hodnotou, je pokládán za pozitivní tuberkulózu. V alternativní upřednostňované části běžná hodnota je určena použitím získané operační křivky (Receiver Operátor Curve) podle metody podle Sackett et al., 1985, Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Médie ine, Little Brown and Co., pp. 106 - 107. Stručně v této části běžná hodnota může být určena z diagramu dvojic pozitivních poměrů (například citlivosti) a falešně pozitivních poměrů (100 % specifičnosti), které odpovídají každé možné běžné hodnotě pro výsledek diagnostického testu. Běžná hodnota na diagramu, která je posunuta do horního levého rohu (například hodnota, která
-20CZ 302870 B6 je vložena do celé plochy) je přesnější běžná hodnota a vzorek vysílající signál, který je vyšší než běžná hodnota určená touto metodou, může být pokládán za pozitivní. Volitelně běžná hodnota může být posunuta doleva podle diagramu, pro minimalizování falešného pozitivního poměru, nebo doprava, pro minimalizování falešného negativního poměru. Obecně vzorek vysílající signál, který je vyšší než běžná hodnota určená touto metodou, je pokládán za pozitivní na tuberkulózu.
V odpovídající části je měření provedeno s použitím rychlé přímé průtočné nebo proužkové metody, ve kterém je antigen imobilizován na membránu, jako je nitrocelulóza. Při přímé průtočné metodě se protilátky ve vzorku naváží na imobilizovaný polypeptid, když vzorek prochází přes membránu. Detekční činidlo (například protein A - koloidní zlato), které se naváže na komplex protilátka - polypeptid jako roztok, obsahující detekční činidlo, protéká přes membránu. Detekce navázaného detekčního činidla může pak být provedena tak, jak je popsáno výše. Při použití proužkové metody jeden konec membrány, na kterém je polypeptid navázán, je ponořen do roztoku obsahující vzorek. Vzorek putuje podél membrány přes oblast obsahující detekční činidlo a do oblasti imobilizovaného polypeptidů. Koncentrace detekčního činidla na polypeptidů dokazuje přítomnost protilátek proti M. tuberculosis ve vzorku. Obvykle koncentrace detekčního činidla na tomto místě vytvoří obrazec, jako je přímka, která může být vizuálně odečtena. Nepřítomnost takového obrazce dokazuje negativní výsledek. Obecně množství polypeptidů, imobilizovaného na membránu, je zvoleno tak, aby vytvořilo vizuálně rozeznatelný obrazec, jestliže biologický vzorek obsahuje množství protilátek, které je dostatečné k vytvoření pozitivního signálu při ELISE, jakje ukázáno výše. Přednostně množství polypeptidů, imobilizovaného na membránu, je v rozmezí od přibližně 5 ng do přibližně 1 μg a lépe od přibližně 50 ng do přibližně 500 ng. Takové testy mohou být obvykle provedeny s velmi malým množstvím (například jednou kapkou) pacientova séra nebo krve.
Vynález byl popsán, následující příklady jsou poskytnuty pro jasné vysvětlení.
Přehled obrázků na výkresech obr. 1 A a 1 B: Nukleotidové sekvence (SEQ ID NO: 1) a aminokyselinová sekvence (SEQ
ID NO: 2) tri - fúzního proteinu Ra 12 - TbH 9 - Ra 35 (označená Mtb 32 A).
obr. 2: Nukleotidové sekvence (SEQ ID NO: 3) a aminokyselinová sekvence (SEQ
ID NO: 4) tri - fúzního proteinu Erd 14 - DPV - MTI (označená Mtb 39 A), obr. 3 A až 3 D: Nukleotidové sekvence (SEQ ID NO: 5) a aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO: 6) tri - fúzního proteinu TbRa 3 - 38 kD - Tb38 - 1, obr. 4 A až 4 D: Nukleotidové sekvence (SEQ ID NO: 7) a aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO: 8) bi - fúzního proteinu TbH 9 - Tb 38 - 1.
obr. 5 A až 5 J: Nukleotidové sekvence (SEQ ID NO: 9) a aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO: 10) tetra - fúzního proteinu TbRa 3 - 38 kD - Tb 38 - 1 - DPEP (označená TbF - 2).
obr. 6 A a 6 B: Nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 11) a aminokyselinová sekvence (SEQ
ID NO: 12) penta - fúzního proteinu Erd 14 - DPV - MTI - MSL - MTCC 2 (označená Mtb 88 f).
obr. 7 A a 7 B: Nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 13) a aminokyselinová sekvence (SEQ
ID NO: 14) tetra - fúzního proteinu Erd 14 - DPV - MTI - MSL (označená Mtb 46 f).
*21 CZ 302870 B6 obr. 8 A a 8 B: Nukleotidové sekvence (SEQ ID NO: 15) a aminokyselinová sekvence (SEQ
ID NO: i 6) tetra - fúzního proteinu DPV - MTI - MSL - MTCC 2 (označená Mtb 71 f)obr. 9 A a 9 B: Nukleotidové sekvence (SEQ ID NO: 17) a aminokyselinová sekvence (SEQ
ID NO: 18) tri - fúzního proteinu DPV - MTI - MSL (označená Mtb 31 f)· obr. 10 A a 10 B: Nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 19) a aminokyselinová sekvence (SEQ io ID NO: 20) tri - fúzního proteinu TbH 9 - DPV - MTI (označená Mtb 61 f)· obr. 11 A a 11 B: Nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 21) a aminokyselinová sekvence (SEQ
ID NO: 22) tri - fúzního proteinu Erd 14 - DPV - MTI (označená Mtb 36 f).
obr. 12 A a 12 B: Nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 23) a aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO: 24) bi - fúzního proteinu TbH 9 - Ra 35 (označená Mtb 59 f).
obr. 13 A a 13 B: Nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 25) a aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO: 26) bi - fúzního proteinu Ra 12 - DPPD (označená Mtb 24).
obr. 14 A až 14 F: Proliferace T lymfocytů šesti PPD+ subjektů, jestliže jsou stimulovány dvěma fúzními proteiny a jejich jednotlivými složkami.
obr. 15 A až 15 F: Produkce IFN -γ šesti PPD+ subjektů, jestliže jsou stimulovány dvěma fúzními proteiny a jejich jednotlivými složkami.
obr. 16 A a 16 F: Proliferace T lymfocytů myší, imunizovaných fúzním proteinem nebo jeho jednotlivými složkami a pomocnou látkou.
obr. 17: Produkce IFN -γ myšmi, imunizovaných fúzním proteinem nebo jeho jednotlivými složkami a pomocnou látkou.
obr. 18: Produkce IL - 4 myšmi, imunizovaných fúzním proteinem nebo jeho jednotlivými složkami a pomocnou látkou.
obr. 19 A až 19 F: Koncentrace protilátek v séru myší, imunizovaných fúzním proteinem nebo jeho jednotlivými složkami a pomocnou látkou.
obr. 20 A až 20 C: Zůstatek guinejských prasat po aerosolovém imunologickém testu Až tubercu40 losis. Fúzní proteiny, Mtb 32 A a Mtb 39 A, byly připraveny s pomocnou látkou SBAS 1 c (20 A), SBAS 2 (20 B) nebo SBAS 7 (20 C) a použity jako imunogen v guinejských prasatech v předcházejícím imunologickém testu $ bakteriemi. BCG je pozitivní kontrola.
obr. 21 A a 21 B: Stimulace proliferace a produkce IFN - γ v TbH 19-1 specifických T Iymfocytech fúzním proteinem TbH 9 - Tb 38 - 1.
obr. 22 A a 22 B: Stimulace proliferace a produkce IFN - γ v Tb 38 - 1 specifických T lymfocytech fúzním proteinem TbH 9 - Tb 38 - 1.
obr. 23 A a 23 B: Stimulace proliferace a produkce IFN - γ v T lymfocytech, které dříve vykazovaly odpověď na oba antigeny TbH - 9 a Tb 38 - 1, fúzním proteinem TbH 9-Tb38- 1.
-22CZ 302870 B6
Příklad provedení vynálezu
Fúzní proteiny antigenů M. Tuberculosis si uchovávají imunogenicitu jednotlivých částí.
Materiál a metody
Konstrukce fuzních proteinů - Kódující sekvence antigenů M Tuberculosis byly modifikovány PCR pro usnadnění jejich fúze a následné exprese fúzního proteinu. Amplifíkace DNA byla uskutečněna použitím 10 μΐ lOx Pfú pufru, 2 μΐ 10 mM dNTPs, 2 μΐ každého PCR primeru v 10 μΜ koncentraci, 81,5 μΐ vody, 1,5 μΐ Pfu DNA polymerázy (Stratagene, La Jolla, CA) a 1 μΐ DNA v buď 70 ng/μΙ (pro antigen TbRa 3), nebo 50 ng/μΙ (pro antigeny 38 kD a Tb 38 - 1). Pro antigen TbRa 3 byla provedena denaturace při 94 °C po dobu 2 minut, následována 40 cykly 96 °C po 15 sekundách a 72 °C po 1 minutě a nakonec 72 °C po 4 minuty. Pro 38 kD antigen byla provedena denaturace při 96 °C po dobu 2 minut, následována 40 cykly 96 °C po 30 sekundách, 68 PC po 15 sekundách a 72 °C po 3 minutách a nakonec 72 °C po 4 minuty. Pro antigen Tb 38 - 1 denaturace při 94 °C po dobu 2 minut byla následována 10 cykly 96 °C po 15 sekundách, 68 °C po 15 sekundách a 72 °C po 1,5 minutě, 10 cykly 96 °C po 15 sekundách, 64 °C po 15 sekundách a 72 °C po 1,5 a nakonec 72 °C po 4 minuty.
Po následující úpravě restrikční endonukleázou, poskytující vhodné kohézní nebo tupé konce, byl polynukleotid, specifický pro každý fúzní polypeptid, ligován do expresního plasmidu. Každý výsledný plasmid obsahuje kódující sekvence jednotlivých antigenů každého fúzního póly peptidu, Použité expresní vektory byly pET -l2bapT7AL2ILl.
Tři kódující sekvence pro antigeny Ra 12, TbH 9 a Ra 35 byly ligovány do jednoho kódovaného fúzního proteinu (SEQ ID NOS: 1 a 2) (obr. 1 A a 2 B). Jiné tři kódující sekvence pro antigeny Erd 14, DPV a MTI byly ligovány do kódovaného druhého fúzního proteinu (SEQ ID NOS: 3 a 4) (obr. 2). Tři kódující sekvence pro antigeny TbRa 3, 38 kD a Tb 38 - 1 byly ligovány do jed30 noho kódovaného fúzního proteinu (SEQ ID NOS: 5 a 6) (obr. 3 A - 3 D). Dvě kódující sekvence pro antigeny TbH 9 a Tb 38 - 1 byly ligovány do jednoho kódovaného fúzního proteinu (SEQ ID NOS: 7 a 8) (obr. 4 A - 4 D). Čtyři kódující sekvence pro antigeny TbRa 3, 38 kD, Tb 38 - 1 a DPEP byly ligovány do jednoho kódovaného fúzního proteinu (SEQ ID NOS: 9 a 10) (obr. 5 A - 5 J). Pět kódujících sekvencí pro antigeny Erd 14, DPV, MTI, MSL a MTCC 2 byly ligovány do jednoho kódovaného fúzního proteinu (SEQ ID NOS: 11 a 12) (obr. 6 A a 6 B). Čtyři kódující sekvence pro antigeny Erd 14, DPV, MTI a MSL byly ligovány do jednoho kódovaného fúzního proteinu (SEQ ID NOS: 13 a 14) (obr. 7 A a 7 B). Čtyři kódující sekvence pro antigeny DPV, MTI, MSL a MTCC 2 byly ligovány do jednoho kódovaného fúzního proteinu (SEQ ID NOS: 15 a 16) (obr. 8 A a 8 B). Tři kódující sekvence pro antigeny DPV, MTI a MSL byly ligovány do jednoho kódovaného fúzního proteinu (SEQ ID NOS: 17 a 18) (obr. 9 A a 9 B). Tři kódující sekvence pro antigeny TbH 9, DPV a MTI byly ligovány do jednoho kódovaného fúzního proteinu (SEQ ID NOS: 19 a 20) (obr. 10 A a 10 B). Tři kódující sekvence pro antigeny Erd 14, DPV a MTI byly ligovány do jednoho kódovaného fúzního proteinu (SEQ ID NOS: 21 a 22) (obr. 11 A a 11 B). Dvě kódující sekvence pro antigeny TbH 9 a Ra 35 byly ligovány do jednoho kódo45 váného fúzního proteinu (SEQ ID NOS: 23 a 24) (obr. 12 A a 12 B). Dvě kódující sekvence pro antigeny Ra 12 a DPPD byly ligovány do jednoho kódovaného fúzního proteinu (SEQ ID NOS: 25 a 26) (obr. 13 A a 13 B).
Rekombinantní proteiny byly exprimovány v £. coli se šesti histidinovými zbytky v N-koncové části použitím pET plasmidového vektoru (pET - 17 b) a T 7 RNA polymerázového expresního systému (Novagen, Madíson, WI). Pro silnou expresi byl použit kmen E. coli BL 21 (DE 3) pLysE (Novagen). Rekombinantní (His - Tag) fúzní proteiny byly purifíkovány z tekutého supernatantu nebo nerozpustného inkluzního tělíska z 500 ml IPTG indukovaných vsádkových kultur afinitní chromatografii použitím jednoho kroku QIA express Ni - NTA agarózového základu (QIAGEN, Chatsworth, CA) v přítomnosti 8 M močoviny. Stručně, 20 ml přes noc saturované
-23 CZ 302870 B6 kultury BL 21, obsahující pET konstrukt, bylo přidáno do 500 ml 2 x YT média, obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu a 34 pg/ml chloramfenikolu, a rostlo při 37 °C za míchání. Bakteriální kultury byly indukovány 2 mM IPTG pri OD 560 0,3 a rostly ještě 3 hodiny (O. D. - od 1,3 do 1,9). Buňky byly získány z 500 ml vsádkových kultur centrifugací a resuspendováním ve 20 ml spojovacího pufru (0,1 M sodný fosfát, pH 8,0; 10 mM Tris - HCI, pH 8,0), obsahujícího 2 mM PMSF a 20 pg/ml leupeptinu plus kompletní tabletu inhibitoru proteázy (Boehringer Mannheim) na 25 ml. E. coli byla lyžována zmražením a rozmražením, následovaným krátkým působením ultrazvuku, pak byla stočena pri 12 k rpm a 30 minutách do pelety inkluzních tělísek.
Inkluzní tělíska byly promyty třikrát v 1 % CHAPS v 10 mM Tris - HCI (pH 8,0). Tento krok značně snižuje hladinu kontaminujícího LPS. Inkluzní tělísko bylo nakonec rozpuštěno ve 20 ml spojovacího pufru, obsahujícího 8 M močovinu nebo 8 M močovina byla přidaná po stočení přímo do supematantu. Rekombinantní fúzní proteiny s His - Tag zbytky byly ve várkách navázány na Ni - NTA agarózovou pryskyřici (5 ml pryskyřice na 500 ml indukované várky) třepáním při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny a celkové projití přes kolonu. Průtok skrz byl proveden dvakrát přes tu samou kolonu a kolona byla třikrát promyta promývacím pufrem (0,1 M fosforečnan sodný a 10 mM Tris - HCI, pH 6,3) také obsahujícím 8 M močovinu. Navázaný protein byl eluován 30 ml 150 mM imidazolu v promývacím pufru a byly odchytávány 5 ml frakce. Frakce, obsahující některý rekombinantní fúzní protein, byly použity dále, dialyzovány proti 10 mM trisHCl (pH 8,0), navázány jednou nebo vícekrát na Ni - NTA podklad, eluovány a dialyzovány v 10 mM Tris - HCI (pH 7,8). Množství rekombinantního proteinu kolísá od 25 do 50 mg na litr indukované bakteriální kultury s vyšší než 98 % čistotou. U rekombínantních proteinů byla měřena endotoxinová kontaminace použitím Limulusového měření (BioWhittaker) a byl zjištěn obsah < 10E. U.Img.
Měření proliferace T lymfocytů - Purifikované fúzní polypeptidy byly testovány, zdajsou schopny indukovat proliferaci T lymfocytů v přípravcích z periferních krevních mononukleámích buněk (PBMC). PBMC od dárců, kteří měli pozitivní PPD kožní test a u kterých byla pozorována proliferace T lymfocytů jako reakce na PPD, a nezpracované rozpustné proteiny M. tuberculosis byly upraveny na RPMI 1640, doplněny 10 % uchovaným lidským sérem a 50 pg/ml gentamicinu. Purifikované proteiny byly přidány dvojmo v koncentraci od 0,5 do 10 pl/ml. Po šesti dnech přípravy v 96 jamkách na destičce s kulatým dnem v objemu 200 pl bylo 50 pl média odebráno z každé jamky pro určení hladiny IFN - γ, jak je popsáno níže v Měření interferonů γ. Destičky byly poté inkubovány s 1 pCi/jamka triciovaného thymidinu po dobu dalších 18 hodin, odebrány a bylo v nich změřeno tricium použitím plynového scintilačního detektoru. Frakce, které dávají při proliferaci v obou paralelkách třikrát větší reakci, než je pozorována pri proliferace buněk kultivovaných v samotném médiu, byly označeny za pozitivní.
Měření interferonů - γ - Sleziny z myší byly asepticky odebrány a byla připravena suspenze jednotlivých buněk v kompletním RPMI, následována lýzí červených krvinek. 100 pl buněk (2 x 10“5 buněk) bylo umístěno do jamky v 96 jamkové mikrotitrační destičce s rovným dnem. Kultury byly stimulovány označenými rekombinantními proteiny 24 hodin a v supematantu byl změřen IFN-γ.
Hladina IFN - γ v supematantu byla analyzována nekompetitivní EL1SOU použitím dvojic protilátek a postupu dostupnému od PharMingenu. Standardní křivky byly připraveny použitím rekombínantních myších cytokinů. ELIS A destičky (Corning) byly potaženy 50 pl/jamka (1 pg/ml, v 0,1 M uhličitan obsahujícího pufru, pH 9,6) cytokinů vázaného mAb (krysí protimyší IFN - γ (PharMingen; Cat. # 18181 D)) a inkubovány 4 hodiny při pokojové teplotě. Třepání destiček, obsahujících a blokovaných PBS - 0,05 % Tweenem, 1,0 % BSA (200 pl/jamka), probíhalo pres noc pri 4 °C a pak byly promyty 6 x v PBS - 0,1 % Tweenem. Standardy (myší IFN γ) a vzorky supematantů, zředěných PBS - 0,05 % Tweenem, 0,1 % BSA, byly pak přidány na 2 hodiny při pokojové teplotě. Destičky byly promyty jak je uvedeno výše a pak inkubovány 2 hodiny při pokojové teplotě se 100 pl/jamka druhého Ab (krysí biotin a myší IFN - γ (Cat. #
-24CZ 302870 B6
18112 D; PharMingen) při 0,5 pg/ml zředěného PBS - 0,05 % Tweenem, 0,1 % BSA. Po promytí destičky byly inkubovány se 100 μΐ / jamka streptavidin - HRP (Zymed), zředěného 1 : 2500 PBS - 0,05 Tweenem, 0,1 % BSA při pokojové teplotě 1 hodinu. Destičky byly promyty naposledy a vyvinuty se 100 μΙ/jamka TMB substrátu (3,3 5,5' - tetramethylbenzidin, Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD) a reakce je zastavena po zbarvení H2SO4, 50 μΙ/jamka. Absorbance (O. D.) byla určena při 450 nm použitím 570 nm jako referenční vlnové délky a koncentrace cytokinů určena použitím standardní křivky.
Výsledky
Trojfuzními proteiny indukovaná imunitní reakce - Tři kódující sekvence antigenu M tuberculosis byly vloženy do expresního vektoru pro produkci fůzního proteinu. Antigeny, označené Ra 12, TbH 9a Ra 35, byly produkovány jako jeden fuzní protein (obr. 1 A a 1 B). Antigeny Erd 14, DPV a MTI byly produkovány jako druhý fúzní protein (obr. 2). Dva fúzní proteiny byly puntíkovány afinitní chromatografii pro použití v in vitro a in vivo měření.
Dva fuzní proteiny byly testovány, zda jsou schopny stimulovat reakci T lymfocytů ze šesti PPD+ subjektů. Když byla měřena proliferace T lymfocytů, oba fúzní proteiny se projevily podobnou reaktivitou jako jejich jednotlivé části (obr. 14 A až 14 F). Podobné výsledky byly získány, když byla měřena produkce IFN - γ (obr. 15 A a 15 F). Například subjekt D 160 reagoval na antigeny TbH 9 a MTI jednotlivě. Subjekt D 160 také reagoval na fuzní proteiny, které obsahovaly tyto antigeny (obr. 14 B a 15 B). Naopak reakce T lymfocytů zD 160 na jiné jednotlivé antigeny nebyla pozorována. Jiný subjekt, D 201, který nereagoval s jednotlivými antigeny Erd 14, DPV nebo MTI, nebyl také citlivý na fúzní proteiny, obsahující tyto antigeny. Můžeme si všimnout, že když reakce T lymfocytů na jednotlivé části dvou fúzních proteinů nebyla zvlášť silná, fúzní proteiny vyvolaly ve většině případů reakci, která byla stejná nebo vyšší než ta, která byla indukována jednotlivými antigeny.
Trojfúzní proteiny Ra 12 - TbH 9 - Ra 35 byly také testovány jako imunogeny in vivo. V těchto experimentech byl pro imunizaci fuzní protein podán injekčně do měkké části nohy myší. Každá skupina tří myší dostala protein v různých pomocných látkách: SBAS 1 c, SBAS 2 (Linge et aí, 1997, Vaccine 15: 1562 - 1567), SBAS 7 a A1(OH)3. Po dvou podkožních imunizacích ve třech týdenních intervalech byla zvířata o další týden později usmrcena a jejich vysušené mízní uzliny byly odebrány pro použití jako referenční lymfocyty při měření proliferace T lymfocytů a produkce cytokinů.
Bez ohledu na to, která pomocná látka byla použita při imunizaci, byla indukována silná proliferace T lymfocytů proti TbH 9, když byl použit jako jednotlivý antigen (obr. 16 A). Slabší reakce byla indukována proti Ra 35 a Ra 12 (obr. 16 B a 16 C). Když byl Ra 12 - TbH 9 - Ra 35 fúzní protein použit jako imunogen, reakce byla podobná s tou, která byla pozorována proti jednotlivým složkám.
Když byla měřena produkce cytokinů, pomocné SBAS 1 c a SBAS 2 vyvolaly podobnou reakci IFN - γ (obr. 17) a IL - 4 (obr. 18). Nicméně kombinace SBAS 7 a hydroxidu hlinitého vyvolává nej silnější IFN - γ reakci a nejnižší produkci IL - 4 pro všechny tri antigeny. Vzhledem k odpovědi humorálními protilátkami in vivo, figuře 19 A až 19 F ukazují, že fůzní protein vyvolává obě IgG) a IgG2A antigen - specifické reakce, když byl použit s jakoukoliv ze tří pomocných látek.
Dodatečně byly imunizovány C 57 BL / 6 myši kombinací dvou expresních konstruktů, každý obsahoval kódující sekvenci Ra 12 - TbH 9 - Ra 35 (Mtb 32 A) nebo Erd 14 - DPV - MTI (Mtb 39 A) jako DNA očkovací látku. Při následné aerosolové stimulaci živými bakteriemi byla imunizovaná zvířata významně chráněna proti tuberkulóze. Na základě těchto výsledků byly připraveny fúzní konstrukty Mtb 32 A a Mtb 39 A kódujících sekvencí, a jimi kódovaný produkt byl testován na modelových guinejských prasatech jako dlouhodobá ochrana. V této studii guinejská
-25CZ 302870 B6 prasata byla imunizována samostatným rekombinantním fúzním proteinem nebo směsí proteinů Mtb 32 A a Mtb 39 A ve směsi obsahující pomocnou látku. Obr. 20 A až 20 C ukazuje, že guinejská prasata, imunizovaná fúzním proteinem v SBAS 1 c nebo SBAS 2, byla lépe chráněna proti rozvinutí tuberkulózy při další stimulaci ve srovnání se zvířaty, imunizovanými dvěma pro5 ti látkami ve směsí v pomocné látce stejného složení. Fúzní proteiny ve směsi SBAS 2 umožnily u zvířat nej lepší ochranu. Tak mohou být fúzní proteiny různých antigenů M. tuberculosis použity v očkovací látce jako efektivnější imunogeny nežje směs jednotlivých složek.
Imunitní reakce indukovaná dvoj fúzním proteinem - Dvoj fúzní protein, obsahující antigeny io TbH-9 a Tb 38 - 1 bez čepové sekvence, byl produkován rekombinantními metodami. Byla zkoušena schopnost fúzního proteinu TbH 9 - Tb 38 - 1 indukovat proliferaci T lymfocytů a produkci IFN - γ. Byly použity PBMC od tří dárců: u jednoho dárce byla dříve zjištěna reakce na
TbH 9, ale ne na Tb 38 - 1 (dárce 131); u dalšího byla zjištěna reakce na Tb 38 - 1, ale ne na TbH 9 (dárce 184); a u dalšího byla zjištěna reakce na oba antigeny (dárce 201). Výsledky těchto i5 studií ukazují funkční aktivitu obou antigenů ve fúzním proteinu (obr. 21 A a 21 B, 22 A a 22 B a23 Aa23 B).
Reakce čtyřfúzního proteinu se sérem pacienta s tuberkulózou - Fúzní protein, obsahující TbRa
3, antigen 38KD, Tb38-la DPEP, byl produkován rekombinantními metodami. Reaktivita 20 tohoto čtyřfúzního proteinu, která se vztahuje k TbF - 2 ze séra z pacientů, infikovaných M. tuberculosis, byla testována ELISOU. Výsledky těchto studií (tabulka l) ukazují, že všechny čtyři antigeny jsou ve fúzním proteinu nezávisle funkční.
Odborník ocení, že uspořádání jednotlivých antigenů v každém fúzním proteinu může být změně25 no a že srovnání aktivit dává předpoklad, že každý epitop je stále funkčně dostupný. Dále zkrácené formy proteinů, obsahující aktivní epitopy, mohou být použity pro přípravu fúzních proteinů.
Předkládaný vynález je v nezkráceném rozsahu s uvedenými částmi, které jsou myšleny jako ilustrace jednotlivých aspektů vynálezu, a klony, nukleovými nebo aminokyselinovými sekven30 cemi, které jsou funkčně zaměnitelné, jsou v rozsahu vynálezu. Jistě, různé modifikace vynálezu zde popsané, budou odborníkům zřejmé z již uvedeného popisu a doprovodných obrázků. Takové modifikace jsou promyšleně uvedeny v rozsahu připojených patentových nároků. Je také pochopitelné, že všechny základní párové velikosti, uvedené pro nukleotidy, jsou přibližně a použité za účelem popsání.
Všechny publikace zde citované jsou připojeny v odkazech jako celek.
-26CZ 302870 B6 tabulka 1: reakce fúzního proteinu TbF - 2 s TB a přirozeným sérem
| sérum ID | chan.kter | TbF OD 450 | charakter | TbF - 2 OD 450 | charakter | reakce ph ELISE | |||
| 38 kD | TbR>3 | Tb 38 - 1 | DPEP | ||||||
| B931 -40 | TB | 0,57 | + | 0.321 | - | + | - | + | |
| B 931 -41 | TB | 0,601 | + | 0,396 | + | + | + | + | - |
| B 931 - 109 | TB | 0,494 | + | 0,404 | + | + | + | ti | - |
| B931 - 132 | TB | 1,502 | + | 1,292 | + | + | + | ++ | |
| 5004 | TB | 1,806 | + | 1,666 | + | ++ | + + | + | - |
| 15004 | TB | 2.862 | 4- | 2,468 | + | + | + | + | |
| 39004 | TB | 2,443 | + | 1,722 | + | + | + | - | |
| 68004 | TB | 2,871 | + | 2,575 | + | + | + | + | - |
| 99004 | TB | 0,691 | + | 0,971 | - | + | - | ||
| 107004 | TB | 0,875 | + | 0,732 | + | - | ±± | + | ; - |
| 92004 | TB | 1,632 | + | 1,394 | + | + | ++ | ++ | - |
| 97004 | TB | 1,491 | + | 1,979 | + | + | ++ | - | + |
| 118004 | TB | 3,182 | + | 3,045 | + | + | ++ | - | - |
| 173004 | TB | 3.644 | + | 3,578 | + | + | + | + | - |
| 175004 | TB | 3,332 | + | 2,916 | + | + | - | - | |
| 274004 | TB | 3,696 | + | 3,716 | + | - | + | - | + |
| 276004 | TB | 3,243 | + | 2,56 | + | - | + | - | |
| 282004 | TB | 1,249 | + | 1,234 | + | + | - | - | - |
| 289004 | TB | 1,373 | + | 1,17 | + | - | + | - | - |
| 308004 | TB | 3.708 | + | 3,355 | + | - | - | + | |
| 314004 | TB | 1,663 | 1,399 | + | - | - | + | - | |
| 317004 | TB | 1,163 | + | 0,92 | + | + | - | ||
| 312004 | TB | 1,709 | + | 1,453 | + | - | + | • | |
| 380004 | TB | 0.238 | - | 0,461 | + | - | ++ | ||
| 451004 | TB | 0,18 | - | 0,2 | • | - | - | ++ | |
| 478004 | TB | 0,188 | • | 0,469 | + | - | - | ++ | |
| 410004 | TB | 0,384 | 2,392 | + | ++ | - | + | ||
| 411004 | TB | 0,306 | + | 0,874 | + | - | + | ||
| 421004 | TB | 0,357 | + | 1,456 | + | - | + | + | |
| 528004 | TB | 0,047 | 0,196 | - | + | ||||
| A6-87 | normální | 0,094 | 0,063 | - | - | ||||
| A6 - 88 | normální | 0,214 | 0,19 | - | |||||
| A6-89 | normální | 0,248 | 0,125 | - | - | ||||
| A 6-90 | normální | 0,179 | 0,206 | - | - | ||||
| A6 -91 | normální | 0,135 | 0,151 | - | |||||
| A6 -92 | normální | 0,064 | 0,097 | - | - | ||||
| A 6 -93 | normální | 0.072 | 0,098 | - | - | ||||
| A6 -94 | normální | 0,072 | 0,064 | - | |||||
| A 6 - 95 | normální | 0,125 | 0,159 | - | - | - | |||
| A 6 - 96 | normální | 0,121 | 0,12 | - | - | - | - | ||
| běžné hodnoty | 0,284 | 0,266 |
Claims (17)
- 5 PATENTOVÉ NÁROKY1. Polynukleotid obsahující prvou nukleotidovou sekvenci, která io i) za mírně stringentních podmínek hybridizuje s druhou nukleotidovou sekvencí, jež je komplementární k třetí nukleotidové sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvenci:U * Η 1 Π » 1 H 5 0 « f í L S í í C I 1>Ž*T2OGF i t P l.t Q JI M i I A G Q I I s ; C C S p t f 1 i C P I t r ’ —yw .....- -----------i c ί c y y Bt i s ΐ i c a t v a « y y c s a ř A a s t c i s r c o-J I I U 1 C 4 P |H Π Η ϊ Η H « C « # P C B » 1 S Y I í C . .. .................IbftUr-THSCGlÉTCRiriLAtCPPAtfBVtrCAtřPtlII-—-(. i-A a-S A « Η T A G F « S A S l ¥ A A A O Η » 9 Š ¥ A $ B l í S A A S A ňš V««U HUB [ c Ϊ S I δ l « V A A. A s ř T * A I I s y --Att -. ' ' 'f h m ( l n*H η h u rííí t c i i yip p v i a ' ' · i '-Λ· »a , ' -— t It A C i K t t I A T li Ϊ t Hl ! Pi ΠΪΙΟΗ 6 ť II ——---w i. ; ηA B > A A A tr 6 T A A AT A t A I A Γ L 1 P f tt A P (I Ϊ S A G-im-C L t t J rH H [ » S O H UIO Π » T P í U 9 0 A A--—................ TA » —OPIBCITPSSKLCCLXXIVSPHASPlSllirSIAI TAM ......A A KAS Hll$CySHfBlL$SlLXCÍAPAAAAQA¥9............ !>» ...........Uí 5ÍÍHH J3 t CTH CS Sí l C G G V A A N L G » A - ' WH»A 5 y ť 5 l i ¥ P B A t A A *-* 0 A V I P'AA I 1 l P I I S l I S ——...............A > H t P C Hl C « t P »c Q u c A i A C S C L S e y l K V P P ...................... Α» « P r * H PII P A A G 0 ÍAPPALSOO Η Γ ( I f P A l P l » ——·—:—w»·'......-—--i ---ftM i p $ a m r a 9 v c p »» r « 11 i κ i g y a h a y c a g t g i t i —-- n«*aGP»GTiřiiHiiTviAG*iDiiiArsy5SG9iTcyBy . 1 TÁ HďSr ¥ C ϊ 9I Ϊ Q B V A t L 9 L H C A C C l P S A A I CiíVTYtE . - II · iiiMIx.R· —' p r nui stene hiát pít i y a rc o i ϊ g a 5 o WMS i L t C A t E 1 l Η Cl 1 Q f« A A I 9 P G B S G G P y y a G I c G fcfač v v C A A Ϊ t5 přičemž uvedená prvá nukleotidová sekvence kóduje polypeptid, který je schopen indukce imunogenní odpovědi na TbRal2, TbH9 a TbRa35 v testu proliferace T buněk nebo testu produkce interferonu gama, nebo i i i) hybridizuje za mírně stringentních podmínek s druhou nukleotidovou sekvencí, jež je kom20 plementámí k třetí nukleotidové sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvenci:-28CZ 302870 B6MHXHHHHRYGFCALPPEIMSARIIYAÍPGS*$L..................*......................... ! ! ^*^Χ****χ^*Α****Α****1 vaaaouvdsvasilísaasafosyvvciivcsvi........................CSSAGlMVAAASřYVAlKSYJAGOAELfAAQVR............................1...... I .................li ................***«'“* ..I.·.. 1....1V A A A A Y Ε I A Y C L 1 Y P P P V t A í N R A £ t Μ Ϊ l i A I R ,ιιιΙι·ι«ί,ιιιΙιιι·Ι llGORfPAlAYRCAEYGElHAOGAAAtirCYAAAl...... ................ ........ ...............1.^-^-^.1AIAIArilPFEEAPEHTSACCLLEQAAAVEEAS... ... ... 11...i. *1*—OYAAAMOLUMMVPOALQOLAQPIOCTTPSSKLCCLVKTVSPHRSPlSIlíVSUANHHUSlIfffSCVSUTN7L$SVLXCFAPAAAA0AV0TAAQR6VRAHSSL **1*Μ**ΜΜ*^«·1ί1··ΐΙ.Ι1·1··..ί.11ιΙ1..ι)| ml. ***1**mM. ...1...11. ...1«.»****·^* >!* UlCSSLGSSCLCGCVAANLGRAA$YS$l$YPOAVA....... -1 Hi ‘HI ‘ * t ~ .1 “ Tf' 1' 1H t *1 .........i.......AAN0AVIPAARALPIT5LTSAAERGPGQVIC6LP...........................Ml—.......................................—*.....*...............V « 0 M c A I A G C 6 L S C V t R V ř p P p v * R p H s P A A G í . ...»1,.U..-1.-Iil...........................................................I--.-.....1 lAPPAlSQRRfAIFPAlPLfiPSAMYAQVGPQYVU**l****lj Mlll M I lutn.llHllIllnll ...h I I I. I I I I 1NIRIXlGYRlAVGAtlGIYIRPNGVVirRNHVlACAIOIRAFSYGSGOIYÍYIYYGYORTMYAYLOII II I. .1.1. ...1....1. ...1.1..1.1. lil ...1..1. I.LRGAGCIPSAAIGGCVAYGEPVVARGRSGGGGG tpraypgrvvalcoivoasdsltgaectlnciiq........ I li I ...............................1........... Ι·,·Ι· I lil ιΐι^ι l i.. ...........fbaaiopgisggpytrglcoyvgkriaasI lÍ.ftMi. I lni. . I I i IHHllll..l....l.lwlll ..I.........................lil II.......I přičemž uvedená prvá nukleotidová sekvence kóduje polypeptid, kteiý je schopen indukce imu5 nogenní odpovědi na TbH9 a TbRa35 v testu proliferace T buněk nebo testu produkce interferonu gama.
- 2. Polynukleotid obsahující prvou nukleotidovou sekvenci podle nároku 1, která10 i) hybridizuje za vysoce stringentníeh podmínek s druhou nukleotidovou sekvencí, jež je komplementární k třetí nukleotidové sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvenci:-29CZ 302870 B6XXRRHXHIAASGXfGtSOGC | —Tb fallQ C ΐ k I P I C O A I A I A C O I I S S C C S P I V X I C P I A F-aam ----iClCVVDIYCXCilíYflRYVCSA.PAASlGISICĎ -II R,r2tlíAVGCAPlXSATAXAXRLXCHHPCDVISYlXS .............. -....... TbWaUT K S C fi: 1 fi T G X ¥ 1 l λ f 6 P t A £ f I ¥ D f C A L P P E l X -...... Tli laU I I-f* W-—---- SA#H1fAGP6SA5lVAAAQ#iaS¥ASCLrSA*SA .. ———TbH —FOSVYYGlTVGSXICSSACLMVAAASPTVAlMSV-ne -,T*C0AEllAA0V8¥AIAAYF lAVCt tVPPPVIA--------- — i»BIXRAElXTtlAlXttCIJXTPAlAYXÉACFGEXX- ’ -b Λ ————AO»AAAXrGTAAAIA(AIAILLPF[TAPENlSAG -nm—C U U U H U i $ I H U I O l II I IV ? U Η O ί A-i-ftB , ...............α p I OC I H$SH UIH U5PNKP I S N Μ 1 $ X A ' fttpX X K X S X T X S G Y S ϊ f X J t $ S X l X C F A P A A A A. 4 A Y 9 -'-'-IHS------ -------------------1 A A 5 K » * A X Sít G S $ t 6 $ S G L G < C Υ A A X 1 G 8 A ' I — . . ' l ý=IB 1 tl ----- 'A $ Y G S t $ ? P 9 A I A A A I. fl A V ϊ P A A I A V P t 1 5 l T S ---1---¥» A A E Rt P $ 9 X l C G l P í C O X € AR A GGCL. SCV-LRVPP-,-_M»'_-X ř V Y X P XS P A A CO lAPPALSÍBRFAOFPAlPLO--*»'---1 -*-fth»·· .......P- S A X Y λ O V C P ff V V X I R f X L G T X N A V C A G 1 G i V ) · - --’TBW5O f » C H L I » I H ϊ H t U í I li f S l H C O I r c V H . . -i—ftfe» -----»· G Y ϊ I 7 O B Y-A VLQlRGAGGt PS A A I G G C Y -A Y C f“ ‘ % W5-—........p r γ abg i s c ggg gi pí a y p gíy y a ic af γo aso--ft MS ' , . ........ —-s l I C Al E J l I{l I o F0AA I 9 PC | s 6 G P Y Y XC L $ Q —-IbteR .....-....... ·¥ Y fFHU A A 5 přičemž uvedená prvá nukleotidová sekvence kóduje polypeptid, který je schopen indukce imunogenní odpovědi na TbRal2, TbH9 a TbRa35 v testu proliferace T buněk nebo testu produkce interferonů gama nebo ii) hybridizuje za vysoce stringentních podmínek s druhou nukleotidovou sekvencí, jež je kom· plementámí k třetí nukleotidové sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvenci:-30CZ 302870 B6UHHHHHHUYDFCAtPPEIflSARHTAGPCSASt—...... .................rti ι»ι 1....1...,1 II.....................mil..........1.......‘1|·.......V A A A Q Μ · δ S V A 5 0 l F S A A 5 A f fl S ¥ Y » C L Τ V C $ í I........... ...... , I txx,/] --- .....Ι·.··.Γ ........,1CSSAGlflVAAASPYYAIflSYlACAAELlAAQYIt........ .........1.·ι I.......... ............ ' I I .....................Y A A A A Y E T A Y C L Τ ¥ P P P V I A E A R A E l I I L I A T fl...... - ->..... ---..... - ..... -.................... -.......1.........I.....·.·.1 .......1L L G 0 fl Τ P λ I A V N E A E T t E M R A 0 δ A A A H Γ G Y A A A T.....- . - - ‘ -in---*.................. I.........1.........1,...1....1-........1.—.1...-1AFAlATtLPFEEAPERISAGGllEQAAAYEEAS 1........1................ ll..........I..................tm ..................... ..........IOIAAAAOlUHMYPflAlOAtAOPÍflCTJPSSKLC.......... .......................·-- ....... - .............-....---I..-..............CLRKTVSPHflSPlSflflYSMAflflHHSfllflSCVSlíT flTL$5fltKGFAPAAAAAAY0TAA0flCVRAÍS$LCSSlGSSGLGGGYAAfllCRAASYCSLSVPQARA ........... -------------- ................................... ...1.....,.1,1AAHOAVIPAARALPtlSlTSAAEÍCPGOlIlfiCLP.........----...............1----.. ..----,----.-.....1-...1 . ......................VCOIICAiACCClSCILtYPPÍPYYHPífSPAACfl.....—-·*....... .................. · - .-..-1-----I...1 .. 1 .......IIAPPALS0flRÍA|fPALPl8PSAfl¥AQYGP0¥¥..... .......- 1 1 .. ...I.. - .... ..........1..-.....1......—l·—1 I ....1....1MIHlXLGYNRAYGAGlCIVIOPflCVYlTflNNVIA....... - tfclitl- 1.......... ....* ---- ................-l.—^X. 1—. 1GAlOINAFSVGSGQTYCVDVVGYDRFQRVAVLfl1 «H 1« »«lll | iLRCAGCtPSAAlGGGVAVGEPVVAMGNSflflOfle........-*-TTl I ....................l..-.ι—- I. .... 1.-.-.-...1.... ...............TPftAYPGRVVALCfllVOASOSLTGAEETLflGtlfl i 111 < 11. III ... 1.1«111 ml I. ) i ili .lilu uli t*IH 11 «Mil.»·*»—*——*·*—**—F D Μ I 0 P C 0 S C í Μ » K 1 S 0 H C M l ( H 5..... ---.....................................1 - -........—................přičemž uvedená prvá nukleotidová sekvence kóduje polypeptid, který je schopen indukce imunogenní odpovědi na TbH9 a TbRa35 v testu proliferace T buněk nebo testu produkce interferonu5 gama.
- 3. Polynukleotid obsahující prvou nukleotidovou sekvenci podle nároku I nebo 2, která hybridizuje s druhou nukleotidovou sekvencí, jež je komplementární k třetí nukleotidové sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvenci:-31 CZ 302870 B6MHHHRIIHlAASMFClSQCC 1 It tolžQ C F A I P I C O A II A I AC O I 8 S C C 6 S P Γ * Η I G P f A F 1AIM2 ............................ l G L C V ¥ O Μ X G 1 C A (t ¥ G 8 ¥ ¥ C S A PA A $ l C 1 S I C O-,--..............................T ( I A V O c A P I « S A I A M A í A l * G Η » P S β V f S i I f Q ............................... Mha· —.........I I S C C 1 R I t N V 1 t A E 5 ? P A E f « ¥B ř 6 A l P P f I N- , (bJ2-1 | —It«SAlHYAGPGSASMAAAGMlOSYASBLFSAASA -feHS-fOSV¥fCLÍ¥CSllCS3AClM¥AAASPV¥A8íS¥ -1„ hs ÍACOAEt IAAO¥A¥AAAATETA¥GirVPPPVI A -1,, -----------------EISAÍltílLIATfltLSOJtrPAtA¥IIEAETG£KV........ T»»A O Ď A A A 8 f G Y A A A í A I A T λ Γ l l P F f £ A P i U t S A C ..... — rt»U l ÍOAUIU HO f MHOHUIFU UCH...... — ...... It» ................. —O P l 0 C T T P 3 tl u ( t 1.K U tn U Π tT I n« A ---It«—íΗ H U S m M S G V S II F 1. F L $ $ Rt < G F A P Λ A Λ..Α Q A ¥ Q -it»1 AA 5MGY8AR3 5 LG SS t « S S G t G C € ¥ A AM L C « A -——— . Ik·»-A S ¥ G S 1 $ Y P Q A t A A A R R A ¥ Γ P A A 8 A l P l T S l 1 5 ——————-rt»---- >k Á E íí P G < Rt € C L P ¥ G Q H C A 8 A C £ C L S G Y l 8 V P P ;--—...... .It«i liniHSP AAG 8 I A I P IL i Q B * F A 0 f P A t P t 8 -ine-i' --—ttttfr-K At II H C P O ¥ Y X I 8 í K L C Y R I λ ¥ G A 6 I G ϊ * I ' ' It BA»- ' 0 p * G ¥ V l 1 HA RYIACAtOIRAF$¥CS-CQTYGV0¥----------¥ C Y 8 l ! Q 0 V A V L O l 8 G A C C l P $ Λ λ t G G C V Λ V G [ --— rtteg——P F ¥ ΑΠΙ SGGR GC T ΡβΑΥ P 6 β V V A t GGT ¥ O A S O ......... It fett . ..........S i I C * E t T l K c t I O F O A λ 1 0 P 6 0 5 C G P ¥ V 8 G L C Q —--ft(w8. .........¥ V C U 8 I A I S
- 4. Polynukleotid obsahující prvou nukleotidovou sekvenci podle nároku 1 nebo 2, která hybri dizuje s druhou nukleotidovou sekvencí, jež je komplementární k třetí nukleotidové sekvenci
- 5 která kóduje aminokyselinovou sekvenci:-32CZ 302870 B
- 6 tfHHHNHHUVDFCALPPE 1XSARMYAGP65ASL . -------............................................ 11.1....1YAAAGB»e$VA$»tfSAA$AfOSYVlGtlYGSII .ν__·__.^ . ~ * -I m I *...................GSSAClHYAAASPYYARHSYlACOAELrAAOYR —_Lia- X,u-iJLi-i-»--‘ _·. - r -1 - - -...........* · ' ........—»-.-.1-—....V A A A A Y E Ϊ A Y C l I V P P P » I A E X R A E l Μ I L I A T X..................‘ *--r................*............................i.........>.··......ΙLlCONTPAlAVHEAtrCEVHAOBAAAHrCYAAAr..... - · ---...................................................................ATATATllPrEEAPEMrSAGGllEOAAAVEEAS......- ‘.........— ...... ................— *· —*.............-i.......—........biaaaxqlxxxypoaloolaopiogttpssxlc.......... ...................----.-- ........ I It ........ICtlXIVSPHRSPISXMYSMAXXHXSRTXSCYSMT.....1r1t-‘.................. ................................................................MlLSSXLKGFAPAAAAOAVOFAAQXCVtAXSSLι....·Ι·«*ΧΜ—I»*—*· minulu 1.1.. . 11««.«*l »*<.ι.......... m iti iiiI.^Jimi.G S $ L G S S Cl GCC YA ΑΝ l C RA KS Y G S L S V P 0 Al A----------......................................·--.................* — ........-*..........AAXGAVTPAARAlPLTSllSAAERGPCQMtGGtP...... ·1VGOMGAftAGCGLSGVLBVPPIPYVKPHSPAACO . .... .i-..-. . ....................... . ..........1-..... ...1 lAPPALSQDRFAQFPALPlQPSAXYAQVGPQVV «Μ—***^^A.iiiIiiiUi iiiIuiiIiiii u m IiiiiIhiiIiM1N1XICYNXAVGACTC1VI0PRGYVLTNNHVIA.......·*...... - 1 Ί r ri 1 ...................1.........- ---. . .. ..........GAFIINAFSVGSGQFYGVlVVCYDRTQDVAVlOIRGAGCLPSAAIGGGVAVGEPYVAMGNSGCQGCIli1111n1111«Umji11i,iX*<fA*jA****.*X***l«****!***** * iiilniiti I··!TPRAVPGXVVALGQIVQASDSITGAEEILMGLIQFĎAAIOPCOSCGPYYXGICOYYCHXTAAS.................................I..........................I....................5. Polypeptid kódovaný polynukleotidem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4.5 6. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle nároku 5.
- 7. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje polynukleotid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4.
- 8. Expresní vektor obsahující polynukleotid podle kteréhokoliv z nároků t až 4.
- 9. Expresní vektor podle nároku 8, jímž je virový vektor.is
- 10. Vakcínový prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle nároku 5 a adjuvant.
- 11. Vakcínový prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje polynukleotid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4.
- 12. Polypeptid podle nároku 5 pro použití pri léčbě nebo prevenci infekce M. tuberculosis.
- 13. Polynukleotid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 pro použití pri léčbě nebo prevenci infekce M. tuberculosis.-33 CT. 302870 B6
- 14. Použití polypeptidu podle nároku 5 pro výrobu léčiva pro léčení nebo prevenci infekce M. tuberculosis.5
- 15. Použití polynukleotidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 pro výrobu léčiva pro léčení nebo prevenci infekce M. tuberculosis.
- 16. Způsob výroby polypeptidu podle nároku 5, vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní expresi polynukleotidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4.u
- 17. Izolovaná hostitelská buňka, která rekombinantně exprímuje polypeptid podle nároku 5.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/056,556 US6350456B1 (en) | 1997-03-13 | 1998-04-07 | Compositions and methods for the prevention and treatment of M. tuberculosis infection |
| US09/223,040 US6544522B1 (en) | 1998-12-30 | 1998-12-30 | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20003652A3 CZ20003652A3 (en) | 2001-05-16 |
| CZ302870B6 true CZ302870B6 (cs) | 2011-12-28 |
Family
ID=26735428
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20003652A CZ302870B6 (cs) | 1998-04-07 | 1999-04-07 | Polynukleotid, polypeptid, farmaceutický prostredek, vakcínový prostredek a jejich použití k lécbe a prevenci infekce tuberkulózou |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7186412B1 (cs) |
| EP (1) | EP1068329A2 (cs) |
| JP (2) | JP4227302B2 (cs) |
| KR (2) | KR100692227B1 (cs) |
| CN (2) | CN1629185B (cs) |
| AU (1) | AU753995B2 (cs) |
| BR (1) | BR9909472A (cs) |
| CA (1) | CA2326598C (cs) |
| CZ (1) | CZ302870B6 (cs) |
| HU (1) | HU228354B1 (cs) |
| IL (1) | IL138809A0 (cs) |
| NO (2) | NO332500B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ507378A (cs) |
| PL (1) | PL202844B1 (cs) |
| SA (1) | SA99200488B1 (cs) |
| TR (1) | TR200002938T2 (cs) |
| WO (1) | WO1999051748A2 (cs) |
Families Citing this family (90)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6592877B1 (en) * | 1995-09-01 | 2003-07-15 | Corixa Corporation | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis |
| US6290969B1 (en) * | 1995-09-01 | 2001-09-18 | Corixa Corporation | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis |
| US6458366B1 (en) | 1995-09-01 | 2002-10-01 | Corixa Corporation | Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis |
| WO1999051748A2 (en) | 1998-04-07 | 1999-10-14 | Corixa Corporation | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses |
| JP4633931B2 (ja) | 1998-11-04 | 2011-02-16 | アイシス イノヴェイション リミテッド | 結核診断試験 |
| US6555115B1 (en) | 1998-12-08 | 2003-04-29 | Corixa Corporation | Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection |
| US6448234B1 (en) | 1998-12-08 | 2002-09-10 | Corixa Corporation | Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection |
| US6565856B1 (en) * | 1998-12-08 | 2003-05-20 | Corixa Corporation | Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection |
| US6432916B1 (en) | 1998-12-08 | 2002-08-13 | Corixa Corporation | Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection |
| US6447779B1 (en) | 1998-12-08 | 2002-09-10 | Corixa Corporation | Compounds for the diagnosis of Chlamydial infection |
| US20020061848A1 (en) | 2000-07-20 | 2002-05-23 | Ajay Bhatia | Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection |
| US20030027774A1 (en) * | 1999-03-18 | 2003-02-06 | Ronald C. Hendrickson | Tuberculosis antigens and methods of use therefor |
| US8143386B2 (en) * | 1999-04-07 | 2012-03-27 | Corixa Corporation | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses |
| US7009042B1 (en) | 1999-10-07 | 2006-03-07 | Corixa Corporation | Methods of using a Mycobacterium tuberculosis coding sequence to facilitate stable and high yield expression of the heterologous proteins |
| JP2003510370A (ja) | 1999-10-07 | 2003-03-18 | コリクサ コーポレイション | Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの融合タンパク質 |
| JP2003527830A (ja) * | 1999-10-07 | 2003-09-24 | コリクサ コーポレイション | 異種タンパク質の安定かつ高収量の発現を容易にするための、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓをコードする配列を使用する方法 |
| US6316205B1 (en) | 2000-01-28 | 2001-11-13 | Genelabs Diagnostics Pte Ltd. | Assay devices and methods of analyte detection |
| AU2001241738A1 (en) * | 2000-02-25 | 2001-09-03 | Corixa Corporation | Compounds and methods for diagnosis and immunotherapy of tuberculosis |
| GB0006692D0 (en) * | 2000-03-20 | 2000-05-10 | Glaxo Group Ltd | Epitopes |
| US6919187B2 (en) | 2000-04-21 | 2005-07-19 | Corixa Corporation | Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection |
| ES2303525T3 (es) | 2000-04-21 | 2008-08-16 | Corixa Corporation | Compuestos y metodos para el tratamiento y diagnostico de infeccion por chlamydia. |
| DK2133100T3 (da) * | 2000-06-20 | 2012-01-23 | Corixa Corp | MTB32A-Antigen af Mycobacterium tuberculosis med inaktiveret aktivt sted og fusionsproteiner deraf |
| GB0109297D0 (en) | 2001-04-12 | 2001-05-30 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
| US6841159B2 (en) | 2002-01-30 | 2005-01-11 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Rapid lateral flow assay for determining exposure to Mycobacterium tuberculosis and other mycobacteria |
| AU2003213118A1 (en) * | 2002-02-15 | 2003-09-09 | Corixa Corporation | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis |
| GB0321615D0 (en) | 2003-09-15 | 2003-10-15 | Glaxo Group Ltd | Improvements in vaccination |
| WO2005061534A2 (en) * | 2003-12-23 | 2005-07-07 | Statens Serum Institut | Improved tuberculosis vaccines |
| EP1797127B1 (en) | 2004-09-24 | 2017-06-14 | Amgen Inc. | Modified fc molecules |
| US8475735B2 (en) | 2004-11-01 | 2013-07-02 | Uma Mahesh Babu | Disposable immunodiagnostic test system |
| KR101255870B1 (ko) | 2004-11-16 | 2013-04-17 | 아에라스 글로벌 티비 백신 파운데이션 | 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 다가 백신 |
| CN100368437C (zh) * | 2005-01-28 | 2008-02-13 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 一种诊断牛结核病的重组抗原蛋白及其制备方法 |
| CN106390108B (zh) | 2005-04-29 | 2020-09-08 | 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 | 用于预防或治疗结核分枝杆菌感染的新方法 |
| US8008453B2 (en) | 2005-08-12 | 2011-08-30 | Amgen Inc. | Modified Fc molecules |
| TWI457133B (zh) | 2005-12-13 | 2014-10-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | 新穎組合物 |
| CN100999550B (zh) * | 2006-01-10 | 2010-10-06 | 中国人民解放军第三○九医院 | 结核分枝杆菌融合蛋白及其应用 |
| CN100415771C (zh) * | 2006-06-06 | 2008-09-03 | 中国人民解放军第二军医大学 | 激发人体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位及其用途 |
| CN101311189B (zh) * | 2006-06-06 | 2010-09-08 | 中国人民解放军第二军医大学 | 激发人体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位及其用途 |
| CN101311190B (zh) * | 2006-06-06 | 2011-08-03 | 中国人民解放军第二军医大学 | 激发人体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位及其用途 |
| CN101298471B (zh) * | 2006-06-06 | 2011-01-19 | 中国人民解放军第二军医大学 | 激发人体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位及其用途 |
| AU2007264205B2 (en) * | 2006-06-28 | 2013-04-18 | Statens Serum Institut | Expanding the T cell repertoire to include subdominant epitopes by vaccination with antigens delivered as protein fragments or peptide cocktails |
| US20090181078A1 (en) | 2006-09-26 | 2009-07-16 | Infectious Disease Research Institute | Vaccine composition containing synthetic adjuvant |
| JP5443164B2 (ja) | 2006-09-26 | 2014-03-19 | インフェクティアス ディジーズ リサーチ インスティチュート | 合成アジュバントを含むワクチン組成物 |
| SI2086582T1 (sl) | 2006-10-12 | 2013-02-28 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Cepivo, ki obsega emulzijo olja v vodi kot adjuvans |
| KR101151202B1 (ko) | 2006-10-12 | 2012-06-11 | 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. | 수중유 에멀젼 애주번트를 포함하는 백신 |
| US9717788B2 (en) | 2007-03-02 | 2017-08-01 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Method of inducing an immune response against HIV employing HIV immunogens, adenoviral vectors encoding said immunogens, and adjuvant |
| ES2744676T3 (es) | 2007-03-02 | 2020-02-25 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Procedimiento novedoso y composiciones |
| PL2136836T3 (pl) * | 2007-04-04 | 2017-07-31 | Infectious Disease Research Institute | Kompozycje immunogenne zawierające polipeptydy prątka gruźlicy i produkty ich fuzji |
| WO2009049097A1 (en) * | 2007-10-13 | 2009-04-16 | Cornell University | Compositions for eliciting an immune response against mycobacterium avium subspecies paratuberculosis |
| KR101378240B1 (ko) | 2008-02-22 | 2014-03-28 | 포항공과대학교 산학협력단 | 결핵 예방용 조성물 |
| LT2315597T (lt) | 2008-07-25 | 2018-02-12 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Naujos kompozicijos ir būdai |
| PT2315773T (pt) * | 2008-07-25 | 2016-11-23 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Polipéptidos, polinucleótidos e composições para utilização no tratamento de tuberculose latente |
| CN102165064B (zh) | 2008-07-25 | 2017-06-20 | 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 | 结核病rv2386c蛋白、组合物及其用途 |
| GB0815872D0 (en) | 2008-09-01 | 2008-10-08 | Pasteur Institut | Novel method and compositions |
| CA2754906C (en) * | 2009-03-10 | 2021-02-09 | Baylor Research Institute | Antigen presenting cell targeted fusion proteins comprising a linker for increased stability |
| CA3032548C (en) | 2009-03-10 | 2023-05-09 | Baylor Research Institute | Anti-cd40 antibodies and uses thereof |
| ES2911752T3 (es) * | 2009-03-10 | 2022-05-20 | Baylor Res Institute | Anticuerpos contra CD40 |
| EP2437753B1 (en) | 2009-06-05 | 2016-08-31 | Infectious Disease Research Institute | Synthetic glucopyranosyl lipid adjuvants and vaccine compositions containing them |
| JP6010463B2 (ja) | 2010-01-27 | 2016-10-19 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | 改変された結核抗原 |
| ES2651005T3 (es) | 2010-03-09 | 2018-01-23 | Biomedical Research Models, Inc. | Una nueva estrategia de vacunación mucosa para el virus del herpes simple tipo-2 |
| EP3593813A1 (en) | 2010-12-14 | 2020-01-15 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Mycobacterium antigenic composition |
| GB201022007D0 (en) | 2010-12-24 | 2011-02-02 | Imp Innovations Ltd | DNA-sensor |
| CN102154324B (zh) * | 2010-12-29 | 2012-11-28 | 兰州大学 | 结核分枝杆菌融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的构建、表达和纯化方法及其应用 |
| US20120301465A1 (en) | 2011-03-25 | 2012-11-29 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Compositions and methods to immunize against hepatitis c virus |
| SG194083A1 (en) | 2011-04-08 | 2013-11-29 | Immune Design Corp | Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses |
| WO2012149307A2 (en) | 2011-04-27 | 2012-11-01 | Immune Design Corp. | Synthetic long peptide (slp)-based vaccines |
| CN102305855A (zh) * | 2011-05-19 | 2012-01-04 | 中山大学 | 体外检测结核分枝杆菌感染的试剂和方法 |
| EP2771469A4 (en) * | 2011-10-24 | 2015-04-08 | Univ Central Florida Res Found | CONCENTRATED PLASTIC-EXPRESSED MYCOBACTERIUM TUBERCULOSE VACCINE FUEL ESTATES ESAT-6 AND MTB72F AT CHOLERATOXIN B SUB-UNIT |
| EP2811981B1 (en) | 2012-02-07 | 2019-05-08 | Infectious Disease Research Institute | Improved adjuvant formulations comprising tlr4 agonists and methods of using the same |
| MX347154B (es) | 2012-02-24 | 2017-02-21 | Centro De Investigación Científica Y De Educación Superior De Ensenada Baja California (Cicese) | Prueba de diagnóstico para enfermedades infecciosas en ganado bovino. |
| EP3388835B1 (en) | 2012-05-16 | 2020-04-01 | Immune Design Corp. | Vaccines for hsv-2 |
| CN102757971B (zh) * | 2012-08-07 | 2013-09-11 | 中国人民解放军第三O九医院 | 一种结核分枝杆菌重组蛋白质及其制备方法 |
| US9526773B2 (en) | 2012-10-23 | 2016-12-27 | Statens Serum Institut | M. tuberculosis vaccines |
| WO2014107731A1 (en) | 2013-01-07 | 2014-07-10 | Biomedical Research Models, Inc. | Therapeutic vaccines for treating herpes simplex virus type 2 infections |
| CN110075287A (zh) * | 2013-03-15 | 2019-08-02 | 宾夕法尼亚大学理事会 | 用于结核病的预防或治疗的合成免疫原 |
| EP2986303B1 (en) | 2013-04-18 | 2020-02-26 | Immune Design Corp. | Gla monotherapy for use in cancer treatment |
| US9463198B2 (en) | 2013-06-04 | 2016-10-11 | Infectious Disease Research Institute | Compositions and methods for reducing or preventing metastasis |
| US11801223B2 (en) | 2013-12-31 | 2023-10-31 | Access To Advanced Health Institute | Single vial vaccine formulations |
| US10286058B2 (en) | 2014-01-13 | 2019-05-14 | Baylor Research Institute | Vaccines against HPV and HPV-related diseases |
| WO2017151818A2 (en) * | 2016-03-02 | 2017-09-08 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof |
| WO2017176076A1 (en) | 2016-04-06 | 2017-10-12 | Ewha University - Industry Collaboration Foundation | A peptide with ability to penetrate cell membrane |
| CA3023672A1 (en) | 2016-05-16 | 2017-11-23 | Infectious Disease Research Institute | Pegylated liposomes and methods of use |
| ES2929054T3 (es) | 2016-05-16 | 2022-11-24 | Access To Advanced Health Inst | Formulación que contiene un agonista de TLR y métodos de uso |
| KR20250008135A (ko) | 2016-06-01 | 2025-01-14 | 액세스 투 어드밴스드 헬스 인스티튜트 | 사이징제를 함유하는 나노명반 입자 |
| CN111315362A (zh) | 2017-06-15 | 2020-06-19 | 传染病研究所 | 纳米结构脂质载剂和稳定乳剂以及其用途 |
| EP3678695A1 (en) | 2017-09-08 | 2020-07-15 | Infectious Disease Research Institute | Liposomal formulations comprising saponin and methods of use |
| US10610585B2 (en) | 2017-09-26 | 2020-04-07 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Methods and compositions for treating and preventing HIV |
| CN109825497A (zh) * | 2019-01-25 | 2019-05-31 | 石河子大学 | 一种新型结核杆菌融合菌株的制备方法及其应用 |
| WO2020243115A1 (en) | 2019-05-25 | 2020-12-03 | Infectious Disease Research Institute | Composition and method for spray drying an adjuvant vaccine emulsion |
| AU2023336224A1 (en) | 2022-09-09 | 2025-03-27 | Access To Advanced Health Institute | Immunogenic vaccine composition incorporating a saponin |
| CN118652311B (zh) * | 2024-07-17 | 2025-02-25 | 扬州大学 | 结核分枝杆菌复合体ⅶ型分泌系统效应蛋白cfp10保守功能性b细胞表位及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997009429A2 (en) * | 1995-09-01 | 1997-03-13 | Corixa Corporation | Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis |
| WO1997009428A2 (en) * | 1995-09-01 | 1997-03-13 | Corixa Corporation | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis |
Family Cites Families (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4980286A (en) | 1985-07-05 | 1990-12-25 | Whitehead Institute For Biomedical Research | In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells |
| US5811128A (en) | 1986-10-24 | 1998-09-22 | Southern Research Institute | Method for oral or rectal delivery of microencapsulated vaccines and compositions therefor |
| US5075109A (en) | 1986-10-24 | 1991-12-24 | Southern Research Institute | Method of potentiating an immune response |
| US4897268A (en) | 1987-08-03 | 1990-01-30 | Southern Research Institute | Drug delivery system and method of making the same |
| US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
| DE69024953T3 (de) | 1989-05-04 | 2005-01-27 | Southern Research Institute, Birmingham | Einkapselungsverfahren |
| CA2092323A1 (en) | 1990-10-01 | 1992-04-02 | George Y. Wu | Targeting viruses and cells for selective internalization by cells |
| DK0584279T3 (da) | 1991-05-14 | 2001-06-11 | Immune Response Corp Inc | Målrettet aflevering af gener, som koder for immunogene proteiner |
| ATE195656T1 (de) | 1991-06-05 | 2000-09-15 | Univ Connecticut | Zielgerichtete freisetzung von genen, die sekretorische proteine kodieren |
| DK0528306T3 (da) * | 1991-08-15 | 2000-04-25 | Hoffmann La Roche | Mycobacterium-primerpar |
| AU3434393A (en) | 1992-01-17 | 1993-08-03 | Regents Of The University Of Michigan, The | Targeted virus |
| AU3940293A (en) | 1992-04-03 | 1993-11-08 | Alexander T. YOUNG | Gene therapy using targeted viral vectors |
| DE69313134T2 (de) | 1992-06-25 | 1998-02-26 | Smithkline Beecham Biolog | Adjuvantien enthaltende impfstoffzusammensetzung |
| US5330754A (en) * | 1992-06-29 | 1994-07-19 | Archana Kapoor | Membrane-associated immunogens of mycobacteria |
| US5359681A (en) | 1993-01-11 | 1994-10-25 | University Of Washington | Fiber optic sensor and methods and apparatus relating thereto |
| DK79793D0 (da) * | 1993-07-02 | 1993-07-02 | Statens Seruminstitut | Diagnostic test |
| DK79893D0 (da) * | 1993-07-02 | 1993-07-02 | Statens Seruminstitut | New vaccine |
| US5955077A (en) | 1993-07-02 | 1999-09-21 | Statens Seruminstitut | Tuberculosis vaccine |
| US5679647A (en) | 1993-08-26 | 1997-10-21 | The Regents Of The University Of California | Methods and devices for immunizing a host against tumor-associated antigens through administration of naked polynucleotides which encode tumor-associated antigenic peptides |
| GB9326253D0 (en) | 1993-12-23 | 1994-02-23 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccines |
| UA56132C2 (uk) | 1995-04-25 | 2003-05-15 | Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. | Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини |
| US6627198B2 (en) * | 1997-03-13 | 2003-09-30 | Corixa Corporation | Fusion proteins of Mycobacterium tuberculosis antigens and their uses |
| US6544522B1 (en) * | 1998-12-30 | 2003-04-08 | Corixa Corporation | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses |
| WO1999051748A2 (en) | 1998-04-07 | 1999-10-14 | Corixa Corporation | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses |
-
1999
- 1999-04-07 WO PCT/US1999/007717 patent/WO1999051748A2/en active Search and Examination
- 1999-04-07 BR BR9909472-0A patent/BR9909472A/pt not_active Application Discontinuation
- 1999-04-07 IL IL13880999A patent/IL138809A0/xx unknown
- 1999-04-07 HU HU0101521A patent/HU228354B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1999-04-07 CA CA2326598A patent/CA2326598C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-07 KR KR1020007011196A patent/KR100692227B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-07 PL PL344142A patent/PL202844B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-04-07 TR TR2000/02938T patent/TR200002938T2/xx unknown
- 1999-04-07 EP EP99916513A patent/EP1068329A2/en not_active Withdrawn
- 1999-04-07 AU AU34817/99A patent/AU753995B2/en not_active Ceased
- 1999-04-07 NZ NZ507378A patent/NZ507378A/xx unknown
- 1999-04-07 CN CN2004100618462A patent/CN1629185B/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-07 KR KR1020067009456A patent/KR100797876B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-07 JP JP2000542460A patent/JP4227302B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-07 CZ CZ20003652A patent/CZ302870B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-04-07 CN CNB998070777A patent/CN1163602C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-08-17 SA SA99200488A patent/SA99200488B1/ar unknown
-
2000
- 2000-06-20 US US09/597,796 patent/US7186412B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-10-06 NO NO20005050A patent/NO332500B1/no not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-03-30 US US11/396,117 patent/US7261897B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-03-31 JP JP2006100968A patent/JP4326008B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2012
- 2012-05-25 NO NO20120621A patent/NO20120621L/no not_active Application Discontinuation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997009429A2 (en) * | 1995-09-01 | 1997-03-13 | Corixa Corporation | Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis |
| WO1997009428A2 (en) * | 1995-09-01 | 1997-03-13 | Corixa Corporation | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ302870B6 (cs) | Polynukleotid, polypeptid, farmaceutický prostredek, vakcínový prostredek a jejich použití k lécbe a prevenci infekce tuberkulózou | |
| US7335369B2 (en) | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses | |
| JP4516616B2 (ja) | Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原の融合タンパク質およびその使用 | |
| ES2262595T3 (es) | Compuestos y metodos para la inmunoterapia y diagnostico de la tuberculosis. | |
| US8143386B2 (en) | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses | |
| KR20010012812A (ko) | 결핵의 면역치료 및 확인용 화합물과 이의 사용 방법 | |
| JP2002503683A (ja) | 結核の免疫療法および診断のための化合物および方法 | |
| ES2368572T3 (es) | Compuestos y métodos para inmunoterapia y diagnosis de tuberculosis. | |
| MXPA00009803A (en) | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis | |
| HK1163176A (en) | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses | |
| ZA200005505B (en) | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis and their uses. | |
| HK1059282B (en) | Compounds for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20140407 |