ES2602430T3 - Polipéptidos, polinucleótidos y composiciones para uso en el tratamiento de tuberculosis latente - Google Patents

Abstract

Un polipéptido aislado, que comprende: (i) una secuencia de proteína de Rv3616c seleccionada de SEQ ID NO: 1 y 3-7; (ii) una variante de una secuencia de proteína de Rv3616c seleccionada de SEQ ID NO: 1 y 3-7, teniendo dicha variante al menos 90 % de identidad con la misma; o (iii) un fragmento inmunogénico de una secuencia de proteína de Rv3616c, seleccionándose dicho fragmento de SEQ ID NO: 29-126, 127, 128, 130, 131-133, 135, 143-148 o 150-156; para su uso en el tratamiento de tuberculosis latente.

Description

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SEQ ID NO: 105: epítopo de células CD8 humano supuesto 58.

SEQ ID NO: 106: epítopo de células CD8 humano supuesto 59.

SEQ ID NO: 107: epítopo de células CD8 humano supuesto 60.

SEQ ID NO: 108: epítopo de células CD8 humano supuesto 61.

SEQ ID NO: 109: epítopo de células CD8 humano supuesto 62.

SEQ ID NO: 110: epítopo de células CD8 humano supuesto 63.

SEQ ID NO: 111: epítopo de células CD8 humano supuesto 64.

SEQ ID NO: 112: epítopo de células CD8 humano supuesto 65.

SEQ ID NO: 113: epítopo de células CD8 humano supuesto 66.

SEQ ID NO: 114: epítopo de células CD8 humano supuesto 67.

SEQ ID NO: 115: epítopo de células CD8 humano supuesto 68.

SEQ ID NO: 116: epítopo de células CD8 humano supuesto 69.

SEQ ID NO: 117: epítopo de células CD8 humano supuesto 70.

SEQ ID NO: 118: epítopo de células CD8 humano supuesto 71.

SEQ ID NO: 119: epítopo de células CD8 humano supuesto 72.

SEQ ID NO: 120: epítopo de células CD8 humano supuesto 73.

SEQ ID NO: 121: epítopo de células CD8 humano supuesto 74.

SEQ ID NO: 122: epítopo de células CD8 humano supuesto 75.

SEQ ID NO: 123: epítopo de células CD8 humano supuesto 76.

SEQ ID NO: 124: epítopo de células CD8 humano supuesto 77.

SEQ ID NO: 125: epítopo de células CD8 humano supuesto 78.

SEQ ID NO: 126: epítopo de células CD8 humano supuesto 79.

SEQ ID NO: 127: péptido 1.

SEQ ID NO: 128: péptido 2.

SEQ ID NO: 129: péptido 3.

SEQ ID NO: 130: péptido 4.

SEQ ID NO: 131: péptido 5.

SEQ ID NO: 132: péptido 6.

SEQ ID NO: 133: péptido 7.

SEQ ID NO: 134: péptido 8.

SEQ ID NO: 135: péptido 9.

SEQ ID NO: 136: péptido 10.

SEQ ID NO: 137: péptido 11.

SEQ ID NO: 138: péptido 12.

SEQ ID NO: 139: péptido 13.

SEQ ID NO: 140: péptido 14.

SEQ ID NO: 141: péptido 15.

SEQ ID NO: 142: péptido 16.

SEQ ID NO: 143: péptido 17.

SEQ ID NO: 144: péptido 18.

SEQ ID NO: 145: péptido 19.

SEQ ID NO: 146: péptido 20.

SEQ ID NO: 147: péptido 21.

SEQ ID NO: 148: péptido 22.

SEQ ID NO: 149: péptido 23.

SEQ ID NO: 150: péptido 24.

SEQ ID NO: 151: péptido 25.

SEQ ID NO: 152: péptido 26.

SEQ ID NO: 153: péptido 27.

SEQ ID NO: 154: péptido 28.

SEQ ID NO: 155: péptido 29.

SEQ ID NO: 156: péptido 30.

SEQ ID NO: 157: secuencia de polipéptido de Rv1753c a partir de M. tuberculosis, cepa H37Rv.

SEQ ID NO: 158: secuencia de polipéptido de Rv2386c a partir de M. tuberculosis, cepa H37Rv.

SEQ ID NO: 159: secuencia de polipéptido de Rv2707c a partir de M. tuberculosis, cepa H37Rv.

Descripción detallada

Actualmente, la vacunación con bacterias vivas es el procedimiento más eficiente para inducir la inmunidad protectora. La Mycobacterium más común empleada para este propósito es Bacillus Calmette-Guerin (BCG), una cepa avirulenta de M. bovis que fue desarrollada hace más de 60 años. Sin embargo, la seguridad y eficacia de la BCG es una fuente de controversia -aunque protege contra la manifestación de la enfermedad grave en los niños, la BCG no previene el establecimiento de la TB latente o la reactivación de la enfermedad pulmonar en la vida adulta. Adicionalmente, algunos países, tales como los Estados Unidos, no vacunan al público en general con este agente.

Casi todas las vacunas de TB de nueva generación que están actualmente en desarrollo clínico se han diseñado

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como vacunas previas a la exposición. Estas incluyen las vacunas subunitarias, las cuales han sido particularmente efectivas para reforzar la inmunidad inducida mediante la vacunación previa con BCG, y mediante las vacunas micobacterianas vivas avanzadas que tienen como objetivo reemplazar la BCG con cepas más eficientes y/o más seguras. Aunque estas vacunas tienen como objetivo mejorar la resistencia a la infección, tienen probabilidades de ser menos efectivas como vacunas posteriores a la exposición o terapéuticas en los casos de TB latente (Lin MY y col., Endocrine, Metabolic & Immune Disorders – Drug Targets 2008 8: 15-29).

Se ha demostrado que algunas de las proteínas que se expresan fuertemente durante las etapas tempranas de la infección por Mycobacterium proporcionan una fuerte eficacia protectora en los modelos de vacunación de animales. Sin embargo, la vacunación con antígenos que se expresan altamente durante las etapas tempranas de la infección puede no proporcionar una respuesta inmunitaria óptima para tratar con las etapas posteriores de la infección. El control adecuado durante las etapas posteriores de la infección puede requerir células-T que sean específicas para los antígenos particulares que se expresan en ese momento.

Las vacunas posteriores a la exposición que se dirigen directamente hacia las bacterias persistentes latentes pueden ayudar a proteger contra la reactivación de la TB, mejorando de esta manera el control de la TB, o inclusive haciendo posible la eliminación de la infección. Por consiguiente, una vacuna que se dirija hacia la TB latente podría reducir de una manera significativa y económica los índices globales de infección por TB.

También se podrían utilizar las vacunas subunitarias basadas en los antígenos de etapa tardía en combinación con los antígenos de etapa temprana, para proporcionar una vacuna de múltiples fases. De una manera alternativa, los antígenos de etapa tardía se podrían utilizar para complementar y mejorar la vacunación con BCG (ya sea mediante el refuerzo de la respuesta a la BCG, o bien a través del desarrollo de cepas de BCG recombinantes avanzadas).

Rv3616c, también conocido como Mtb40 o HTCC1, se ha implicado anteriormente en las respuestas inmunitarias asociadas con tuberculosis (véase, por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO98/53075). Al-Attiyah y col., Clin. Exp. Immunol. 2004 138: 139-144, han demostrado que Rv3616c es bien reconocido (a través de la proliferación de las PBMC y de la producción de IFN-gamma) por los pacientes de tuberculosis pulmonar. Mustafa y col., Infect. Immun. 2006 74(8): 4566-4572, han investigado el reconocimiento de Rv3616c por el ganado infectado por M. Bovis y vacunado con BCG.

Recientemente, se ha propuesto un número de vacunas de M. tuberculosis candidatas, basándose en un análisis bioinformático del genoma entero de M. tuberculosis (Zvi y col., BMC Medical Genetics 2008 1: 18), y en la prueba de las proteínas diferencialmente expresadas en los individuos activamente y latentemente infectados (Schuck SD y col., PLoS ONE 2009 4(5): e5590).

Aunque se ha demostrado que los macrófagos actúan como los efectores principales de la inmunidad a Mycobacterium, las células-T son los inductores predominantes de esta inmunidad. La función esencial de las células-T en la protección contra la tuberculosis se ilustra por el aumento en los índices de la reactivación de la TB en los individuos infectados con el virus de inmunodeficiencia humana, debido al agotamiento asociado de las células-T CD4+. Adicionalmente, se ha demostrado que la transferencia adoptiva de las células-T CD4+ tomadas al máximo de la respuesta inmunitaria primaria a la M. tuberculosis confiere protección contra la M. tuberculosis en los ratones deficientes en células-T (Orme y col., J. Exp. Med. 1983 158: 74-83).

Se ha demostrado que las células-T CD4+ que reaccionan con Mycobacterium son potentes productoras de interferón-γ (IFN-γ), el cual, a su vez, se ha demostrado que desencadena los efectos anti-micobacterianos de los macrófagos en los ratones (Flynn y col., J. Exp. Med. 1993 178: 2249-2254). Aunque está menos clara la función del IFN-γ en los seres humanos, los estudios han demostrado que la 1,25-dihidroxi-vitamina D3, ya sea sola o bien en combinación con el IFN-γ o con el factor de necrosis tumoral-alfa, activa los macrófagos humanos para inhibir la infección por M. tuberculosis. Adicionalmente, se sabe que el IFN-γ estimula a los macrófagos humanos para hacer la 1,25-dihidroxi-vitamina D3. De una manera similar, se ha demostrado que la interleucina-12 (IL-12) tiene una función en la estimulación de la resistencia a la infección por M. tuberculosis. Para una revisión de la inmunología de la infección por M. tuberculosis, véase Chan y Kaufmann, Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control (Bloom, Editor, 1994), Tuberculosis (2a Edición, Rom y Garay, Editores, 2003), y Harrison’s Principles of Internal Medicine, Capítulo 150, páginas 953-966 (16a Edición, Braunwald y col., Editores, 2005).

La presente invención se refiere en términos generales a la identificación de Rv3616c como un antígeno de TB, el cual está asociado con TB latente, y a los usos en el tratamiento de TB latente, y en la prevención o retardo de la reactivación de TB.

La invención, por consiguiente, proporciona un polipéptido aislado que comprende:

(i)

una secuencia de proteína de Rv3616c seleccionada de SEQ ID NO: 1 y 3-7;

(ii)

una variante de una secuencia de proteína de Rv3616c seleccionada de SEQ ID NO: 1 y 3-7, teniendo dicha variante al menos 90 % de identidad con la misma; o

(iii) un fragmento inmunogénico de una secuencia de proteína de Rv3616c, seleccionándose dicho fragmento de SEQ ID NO: 29-126, 127, 128, 130, 131-133, 135, 143-148 o 150-156,

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o un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende:

(i)

una secuencia de proteína de Rv3616c seleccionada de SEQ ID NO: 1 y 3-7;

(ii)

una variante de una secuencia de proteína de Rv3616c seleccionada de SEQ ID NO: 1 y 3-7, teniendo dicha variante al menos 90 % de identidad con la misma; o

(iii) un fragmento inmunogénico de una secuencia de proteína de Rv3616c, seleccionándose dicho fragmento de SEQ ID NO: 29-126, 127, 128, 130, 131-133, 135, 143-148 o 150-156,

para utilizarse en el tratamiento de TB latente. El uso puede ser en la prevención o retardo de la reactivación de TB (en especial el retardo de la reactivación de TB, por ejemplo por un período de meses, años, o incluso indefinidamente).

El término “especie de Mycobacterium del complejo de tuberculosis” incluye las especies que tradicionalmente se consideran como causantes de la enfermedad de tuberculosis, así como las especies ambientales y oportunistas de Mycobacterium que provocan la tuberculosis y la enfermedad pulmonar en los pacientes inmuno-comprometidos, tales como los pacientes con SIDA, por ejemplo, M. tuberculosis, M. bovis, o M. africanum, BCG, M. avium, M. intracellulare, M. celatum, M. genavense, M. haemophilum, M. kansasii, M. simiae, M. vaccae, M. fortuitum, y M. scrofulaceum (véase, por ejemplo, Harrison’s Principles of Internal Medicine, Capítulo 150, páginas 953-966 (16a Edición, Braunwald y col., Editores, 2005). La presente invención se refiere en particular a la infección con M. tuberculosis.

El término “infección activa” se refiere a una infección (por ejemplo, una infección por M. tuberculosis) con los síntomas y/o lesiones evidentes de la enfermedad (de una manera adecuada, con los síntomas manifestados de la enfermedad). Los términos “infección inactiva”, “infección letárgica" o "infección latente” se refieren a una infección (por ejemplo, a una infección por M. tuberculosis) sin los síntomas y/o lesiones evidentes de la enfermedad (de una manera adecuada, sin los síntomas manifestados de la enfermedad).

El término “tuberculosis primaria” se refiere a la enfermedad clínica (la manifestación de los síntomas de la enfermedad) directamente después de la infección (por ejemplo, la infección por M. tuberculosis). Véase, Harrison’s Principles of Internal Medicine, Capítulo 150, páginas 953-966 (16a Edición, Braunwald y col., Editores, 2005).

Los términos “tuberculosis secundaria" o "tuberculosis post-primaria” se refieren a la reactivación de una infección letárgica, inactiva o latente (por ejemplo, una infección por M. tuberculosis). Véase, Harrison’s Principles of Internal Medicine, Capítulo 150, páginas 953-966 (16a Edición, Braunwald y col., Editores, 2005).

El término “reactivación de tuberculosis” se refiere a la manifestación posterior de los síntomas de la enfermedad en un individuo en quien se prueba positiva la infección (por ejemplo, en una prueba de tuberculina de piel, de una manera adecuada en un ensayo basado en células-T in vitro) pero que no tiene los síntomas evidentes de la enfermedad. La prueba de diagnóstico positiva indica que el individuo está infectado; sin embargo, el individuo puede o no haber manifestado anteriormente los síntomas de la enfermedad activa que se hubieran tratado lo suficiente para llevar a la tuberculosis hasta un estado inactivo o latente. Se reconocerá que se pueden iniciar procedimientos para la prevención, retardo, o tratamiento de la reactivación de tuberculosis en un individuo que manifieste los síntomas activos de la enfermedad.

El término tuberculosis “resistente a fármacos” se refiere a una infección (por ejemplo, una infección por M. tuberculosis), en donde la cepa infecciosa no se mantiene estática ni es aniquilada por (es decir, es resistente a) uno

o más de los denominados como agentes quimioterapéuticos "de línea frontal" efectivos en el tratamiento de tuberculosis (por ejemplo, isoniazida, rifampina, etambutol, estreptomicina, y pirazinamida).

El término tuberculosis “resistente a múltiples fármacos” se refiere a una infección (por ejemplo, una infección por M. tuberculosis), en donde la cepa infecciosa es resistente a dos o más de los agentes quimioterapéuticos "de la línea frontal" efectivos en el tratamiento de tuberculosis.

Un “agente quimioterapéutico” se refiere a un agente farmacológico conocido y usado en la materia para tratar tuberculosis (por ejemplo, la infección por M. tuberculosis). Los agentes farmacológicos ejemplificados utilizados para tratar la tuberculosis incluyen, pero no se limitan a, amicacina, ácido amino-salicílico, capreomicina, cicloserina, etambutol, etionamida, isoniazida, canamicina, pirazinamida, rifamicinas (es decir, rifampina, rifapentina y rifabutina), estreptomicina, ofloxacina, ciprofloxacina, claritromicina, azitromicina y fluoro-quinolonas. Los agentes quimioterapéuticos "de primera línea" o "de línea frontal" utilizados para tratar la tuberculosis que no es resistente a fármacos incluyen isoniazida, rifampina, etambutol, estreptomicina, y pirazinamida. Los agentes quimioterapéuticos "de segunda línea" utilizados para tratar la tuberculosis que ha demostrado resistencia a fármacos, es decir, a uno o más fármacos "de primera línea" incluyen ofloxacina, ciprofloxacina, etionamida, ácido amino-salicílico, cicloserina, amicacina, canamicina y capreomicina. Estos agentes farmacológicos se revisan en el Capítulo 48 de Goodman y Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, Hardman y Limbird, Editores, 2001.

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Familia Haarlem (tal como Haarlem A) -Cepas resistentes a fármacos encontradas en las poblaciones humanas populosas. Se han encontrado miembros de la familia Haarlem de las cepas de M. tuberculosis en muchas partes del mundo. El primer representante de la familia se descubrió en Haarlem, Holanda.

KZN4207 -Aislado sensible a fármacos a partir de los pacientes de KwaZulu-Natal, Sudáfrica.

KZN1435 -Aislado resistente a múltiples fármacos (MDR) a partir de los pacientes de KwaZulu-Natal, Sudáfrica.

KZN605 -Aislado extensamente resistente a fármacos (XDR) a partir de los pacientes de KwaZulu-Natal, Sudáfrica.

C -Altamente transmitido en la Ciudad de Nueva York. En un estudio, se encontró que esta cepa es más común entre los usuarios de fármacos de inyección y resistente a los intermediarios de nitrógeno reactivo (Friedman y col., J. Infect. Dis. 1997 176(2): 478-84)

94_M4241A -Aislado en San Francisco en 1994 a partir de un paciente nacido en China. Esta cepa se analizó anteriormente mediante el análisis de agotamiento genómico (Gagneux y col., PNAS 2006 103(8): 2869-2873).

02_1987 -Aislado en San Francisco en 2002 a partir de un paciente nacido en Corea del Sur. Esta cepa se analizó anteriormente mediante el análisis de agotamiento genómico (Gagneux y col., PNAS 2006 103(8): 28692873).

T92 -Aislado en San Francisco en 1999 a partir de un paciente nacido en Las Filipinas. Esta cepa se publicó en Hirsh y col., PNAS 2004 101: 4871–4876).

T85 -Aislado en San Francisco en 1998 a partir de un paciente nacido en China. Esta cepa se publicó en Hirsh y col., PNAS 2004 101: 4871–4876).

EAS054 -Aislado en San Francisco en 1993 a partir de un paciente nacido en India. Esta cepa se analizó anteriormente mediante el análisis de agotamiento genómico (Gagneux y col., PNAS 2006 103(8): 2869-2873).

Gagneux y col., PNAS 2006 103(8): 2869-2873 y Herbert y col., Infect. Immun. 2007 75(12): 5798-5805 proporcionan valiosos antecedentes sobre el rango de cepas de M. tuberculosis que se sabe que existen.

La proteína de Rv3616c se selecciona a partir de las secuencias de polipéptidos proporcionadas en las SEQ ID NO: 1 y 3 a 7, en particular en las SEQ ID NO: 1 y 3a 6, tal como la SEQ ID NO: 1.

Los polinucleótidos desvelados de un interés particular son aquellos que comprenden (tal como que consisten en) una secuencia que codifica:

(i)

una secuencia de proteína de Rv3616c;

(ii)

una variante de una secuencia de proteína de Rv3616c; o

(iii) un fragmento inmunogénico de una secuencia de proteína de Rv3616c.

Los polinucleótidos desvelados adecuadamente comprenderán (tal como consistirán en) una variante de la SEQ ID NO: 2 o un fragmento de la SEQ ID NO: 2 que codifique un fragmento inmunogénico de una proteína de Rv3616c.

COMBINACIONES

Los polipéptidos de Rv3616c relacionados útiles en la presente invención pueden comprender además otros componentes diseñados para mejorar su inmunogenicidad o para mejorar estos antígenos en otros aspectos. Por ejemplo, se puede facilitar un mejor aislamiento de los antígenos de polipéptido a través de la adición de un estiramiento de los residuos de histidina (comúnmente conocido como una marca his) hacia un extremo del antígeno.

El término "marca-his" se refiere a una hilera de residuos de histidina, típicamente de seis residuos, que se insertan dentro de la secuencia de referencia. Para minimizar la alteración de la actividad asociada con la secuencia de referencia, típicamente se inserta una marca-his en el término N, usualmente inmediatamente después del residuo de metionina de inicio, o de otra manera, en el término C. Usualmente son heterólogos para la secuencia nativa, pero se incorporan debido a que facilitan el aislamiento mediante la mejora del enlace de la proteína a las resinas de cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC). Hablando en términos generales, la presencia o ausencia de una marca-his no es significativa desde el punto de vista de provocar una respuesta inmunitaria deseable contra la proteína de referencia. Sin embargo, con el objeto de evitar el riesgo de una reacción adversa contra la marca-his misma, se considera mejor minimizar la longitud de la marca-his, por ejemplo, hasta cuatro o menos residuos, en particular hasta dos residuos (o excluir el uso de una marca-his totalmente).

Con el fin de mejorar la magnitud y/o el alcance de la respuesta inmunitaria provocada, las composiciones, polipéptidos y ácidos nucleicos para uso pueden comprender múltiples copias del antígeno de la invención y/o polipéptidos heterólogos adicionales (o polinucleótidos que los codifiquen) a partir de las especies de Mycobacterium

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(en particular M. tuberculosis).

Un experto en este campo reconocerá que, cuando se utilizan un número de componentes en combinación, se puede variar la presentación precisa. Por ejemplo, se podría presentar un componente de Rv3616c y una copia adicional del antígeno o de un componente de antígeno heterólogo adicional:

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como dos componentes de polipéptido individuales;

(2)

como una proteína de fusión que comprende ambos componentes de polipéptido;

(3)

como un polipéptido y un componente de polinucleótido;

(4)

como dos componentes de polinucleótido individuales;

(5)

como un solo polinucleótido que codifica dos componentes de polipéptido individuales; o

(6)

como un solo polinucleótido que codifica una proteína de fusión que comprende ambos componentes de polipéptido.

Esta flexibilidad se aplica igualmente a las situaciones en donde se utilizan tres o más componentes en combinación. Sin embargo, para mayor conveniencia, con frecuencia es deseable que, cuando están presentes un número de componentes, están contenidos dentro de una sola proteína de fusión o de un polinucleótido que codifique una sola proteína de fusión. En una realización de la invención, todos los componentes de antígeno se proporcionan como polipéptidos (por ejemplo, dentro de una sola proteína de fusión). En una realización alternativa de la invención, todos los componentes de antígeno se proporcionan como polinucleótidos (por ejemplo, un solo polinucleótido, tal como uno que codifique una sola proteína de fusión).

El término “heterólogo”, cuando se utiliza con referencia a porciones de un ácido nucleico, indica que el ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación unas con otras en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico se produce típicamente de una manera recombinante, teniendo dos o más secuencias a partir de genes no relacionados configurados para hacer un nuevo ácido nucleico funcional, por ejemplo, un promotor a partir de una fuente, y una región codificante a partir de otra fuente. De una manera similar, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación unas con otras en la naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión).

“Polipéptido de fusión" o "proteína de fusión" se refiere a una proteína que tiene al menos dos polipéptidos heterólogos (por ejemplo, al menos dos polipéptidos de especies de Mycobacterium) covalentemente enlazados, ya sea directamente o bien por medio de un enlazador de aminoácido. Los polipéptidos que forman la proteína de fusión típicamente enlazan el término C al término N, aunque también puede enlazar el término C al término C, el término N al término N, o el término N al término C. Los polipéptidos de la proteína de fusión pueden estar en cualquier orden. Este término también se refiere a las variantes conservadoramente modificadas, variantes polimórficas, alelos, mutantes, fragmentos inmunogénicos, y homólogos inter-especies de los antígenos que forman la proteína de fusión. Los antígenos de Mycobacterium tuberculosis se describen en Coler y col., Nature 393: 537 (1998), el cual da a conocer el genoma entero de Mycobacterium tuberculosis. Los antígenos a partir de otras especies de Mycobacterium que corresponden a los antígenos de M. tuberculosis se pueden identificar, por ejemplo, utilizando algoritmos de comparación de secuencias, como se describen en el presente documento, u otros procedimientos conocidos por los expertos en este campo, por ejemplo, ensayos de hibridación y ensayos de enlace de anticuerpos.

El término “fusionado” se refiere al enlace covalente entre dos polipéptidos en una proteína de fusión. Los polipéptidos típicamente se unen por medio de un enlace peptídico, ya sea directamente a uno al otro o bien por medio de un enlazador de aminoácidos. Opcionalmente, los péptidos se pueden unir por medio de enlaces covalentes no peptídicos conocidos por los expertos en este campo.

Los antígenos de M. tuberculosis de ejemplo que se pueden combinar con Rv3616c incluyen uno o más de (por ejemplo, de 1 a 5, tal como de 1 a 3, en particular 1) los siguientes (tales como uno o más de (i) a (xii)):

(i)

Mtb8.4 (también conocido como DPV y Rv1174c), cuya secuencia de polipéptido se describe en la SEQ ID NO: 102 de la Publicación Internacional Número WO97/09428 (ADNc en la SEQ ID NO: 101), y en Coler y col., Journal of Immunology 1998 161: 2356-2364. Es de un interés particular la secuencia de Mtb8.4 madura, la cual está ausente en el péptido de señal delantero (es decir, en los residuos de aminoácidos 15 a 96 de la SEQ ID NO: 102 de la Publicación Internacional Número WO97/09428). La secuencia del polipéptido de longitud completa de Mtb8.4 se muestra en la SEQ ID NO: 8;

(ii)

Mtb9.8 (también conocido como MSL y Rv0287), cuya secuencia de polipéptido se describe en la SEQ ID NO: 109 de la Publicación Internacional Número WO98/53075 (los fragmentos de MSL se desvelan en las SEQ ID NOs: 110 a 124 de la Publicación Internacional Número WO98/53075, siendo de un interés particular las SEQ ID NOs: 119 y 120), y también en Coler y col., Vaccine 2009 27: 223-233 (en particular los fragmentos reactivos mostrados en la Figura 2 del mismo). La secuencia del polipéptido de longitud completa para Mtb9.8 se muestra en la SEQ ID NO: 9;

(iii) Mtb9.9 (también conocido como Mtb9.9A, MTI, MTI-A y Rv1793), cuya secuencia de polipéptido se describe en la SEQ ID NO: 19 de la Publicación Internacional Número WO98/53075 y en Alderson y col., Journal of

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En algunas circunstancias, se puede utilizar una pluralidad de fragmentos del polipéptido de longitud completa (los cuales pueden o no estar traslapados, y los cuales pueden o no cubrir la totalidad de la secuencia de longitud completa) para obtener una respuesta biológica equivalente a la secuencia de longitud completa misma. Por ejemplo, al menos dos fragmentos inmunogénicos (tal como tres, cuatro, o cinco) como se describe anteriormente, que en combinación proporcionen al menos el 50 %, de una manera adecuada al menos el 75 %, y en especial al menos el 90 % de la actividad de la secuencia de referencia en un ensayo de re-estimulación in vitro de PBMC o de sangre entera (por ejemplo, un ensayo de proliferación de células-T y/o de producción de IFN-gamma).

Los péptidos de las SEQ ID NO: 127 a 156 son fragmentos desvelados de un interés particular (en especial aquellos de las SEQ ID NO: 127 a 133 y 143 a 156).

VARIANTES

“Variantes" o "variantes conservadoramente modificadas” se aplica a las secuencias tanto de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes conservadoramente modificadas se refieren a los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o en donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, hasta secuencias esencialmente idénticas.

Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. Por consiguiente, en cada posición en donde se una alanina sea especificada por un codón, el codón se puede alterar hasta cualquiera de los codones correspondientes descritos, sin alterar el polipéptido codificado. Estas variaciones de ácidos nucleicos conducen a variantes "silenciosas" o "degeneradas", las cuales son una especie de variaciones conservadoramente modificadas. Cada secuencia de ácido nucleico de la presente que codifica un polipéptido también describe cada variación silenciosa posible del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, el cual es ordinariamente el único codón para metionina, y TGG, el cual es ordinariamente el único codón para triptófano) se puede modificar para proporcionar una molécula funcionalmente idéntica. De conformidad con lo anterior, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

Un polinucleótido para uso de la invención puede contener un número de variaciones silenciosas (por ejemplo, se pueden alterar de 1 a 50, tal como de 1 a 25, en particular de 1 a 5, y en especial 1 codón(es)) cuando se compara con la secuencia de referencia. Un polinucleótido para uso de la invención puede contener un número de variaciones conservadoras no silenciosas (por ejemplo, se pueden alterar de 1 a 25, en particular de 1 a 5, y en especial 1 codón(es)) cuando se compara con la secuencia de referencia. Las variaciones no silenciosas son aquellas que dan como resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos codificada (ya sea a través de la sustitución, supresión, o adición de los residuos de aminoácidos). Los expertos en este campo reconocerán que una secuencia de polinucleótido particular puede contener variaciones conservadoras tanto silenciosas como no silenciosas.

Con respecto a las variantes de una secuencia de proteína, la persona experta reconocerá que las sustituciones, supresiones, o adiciones individuales al polipéptido, que alteren, agreguen, o supriman un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos son una “variante conservadoramente modificada”, en donde las alteraciones dan como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido funcionalmente similar, o la sustitución/supresión/adición de los residuos que no impacten sustancialmente la función biológica de la variante.

Las tablas de sustituciones conservadoras, que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares, son bien conocidas en este campo. Estas variantes conservadoramente modificadas son además de, y no excluyen, las variantes polimórficas, los homólogos inter-especies, y los alelos de la invención.

Un polipéptido para uso de la invención puede contener un número de sustituciones conservadoras (por ejemplo, se pueden alterar de 1 a 25, en particular de 1 a 10, y en especial 1 residuo(s) de aminoácidos) cuando se compara con la secuencia de referencia. En general, estas sustituciones conservadoras caerán dentro de una de las agrupaciones de aminoácidos especificadas más adelante, aunque en algunas circunstancias, son posibles otras sustituciones sin afectar sustancialmente las propiedades inmunogénicas del antígeno. Los siguientes ocho grupos cada uno contienen aminoácidos que son típicamente sustituciones conservadoras unos de otros:

1) Alanina (A), Glicina (G);

2) Ácido aspártico (D), ácido glutámico (E);

3) Asparagina (N), Glutamina (Q);

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V);

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W);

7) Serina (S), Treonina (T); y

8) Cisteína (C), Metionina (M)

(véase, por ejemplo, Creighton, Proteins 1984).

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De una manera adecuada estas sustituciones no se presentan en la región de un epítopo y, por consiguiente, no tienen un impacto significativo sobre las propiedades inmunogénicas del antígeno.

Las variantes de proteína también pueden incluir aquellas en donde se insertan aminoácidos adicionales comparándose con la secuencia de referencia, por ejemplo, estas inserciones pueden presentarse en 1 a 10 localizaciones (tal como de 1 a 5 localizaciones, de una manera adecuada 1 o 2 localizaciones, en particular 1 localización) y, por ejemplo, pueden involucrar la adición de 20 o menos aminoácidos en cada localización (en particular 10 o menos, en especial 5 o menos). De una manera adecuada, estas inserciones no se presentan en la región de un epítopo y, por consiguiente, no tienen un impacto significativo sobre las propiedades inmunogénicas del antígeno. Un ejemplo de inserciones incluye un estiramiento corto de residuos de histidina (por ejemplo, de 2 a 6 residuos) para ayudar a la expresión y/o purificación del antígeno en cuestión.

Las variantes de proteína incluyen aquellas en donde se han suprimido aminoácidos, comparándose con la secuencia de referencia, por ejemplo, estas supresiones pueden presentarse en 1 a 10 localizaciones (tal como en 1 a 5 localizaciones, de una manera adecuada en 1 o 2 localizaciones, en particular en 1 localización) y, por ejemplo, pueden involucrar la supresión de 20 o menos aminoácidos en cada localización (en particular 10 o menos, en especial 5 o menos). De una manera adecuada, estas supresiones no se presentan en la región de un epítopo y, por consiguiente no tienen un impacto significativo sobre las propiedades inmunogénicas del antígeno.

La persona experta reconocerá que una variante de proteína particular puede comprender sustituciones, supresiones y adiciones (o cualquier combinación de las mismas).

Los procedimientos para determinar las regiones de epítopo de un antígeno se describen y se ejemplifican en los Ejemplos.

Variantes de preferencia exhiben al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 % de identidad con la secuencia de referencia asociada.

Los términos “idéntico” o porcentaje de “identidad”, en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o sub-secuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, identidad del 70 %, opcionalmente identidad del 75 %, del 80 %, del 85 %, del 90 %, del 95 %, del 98 %, o del 99 % sobre una región especificada), al compararse y alinearse para una máxima correspondencia sobre una ventana de comparación, o una región diseñada como se mida utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias, o mediante alineación manual e inspección visual. Entonces se dice que estas secuencias son “sustancialmente idénticas”. Esta definición también se refiere al complemento de una secuencia de prueba. Opcionalmente, la identidad existe sobre una región que sea de al menos aproximadamente 25 a aproximadamente 50 aminoácidos o nucleótidos de longitud, u opcionalmente sobre una región que sea de 75 a 100 aminoácidos o nucleótidos de longitud. De una manera adecuada, la comparación se lleva a cabo sobre una ventana correspondiente a toda la longitud de la secuencia de referencia.

Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en una computadora, se designan las coordenadas de la subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. Se pueden utilizar los parámetros del programa por omisión, o se pueden designar parámetros alternativos. Entonces el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencias para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Una “ventana de comparación”, como se utiliza en el presente documento, hace referencia a un segmento en donde se puede comparar una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que se alinean óptimamente las dos secuencias. Los procedimientos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. La alineación óptima de secuencias para comparación se puede conducir, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. MoI. Biol. 48:443 (1970), mediante el procedimiento de búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y col., editores, suplemento 1995)).

Un ejemplo de un algoritmo útil es el PILEUP. PILEUP crea una alineación de múltiples secuencias a partir de un grupo de secuencias relacionadas, utilizando alineaciones progresivas por pares, para mostrar la relación y el porcentaje de identidad de secuencias. También grafica un árbol o dendograma que muestra las relaciones de agrupación utilizadas para crear la alineación. PILEUP utiliza una simplificación del procedimiento de alineación progresiva de Feng y Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 351-360 (1987). El procedimiento empleado es similar al procedimiento descrito por Higgins y Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989). El programa puede alinear hasta 300

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secuencias, cada una de una longitud máxima de 5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineación múltiple empieza con la alineación por pares de las dos secuencias más similares, produciendo un racimo de dos secuencias alineadas. Este racimo se alinea entonces con la siguiente secuencia más relacionada o racimo de secuencias alineadas. Dos racimos de secuencias se alinean mediante una extensión simple de la alineación por pares de dos secuencias individuales. La alineación final se logra mediante una serie de alineaciones progresivas por pares. El programa se ejecuta mediante la designación de secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o nucleótidos para las regiones de comparación de secuencias, y mediante la designación de los parámetros del programa. Utilizando PILEUP, se compara una secuencia de referencia con otras secuencias de prueba para determinar la relación del porcentaje de identidad de secuencias, utilizando los siguientes parámetros: peso de hueco por omisión (3,00), peso de longitud de hueco por omisión (0,10), y huecos de extremo ponderados. PILEUP se puede obtener del paquete de software de análisis de secuencias GCG, por ejemplo, versión 7.0 (Devereaux y col., Nuc. Acids Res. 12: 387-395 (1984)).

Otro ejemplo de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencias y de similitud de secuencias, son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul y col., Nuc. Acids Res.

25: 3389-3402 (1977), y Altschul y col., J. MoI. Biol. 215: 403-410 (1990), respectivamente. El software para llevar a cabo los análisis BLAST está públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information (sitio web en www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo involucra identificar primeramente los pares de secuencias de alto puntaje (HSPs), mediante la identificación de palabras cortas de una longitud W en la secuencia requerida, que concuerden o satisfagan algún puntaje umbral de valor positivo T al alinearse con una palabra de la misma longitud en una secuencia de una base de datos. T es referido como el umbral de puntaje de palabra vecina (Altschul y col., supra). Estos impactos de palabra vecina iniciales actúan como semillas para iniciar las búsquedas con el fin de encontrar HSPs más largos que las contengan. Los impactos de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia por tanto como se pueda aumentar el puntaje de alineación acumulativo. Los puntajes acumulativos se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntaje de recompensa para un par de residuos emparejados; siempre >0) y N (puntaje de multa para los residuos mal emparejados; siempre <0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntaje para calcular el puntaje acumulativo. La extensión de los impactos de palabra en cada dirección se detienen cuando: el puntaje de alineación acumulativo cae fuera por la cantidad X desde su máximo valor alcanzado; el puntaje acumulativo llega a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntaje negativo; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros W, T, y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza por omisión una longitud de palabra

(W)

de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por omisión una longitud de palabra de 3, y una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntaje BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89: 10915 (1989)), alineaciones

(B)

de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90: 5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual ocurriría un emparejamiento entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos por azar. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0,2, más preferiblemente menor de aproximadamente 0,01 y de una manera muy preferible menor de aproximadamente 0,001.

Se desvelan polinucleótidos que comprenden una primera secuencia de nucleótidos que se hibrida selectivamente bajo condiciones moderadamente restringentes (tal como bajo condiciones altamente restringentes) al complemento de una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende:

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una secuencia de proteína de Rv3616c;

(ii)

una variante de una secuencia de proteína de Rv3616c; o

(iii) un fragmento inmunogénico de una secuencia de proteína de Rv3616c,

para el tratamiento o la prevención de TB latente.

La frase “condiciones de hibridación altamente restringentes” se refiere a las condiciones bajo las cuales una sonda se hibridará a su sub-secuencia objetivo, típicamente en una mezcla compleja de ácido nucleico, pero no a otras secuencias. Las condiciones altamente restringentes dependen de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más altas. Se encuentra una extensa guía sobre la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology --Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridisation and the strategy of nucleic acid assays” (1993). En términos generales, las condiciones altamente restringentes se seleccionan para ser de aproximadamente 5 a 10°C más bajos que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a un pH de concentración iónica definida. La Tm es la temperatura (bajo el pH de concentración iónica definida la concentración de ácido nucleico) en donde el 50 % de las sondas complementarias para el objetivo se hibridan a la secuencia objetivo en equilibrio (debido a que las secuencias objetivo están presentes en exceso, a la Tm, el 50 % de las

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sondas están ocupadas en equilibrio). Las condiciones altamente restringentes serán aquellas en donde la concentración de sal sea menor de aproximadamente 1,0 M de ion de sodio, típicamente una concentración de aproximadamente 0,01 a 1,0 M de ion de sodio (u otras sales) a un pH de 7,0 a 8,3, y la temperatura sea de al menos aproximadamente 30°C para las sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos), y de al menos aproximadamente 60°C para las sondas largas (por ejemplo, mayores de 50 nucleótidos). Las condiciones altamente restringentes también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizantes, tales como formamida. Para la hibridación selectiva o específica, una señal positiva es una hibridación de al menos dos veces el fondo, opcionalmente 10 veces el fondo.

Las condiciones de hibridación altamente restringentes de ejemplo pueden ser como sigue: formamida al 50 %, 5x SSC, y SDS al 1 %, incubación a 42°C, o 5x SSC, SDS al 1 %, incubación a 65°C, con lavado en 0,2x SSC, y SDS al 0,1 % a 65°C.

Los ácidos nucleicos que no se hibridan unos a otros bajo condiciones altamente restringentes son todavía funcionalmente equivalentes si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto ocurre, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico utilizando la máxima degeneración de codones permitida por el código genético. En tales casos, los ácidos nucleicos típicamente se hibridan bajo condiciones de hibridación moderadamente restringentes.

Las “condiciones de hibridación moderadamente restringentes” de ejemplo incluyen una hibridación en un regulador de formamida al 40 %, NaCl 1 M, SDS al 1 %, a 37ºC, y un lavado en 1X SSC a 45°C. Una hibridación positiva es al menos dos veces el fondo. Aquellos de una experiencia ordinaria reconocerán fácilmente que se pueden emplear condiciones alternativas de hibridación y lavado para proporcionar condiciones de una restringencia similar.

La frase “se hibrida selectivamente (o específicamente) a”, se refiere al enlace, duplexión, o hibridación de una molécula solamente a una secuencia de nucleótidos particular, bajo condiciones de hibridación restringentes, cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja (por ejemplo, ADN o ARN celular total o de biblioteca).

En cualquier caso, las variantes de una secuencia de polipéptido tendrán esencialmente la misma actividad que la secuencia de referencia (en el caso de los polinucleótidos, las secuencias de polinucleótidos variantes codificarán un polipéptido que tenga esencialmente la misma actividad que la secuencia de referencia). Esencialmente la misma actividad significa una actividad de al menos el 50 %, de una manera adecuada de al menos el 75 %, y en especial de al menos el 90 % de la secuencia de referencia en un ensayo de re-estimulación in vitro de PBMC o de sangre entera con antígenos específicos (por ejemplo, re-estimulación durante un período de entre varias horas hasta dos semanas, tal como hasta un día, de 1 día a 1 semana, o de 1 a 2 semanas), que mide la activación de las células por medio de linfoproliferación, producción de citoquinas en el sobrenadante de cultivo (medidas mediante ELISA, CBA, etc.), o caracterización de respuestas de células T y B mediante teñido intra-y extra-celular (por ejemplo, utilizando anticuerpos específicos para inmuno-marcadores, tales como CD3, CD4, CD8, IL2, TNFa, IFNg, CD40L, CD69, etc.), seguido por análisis con un citómetro de flujo. De una manera adecuada, esencialmente la misma actividad significa una actividad de al menos el 50 %, de una manera adecuada de al menos el 75 %, y en especial de al menos el 90 % de la secuencia de referencia en un ensayo de proliferación de células-T y/o de producción de IFN-gamma.

COMPOSICIONES DE POLINUCLEÓTIDOS

Como se utiliza en el presente documento, el término “polinucleótido” se refiere a una molécula que se ha aislado para liberarse del ADN genómico total de una especie particular. Por consiguiente, un polinucleótido que codifique un polipéptido se refiere a un segmento de polinucleótido que contiene una o más secuencias de codificación, y no obstante, está sustancialmente aislado de, o purificado para liberarse de, el ADN genómico total de la especie a partir de la cual se obtenga el polinucleótido.

Como será entendido por los expertos en este campo, los polinucleótidos útiles en esta invención pueden incluir secuencias genómicas, secuencias extra-genómicas y codificadas por plásmidos, y segmentos genéticos diseñados más pequeños que expresen, o que se puedan adaptar para expresar, proteínas, polipéptidos, péptidos, y similares. Estos segmentos se pueden aislar naturalmente, o pueden ser modificados sintéticamente por la mano del hombre.

“Aislado”, como se utiliza en el presente documento, significa que un polinucleótido está sustancialmente lejos de otras secuencias de codificación, y que el polinucleótido no contiene porciones grandes de ADN codificante no relacionado, tales como los fragmentos cromosómicos grandes u otros genes funcionales o regiones codificantes de polipéptidos. Un ácido nucleico aislado se separa de otros marcos de lectura abierta que flanquean el gen y que codifican proteínas diferentes del gen. Por supuesto, esto se refiere al segmento de ADN como se aisló originalmente, y no excluye a los genes o a las regiones codificantes agregadas posteriormente al segmento por la mano del hombre.

Como será reconocido por el experto, los polinucleótidos pueden ser de una sola cadena (codificante o anti-sentido)

o de doble cadena, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc, o sintético) o de ARN. Las moléculas de ARN incluyen moléculas de HnARN, que contienen intrones y corresponden a una molécula de ADN de una manera de uno a uno, y moléculas de ARNm, que no contienen intrones. Puede haber secuencias codificantes o no codificantes

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De una manera alternativa, existen numerosas técnicas de amplificación para obtener una secuencia de codificación de longitud completa a partir de una secuencia de ADNc parcial. Dentro de estas técnicas, la amplificación se lleva a cabo en general mediante reacción en cadena de la polimerasa. Se puede emplear cualquiera de una variedad de los kits comercialmente disponibles para llevar a cabo el paso de amplificación. Se pueden diseñar cebadores utilizando, por ejemplo, software bien conocido en la técnica. Los cebadores de preferencia son de 22 a 30 nucleótidos de longitud, tienen un contenido de GC de al menos el 50 %, y se templan a la secuencia objetivo a temperaturas de aproximadamente 68°C a 72°C. La región amplificada se puede secuenciar como se describe anteriormente, y se ensamblan las secuencias traslapadas en una secuencia contigua.

Una de estas técnicas de amplificación es la reacción en cadena de la polimerasa inversa (véase Triglia y col., Nucl. Acids Res. 16:8186 (1988)), la cual utiliza enzimas de restricción para generar un fragmento en la región conocida del gen. Entonces se circulariza el fragmento mediante ligamiento intramolecular, y se utiliza como una plantilla para la reacción en cadena de la polimerasa con cebadores divergentes derivados a partir de la región conocida. Dentro de un planteamiento alternativo, las secuencias adyacentes a una secuencia parcial se pueden recuperar mediante amplificación con un cebador para una secuencia enlazadora y un cebador específico para una región conocida. Las secuencias amplificadas típicamente se someten a una segunda ronda de amplificación con el mismo cebador enlazador y un segundo cebador específico para la región conocida. En la Publicación Internacional Número WO 96/38591, se describe una variación sobre este procedimiento, que emplea dos cebadores que inician la extensión en direcciones opuestas desde la secuencia conocida. Otra de estas técnicas se conoce como “amplificación rápida de los extremos del ADNc” o RACE. Esta técnica involucra el uso de un cebador interno y un cebador externo, que se hibrida a una región poliA o a una secuencia de vector, para identificar las secuencias que sean 5’ y 3’ de una secuencia conocida. Las técnicas adicionales incluyen reacción en cadena de la polimerasa de captura (Lagerstrom y col., PCR Methods Applic. 1:111-19 (1991)), y reacción en cadena de la polimerasa caminante (Parker y col., Nucl. Acids. Res. 19:3055-60 (1991)). También se pueden emplear otros procedimientos que empleen amplificación con el fin de obtener una secuencia de ADNc de longitud completa.

En ciertos casos, es posible obtener una secuencia de ADNc de longitud completa mediante el análisis de las secuencias proporcionadas en una base de datos de marca de secuencia expresada (EST), tal como la que está disponible en GenBank. Las búsquedas de las ESTs traslapadas se pueden llevar a cabo en general empleando programas bien conocidos (por ejemplo, búsquedas de NCBI BLAST), y estás ESTs se pueden utilizar para generar una secuencia de longitud completa contigua. También se pueden obtener secuencias de ADN de longitud completa mediante el análisis de los fragmentos genómicos.

EXPRESIÓN DE POLINUCLEÓTIDOS EN CÉLULAS HUÉSPED

Se pueden utilizar secuencias de polinucleótidos o fragmentos de las mismas que codifiquen los polipéptidos, o proteínas de fusión o sus equivalentes funcionales, en moléculas de ADN recombinante, para dirigir la expresión de un polipéptido en células huésped apropiadas. Debido a la degeneración inherente del código genético, se pueden producir otras secuencias de ADN que codifiquen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos o una secuencia de aminoácidos funcionalmente equivalente, y estas secuencias se pueden utilizar para clonar y expresar un polipéptido dado.

Como será entendido por los expertos en la materia, puede ser conveniente, en algunos casos, producir secuencias de nucleótidos que codifiquen polipéptidos que posean codones que no se presenten naturalmente. Por ejemplo, se pueden seleccionar los codones preferidos por un huésped procariótico o eucariótico particular para aumentar el índice de expresión de proteína, o para producir una transcripción de ARN recombinante que tenga las propiedades deseables, tales como una vida media que sea más larga que aquella de una transcripción generada a partir de la secuencia que se presente naturalmente.

Más aún, las secuencias de polinucleótidos se pueden diseñar empleando procedimientos generalmente conocidos en la técnica, con el objeto de alterar las secuencias de codificación de polipéptidos por una variedad de razones, incluyendo, pero no limitándose a, alteraciones que modifiquen la clonación, procesamiento, y/o expresión del producto genético. Por ejemplo, se puede emplear mezcla de ADN mediante fragmentación aleatoria y reensamble de fragmentos de genes y oligonucleótidos sintéticos mediante reacción en cadena de la polimerasa, para diseñar secuencias de nucleótidos. Además, se puede emplear mutagénesis dirigida al sitio para insertar nuevos sitios de restricción, alterar los patrones de glicosilación, cambiar la preferencia de codones, producir variantes de empalme,

o introducir mutaciones, etc.

Las secuencias de ácidos nucleicos naturales, modificadas, o recombinantes se pueden ligar a una secuencia heteróloga, para codificar una proteína de fusión. Por ejemplo, con el fin de rastrear las bibliotecas de péptidos para determinar los inhibidores de la actividad del polipéptido, puede ser útil codificar una proteína quimérica que pueda ser reconocida por un anticuerpo comercialmente disponible. También se puede diseñar una proteína de fusión para que contenga un sitio de disociación localizado entre la secuencia de codificación del polipéptido y la secuencia de proteína heteróloga, de tal manera que el polipéptido se pueda disociar y purificar a partir de la fracción heteróloga.

Se pueden sintetizar secuencias que codifiquen un polipéptido deseado, del todo o en parte, empleando procedimientos químicos bien conocidos en la materia (véase Caruthers, M. H. y col., Nucl. Acids Res. Symp. Ser.

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En los casos en donde se utilizan vectores de expresión en plantas, la expresión de las secuencias que codifiquen los polipéptidos se puede impulsar mediante cualquiera de un número de promotores. Por ejemplo, se pueden utilizar promotores virales, tales como los promotores 35S y 19S de CaMV solos o en combinación con la secuencia líder omega a partir de TMV (Takamatsu, EMBO J. 6:307-311 (1987)). De una manera alternativa, se pueden utilizar promotores de plantas, tales como la subunidad pequeña de RUBISCO, o los promotores de choque por calor (Coruzzi y col., EMBO J. 3: 1671-1680 (1984); Broglie y col., Science 224: 838-843 (1984); y Winter y col., Results Probl. Cell Differ. 17: 85-105 (1991)). Estas construcciones se pueden introducir en células de plantas mediante la transformación del ADN directa, o mediante transfección mediada por patógeno. Estas técnicas se describen en un número de revisiones generalmente disponibles (véase, por ejemplo, Hobbs, en McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, páginas 191-196 (1992)).

También se puede utilizar un sistema de insecto para expresar un polipéptido de interés. Por ejemplo, en uno de estos sistemas, se utiliza el virus de polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como un vector para expresar genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o en Trichoplusia larvae. Las secuencias que codifiquen el polipéptido se pueden clonar en la región no esencial del virus, tal como el gen de polihedrina, y se ponen bajo el control del promotor de polihedrina. La inserción con éxito de la secuencia decodificación del polipéptido hará que el gen de polihedrina se inactive y produzca el virus recombinante careciendo de proteína de recubrimiento. Entonces se pueden utilizar los virus recombinantes para infectar, por ejemplo, células de S. frugiperda o Trichoplusia larvae, en donde se puede expresar el polipéptido de interés (Engelhard y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 91:3224-3227 (1994)).

En las células huésped de mamífero, en general hay un número de sistemas de expresión basados en virus disponibles. Por ejemplo, en los casos en donde se utiliza un adenovirus como un vector de expresión, se pueden ligar las secuencias que codifiquen un polipéptido de interés en un complejo de transcripción/traducción de adenovirus consistente en el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Se puede emplear la inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma viral para obtener un virus viable, el cual es capaz de expresar el polipéptido en las células huésped infectadas (Logan y Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 81:3655-3659 (1984)). Además, se pueden utilizar potenciadores de transcripción, tales como el potenciador de virus de sarcoma de Rous (RSV), para aumentar la expresión en células huésped de mamífero. Los procedimientos y protocolos para trabajar con vectores de adenovirus se revisan en Wold, Adenovirus Methods and Protocols, 1998. Las referencias adicionales con respecto al uso de vectores de adenovirus se pueden encontrar en Adenovirus: A Medical Dictionary, Bibliography, and Annotated Research Guide to Internet References, 2004.

También se pueden utilizar señales de inicio específicas para lograr una traducción más eficiente de las secuencias que codifiquen un polipéptido de interés. Estas señales incluyen el codón de inicio de ATG y las secuencias adyacentes. En los casos en donde se inserten secuencias que codifiquen el polipéptido, su codón de inicio, y las secuencias corriente arriba, en el vector de expresión apropiado, pueden no necesitarse señales de control de transcripción o de traducción adicionales. Sin embargo, en los casos en donde solamente se inserte la secuencia de codificación, o una porción de la misma, se deben proporcionar señales de control de traducción exógenas, incluyendo el codón de inicio de ATG. Adicionalmente, el codón de inicio debe estar en el marco de lectura correcto para asegurar la traducción del inserto entero. Los elementos de traducción exógenos y los codones de inicio pueden ser de diferentes orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de la expresión se puede mejorar mediante la inclusión de potenciadores que sean apropiados para el sistema celular particular que se utilice, tales como los descritos en la literatura (Scharf y col., Results Probl. Cell Differ. 20:125-162 (1994)).

Además, se puede seleccionar una cepa de células huésped por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas, o para procesar la proteína expresada en la forma deseada. Estas modificaciones del polipéptido incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación, y acilación. También se puede emplear el procesamiento posterior a la traducción que disocie una forma “prepro” de la proteína, para facilitar la inserción correcta, el pliegue, y/o la función. Se pueden seleccionar diferentes células huésped, tales como CHO, HeLa, MDCK, HEK293, y WI38, las cuales tienen una maquinaria celular específica y los mecanismos característicos para estas actividades posteriores a la traducción, con el fin de asegurar la modificación correcta y el procesamiento de la proteína extraña.

Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, en general se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresen establemente un polinucleótido de interés, se pueden transformar utilizando vectores de expresión, los cuales pueden contener orígenes de réplica virales y/o elementos de expresión endógenos, y un gen marcador seleccionable, sobre el mismo vector o sobre un vector separado. Después de la introducción del vector, se puede permitir que las células crezcan durante 1 a 2 días en un medio enriquecido antes de cambiarse al medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de las células que expresen con éxito las secuencias introducidas. Los clones resistentes de las células establemente transformadas se pueden proliferar empleando técnicas de cultivo de tejido apropiadas para el tipo de célula.

Se puede utilizar cualquier número de sistemas de selección para recuperar las líneas celulares transformadas. Estas incluyen, pero no se limitan a, los genes de cinasa de timidina del virus de herpes simple (Wigler y col., Cell 11:223-32 (1977)), y de fosfo-ribosil-transferasa de adenina (Lowy y col., Cell 22:817-23 (1990)), los cuales se

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pueden emplear en células tk-o aprt -, respectivamente. También, se puede utilizar la resistencia a antimetabolitos, a antibióticos, o a herbicidas como la base para la selección; por ejemplo, dhfr que confiere resistencia al metotrexato (Wigler y col., Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 77:3567-70 (1980)); npt, que confiere resistencia a los aminoglicósidos, neomicina y G-418 (Colbere-Garapin y col., J. MoI. Biol. 150:1-14 (1981)); y als o pat, que confieren resistencia al clorosulfurón y a la acetil-transferasa de fosfinotricina, respectivamente (Murry, supra). Se han descrito genes seleccionables adicionales, por ejemplo, trpB, que permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman y Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 85:8047-51 (1988)). Recientemente, el uso de marcadores visibles ha ganado popularidad con marcadores tales como antocianinas, -glucuronidasa y su sustrato GUS, y luciferasa y su sustrato luciferina, que se utilizan ampliamente no sólo para identificar los transformantes, sino también para cuantificar la cantidad de expresión de proteína transitoria o estable atribuible a un sistema de vector específico (Rhodes y col., Methods MoI. Biol. 55:121131 (1995)).

Aunque la presencia/ausencia de la expresión del gen marcador sugiere que también está presente el gen de interés, se puede necesitar confirmar su presencia y su expresión. Por ejemplo, si la secuencia que codifique un polipéptido se inserta dentro de una secuencia del gen marcador, se pueden identificar las células recombinantes que contengan las secuencias por la ausencia de la función del gen marcador. De una manera alternativa, se puede colocar un gen marcador en fila con una secuencia que codifique al polipéptido bajo el control de un solo promotor. La expresión del gen marcador en respuesta a la inducción o a la selección, normalmente indica la expresión del gen en fila también.

De una manera alternativa, se pueden identificar células huésped que contengan y expresen una secuencia de polinucleótido deseada, mediante una variedad de procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, hibridaciones de ADN-ADN o de ADN-ARN, y técnicas de bioensayo o inmunoensayo de proteínas, las cuales incluyen las tecnologías basadas en membrana, en solución, o en chip, para la detección y/o cuantificación del ácido nucleico o de la proteína.

En la técnica se conocen una variedad de protocolos para detectar y medir la expresión de los productos codificados por los polinucleótidos, utilizando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para el producto. Los ejemplos incluyen el ensayo de inmunoabsorción enlazado con enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), y selección de células activada por fluorescencia (FACS). Para algunas aplicaciones, se puede preferir un inmunoensayo basado en monoclonal, de dos sitios, que utilice anticuerpos monoclonales que reaccionen con dos epítopos no interferentes sobre un polipéptido dado, pero también se puede emplear un ensayo de enlace competitivo. Estos y otros ensayos se describen, entre otros lugares, en Hampton y col., Serological Methods, a Laboratory Manual (1990), y en Maddox y col., J. Exp. Med. 158:1211-1216 (1983).

Los expertos en este campo conocen una amplia variedad de marcas y técnicas de conjugación, y se pueden utilizar en diferentes ensayos de ácidos nucleicos y aminoácidos. Los medios para producir hibridación marcada o sondas de reacción en cadena de la polimerasa para detectar secuencias relacionadas con los polinucleótidos incluyen oligomarcado, traducción de apriete, marcado de extremo, o amplificación con reacción en cadena de la polimerasa utilizando un nucleótido marcado. De una manera alternativa, las secuencias, o cualesquiera porciones de las mismas, se pueden clonar en un vector para la producción de una sonda de ARNm. Estos vectores se conocen en la técnica, están comercialmente disponibles, y se pueden utilizar para sintetizar sondas de ARN in vitro, mediante la adición de una polimerasa de ARN apropiada, tal como T7, T3, o SP6, y nucleótidos marcados. Estos procedimientos se pueden conducir empleando una variedad de kits comercialmente disponibles. Las moléculas reporteras o marcas adecuadas que se pueden utilizar incluyen radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimiluminiscentes, o cromogénicos, así como sustratos, co-factores, inhibidores, partículas magnéticas, y similares.

Las células huésped transformadas con una secuencia de polinucleótido de interés se pueden cultivar bajo condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína a partir del cultivo celular. La proteína producida por una célula recombinante puede ser secretada o contenida intracelularmente, dependiendo de la secuencia y/o del vector utilizado. Como será entendido por los expertos en la materia, se pueden diseñar vectores de expresión que contengan los polinucleótidos para contener secuencias de señales que dirijan la secreción del polipéptido codificado a través de una membrana celular procariótica o eucariótica. Se pueden utilizar otras construcciones recombinantes para unir las secuencias que codifiquen un polipéptido de interés a la secuencia de nucleótidos que codifique un dominio de polipéptido que facilite la purificación de las proteínas solubles. Estos dominios que facilitan la purificación incluyen, pero no se limitan a, péptidos quelantes de metales, tales como los módulos de histidina-triptófano, que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, los dominios de la proteína A que permiten la purificación sobre la inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de extensión/purificación por afinidad FLAGS (Immunex Corp., Seattle, Wash.). La inclusión de secuencias enlazadoras disociables, tales como aquellas específicas para el factor XA o la enterocinasa (Invitrogen, San Diego, Calif.) entre el dominio de purificación y el polipéptido codificado, se pueden utilizar para facilitar la purificación. Uno de estos vectores de expresión proporciona la expresión de una proteína de fusión que contiene un polipéptido de interés, y un ácido nucleico que codifica seis residuos de histidina precedentes a una tiorredoxina o a un sitio de disociación de enterocinasa. Los residuos de histidina facilitan la purificación en la IMIAC (cromatografía por afinidad de ión de metal inmovilizado), como se describe en Porath y col., Prot. Exp. Purif. 3:263-281 (1992), mientras que el sitio de disociación de enterocinasa proporciona un medio para purificar el polipéptido deseado a partir de la proteína de

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anteriormente, la línea celular auxiliar actualmente preferida es la 293.

Recientemente, Racher y col. (1995) han dado a conocer mejores procedimientos para cultivar las células 293 y propagar el adenovirus. En un formato, se cultivan agregados celulares naturales mediante la inoculación de las células individuales en matraces centrífugos siliconizados de 1 litro (Techne, Cambridge, Reino Unido) conteniendo de 100 a 200 mililitros del medio. Después de la agitación a 40 revoluciones por minuto, se estima la viabilidad celular con azul de tripano. En otro formato, se emplean microportadores Fibra-Cel (Bibby Sterlin, Stone, Reino Unido) (5 gramos/litro) como sigue. Se agrega un inóculo celular, resuspendido en 5 mililitros del medio, al portador (50 mililitros) en un matraz Erlenmeyer de 250 mililitros, y se deja estacionario, con agitación ocasional, durante 1 a 4 horas. Luego se reemplaza el medio con 50 mililitros de medio fresco, y se inicia la agitación. Para la producción del virus, se permite que las células crezcan hasta aproximadamente una confluencia del 80 %, después de cuyo tiempo, se reemplaza el medio (hasta el 25 % del volumen final), y se agrega el adenovirus a una multiplicidad de infección de 0,05. Los cultivos se dejan estacionarios durante la noche, después de lo cual, se aumenta el volumen hasta el 100 %, y se comienza la agitación durante otras 72 horas.

De una forma diferente que no sea el requisito de que el vector de adenovirus sea defectuoso en réplica, o al menos condicionalmente defectuoso, no se cree que la naturaleza del vector de adenovirus sea crucial para la práctica con éxito de la invención. El adenovirus puede ser de cualquiera de los 42 serotipos conocidos diferentes o subgrupos A-

F. El adenovirus tipo 5 o subgrupo C es el material de partida preferido con el objeto de obtener un vector de adenovirus defectuoso en réplica condicional para uso, debido a que el adenovirus tipo 5 es un adenovirus humano acerca del cual se conoce una gran cantidad de información bioquímica y genética, e históricamente se ha utilizado para la mayoría de las construcciones que emplean adenovirus como un vector.

Como se mencionó anteriormente, el vector típico es defectuoso en réplica, y no tendrá una región de adenovirus E1. Por lo tanto, será más conveniente introducir el polinucleótido que codifique el gen de interés en la posición a partir del cual se hayan removido las secuencias que codifiquen E1. Sin embargo, la posición de inserción de la construcción dentro de las secuencias de adenovirus no es crítica para la invención. El polinucleótido que codifique el gen de interés también se puede insertar en lugar de la región E3 suprimida, en los vectores de reemplazo de E3, como es descrito por Karlsson y col. (1986), o en la región E4, en donde una línea celular auxiliar o un virus auxiliar complementan el defecto de E4.

El adenovirus es fácil de cultivar y manipular, y exhibe un amplio rango de huéspedes in vitro e in vivo. Este grupo de virus se puede obtener en altas titulaciones, por ejemplo, de 109 a 1011 unidades formadoras de placas por mililitro, y son altamente infecciosos. El ciclo de vida del adenovirus no requiere de la integración en el genoma de la célula huésped. Los genes extraños suministrados por los vectores de adenovirus son episomales, y por consiguiente, tienen una baja genotoxicidad para las células huésped. No se han reportado efectos secundarios en los estudios de vacunación con adenovirus de tipo silvestre (Couch y col., 1963; Top y col., 1971), demostrando su seguridad y su potencial terapéutico como vectores de transferencia genética in vivo. Los vectores de adenovirus se han utilizado en la expresión de genes eucarióticos (Levrero y col., 1991; Gomez-Foix y col., 1992), y el desarrollo de vacunas (Grunhaus y Horwitz, 1992; Graham y Prevec, 1992). Recientemente, estudios con animales sugirieron que se podría utilizar el adenovirus recombinante para la terapia genética (Stratford-Perricaudet y Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet y col., 1990; Rich y col., 1993). Los estudios en la administración de adenovirus recombinante a diferentes tejidos incluyen instilación en la tráquea (Rosenfeld y col., 1991; Rosenfeld y col., 1992), inyección muscular (Ragot y col., 1993), inyecciones intravenosas periféricas (Herz y Gerard, 1993), e inoculación estereotáctica en el cerebro (Le Gal La Salle y col., 1993).

Los vectores de adenovirus se pueden originar a partir de adenovirus humanos. De una manera alternativa, se pueden originar a partir de adenovirus de otras especies, por ejemplo de chimpancé, que pueden tener la ventaja de que los vectores virales no se neutralizan por los anticuerpos contra los adenovirus humanos que circulan en muchos sujetos humanos (véase, por ejemplo, Tatsis N. y col. Gene Therapy 2006 13: 421-429).

El adenovirus tipo 35, el cual es relativamente poco común, y por consiguiente hay bajos niveles de inmunidad previamente existente para el vector mismo, se ha utilizado como un sistema de suministro en ciertas vacunas de tuberculosis que se están desarrollando (véase, por ejemplo, Radosevic y col., Infection and Immunity 2007 75(8): 4105-4115). El adenovirus tipo 35 también puede ser de un valor particular como un vector de suministro.

2. RETROVIRUS

Los retrovirus son un grupo de virus de ARN de una sola cadena caracterizados por una capacidad para convertir su ARN en ADN de doble cadena en las células infectadas mediante un proceso de transcripción inversa (Coffin, 1990). Entonces el ADN resultante se integra establemente en los cromosomas celulares como un pro-virus, y dirige la síntesis de las proteínas virales. La integración da como resultado la integración de las secuencias genéticas virales en la célula receptora y sus descendientes. El genoma retroviral contiene tres genes, gag, pol, y env, que codifican para las proteínas de capsida, la enzima polimerasa, y los componentes de envoltura, respectivamente. Una secuencia que se encuentra corriente arriba desde el gen gag, contiene una señal para empacar el genoma en viriones. Hay dos secuencias de repetición terminal larga (LTR) presentes en los extremos 5’ y 3’ del genoma viral. Estas contienen fuertes secuencias promotoras y potenciadoras, y también se requieren para la integración en el

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Por ejemplo, una proteína que se presenta naturalmente se aísla si se separa de algunos o de todos los materiales co-existentes en el sistema natural. De preferencia, estos polipéptidos son al menos aproximadamente el 90 % puros, más preferiblemente al menos aproximadamente el 95 % puros, y de una manera muy preferible al menos aproximadamente el 99 % puros. Se considera que un polinucleótido está aislado si, por ejemplo, se clona en un vector que no sea una parte del medio ambiente natural.

Los polipéptidos se pueden preparar empleando cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas. Los polipéptidos recombinantes codificados por secuencias de ADN, como se describen anteriormente, se pueden preparar fácilmente a partir de las secuencias de ADN empleando cualquiera de una variedad de vectores de expresión conocidos por los expertos ordinarios en la materia. La expresión se puede lograr en cualquier célula huésped apropiado que se haya transformado o transfectado con un vector de expresión que contenga una molécula de ADN que codifique un polipéptido recombinante. Las células huésped adecuadas incluyen células de procariotes, de levadura, y de eucariotes superiores, tales como células de mamífero y células de plantas. De preferencia, las células huésped empleadas son las líneas celulares de E. coli, de levadura, o de mamífero, tales como COS o CHO. Los sobrenadantes de los sistemas de huésped/vector adecuados que secreten la proteína o el polipéptido recombinante en el medio de cultivo, se pueden concentrar primeramente utilizando un filtro comercialmente disponible. Después de la concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación adecuada, tal como una matriz de afinidad o una resina de intercambio de iones. Finalmente, se pueden emplear uno o más pasos de HPLC en fase inversa para purificar adicionalmente un polipéptido recombinante.

Los polipéptidos, los fragmentos inmunogénicos de los mismos, y otras variantes que tengan menos de aproximadamente 100 aminoácidos, y en general menos de aproximadamente 50 aminoácidos, también se pueden generar por medios sintéticos, empleando técnicas bien conocidas por los expertos ordinarios en este campo. Por ejemplo, estos polipéptidos se pueden sintetizar empleando cualquiera de las técnicas en fase sólida comercialmente disponibles, tales como el procedimiento de síntesis en fase sólida de Merrifield, en donde se agregan en secuencia los aminoácidos a una cadena de aminoácidos creciente. Véase Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146 (1963). El equipo para la síntesis automatizada de polipéptidos está comercialmente disponible con proveedores tales como Perkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster City, CA), y se puede operar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Dentro de ciertas realizaciones específicas, un polipéptido para uso puede ser una proteína de fusión que comprenda múltiples polipéptidos, como se describe en el presente documento, o que comprenda al menos un polipéptido como se describe en el presente documento, y una secuencia no relacionada. Los ejemplos de estas proteínas incluyen las proteínas de tétanos, tuberculosis, y hepatitis (véase, por ejemplo, Stoute y col., New Engl. J. Med. 336: 86-91 (1997)). Un componente de fusión, por ejemplo, puede asistir para proporcionar epítopos auxiliares-T (un componente de fusión inmunológico), de preferencia los epítopos auxiliares-T reconocidos por los seres humanos, o puede asistir en la expresión de la proteína (un potenciador de expresión) en rendimientos más altos que la proteína recombinante nativa. Ciertos componentes de fusión preferidos son componentes de fusión tanto inmunológicos como potenciadores de la expresión. Se pueden seleccionar otros componentes de fusión para aumentar la solubilidad de la proteína, o para hacer posible que se dirija la proteína hacia los compartimientos intracelulares deseados. Todavía además, los componentes de fusión incluyen marcos de afinidad, que facilitan la purificación de la proteína.

Las proteínas de fusión se pueden preparar en general empleando técnicas convencionales, incluyendo conjugación química. De preferencia, una proteína de fusión se expresa como una proteína recombinante, permitiendo la producción de mayores niveles, en relación con una proteína no fusionada, en un sistema de expresión. Dicho de una manera breve, las secuencias de ADN que codifiquen a los componentes del polipéptido se pueden ensamblar por separado, y se pueden ligar en un vector de expresión apropiado. El extremo 3’ de la secuencia de ADN que codifique un componente de polipéptido se liga, con o sin un enlazador peptídico, al extremo 5’ de una secuencia de ADN que codifique el segundo componente de polipéptido, de tal manera que los marcos de lectura de las secuencias estén en fase. Esto permite la traducción hasta una sola proteína de fusión que retiene la actividad biológica de ambos polipéptidos componentes.

Se puede emplear una secuencia enlazadora peptídica para separar los primero y segundo componentes de polipéptido por una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliegue en sus estructuras secundarias y terciarias. Esta secuencia enlazadora peptídica se incorpora en la proteína de fusión empleando técnicas convencionales bien conocidas en este campo. Las secuencias enlazadoras peptídicas adecuadas se pueden seleccionar basándose en los siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que podría interactuar con los epítopos funcionales sobre los primero y segundo polipéptidos; y (3) la falta de residuos hidrofóbicos o cargados, que podrían reaccionar con los epítopos funcionales del polipéptido. Las secuencias enlazadoras peptídicas preferidas contienen los residuos Gly, Asn, y Ser. También se pueden utilizar otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala, en la secuencia enlazadora. Las secuencias de aminoácidos que se pueden emplear útilmente como enlazadoras incluyen aquellas que se desvelan en Maratea y col., Gene 40:39-46 (1985); Murphy y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 83:8258-8262 (1986); Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4.935.233, y Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4.751.180. La secuencia enlazadora puede ser en general de 1 a aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. Las secuencias enlazadoras no se requieren cuando los primero y

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segundo polipéptidos tienen regiones de aminoácidos N-terminales no esenciales que se pueden utilizar para separar los dominios funcionales y para prevenir la interferencia estérica.

Dentro de las realizaciones preferidas, un componente de fusión inmunológico se deriva a partir de la proteína D, una proteína superficial de la bacteria gram-negativa Haemophilus influenza B (Publicación Internacional Número WO 91/18926). De preferencia, un derivado de proteína D comprende aproximadamente la primera tercera parte de la proteína (por ejemplo, los primeros 100 a 110 aminoácidos N-terminales), y un derivado de proteína D puede estar liquidado. Dentro de ciertas realizaciones preferidas, se incluyen los primeros 109 residuos de un componente de fusión de lipoproteína D en el término N para proporcionar al polipéptido epítopos de células-T exógenos adicionales, y para aumentar el nivel de expresión en E. coli (funcionando de esta manera como un potenciador de expresión). La cola del lípido asegura la presentación óptima del antígeno ante las células presentadoras de antígeno. Otros componentes de fusión incluyen la proteína no estructural del virus de influenza, NS1 (hemaglutinina). Típicamente, se utilizan los 81 aminoácidos N-terminales, aunque se pueden utilizar diferentes fragmentos que incluyan a los epítopos auxiliares-T.

En otra realización, el componente de fusión inmunológico es una proteína conocida como LYTA, o una porción de la misma (de preferencia una porción C-terminal). LYTA se deriva a partir de Streptococcus pneumoniae, que sintetiza una amidasa de N-acetil-L-alanina conocida como amidasa LYTA (codificada por el gen LytA; Gene 43:265292 (1986)). LYTA es una autolisina que degrada específicamente ciertos enlaces en la estructura base del peptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína LYTA es responsable de la afinidad con la colina, o con algunos análogos de colina, tales como DEAE. Esta propiedad se ha explotado para el desarrollo de plásmidos que expresan C-LYTA de E. coli útiles para la expresión de proteínas de fusión. La purificación de las proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LYTA en el término amino ya ha sido descrita (véase Biotechnology 10:795-798 (1992)). Dentro de una realización preferida, se puede incorporar una porción de repetición de LYTA en una proteína de fusión. Una porción de repetición se encuentra en la región C-terminal empezando en el residuo 178. Una porción de repetición particularmente preferida incorpora los residuos 188-305.

CÉLULAS-T

Las composiciones inmunoterapéuticas también, o alternativamente, pueden comprender células-T específicas para un antígeno de Mycobacterium. Estas células se pueden preparar en general in vitro o ex vivo, empleando procedimientos convencionales. Por ejemplo, las células-T se pueden aislar de la médula ósea, de la sangre periférica, o de una fracción de médula ósea o de sangre periférica de un paciente, utilizando un sistema de separación de células comercialmente disponible, tal como Sistema IsolexMR, disponible en Nexell Therapeutics, Inc. (Irvine, CA; véase también la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5.240.856; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5.215.926; y las Publicaciones Internacionales Números WO 89/06280; WO 91/16116 y WO 92/07243). De una manera alternativa, las células-T se pueden derivar a partir de seres humanos, mamíferos no humanos, líneas celulares, o cultivos relacionados o no relacionados.

Las células-T se pueden estimular con un polipéptido, un polinucleótido que codifique este polipéptido, y/o una célula presentadora de antígeno (APC) que exprese dicho polipéptido. Este estímulo se lleva a cabo bajo condiciones y durante un tiempo suficientes para permitir la generación de las células-T que sean específicas para el polipéptido. De una manera preferible, el polipéptido o el polinucleótido está presente dentro de un vehículo de suministro, tal como una microesfera, para facilitar la generación de células-T específicas.

Las células-T se consideran como específicas para un polipéptido para uso de la invención si las células-T específicamente proliferan, secretan citoquinas, o aniquilan a las células objetivo recubiertas con el polipéptido o que expresen un gen que codifique el polipéptido. La especificidad de las células-T se puede evaluar empleando cualquiera de una variedad de técnicas convencionales. Por ejemplo, dentro de un ensayo de liberación de cromo o un ensayo de proliferación, un índice de estímulo de un aumento de más del doble en la lisis y/o proliferación, comparándose con los controles negativos, indica especificidad de las células-T. Estos ensayos se pueden llevar a cabo, por ejemplo, como se describe en Cheng y col., Cancer Res. 54:1065-1070 (1994). De una manera alternativa, la detección de la proliferación de las células-T se puede llevar a cabo mediante una variedad de técnicas conocidas. Por ejemplo, se puede detectar la proliferación de las células-T midiendo un mayor índice de síntesis de ADN (por ejemplo, mediante el mercado por impulsos de cultivos de células-T con timidina tritiada, y midiendo la cantidad de timidina tritiada incorporada en el ADN). El contacto con un polipéptido para uso de la invención (100 nanogramos/mililitro a 100 microgramos/mililitro, de preferencia de 200 nanogramos/mililitro a 25 microgramos/mililitro) durante 3 a 7 días, debe dar como resultado un aumento de al menos el doble en la proliferación de las células-T. El contacto como se describe anteriormente durante 2 a 3 horas, debe dar como resultado la activación de las células-T medida empleando los ensayos de citoquina convencionales, en donde un aumento del doble en el nivel de liberación de citoquina (por ejemplo, TNF o IFN-) indica la activación de las células-T (véase Coligan y col., Current Protocols in Immunology, Volumen 1 (1998)). Las células-T que se han activado en respuesta a un polipéptido, polinucleótido, o una célula presentadora de antígeno que exprese el polipéptido, pueden ser CD4+ y/o CD8+. Las células-T específicas de la proteína se pueden expandir empleando técnicas convencionales. Dentro de las realizaciones preferidas, las células-T se derivan a partir de un paciente, un donador relacionado, o un donador no relacionado, y se administran al paciente después del estímulo y la expansión.

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Para propósitos terapéuticos, las células-T CD4+ o CD8+ que proliferan en respuesta a un polipéptido, polinucleótido, o célula presentadora de antígeno, se pueden expandir en número ya sea in vitro o bien in vivo. La proliferación de estas células-T in vitro se puede llevar a cabo en una variedad de maneras. Por ejemplo, las células-T se pueden volver a exponer a un polipéptido, o a un péptido corto correspondiente a una porción inmunogénica de este polipéptido, con o sin la adición de factores de crecimiento de células-T, tales como interleucina-2, y/o células estimulantes que sinteticen un polipéptido. De una manera alternativa, una o más células-T que proliferen en la presencia de la proteína, se pueden expandir en número mediante clonación. Los procedimientos para clonar células son bien conocidos en la técnica, e incluyen la dilución limitante.

COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS

En las realizaciones adicionales, los polinucleótidos, polipéptidos y composiciones para uso desvelados en el presente documento, se formularán en soluciones farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente administrables, para administrarse a una célula o a un animal, ya sea solas, o bien en combinación con una o más realizaciones diferentes de terapia.

También se entenderá que, si se desea, el segmento de ácido nucleico (por ejemplo, ARN o ADN) que expresa un polipéptido como se da a conocer en el presente documento, se puede administrar en combinación con otros agentes también, tales como, por ejemplo, otras proteínas o polipéptidos, o diferentes agentes farmacéuticamente activos, incluyendo agentes quimioterapéuticos efectivos contra una infección por M. tuberculosis. De hecho, prácticamente no hay límite para otros componentes que también se puedan incluir, dado que los agentes adicionales no provocan un efecto adverso significativo después de su contacto con las células objetivo o los tejidos del huésped. Por consiguiente, las composiciones se pueden suministrar junto con otros diferentes agentes, como se requieran en la instancia particular. Estas composiciones se pueden purificar a partir de células huésped o de otras fuentes biológicas, o de una manera alternativa, se pueden sintetizar químicamente como se describe en el presente documento. De la misma manera, estas composiciones pueden comprender además composiciones de ARN o ADN sustituidas o derivadas.

La formulación de los excipientes y soluciones de vehículo farmacéuticamente aceptables es bien conocida por los expertos en la materia, así como el desarrollo de regímenes de dosificación y tratamiento adecuados para utilizar las composiciones particulares descritas en el presente documento en una variedad de regímenes de tratamiento, incluyendo, por ejemplo, administración y formulación oral, parenteral, intravenosa, intranasal, e intramuscular. Otras vías de administración incluyen por medio de las superficies mucosas.

Típicamente, las formulaciones que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva suministran de aproximadamente 0,1 microgramos a aproximadamente 1000 microgramos del polipéptido por administración, más típicamente de aproximadamente 2,5 microgramos a aproximadamente 100 microgramos del polipéptido por administración. Con respecto a las composiciones de polinucleótidos, estas típicamente suministran de aproximadamente 10 microgramos a aproximadamente 20 miligramos del polinucleótido de la invención por administración, más típicamente de aproximadamente 0,1 miligramos a aproximadamente 10 miligramos del polinucleótido de la invención por administración

Naturalmente, la cantidad de compuestos activos en cada composición terapéuticamente útil se pueden preparar de tal manera que se obtenga una dosificación adecuada en cualquier dosis unitaria dada del compuesto. Los factores tales como solubilidad, biodisponibilidad, vida media biológica, vía de administración, vida de anaquel del producto, así como otras consideraciones farmacológicas, serán contemplados por un experto en la técnica de la preparación de estas formulaciones farmacéuticas, y como tales, pueden ser deseables una variedad de dosificaciones y regímenes de tratamiento.

1. SUMINISTRO ORAL

En ciertas aplicaciones, las composiciones farmacéuticas para uso desveladas en el presente documento se pueden suministrar mediante administración oral a un animal. Como tales, estas composiciones se pueden formular con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o se pueden encerrar en cápsulas de gelatina de cubierta dura o blanda, o se pueden comprimir en tabletas, o se pueden incorporar directamente con el alimento de la dieta.

Los compuestos activos inclusive se pueden incorporar con excipientes, y se pueden utilizar en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares Mathiowitz y col., 1997; Hwang y col., 1998; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5.641.515; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5.580.579, y Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5.792.451). Los comprimidos, trociscos, píldoras, cápsulas, y similares, también pueden contener lo siguiente: un aglutinante, como goma de tragacanto, acacia, almidón de maíz, o gelatina; excipientes, tales como difosfato de calcio; un agente desintegrante, tal como almidón de maíz, almidón de papa, ácido algínico, y similares; un lubricante, tal como estearato de magnesio; y un agente edulcorante, tal como sacarosa, lactosa, o sacarina, o un agente saborizante, tal como menta, aceite de hierbabuena, o saborizante de cereza. Cuando la forma unitaria de dosificación es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un vehículo líquido. Puede haber otros diferentes materiales presentes como recubrimientos o para modificar de otra manera la forma física de

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los Estados Unidos de Norteamérica Número 2003/0143240); AS02A (3D-MPL y QS21, y una emulsión de aceite en agua; véase Bojang y col., Lancet (2001) 358: 1927); ENHANZYN (Detox); 3D-MPL; saponinas, incluyendo Quil A y sus componentes, por ejemplo, QS21 y miméticos de saponina; CWS (el esqueleto de la pared celular a partir de un bacilo de tubérculo); TDM (dicorinomicolato de trehalosa); 4-fosfatos de amino-alquil-glucosaminida (AGPs); oligonucleopéptidos inmunoestimulantes, por ejemplo, CPG; Leif (factor de inicio de elongación de Leishmania); y derivados de los mismos. En una realización preferida, se administra un polipéptido para uso con uno

o más adyuvantes seleccionados a partir del grupo que consiste en 3D-MPL y QS21 en una formulación de liposomas, por ejemplo, AS01B y 3D-MPL y QS21, y una emulsión de aceite en agua (por ejemplo, AS02A). Los sistemas adyuvantes AS01B y AS02A se describen adicionalmente en Pichyangkul y col., Vaccine (2004) 22: 3831

40.

Cuando se suministra el antígeno Rv3616c como un ácido nucleico, se puede suministrar, por ejemplo, en un vector viral (es decir, un vector de adenovirus), o en una célula huésped de bacteria mutante (es decir, una célula huésped mutante, avirulenta, de Mycobacterium, Lactobacillus o Bacillus, incluyendo Bacillus Calmette-Guerin (BCG), y Lactococcus lactis).

Los adyuvantes preferidos para utilizarse en la provocación de una respuesta predominantemente tipo Th1 incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforil-lípido A (MPL), de preferencia monofosforil-lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL), opcionalmente con una sal de aluminio (véase, por ejemplo, Ribi y col., 1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, páginas 407-419; Patentes Británicas Números GB 2122204B y GB 2220211; y Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US 4.912.094). Una forma preferida de 3D-MPL está en la forma de una emulsión que tiene un tamaño de partículas pequeño menor de 0,2 milímetros de diámetro, y su procedimiento de elaboración se da a conocer en la Publicación Internacional Número WO 94/21292. Se han descrito formulaciones acuosas que comprenden monofosforil-lípido A y un tensoactivo, en la Publicación Internacional Número WO 98/43670. Los adyuvantes preferidos ejemplificados incluyen AS01B (MPL y QS21 en una formulación de liposomas), 3D-MPL y QS21 en una formulación de liposomas, AS02A (MPL y QS21, y una emulsión de aceite en agua), 3D-MPL y QS21, y una emulsión de aceite en agua, y AS15, disponible en GlaxoSmithKline. Los adyuvantes MPL están disponibles en GlaxoSmithKline (véanse las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034 y 4.912.094).

Los oligonucleótidos que contienen CpG (en donde el dinucleótido CpG no está metilado) también inducen una respuesta predominantemente Th1. CpG es una abreviatura para los motivos de los dinucleótidos de citosinaguanosina presentes en el ADN. Estos oligonucleótidos son bien conocidos y se describen, por ejemplo, en las Publicaciones Internacionales Números WO 96/02555 y WO 99/33488, y en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 6.008.200 y 5.856.462. También se describen secuencias de ADN inmunoestimulantes, por ejemplo, por Sato y col., Science 273: 352 (1996). CpG, cuando se formula en composiciones inmunogénicas, se administra en general en solución libre junto con el antígeno libre (Publicación Internacional Número WO96/02555; McCluskie y Davis, supra), o covalentemente conjugado con un antígeno (Publicación Internacional Número WO 98/16247), o se formula con un vehículo, tal como hidróxido de aluminio ((antígeno superficial de hepatitis), Davis y col., supra; Brazolot-Millan y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 1998, 95(26), 15553-8). CpG se conoce en la técnica como un adyuvante que se puede administrar tanto mediante la vía sistémica como mucosa (Publicación Internacional Número WO 96/02555, Patente Europea Número EP 468520, Davis y col., J. Immunol, 1998, 160(2): 870-876; McCluskie y Davis, J. Immunol., 1998, 161(9): 4463-6).

Otro adyuvante preferido es una saponina o miméticos o derivados de saponina, tales como Quil A, de preferencia QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA), que se puede utilizar sola o en combinación con otros adyuvantes. Por ejemplo, un sistema mejorado involucra la combinación de un monofosforil-lípido A (MPL®) y un derivado de saponina, tal como la combinación de QS21 y 3D-MPL, como se describe en la Publicación Internacional Número WO 94/00153, o una composición menos reactogénica, en donde el QS21 se apaga con colesterol, como se describe en la Publicación Internacional Número WO 96/33739. Otras formulaciones preferidas comprenden una emulsión de aceite en agua y tocoferol. Una formulación de adyuvante particularmente potente que involucra QS21, 3D-MPL®, y tocoferol en una emulsión de aceite en agua, se describe en la Publicación Internacional Número WO 95/17210. Los adyuvantes de saponina adicionales útiles en la presente invención incluyen QS7 (descrito en las Publicaciones Internacionales Números WO 96/33739 y WO 96/11711) y QS17 (descrito en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5.057.540 y en la Patente Europea Número EP 0.362.279 B1).

De una manera alternativa, las formulaciones de saponina se pueden combinar con vehículos de vacuna compuestos de quitosano u otros polímeros policatiónicos, partículas de poliláctido y de poliláctido-co-glicólido, matriz de polímero basada en poli-N-acetil-glucosamina, partículas compuestas de polisacáridos o de polisacáridos químicamente modificados, partículas basadas en liposomas y los lípidos, partículas compuestas de monoésteres de glicerol, etc. Las saponinas también se pueden formular en la presencia de colesterol para formar estructuras en partículas, tales como liposomas o ISCOMs. Adicionalmente, las saponinas se pueden formular junto con un éter o éster de polioxi-etileno, ya sea en una solución o suspensión que no esté en partículas, o bien en una estructura en partículas, tal como un liposoma paucilamelar o ISCOM. Las saponinas también se pueden formular con

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excipientes, tales como CARBOPOL, para aumentar la viscosidad, o se pueden formular en una forma de polvo seco con un excipiente en polvo, tal como lactosa.

En una realización, el sistema adyuvante incluye la combinación de a monofosforil-lípido A y un derivado de saponina, tal como la combinación de QS21 y adyuvante 3D-MPL®, como se describe en la Publicación Internacional Número WO 94/00153, o una composición menos reactogénica, en donde el QS21 se apaga con liposomas que contienen colesterol, como se describe en la Publicación Internacional Número WO 96/33739. Otras formulaciones adecuadas comprenden una emulsión de aceite en agua y tocoferol. Otra formulación de adyuvante adecuada que emplea QS21, adyuvante 3D-MPL®, y tocoferol en una emulsión de aceite en agua, se describe en la Publicación Internacional Número WO 95/17210.

Otro sistema de adyuvante mejorado incluye la combinación de un oligonucleótido que contiene CpG y un derivado de saponina, particularmente la combinación de CpG y QS21 como se describe en la Publicación Internacional Número WO 00/09159. De una manera adecuada, la formulación adicionalmente comprende una emulsión de aceite en agua y tocoferol.

Otros adyuvantes convenientes incluyen MONTANIDE® ISA 720 (Seppic, Francia), SAF (Chiron, California, Estados Unidos), ISCOMS® (CSL), MF-59 (Chiron), la serie de adyuvantes SBAS (SmithKline Beecham, Rixensart, Bélgica), Detox (Corixa), RC-529 (Corixa) y otros 4-fosfatos de amino-alquil-glucosaminida (AGPs) tales como los descritos en las solicitudes pendientes de Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica con Números de Serie 08/853.826 y 09/074.720, y adyuvantes de éter de polioxietileno, tales como los descritos en la Publicación Internacional Número WO 99/52549A1. SmithKline Beecham y Corixa Corporation son ahora parte de GlaxoSmithKline.

Otros adyuvantes convenientes incluyen moléculas adyuvantes de la fórmula general (I):

HO(CH2CH2O)n-A-R

en donde n es de 1 a 50, A es un enlace o –C(O)-, R es alquilo de 1 a 50 átomos de carbono o fenil-alquilo de 1 a 50 átomos de carbono.

Otro adyuvante de interés es la cadena de toxina b shiga, usada, por ejemplo, como se describe en la Publicación Internacional Número WO 2005/112991.

Una realización de la presente invención consiste en una composición inmunogénica para uso que comprende un éter de polioxiletileno de la fórmula general (I), en donde n es entre 1 y 50, preferiblemente entre 4 y 24, más preferiblemente 9; el componente R es alquilo de 1 a 50 átomos de carbono, de preferencia alquilo de 4 a 20 átomos de carbono, y todavía más preferiblemente alquilo de 12 átomos de carbono, y A es un enlace. La concentración de los éteres de polioxietileno deberá estar en un intervalo entre el 0,1 y el 20 %, de preferencia entre el 0,1 y el 10 %, y todavía más preferiblemente en el intervalo del 0,1 al 1 %. Los éteres de polioxietileno preferidos se seleccionan a partir del siguiente grupo: 9-lauril-éter de polioxietileno, 9-estearoil-éter de polioxietileno, 8-estearoil-éter de polioxietileno, 4-lauril-éter de polioxietileno, 35-lauril-éter de polioxietileno, y 23-lauril-éter de polioxietileno. Los éteres de polioxietileno, tales como el lauril-éter de polioxietileno, se describen en Merck Index (12a edición: entrada 7717). Estas moléculas adyuvantes se describen en la Publicación Internacional Número WO 99/52549.

Cualquier composición inmunogénica proporcionada en el presente documento se puede preparar empleando procedimientos bien conocidos que den como resultado una combinación de antígeno, potenciador de la respuesta inmunitaria, y un vehículo o excipiente adecuado. Las composiciones descritas en el presente documento se pueden administrar como parte de una formulación de liberación sostenida (es decir, una formulación tal como una cápsula, esponja, o gel (compuesto de polisacáridos, por ejemplo), que efectúe una liberación lenta del compuesto después de la administración). Estas formulaciones se pueden preparar en general empleando la tecnología bien conocida (véase, por ejemplo, Coombes y col., Vaccine 14:1429-1438 (1996)), y se administran, por ejemplo, mediante implante oral, rectal, o subcutáneo, o mediante implante en el sitio objetivo deseado. Las formulaciones de liberación sostenida pueden contener un polipéptido, polinucleótido, o anticuerpo dispersado en una matriz de vehículo, y/o pueden estar contenidos dentro de un depósito rodeado por una membrana de control de velocidad.

Los vehículos para utilizarse dentro de estas formulaciones son biocompatibles, y también pueden ser biodegradables; de preferencia la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación del componente activo. Estos vehículos incluyen micropartículas de poli-(láctido-co-glicólido), poliacrilato, látex, almidón, celulosa, dextrano, y similares. Otros vehículos de liberación retardada incluyen biovectores supramoleculares, los cuales comprenden un núcleo hidrofílico no líquido (por ejemplo, un polisacárido u oligosacárido reticulado), y opcionalmente, una capa externa que comprende un compuesto anfifílico, tal como un fosfolípido (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5.151.254, y las Solicitudes del TCP Números WO 94/20078, WO/94/23701 y WO 96/06638). La cantidad de compuesto activo contenida dentro de una formulación de liberación sostenida depende del sitio de implante, de la velocidad y duración esperada de liberación.

Se puede emplear cualquiera de una variedad de vehículos de suministro dentro de las composiciones farmacéuticas y composiciones inmunogénicas, para facilitar la producción de una respuesta inmunitaria específica del antígeno. Los vehículos de suministro incluyen células presentadoras de antígeno (APCs), tales como células

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componentes individuales de las proteínas de fusión. Esta selección se puede lograr sustrayendo los anticuerpos que reaccionen cruzadamente con los antígenos individuales. Se pueden emplear una variedad de formatos de inmunoensayo para seleccionar los anticuerpos específicamente inmuno-reactivos con una proteína particular. Por ejemplo, rutinariamente se utilizan los inmunoensayos ELISA en fase sólida para seleccionar los anticuerpos específicamente inmuno-reactivos con una proteína (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988), y Using Antibodies: A Laboratory Manual (1998), para ver una descripción de los formatos y condiciones de inmunoensayo que se pueden utilizar para determinar la inmuno-reactividad específica). Típicamente, una reacción específica o selectiva será de al menos dos veces la señal de fondo o ruido, y más típicamente más de 10, 20 o 100 veces el fondo (por ejemplo, el enlace a otras proteínas de Mycobacterium, tal como a otras proteínas de Mycobacterium tuberculosis).

DIAGNÓSTICO

Se desvelan procedimientos para utilizar uno o más de los polipéptidos descritos anteriormente para diagnosticar tuberculosis latente (por ejemplo, utilizando ensayos basados en la respuesta de las células-T o ensayos basados en anticuerpos de un formato convencional).

Por ejemplo, se desvela un procedimiento para determinar la infección latente por M. tuberculosis en un individuo, que comprende:

(a)

obtener una muestra a partir del individuo;

(b)

poner en contacto esta muestra con un polipéptido aislado, que comprende:

(i)

una secuencia de proteína de Rv3616c;

(ii)

una variante de una secuencia de proteína de Rv3616c; o

(iii) un fragmento inmunogénico de una secuencia de proteína de Rv3616c;

(c)

cuantificar la respuesta de la muestra.

Por ejemplo, la muestra puede ser sangre entera o células purificadas. De una manera adecuada, la muestra contendrá células mononucleares de sangre periférica (PBMC). En un ejemplo el individuo será seropositivo. En un segundo ejemplo de la invención, el individuo será seronegativo.

De una manera adecuada, el individuo no habrá sido previamente vacunado contra la infección por M. tuberculosis (por ejemplo, de una manera adecuada, el individuo no habrá sido previamente vacunado con BCG).

La respuesta de la muestra se puede cuantificar mediante un rango de medios conocidos por los expertos en este campo, incluyendo el monitoreo de la proliferación de linfocitos o la producción de citoquinas o anticuerpos específicos. Por ejemplo, se puede utilizar el ELISPOT de células-T para supervisar las citoquinas, tales como interferón-gamma (IFNγ), interleucina-2 (IL2), e interleucina-5 (IL5). Se puede utilizar el ELISPOT de células-B para supervisar la estimulación de los antígenos específicos de M. tuberculosis. La respuesta celular también se puede caracterizar mediante el uso de teñido intra-y extra-celular y análisis mediante un citómetro de flujo.

Los procedimientos para cuantificar la respuesta de proliferación de una muestra incluyen:

(i)

pulsar las células cultivadas con una radiomarca (por ejemplo, timidina tritiada), y supervisar la absorción de tritio (por ejemplo, centelleo de gas);

(ii)

marcado con succinimidil-éster de diacetato de carboxi-fluoresceína (CFSE) y monitoreo de la fluorescencia de la división celular utilizando citometría de flujo.

La cuantificación de la respuesta de citoquina de una muestra incluye en particular el monitoreo de la producción de interferón-gamma.

Cuando se utilizan estos procedimientos de cuantificación, se puede definir una respuesta positiva a un antígeno mediante una proporción de la señal al ruido (proporción S/N) de al menos 2:1 (por ejemplo, de al menos 3:1 o de al menos 5:1).

También se desvelan procedimientos para diagnosticar la infección por M. tuberculosis latente utilizando una prueba de la piel. Como se utiliza en el presente documento, una "prueba de la piel" es cualquier ensayo que se lleve a cabo directamente sobre un paciente, en donde se mide una reacción de híper-sensibilidad de tipo retardado (DTH) (tal como hinchamiento, enrojecimiento, o dermatitis) después de la inyección intradérmica de un polipéptido de Rv153c, como se describe anteriormente (o una variante, fragmentos inmunogénicos del mismo, o nucleótidos que los codifiquen). Esta inyección se puede lograr utilizando cualquier dispositivo adecuado suficiente para poner en contacto las combinaciones de antígeno con las células dérmicas del paciente, tal como una jeringa de tuberculina o una jeringa de 1 mililitro. La reacción se mide después de un período de tiempo, por ejemplo, al menos 48 horas después de la inyección, en especial de 48 a 72 horas.

La reacción DTH es una respuesta inmunitaria mediada por células, la cual es mayor en los pacientes que han sido expuestos anteriormente al antígeno de prueba. La respuesta se puede medir visualmente, utilizando una regla. En

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Rv3616c se seleccionó basándose en un análisis de todo el genoma de los genes de Mycobacterium tuberculosis asociados con el mantenimiento de la fase latente y la infectividad, como en Murphy y Brown BMC. Infect. Dis. 2007

7: 84-99. Los objetivos genéticos en fase latente potenciales en Mycobacterium tuberculosis se priorizaron a través de un meta-análisis bioinformático de los conjuntos de datos de micromatrices de ADN de todo el genoma

5 publicados de la expresión genética bacteriana bajo condiciones latentes simuladas. La localización sub-celular de las proteínas de M. tuberculosis codificadas por los genes se llevó a cabo subsiguientemente sobre el genoma entero para identificar los objetivos de la vacuna.

Dicho de una manera breve, las condiciones experimentales en los modelos de latencia fueron muy variadas, de modo que se desarrolló un sistema de calificación de cero a cinco para normalizar estos datos, basándose en dos 10 criterios: 1) la relevancia de las condiciones experimentales para el estado latente, y 2) el orden de clasificación de la expresión. La máxima calificación para un conjunto de datos experimentales particular se ajustó basándose en la relevancia potencial para la presentación clínica de las infecciones por M. tuberculosis en fase latente. La Tabla 1 muestra los conjuntos de datos recopilados para el Paso 1, junto con las máximas calificaciones ajustadas para cada conjunto de datos. Se obtuvieron conjuntos de datos adicionales sobre la esencialidad de los genes para el

15 crecimiento, a partir de los estudios publicados, utilizando los experimentos de eliminación genética basados en los transposones (TraSH). Los genes que no tuvieron efecto alguno sobre el crecimiento recibieron una calificación de cero.

Tabla 1 -Fuentes, modelos experimentales, y criterios de calificación para la expresión genética de la micromatriz de ADN de M. tuberculosis y la eliminación genética en todo el genoma (esencialidad de la fase 20 de crecimiento).

Referencia

Modelo Experimental Punto del Tiempo: Calificación Máximaa

Betts JC y col., Mol. Microbiol. 2002 43:717731

Inanición bajo O2 controlado 96h: 3 24h: 2 4h: 1

Hampshire T y col., Tuberculosis.(Edimb.) 2004 84:228-238

Agotamiento de nutrientes bajo O2 controlado 62 y 75d: 5 49d: 4 18d: 2

Muttucumaru DG y col., Tuberculosis.(Edimb.) 2004 84:239-246

Modelo de hipoxia de Wayne# 14d (NRP-2): 4 7d (NRP-1): 2

Voskuil MI y col., Tuberculosis.(Edimb.) 2004 84:218-227

Modelo de hipoxia de Wayne# 30 y 80d: 5 14 y 20d: 4 10 y 12d: 3 6 y 8d: 2

Schnappinger D y col., J. Exp. Med. 2003 198:693704

Infección de macrófagos de ratón, +/γ-INF 24 y 48h: 5

Karakousis PC y col., J. Exp. Med. 2004 200:647657

Implante subcutáneo de fibra hueca en ratones 10d: 3

(continuación)

Referencia

Modelo Experimental Punto del Tiempo: CalificaciónMáximaa

Talaat AM y col., Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 2004, 101:4602-4607

Infección de ratones. MTB cosechada a partir de pulmónb 28d: 3

Sassetti CM y col., Mol. Microbiol. 2003 48:7784

Bibliotecas mutadas TraSH cultivadas en un medio sólido 14d:5

Rengarajan J y col., Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 2005, 102: 8327-8332

Infección de macrófagos de ratón, +/γ-INF con Bibliotecas mutadas TraSH de M. tuberculosis 7d:5

Sassetti CM y col., Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 2003 100: 12989-12994

Ratones C57BL/6J infectados con Bibliotecas mutadas TraSH de M. tuberculosis 7, 14, 28 y 56d:5

a Calificación máxima basándose en la relevancia como un modelo de latencia; h = hora; d = día. b Proporción de M. tuberculosis a partir de pulmón de Balb/c a la MTB en un cultivo aireado durante 28 días. # Wayne LG y Hayes LG, Infect. Immun. 1996 64: 2062-2069.

Paso 2 -En la aplicación del segundo criterio, el orden de clasificación de expresión genética, las calificaciones de los genes a partir de cada conjunto de datos, se ordenó desde la más alta hasta la más baja, basándose en la 5 proporción de expresión (las veces de expresión en la condición experimental contra las células en cultivo líquido en fase de registro (log)). El gen de calificación más alta recibió la calificación máxima para ese conjunto de datos particular (enumerado en la columna 3 de la Tabla 1. (por ejemplo, 5, 4 …, 1 punto)). La calificación se redujo por 0,005 puntos para cada gen en orden hasta cero, o hasta que se alcanzó el final del conjunto de datos. Por consiguiente, cuando la calificación máxima fue de 4 puntos, el gen clasificado como 100o recibiría una calificación

10 de 3,500. Para una calificación máxima de 5 puntos, 1000 genes o el 25 % del genoma de M. tuberculosis recibieron una calificación. Para los experimentos en donde se recolectaron datos a partir de múltiples puntos del tiempo, la calificación máxima a través de todos los puntos del tiempo se utilizó como la calificación final.

En el Paso 3, las calificaciones para cada gen en cada una de las condiciones experimentales se recolectaron en una base de datos Microsoft Access. Se agregaron campos de referencia con el objeto de facilitar la priorización,

15 tales como ID Seq Ref (Identificación de Secuencia de Referencia), Función Genbank, Nota Genbank, Clasificación de Tuberculista, y los vínculos de KEGG y Sanger Center. Mediante la combinación de los datos a partir de diferentes estudios y fuentes, se alcanzó una vista en consenso acerca de los genes particulares y las sendas más críticas para la sobrevivencia en el estado latente.

En el Paso 4, se derivó una lista priorizada de objetivos terapéuticos utilizando los 400 genes de calificación superior

20 (aproximadamente el 10 % del genoma) complementada por el análisis computacional y manual experto de las sendas bioquímicas, enzimología, tratabilidad del fármaco, homología con los genes humanos, y otros conocimientos previos. La gran mayoría de los genes de alta calificación vienen a partir del subconjunto en donde se intersectan dos o tres de los grupos.

En el Paso 5, se llevó a cabo la identificación de la localización subcelular de las proteínas de M. tuberculosis

25 codificadas por los genes, en el genoma entero. La heurística empleada para la predicción de la proteína de membrana se describe en Chalker y col., J. Bacteriol. 2001 183: 1259-1268. Se generaron los perfiles de hidropatía promedio (H) (von Heijne G J. Mol. Biol. 1992 225: 487-494) utilizando los valores de hidropatía de GES (Engelman DM y col., Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 1986 15: 321-353) ponderados utilizando una ventana trapezoidal. Empleando un proceso similar a los pasos iniciales del algoritmo TopPred II (Claros M.G. y col., Comput. Appl.

30 Biosci. 1994 10: 685-686), se predijeron los segmentos transmembrana helicoidales (TMS) para cada secuencia de

péptido, mediante la selección de 19 aminoácidos centrados en el valor H más alto (MaxH), enmascarándolos de una consideración adicional, y repitiendo el proceso hasta que ya no quedaron picos son un H de >0,5. Las localizaciones subcelulares se asignaron basándose en el valor MaxH pico, en el número de segmentos con un H de >1,0, y en la distribución y valores H pico de los TMS supuestos. Se seleccionó un corte de MaxH de 1,15 para 5 maximizar la discriminación entre dos conjuntos de datos de 34 pruebas de liberación de SwissProtein que contenían proteínas transmembrana y citoplásmicas, respectivamente (Boyd D y col., Protein Sci. 1998 7: 201-205). Las proteínas con un MaxH de <1,15 se clasificaron como citoplásmicas, mientras que aquellas con un MaxH de >1,15 y al menos tres posibles TMS, se clasificaron como proteínas de membrana. Las proteínas ancladas se definieron por tener exactamente dos TMS, uno empezando antes del aminoácido (aa) 35 y uno con un H de >1,15

10 con el otro teniendo un H no menor de 0,5. Se utilizó específicamente SignalP con las posiciones Gram-positivas para M. bacterium, con el fin de identificar las proteínas secretadas entre aquellas clasificadas ya fuera como citoplásmicas o bien como "desconocidas" en el análisis heurístico (Nielsen H y col., Protein Eng. 1997 10: 1-6).

Rv3616c se clasificó muy alto como un antígeno de vacuna de acuerdo con varios criterios:

(i) Rv3616c se sobre-regula de una manera consistente a través de todos los modelos de latencia. Entre toda la

15 suite de 3999 genes calificados en el meta-análisis, Rv3616c se clasificó en el cuartil superior de los genes sobre-expresados a través de todos los modelos de latencia. La calificación sobre-regulada para Rv3616c fue de 6,52, la cual se comparó favorablemente con la calificación del gen superior de 22,28.

(ii) Rv3616c se clasificó como altamente esencial para la sobrevivencia en el modelo de infección de bazo de ratón ((calificándose en 4,945, de un posible puntaje de 5).

20 (iii) La localización subcelular predijo que la proteína de Rv3616c es una proteína enlazada a membrana y, por consiguiente, tiene una exposición extracelular significativa, indicando su idoneidad como un objetivo de vacuna.

(iv)

Rv3616c puede provocar una respuesta protectora contra la agresión inicial de la tuberculosis.

(v)

Rv3616c es ampliamente reconocido como un antígeno.

EJEMPLO 2 – PREDICCIÓN DE EPÍTOPOS DE Rv3616c

25 Procedimiento

La predicción de los epítopos de células-T se basó en los siguientes planteamientos:

Predicción

Nombre URL/Referencias

CD4 y CD8

Multipred sitio web: antigen.i2r.a-star.edu.sg/multipred/ Zhang,G.L., Khan,A.M., Srinivasan,K.N., August,J.T. y Brusic,V. (2005) “MULTIPRED: a computational system for prediction of promiscuous HLA binding peptides” Nucleic Acids Res. 33, W172 -W179.

SVMHC

sitio web: www-bs.informatik.uni-tuebingen.de/SVMHC “Prediction of MHC class I binding peptides, using SVMHC.” Pierre Dönnes y Arne Elofsson en: BMC Bioinformatics 2002 3: 25

CD4

ProPred sitio web: www.imtech.res.in/raghava/propred/ Singh,H. y Raghava,G.P.S.(2001) “ProPred: Prediction of HLA-DR binding sites.” Bioinformatics,17(12), 1236-37.

Tepitope2

Programa interno basado en: H. Bian, J. Hammer (2004) “Discovery of promiscuous HLA-II-restricted T cell epitopes with TEPITOPE.” Methods 34 : 468-75

(continuación)

Predicción

Nombre URL/Referencias

CD8

nHLA sitio web: www.imtech.res.in/raghava/nhlapred/ Bhasin M. y Raghava G P S (2006) “A hybrid approach for predicting promiscuous MHC class I restricted T cell epitopes”; J. Biosci. 32: 3142

NetCTL

sitio web: www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/ “An integrative approach to CTL epitope prediction. A combined algorithm integrating MHC-I binding, TAP transport efficiency, and proteasomal cleavage predictions.” Larsen M.V., Lundegaard C., Kasper Lamberth, Buus S., Brunak S., Lund O., y Nielsen M. European Journal of Immunology. 35(8): 2295-303. 2005

Epijen

sitio web: www.jenner.ac.uk/EpiJen/ Doytchinova, I. A., P. Guan, D. R. Flower. “EpiJen: a server for multistep T cell epitope prediction.” BMC Bioinformatics, 2006, 7, 131.

Syfpeithi

sitio web: www.syfpeithi.de/Scripts/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm Hans-Georg Rammensee, Jutta Bachmann, Niels Nikolaus Emmerich, Oskar Alexander Bachor, Stefan Stevanovic: “SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs.” Immunogenetics (1999) 50: 213-219

PredTAP

sitio web: antigen.i2r.a-star.edu.sg/predTAP/ Zhang,G.L., Petrovsky,N., Kwoh,C.K., August,J.T. y Brusic,V. (2006) “PREDTAP: a system for prediction of peptide binding to the human transporter associated with antigen processing.” Immunome Res. 2(1), 3.

PAPROC

http://www.paproc2.de/paproc1/paproc1.html C. Kuttler, A.K. Nussbaum, T.P. Dick, H.-G. Rammensee, H. Schild, K.P. Hadeler, “An algorithm for the prediction of proteasomal cleavages”, J. Mol. Biol. 298 (2000), 417-429. A.K. Nussbaum, C. Kuttler, K.P. Hadeler, H.-G. Rammensee, H. Schild, “PAProC: A Prediction Algorithm for Proteasomal Cleavages available on the WWW”, Immunogenetics 53 (2001), 87-94.

Resultados

Tabla 2 -Epítopos de células-T CD4+ humanas de Rv3616c supuestos

N.º de Epítopo de CD4 Supuesto

Posición de Aminoácido Secuencia del Epítopo SEQ ID NO: Alelo HLA

1

5 FIIDPTISA SEQ ID NO: 29 DRB1_0301, DRB1_0401, DRB1_1101

2

31 ILYSSLEYF SEQ ID NO: 30 DRB1_0301

3

36 LEYFEKALE SEQ ID NO: 31 DRB1_1301

4

63 YAGKNRNHV SEQ ID NO: 32 DRB1_0801

5

87 LIHDQANAV SEQ ID NO: 33 DRB1_0301, DRB1_0401

6

111 FVRPVAVDL SEQ ID NO: 34 DRB1_0101

7

119 LTYIPVVGH SEQ ID NO: 35 DRB1_0401

8

121 YIPVVGHAL SEQ ID NO: 36 DRB1_0101

9

151 YLVVKTLIN SEQ ID NO: 37 DRB1_0401

10

152 LVVKTLINA SEQ ID NO: 38 DRB1_1301

11

154 VKTLINATQ SEQ ID NO: 39 DRB1_0401

12

164 LKLLAKLAE SEQ ID NO: 40 DRB1_0301, DRB1_0801, DRB1_1101, DRB1_1301

13

173 LVAAAIADI SEQ ID NO: 41 DRB1_0301, DRB1_1101, DRB1_1301

14

181 IISDVADII SEQ ID NO: 42 DRB1_0301

15

197 WEFITNALN SEQ ID NO: 43 DRB1_0401

16

252 LFGAAGLSA SEQ ID NO: 44 DRB1_1501

17

264 LAHADSLAS SEQ ID NO: 45 DRB1_0401

18

270 LASSASLPA SEQ ID NO: 46 DRB1_0401

(continuación)

N.º de Epítopo de CD4 Supuesto

Posición de Aminoácido Secuencia del Epítopo SEQ ID NO: Alelo HLA

19

288 FGGLPSLAQ SEQ ID NO: 47 DRB1_0401

Tabla 3 -Epítopos de células-T CD8+ humanas de Rv3616c supuestos

N.º de Epítopo de CD4 Supuesto

Posición de Amino-ácido Secuencia del Epítopo SEQ ID NO: Alelo HLA

1

5 FIIDPTISA SEQ ID NO: 48 A2

2

6 IIDPTISAI SEQ ID NO: 49 A_0101, A2

3

9 PTISAIDGL SEQ ID NO: 50 A2, A_0201, B7, B8

4

10 TISAIDGLY SEQ ID NO: 51 A1, A_0101, A3, A_0301

5

12 SAIDGLYDL SEQ ID NO: 52 A2, B_3501

6

13 AIDGLYDLL SEQ ID NO: 53 A_0101, A_0201, B44

7

17 LYDLLGIGI SEQ ID NO: 54 A24

8

25 IPNQGGILY SEQ ID NO: 55 B7, A_0101, B_3501, B51

9

30 GILYSSLEY SEQ ID NO: 56 A1, A_0101, A3, A_0301

10

33 YSSLEYFEK SEQ ID NO: 57 A1, A_0301

11

35 SLEYFEKAL SEQ ID NO: 58 A_0201, B7, Cw_0401, Cw_0602

12

38 YFEKALEEL SEQ ID NO: 59 A24, A_2402, B8, Cw_0401, Cw_0602

13

39 FEKALEELA SEQ ID NO: 60 B44, B_4403

14

69 NHVNFFQEL SEQ ID NO: 61 A24, Cw_0602

15

76 ELADLDRQL SEQ ID NO: 62 A_0201

(continuación)

N.º de Epítopo de CD4 Supuesto

Posición de Amino-ácido Secuencia del Epítopo SEQ ID NO: Alelo HLA

16

77 LADLDRQLI SEQ ID NO: 63 A_0101, B51

17

79 DLDRQLISL SEQ ID NO: 64 A_0101, A_0201

18

80 LDRQLISLI SEQ ID NO: 65 A24, B7, B51

19

94 AVQTTRDIL SEQ ID NO: 66 B7

20

103 EGAKKGLEF SEQ ID NO: 67 A24, B7

21

107 KGLEFVRPV SEQ ID NO: 68 A_0201, B51

22

108 GLEFVRPVA SEQ ID NO: 69 A_0101, A_0301

23

109 LEFVRPVAV SEQ ID NO: 70 B44

24

111 FVRPVAVDL SEQ ID NO: 71 B7, B8, B_3501

25

113 RPVAVDLTY SEQ ID NO: 72 B7, A_0101, B_3501, B51

26

116 AVDLTYIPV SEQ ID NO: 73 A2, A_0201

27

120 TYIPVVGHA SEQ ID NO: 74 A24

28

121 YIPVVGHAL SEQ ID NO: 75 A_0101, A2, A_0201, B7, B8

29

129 LSAAFQAPF SEQ ID NO: 76 A1, B7, B_3501

30

130 SAAFQAPFC SEQ ID NO: 77 A_0201

31

131 AAFQAPFCA SEQ ID NO: 78 A_0301, B_3501

32

133 FQAPFCAGA SEQ ID NO: 79 A2, A_0201

33

135 APFCAGAMA SEQ ID NO: 80 B7, B_3501

34

136 PFCAGAMAV SEQ ID NO: 81 A3

35

141 AMAVVGGAL SEQ ID NO: 82 A2, A_0201, A24, B7

(continuación)

N.º de Epítopo de CD4 Supuesto

Posición de Amino-ácido Secuencia del Epítopo SEQ ID NO: Alelo HLA

36

143 AVVGGALAY SEQ ID NO: 83 A1, A3, A_0301, B7

37

147 GALAYLVVK SEQ ID NO: 84 A3, A_0301

38

149 LAYLVVKTL SEQ ID NO: 85 B8, B44, B51

39

150 AYLVVKTLI SEQ ID NO: 86 A24

40

155 KTLINATQL SEQ ID NO: 87 A_0201, A2, A_0301, A24

41

156 TLINATQLL SEQ ID NO: 88 A2, A_0201, A3, A_0101, Cw_0401

42

158 INATQLLKL SEQ ID NO: 89 B7, B8, Cw_0602

43

159 NATQLLKLL SEQ ID NO: 90 A_2402, B7, B_3501, B44, Cw_0401, Cw_0602

44

162 QLLKLLAKL SEQ ID NO: 91 A2, A_0201, A_0301, A_2402, B8, Cw_0401, Cw_0602

45

165 KLLAKLAEL SEQ ID NO: 92 A2, A_0201, A_0301, B7, B8, Cw_0602

46

166 LLAKLAELV SEQ ID NO: 93 A2, A_0201, A_0101, B8

47

169 KLAELVAAA SEQ ID NO: 94 A2

48

170 LAELVAAAI SEQ ID NO: 95 A1, A24, B51

49

173 LVAAAIADI SEQ ID NO: 96 B7, B51

50

177 AIADIISDV SEQ ID NO: 97 A2, A_0201, Cw_0602

51

178 IADIISDVA SEQ ID NO: 98 A_0101, B_3501

52

182 ISDVADIIK SEQ ID NO: 99 A1, A_0301

(continuación)

N.º de Epítopo de CD4 Supuesto

Posición de Amino-ácido Secuencia del Epítopo SEQ ID NO: Alelo HLA

53

192 TLGEVWEFI SEQ ID NO: 100 A2, A_0201

54

199 FITNALNGL SEQ ID NO: 101 A2

55

202 NALNGLKEL SEQ ID NO: 102 B51, A_2402, B_3501, Cw_0602

56

213 KLTGWVTGL SEQ ID NO: 103 A2, A_0201

57

214 LTGWVTGLF SEQ ID NO: 104 A1, A_0101, A24

58

225 GWSNLESFF SEQ ID NO: 105 A24

59

228 NLESFFAGV SEQ ID NO: 106 A2, A_0201

60

231 SFFAGVPGL SEQ ID NO: 107 A2, A_0201, A24, Cw_0401

61

238 GLTGATSGL SEQ ID NO: 108 A2, A_0201

62

246 LSQVTGLFG SEQ ID NO: 109 A1, B8

63

247 SQVTGLFGA SEQ ID NO: 110 A2

64

258 LSASSGLAH SEQ ID NO: 111 A1, A3, B7, B8

65

260 ASSGLAHAD SEQ ID NO: 112 A1, A3, A_0301

66

262 SGLAHADSL SEQ ID NO: 113 A_0201

67

263 GLAHADSLA SEQ ID NO: 114 A_0101, A_0201, A_0301

68

269 SLASSASLP SEQ ID NO: 115 A_0201, A_0301

69

271 ASSASLPAL SEQ ID NO: 116 B7

70

286 SGFGGLPSL SEQ ID NO: 117 A2, A_0201, B51

(continuación)

N.º de Epítopo de CD4 Supuesto

Posición de Amino-ácido Secuencia del Epítopo SEQ ID NO: Alelo HLA

71

291 LPSLAQVHA SEQ ID NO: 118 B7, B_3501, B51

72

298 HAASTRQAL SEQ ID NO: 119 B7, B8, B_3501

73

301 STRQALRPR SEQ ID NO: 120 A3, A_0301

74

307 RPRADGPVG SEQ ID NO: 121 B7, B_0702, B8, B51

75

319 EQVGGQSQL SEQ ID NO: 122 B7, B44

76

350 GASKGTTTK SEQ ID NO: 123 A3, A_0301

77

351 ASKGTTTKK SEQ ID NO: 124 A3, A_0301

78

353 KGTTTKKYS SEQ ID NO: 125 A_0301, B8

79

368 TEDAERAPV SEQ ID NO: 126 B44

Como se puede ver a partir de las Tablas 2 y 3, Rv3616c contiene un número de epítopos de células-T CD4+ y CD8 predichos. Adicionalmente, esta información sugiere que la proteína lleva epítopos que pueden ser reconocidos por 5 los HLAs que se presentan en todo el mundo (es decir, los HLAs de individuos caucásicos, africanos, asiáticos, o latinoamericanos – véase el sitio web en www.allelefrequencies.net).

EJEMPLO 3 -IDENTIFICACIÓN DE EPÍTOPOS DE Rv3616c

Se preparó un número de 30 péptidos traslapados que cubrían la longitud completa de Rv3616c (véase la Figura 1 para conocer los detalles, y las SEQ ID NO: 127 a 156), y se probaron para determinar su capacidad para estimular

10 las PBMC a partir de cuatro donadores PPD+.

Los datos, mostrados en la Figura 2, revelan que los péptidos 1 a 7 y 17 a 30 fueron inmunogénicos para estos individuos.

Se debe observar que los péptidos 8 a 16 (residuos de aminoácidos 92 a 215) pueden ser inmunogénicos en otros individuos que tengan un tipo de HLA diferente.

15 EJEMPLO 4 – HOMÓLOGOS DE H37Rv

Las secuencias de Rv3616c a partir de un número de cepas de M. tuberculosis y BCG se identificaron utilizando búsquedas BLASTP de GenBank (secuencia de referencia H37Rv, número de acceso NP_218133.1):

Cepa

Número de Acceso % de Identidad

CDC1551

NP_338263.1 99

F11

YP_001289574.1 99

Haarlem

ZP_02248979.1 99

5

10

15

20

25

30

35

40

45

(continuación)

Cepa

Número de Acceso % de Identidad

C

ZP_00877472.1 99

BCG

YP_979759.1 99

La alineación de las secuencias homólogas indica un alto nivel de identidad.

ENSAYOS BIOLÓGICOS

Cuantificación de las respuestas de células-T al Rv3616c

Los polipéptidos se pueden rastrear para determinar su capacidad para activar las células-T (inducción de proliferación y/o producción de citoquinas) en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o en las preparaciones de sangre entera a partir de los individuos infectados (tal como latententemente infectados).

Los individuos latentemente infectados normalmente se identifican mediante una prueba de la piel que tiene un diámetro mayor de 10 milímetros y sin síntomas, sin cultivo positivo de Mtb, con un esputo negativo, y sin lesión (como se detecta mediante rayos-X del pecho).

Se pueden utilizar un número de ensayos in vitro, basándose en muestras de PBMC o en sangre entera: después de la re-estimulación en la presencia del antígeno (o de la variante/del fragmento inmunogénico del mismo, como sea apropiado), se puede determinar la proliferación de las células (como se mide mediante CFSE/citometría de flujo), o se puede cuantificar la producción de citoquinas (presentes en las células del sobrenadante de cultivo y medidas mediante ELISA, o, después del teñido intracelular de las células-T CD4 y CD8 y del análisis mediante citometría de flujo).

Por ejemplo, las muestras de PBMC se pueden obtener a partir de sangre entera heparinizada, mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque siguiendo los procedimientos convencionales. Las células entonces se pueden lavar y crioconservar en nitrógeno líquido hasta la prueba (para otros detalles, véase Lalvani A y col., J. Infect. Dis. 1999 180: 1656-1664).

Proliferación de Células-T

La respuesta inmunitaria específica se puede caracterizar llevando a cabo el análisis de la proliferación de linfocitos utilizando la timidina tritiada. Esta técnica evalúa la expansión celular después de la estimulación in vitro a un antígeno. En la práctica, proliferación celular se determina mediante la estimación de la incorporación de la timidina tritiada en el ADN, un proceso estrechamente relacionado con los cambios subyacentes en el número de células.

De una manera más adecuada, la proliferación de linfocitos se puede llevar a cabo utilizando el succinimidil-éster de diacetato de carboxi-fluoresceína (CFSE). El CFSE se acopla de una manera espontánea e irreversible tanto con las proteínas intracelulares como con las proteínas de superficie celular, mediante su reacción con las cadenas laterales de lisina y otros grupos amina disponibles. Cuando se dividen las células de linfocitos, el marcado con CFSE se distribuye igualmente entre las células hijas, las cuales, por consiguiente, son la mitad de fluorescentes que las progenitoras. Como un resultado, la mitad de la intensidad de fluorescencia celular marca cada generación sucesiva en una población de células proliferantes, y es fácilmente seguida mediante citometría de flujo (para otros detalles, véase Hodgkins, PD y col., J. Exp. Med. 1996 184: 277-281).

Prácticamente, después de la descongelación, las PBMC se pueden lavar y teñir con CFSE antes de cultivarse (2 x 105 células) durante 72 horas con 10 microgramos/mililitro de antígeno en el medio de cultivo (RPMI-1640 complementado con glutamina, aminoácidos no esenciales, piruvato, y suero AB humano inactivado por calor). Las células entonces se pueden cosechar, y se puede caracterizar su fenotipo utilizando teñido superficial para identificar las células-T CD8 y CD4+ de memoria. Subsiguientemente, se puede utilizar el análisis de citometría de flujo para indicar el grado de proliferación de linfocitos en respuesta a cada antígeno (proporción de las células con una intensidad de CFSE reducida después de la estimulación in vitro).

Producción de Citoquina

La producción de IFN-γ (o la producción de otras citoquinas, tales como, por ejemplo, IL2, TNF-alfa, IL5, IL12, etc.), se puede medir utilizando un ensayo de inmunoabsorción enlazado con enzimas (ELISA). Las placas ELISA se pueden recubrir con un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido hacia el IFN-γ humano (PharMingen, San Diego, CA) en suero regulado con fosfato (PBS) durante cuatro horas a temperatura ambiente. Entonces los pozos se bloquean con suero regulado con fosfato (PBS) que contiene leche descremada y deshidratada al 5 % (peso/volumen) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan entonces, por ejemplo, seis veces, en suero regulado con fosfato/TWEEN-20 al 0,2 %, y las muestras se diluyen a 1:2 en el medio de cultivo en las placas ELISA, y se incuban

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Claims (1)

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