EA024826B1 - Способ лечения латентного туберкулеза - Google Patents

Способ лечения латентного туберкулеза Download PDF

Info

Publication number
EA024826B1
EA024826B1 EA201100072A EA201100072A EA024826B1 EA 024826 B1 EA024826 B1 EA 024826B1 EA 201100072 A EA201100072 A EA 201100072A EA 201100072 A EA201100072 A EA 201100072A EA 024826 B1 EA024826 B1 EA 024826B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
sequence
protein
polypeptide
ku3616c
cells
Prior art date
Application number
EA201100072A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201100072A1 (ru
Inventor
Джеймс Браун
Паскаль Меттенс
Деннис Мерфи
Original Assignee
Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Глаксо Груп Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А., Глаксо Груп Лимитед filed Critical Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Publication of EA201100072A1 publication Critical patent/EA201100072A1/ru
Publication of EA024826B1 publication Critical patent/EA024826B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/04—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)

Abstract

Изобретение относится к полипептиду, содержащему (1) последовательность белка Rv3616c; (2) вариант последовательности белка Rv3616c или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Rv3616c для применения в лечении или предупреждении латентного туберкулеза. В других аспектах изобретение относится к ассоциированным полинуклеотидам, слитым белкам и способам лечения или предупреждения латентного туберкулеза.

Description

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к полипептидам и полинуклеотидам для применения в лечении или предупреждении туберкулеза, в частности для применения в лечении или предупреждении латентного туберкулеза и в предупреждении или замедлении реактивации туберкулеза (и также к родственным способам). Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим и иммуногенным композициям, содержащим указанные полипептиды и полинуклеотиды, и к способам диагностики туберкулеза (в частности, латентного туберкулеза).
Предшествующий уровень техники
Туберкулез (ТВ) представляет собой хроническое инфекционное заболевание, вызываемое инфекцией МусоЪайегшт 1иЪегси1о818 и другими видами МусоЪайегшт. Это заболевание является основным заболеванием в развивающихся странах, а также представляет собой нарастающую проблему в развитых частях света. Считается, что более 2 млрд людей инфицированы бациллами ТВ, примерно с 9,2 млн новых случаев ТВ и 1,7 млн смертей ежегодно. У 10% инфицированных бациллами ТВ развивается активный ТВ, при этом каждый человек с активным ТВ в течение года заражает в среднем 10-15 других людей. Несмотря на то что ежегодные показатели коэффициентов заболеваемости достигли своего пика во всем мире, количество смертельных исходов и случаев туберкулеза по-прежнему растет ввиду роста численности населения (Всемирная организация здравоохранения, ТиЪегси1о818 Рас18, 2008).
МусоЪайегшт 1иЪегси1о818 инфицирует людей через дыхательные пути. Альвеолярные макрофаги осуществляют захват этой бактерии, однако она способна выживать и пролиферировать благодаря ингибированию слияния фагосом с содержащими кислую среду лизосомами. Результатом является комплексный иммунный ответ, вовлекающий СЭ4+ и СЭ8+ Т-клетки, в конечном итоге приводящий к образованию гранулёмы. Важным для успешного действия МусоЪайегшт 1иЪегси1о818 как патогена является тот факт, что изолированные, но не искорененные бактерии могут сохраняться в течение длительных периодов времени, в результате чего индивидуум остается восприимчивым к развитию впоследствии активного ТВ.
Менее чем у 5% инфицированных индивидуумов активный ТВ развивается в первые годы после инфекции. Гранулёма может сохраняться десятилетиями, и предполагают, что она содержит живые МусоЪайегшт 1иЪегси1о818 в состоянии покоя, без кислорода и питательных веществ. Однако недавно выдвинуто предположение, что большая часть бактерий в состоянии покоя локализована в типах клеток, не являющихся макрофагами, распределенных по всему организму (ЬосЙ е1 а1., Ехрей Θρίη. Вю1. Ткег.. 2007, 7(11):1665-1677). Развитие активного ТВ происходит, когда баланс между природным иммунитетом хозяина и патогенным микроорганизмом изменяется, например, в результате иммуносупрессорного события (Апбег8оп Р., Тгепб8 ίη МюгоЪюйду, 2007, 15(1):7-13; Ек1ег8 8., 1п£ес1юп, 2009, 37(2):87-95).
Также предложена динамическая гипотеза, описывающая баланс между латентным ТВ и активным ТВ (Сагбапа Р.-Т, 1пДаттабоп & А11егду - Эгид ТагдеК 2006, 6:27-39; Сагбапа Р.-Т, 1пГес1лоп, 2009, 37(2):80-86).
Несмотря на то что инфекция может быть бессимптомной в течение значительного периода времени, активное заболевание в подавляющем большинстве случаев проявляется как острое воспаление легких, приводящее к повышенной утомляемости, потере массы, лихорадке и непрекращающемуся кашлю. При отсутствии лечения типичным результатом являются серьёзные осложнения и смерть.
Обычно туберкулез можно контролировать с использованием длительной терапии антибиотиками, хотя такое лечение не является достаточным для предупреждения распространения заболевания. Инфицированные индивидуумы могут в течение некоторого периода времени не проявлять симптомов, но быть заразными. Кроме того, несмотря на то что соблюдение схемы лечения является критическим, поведение пациента трудно контролировать. Некоторые пациенты не завершают курс лечения, что может приводить к неэффективности лечения и развитию лекарственной устойчивости.
Мультирезистентный ТВ (МЭК-ТВ) представляет собой форму, которая не отвечает на лекарственные средства первой линии. 5% всех случаев ТВ представляют собой МЭК-ТВ, при этом в течение каждого года возникает приблизительно 490000 новых случаев МЭК-ТВ. ТВ с широкой лекарственной устойчивостью (ХБК.-ТВ) возникает, когда помимо МЭК-ТВ развивается резистентность к лекарственным средствам второй линии. По оценкам, ежегодно возникает 40000 новых случаев фактически неизлечимого ХЭК-ТВ (Всемирная организация здравоохранения, ТиЪегси1о818 Рас18, 2008).
Даже если полный курс лечения антибиотиками пройден, инфекция М.1иЪегси1о818 может не быть искоренена в инфицированном индивидууме, а может оставаться в виде латентной инфекции, которая может реактивироваться.
Для того чтобы контролировать распространение туберкулеза, крайне важным являются эффективная вакцинация и точный ранний диагноз заболевания.
Диагностику латентной ТВ инфекции обычно выполняют, применяя туберкулиновую кожную пробу, которая включает внутрикожное введение очищенного от белков туберкулина (РРЭ). Антигенспецифические Т-клеточные ответы приводят к измеряемому уплотнению в месте инъекции через 48-72 ч после инъекции, что указывает на контакт с микобактериальными антигенами. Однако проблемой этого теста является чувствительность и специфичность, и индивидуумов, вакцинированных БЦЖ, не всегда
- 1 024826 можно легко отличить от инфицированных индивидуумов (это особенно важно в свете того факта, что БЦЖ не защищает от латентной инфекции). В общем, индивидуумы, получившие БЦЖ, но не инфицированные М.1иЪегси1о515, демонстрируют реакцию на ΡΡΌ менее 10 мм в диаметре, в то время как люди с реакцией на ΡΡΌ более 10 мм в диаметре считаются инфицированными М.1иЪегси1о515. Однако это правило не применимо к индивидуумам с иммуносупрессией вследствие ВИЧ-инфекции, которая может приводить к реакции на ΡΡΌ менее 10 мм в диаметре; или в эндемичных странах, где люди, инфицированные нетуберкулезными микобактериями, могут демонстрировать реакцию на ΡΡΌ более 10 мм в диаметре.
В последние годы наблюдается прогресс в разработке анализов ίη νίίτο с использованием Т-клеток, основанных на высвобождении интерферона-γ и использовании антигенов, которые более специфичны к МТиЪегси1о515, чем ΡΡΌ, а именно ΕδΑΤ-6 (6 кДа ранний секреторный антиген) и ΟΡΡ-10 (10 кДа белок культурального фильтрата). По-видимому, эти высокоспецифичные тесты имеют, по меньшей мере, такую же чувствительность, как и туберкулиновая кожная проба, и, кроме того, демонстрируют меньшую перекрестную реактивность, обусловленную вакцинацией БЦЖ. В качестве последнего обзора диагностики латентного ТВ см. Ραί М.е1 а1., Ехрей Кеу. Мо1. Όίαβίη 2006, 6(3):413-422. Однако, поскольку Ε8ΑΤ-6/ΟΡΡ-10 являются антигенами ранней стадии, анализы, основанные на Ε8ΑΤ-6/ΟΡΡ-10, оптимально можно выполнить только на недавно инфицированных людях. Следовательно, идентификация новых антигенов, специфически ассоциированных с латентным туберкулезом, может помочь разработке более чувствительных методов анализа, с помощью которых можно было бы обнаружить долгосрочные латентные инфекции.
Сохраняется потребность в эффективных стратегиях для лечения и предупреждения туберкулеза, в частности лечения и предупреждения латентного ТВ и предупреждения реактивации ТВ.
Краткое изложение сущности изобретения
В целом настоящее изобретение относится к идентификации Ку3616с в качестве антигена латентного ТВ и к родственным способам и применениям в предупреждении и лечении латентного ТВ и в предупреждении или замедлении реактивации ТВ.
Согласно настоящему изобретению предложен полипептид, содержащий:
(1) последовательность белка Ку3616с;
(2) вариант последовательности белка Ку3616с или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ку3616с, для применения в качестве лекарственного средства в лечении или предупреждении латентного ТВ.
Следующий аспект изобретения относится к способу лечения или предупреждения латентного ТВ, включающий введение безопасного и эффективного количества полипептида, содержащего:
(1) последовательность белка Ку3616с;
(2) вариант последовательности белка Ку3616с или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ку3616с; субъекту, нуждающемуся в этом, где указанный полипептид вызывает иммунный ответ, в частности, иммунный ответ против МусоЪас1егшт 1иЪегси1о515.
Применение полипептида, содержащего:
(1) последовательность белка Ку3616с;
(2) вариант последовательности белка Ку3616с или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ку3616с, в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения латентного ТВ, представляющего собой другой аспект изобретения.
Также предложен полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, содержащий:
(1) последовательность белка Ку3616с;
(2) вариант последовательности белка Ку3616с или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ку3616с;
для применения в качестве лекарственного средства в лечении или предупреждении латентного ТВ.
Следующий аспект изобретения относится к способу лечения или предупреждения латентного ТВ, включающему введение безопасного и эффективного количества полинуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, содержащий:
(1) последовательность белка Ку3616с;
(2) вариант последовательности белка Ку3616с или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ку3616с;
субъекту, нуждающемуся в этом, где указанный полинуклеотид вызывает иммунный ответ, в частности иммунный ответ против МусоЪас!егшт 1иЪегси1о515.
Применение полинуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, содержащий:
(1) последовательность белка Ку3616с;
(2) вариант последовательности белка Ку3616с или
- 2 024826 (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ку3616с, в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения латентного ТВ, представляющего собой другой аспект изобретения.
В дополнение к этому, предложена фармацевтическая композиция, содержащая:
(а) полипептид, содержащий:
(1) последовательность белка Ку3616с;
(2) вариант последовательности белка Ку3616с или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ку3616с; или (б) полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид из (а); и (в) фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент, для применения в качестве лекарственного средства в лечении или предупреждении латентного ТВ.
Кроме того, предложена иммуногенная композиция, содержащая:
(а) полипептид, содержащий:
(1) последовательность белка Ку3616с;
(2) вариант последовательности белка Ку3616с или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ку3616с; или (б) полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид из (а); и (в) неспецифический усилитель иммунного ответа, для применения в качестве лекарственного средства в лечении или предупреждении латентного ТВ.
В дополнение к этому, предложено антитело или его фрагмент, которые специфично связываются с полипептидом, содержащим:
(1) последовательность белка Ку3616с;
(2) вариант последовательности белка Ку3616с или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ку3616с, для применения в диагностике латентного ТВ (как, например, в способах диагностики латентного туберкулеза, включающих определение присутствия антитела или его фрагмента, которые специфично связываются с полипептидами по изобретению в биологическом образце, взятом у тестируемого субъекта).
Также предложен способ лечения латентного ТВ, включающий стадии:
(1) идентификация субъекта как имеющего латентную инфекцию ТВ (например, посредством анализов на основе ΡΡΌ или Т-клеток);
(2) введение указанному субъекту безопасного и эффективного количества полипептида или полинуклеотида, как изложено здесь (например, в форме фармацевтической композиции или иммуногенной композиции).
Также предложено применение полипептида по настоящему изобретению в изготовлении диагностического набора для идентификации латентного ТВ у тестируемого субъекта.
В одном воплощении субъект, получающий полипептид, полинуклеотид или композицию, может иметь активный туберкулез (например, активную инфекцию МДиЬегси1о818). Во втором воплощении субъект может иметь латентный туберкулез (например, скрытую инфекцию МТиЬегси1о818). В третьем воплощении субъект может не иметь туберкулеза (например, не иметь инфекции МДиЬсгсЫоУ).
Субъект, получающий полипептид, полинуклеотид или композицию, может быть предварительно вакцинированным от туберкулеза (например, вакцинированным против инфекции М.шЬсгсЫоУ). например вакцинированным бациллой Кальметта-Герена (БЦЖ (ВСС)). Альтернативно, субъект, получающий полипептид, полинуклеотид или композицию по изобретению, может быть не вакцинированным предварительно от туберкулеза (например, не вакцинированным против инфекции М.1иЬегси1о818), например не вакцинированным бациллой Кальметта-Герена (БЦЖ).
Описание графических материалов
Фиг. 1. Выравнивание пептида Ку3616с с полноразмерной последовательностью.
Фиг. 2. РВМС-ответы на пептиды Ку3616с.
Фиг. 3. Процент СЭ4 и СЭ8 клеток от иммунизированных СВ6Р1 мышей, экспрессирующих цитокины ΙΡΝ-γ и/или 1Ь-2, и/или ТЧР-α. на 21-е сутки (т.е. через 7 суток после второй иммунизации).
Фиг. 4. Цитокиновый профиль на 21-е сутки (т.е. через 7 суток после второй иммунизации) для антигенспецифического СЭ4-ответа у иммунизированных СВ6Р1 мышей.
Фиг. 5. Цитокиновый профиль на 21-е сутки (т.е. через 7 суток после второй иммунизации) для антигенспецифического СЭ8-ответа у иммунизированных СВ6Р1 мышей.
Фиг. 6. Процент СЭ4 и СЭ8 клеток от иммунизированных СВ6Р1 мышей, экспрессирующих цитокины ΙΡΝ-γ и/или 1Ь-2, и/или ΊΝΡ-α, на 35-е сутки (т.е. через 7 суток после третьей иммунизации).
Фиг. 7. Цитокиновый профиль на 35-е сутки (т.е. через 7 суток после третьей иммунизации) для антигенспецифического СЭ4-ответа у иммунизированных СВ6Р1 мышей.
- 3 024826
Фиг. 8. Цитокиновый профиль на 35-е сутки (т.е. через 7 суток после третьей иммунизации) для антигенспецифического СЭ8-ответа у иммунизированных СВ6Р1 мышей.
Фиг. 9. Процент СГО4 и СЭ8 клеток от иммунизированных С57ВЬ/6 мышей, экспрессирующих цитокины ΙΡΝ-γ и/или 1Ь-2, и/или ΤΝΡ-α, на 21-е сутки (т.е. через 7 суток после второй иммунизации).
Фиг. 10. Цитокиновый профиль на 21-е сутки (т.е. через 7 суток после второй иммунизации) для антигенспецифического СГО4-ответа у иммунизированных С57ВЬ/6 мышей.
Фиг. 11. Процент СГО4 и СЭ8 клеток от иммунизированных С57ВЬ/6 мышей, экспрессирующих цитокины ΙΡΝ-γ и/или 1Ь-2, и/или ΤΝΡ-α, на 35-е сутки (т.е. через 7 суток после третьей иммунизации).
Фиг. 12. Цитокиновый профиль на 35-е сутки (т.е. через 7 суток после третьей иммунизации) для антигенспецифического СГО4-ответа у иммунизированных С57ВЬ/6 мышей,
Фиг. 13. Цитокиновый профиль на 35-е сутки (т.е. через 7 суток после третьей иммунизации) для антигенспецифического СО8-ответа у иммунизированных С57ВЬ/6 мышей.
Фиг. 14. Антигенспецифические СЭ4 Τ-клеточные ответы у ранее не подвергавшихся инфекции людей и людей с латентной инфекцией.
8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0 8ЕЦ ГО N0
Описание списка последовательностей 1: полипептидная последовательность Ку3616е из штамма Η37Κν М.1иЬегси1о818.
2: полинуклеотидная последовательность Ку3616с из штамма Η37Κν М.1иЬегси1о818. 3: полипептидная последовательность Ку3616с из штамма СГОС1551 М.1иЬегси1о818. 4: полипептидная последовательность Ку3616с из штамма Ρ11 М.1иЬегси1о818.
5: полипептидная последовательность Ку3616с из штамма Нааг1ет А М.щЬегсЫоых 6: полипептидная последовательность Ку3616с из штамма С М.щЬегсЫоых 7: полипептидная последовательность Ку3616с из БЦЖ.
8: полипептидная последовательность МШ8.4.
9: полипептидная последовательность МШ9.8.
10: полипептидная последовательность МШ9.9.
11: полипептидная последовательность Ка12.
12: полипептидная последовательность Ка35.
13: полипептидная последовательность ТЬН9.
14: полипептидная последовательность МЛЬ41.
15: полипептидная последовательность Е8АТ-6.
16: полипептидная последовательность Ад85А.
17: полипептидная последовательность Ад85В.
18: полипептидная последовательность альфа-кристаллина.
19: полипептидная последовательность МРТ64.
20: полипептидная последовательность МШ32А.
21: полипептидная последовательность 8ег/А1а-мутантного зрелого М(Ь32А.
22: полипептидная последовательность ТВ10.4.
23: полипептидная последовательность М(Ь72Г.
24: полипептидная последовательность М72.
25: полипептидная последовательность М!Ь71Г.
26: полипептидная последовательность слитой конструкции М92.
27: полипептидная последовательность слитой конструкции М103.
28: полипептидная последовательность слитой конструкции М114.
29: предсказанный СГО4 клеточный эпитоп 1 человека.
30: предсказанный СГО4 клеточный эпитоп 2 человека.
31: предсказанный СГО4 клеточный эпитоп 3 человека.
32: предсказанный СГО4 клеточный эпитоп 4 человека.
33: предсказанный СГО4 клеточный эпитоп 5 человека.
34: предсказанный СГО4 клеточный эпитоп 6 человека.
35: предсказанный СГО4 клеточный эпитоп 7 человека.
36: предсказанный СГО4 клеточный эпитоп 8 человека.
37: предсказанный СГО4 клеточный эпитоп 9 человека.
38: предсказанный СГО4 клеточный эпитоп 10 человека.
39: предсказанный СГО4 клеточный эпитоп 11 человека.
40: предсказанный СГО4 клеточный эпитоп 12 человека.
41: предсказанный СГО4 клеточный эпитоп 13 человека.
42: предсказанный СГО4 клеточный эпитоп 14 человека.
43: предсказанный СГО4 клеточный эпитоп 15 человека.
44: предсказанный СГО4 клеточный эпитоп 16 человека.
45: предсказанный СГО4 клеточный эпитоп 17 человека.
46: предсказанный СГО4 клеточный эпитоп 18 человека.
- 4 024826 δΕφ ΙΌ N0 δΕφ ΙΌ N0 δΙΓ) ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0 δΕΟ ΙΌ N0
47: предсказанный 0Ό4 клеточный эпитоп 19 человека. 48: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 1 человека. 49: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 2 человека. 50: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 3 человека.
51: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 4 человека. 52: предсказанный 0Ό8 клеточный элитоп 5 человека. 53: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 6 человека. 54: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 7 человека. 55: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 8 человека. 56: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 9 человека. 57: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 10 человека. 58: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 11 человека. 59: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 12 человека. 60: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 13 человека. 61: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 14 человека. 62: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 15 человека. 63: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 16 человека. 64: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 17 человека. 65: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 18 человека. 66: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 19 человека. 67: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 20 человека. 68: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 21 человека. 69: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 22 человека. 70: предсказанный 0Ό8 клеточный элитоп 23 человека. 71: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 24 человека. 72: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 25 человека. 73: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 26 человека. 74: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 27 человека. 75: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 28 человека. 76: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 29 человека. 77: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 30 человека. 78: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 31 человека. 79: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 32 человека. 80: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 33 человека. 81: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 34 человека. 82: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 35 человека. 83: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 36 человека. 84: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 37 человека. 85: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 38 человека. 86: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 39 человека. 87: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 40 человека. 88: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 41 человека. 89: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 42 человека. 90: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 43 человека. 91: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 44 человека. 92: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 45 человека. 93: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 46 человека. 94: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 47 человека. 95: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 48 человека. 96: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 49 человека. 97: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 50 человека. 98: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 51 человека. 99: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 52 человека. 100: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 53 человека. 101: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 54 человека. 102: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 55 человека. 103: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 56 человека. 104: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 57 человека. 105: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 58 человека. 106: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 59 человека. 107: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 60 человека. 108: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 61 человека.
- 5 024826
8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0 8ЕЦ ΙΌ N0
109: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 62 человека.
110: предсказанный 0Ό8 клеточный эпитоп 63 человека.
111: предсказанный ΕΌ8 клеточный эпитоп 64 человека.
112: предсказанный ΕΌ8 клеточный эпитоп 65 человека.
113: предсказанный ΕΌ8 клеточный эпитоп 66 человека.
114: предсказанный ΕΌ8 клеточный эпитоп 67 человека.
115: предсказанный ΕΌ8 клеточный эпитоп 68 человека.
116: предсказанный ΕΌ8 клеточный эпитоп 69 человека.
117: предсказанный ΕΌ8 клеточный эпитоп 70 человека.
118: предсказанный ΕΌ8 клеточный эпитоп 71 человека.
119: предсказанный ΕΌ8 клеточный эпитоп 72 человека.
120: предсказанный ΕΌ8 клеточный эпитоп 73 человека.
121: предсказанный ΕΌ8 клеточный эпитоп 74 человека.
122: предсказанный ΕΌ8 клеточный эпитоп 75 человека.
123: предсказанный ΕΌ8 клеточный эпитоп 76 человека.
124: предсказанный ΕΌ8 клеточный эпитоп 77 человека.
125: предсказанный ΕΌ8 клеточный эпитоп 78 человека.
126: предсказанный ΕΌ8 клеточный эпитоп 79 человека.
127: пептид 1.
128: пептид 2.
129: пептид 3.
130: пептид 4.
131: пептид 5.
132: пептид 6.
133: пептид 7.
134: пептид 8.
135: пептид 9.
136: пептид 10.
137: пептид 11.
138: пептид 12.
139: пептид 13.
140: пептид 14.
141: пептид 15.
142: пептид 16.
143: пептид 17.
144: пептид 18.
145: пептид 19.
146: пептид 20.
147: пептид 21.
148: пептид 22.
149: пептид 23.
150: пептид 24.
151: пептид 25.
152: пептид 26.
153: пептид 27.
154: пептид 28.
155: пептид 29.
156: пептид 30.
157: полипептидная последовательность Ку1753е из штамма Η37Κν М.!иЬетси1о818. 158: полипептидная последовательность Ву2386с из штамма Η37Κν М.!иЬетси1о818. 159: полипептидная последовательность Р.у2707с из штамма Η37Κν М.!иЬетси1о818.
Подробное описание
В настоящее время вакцинация живыми бактериями является наиболее эффективным способом индукции защитного иммунитета. Наиболее часто используемой для этой цели микобактерией является бацилла Кальметта-Герена (БЦЖ), авирулентный штамм М.Ьотй. который был разработан более 60 лет назад. Однако безопасность и эффективность БЦЖ являются предметом дискуссии: защищая от тяжелого проявления болезни у детей, БЦЖ не предотвращает возникновение латентного ТВ или реактивацию болезни легких во взрослой жизни. Кроме того, в некоторых странах, таких как Соединенные Штаты, широкую вакцинацию населения этим агентом не проводят.
Почти все вакцины против ТВ нового поколения, которые в настоящее время находятся в стадии клинической разработки, были разработаны как вакцины прединфекционной профилактики. Они включают субъединичные вакцины, которые особенно эффективны в повышении иммунитета, индуцируемого
- 6 024826 предшествующей вакцинацией БЦЖ, и усовершенствованные живые микобактериальные вакцины, которые предназначены для того, чтобы заменить БЦЖ на более эффективные и/или безопасные штаммы. Несмотря на то что эти вакцины предназначены для улучшения устойчивости к инфекции, по всей вероятности они менее эффективны в качестве постинфекционных или терапевтических вакцин в случаях латентного ТВ (Мп Μ.Υ. с1 а1., Епйосппе, Ме1аЬойс & 1ттипе Ойогйеш - Эгид ТагдеК 2008, 8:15-29).
Показано, что некоторые белки, которые интенсивно экспрессируются на ранних стадиях микобактериальной инфекции, обеспечивают высокую защитную эффективность в моделях вакцинации на животных. Тем не менее, вакцинация антигенами, которые интенсивно экспрессируются на ранних стадиях инфекции, не может обеспечить оптимальный иммунный ответ на более поздних стадиях инфекции. Для адекватного контроля на более поздних стадиях инфекции могут потребоваться Т-клетки, которые являются специфичными к определенным антигенам, которые экспрессируются на тот момент времени.
Постинфекционные вакцины, которые нацелены непосредственно на находящиеся в состоянии покоя персистирующие бактерии, могут оказывать содействие в защите от реактивации ТВ, тем самым усиливая контроль над ТВ или даже давая возможность устранения инфекции. Поэтому вакцина, нацеленная на латентный ТВ, могла бы значительно и экономично снизить общие уровни зараженности ТВ.
Субъединичные вакцины на основе антигенов поздних стадий также могут быть использованы в комбинации с антигенами ранних стадий для приготовления мультифазной вакцины. Альтернативно, антигены поздних стадий могли бы быть использованы для дополнения и улучшения вакцинации БЦЖ (либо путём усиления ответа на БЦЖ, либо путём разработки усовершенствованных рекомбинантных штаммов БЦЖ).
Ранее показано, что Ку3616с, также известный как М(Ь40 или НТСС1, вовлечен в иммунные ответы, ассоциированные с туберкулезом (см., например, \УО 98/53075). В Α1-ΑΐΙίν;·ι1ι е1 а1., Сйп. Ехр. 1ттипо1. 2004, 138:139-144 показано, что Ку3616с хорошо распознается (посредством анализа пролиферации РМВС и продукции ΙΡΝ-γ) у пациентов с туберкулезом легких. В работе Ми81аГа е1 а1., 1пГес1. 1ттип. 2006, 74(8):4566-4572 исследовано распознавание Ру3616с у крупного рогатого скота, инфицированного М.Ьоуй и вакцинированного БЦЖ.
Недавно на основании биоинформационного анализа полного генома М.1иЬегси1о818 (Ζνί е1 а1., ВМС Мейюа1 Сепейск, 2008, 1:18) и тестирования дифференциально экспрессируемых белков у индивидуумов, пораженных активной и латентной инфекцией (8сйиск 8.Ό. е1 а1., РЬо8 ΟΝΕ, 2009, 4(5):е5590), была предложена группа вакцин-кандидатов против МДиЬегсЫойк
В то время как макрофаги, как было показано, действуют в качестве главных эффекторов иммунитета к МусоЬас1ейит, Т-клетки являются преобладающими индукторами такого иммунитета. Существенную роль Т-клеток в защите против туберкулеза иллюстрирует повышенная частота реактивации ТВ у индивидуумов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека, вследствие связанного с этим истощения СЭ4+ Т-клеток. Более того, показано, что адоптивный перенос СЭ4+ Т-клеток, полученных на пике первичного иммунного ответа на М.1иЬегси1о818, предоставляет защиту против М.1иЬегси1о818 дефицитным по Т-клеткам мышам (Огте е1 а1., 1. Ехр. Мей., 1983, 158:74-83).
Показано, что МусоЬас1ейит-реактивные СЭ4+ Т-клетки являются мощными продуцентами γ-интерферона (ΙΡΝ-γ), для которого, в свою очередь, показано, что он запускает антимикобактериальные эффекты макрофагов у мышей (Р1упп е1 а1., 1. Ехр. Мей., 1993, 178:2249-2254). В то время как роль ΙΡΝ-γ у людей менее понятна, исследования показали, что 1,25-дигидрокси витамин Ό3, либо сам по себе, либо в комбинации с ΙΡΝ-γ или фактором некроза опухоли-альфа, активирует макрофаги человека для ингибирования инфекции М.1иЬегси1о818. Кроме того, известно, что ΙΡΝ-γ стимулирует макрофаги человека к продукции 1,25-дигидрокси витамина Ό3. Аналогично показано, что интерлейкин-12 (1Ь-12) играет роль в стимуляции устойчивости к инфекции, вызываемой М.1иЬегси1о818. Для обзора иммунологии инфекции, вызываемой М.1иЬегси1о818, см. Сйап & КаиГтапп, ТиЬегси1оЙ5: Ра1йодепе818, Рго1есйоп апй Сопйо1 (В1оот ей., 1994), ТиЬегси1о818 (2-е изд., Кот апй Сагау, ей8., 2003) и НаггйопА Рйпс1р1е8 оГ 1п1егпа1 Мейюше, Сйар1ег 150, р. 953-966 (16-е изд., Вгаип\уа1й, е! а1., ей8., 2005).
В целом настоящее изобретение относится к идентификации К\'3616с в качестве ТВ антигена, ассоциированного с латентным ТВ, и к родственным способам и применениям в предупреждении и лечении латентного ТВ и в предупреждении или замедлении реактивации ТВ.
Таким образом, согласно изобретению предложен белок К\'3616с, его вариант или его иммуногенный фрагмент либо полинуклеотид, кодирующий указанный белок, вариант или фрагмент, для применения в лечении или предупреждении латентного ТВ. Подходящим образом применение может быть специфично в лечении латентного ТВ (особенно лечении латентного ТВ). Альтернативно, применение может заключаться в предупреждении или замедлении реактивации ТВ (особенно замедлении реактивации ТВ, например, на период времени в несколько месяцев, лет или даже на неограниченный период времени).
Термин виды МусоЬасЮгннн туберкулезного комплекса включает такие виды, которые традиционно считаются вызывающими заболевание туберкулез, а также присутствующие в окружающей среде и условно-патогенные виды МусоЬасЮпит, которые вызывают туберкулез и болезнь легких у иммуноло- 7 024826 гически скомпрометированных Дшшиие сошргош15еб) пациентов, таких как пациенты со СПИДом, например, М.1иЬегси1о818, Μ.ϋονίδ или М.айтсаииш, БЦЖ, М.аушш, М.ш!гасе11и1аге, М.се1а!иш, М.депауегже. М.Ьаешорййиш, М.каикакп, М.81Ш1ае, М.уассае, М.Гойийиш и М.5сгоГи1асеиш (см., например, Натзоик Ргшшр1е5 оГ 1и!егиа1 Мебюше, СДар!ег 150, р. 953-966 (16-е изд., Вгаииуа1б, е! а1., еб5., 2005). Настоящее изобретение относится особенно к инфекции, вызываемой М.!иЬегси1о515.
Термин активная инфекция относится к инфекции (например, инфекции, вызываемой МЛиЬегси1о515) с проявляющимися симптомами заболевания и/или поражениями (соответственно с проявляющимися симптомами заболевания).
Термины неактивная инфекция, скрытая инфекция или латентная инфекция относятся к инфекции (например, инфекции, вызываемой М, !иЬегси1о515) без проявляющихся симптомов заболевания и/или поражений (соответственно без проявляющихся симптомов заболевания).
Термин первичный туберкулез относится к клинической форме заболевания (проявлению симптомов заболевания), следующей непосредственно за инфекцией (например, инфекцией, вызываемой МЛиЬегси1о515). См. Нат5ои'5 Ргтар1е5 оГ 1и!егиа1 Мебюше, СДар!ег 150, р. 953-966 (16-е изд., Вгаииуа1б, е! а1., еб5., 2005).
Термины вторичный туберкулез или постпервичный туберкулез относятся к реактивации скрытой, неактивной или латентной инфекции (например, инфекции, вызываемой М.!иЬегси1о515). См. Нат5ои'5 Ргшщр1е5 оГ 1и!егиа1 Мебюше, СДар!ег 150, р. 953-966 (16-е изд., ВгаииуаЫ, е! а1., еб5., 2005).
Термин реактивация туберкулеза относится к более позднему проявлению симптомов заболевания у индивидуума, который имеет положительные результаты в тесте на инфекцию (например, в туберкулиновой кожной пробе, подходящим образом в анализе ш νίΙΐΌ, основанном на использовании Тклеток), но не имеет очевидных симптомов заболевания. Положительный результат диагностического теста указывает на то, что индивидуум инфицирован, однако этот индивидуум может иметь или может не иметь ранее проявлявшихся активных симптомов заболевания, которые были подвергнуты лечению в достаточной степени для того, чтобы перевести туберкулез в неактивное или латентное состояние. Общепризнано, что способы предупреждения, замедления или лечения реактивации туберкулеза могут быть инициированы у индивидуума, демонстрирующего активные симптомы заболевания.
Термин туберкулез устойчивый к лекарственным средствам относится к инфекции (например, инфекции, вызываемой М.!иЬегси1о515), при которой инфицирующий штамм не останавливается в развитии или не убивается (т.е. является устойчивым к) одним или более чем одним так называемым химиотерапевтическим агентом первой линии, эффективным в лечении туберкулеза (например, изониазидом, рифампином, этамбутолом, стрептомицином и пиразинамидом).
Термин мультирезистентный туберкулез относится к инфекции (например, инфекции, вызываемой М.!иЬегси1о515), при которой инфицирующий штамм устойчив к двум или более химиотерапевтическим агентам первой линии, эффективным в лечении туберкулеза.
Химиотерапевтический агент относится к фармакологическому агенту, который известен и используется в данной области для лечения туберкулеза (например, инфекции, вызываемой М.!иЬегси1о515). Типичные фармакологические агенты, используемые для лечения туберкулеза, включают амикацин, аминосалициловую кислоту, капреомицин, циклосерин, этамбутол, этионамид, изониазид, канамицин, пиразинамид, рифамицины (т.е. рифампин, рифапентин и рифабутин), стрептомицин, офлоксацин, ципрофлоксацин, кларитромицин, азитромицин и фторхинолоны, но этим не ограничиваются. Химиотерапевтические агенты первой линии или передовой линии, используемые для лечения туберкулеза, не обладающего лекарственной устойчивостью, включают изониазид, рифампин, этамбутол, стрептомицин и пиразинамид. Химиотерапевтические агенты второй линии, используемые для лечения туберкулеза, демонстрирующего лекарственную устойчивость к одному или более чем одному лекарственному средству первой линии, включают офлоксацин, ципрофлоксацин, этионамид, аминосалициловую кислоту, циклосерин, амикацин, канамицин и капреомицин. Обзор таких фармакологических агентов приведен в главе 48 Сообшаи аиб СДшаи'5 ТДе РДагшасо1одюа1 Ва515 оГ ТДегареийс5, Нагбшаи аиб ПшЬйб еб5., 2001.
Термины полипептид, пептид и белок используются здесь взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Данные термины также применяются к аминокислотным полимерам, в которых один или более чем один аминокислотный остаток представляет собой искусственный химический миметик соответствующей природной аминокислоты, а также к природным полимерам аминокислот и неприродным полимерам аминокислот. Удобно, когда полипептид по настоящему изобретению будет состоять только из природных аминокислотных остатков, особенно таких аминокислот, которые кодируются генетическим кодом.
Термин аминокислота относится к природным и синтетическим аминокислотам, а также к аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые функционируют аналогично природным аминокислотам. Природные аминокислоты представляют собой аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также аминокислоты, которые подвергаются более поздним модификациям, например, гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат и О-фосфосерин. Термин аналоги аминокислот относится к соединениям, которые имеют такую же основную химическую структуру, что и природная аминокислота, т.е.
- 8 024826 α-углерод, который связан с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и группой К, например гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионинметилсульфоний. Такие аналоги имеют модифицированные группы К (например, норлейцин) или модифицированные пептидные остовы, но сохраняют такую же основную химическую структуру, как у природной аминокислоты. Термин миметики аминокислот относится к химическим соединениям, которые имеют структуру, отличающуюся от общей химической структуры аминокислоты, но которые функционируют подобно природной аминокислоте. Удобно, когда аминокислота представляет собой природную аминокислоту или аналог аминокислоты, особенно природную аминокислоту и, в частности, те аминокислоты, которые кодируются генетическим кодом.
Нуклеиновая кислота относится к дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам и их полимерам как в одноцепочечной, так и в двухцепочечной форме. Термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги нуклеотидов или модифицированные остатки или связи в остове, которые являются синтетическими, природными и неприродными, которые имеют связывающие свойства, подобные связывающим свойствам эталонной нуклеиновой кислоты, и которые метаболизируются аналогично эталонным нуклеотидам. Примеры таких аналогов включают, без ограничения, фосфоротиоаты, фосфорамидаты, метилфосфонаты, хиральные метилфосфонаты, 2-О-метилрибонуклеотиды, пептидонуклеиновые кислоты (ПНК). Соответственно, термин нуклеиновая кислота относится к природным дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам и их полимерам.
Если не указано иное, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также полностью охватывает ее консервативно модифицированные варианты (например, замены вырожденных кодонов) и комплементарные последовательности, а также подробно указанную последовательность (удобно, когда это относится к подробно указанной последовательности). Конкретно, замены вырожденных кодонов могут быть получены путем создания последовательностей, в которых третье положение в одном или более выбранных (или всех) кодонов содержит замены на остатки смешанных оснований и/или дезоксиинозина (Ва1/ег е! а1., ШсЮс АсИ Ке8., 19:5081 (1991); ОЬ!кика е! а1., 1. ΒίοΙ. СЬет., 260:2605-2608 (1985); Κοκκοΐίηί е! а1., Мо1. Се11. РгоЬек, 8:91-98 (1994)). Термин нуклеиновая кислота используется взаимозаменяемо с терминами ген, кДНК, мРНК, олигонуклеотид и полинуклеотид.
Аминокислоты здесь могут быть обозначены либо в соответствии с их общеизвестными трехбуквенными символами, либо в соответствии с однобуквенными символами, рекомендованными Комиссией по биохимической номенклатуре Международного союза по теоретической и прикладной химии/Международного биохимического союза (ШРАС-ШВ). Аналогично, нуклеотиды могут быть обозначены в соответствии с их общепринятыми однобуквенными кодами.
Под термином последовательность белка Κν3616ε, как он использован здесь, понимается полипептидная последовательность, приведенная в §ЕЦ ГО N0: 1, или её гомолог из вида МусоЬас!егшт туберкулезного комплекса, например такого вида, как М.!иЬегси1о515, ΜΕονίκ или М.айтсапит, или вида МусоЬас!егшт, который присутствует в окружающей среде или является условно-патогенным и который вызывает оппортунистические инфекции, такие как легочные инфекции, у хозяев с ослабленным иммунитетом (например, у пациентов со СПИДом), например, БЦЖ, М.аушт, М.т!гасе11и1аге, М.се1а!ит, М.депауепке, М.ЬаеторЬйит, М.капкакп, М.к1т1ае, М.уассае, М.ГойиЬит и М.ксгоГи1асеит (см., например, Наткоп'к Ргшщркк оГ 1п!егпа1 МеФсше, СЬар!ег 150, р. 953-966 (16-е изд., ВгаииетаМ, е! а1., ебк., 2005).
Для обеспечения высокого показателя эффективности среди вакцинируемых реципиентов, компоненты вакцины должны быть высоко консервативными среди штаммов клинической значимости. Удобно, когда белок Ру3616с происходит из Η37Κν М.!иЬегси1о515 (т.е. полипептидной последовательности, приведенной в §ЕЦ ГО N0: 1) или является его гомологом из другого штамма М.!иЬегси1о515 (такого как штаммы СЭС1551, Р11, Нааг1ет А и С). Штаммы М.!иЬегси1о515, которые ассоциированы с лекарственной устойчивостью (например, МОК или особенно ХЭК), представляют собой особенно важную основу для последовательности белка Ву3616с. Представляющие интерес штаммы включают:
СЭС1551 - трансмиссивный и вирулентный штамм;
семейство Нааг1ет (как, например, Нааг1ет А) - штаммы с лекарственной устойчивостью, обнаруженные в местах проживания большого количества людей. Члены семейства Нааг1ет из штаммов М.!иЬегси1о515 обнаружены во многих частях мира. Первый представитель данного семейства был открыт в Харлеме (Нааг1ет, ТЬе №1Ьег1ап6к);
ΚΖΝ4207 - чувствительный к лекарственным средствам изолят, полученный от пациентов КвазулуНатал (Южная Африка);
ΚΖΝ1435 - мультирезистентный (МОК) изолят, полученный от пациентов Квазулу-Натал (Южная Африка);
ΚΖΝ605 - изолят с широкой лекарственной устойчивостью (ХЭК), полученной от пациентов Квазулу-Натал (Южная Африка);
С - широко распространенный в Нью-Йорке. В одном исследовании было обнаружено, что этот штамм наиболее часто встречается среди принимающих инъекционные преператы, и что он устойчив к химически активным промежуточным соединениям азота (Рпебшап е! а1. 1. 1пГес!. Όίκ. 1997, 176(2):478- 9 024826
84);
94_М4241А - выделенный в Сан-Франциско в 1994 г. от пациента, рожденного в Китае. Этот штамм ранее был изучен с использованием делеционного анализа генома (Оадпеих е! а1., ΡΝΑδ, 2006, 103(8):2869-2873);
02_1987 - выделенный в Сан-Франциско в 2002 г. от пациента, рожденного в Южной Корее. Этот штамм ранее был изучен с использованием анализа делеционного анализа генома (Садиеих е! а1., ΡΝΑδ, 2006, 103(8):2869-2873);
Т92 - выделенный в Сан-Франциско в 1999 г. от пациента, рожденного на Филиппинах. Данные об этом штамме опубликованы в НЫкЬ е! а1. ΡΝΑδ, 2004, 101:4871-4876;
Т85 - выделенный в Сан-Франциско в 1998 г. от пациента, рожденного в Китае. Данные об этом штамме опубликованы в НЫкЬ е! а1. ΡΝΑδ, 2004, 101:4871-4876;
ΕΑδ054 - выделенный в Сан-Франциско в 1993 г. от пациента, рожденного в Индии. Этот штамм ранее был изучен с использованием делеционного анализа генома (Садиеих е! а1., ΡΝΑδ, 2006, 103(8):2869-2873).
Садиеих е! а1., ΡΝΑδ, 2006, 103(8):2869-2873 и НегЬей е! а1. 1п1ес!. 1ттип., 2007, 75(12):5798-5805 обеспечивают полезные знания в отношении группы известных существующих штаммов М.!иЬегси1о515.
Наиболее удобно, когда белок Ку3616с выбран из полипептидных последовательностей, приведенных в δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1 и 3-7, в частности δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1 и 3-6, например δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1.
Представляющими особый интерес полинуклеотидами являются полинуклеотиды, содержащие последовательность, кодирующую (как, например, состоящие из последовательности, кодирующей):
(1) последовательность белка Ку3616с;
(2) вариант последовательности белка Ку3616с или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ку3616с.
Полинуклеотиды соответствующим образом будут содержать (например, состоять из) вариант(а) δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 2 или фрагмент(а) δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 2, который кодирует иммуногенный фрагмент белка Ку3616с.
Комбинации.
Ку3616с-родственные полипептиды по настоящему изобретению могут дополнительно содержать другие компоненты, сконструированные для усиления их иммуногенности или для улучшения этих антигенов в других отношениях. Например, улучшенному выделению полипептидных антигенов может способствовать добавление последовательности из остатков гистидина (широко известный как Ык-метка) к одному концу антигена.
Термин Ык-метка относится к последовательности из остатков гистидина, в типичном случае из шести остатков, которые встроены в эталонную последовательность. Чтобы свести к минимуму нарушение активности, связанной с эталонной последовательностью, Ык-метку обычно встраивают на Ν-конце, обычно сразу же после инициирующего остатка метионина, или же на С-конце. Они обычно являются гетерологичными в отношении нативной последовательности, но их вводят, поскольку они облегчают выделение путем улучшения связывания белка со смолами для аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом (IМΑС). Вообще, наличие или отсутствие Ык-метки не существенно с точки зрения индукции желаемого иммунного ответа против эталонного белка. Однако, чтобы избежать риска неблагоприятной реакции против самой Ык-метки, считается, что лучше всего свести к минимуму длину Ыкметки, например до четырех или менее чем четырех остатков, в частности, до двух остатков (или полностью исключить применение Ык-метки).
Для того чтобы улучшить величину и/или широту охвата вызываемого иммунного ответа, композиции, полипептиды и нуклеиновые кислоты по изобретению могут содержать многочисленные копии антигена по изобретению и/или дополнительных гетерологичных полипептидов (или полинуклеотидов, кодирующих их) из вида МусоЬас!егшт (в частности, М.!иЬегси1ок1к).
Специалисту в данной области техники будет понятно, что если в комбинации используют несколько компонентов, то точная форма представления может быть различной. Например, компонент Ку3616с и дополнительная копия антигена по изобретению или дополнительный гетерологичный антигенный компонент могут быть представлены в виде:
(1) двух индивидуальных полипептидных компонентов;
(2) слитого белка, содержащего оба полипептидных компонента;
(3) одного полипептидного и одного полинуклеотидного компонента;
(4) двух индивидуальных полинуклеотидных компонентов;
(5) единого полинуклеотида, кодирующего два отдельных полипептидных компонента; или (6) единого полинуклеотида, кодирующего слитый белок, содержащий оба полипептидных компонента.
Такая гибкость применима в равной мере к ситуациям, когда в комбинации используют три или более чем три компонента. Однако для удобства часто желательно, чтобы в случае, если присутствует несколько компонентов, они содержались в едином слитом белке или полинуклеотиде, кодирующем единый слитый белок. В одном воплощении изобретения все антигенные компоненты предложены в виде
- 10 024826 полипептидов (например, в едином слитом белке). В альтернативном воплощении изобретения все антигенные компоненты предложены в виде полинуклеотидов (например, единого полинуклеотида, например, полинуклеотида, кодирующего единый слитый белок).
Термин гетерологичный, когда он используется в отношении участков нуклеиновой кислоты, означает, что нуклеиновая кислота содержит две или более чем две подпоследовательности, которые не обнаруживаются в таком же взаимном расположении относительно друг друга в природе. Например, нуклеиновую кислоту обычно получают с помощью технологии рекомбинантных нуклеиновых кислот, таким образом, что она имеет две или более последовательностей из неродственных генов, расположенных так, чтобы создать новую функциональную нуклеиновую кислоту, например, промотор из одного источника, а кодирующая область из другого источника. Аналогично, термин гетерологичный белок означает, что белок содержит две или более чем две подпоследовательности, которые не обнаруживаются в таком же взаимном расположении относительно друг друга в природе (например, слитый белок).
Термин слитый полипептид или слитый белок относится к белку, имеющему по меньшей мере два гетерологичных полипептида (например, по меньшей мере два полипептида из МусоЪас!егшт зр.), связанных ковалентно либо непосредственно, либо через аминокислотный линкер. Полипептиды, образующие слитый белок, обычно связаны С-концом к Ν-концу, хотя они также могут быть связаны Сконцом к С-концу, Ν-концом к Ν-концу или Ν-концом к С-концу. Полипептиды слитого белка могут располагаться в любом порядке. Этот термин также относится к консервативно модифицированным вариантам, полиморфным вариантам, аллелям, мутантам, иммуногенным фрагментам и межвидовым гомологам антигенов, из которых составлен слитый белок. Антигены МусоЪас!егшт !иЪегси1оз1з описаны в Со1е е! а1., №Циге. 393:537 (1998), в которой полностью раскрыт геном МусоЪас!егшт 1нЪегсн1оз13. Антигены из другого вида МусоЪас!егшт, соответствующие антигенам М.!иЪегси1оз1з, можно идентифицировать, например используя алгоритмы сравнения последовательностей, как изложено здесь, или другие методы, известные специалистам в данной области техники, например, гибридизационные анализы и анализы связывания антител.
Термин слитый относится к ковалентной связи между двумя полипептидами в слитом белке. Обычно полипептиды соединены посредством пептидной связи либо непосредственно друг с другом, либо через аминокислотный линкер. Возможно, пептиды могут быть соединены посредством непептидных ковалентных связей, известных специалистам в данной области.
Типичные антигены МДиЪегси1оз1з, которые можно комбинировать с Ку3616с, включают один или более чем один (например, 1-5, как, например, 1-3, в частности 1) антиген из следующих (например, один или более чем один из (1)-(12)):
(1) М(Ъ8.4 (также известный как ИРУ и Ку1174с), полипептидная последовательность которого описана в 8ЕЦ ГО N0: 102 в \У0 97/09428 (кДНК в 8ЕЦ ГО N0: 101) и в Со1ег е! а1., 1оигиа1 оТ 1ттипо1оду, 1998, 161:2356-2364. Особый интерес представляет последовательность зрелого М!Ъ8.4, у которого отсутствует лидерный сигнальный пептид (т.е. аминокислотные остатки 15-96 из 8ЕЦ ГО N0: 102 в \УО 97/09428). Полноразмерная полипептидная последовательность М!Ъ8.4 показана в 8ЕЦ ГО N0: 8;
(2) М!Ъ9.8 (также известный как М8Ь и Κν0287), полипептидная последовательность которого описана в 8ЕЦ ГО N0: 109 в \\'0 98/53075 (фрагменты М8Ь описаны в 8ЕЦ ГО N0: 110-124 в \\'0 98/53075, причём 8ЕЦ ГО N0: 119 и 120 представляют особый интерес) и также в Со1ег е! а1., Уассше, 2009, 27:223233 (в частности, активные фрагменты показаны здесь на фиг. 2). Полноразмерная полипептидная последовательность М!Ъ9.8 показана в 8ЕЦ ГО N0: 9;
(3) М!Ъ9.9 (также известный как М!Ъ9.9А, МТ1, МТ1-А и Κν1793), полипептидная последовательность которого описана в 8ЕЦ ГО N0: 19 в \У0 98/53075 и в ЛИегзоп е! а1., 1онгпа1 оТ Ехрептейа1 МеФсте, 2000, 7:551-559 (фрагменты МТ1 описаны в 8ЕЦ ГО N0: 17 и 51-66 в \У0 98/53075, причём 8ЕЦ ГО N0: 17, 51, 52, 53, 56 и 62-65 представляют особый интерес). Несколько полипептидных вариантов МТ1 описаны в 8ЕЦ ГО N0: 21, 23, 25, 27, 29 и 31 в \У0 98/53075 и в ЛИегзоп е! а1., 1оигпа1 оТ Ехрептеп!а1 Мебюте, 2000, 7:551-559. Полноразмерная полипептидная последовательность М!Ъ9.9 показана в 8ЕЦ ГО N0: 10;
(4) Ка12 (также известный как С-концевой антиген М!Ъ32А), полипептидная последовательность которого описана в 8ЕЦ ГО N0: 10 в \У0 01/98460 и в 8ке1ку е! а1., 1онгпа1 оТ 1ттипо1оду, 2004, 172:7618-7682. Полноразмерная полипептидная последовательность Ка12 показана в 8ЕЦ ГО N0: 11;
(5) Ка35 (также известный как ^концевой антиген М!Ъ32А), полипептидная последовательность которого описана в 8ЕЦ ГО N0: 8 в \У0 01/98460 и в 8ке1ку е! а1., 1оигпа1 оТ 1ттипо1оду, 2004, 172: 76187682. Полноразмерная полипептидная последовательность Ка35 показана в 8ЕЦ ГО N0: 12;
(6) ТЪН9 (также известный как М!Ъ39, М!Ъ39А, ТЪН9РЬ и Κν1196), полипептидная последовательность которого описана в 8ЕЦ ГО N0: 107 в \У0 97/09428, а также в ИШоп е! а1., 1п1ес1юп апб 1ттипЪу, 1999, 67(6): 2941-2950 и 8ке1ку е! а1., 1оигиа1 оТ 1ттипо1оду, 2004, 172: 7618-7682. Полноразмерная (РЬ) полипептидная последовательность ТЪН9 показана в 8ЕЦ ГО N0: 13;
(7) М!Ъ41 (также известный как МТСС2 и Ку0915с), полипептидная последовательность которого описана в 8ЕЦ ГО N0: 142 в \У0 98/53075 (кДНК в 8ЕЦ ГО N0: 140) и в 8ке1ку е! а1., 1оигпа1 оТ 1ттипо1оду, 2000, 165:7140-7149. Полноразмерная полипептидная последовательность М!Ъ41 показана в
- 11 024826 δΕί) ΙΌ N0: 14;
(8) ΕδΆΤ-6 (также известный как С5.\Л и Κν3875), полипептидная последовательность которого описана в δΕΟ ΙΌ N0: 103 в \У0 97/09428 (кДНК в δΕΟ ΙΌ N0: 104) и в δοτβηδβη е! а1., Шесбоп апб 1ттипбу, 1995, 63(5):1710-1717. Полноразмерная полипептидная последовательность ΕδΑΤ-6 показана в δΕί) ΙΌ N0: 15;
(9) антигены комплекса Α§85 (например, Α§85Α, также известного как 1ЬрА и Ку3804с; или Α§85Β, также известного как 1ЬрВ и К\'1886с). обсуждение которых приведено, например, в СоШеШ е! а1., Шесбоп апб 1ттипбу, 1991, 59:3205-3212 и в Ниудеп е! а1., №Пиге Мебюше, 1996, 2(8):893-898. Полноразмерная полипептидная последовательность для Αд85Α показана в δΕΟ ΙΌ N0: 16 (зрелый белок с остатками 43-338, т.е. не имеющий сигнального пептида, представляющий особый интерес). Полноразмерная полипептидная последовательность для Αд85Β показана в δΕΟ ΙΌ N0: 17 (зрелый белок с остатками 41-325, т.е. не имеющий сигнального пептида, представляющий особый интерес);
(10) альфа-кристаллин (также известный как Н8рХ (белок теплового шока X) и Ку2031с), который описан в УегЬоп е! а1., 1оигпа1 οί Вас!епо1оду, 1992, 174:1352-1359 и Рб8ша е! а1., Сбшса1 апб Ε\ребтеηίа1 Iттиηο1οду, 1995, 102:53-57 (представляющими особый интерес являются фрагменты, соответствующие остаткам 71-91, 21-40, 91-110 и 111-130). Полноразмерная полипептидная последовательность альфакристаллина показана в δΕΟ ΙΌ N0: 18;
(11) Мр!64 (также известный как Къ1980с), который описан в Косбе е! а1., δсапб^ηаν^аη 1оигпа1 οί Iттиηο1οду, 1996, 43:662-670. Полноразмерная полипептидная последовательность МРТ64 показана в δΕΟ ΙΌ N0: 19 (зрелый белок с остатками 24-228, т.е. не имеющий сигнального пептида, представляющий особый интерес);
(12) М!Ь32А, полипептидная последовательность которого описана в δΕΟ ΙΌ N0: 2 (полноразмерная), а остатки 8-330 в δΕΟ ΙΌ N0: 4 (зрелая форма) в \У0 01/98460, особенно варианты, имеющие мутацию по меньшей мере в одной каталитической триаде (например, каталитический остаток серина, который может быть, например мутирован в аланин). Полноразмерная полипептидная последовательность для М!Ь32А показана в δΕΟ ΙΌ N0: 20. Зрелая форма М!Ь32Α имеющая мутацию δе^/Α1а показана в δΕί) ΙΌ N0: 21;
(13) ТВ10.4, полноразмерная полипептидная последовательность для ТВ10.4 показана в δΕί) ΙΌ N0: 22;
(14) Кь1753с, полноразмерная полипептидная последовательность для Ку1753с из МусоЬас!егшт !иЬегси1о818 Η37Κν показана в δΕΟ ΙΌ N0: 157;
(15) Ку2386с, полноразмерная полипептидная последовательность Ку2386с из МусоЬас!егшт !иЬегси1о818 Η37Κν показана в δΕΟ ΙΌ N0: 158; и/или (16) Κν2707ο, полноразмерная полипептидная последовательность Ку2707с из МусоЬас!егшт !иЬегси1о818 Η37Κν показана в δΕΟ ΙΌ N0: 159;
или их комбинаций, таких как (например, таких комбинаций, как (а)-(ж)):
(а) комбинация компонентов Ка12, ТЬН9 и Ка35, например, в форме слитого белка, такого как М(Ь72Г. Полипептидная последовательность М!Ь72ί описана в δΕΟ ΙΌ N0: 6 в \У0 2006/117240 (кДНК в δΕΟ ΙΌ N0: 5) и в δке^ку е! а1., 1оигпа1 оГ Iттиηο1οду, 2004, 172:7618-7682 (где она включает возможную Н18-метку для облегчения очистки; при использовании в настоящем изобретении М!Ь72Г подходящим образом не содержит дополнительных остатков гистидина). Полипептидная последовательность для М!Ь72Г показана в δΕΟ ΙΌ N0: 23;
(б) комбинация компонентов Ка12, ТЬН9 и Ка35 с мутацией δе^/Α1а (т.е. где каталитический остаток серина заменен на аланин), например, в форме слитого белка, такого как М72. Полипептидная последовательность М72 описана в δΕΟ ΙΌ N0: 4 в \У0 2006/117240 (кДНК в δΕΟ ΙΌ N0: 3), где она возможно включает два рядом расположенных гистидина для облегчения получения; при использовании в настоящем изобретении М72 также может включать два рядом расположенных гистидина, хотя подходящим образом М72 может не содержать двух рядом расположенных гистидинов (т.е. остатки 4-725 в δΕΟ ΙΌ N0: 4 в \У0 2006/117240 представляют особый интерес). Полипептидная последовательность М72 показана в δΕΟ ΙΌ N0: 24;
(в) комбинация компонентов М!Ь8.4, М!Ь9.8, М!Ь9.9 и М!Ь41, например, в форме слитого белка, такого как М!Ь71Г. Полипептидная последовательность М!Ь71Г описана в δΕΟ ΙΌ N0: 16 в \У0 99/051748 (кДНК в δΕΟ ΙΌ N0: 15), где она включает возможную Н18-метку для облегчения очистки; при использовании в настоящем изобретении М!Ь71Г подходящим образом соответствует аминокислотным остаткам 9-710 в δΕΟ ΙΌ N0: 16 из ^099/051748. Полипептидная последовательность для М!Ь71Г показана в δΕί) ΙΌ N0: 25;
(г) комбинация М!Ь72Г или М72 (подходящим образом без дополнительных остатков гистидина для облегчения экспрессии) с М!Ь9.8 и М!Ь9.9, например, в слитом белке. Полипептидная последовательность для слитой конструкции М72-М!Ь9.9-М!Ь9.8 показана в δΕΟ ΙΌ N0: 26 (слитая конструкция М92); при использовании в настоящем изобретении слитая конструкция М72-М!Ь9.9-М!Ь9.8 может дополнительно включать два рядом расположенных гистидина после инициирующего остатка метионина для облегчения получения;
- 12 024826 (д) комбинация М(Ь72Г или М72 (подходящим образом без дополнительных остатков гистидина для облегчения экспрессии) с Л§85В, например, в слитом белке, таком как М1Ь103Г. Полипептидная последовательность М!Ь103Г описана в 8ЕЦ ГО N0: 18 в АО 03/070187 (кДНК в 8Е0 ГО N0: 10), где она включает возможную Ηίδ-метку для облегчения очистки; при использовании в настоящем изобретении М1Ы03Г подходящим образом соответствует аминокислотным остаткам 8-1016 в 8Е0 ГО N0: 18 из А003/070187. Также особый интерес представляет М103, т.е. М1Ы03Г. включающий мутацию 8ег/А1а в компоненте Ка35; при использовании в настоящем изобретении М103 подходящим образом соответствует аминокислотным остаткам 8-1016 в 8Е0 ГО N0: 18 из А003/070187, где остаток 8ег в положении 710 заменен на А1а. Полипептидная последовательность М103 показана в 8Е0 ГО N0: 27, при использовании в настоящем изобретении слитая конструкция М72-М!Ь9.9-М!Ь9.8 может дополнительно включать два рядом расположенных гистидина после инициирующего остатка метионина для облегчения получения;
(е) комбинация М(Ь72Г или М72 (подходящим образом без возможных остатков гистидина для облегчения экспрессии) с М!Ь41, например, в слитом белке, таком как М(Ь114Г. Полипептидная последовательность М(Ь114Г описана в 8Е0 ГО N0: 16 в А0 03/070187 (кДНК в 8Е0 ГО N0: 9), где она включает возможную Ηίδ-метку для облегчения очистки; при использовании в настоящем изобретении М(Ь114Г подходящим образом соответствует аминокислотным остаткам 8-1154 в 8Е0 ГО N0: 16 из А003/070187. Также особый интерес представляет М114, т.е. М1Ь114Г, включающий мутацию 8ег/А1а в компоненте Ка35; при использовании в настоящем изобретении М114 подходящим образом соответствует аминокислотным остаткам 8-1154 в 8Е0 ГО N0: 16 из А0 03/070187, где остаток 8ег в положении 710 заменен на А1а. Полипептидная последовательность М114 показана в 8Е0 ГО N0: 28, при использовании в настоящем изобретении слитая конструкция М72-М!Ь9.9-М!Ь9.8 возможно может включать два рядом расположенных гистидина после инициирующего остатка метионина для облегчения получения;
(ж) комбинация компонентов Ад85В и Е8АТ-6, как, например, в слитой конструкции, описанной в ОоНеПу е! а1., 1оигиа1 оГ 1иГес1юи8 П18еа8е8, 2004, 190:2146-2153; и/или (з) комбинация компонентов Ад85В и ТВ10.4, как, например, в слитой конструкции, описанной в 01е1пск е! а1., 1оигиа1 оГ 1ттипо1оду, 2005, 174(10):6332-6339, 190:2146-2153.
Комбинации компонента Ку3616с и компонента Ку1753с представляют особый интерес. Очевидно, такие комбинации возможно могут содержать другие дополнительные антигенные компоненты (например, компонент М72).
Другая представляющая интерес комбинация содержит компонент Ку3616с и компонент М72.
Следующая представляющая интерес комбинация содержит компонент Ку3616с и компонент Ку2386с.
Другие представляющие интерес комбинации включают комбинации, содержащие компонент Ку3616с и компонент Ку2707с.
Дополнительная представляющая интерес комбинация содержит компонент Ку3616с и компонент альфа-кристаллин.
Специалисту будет понятно, что комбинации не обязательно должны основываться на специфических последовательностях, описанных выше в (1)-(16) и (а)-(з), и что для получения такого же практического эффекта можно использовать консервативно модифицированные варианты (например, с идентичностью по меньшей мере 70%, как, например, с идентичностью по меньшей мере 80%, в частности, с идентичностью по меньшей мере 90% и особенно с идентичностью по меньшей мере 95%) или иммуногенные фрагменты (например, по меньшей мере 20% полноразмерного антигена, как, например, по меньшей мере 50% антигена, в частности, по меньшей мере 70% и особенно по меньшей мере 80%) описанных последовательностей.
Каждая из вышеупомянутых индивидуальных антигенных последовательностей также раскрыта в Со1е е! а1. №!иге, 1998, 393:537-544 и Сатик, МюгоЬю1оду, 2002, 148:2967-2973. Геном Η37Κν М.1иЬегси1о818 находится в открытом доступе, например на веб-сайте Ае1соте Тгик! 8апдег 1пкй!и!е (\у\у\у.$апдег.ас.ик/Рго|ес15/М_1иЬегси1о515/) и в других местах.
Многие из упомянутых выше антигенов также раскрыты в заявках на патент США № 08/523435, 08/523436, 08/658800, 08/659683, 08/818111, 08/818112, 08/942341, 08/942578, 08/858998, 08/859381, 09/056556, 09/072596, 09/072967, 09/073009, 09/073010, 09/223040, 09/287849 и в патентных заявках РСТ РСТ/И898/10407, РСТ/и898/10514, РСТ/И899/03265, РСТ/и899/03268, РСТ/и899/07717, А0 97/09428 и А0 97/09429, А0 98/16645, А0 98/16646, каждая из которых здесь включена посредством ссылки.
Композиции, полипептиды и нуклеиновые кислоты по изобретению также могут содержать дополнительные полипептиды из других источников. Например, композиции и слитые белки по изобретению могут включать полипептиды или нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, где данный полипептид усиливает экспрессию антигена, например, N81 белка вируса гриппа, (см., например, А0 99/40188 и А0 93/04175). Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть сконструированы на основе предпочтения кодонов у выбранного вида, например, у человека (в случае экспрессии ш νί\Ό) или у конкретной бактерии (в случае продуцирования полипептидов).
Компонент Ву3616с также может быть введен с одним или более чем одним химиотерапевтическим агентом, эффективным против туберкулеза (например, инфекции, вызываемой М.!иЬегси1ок1к). Примеры
- 13 024826 таких химиотерапевтических агентов включают, но не ограничиваются этим, амикацин, аминосалициловую кислоту, капреомицин, циклосерин, этамбутол, этионамид, изониазид, канамицин, пиразинамид, рифамицины (т.е. рифампин, рифапентин и рифабутин), стрептомицин, офлоксацин, ципрофлоксацин, кларитромицин, азитромицин и фторхинолоны. Такая химиотерапия определяется решением лечащего врача, использующего предпочтительные комбинации лекарственных средств. Химиотерапевтические агенты первой линии, используемые для лечения туберкулеза (например, инфекции, вызываемой М.1иЪегси1о818), не обладающего лекарственной устойчивостью, включают изониазид, рифампин, этамбутол, стрептомицин и пиразинамид. Химиотерапевтические агенты второй линии, используемые для лечения туберкулеза (например, инфекции, вызываемой М1иЪетси1о818), демонстрирующего лекарственную устойчивость к одному или более чем одному лекарственному средству первой линии, включают офлоксацин, ципрофлоксацин, этионамид, аминосалициловую кислоту, циклосерин, амикацин, канамицин и капреомицин.
Традиционные химиотерапевтические агенты обычно вводят в течение относительно длительного периода времени (приблизительно 9 месяцев). Сочетание применения традиционных химиотерапевтических агентов с введением компонента Ку3616с по настоящему изобретению может способствовать уменьшению продолжительности химиотерапевтического лечения (например, до 8, 7, 6, 5, 4, 3 месяцев или меньше) без уменьшения эффективности.
Особый интерес представляет применение компонента Ку3616с вместе с бациллой КальметтаГерена (БЦЖ). Например, в форме модифицированной БЦЖ, которая рекомбинантно экспрессирует Ку3616с (или его вариант или фрагмент, как изложено здесь). Альтернативно, компонент Ку3616с может быть использован для усиления ответа субъекта на вакцинацию БЦЖ либо путём совместного введения, либо путём повторной иммунизации после предыдущей вакцинации БЦЖ. Очевидно, что компонент Ку3616с, когда его используют для усиления ответа субъекта на вакцинацию БЦЖ, может быть представлен в форме полипептида или полинуклеотида (возможно вместе с дополнительными антигенными компонентами, как описано выше).
Специалисту будет понятно, что комбинации компонентов не обязательно вводят совместно и что они могут быть применены: по отдельности или в комбинации; одновременно, последовательно или в пределах короткого периода времени; и введены одинаковыми или разными путями. Тем не менее, для удобства обычно желательно (там где режимы введения совместимы) вводить комбинацию компонентов в виде единой композиции.
Полипептиды, полинуклеотиды и композиции по настоящему изобретению в общем случае будут введены людям, но они эффективны и для других млекопитающих, включая домашних животных (например, собак, кошек, кроликов, крыс, мышей, морских свинок, хомячков, шиншилл) и сельскохозяйственных млекопитающих (например, коров, свиней, овец, коз, лошадей).
Иммуногенныу фрагменты.
Т-клеточные эпитопы представляют собой короткие непрерывные отрезки из аминокислот, которые распознаются Т-клетками (например, СЭ4' или СЭ8' Т-клетками). Идентификация Т-клеточных эпитопов может быть достигнута с помощью экспериментов по эпитопному картированию, которые хорошо известны специалисту в данной области техники (см., например, Раи1, Рнп6атеп1а1 1ттнпо1оду. 3-е изд., 243-247 (1993); ВеФагФ е1 а1., Вюш(огтайс8, 2005, 21(§ирр1. 1):ί29-ί37).
Альтернативно, эпитопы можно предсказать, используя подходы, обсуждаемые в разделе Примеры.
Исходя из решающего значения Т-клеточного ответа при туберкулезе очевидно, что фрагменты полноразмерного полипептида Ку3616с, содержащие по меньшей мере один Т-клеточный эпитоп, будут иммуногенными и могут вносить вклад в иммунологическую защиту. Такие фрагменты называются здесь иммуногенными фрагментами.
Иммуногенные фрагменты по настоящему изобретению обычно будут содержать по меньшей мере 9 следующих друг за другом аминокислот из полноразмерной полипептидной последовательности (например, по меньшей мере 10), как, например, по меньшей мере 12 следующих друг за другом аминокислот (например, по меньшей мере 15 или по меньшей мере 20 следующих друг за другом аминокислот), в частности, по меньшей мере 50 следующих друг за другом аминокислот, как, например, по меньшей мере 100 следующих друг за другом аминокислот (например, по меньшей мере 200 следующих друг за другом аминокислот). Соответственно, иммуногенные фрагменты будут составлять по меньшей мере 20%, например, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 70% или по меньшей мере 80% длины полноразмерной полипептидной последовательности.
Понятно, что в разнотипной аутбредной популяции, такой как люди, наличие различных типов НЬА (антигенов тканевой совместимости человека) означает, что специфические эпитопы могут не распознаваться всеми членами популяции. Следовательно, чтобы максимизировать уровень распознавания и величину иммунного ответа на полипептид, как правило, желательно, чтобы иммуногенный фрагмент содержал множество эпитопов из полноразмерной последовательности (соответствующим образом все эпитопы).
- 14 024826
Конкретные фрагменты белка Ку3616с, которые могут быть использованы, включают фрагменты, содержащие по меньшей мере один СГО4' эпитоп, соответственно по меньшей мере два СЭ4' эпитопа и в особенности все СЭ4' эпитопы (как, например, эпитопы, описанные в разделе Примеры и в §ЕЦ ГО N0: 29-47, в частности эпитопы, ассоциированные с большинством НЬЛ-аллелей, например эпитопы, ассоциированные с 2, 3, 4, 5 или более аллелями).
Другие фрагменты белка Ку3616с, которые могут быть использованы, включают фрагменты, содержащие по меньшей мере один СГО8 эпитоп, соответственно по меньшей мере два СГО8 эпитопа и в особенности все СГО8 эпитопы (как, например, эпитопы, описанные в разделе Примеры и в §ЕЦ ГО N0: 48-126, в частности эпитопы, ассоциированные с множеством НЬЛ-аллелей, например эпитопы, ассоциированные с 2, 3, 4, 5 или более аллелями).
Когда используют индивидуальный фрагмент полноразмерного полипептида, такой фрагмент считают иммуногенным, если он вызывает ответ, составляющий по меньшей мере 20%, подходящим образом по меньшей мере 50% и в особенности по меньшей мере 75% (как, например, по меньшей мере 90%) активности эталонной последовательности в анализе ίη νίΐτο рестимуляции РВМС или цельной крови специфическими антигенами (например, рестимуляции в течение периода времени от нескольких часов до двух недель, как, например, до 1 суток, от 1 суток до 1 недели или 1-2 недель), в котором измеряют активацию клеток посредством измерения лимфопролиферации, продукции цитокинов в супернатанте культуры (измеряемых с помощью ЕЬ1§А, СВА (СуЮтеОгс Ьеаб аггау) и т.д.) или определения параметров Т- и В-клеточных ответов с помощью внутри- и внеклеточного окрашивания (например, с применением антител, специфичных к иммунным маркерам, таким как СГО3. СГО4. СГО8. 1Ь2 (интерлейкин-2), ТОТа (фактор некроза опухоли-α), ΙΡΝγ (γ-интерферон), СО40Ь, СГО69 и т.д.) с последующим анализом на проточном цитометре. Соответствующим образом, фрагмент считается иммуногенным, если он вызывает ответ, составляющий по меньшей мере 20%, подходящим образом по меньшей мере 50% и в особенности по меньшей мере 75% (как, например, по меньшей мере 90%) активности эталонной последовательности в анализе Т-клеточной пролиферации и/или продукции ΙΡΝ-γ.
В некоторых случаях для получения эквивалентного биологического ответа на саму полноразмерную последовательность можно использовать множество фрагментов полноразмерного полипептида (которые могут перекрываться или не перекрываться и могут охватывать или не охватывать полноразмерную последовательность целиком). Например, по меньшей мере два иммуногенных фрагмента (например, три, четыре или пять), как описано выше, которые в комбинации обеспечивают по меньшей мере 50%, соответственно по меньшей мере 75% и в особенности по меньшей мере 90% активности эталонной последовательности в анализе ίη νίίτο рестимуляции РВМС или цельной крови (например, в анализе Т-клеточной пролиферации и/или продукции ΙΡΝ-γ).
Пептиды с 8ЕЦ ГО Ν0: 127-156 представляют собой особенно интересные фрагменты (в частности пептиды в 8ЕЦ ГО Ν0: 127-133 и 143-156).
Варианты.
Термин варианты или консервативно модифицированные варианты применяется как к аминокислотным последовательностям, так и к последовательностям нуклеиновой кислоты. Что касается конкретных последовательностей нуклеиновой кислоты, то термин консервативно модифицированные варианты относится к тем нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности, или, когда нуклеиновая кислота не кодирует какую-либо аминокислотную последовательность, по существу к идентичным последовательностям.
Вследствие вырожденности генетического кода любой заданный белок кодируется большим числом функционально идентичных нуклеиновых кислот. Например, все кодоны ССА, ССС, ССС и ОСИ кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в любом положении, где аланин задается кодоном, данный кодон может быть изменен на любой из соответствующих описанных кодонов, не вызывая изменений в кодируемом полипептиде. Такие варианты нуклеиновых кислот приводят к молчащим или вырожденным вариантам, которые являются одним из видов консервативно модифицированных вариантов. Каждая приведенная здесь последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, также описывает каждый возможный молчащий вариант нуклеиновой кислоты. Специалисту будет понятно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением АИС, который обычно представляет собой единственный кодон для метионина, и ТСС, который обычно представляет собой единственный кодон для триптофана) может быть модифицирован с получением функционально идентичной молекулы. Соответственно, каждый молчащий вариант нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, подразумевается в каждой описанной последовательности.
Полинуклеотид по изобретению может содержать несколько молчащих вариантов (например, могут быть изменены 1-50, как, например, 1-25, в частности 1-5 кодонов и в особенности 1 кодон) по сравнению с эталонной последовательностью. Полинуклеотид по изобретению может содержать несколько не являющихся молчащими консервативных вариантов (например, могут быть изменены 1-50, как, например, 1-25, в частности 1-5 кодонов и в особенности 1 кодон) по сравнению с эталонной последовательностью. Не молчащими вариантами являются такие, которые вызывают изменение в кодируемой амино- 15 024826 кислотной последовательности (либо путём замены, либо делеции, либо вставки аминокислотных остатков). Специалистам в данной области будет понятно, что конкретная полинуклеотидная последовательность может содержать как молчащие, так и не молчащие консервативные варианты.
Что касается вариантов белковой последовательности, то специалисту будет понятно, что индивидуальные замены, делеции или вставки в полипептиде, приводящие к изменению, добавлению или делеции одной аминокислоты или небольшого процента аминокислот, представляют собой консервативно модифицированный вариант, когда данное изменение(я) приводит к замене аминокислоты функционально аналогичной аминокислотой или к замене/делеции/вставке остатков, которые, по существу, не затрагивают биологической функции данного варианта.
Таблицы консервативных замен, обеспечивающих функционально аналогичные аминокислоты, хорошо известны в данной области. Такие консервативно модифицированные варианты присутствуют в дополнение к полиморфным вариантам, межвидовым гомологам и аллелям по изобретению и не исключают их.
Полипептид по изобретению может содержать ряд консервативных замен (например, могут быть изменены 1-50, как, например, 1-25, в частности 1-10 аминокислотных остатков и в особенности 1 аминокислотный остаток) по сравнению с эталонной последовательностью. В общем случае такие консервативные замены будут попадать в пределы одной из групп аминокислот, определенных ниже, хотя в некоторых случаях могут быть возможны и другие замены без существенного воздействия на иммуногенные свойства антигена. Каждая из следующих ниже восьми групп содержит аминокислоты, которые являются типично консервативными заменами друг для друга:
1) аланин (А), глицин (О);
2) аспарагиновая кислота (Ό), глутаминовая кислота (Е);
3) аспарагин (Ν), глутамин (О);
4) аргинин (Κ), лизин (К);
5) изолейцин (I), лейцин (Ь), метионин (М), валин (V);
6) фенилаланин (Ρ), тирозин (Υ), триптофан (^);
7) серин (8), треонин (Т);
8) цистеин (С), метионин (М) (см., например, СгефШоп, ΡιπΙοι^, 1984).
Соответственно, такие замены не присутствуют в участке эпитопа и поэтому не оказывают существенного воздействия на иммуногенные свойства антигена.
Варианты белков также могут включать такие варианты, где дополнительные аминокислоты вставлены по сравнению с эталонной последовательностью, например, такие вставки могут присутствовать в 1-10 местах локализации (как, например, 1-5 местах локализации, подходящим образом в 1 или 2 местах локализации, в частности в 1 месте локализации) и могут, например, включать добавление 50 или меньшего количества аминокислот в каждом месте локализации (как, например, 20 или меньше, в частности 10 или меньше, в особенности 5 или меньше). Соответственно, такие вставки не присутствуют в участке эпитопа и поэтому не оказывают существенного воздействия на иммуногенные свойства антигена. Один из примеров вставок включает короткий участок остатков гистидина (например, 2-6 остатков) для облегчения экспрессии и/или очистки рассматриваемого антигена.
Варианты белков включают такие варианты, где аминокислоты делетированы по сравнению с эталонной последовательностью, например, такие делеции могут присутствовать в 1-10 местах локализации (как, например, в 1-5 местах локализации, удобно, если в 1 или 2 местах локализации, в частности в 1 месте локализации) и могут, например, включать делецию из 50 или меньшего количества аминокислот в каждом месте локализации (как, например, 20 или меньше, в частности 10 или меньше, в особенности 5 или меньше). Соответственно, такие делеции не присутствуют в участке эпитопа и поэтому не оказывают существенного воздействия на иммуногенные свойства антигена.
Специалисту будет понятно, что конкретный варианты белка может содержать замены, делеции и вставки (или любую их комбинацию).
Способы определения эпитопных участков антигена описаны и проиллюстрированы в разделе Примеры.
Варианты предпочтительно демонстрируют по меньшей мере примерно 70% идентичности, более предпочтительно по меньшей мере примерно 80% идентичности и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 90% идентичности (как, например, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 98% или по меньшей мере примерно 99%) с соответствующей эталонной последовательностью.
Термины идентичный или процент идентичности в контексте двух или более нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей относятся к двум или более чем двум последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент одинаковых аминокислотных остатков или нуклеотидов (т.е. идентичны на 70%, возможно идентичны на 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% в определенной области), при сравнении и выравнивании на максимальное соответствие в окне сравнения или внутри указанной области, что измеряется с использованием одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или посредством выравнивания вручную и
- 16 024826 визуального просмотра. О таких последовательностях далее говорится, что они по существу идентичны. Это определение также относится к комплементу тестируемой последовательности.
Возможно, идентичность существует в области, длина которой составляет по меньшей мере от примерно 25 до примерно 50 аминокислот или нуклеотидов, или возможно в области длиной 75-100 аминокислот или нуклеотидов. Подходящим образом, сравнение выполняют в окне, соответствующем полной длине эталонной последовательности.
Для сравнения последовательностей обычно одна последовательность выступает в роли эталонной последовательности, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, при необходимости указывают координаты подпоследовательностей и задают параметры программы алгоритма сравнения последовательностей. Можно использовать параметры программы по умолчанию или можно задать альтернативные параметры. Далее с использованием алгоритма сравнения последовательностей, на основании параметров программы, рассчитывают процент идентичности последовательностей для тестируемых последовательностей относительно эталонной последовательности.
Термин окно сравнения, как он используется здесь, содержит ссылку на сегмент, в котором последовательность можно сравнивать с эталонной последовательностью с тем же числом следующих один за другим положений, после того, как эти две последовательности оптимально выровнены. Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено, например, с помощью алгоритма локальной гомологии по διηίΐΐι & ^а!егтап, Α6ν. Αρρί. Ма!Ь. 2:482 (1981), с помощью алгоритма гомологичного выравнивания по №еб1етап & ХУипксН. 1. Мо1. ΒίοΙ. 48:443 (1970), с помощью поиска (вариантов) согласно методу подобия по Геа/коп & Нртап, Ггос. №Г1. Αсаб δα. υδΑ, 85:2444 (1988), с помощью компьютеризированных воплощений этих алгоритмов (ΟΑΡ, ΒΕδΤΡΙΤ, ΡΑδΤΑ и ΤΡΑδΤΑ в ХУбсопкт Оепебск δοΠ\γа^е Ρаскаде, Сепейск Сотри!ег Огоир, 575 δ^ιτ^ Όγ., Майкоп, νΙ) или с помощью выравнивания вручную и визуального просмотра (см., например, Сштеп! кго1осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду (приложение к Αι^ι^Ι е! а1., ебк. 1995)).
Одним примером полезного алгоритма является ΡΙΡΕυΡ. ΡΙΡΕυΡ формирует множественное выравнивание последовательностей из группы родственных последовательностей с использованием прогрессивного, попарного выравнивания с целью выявления взаимосвязи и процента идентичности последовательностей. Он также производит построение дерева или дендрограммы, показывающего(ей) соотношения между кластерами, используемые для выравнивания. ΡΙΡΕυΡ использует упрощение метода прогрессивного выравнивания по Рейд & ОооШИе, ί. Мо1. Ενο1., 35:351-360 (1987). Используемый метод аналогичен методу, описанному Шддшк & δΙκ-ΐΓρ, СΑΒIΟδ, 5:151-153 (1989). Данная программа может выравнивать вплоть до 300 последовательностей, каждая с максимальной длиной 5000 нуклеотидов или аминокислот. Процедура множественного выравнивания начинается с попарного выравнивания двух наиболее похожих последовательностей с образованием кластера из двух выровненных последовательностей. Затем этот кластер выравнивают со следующей наиболее родственной последовательностью или кластером выровненных последовательностей. Два кластера последовательностей выравнивают путем простого удлинения попарного выравнивания двух индивидуальных последовательностей. Окончательное выравнивание достигается в результате серии прогрессивных попарных выравниваний. Программа действует путем определения специфических последовательностей и их аминокислотных или нуклеотидных координат для сравнения участков последовательностей и путем указания программных параметров. Используя ΡΙΡΕυΡ, сравнивают эталонную последовательность с другими тестируемыми последовательностями с целью определения соотношения процента идентичности последовательностей, используя следующие параметры: вес бреши по умолчанию (3.00), вес длины бреши по умолчанию (0.10) и взвешенные концевые бреши. ΡΙΡΕυΡ можно взять из пакета программ для анализа последовательности ССС, например, версии 7.0 (^еνе^еаиx е! а1., Шс, Αс^бк Кек., 12:387-395 (1984)).
Другим примером алгоритма, который является подходящим для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, являются алгоритмы ΒΡΑδΤ и ΒΡΑδΤ 2.0, которые описаны в АксНЫ е! а1., Шс. Αс^бк Кек., 25:3389-3402 (1977) и Α!8θΗπ1 е! а1., 1. Мо1. Β^ί, 215:403-410 (1990), соответственно. Программное обеспечение для проведения анализа с использованием ΒΡΑδΤ общедоступно через Национальный центр биотехнологической информации (Шбопа1 Сеп!ег £ог Β^ο!есЬиο1οду тогта!^ (NСΒI)) (веб-сайт №№№.исЬ^.п1т.п^Ь.дον/). Этот алгоритм включает, прежде всего, идентификацию пар последовательностей с высоким баллом (ΗδΡ) посредством идентификации коротких слов длиной V в анализируемой последовательности, которые или соответствуют, или удовлетворяют некоторому положительно оцениваемому пороговому баллу Τ при выравнивании со словом той же длины в последовательности из базы данных. Τ обозначает пороговый балл для соседнего слова (ΑΙίδ^ΗυΙ е! а1., выше). Эти изначальные соседние удачные слова (Ы!к) действуют в качестве затравок для инициирования поиска вариантов с целью нахождения более длинных ΗδΡ, содержащих их. Удачные слова удлиняются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности настолько, насколько может быть увеличен кумулятивный балл выравнивания. Для нуклеотидных последовательностей кумулятивные баллы рассчитывают с использованием параметров М (балл - вознаграждение за пару соответ- 17 024826 ствующих остатков; всегда >0) и N (штрафной балл за ошибочно спаренные остатки; всегда <0). Для расчета кумулятивного балла в отношении аминокислотных последовательностей используют матрицу баллов. Удлинение удачных слов в каждом направлении останавливается, когда: кумулятивный балл выравнивания падает на величину Х от его максимально достигнутой величины; кумулятивный балл доходит до нуля или ниже вследствие аккумуляции одного или более чем одного выравнивания остатков с отрицательными баллами; или при достижении конца любой из двух последовательностей. Параметры V, Т и X алгоритма ВЬА§Т определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа ВЬА§'ГО (для нуклеотидных последовательностей) использует по умолчанию длину слова (V), равную 11; математическое ожидание (Е), равное 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей программа ВЬА§ТР использует по умолчанию длину слова, равную 3; и математическое ожидание (Е), равное 10; и выравнивания (В) по матрице баллов ВЬО§иМ62 (см. НешкоГГ & НешкоГГ, Ргос. Ν;·ιΐ1. Асаб. 8ск И8А, 89:10915 (1989)), равные 50; математическое ожидание (Е), равное 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей.
Алгоритм ВЬА§Т также осуществляет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Каг1ш & А118ски1, Ргос. №Г1. Асаб. §ск И8А, 90:5873-5787 (1993)). Одной из мер сходства, предоставляемых алгоритмом ВЬА§Т, является наименьшая суммарная вероятность ^(Ν)), которая дает указание на вероятность того, что совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями будет случайным. Например, считается, что нуклеиновая кислота аналогична эталонной последовательности, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестируемой нуклеиновой кислоты с эталонной нуклеиновой кислотой меньше чем примерно 0,2, более предпочтительно меньше чем примерно 0,01 и наиболее предпочтительно меньше чем примерно 0,001.
Настоящее изобретение также распространяется на полинуклеотиды, содержащие первую нуклеотидную последовательность, которая селективно гибридизуется в умеренно жестких условиях (как, например, в жестких условиях) с комплементом второй нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий:
(1) последовательность белка Ку3616с;
(2) вариант последовательности белка Ку3616с или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ку3616с, для лечения или предупреждения латентного ТВ.
Фраза жесткие условия гибридизации относится к условиям, при которых зонд будет гибридизоваться со своей подпоследовательностью-мишенью, обычно в сложной смеси, содержащей нуклеиновую кислоту, а ни с какими-либо другими последовательностями. Жесткие условия зависят от последовательности и в разных обстоятельствах будут различаться. Более длинные последовательности специфически гибридизуются при более высоких температурах. Исчерпывающее руководство по гибридизации нуклеиновых кислот можно найти в Ту88еп, Тескп1цие8 ш В1оскеш181гу апб Мо1еси1аг Вю1оду-НуЪпб17а1юп \\кк ШсГСс РгоЪе8, Оуегаете оГ ргтс1р1е8 оГ кук^/акоп апб 1ке 81га1еду оГ пис1ею аиб а88ау8 (1993). Как правило, жесткие условия выбирают так, чтобы температура была примерно на 510°С ниже, чем термическая точка плавления (Тт) для конкретной последовательности при определенных значениях ионной силы и рН. Тт представляет собой температуру (при определенных значениях ионной силы, рН и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зондов, комплементарных мишени, гибридизуются с последовательностью-мишенью при равновесии (поскольку последовательности-мишени присутствуют в избытке, то при Тт 50% зондов в равновесии находятся в связанном состоянии). Жесткими условиями будут такие, при которых концентрация соли ниже примерно 1,0 М для ионов натрия, в типичном случае концентрация ионов натрия (или других солей) составляет примерно 0,011,0 М при рН 7,0-8,3, а температура равна по меньшей мере примерно 30°С для коротких зондов (например, 10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере примерно 60°С для длинных зондов (например, больше 50 нуклеотидов). Жесткие условия также могут быть достигнуты путём добавления дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Для селективной или специфической гибридизации положительный сигнал по меньшей мере в два раза превышает фон, возможно в 10 раз превышает фоновую гибридизацию.
Типичные жесткие условия гибридизации могут быть следующими: 50% формамида, 5х88С (раствор хлорида и цитрата натрия) и 1% δΌδ (додецилсульфат натрия), инкубация при 42°С, или 5х§§С, 1% 8Э8, инкубация при 65°С, с промывкой в 0,2х§§С и 0,1% δΌδ при 65°С.
Нуклеиновые кислоты, которые не гибридизуются друг с другом в жестких условиях, остаются попрежнему функционально эквивалентными, если полипептиды, которые они кодируют, являются по существу идентичными. Это имеет место, например, когда копия нуклеиновой кислоты создана с использованием максимальной вырожденности кодонов, допускаемой генетическим кодом. В таких случаях нуклеиновые кислоты обычно гибридизуются в умеренно жестких условиях гибридизации.
Типичные умеренно жесткие условия гибридизации включают гибридизацию в буфере из 40% формамида, 1 М №С1, 1% 8Э8, при 37°С и промывку в 1х88С при 45°С. Положительная гибридизация превышает фон по меньшей мере в два раза. Средние специалисты легко поймут, что для обеспечения
- 18 024826 условий аналогичной жесткости могут быть использованы альтернативные условия гибридизации и промывки.
Фраза селективно (или специфически) гибридизуется с относится к связыванию, образованию дуплекса или гибридизации молекулы только с конкретной нуклеотидной последовательностью в жестких условиях гибридизации, когда данная последовательность присутствует в сложной смеси (например, суммарной клеточной или библиотечной ДНК или РНК).
Во всяком случае, варианты полипептидной последовательности будут обладать, по существу, той же активностью, что и эталонная последовательность (в случае полинуклеотидов, варианты полинуклеотидных последовательностей будут кодировать полипептид, который обладает, по существу, той же активностью, что и эталонная последовательность). Под по существу той же активностью понимают по меньшей мере 50%, подходящим образом по меньшей мере 75% и в особенности по меньшей мере 90% активности эталонной последовательности в анализе ίη νίίτο рестимуляции РВМС или цельной крови специфическими антигенами (например, рестимуляции в течение периода времени от нескольких часов вплоть до двух недель, как, например, вплоть до одних суток, от 1 суток до 1 недели или 1-2 недель), в котором измеряют активацию клеток посредством измерения лимфопролиферации, продукции цитокинов в супернатанте культуры (измеряемых с помощью ΕΟδΆ, СВА и т.д.) или определения параметров Т- и В-клеточных ответов с помощью внутри- и внеклеточного окрашивания (например, с использованием антител, специфичных к иммунным маркерам, таким как С'.Н3. С'.Н4. С'.Н8. ГО2, ТОТа, ГРИу, СИ40Ь, С.Н69 и т.д.) с последующим анализом на проточном цитометре. Соответственно, под по существу той же активностью понимают по меньшей мере 50%, соответственно по меньшей мере 75% и в особенности по меньшей мере 90% активности эталонной последовательности в анализе Т-клеточной пролиферации и/или продукции ШЫ-у.
Полинуклеотидные композиции.
Как он использован здесь, термин полинуклеотид относится к молекуле, выделенной в свободном от суммарной геномной ДНК состоянии из конкретного образца. Поэтому полинуклеотид, кодирующий полипептид, относится к сегменту полинуклеотида, который содержит одну или более чем одну кодирующую последовательность, уже, по существу, изолированному или очищенному от общей геномной ДНК видов, из которых получен данный полинуклеотид.
Как будет понятно специалистам в данной области, полинуклеотиды по данному изобретению могут включать геномные последовательности, экстрагеномные и кодируемые плазмидами последовательности и более мелкие генно-инженерные сегменты генов, которые экспрессируют, или которые могут быть адаптированы для экспрессии, белки, полипептиды, пептиды и т.п. Такие сегменты могут быть выделены из природных источников или синтетически модифицированы человеком.
Термин выделенный, как он использован здесь, означает, что полинуклеотид, по существу, свободен от других кодирующих последовательностей и что данный полинуклеотид не содержит больших порций неродственной кодирующей ДНК, таких как большие хромосомные фрагменты или другие функциональные гены, или участки, кодирующие полипептиды. Выделенная нуклеиновая кислота отделена от других открытых рамок считывания, которые фланкируют ген и кодируют белки, отличающиеся от тех, которые кодирует данный ген. Несомненно, это относится к сегменту ДНК, как он выделен изначально, и не исключает генов или кодирующих участков, позже добавленных к данному сегменту человеком.
Как будет понятно специалисту в данной области, полинуклеотиды могут быть одноцепочечными (кодирующими или антисмысловыми) или двухцепочечными и могут представлять собой молекулы ДНК (геномной, кДНК или синтетической) или РНК. Молекулы РНК включают молекулы гяРНК (гетерогенная ядерная РНК), которые содержат интроны и соответствуют молекуле ДНК по типу один-к-одному (опс-Ю-опс), и молекулы мРНК, которые не содержат интронов. Дополнительные кодирующие или некодирующие последовательности могут, но необязательно, находиться в пределах полинуклеотида по настоящему изобретению, и полинуклеотид может быть, но необязательно, соединен с другими молекулами и/или веществами-носителями.
Полинуклеотиды могут содержать нативную последовательность (т.е. эндогенную последовательность, которая кодирует антиген МусоЪас1етшт или его часть) или могут содержать вариант или биологический либо функциональный эквивалент такой последовательности. Полинуклеотидные варианты могут содержать одну или более чем одну замену, добавление, делецию и/или вставку, что также описано ниже, предпочтительно таких, чтобы иммуногенность кодируемого полипептида относительно эталонного белка не уменьшалась. Обычно влияние кодируемого полипептида на иммуногенность можно оценить, как изложено здесь.
В дополнительных воплощениях настоящего изобретения предложены выделенные полинуклеотиды и полипептиды, содержащие различные отрезки следующих один за другим участков последовательности, идентичной одной или более чем одной последовательности, раскрытой здесь, или комплементарной одной или более чем одной последовательности, раскрытой здесь. Например, согласно этому изобретению предложены полинуклеотиды, которые содержат по меньшей мере примерно 30, 40, 50, 75, 100,
- 19 024826
150, 200, 300, 400, 500 или 1000 или более следующих один за другим нуклеотидов эталонной последовательности, раскрытой здесь, а также все находящиеся между ними промежуточные отрезки. Легко понять, что промежуточные отрезки в этом контексте означают отрезки любой длины, находящейся между приведенными величинами, как, например, 30, 31, 32 и т.д.; 50, 51, 52, 53 и т.д.; 100, 101, 102, 103 и т.д.; 150, 151, 152, 153 и т.д.; в том числе все целочисленные значения в диапазонах 200-500; 500-1000 и т.п.
Более того, специалистам в данной области будет очевидно, что в результате вырожденности генетического кода существует много нуклеотидных последовательностей, которые кодируют полипептид как раскрыто здесь. Некоторые из этих полинуклеотидов имеют относительно низкую идентичность с нуклеотидной последовательностью любого нативного гена. Однако в настоящем изобретении особенно рассматриваются полинуклеотиды, которые варьируют вследствие различий при использовании кодонов, например полинуклеотиды, которые оптимизированы для отбора кодонов человека и/или приматов. Более того, аллели генов, содержащих полинуклеотидные последовательности, предложенные здесь, находятся в пределах объема настоящего изобретения. Аллели представляют собой эндогенные гены, которые изменяются в результате одной или более мутаций, таких как делеции, добавления и/или замены нуклеотидов. Полученные мРНК и белок могут, но не обязательно, иметь измененную структуру или функцию. Аллели могут быть идентифицированы с использованием стандартных методов (таких как гибридизация, амплификация и/или сравнение последовательностей из базы данных). Идентификация и характеристика полинуклеидов.
Полинуклеотиды могут быть идентифицированы, получены с использованием любого из множества общепризнанных методов и/или на них можно воздействовать с использованием множества общеспризнанных методов. Например, полинуклеотид может быть идентифицирован, как описано более подробно ниже, путём скрининга на микрочипах кДНК. Такие скрининги могут быть проведены, например, с использованием микрочипа 8уп1ет (Ра1о А11о, СА) в соответствии с инструкциями производителя (и, по существу, как описано в §сЬепа е! а1., Ргос. Ыа11. Асаб. δα. υδΑ, 93:10614-10619 (1996) и Не11ег е! а1., Ргос. Ν;·ιΐ1. Асаб. δα. υδΑ, 94:2150-2155 (1997)). Альтернативно, полинуклеотиды могут быть амплифицированы на основании кДНК, полученной из клеток, экспрессирующих белки, раскрытые здесь, таких как клетки М.!иЪегси1о818. Такие полинуклеотиды могут быть амплифицированы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для этого подхода на основании предложенных здесь последовательностей могут быть сконструированы сиквенс-специфические праймеры, и их можно приобрести или синтезировать.
Амплифицированный участок полинуклеотида может быть использован для выделения полноразмерного гена из подходящей библиотеки (например, библиотеки кДНК М.!иЪегси1о818) с использованием хорошо известных методов. В таких методах библиотеку (кДНК или геномную) подвергают скринингу, используя один или более чем один полинуклеотидный зонд или праймер, подходящих для амплификации. Предпочтительно, чтобы библиотека была отобрана по размеру для включения молекул большего размера. Библиотеки, полученные с использованием случайных праймеров также могут быть предпочтительны для идентификации 5'- и расположенных выше участков генов. Геномные библиотеки являются предпочтительными для получения интронов и протяженных 5'-последовательностей.
Что касается методов гибридизации, то частичная последовательность может быть мечена (например, посредством ник-трансляции или концевого мечения с помощью 32Р) с использованием хорошо известных методов. Затем бактериальную или бактериофаговую библиотеку обычно подвергают скринингу посредством гибридизации на фильтрах, содержащих денатурированные бактериальные колонии (или газонах, содержащих фаговые бляшки), с меченым зондом (см. δатЪ^оок е! а1., Мо1еси1аг С1отп§: А ЬаЪота!оту Мапиа1 (2000)). Гибридизующиеся колонии или бляшки отбирают и размножают, и ДНК выделяют для дальнейшего анализа. Клоны кДНК могут быть проанализированы с целью определения количества дополнительной последовательности посредством, например, ПЦР с использованием праймера из частичной последовательности и праймера из вектора. Для идентификации одного или более чем одного перекрывающегося клона могут быть созданы рестрикционные карты и частичные последовательности. Затем можно определить полную последовательность с использованием стандартных методов, которые могут вовлекать создание ряда делеционных клонов. Полученные перекрывающиеся последовательности затем могут быть собраны в единую непрерывную последовательность. Полноразмерную молекулу кДНК можно создать путём лигирования подходящих фрагментов, используя хорошо известные методы.
Альтернативно, существуют многочисленные методы амплификации для получения полноразмерной кодирующей последовательности из частичной последовательности кДНК. В таких методах амплификацию обычно осуществляют с помощью ПЦР. Для осуществления стадии амплификации можно использовать любой из множества имеющихся в продаже наборов. Праймеры можно конструировать с использованием, например, программного обеспечения, хорошо известного в данной области. Праймеры предпочтительно имеют длину 22-30 нуклеотидов, имеют содержание ОС по меньшей мере 50% и отжигаются с последовательностью-мишенью при температуре примерно 68-72°С. Амплифицированный участок может быть секвенирован, как описано выше, и перекрывающиеся последовательности собраны в
- 20 024826 непрерывную последовательность.
Одной такой методикой амплификации является инвертированная ПЦР (см. ТпдПа е! а1., Ыис1. Лс1б5 Ре5., 16:8186 (1988)), в которой используют рестриктазы для создания фрагмента в известном участке гена. Затем этот фрагмент подвергают циркуляризации посредством внутримолекулярного лигирования и используют в качестве матрицы для ПЦР с применением дивергентных праймеров, полученных исходя из последовательности известного участка. В рамках альтернативного подхода последовательности, примыкающие к неполной последовательности могут быть восстановлены путём амплификации с использованием праймера к линкерной последовательности и праймера, специфичного к известному участку. Обычно амплифицированные последовательности подвергают второму раунду амплификации с использованием того же самого линкерного праймера и второго праймера, специфичного к известному участку. Вариант этой процедуры, в котором используют два праймера, инициирующие удлинение в противоположных направлениях от известной последовательности, описан в АО 96/38591. Другая такая методика известна как быстрая амплификация концов кДНК или РАСЕ. Эта методика включает применение внутреннего праймера и внешнего праймера, который гибридизуется с поли-А участком или последовательностью вектора, для идентификации последовательностей, расположенных в 5'- и 3'-направлениях от известной последовательности. Дополнительные методики включают ПЦР с захватом (Ъадег51гош е! а1., РСР Ме!йоб5 Аррйс, 1:111-19 (1991)) и ПЦР-прогулку (Рагкег е! а1., Ыис1. Ааб5. Ре5. 19:3055-60 (1991)). Другие способы, использующие амплификацию, также могут быть использованы для получения полноразмерной последовательности кДНК.
В некоторых случаях существует возможность получения полноразмерной последовательности кДНК путём анализа последовательностей, приведенных в базе данных экспрессируемых маркерных последовательностей (Е8Т, Ехрге55еб 8ециеисе Тад), таких как те, которые доступны из СеиВаик. Поиски перекрывающихся Е8Т обычно могут быть осуществлены с использованием хорошо известных программ (например, поиски ЫСВ1 ВЬА8Т), и такие Е8Т могут быть использованы для создания непрерывной полноразмерной последовательности. Полноразмерные последовательности ДНК также можно получить путём анализа геномных фрагментов.
Экспрессия полинуклеотидов в клетках хозяина.
Полинуклеотидные последовательности или их фрагменты, кодирующие полипептиды по изобретению или слитые белки либо их функциональные эквиваленты, могут быть использованы в молекулах рекомбинантной ДНК для того, чтобы направить экспрессию полипептида в соответствующих клетках хозяина. Вследствие природной вырожденности генетического кода могут быть получены другие последовательности ДНК, которые кодируют, по существу, такую же или функционально эквивалентную аминокислотную последовательность, и эти последовательности могут быть использованы для клонирования и экспрессии указанного полипептида.
Как будет понятно специалистам в данной области, в некоторых случаях может иметь преимущество получение полипептид-кодирующих нуклеотидных последовательностей, имеющих неприродные кодоны. Например, для увеличения скорости экспрессии белка или для продуцирования рекомбинантного РНК транскрипта, имеющего такие желаемые свойства, как период полувыведения, который продолжительнее такового у транскрипта, созданного из последовательности природного происхождения, могут быть выбраны кодоны, предпочтительные для конкретного прокариотического или эукариотического хозяина.
Более того, можно конструировать полинуклеотидные последовательности, применяя способы, общеизвестные в данной области для того, чтобы изменять полипептид-кодирующие последовательности по ряду причин, включая, но этим не ограничиваясь, изменения, которые модифицируют клонирование, процессинг и/или экспрессию генного продукта. Например, для конструирования нуклеотидных последовательностей можно использовать перетасовку ДНК путем случайной фрагментации и вторичной сборки генных фрагментов и синтетических олигонуклеотидов с помощью ПЦР.
В дополнение к этому, сайт-направленный мутагенез можно использовать для вставки новых рестрикционных сайтов, изменения характера гликозилирования, изменения предпочтения кодонов, получения сплайс-вариантов или введения мутаций и т.д.
Природные, модифицированные или рекомбинантные последовательности нуклеиновой кислоты могут быть лигированы с гетерологичной последовательностью для того, чтобы кодировать слитый белок. Например, скрининг пептидных библиотек в отношении ингибиторов полипептидной активности может быть полезным для кодирования химерного белка, который может распознаваться имеющимся в продаже антителом. Также слитый белок может быть сконструирован так, чтобы он содержал сайт расщепления, локализованный между полипептид-кодирующей последовательностью и гетерологичной белковой последовательностью, так чтобы полипептид можно было отщепить и очистить от гетерологичной группировки.
Последовательности, кодирующие желаемый полипептид, можно синтезировать, целиком или частично, используя химические способы, хорошо известные в данной области техники (см. Саги!йег5, М.Н. е! а1., Ыис1. Ас1б5 Ре5. 8ушр. 8ег., р. 215-223 (1980), Ноги е! а1., Ыис1. Ааб5 Ре5. 8ушр. 8ег., р. 225-232 (1980)). Альтернативно, сам белок можно получить, используя химические способы синтеза аминокис- 21 024826 лотной последовательности полипептида или его участка. Например, пептидный синтез может быть осуществлен с использованием различных твердофазных методов (КоЬегде е! а1., 8с1епсе, 269:202-204 (1995)), а автоматизированного синтеза можно достичь, например, с использованием пептидного синтезатора АВ1 431А (Регкт Е1тег, Ра1о А1!о, СА).
Вновь синтезированный пептид можно в значительной степени очистить с помощью препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (например, Сге1дЬ!оп, Рго!е1п8, §!гис!игек апб Мо1еси1аг Ргтс1р1ек (1983)) или других сравнимых методов, доступных в данной области. Состав синтетических пептидов может быть подтвержден аминокислотным анализом или секвенированием (например, процедурой деградации по Эдману). Кроме того, аминокислотную последовательность полипептида или любого его участка можно изменить в процессе прямого синтеза и/или скомбинировать, используя химические способы, с последовательностями из других белков или любого их участка с целью продуцирования вариантного полипептида.
Для того чтобы экспрессировать желаемый полипептид, нуклеотидные последовательности, кодирующие этот полипептид или его функциональные эквиваленты, можно встроить в соответствующий экспрессирующий вектор, т.е. вектор, содержащий необходимые элементы для транскрипции и трансляции встроенной кодирующей последовательности. Способы, которые хорошо известны специалистам в данной области, могут быть использованы для конструирования экспрессирующих векторов, содержащих последовательности, кодирующие представляющий интерес полипептид, и соответствующие транскрипционные и трансляционные контрольные элементы. Эти способы включают методы рекомбинантной ДНК ш νί!το, методы синтеза и методы генетической рекомбинации ш νίνο. Такие методы описаны в 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1отпд, А ЬаЬога!огу Мапиа1 (2000) и АикиЬе1 е! а1., Сиггеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду (обновляемые ежегодно).
Ряд систем экспрессирующий вектор/хозяин можно использовать для содержания и экспрессии полинуклеотидных последовательностей. Они включают, но не ограничиваются этим, микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантными бактериофаговыми, плазмидными или космидными ДНК-экспрессирующими векторами; дрожжи, трансформированные дрожжевыми векторами экспрессии; клеточные системы насекомых, инфицированные вирусными векторами экспрессии (например, бакуловирусными); растительные клеточные системы, трансформированные вирусными векторами экспрессии (например, на основе вируса мозаики цветной капусты (СаМУ); вируса табачной мозаики (ТМУ)) или бактериальными векторами экспрессии (например, плазмидами Τί или рВК322); или животные клеточные системы.
Контрольные элементы или регуляторные последовательности, присутствующие в экспрессирующем векторе, представляют собой нетранслируемые участки вектора - энхансеры, промоторы, 5'- и 3'-нетранслируемые участки, которые взаимодействуют с клеточными белками хозяина для осуществления транскрипции и трансляции. Такие элементы могут варьировать по своей эффективности и специфичности. В зависимости от применяемых векторной системы и хозяина можно использовать любое количество подходящих транскрипционных и трансляционных элементов, включая конститутивные и индуцибельные промоторы. Например, при клонировании в бактериальных системах можно использовать индуцибельные промоторы, такие как гибридный промотор ΕκΖ фагмиды РВЬиЕ§СК1РТ (§1га1адепе, Ьа ЛоНа, СаПГ.) или плазмиды Р8РОКТ1 (ОШсо ВКЬ, СаЬЬегкЬигд, МО) и т.п. В клеточных системах млекопитающих обычно предпочтительны промоторы из генов млекопитающих или из вирусов млекопитающих. Если необходимо создать клеточную линию, которая содержит множественные копии последовательности, кодирующей полипептид, преимущество в использовании имеют векторы на основе 8У40 (обезьяньего вируса 40) или ЕВУ (вируса Эпштейна-Барр) с соответствующим селектируемым маркером.
В бактериальных системах количество экспрессирующих векторов может быть выбрано в зависимости от применения, предполагаемого для экспрессируемого полипептида. Например, когда требуются большие количества, например, для индукции антител, то можно использовать векторы, приводящие к высокому уровню экспрессии слитых белков, которые можно легко очистить. Такие векторы включают, но не ограничиваются этим, многофункциональные клонирующие и экспрессирующие в Е.соН векторы, такие как ВЬИЕЗСКГРТ (§1га!адепе), в которых последовательность, кодирующая представляющий интерес полипептид, может быть лигирована в этот вектор в рамке считывания с последовательностями для аминоконцевого Ме! и последующих 7 остатков β-галактозидазы, таким образом, что продуцируется гибридный белок; векторы рШ (Уап Нееке & 8сЬи5!ег, 1. Вю1. СЬет., 264:5503-5509 (1989)) и т.п. Векторы рСЕХ (Рготеда, МаФкоп, ^ίκ.) также могут быть использованы для экспрессии чужеродных полипептидов в виде слитых белков с глутатион-§-трансферазой (С8Т). Обычно такие слитые белки растворимы и могут быть легко очищены из лизированных клеток путём адсорбции на глутатион-агарозных гранулах с последующим элюированием в присутствии свободного глутатиона. Белки, полученные в таких системах, можно конструировать таким образом, чтобы включить сайты гепарина, сайты расщепления тромбином или протеазой фактор ХА, с тем, чтобы при желании представляющий интерес клонированный полипептид можно было освободить от С8Т-группировки.
В дрожжах 8ассЬаготусек сегемыае могут быть использованы различные векторы, содержащие конститутивные или индуцибельные промоторы, такие как промоторы альфа-фактора, алкогольоксидазы
- 22 024826 и РСН. Другие векторы, содержащие конститутивные или индуцибельные промоторы, включают промоторы генов САР (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа), РСК (фосфоглицераткиназа), САЬ (галактозидаза) и ΑΌΗ (алкогольдегидрогеназа). В качестве обзоров см. АикиЬе1 е! а1. (выше) и Сгап! е! а1., Ме1койк Еп/уто1., 153:516-544 (1987) и Котак е! а1. Υеак!, 8:423-88 (1992).
В случаях использования растительных экспрессирующих векторов экспрессия последовательностей, кодирующих полипептиды, может управляться любым из множества промоторов. Например, вирусные промоторы, такие как промоторы 358 и 198 СаМУ, могут быть использованы по отдельности или в комбинации с омега-лидерной последовательностью из ТМУ (Таката!ки, ЕМВО ί., 6:307-311 (1987)). Альтернативно, могут быть использованы растительные промоторы, такие как промоторы генов малой субъединицы КИВ18СО (рибулозобисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа) или белков теплового шока (Согн/ζί е! а1., ЕМВО ί., 3:1671-1680 (1984); Вгодйе е! а1., 8с1епсе, 224:838-843 (1984) и \УнИег е! а1., Кеки1!к РгоЬ1. Се11 Όίί&Γ, 17:85-105 (1991)). Эти конструкции могут быть введены в растительные клетки путем прямой трансформации ДНК или путём патоген-опосредованной трансфекции. Такие методы описаны в ряде обычно доступных обзоров (см., например, НоЬЬк в МсСгате НШ Υеа^Ьоок оГ 8аепсе апй Тескпо1оду, р. 191-196 (1992)).
Систему (клеток) насекомых также можно использовать для экспрессии представляющего интерес полипептида. Например, в одной такой системе в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов в клетках 8ройор!ега Ггид1регйа или в Тпскорйыа 1аг\'ае используют вирус ядерного полиэдроза Аи!одгарка саПГониса (АсМРУ). Последовательности, кодирующие полипептид, можно клонировать в несущественный участок вируса, например, полиэдриновый ген, и поместить под контроль полиэдринового промотора. Успешная вставка полипептид-кодирующей последовательности будет делать полиэдриновый ген неактивным и давать рекомбинантный вирус, не имеющий белка оболочки. Затем рекомбинантные вирусы могут быть использованы для инфицирования, например, клеток 8.Ггид1регйа или ТпсПорИМа 1аг\'ае, в которых может экспрессироваться представляющий интерес полипептид (ЕпдеШагй е! а1., Ргос. №И. Асай. 8οΐ. И.8.А., 91:3224-3227 (1994)).
В клетках-хозяевах млекопитающих обычно доступен ряд экспрессирующих систем на основе вирусов. Например, в случаях, где аденовирус используется в качестве экспрессирующего вектора, последовательности, кодирующие представляющий интерес полипептид, могут быть лигированы в аденовирусный транскрипционный/трансляционный комплекс, состоящий из позднего промотора и трехкомпонентной лидерной последовательности. Вставку в несущественный участок Е1 или Е3 вирусного генома можно использовать для получения жизнеспособного вируса, способного экспрессировать полипептид в инфицированных клетках-хозяевах (Ьодап & 8Ьепк, Ргос. №!1. Асай. 8сг И.8.А., 81:3655-3659 (1984)). Дополнительно, для увеличения экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих можно использовать энхансеры транскрипции, такие как энхансер вируса саркомы Рауса (К8У). Обзоры способов и протоколов для работы с аденовирусными векторами приведены в \Уо1й, Айепо\агнк МеШойк апй Рго!осо1к, 1998. Дополнительные ссылки, касающиеся применения аденовирусных векторов, можно найти в Айепо\агнк: А Мейюа1 Эюйопагу, ВШНодгарку, апй АппоКИей Кекеагск Сшйе !о 1п!егпе! КеГегепсек, 2004.
Для достижения более эффективной трансляции последовательностей, кодирующих представляющий интерес полипептид, также могут быть использованы специфические сигналы инициации. Такие сигналы включают инициирующий кодон АТС и примыкающие последовательности. В тех случаях, когда последовательности, кодирующие полипептид, его инициирующий кодон и расположенные выше последовательности встроены в соответствующий экспрессирующий вектор, никаких дополнительных транскрипционных или трансляционных контрольных сигналов может не потребоваться. Однако в случаях, когда встроены только кодирующая последовательность или ее участок, необходимо обеспечить экзогенные трансляционные контрольные сигналы, включая инициирующий кодон АТС. Более того, инициирующий кодон должен находиться в правильной рамке считывания, чтобы гарантировать трансляцию всей вставки. Экзогенные трансляционные элементы и инициирующие кодоны могут быть различного происхождения, как природными, так и синтетическими. Эффективность экспрессии можно повысить путем включения энхансеров, которые являются соответствующими конкретной используемой клеточной системе, которая применяется, как, например, энхансеров, которые описаны в литературе (8скагГ. е! а1., Кеки1!к РгоЬ1. Се11 ЭГГег, 20:125-162 (1994)).
Кроме того, можно выбрать штамм клеток хозяина по его способности модулировать экспрессию встроенных последовательностей или осуществлять процессинг экспрессируемого белка желательным образом. Такие модификации полипептида включают, но не ограничиваются этим, ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидизацию и ацилирование. Посттрансляционный процессинг, при котором происходит расщепление препро-формы белка, также можно использовать для облегчения правильной вставки, фолдинга и/или функции. Различные клетки-хозяева, такие как клетки СНО (яичников китайского хомячка), НеЬа, МЭСК, НЕК293 (почек эмбриона человека) и ^У!38, которые имеют специфический клеточный аппарат и специфические механизмы для таких посттрансляционных активностей, могут быть выбраны для обеспечения правильной модификации и процессинга чужеродного белка.
- 23 024826
Для продолжительного продуцирования рекомбинантных белков с высоким выходом обычно предпочтительна стабильная экспрессия. Например, клеточные линии, которые стабильно экспрессируют представляющий интерес полинуклеотид, могут быть трансформированы с использованием экспрессирующих векторов, которые могут содержать вирусные точки инициации репликации и/или эндогенные элементы экспрессии и селектируемый маркерный ген в том же или в отдельном векторе. После введения вектора клетки можно оставить расти в течение 1-2 суток в обогащенной среде, прежде чем перевести их в селективную среду. Задача селектируемого маркера заключается в том, чтобы придать устойчивость к селекции, и его присутствие делает возможным рост и выделение клеток, успешно экспрессирующих введенные последовательности. Устойчивые клоны стабильно трансформированных клеток могут быть размножены с использованием методов культивирования тканей, подходящих для данного типа клеток.
Для получения трансформированных клеточных линий можно использовать любое количество систем селекции. Они включают, но не ограничиваются этим, гены тимидинкиназы (!к) (А1д1ет е! а1., Се11, 11:223-32 (1977)) и аденинфосфорибозилтрансферазы (арг!) вируса простого герпеса (Ьо^у е! а1., Се11, 22:817-23 (1990)), которые могут быть использованы соответственно в !к.8ир.- или арг!.8ир.- клетках. Кроме того, в качестве основы для селекции можно использовать устойчивость к антиметаболитам, антибиотикам или гербицидам; например йМг (дигидрофолатредуктаза), который придает устойчивость к метотрексату (Аф1ег е! а1., Ргос. №йк Асай. Зск и.З.А., 77:3567-70 (1980)); пр! (неомицинфосфотрансфераза), который придает устойчивость к аминогликозидам, неомицину и 0-418 (Со1Ьете-0агарш е! а1., ί. Мо1. Вю1., 150:1-14 (1981)); и а18 (ацетолактатсинтаза) или ра! (фосфинотрицинацетилтрансфераза), которые придают устойчивость соответственно к хлорсульфурону и фосфинотрицину (Митту, выше). Были описаны дополнительные селектируемые гены, например, !грВ (триптофансинтаза), который позволяет клеткам утилизировать индол вместо триптофана, или ΗίδΌ (гистидинолдегидрогеназа), который позволяет клеткам утилизировать гистидинол вместо гистидина (Наг!тап & МиШдап, Ргос. №!1. Асай. Зсн и.З.А., 85:8047-51 (1988)). Недавно применение видимых маркеров сделало популярным использование таких маркеров, как антоцианины, β-глюкуронидаза и ее субстрат 0ИЗ, люцифераза и ее субстрат люциферин, причем их широко используют не только для идентификации трансформантов, но также для количественного определения величины временной или стабильной экспрессии белка, присущей конкретной векторной системе (Кйойек е! а1., Ме!йой§ Мо1. Вю1., 55:121-131 (1995)).
Хотя наличие/отсутствие экспрессии маркерного гена предполагает, что представляющий интерес ген также присутствует, его присутствие и экспрессия могут нуждаться в подтверждении. Например, если последовательность, кодирующую полипептид, встраивают в последовательность маркерного гена, рекомбинантные клетки, содержащие последовательности, могут быть идентифицированы по отсутствию функции маркерного гена. Альтернативно, маркерный ген можно разместить в тандеме с полипептид-кодирующей последовательностью под контролем одного промотора. Экспрессия маркерного гена в ответ на индукцию или селекцию обычно также указывает на экспрессию тандемного гена.
Альтернативно, клетки хозяина, содержащие и экспрессирующие желаемую полинуклеотидную последовательность, можно идентифицировать различными методами, известными специалистам в данной области. Эти методы включают, но не ограничиваются этим, ДНК-ДНК или ДНК-РНК гибридизации и методы биоанализа или иммуноанализа белков, которые включают мембранные технологии, технологии в растворах или технологии на основе чипов для детекции и/или количественного определения нуклеиновой кислоты или белка.
В данной области техники известно множество протоколов детекции и измерения экспрессии полинуклеотид-кодируемых продуктов с использованием либо поликлональных, либо моноклональных антител, специфичных к данному продукту. Примеры включают твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫЗА), радиоиммуноанализ (ΡΙΛ) и метод флуоресцентно-активированной сортировки клеток (РАСЗ). Для некоторых применений предпочтительным может быть двухстадийный, основанный на моноклональных антителах иммунологический анализ, в котором используются моноклональные антитела, реагирующие с двумя неперекрывающимися эпитопами на указанном полипептиде, но также можно использовать анализ конкурентного связывания. Эти и другие анализы описаны, наряду с другими источниками, в Натр!оп е! а1., Зего1офса1 Ме!йой8, а ЬаЬота!оту Мапиа1 (1990) и Маййох е! а1., ί. Ехр. Мей., 158:1211-1216 (1983).
Большое разнообразие меток и методов конъюгирования известны специалистам в данной области, и их можно использовать в различных анализах нуклеиновых кислот и аминокислот. Способы получения меченых гибридизационных или ПЦР-зондов для детекции последовательностей, относящихся к полинуклеотидам, включают олигомечение, ник-трансляцию, концевое мечение или ПЦР-амплификацию с использованием меченого нуклеотида. Альтернативно, последовательности или любые их участки можно клонировать в вектор для продуцирования мРНК-зонда. Такие векторы известны в данной области, имеются в продаже и их можно использовать для синтеза РНК-зондов ш уйго путем добавления соответствующей РНК-полимеразы, например, Т7, Т3 или ЗР6, и меченых нуклеотидов. Эти процедуры можно проводить, используя различные имеющиеся в продаже наборы. Подходящие репортерные молекулы или метки, которые могут быть использованы, включают радионуклиды, ферменты, флуоресцентные, хеми- 24 024826 люминесцентные или хромогенные агенты, а также субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и т.п.
Клетки хозяина, трансформированные представляющей интерес полинуклеотидной последовательностью, можно культивировать в условиях, подходящих для экспрессии и выделения белка из клеточной культуры. Белок, продуцируемый рекомбинантной клеткой, может секретироваться или оставаться внутри клетки в зависимости от используемых последовательности и/или вектора. Как будет очевидно специалистам в данной области, экспрессирующие векторы, содержащие полинуклеотиды, могут быть сконструированы таким образом, чтобы содержать в себе сигнальные последовательности, которые управляют секрецией кодируемого полипептида через мембрану прокариотических или эукариотических клеток. Другие рекомбинантные конструкции могут быть использованы для присоединения последовательностей, кодирующих представляющий интерес полипептид, к нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептидный домен, который будет облегчать очистку растворимых белков. Такие облегчающие очистку домены включают, но не ограничиваются этим, металл-хелатирующие пептиды, такие как гистидин-триптофановые модули, позволяющие осуществлять очистку на иммобилизованных металлах, домены белка Α, позволяющие осуществлять очистку на иммобилизованном иммуноглобулине, и домен, используемый в системе ΡΤΑΟδ-удлинения/аффинной очистки Дттипех Согр., δеа!ι1е, \Уа8Й.). Встраивание расщепляемых линкерных последовательностей, таких как линкерные последовательности, специфичные к фактору ΧΑ или энтерокиназе Диьбгодеп, δаη О1едо, Са1тГ.), между доменом очистки и кодируемым полипептидом можно использовать для облегчения очистки. Один такой экспрессирующий вектор обеспечивает экспрессию слитого белка, содержащего представляющий интерес полипептид, и этот вектор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую 6 гистидиновых остатков, находящихся перед тиоредоксиновым или энтерокиназным сайтом расщепления. Гистидиновые остатки облегчают очистку на ГМ^С (аффинная хроматография с использованием иммобилизованных ионов металлов), как описано в Рога!й е! а1., Рго! Ε\ι. РигТ., 3:263-281 (1992), в то время как сайт расщепления энтерокиназой обеспечивает средство для очистки желаемого полипептида из слитого белка. Обсуждение векторов, кодирующих слитые белки, приведено в Кго11 е! а1., ΌΗΑ Се11 Вю1., 12:441-453 (1993)).
Методы доставки полинуклеотидов ш νί\Ό.
В дополнительных воплощениях генетические конструкции, содержащие один или более полинуклеотидов по изобретению, вводят в клетки ш νί\Ό. Этого можно достичь с использованием любого из различных хорошо известных подходов; некоторые из них приведены ниже с целью иллюстрации.
1. Аденовирус.
Один из предпочтительных способов для ш νί\Ό доставки одной или более чем одной последовательности нуклеиновой кислоты включает применение аденовирусного экспрессирующего вектора. Подразумевается, что аденовирусный экспрессирующий вектор включает такие конструкции, которые содержат аденовирусные последовательности, достаточные для (а) поддержания упаковки конструкции и для (б) экспрессии полинуклеотида, клонированного в нем в смысловой или антисмысловой ориентации. Конечно, в контексте антисмысловой конструкции экспрессия не требует, чтобы продукт гена синтезировался.
Экспрессирующий вектор содержит генно-инженерную форму аденовируса. Знание генетической организации аденовируса, представляющего собой вирус с линейной двухцепочечной ДНК, 36 т.п.н., позволяет производить замену больших участков аденовирусной ДНК чужеродными последовательностями вплоть до 7 т.п.н. (ОгипНаи8 & НогМШ, 1992). В противоположность ретровирусу, аденовирусная инфекция клеток хозяина не приводит к хромосомной интеграции, потому что аденовирусная ДНК может реплицироваться в виде эписомы без потенциальной генотоксичности. Кроме того, аденовирусы структурно стабильны, и после активной амплификации не отмечено никакой геномной перестройки. Аденовирус может инфицировать фактически все эпителиальные клетки независимо от стадии их клеточного цикла. До настоящего времени аденовирусная инфекция обнаруживается связанной, повидимому, только с легкой формой заболевания, такого как острое респираторное заболевание, у людей.
Аденовирус особенно подходит для применения его в качестве вектора для переноса генов из-за среднего размера его генома, легкости манипулирования, высокого титра, широкого диапазона клетокмишеней и высокой инфекционности. Оба конца вирусного генома содержат инвертированные повторы длиной 100-200 пар оснований ДТР), которые представляют собой цис-элементы, необходимые для репликации и упаковки вирусной ДНК. Ранние (Ε) и поздние (Ь) участки генома содержат разные транскрипционные единицы, которые разделены точкой начала репликации вирусной ДНК. Участок Ε1 (Ε1Α и Ε^ί кодирует белки, отвечающие за регуляцию транскрипции вирусного генома и нескольких клеточных генов. Экспрессия участка Ε2 (Ε2Α и Ε2Β) приводит к синтезу белков для репликации вирусной ДНК. Эти белки вовлечены в репликацию ДНК, экспрессию поздних генов и отключение клеткихозяина (Репап, 1990). Продукты поздних генов, включая большую часть капсидных вирусных белков, экспрессируются только после значительного процессинга одного первичного транскрипта под контролем главного позднего промотора (МЬР). МЬР (расположенный на 16,8 единицы карты) особенно эффективен в поздней фазе инфекции, и все мРНК, контролируемые этим промотором, содержат 5'-тройственную лидерную (ТРЬ) последовательность, которая делает их предпочтительными мРНК для
- 25 024826 трансляции.
В настоящей системе рекомбинантный аденовирус получают в результате гомологичной рекомбинации между челночным вектором и провирусным вектором. Вследствие возможной рекомбинации между двумя провирусными векторами в результате этого процесса может быть получен аденовирус дикого типа. Поэтому крайне необходимым является выделение единичного клона вируса из индивидуальной бляшки и проверка его геномной структуры.
Получение и размножение существующих в настоящее время аденовирусных векторов, которые дефектны по репликации, зависит от уникальной линии хелперных клеток, обозначенной 293, которая представляет собой клетки почки эмбриона человека, трансформированные фрагментами ДНК А65 (аденовируса 5 серотипа), и которая конститутивно экспрессирует белки Е1 (ОгаЬат е1 а1., 1977). Поскольку участок Е3 является необязательным в аденовирусном геноме (1опек & ЗЬепк, 1978), существующие в настоящее время аденовирусные векторы с помощью клеток 293 несут чужеродную ДНК либо в участке Е1, либо Ό3, либо в обоих этих участках (ОгаЬат & Ьгеуес, 1991). В природе аденовирус может упаковывать приблизительно 105% генома дикого типа (ОЬокЬ-СЬоибЬигу е1 а1., 1987), обеспечивая емкость приблизительно для 2 дополнительных т.п.н. ДНК. В сочетании с приблизительно 5,5 т.п.н. ДНК, которые могут быть заменены в участках Е1 и Е3, максимальная емкость существующих в настоящее время аденовирусных векторов составляет менее 7,5 т.п.н. или примерно 15% от общей длины вектора. Более 80% вирусного генома аденовируса остается в остове вектора и является источником трансмиссивной цитотоксичности. На этом дефектность по репликации Е1-делетированного вируса не заканчивается. Например, при использовании доступных в настоящее время векторов с высокой множественностью заражения (МО1) наблюдалась утечка экспрессии вирусных генов (МиШдап, 1993).
Хелперные клеточные линии могут происходить из клеток человека, таких как клетки почки эмбриона человека, мышечные клетки, гемопоэтические клетки или другие мезенхимальные или эпителиальные клетки эмбриона человека. Альтернативно, хелперные клетки могут происходить из клеток других видов млекопитающих, пермиссивных для аденовируса человека. Такие клетки включают, например, клетки Vе^ο (клетки почки зеленой мартышки) или другие эмбриональные мезенхимальные или эпителиальные клетки обезьяны. Как указано выше, в настоящее время предпочтительной хелперной клеточной линией является линия 293.
КасЬег е1 а1. (1995) описали улучшенные способы культивирования клеток 293 и размножения аденовируса. В одном из форматов агрегаты природных клеток выращивают путем инокуляции индивидуальных клеток в силиконизированных вращающихся колбах объемом 1 л (ТесЬпе, СатЪйбде, ИК), содержащих по 100-200 мл среды. После перемешивания при 40 об/мин оценивают жизнеспособность клеток с использованием трипанового синего. В другом формате используют микроносители Р1Ъга-Се1 (ВЛЪу 81ег1н1, 81опе, ИК) (5 г/л) следующим образом. Клеточный инокулят, ресуспендированный в 5 мл среды, добавляют к носителю (50 мл) в колбе Эрленмейера объемом 250 мл и оставляют в стационарном состоянии на 1-4 ч с перемешиванием время от времени. Затем среду заменяют на 50 мл свежей среды и начинают встряхивание. Для продуцирования вируса клетки оставляют расти до конфлюентности примерно 80%, после чего среду меняют (до 25% конечного объема) и добавляют аденовирус при МО1 0,05. Культуры оставляют в стационарном состоянии на ночь, после чего объем увеличивают до 100% и начинают встряхивание, которое продолжают в течение еще 72 ч.
Помимо требования, чтобы аденовирусный вектор был дефектным или, по меньшей мере, условно дефектным по репликации, природа аденовирусного вектора, по-видимому, не является решающей для успешного практического применения изобретения. Аденовирус может представлять собой любой из 42 разных известных серотипов или подгрупп А-Р. Аденовирус 5 типа подгруппы С является предпочтительным исходным материалом для получения условно дефектного по репликации аденовирусного вектора для применения в настоящем изобретении, поскольку аденовирус 5 типа является человеческим аденовирусом, о котором известно огромное количество биохимической и генетической информации, и исторически его используют для большинства конструкций, использующих аденовирус в качестве вектора.
Как указано выше, типичный вектор по настоящему изобретению дефектен по репликации и не будет иметь аденовирусного участка Е1. Таким образом, удобнее всего будет вводить полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес ген, в положение, из которого удалены Е1-кодирующие последовательности. Однако положение вставки конструкции в аденовирусных последовательностях не критично для этого изобретения. Полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес ген, также может быть встроен вместо делетированного участка Е3 в Е3-замещающих векторах, как описано Кайккоп е1 а1. (1986), или в участок Е4, где линия хелперных клеток или хелперный вирус комплементирует дефект Е4.
Аденовирус легко выращивать, им легко манипулировать, и он демонстрирует широкий круг хозяев ш у|1го и ш угуо. Эта группа вирусов может быть получена с высокими титрами, например 109-10п бляшкообразующих единиц на 1 мл, и они обладают высокой инфекционностью. Жизненный цикл аденовируса не требует интеграции в геном клетки-хозяина. Чужеродные гены, доставляемые посредством аденовирусных векторов, являются эписомными и, следовательно, имеют низкую генотоксичность в отношении клеток хозяина. Не сообщалось ни о каких побочных эффектах при исследованиях вакцинации аде- 26 024826 новирусом дикого типа (СоисЬ е! а1., 1963; Тор е! а1., 1971), что демонстрирует их безопасность и терапевтический потенциал в качестве векторов для переноса генов ίη νί\Ό.
Аденовирусные векторы использовали в экспрессии эукариотических генов (Ъеугего е! а1., 1991; Сошех-Рокх е! а1., 1992) и разработке вакцин (СгипЬаих & Ног\\Ц/. 1992; СгаЬат & Ргеуес. 1992). Недавно исследования на животных показали, что рекомбинантный аденовирус может быть использован для генной терапии (§1гаГГог6-Ретсаи6е! & Ретсаибе!, 1991; §!гаГГог6-Ретсаи6е! е! а1., 1990; ШсЬ е! а1., 1993). Исследования при введении рекомбинантного аденовируса в разные ткани включают инстилляцию трахеи (КохепГеИ е! а1., 1991; КохепГеИ е! а1., 1992), мышечную инъекцию (Надо! е! а1., 1993), периферические внутривенные инъекции (Нега & Сегагб, 1993) и стереотактическую инокуляцию в головной мозг (Ье Са1 Ьа 8а11е е! а1., 1993).
Аденовирусные векторы могут происходить из человеческого аденовируса. Альтернативно, они могут происходить из аденовируса других видов, например шимпанзе, что может иметь преимущество, поскольку данные вирусные векторы не нейтрализуются антителами против человеческого аденовируса, циркулирующего в крови многих человеческих субъектов (см., например: Та!818 Ν. е! а1., Сепе ТЬегару, 2006, 13: 421-429).
Аденовирус 35 типа, который является относительно редко встречающимся, и поэтому против самого этого вектора имеются низкие уровни предсуществующего иммунитета, использовали в качестве системы доставки в некоторых противотуберкулезных вакцинах, находящихся в стадии разработки (см., например, Кабохеую е! а1., ЪГесЬоп апб ЬшпипПу. 2007, 75(8): 4105-4115). Аденовирус 35 типа также может быть особенно полезен в настоящем изобретении в качестве вектора для доставки.
2. Ретровирусы.
Ретровирусы представляют собой группу вирусов, содержащих одноцепочечную РНК, характеризующихся способностью превращать свою РНК в двухцепочечную ДНК в инфицированных клетках посредством процесса обратной транскрипции (СоГйп, 1990). Полученная ДНК затем стабильно интегрируется в клеточные хромосомы в виде провируса и направляет синтез вирусных белков. Интеграция приводит к сохранению последовательностей вирусных генов в реципиентной клетке и ее потомках. Ретровирусный геном содержит три гена: дад, ро1 и епу. которые кодируют капсидные белки, фермент полимеразу и компоненты оболочки соответственно. Последовательность, обнаруженная выше гена дад, содержит сигнал для упаковки генома в вирионы. На 5'- и 3'-концах вирусного генома имеются две последовательности длинных концевых повторов (ЬТН). Они содержат сильные промоторные и энхансерные последовательности и также необходимы для интеграции в геном клетки-хозяина (СоГйп, 1990).
Для того чтобы создать ретровирусный вектор, нуклеиновую кислоту, кодирующую одну или более представляющих интерес олигонуклеотидных или полинуклеотидных последовательностей, встраивают в вирусный геном в место расположения определенных вирусных последовательностей для получения вируса, дефектного по репликации. Для получения вирионов конструируют упаковывающую клеточную линию, содержащую гены дад, ро1 и епу. но не содержащую ЬТН и упаковывающие компоненты (Мапп е! а1., 1983). Когда в эту клеточную линию вводят (например, путем осаждения фосфатом кальция) рекомбинантную плазмиду, содержащую кДНК, вместе с ретровирусными ЬТН и упаковывающими последовательностями, упаковывающая последовательность способствует упаковке транскрипта РНК рекомбинантной плазмиды в вирусные частицы, которые затем секретируются в культуральную среду (№со1ах & НиЬеп81е1п, 1988; Тетш, 1986; Мапп е! а1., 1983). Среды, содержащие рекомбинантные ретровирусы, затем собирают, возможно концентрируют и используют для переноса генов. Ретровирусные векторы способны инфицировать широкий спектр клеточных типов. Однако для интеграции и стабильной экспрессии необходимо деление клеток хозяина (Рахкшб е! а1., 1975).
Недавно был разработан новый подход, который делает возможным специфическое прицеливание ретровирусных векторов, основанный на химической модификации ретровируса путем химического присоединения остатков лактозы к вирусной оболочке. Благодаря этой модификации смогли осуществить специфическое заражение гепатоцитов через сиалогликопротеиновые рецепторы.
Был применен другой подход для прицеливания рекомбинантных ретровирусов, в котором использовали биотинилированные антитела против ретровирусного оболочечного белка и против специфического клеточного рецептора. Антитела соединяли друг с другом через биотиновые компоненты путем использования стрептавидина (Ноих е! а1., 1989). С использованием антител против антигенов класса Ι и класса ΙΙ главного комплекса гистосовместимости они продемонстрировали, что имеет место инфекция различных человеческих клеток, несущих такие поверхностные антигены, экотропным вирусом ш У1!го (Ноих е! а1., 1989).
3. Аденоассоциированные вирусы (ААУ).
ААУ (Шбдетау, 1988; Негтопа! & Ми/усхка. 1984) представляет собой парвовирус, открытый в виде контаминации аденовирусных штаммов. Он является повсеместно распространенным вирусом (антитела имеются у 85% человеческой популяции в США), связи которого с какой-либо болезнью не установлены. Кроме того, его классифицируют как депендовирус, поскольку его репликация зависит от присутствия хелперного вируса, такого как аденовирус. Были выделены пять серотипов, из которых лучше всего охарактеризован ААУ-2. ААУ имеет одноцепочечную линейную ДНК, которая заключена в кап- 27 024826 сидную оболочку с капсидными белками УР1, УР2 и УР3 с образованием икосаэдрического вириона с диаметром 20-24 нм (Ми/ус/ка & МсЬаидЬИп, 1988).
ДНК ААУ имеет длину приблизительно 4,7 тысяч оснований. Она содержит две открытые рамки считывания и фланкирована двумя ГТК. В геноме ААУ имеются два основных гена: гер и сар. Ген гер кодирует белки, ответственные за вирусные репликации, тогда как сар кодирует капсидный белок УР1-3. Каждый ГТК образует Т-образную шпилечную структуру. Эти концевые повторы являются единственными существенными цис-компонентами ААУ для интеграции в хромосомы. Поэтому ААУ может быть использован в качестве вектора со всеми вирусными кодирующими последовательностями, удаленными и замененными кассетой генов для доставки. Идентифицированы три вирусных промотора, и они обозначены как р5, р19 и р40 в соответствии с их положением на карте. Транскрипция с р5 и р19 приводит к продуцированию белков гер, а транскрипция с р40 приводит к продуцированию капсидных белков (Негтопа! & Ми/ус/ка, 1984).
Существует несколько факторов, которые побуждали исследователей к изучению возможности использования гААУ (рекомбинантного ААУ) в качестве экспрессирующего вектора. Один из них заключается в том, что необходимых условий для доставки гена для интеграции в хромосому хозяина удивительно мало. Необходимо иметь инвертированные повторы (ГТК) размером 145 п.н., что составляет только 6% генома ААУ. Это оставляет место в векторе для составления вставки ДНК длиной 4,5 т.н. Несмотря на то что такая несущая емкость может препятствовать доставке больших генов с использованием ААУ, она в достаточной степени подходит для доставки антисмысловых конструкций.
Кроме того, ААУ представляет собой хороший выбор в качестве средств доставки ввиду своей безопасности. Существует относительно сложный механизм его высвобождения: для мобилизации гААУ требуются не только аденовирус дикого типа, но также гены ААУ. Более того, ААУ не является патогенным и не ассоциирован с каким-либо заболеванием. Удаление вирусных кодирующих последовательностей минимизирует иммунные ответы на экспрессию вирусных генов, и, следовательно, гААУ не индуцирует воспалительный ответ.
4. Другие вирусные векторы в качестве экспрессирующих конструкций.
Для доставки олигонуклеотидных или полинуклеотидных последовательностей в клетку-хозяина в качестве экспрессирующих конструкций в настоящем изобретении можно использовать другие вирусные векторы. Можно использовать векторы, происходящие из таких вирусов, как вирус оспы коров (Кйдеуау, 1988; Соираг е! а1., 1988), лентивирусы, полиовирусы и герпесвирусы. Также можно ожидать, что будут использованы другие векторы, происходящие из поксвирусов, как, например, векторы на основе вируса оспы птиц. Они обладают некоторыми привлекательными свойствами для различных клеток млекопитающих (Тпектапп, 1989; КМдеуау, 1988; Соираг е! а1., 1988; НогуюЬ е! а1., 1990).
Благодаря недавнему открытию дефектных вирусов гепатита В было достигнуто новое понимание структурно-функциональной взаимосвязи разных вирусных последовательностей. Исследования ш уйго показали, что вирус может сохранять способность к хелпер-зависимой упаковке и обратной транскрипции, несмотря на удаление вплоть до 80% его генома (НогуюЬ е! а1., 1990). Это навело на мысль, что большие участки генома могут быть заменены чужеродным генетическим материалом. Гепатотропизм и персистенция (интеграция) являлись особенно привлекательными свойствами для печень-направленного переноса генов. СЬапд е! а1. (1991) ввели ген хлорамфениколацетилтрансферазы (САТ) в геном вируса гепатита В утки в место расположения последовательностей, кодирующих полимеразу, поверхностную и предповерхностную (рге-кигГасе) кодирующие области. Осуществили его котрансфецию вместе с вирусом дикого типа в клеточную линию гепатомы птиц. Для инфицирования первичных утиных гепатоцитов использовали культуральные среды, содержащие высокие титры рекомбинантного вируса. Стабильную экспрессию гена САТ детектировали в течение по меньшей мере 24 суток после трансфекции (СЬапд е! а1., 1991).
Дополнительные вирусные векторы включают вирусоподобные частицы (УЬР) и фаги.
5. Невирусные векторы.
Для того чтобы осуществить экспрессию олигонуклеотидных или полинуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению, экспрессирующая конструкция должна быть доставлена в клетку. Эта доставка может быть осуществлена ш νίΙΐΌ, как в лабораторных методах трансформации клеточных линий, или ш угуо или ех У1уо, как при лечении некоторых болезненных состояний. Как описано выше, один из предпочтительных механизмов доставки осуществляется через вирусную инфекцию, когда экспрессирующая конструкция инкапсулируется в инфекционную вирусную частицу.
После доставки экспрессирующей конструкции в клетку нуклеиновая кислота, кодирующая желаемые олигонуклеотидные или полинуклеотидные последовательности, может располагаться и экспрессироваться в разных сайтах. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота, кодирующая такую конструкцию, может стабильно интегрироваться в геном клетки. Эта интеграция может осуществляться в специфическом положении и ориентации посредством гомологичной рекомбинации (замена генов), или она может интегрироваться в случайном, неспецифическом положении (генная аугментация). В следующих других воплощениях нуклеиновая кислота может стабильно поддерживаться в клетке в виде отдельного эписомного сегмента ДНК. Такие сегменты нуклеиновой кислоты или эписомы кодируют последова- 28 024826 тельности, достаточные для поддержания и репликации независимо от клеточного цикла хозяина или синхронизироанно с ним. То, каким образом экспрессирующая конструкция доставляется в клетку, и где в клетке сохраняется нуклеиновая кислота, зависит от типа используемой экспрессирующей конструкции.
В некоторых воплощениях изобретения экспрессирующая конструкция, содержащая одну или более олигонуклеотидных или полинуклеотидных последовательностей, может просто состоять из голой рекомбинантной ДНК или плазмиды. Перенос такой конструкции может быть осуществлен, например, любым способом, который физически или химически увеличивает проницаемость клеточной мембраны. Это особенно применимо для переноса ίη νίΐΐΌ, но также может быть использовано для применения ίη νί\Ό. ЭиЬепкку е1 а1. (1984) успешно инъецировали полиомавирусную ДНК в форме кальций-фосфатных преципитатов в печень и селезёнку взрослых и новорожденных мышей, продемонстрировав активную вирусную репликацию и острую инфекцию. ВепуепМу и РекЬеГ (1986) также продемонстрировали, что прямая внутрибрюшинная инъекция осажденных фосфатом кальция плазмид приводит к экспрессии трансфицированных генов. Рассматривается возможность того, что ДНК, кодирующая представляющий интерес ген, также может быть перенесена аналогичным образом ίη νί\Ό и может экспрессировать генный продукт.
Другое воплощение изобретения, касающееся переноса в клетки экспрессирующей конструкции, представляющей собой голую ДНК, может включать бомбардировку частицами. Этот способ зависит от способности ускорять ДНК-покрытые бомбардирующие микрочастицы до высокой скорости, позволяющей им проходить через клеточные мембраны и проникать в клетки, не вызывая их гибели (К1еш е1 а1., 1987). Разработано несколько устройств для ускорения небольших частиц. В основе одного такого устройства лежит высоковольтный разряд с целью генерирования электрического тока, что в свою очередь обеспечивает движущую силу (Уапд е1 а1., 1990). Используемые микрочастицы состоят из биологически инертных веществ, таких как вольфрамовые или золотые гранулы.
Выбранные органы, включая печень, кожу и мышечную ткань крыс и мышей, подвергали бомбардировке ίη νί\Ό (Уапд е1 а1., 1990; 2е1етп е1 а1., 1991). Для этого может потребоваться хирургическое воздействие на ткань или клетки с целью исключения любой мешающей ткани, находящейся между пушкой и органом-мишенью, то есть, обработка ех νί\Ό. И снова, ДНК, кодирующая конкретный ген, может быть доставлена с помощью этого способа и кроме того может быть встроена.
В качестве способа доставки также можно использовать бактерии (например, листерии, см. \У0 2004/11048) и, в особенности, БЦЖ. Полипептидные композиции.
Как правило, полипептид, используемый в данном изобретении, будет представлять собой выделенный полипептид (т.е. отделенный от тех компонентов, вместе с которыми его обычно можно обнаружить в природе).
Например, природный белок является выделенным, если он отделен от некоторых или всех сопутствующих веществ в природной системе. Предпочтительно такие полипептиды являются чистыми по меньшей мере примерно на 90%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно на 99%. Полинуклеотид считается выделенным, если, например, он клонирован в вектор, не являющийся частью природного окружения.
Полипептиды могут быть получены с использованием любого из множества хорошо известных методов. Рекомбинантные полипептиды, кодируемые последовательностями ДНК, которые описаны выше, можно легко получить из последовательностей ДНК с использованием любого из различных экспрессирующих векторов, известных средним специалистам в данной области. Можно добиться экспрессии в любой подходящей клетке хозяина, которая трансформирована или трансфицирована экспрессирующим вектором, содержащим молекулу ДНК, которая кодирует рекомбинантный полипептид. Подходящие клетки хозяина включают прокариоты, дрожжи и клетки высших эукариот, такие как клетки млекопитающих и клетки растений. Предпочтительно используемыми клетками хозяина являются Е.соИ, дрожжи или линия клеток млекопитающих, такая как С08 (клетки африканской зеленой мартышки) или СН0 (клетки яичников китайского хомячка). Супернатанты из подходящих систем хозяин/вектор, секретирующих рекомбинантный белок или полипептид в культуральную среду, сначала могут быть сконцентрированы с использованием имеющегося в продаже фильтра. После концентрирования концентрат может быть нанесен на подходящий матрикс для очистки, такой как аффинный матрикс или ионообменная смола. Наконец, для дальнейшей очистки рекомбинантного полипептида может быть использована одна или более чем одна стадия обращенно-фазовой ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография).
Полипептиды по изобретению, их иммуногенные фрагменты и другие варианты, имеющие меньше чем примерно 100 аминокислот и обычно меньше чем примерно 50 аминокислот, могут быть также получены способами синтеза с использованием методов, хорошо известных средним специалистам в данной области техники. Например, такие полипептиды могут быть синтезированы с использованием любого из коммерчески доступных твердофазных методов, таких как метод твердофазного синтеза по Меррифильду, в котором аминокислоты последовательно добавляют к растущей аминокислотной цепи. См. МегпПеИ. ί. Ат. СИет. 8ос. 85:2149-2154 (1963). Оборудование для автоматизированного синтеза полипептидов имеется в продаже у таких поставщиков, как Регкш Е1тег/АррНеб Вю8у51ет5 ЭМкюп (Ройег
- 29 024826
Ску, СА), и на нем можно работать в соответствии с инструкциями производителя.
В некоторых конкретных воплощениях полипептид может представлять собой слитый белок, который содержит множество полипептидов, как описано здесь, или который содержит по меньшей мере один полипептид, как описано здесь, и неродственную последовательность, примеры таких белков включают белки возбудителей столбняка, туберкулеза и гепатита (см., например, 81ои1е е1 а1., №те Еп§1. 1 Меб., 336:86-91 (1997)). Партнер слияния может, например, содействовать обеспечению Т-хелперных эпитопов (иммунологический партнер слияния), предпочтительно Т-хелперных эпитопов, распознаваемых людьми, или может содействовать экспрессии белка (усилитель экспрессии) с более высокими выходами, чем у нативного рекомбинантного белка. Некоторые предпочтительные партнеры слияния являются и иммунологическими, и усиливающими экспрессию партнерами слияния. Другие партнеры слияния могут быть выбраны так, чтобы увеличивать растворимость белка или позволять белку достигать желаемых внутриклеточных компартментов. Другие партнеры слияния включают аффинные метки, которые облегчают очистку белка.
Слитые белки в общем случае могут быть получены с использованием стандартных методов, включая химическое конъюгирование. Предпочтительно слитый белок экспрессируется в виде рекомбинантного белка, позволяя осуществлять продуцирование с повышенными уровнями относительно неслитого белка в экспрессирующей системе. Коротко, последовательности ДНК, кодирующие полипептидные компоненты, могут быть собраны по отдельности и лигированы в соответствующий экспрессирующий вектор. 3'-конец последовательности ДНК, кодирующей один полипептидный компонент, лигируют с пептидным линкером или без него, с 5'-концом последовательности ДНК, кодирующей второй полипептидный компонент, таким образом, чтобы рамки считывания последовательностей находятся в фазе. Это позволяет осуществлять трансляцию в виде единого слитого белка, который сохраняет биологическую активность обоих полипептидных компонентов.
Пептидную линкерную последовательность можно использовать для отделения первого и второго полипептидных компонентов расстоянием, достаточным для того, чтобы обеспечить то, что каждый полипептид будет сворачиваться в свою вторичную и третичную структуры. Такую пептидную линкерную последовательность встраивают в слитый белок, используя стандартные методы, хорошо известные в данной области. Подходящие пептидные линкерные последовательности могут быть выбраны на основании следующих факторов: (1) их способности принимать гибкую вытянутую конформацию; (2) их неспособности принимать вторичную структуру, которая могла бы взаимодействовать с функциональными эпитопами на первом и втором полипептидах; и (3) отсутствия гидрофобных или заряженных остатков, которые могли бы взаимодействовать с полипептидными функциональными эпитопами. Предпочтительные пептидные линкерные последовательности содержат остатки О1у, А8п и 8ег. Другие почти нейтральные аминокислоты, такие как Ткг и А1а, также могут быть использованы в линкерной последовательности. Аминокислотные последовательности, которые можно успешно использовать в качестве линкеров, включают последовательности, раскрытые в Мата1еа е1 а1., Оепе, 40:39-46 (1985); Мигрку е1 а1., Ргос. Ν;·ιΐ1. Асаб. 8с1. И8А, 83:8258-8262 (1986); патента США № 4935233 и 4751180. Линкерная последовательность обычно может иметь длину от 1 до примерно 50 аминокислот. Линкерные последовательности не требуются, когда первый и второй полипептиды имеют несущественные Ν-концевые аминокислотные участки, которые могут быть использованы для отделения функциональных доменов и предупреждения пространственной интерференции.
В предпочтительных воплощениях иммунологический партнер слияния происходит из белка Ό, поверхностного белка грамотрицательной бактерии НаеторЫ1и8 тЛиеп/а В (νθ 91/18926). Предпочтительно, когда производное белка Ό содержит приблизительно первую треть белка (например, первые Ν-концевые 100-110 аминокислот), и производное белка Ό может быть липидизировано. В некоторых предпочтительных воплощениях первые 109 остатков партнера слияния липопротеина Ό включены на Ν-конце для получения полипептида с дополнительными экзогенными Т-клеточными эпитопами и для увеличения уровня экспрессии в Е.соИ (таким образом, функционируя как усилитель экспрессии). Липидный хвост обеспечивает оптимальное представление антигена антигенпредставляющим клеткам. Другие партнеры слияния включают неструктурный белок из вируса гриппа: N81 (гемагглютинин). Обычно используют 81 й-концевую аминокислоту, хотя можно использовать разные фрагменты, которые включают Т-хелперные эпитопы.
В другом воплощении иммунологическим партнером слияния является белок, известный как ЬУТА, или его участок (предпочтительно С-концевой участок). ЬУТА происходит из 8Кер1ососси8 рпеитотае, который синтезирует У-ацетил-Е-аланин-амидазу, известную как амидаза ЬУТА (кодируемую геном Ьу1А; Оепе, 43:265-292 (1986)). ЬУТА представляет собой аутолизин, который специфически расщепляет определенные связи в пептидогликановом остове. С-концевой домен белка ЬУТА отвечает за сродство к холину или некоторым аналогам холина, таким как ЭЕАЕ (диэтиламиноэтил). Это свойство использовали для разработки Е.соИ С-ЬУГА-экспрессирующих плазмид, полезных для экспрессии слитых белков. Описана очистка гибридных белков, содержащих фрагмент С-ЬУТА на аминоконце (см. Вю1ескпо1оду, 10:795-798 (1992)). В предпочтительном воплощении повторяющийся участок ЬУТА может быть встроен в слитый белок. Повторяющийся участок обнаружен в С-концевой области, начиная с остатка 178. Осо- 30 024826 бенно предпочтительный повторяющийся участок включает в себя остатки 188-305.
Т-клетки.
Иммунотерапевтические композиции могут также, или альтернативно, содержать Т-клетки, специфичные к антигену МусоЪас!егшт. Такие клетки обычно могут быть получены ш У1!го или ех У1уо с использованием стандартных процедур. Например, Т-клетки можно выделить из спинного мозга, периферической крови или фракции спинного мозга или периферической крови пациента, используя имеющуюся в продаже систему для разделения клеток, такую как система 18о1ех™, доступная от №хе11 Тйегареийс8, 1пс. (1гуше, СА; см. также патенты США № 5240856; 5215926; νϋ 89/06280; νϋ 91/16116 и \νϋ 92/07243). Альтернативно, Т-клетки могут быть получены от родственников или не родственников, от млекопитающих, не являющихся людьми, из клеточных линий или культур.
Т-клетки могут быть стимулированы полипептидом по изобретению, полинуклеотидом, кодирующим такой полипептид, и/или антигенпрезентирующей клеткой (АРС), которая экспрессирует такой полипептид. Такую стимуляцию проводят в условиях и в течение времени, достаточных для того, чтобы обеспечить продукцию Т-клеток, специфичных к полипептиду. Предпочтительно полипептид или полинуклеотид присутствует в средстве для доставки, таком как микросфера, для облегчения продуцирования специфических Т-клеток.
Т-клетки считаются специфичными к полипептиду по изобретению, если эти Т-клетки специфически пролиферируют, секретируют цитокины или уничтожают клетки-мишени, покрытые полипептидом или экспрессирующие ген, кодирующий полипептид. Т-клеточную специфичность можно оценить, используя любую из множества стандартных методов. Например, в анализе с высвобождением хрома или анализе пролиферации, увеличение индекса стимуляции более чем в два раза в лизисе и/или пролиферации по сравнению с отрицательными контролями указывает на Т-клеточную специфичность. Такие анализы могут быть проведены, например, как описано в СБеп е! а1., Сапсег Ке8., 54:1065-1070 (1994). Альтернативно, определение пролиферации Т-клеток может быть выполнено с помощью различных известных методов. Например, Т-клеточную пролиферацию можно определить путем измерения возрастающей скорости синтеза ДНК (например, с применением импульсно меченых культур Т-клеток с использованием меченного тритием тимидина и измерения количества меченного тритием тимидина, включенного в ДНК). Контакт с полипептидом по изобретению (100 нг/мл - 100 мкг/мл, предпочтительно 200 нг/мл - 25 мкг/мл) в течение 3-7 суток должен приводить по меньшей мере к двукратному увеличению пролиферации Т-клеток. Описанный выше контакт в течение 2-3 ч должен приводить к активации Т-клеток, как измерено с использованием стандартных цитокиновых анализов, в которых двукратное увеличение в уровне высвобождения цитокина (например, ТОТ1 или ΙΡΝ-γ) является индикатором Т-клеточной активации (см. Сойдап е! а1., Сиггеп! Рго!осо18 ш 1ттипо1оду, уо1. 1 (1998)). Т-клетки, которые были активированы в ответ на полипептид, полинуклеотид или полипептид-экспрессирующие АРС, могут представлять собой СЭ4' и/или СЭ8'. Белок-специфические Т-клетки могут быть размножены с использованием стандартных методов. В предпочтительных воплощениях Т-клетки получают от пациента, донора-родственника или донора, не являющегося родственником, и их вводят пациенту после стимуляции и размножения.
Для терапевтических целей СО4' или СЭ8' Т-клетки, которые пролиферируют в ответ на полипептид, полинуклеотид или АРС, могут быть количественно размножены или ш уйго, или ш У1уо. Пролиферацию таких Т-клеток ш уйго можно осуществить различными способами. Например, Т-клетки могут быть повторно экспонированы полипептиду или короткому пептиду, соответствующему иммуногенному участку такого полипептида, с добавлением или без добавления Т-клеточных ростовых факторов, таких как интерлейкин-2, и/или стимуляторными клетками, которые синтезируют полипептид. Альтернативно, одна или более Т-клеток, которые пролиферируют в присутствии белка, могут быть количественно размножены путем клонирования. Способы клонирования клеток хорошо известны в данной области и включают серийное разведение.
Фармацевтические композиции.
В дополнительных воплощениях полинуклеотидные, полипептидные, Т-клеточные композиции и/или композиции антител, раскрытые здесь, будут изготовлены в фармацевтически приемлемых или физиологически приемлемых растворах для введения в клетку или животному либо отдельно, либо в комбинации с одним или более чем одним другим способом терапии.
Также следует понимать, что, при желании, сегмент нуклеиновой кислоты (например, РНК или ДНК), экспрессирующий полипептид, как раскрыто здесь, можно вводить также в комбинации с другими агентами, такими как, например, другие белки или полипептиды или различные фармацевтически активные агенты, включая химиотерапевтические агенты, эффективные против инфекции, вызываемой М.!иЪегси1о818. На самом деле, фактически нет никакого ограничения в отношении других компонентов, которые также могут быть включены, при условии, что дополнительные агенты не вызывают значительного неблагоприятного эффекта при контакте с клетками-мишенями или тканями хозяина. Таким образом, композиции могут быть доставлены вместе с различными другими агентами, как необходимо в конкретном случае. Такие композиции могут быть очищены из клеток хозяина или других биологических
- 31 024826 источников либо, альтернативно, могут быть химически синтезированы, как изложено здесь. Более того, такие композиции могут также включать композиции замещенных РНК или ДНК или их производных.
Технология приготовления фармацевтически приемлемых эксципиентов и растворов-носителей хорошо известна специалистам в данной области техники, поскольку относится к разработке подходящих режимов дозирования и схем лечения для применения конкретных композиций, раскрытых здесь, в ряде схем лечения, включая, например, пероральное, парентеральное, внутривенное, интраназальное и внутримышечное введение, и в изготовлении препаратов. Другие пути введения включают введение через поверхности слизистых.
Обычно, с помощью препаратов, содержащих терапевтически эффективное количество, доставляют от примерно 0,1 до примерно 1000 мкг полипептида за одно введение, в более типичных случаях от примерно 2,5 до примерно 100 мкг полипептида за одно введение. Что касается полинуклеотидных композиций, то обычно доставляют от примерно 10 мкг до примерно 20 мг полинуклеотида по изобретению за одно введение, в более типичных случаях примерно от 0,1 до примерно 10 мг полинуклеотида по изобретению за одно введение.
Естественно, количество активного(ых) соединения(й) в каждой терапевтически полезной композиции, которая может быть изготовлена, делают таким, чтобы в любой указанной стандартной дозе соединения получить подходящую дозировку. Такие факторы, как растворимость, биодоступность, биологический период полувыведения, путь введения, срок годности продукта, а также другие фармакологические полезные свойства, будут подразумеваться специалистом в области изготовления таких фармацевтических композиций, и, по существу, могут быть желательными различные дозировки и схемы лечения.
1. Пероральная доставка.
В некоторых применениях фармацевтические композиции, раскрытые здесь, могут быть доставлены посредством перорального введения животному. По существу, эти композиции могут быть изготовлены с использованием инертного разбавителя или с использованием усваиваемого пищевого носителя, или они могут быть помещены в желатиновую капсулу с твердой или мягкой оболочкой, или они могут быть спрессованы в таблетки, или они могут быть введены непосредственно с пищей рациона.
Активные соединения могут быть даже объединены с эксципиентами и использованы в форме проглатываемых таблеток, трансбуккальных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и т.п. (Ма11ио\\Ь/ е! а1., 1997; Н\\апд е! а1. 1998; патенты США № 5641515; 5580579 и 5792451, каждый из которых конкретно включен в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки). Таблетки, пастилки, пилюли, капсулы и т.п. могут также содержать следующее: связующее вещество, такое как трагакантовая камедь, аравийская камедь, кукурузный крахмал или желатин; эксципиенты, такие как дикальцийфосфат; разрыхлитель, такой как кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота и т.п.; смазывающее вещество, такое как стеарат магния; и может быть добавлен подсластитель, такой как сахароза, лактоза или сахарин, или корригент, как, например, перечная мята, масло гаультерии или вишневый корригент. Когда стандартная лекарственная форма представляет собой капсулу, тогда она может содержать, в дополнение к веществам вышеприведенного типа, жидкий носитель. Различные другие вещества могут присутствовать в качестве покрытий или каким-либо иным образом модифицировать физическую форму лекарственной единицы. Например, таблетки, пилюли или капсулы могут быть покрыты шеллаком, сахаром или и тем и другим. Сироп эликсира может содержать активное соединение, сахарозу в качестве подсластителя, метил- и пропилпарабены в качестве консервантов, краситель и корригент, как, например, вишневый или апельсиновый корригент. Конечно, любое вещество, используемое в изготовлении любой стандартной лекарственной формы, должно быть фармацевтически чистым и, по существу, нетоксичным в используемых количествах. Кроме того, активные компоненты могут быть включены в препарат и композиции с непрерывным высвобождением.
Для перорального введения композиции по настоящему изобретению могут быть альтернативно введены с одним или более эксципиентами в форме жидкости для полоскания рта, средства для чистки зубов, трансбуккальных таблеток, перорального спрея или сублингвального, вводимого в ротовую полость препарата. Например, жидкость для полоскания рта может быть приготовлена путем введения активного ингредиента в необходимом количестве в соответствующий растворитель, такой как раствор бората натрия (раствор Добелла). Альтернативно, активный ингредиент может быть включен в пероральный раствор, такой как раствор, содержащий борат натрия, глицерин и бикарбонат калия, или диспергирован в средстве для чистки зубов, или добавлен в терапевтически эффективном количестве к композиции, которая может содержать воду, связующие вещества, абразивные вещества, корригенты, пенообразователи и увлажнители. Альтернативно, композиции могут быть изготовлены в форме таблетки или раствора, которые можно поместить под язык или каким-либо иным образом растворить во рту.
2. Доставка путем инъекции.
В некоторых случаях будет желательно доставлять фармацевтические композиции, раскрытые здесь, парентерально, внутривенно, внутримышечно, интрадермально или даже интраперитонеально, как описано в патентах США № 5543158; 5641515 и 5399363 (каждый из которых конкретно включен здесь во всей своей полноте посредством ссылки). Растворы активных соединений в виде свободного основания или фармакологически приемлемых солей могут быть приготовлены в воде, смешанной соответст- 32 024826 венно с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Также могут быть приготовлены дисперсии в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях и в маслах. В обычных условиях хранения и применения эти композиции содержат консервант для предупреждения роста микроорганизмов.
Фармацевтические формы, подходящие для применения путем инъекции, включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий (патент США № 5466468, конкретно включенный здесь во всей своей полноте посредством ссылки). Во всех случаях форма должна быть стерильной и должна быть жидкой в такой степени, чтобы ее можно было легко вводить с помощью шприца. Она должна быть стабильной в условиях изготовления и хранения и должна быть защищена от контаминирующего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и тому подобное), подходящие их смеси и/или растительные масла. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путём применения покрытия, такого как лецитин, путём поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсии и путём применения поверхностно-активных веществ. Предотвращение воздействия микроорганизмов можно облегчить путём использования различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимеросала и тому подобного. Во многих случаях предпочтительным будет включение изотонических агентов, например, Сахаров или хлорида натрия. Пролонгированное всасывание инъекционных композиций можно осуществить путём применения в композициях агентов, замедляющих всасывание, например моностеарата алюминия и желатина.
Для парентерального введения в водном растворе, например, раствор должен быть, при необходимости, соответствующим образом забуферен, и жидкий разбавитель должен быть сначала приготовлен изотоническим с использованием достаточного количества физиологического раствора или глюкозы. Такие специфические водные растворы особенно подходят для внутривенного, внутримышечного, подкожного и интраперитонеального введения. В связи с этим в свете настоящего описания специалистам в данной области техники будет известна стерильная водная среда, которая может быть использована. Например, одну дозировку можно растворить в 1 мл изотонического раствора ЫаС1 и либо добавить к 1000 мл жидкости для введения в подкожную клетчатку, либо инъецировать в предполагаемое место инфузии (см., например, Решшдоик РДагшасеи!юа1 8с1еисе5, 15-е изд., р. 1035-1038 и 1570-1580). Обязательно будет иметь место некоторая вариация в дозировке в зависимости от состояния подвергаемого лечению субъекта. Лицо, ответственное за введение, в любом случае будет определять соответствующую дозу для индивидуального субъекта. Более того, для введения человеку препараты должны удовлетворять стандартам стерильности, пирогенности и общей безопасности и чистоты, согласно требованиям ГОА (Управление по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных препаратов) на основании стандартов для биопрепаратов.
Стерильные инъекционные растворы готовят путем введения активных соединений в необходимом количестве в соответствующий растворитель с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, при необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием. Обычно дисперсии готовят путем введения различных стерилизованных активных ингредиентов в стерильный наполнитель, содержащий основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из тех, которые перечислены выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами изготовления являются методы вакуумной сушки и лиофилизации, с помощью которых получают порошок активного ингредиента и любого дополнительного желаемого ингредиента из их предварительно стерильно отфильтрованного раствора.
Композиции, раскрытые здесь, могут быть изготовлены в нейтральной или солевой форме. Фармацевтически приемлемые соли включают соли присоединения кислоты (образованные со свободными аминогруппами белка) и которые образованы с неорганическими кислотами, такими как, например, соляная или фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и т.п. Кроме того, соли, образованные свободными карбоксильными группами, могут происходить из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и т.п. После приготовления растворы будут введены способом, совместимым с лекарственной формой, и в таком количестве, которое является терапевтически эффективным. Композиции легко вводят в разнообразных лекарственных формах, таких как инъекционные растворы, капсулы с высвобождением лекарственного средства и т.п.
Термин носитель, как он использован здесь, включает каждый и все растворители, дисперсионные среды, наполнители, покрытия, разбавители, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие всасывание агенты, буферы, растворы-носители, суспензии, коллоиды и т.п. Применение таких сред и агентов для фармацевтических активных веществ хорошо известно в данной области техники. За исключением случаев, когда любая традиционная среда или агент не совместимы с активным ингредиентом, их применение в терапевтических композициях предполагается.
- 33 024826
В композиции также могут быть включены дополнительные активные ингредиенты.
Фраза фармацевтически приемлемый относится к молекулярным структурам и композициям, которые не дают аллергической или подобной неблагоприятной реакции при введении человеку. Изготовление водной композиции, содержащей белок в качестве активного ингредиента, хорошо известно в данной области. Обычно такие композиции изготавливают в виде инъецируемых форм, либо в виде жидких растворов, либо в виде суспензий; также могут быть изготовлены твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией. Композиция также может быть эмульгирована.
3. Назальная и трансбуккальная доставка.
В некоторых воплощениях фармацевтические композиции можно доставлять посредством интраназальных спреев, трансбуккальных спреев, ингаляции и/или других приспособлений для доставки аэрозолей. Способы доставки генов, нуклеиновых кислот и пептидных композиций непосредственно в легкие, например, посредством назальных и трансбуккальных аэрозольных спреев, описаны, например, в патентах США № 5756353 и 5804212 (каждый из которых конкретно включен здесь во всей своей полноте посредством ссылки). Кроме того, в области фармацевтики также хорошо известна доставка лекарственных средств с использованием интраназальных смол в виде микрочастиц (Такепада с1 а1., 1998) и лизофосфатидил-глицериновых соединений (патент США № 5725871, конкретно включенный здесь во всей своей полноте посредством ссылки). Кроме того, трансмукозальная доставка лекарственного средства в форме основного вещества с носителем из политетрафторэтилена описана в патенте США № 5780045 (конкретно включенном здесь во всей своей полноте посредством ссылки).
4. Доставка, опосредованная липосомами, нанокапсулами и микрочастицами.
В некоторых воплощениях авторы изобретения предполагают применение липосом, нанокапсул, микрочастиц, микросфер, липидных частиц, везикул и т.п. для введения композиций по настоящему изобретению в подходящие клетки хозяина. В частности, композиции по настоящему изобретению могут быть изготовлены для доставки инкапсулированными либо в липидную частицу, либо липосому, либо везикулу, либо наносферу, либо наночастицу, либо т.п.
Такие композиции могут быть предпочтительны для введения фармацевтически приемлемых композиций нуклеиновых кислот или конструкций, раскрытых здесь. Образование и использование липосом обычно известно специалистам в данной области техники (см., например, Соттенг е1 а1., 1977; Соттеиг, 1988; Ьак1с, 1998; где описано применение липосом и нанокапсул в направленной антибиотикотерапии внутриклеточных бактериальных инфекций и заболеваний). Недавно были разработаны липосомы с улучшенными стабильностью в сыворотке и периодами полувыведения из кровотока (СаЫ/оп и РараЪаб|орои1о5, 1988; А11еп и Скопи 1987; патент США № 5741516, конкретно включенный здесь во всей своей полноте посредством ссылки). Кроме того, представлены обзоры различных способов изготовления липосомных и липосомоподобных композиций в качестве потенциальных лекарственных носителей (Такакига, 1998; Скапбгап е1 а1., 1997; МагдаШ, 1995; патенты США № 5567434; 5552157; 5565213; 5738868 и 5795587, каждый из которых конкретно включен здесь во всей своей полноте посредством ссылки).
Липосомы были успешно использованы с различными типами клеток, которые в норме резистентны к трансфекции другими методами, включая Т-клеточные суспензии, первичные культуры гепатоцитов и клетки РС 12 (Кеппе15еп е1 а1., 1990; Ми11ег е1 а1., 1990). Кроме того, липосомы не имеют ограничений по длине ДНК, которые обычны для систем доставки на основе вирусов. Липосомы были эффективно использованы для введения генов, лекарственных средств (Неа1й и Магбп, 1986; Неа1й е1 а1., 1986; Ва1а/ко\'Й5 е1 а1., 1989; Ргек1а и РидПкк 1996), радиотерапевтических агентов (Р1ки1 е1 а1., 1987), ферментов (Пши/ипи е1 а1., 1990а; йши/ипи е1 а1., 1990Ь), вирусов (Ра11ег и ВаШтоге, 1984), транскрипционных факторов и аллостерических эффекторов (№со1аи и Сегкопбе, 1979) в различные культивируемые клеточные линии и животных. Кроме того, завершено несколько успешных клинических испытаний, в которых исследована эффективность опосредованной липосомами лекарственной доставки (Ъоре/-Веге51еЙ1 е1 а1., 1985а; 1985Ь; Соипе, 1988; δαι^Γ е1 а1., 1988). Кроме того, некоторыми исследованиями доказано, что применение липосом не ассоциировано с аутоиммунными ответами, токсичностью или гонадной локализацией, как после системной доставки (Моп и Рика1ки, 1992).
Липосомы образуются из фосфолипидов, которые диспергируются в водной среде и самопроизвольно образуют мультиламеллярные концентрические бислойные везикулы (также названные мультиламеллярными везикулами (МЬУ)). Обычно МЬУ имеют диаметры от 25 нм до 4 мкм. Обработка МЬУ ультразвуком приводит к образованию небольших униламеллярных везикул (δυν) диаметрами в диапазоне 200-500 А, содержащих водный раствор в сердцевине.
Липосомы имеют сходство с клеточными мембранами и предложены для применения согласно настоящему изобретению в качестве носителей для пептидных композиций. Они подходят для широкого применения, поскольку могут захватывать вещества, растворимые как в воде, так и в липидах, т.е. в водных пространствах и внутри самого бислоя соответственно. Существует возможность использования липосом, несущих лекарственное средство, даже для сайт-специфической доставки активных агентов посредством селективной модификации липосомной композиции.
В дополнение к учению Сотгенг е1 а1. (1977; 1988) для получения липосомных композиций может
- 34 024826 быть использована следующая информация. При диспергировании в воде фосфолипиды могут образовывать ряд структур, отличающихся от липосом, в зависимости от молярного соотношения липида и воды. При низких соотношениях предпочтительной структурой является липосома. Физические характеристики липосом зависят от рН, ионной силы и присутствия двухвалентных катионов. Липосомы могут демонстрировать низкую проницаемость в отношении ионных и полярных веществ, но при повышенных температурах подвергаются фазовому переходу, который заметно изменяет их проницаемость. Фазовый переход включает изменение от плотно упакованной, упорядоченной структуры, известной как состояние геля, до слабо упакованной, менее упорядоченной структуры, известной как жидкое состояние. Это происходит при характеристической температуре фазового перехода и приводит к увеличению проницаемости в отношении ионов, сахаров и лекарственных средств.
Помимо температуры, экспозиция с белками может изменять проницаемость липосом. Некоторые растворимые белки, такие как цитохром с, связываются с двойным слоем, деформируют его и проникают через него, вызывая при этом изменения в проницаемости. Холестерин ингибирует это проникновение белков, очевидно посредством более плотной упаковки фосфолипидов. Считается, что наиболее полезные липосомные препараты для доставки антибиотиков и ингибиторов будут содержать холестерин.
Способность захватывать растворенные вещества варьирует у разных типов липосом. Например, МЬУ умеренно эффективны в отношении захвата растворенных веществ, а δυν в высшей степени неэффективны. δυν дают преимущество в гомогенности и воспроизводимости в распределении по размерам, однако, компромисс между размером и эффективностью захвата обеспечивается при использовании больших униламеллярных везикул (Ευν). Их получают путём упаривания из эфира, и они в три-четыре раза более эффективны в отношении захвата растворенных веществ по сравнению с МБ-ν.
В дополнение к липосомным характеристикам, важной детерминантой в захвате соединений являются физико-химические свойства самого соединения. Полярные соединения захватываются в водных пространствах, а неполярные соединения связываются с липидным бислоем везикулы. Полярные соединения высвобождаются путем проникновения или при разрушении бислоя, а неполярные соединения остаются соединенными с бислоем пока он не разрушится под действием температуры или экспозиции с липопротеинами. Оба типа демонстрируют максимальные скорости истечения при температуре фазового перехода.
Липосомы взаимодействуют с клетками посредством четырех разных механизмов: эндоцитоза фагоцитарными клетками ретикулоэндотелиальной системы, такими как макрофаги и нейтрофилы; адсорбции на клеточной поверхности либо под действием неспецифических слабых гидрофобных или электростатических сил, либо путем специфических взаимодействий с компонентами клеточной поверхности; слияния с плазматической клеточной мембраной путем вставки липидного бислоя липосомы в плазматическую мембрану с одновременным высвобождением содержимого липосомы в цитоплазму; и путем переноса липосомных липидов в клеточные или субклеточные мембраны или наоборот без какой-либо ассоциации с содержимым липосом. Часто бывает трудно определить, какой механизм действует, и в одно и то же время может действовать более чем один механизм.
Судьба и место размещения внутривенно инъецируемых липосом зависит от их физических свойств, таких как размер, текучесть и поверхностный заряд. Они могут персистировать в тканях в течение часов или суток в зависимости от своего состава, а полупериоды существования в крови изменяются в диапазоне от минут до нескольких часов. Более крупные липосомы, такие как МБ-ν и Ευν, быстро захватываются фагоцитарными клетками ретикулоэндотелиальной системы, однако физиология системы кровообращения ограничивает выход таких больших разновидностей в большинство мест. Они могут выйти только в местах, где имеются большие отверстия или поры в эндотелии капилляров, таких как синусоидные капилляры печени или селезёнки. Поэтому эти органы являются предпочтительным местом захвата. С другой стороны, δυν демонстрируют более широкое распределение в тканях, но накапливаются все же в высокой степени в печени и селезёнке. Обычно такое поведение ш νί\Ό ограничивает возможную направленную доставку липосом только теми органами и тканями, которые доступны для их большого размера. Они включают кровь, печень, селезёнку, спинной мозг и лимфоидные органы.
Вообще, направленная доставка не является ограничением в контексте настоящего изобретения. Однако при необходимости специфической направленной доставки должны быть выполнены способы, доступные для этой цели. Можно использовать антитела для связывания с поверхностью липосомы и для направления антитела и её лекарственных составляющих к специфическим антигенным рецепторам, расположенным на поверхности конкретного клеточного типа. Также можно использовать углеводные детерминанты (гликопротеиновые или гликолипидные компоненты клеточной поверхности, которые играют роль в межклеточном распознавании, взаимодействии и адгезии) в качестве сайтов узнавания, поскольку они обладают способностью направлять липосомы к конкретным типам клеток. В основном подразумевают, что будет использоваться внутривенная инъекция липосомных препаратов, однако другие пути введения также возможны.
Альтернативно, согласно изобретению предложены фармацевтически приемлемые нанокапсулярные препараты композиций по настоящему изобретению. Обычно нанокапсулы могут захватывать соединения стабильным и воспроизводимым образом (Ηеη^у-М^сЬе11аиά е! а1., 1987; Оит1апаг-Сиеггего е!
- 35 024826 а1., 1998; Эопд1а8 е! а1., 1987). Во избежание побочных эффектов, обусловленных внутриклеточной полимерной перегрузкой, необходимо конструировать такие ультрамелкие частицы (размером около 0,1 мкм) с использованием полимеров, способных разлагаться ш νί\Ό. Предполагается, что биоразлагаемые полиалкилцианоакрилатные наночастицы, которые удовлетворяют этим требованиям, подходят для применения в настоящем изобретении. Такие частицы могут быть легко изготовлены, как описано (Соиугеиг е! а1., 1980; 1988; /иг МиН1еп е! а1., 1998; 2атЬаи\ е! аг 1998; Р^п!ο-Α1рЬапб^у е! а1., 1995 и патент США № 5145684, конкретно включенные здесь во всей своей полноте посредством ссылки).
Для чрескожной доставки также могут быть использованы трансдермальные пластыри.
Иммуногенные композиции.
В некоторых предпочтительных воплощениях настоящего изобретения предложены иммуногенные композиции. Обычно иммуногенные композиции будут содержать один или более полипептидов или полинуклеотидов, таких как описаны выше, в комбинации с иммуностимулятором. Иммуностимулятор может представлять собой любое вещество, которое усиливает или потенцирует иммунный ответ (антительный и/или клеточно-опосредованный) на экзогенный антиген. Примеры иммуностимуляторов включают адъюванты, биоразлагаемые микросферы (например, галактид полимера молочной кислоты) и липосомы (в которые включено соединение; см., например, Ри11епоп, патент США № 4235877).
Изготовление иммуногенных композиций в целом описано, например, в Ро\\е11 & Уеитап, е! а1., Уассше Эе81дп (субъединичный и адъювантный подход) (1995). Фармацевтические композиции и иммуногенные композиции, включенные в объем настоящего изобретения, также могут содержать другие соединения, которые могут быть биологически активными или неактивными. Например, в фармацевтической или иммуногенной композиции может присутствовать один или более чем один иммуногенный участок других антигенов М.!иЬегси1о818, либо встроенных в слитый полипептид или в виде отдельного соединения.
Приведенные в качестве иллюстрации иммуногенные композиции могут содержать полинуклеотид (например, ДНК), кодирующий один или более полипептидов, которые описаны выше, так что полипептид образуется ш 8Йи (тем самым вызывая иммунный ответ). Как отмечено выше, ДНК может находиться в любой из множества систем доставки, известных средним специалистам в данной области, включая экспрессирующие системы на основе нуклеиновых кислот, бактериальные и вирусные экспрессирующие системы. Многочисленные методы генной доставки общеизвестны в данной области, как, например, описанные в Ро11апб, Сп! Реν. ТНегар. Эгид Сатег δу8!ет8, 15:143-198 (1998) и приведенных там ссылках. Соответствующие экспрессирующие системы на основе нуклеиновых кислот содержат необходимые последовательности ДНК для экспрессии у пациента (такие как подходящий промотор и сигнал терминации). Бактериальные системы доставки включают введение бактериальной клетки-хозяина (например, штамм МусоЬас!егшт, ВасШи8 или Рас!оЬасШи8, включая бациллу Кальметта-Герена (ВасШп8-Са1те11еОиеггш) или Ьас!ососси8 1ас!18), которая экспрессирует полипептид (например, на своей клеточной поверхности или секретирует данный полипептид) (см., например, Реггета, е! а1., Αιι. Αсаб Вга8. Шепс. (2005), 77:113-124 и РаНа, е! а1., Αрр1. МюгоЬю1. Вю!есНпо1. (2005), РиЬМеб ГО 15635459). В предпочтительном воплощении ДНК может быть введена с использованием вирусной экспрессирующей системы (например, вируса коровьей оспы или другого поксвируса, ретровируса или аденовируса), которая может включать применение непатогенного (дефектного), компетентного по репликации вируса. Подходящие системы раскрыты, например, в р18Нег-НосН е! а1., Ргос. №л1. Αсаб. δα. υδΑ, 86:317-321 (1989); Р1е\пег е! а1., Αηп. КУ. Αсаб. 8сг, 569:86-103 (1989); Р1е\пег е! а1., Уассше, 8:17-21 (1990); патентах США № 4603112, 4769330 и 5017487; \\'0 89/01973; патенте США № 4777127; СВ 2200651; ΕР 0345242; \С0 91/02805; Вегкпег, Вю!есНшдие8, 6:616-627 (1988); Ро8епГе1б е! а1., δ^ι^, 252:431-434 (1991); Ко118 е! а1., Ргос. №ιΐ1. Αсаб δ^.. υδΑ, 91:215-219 (1994); ^88^18^ е! а1., Ргос. №ιΐ1. Αсаб. δΜ. υδΑ, 90:1149811502 (1993); Сш/таи е! а1., Сиси1а!юп, 88:2838-2848 (1993); и Сш/таи е! а1., Сй. Ре8., 73:1202-1207 (1993). Методы включения ДНК в такие экспрессирующие системы хорошо известны средним специалистам в данной области техники. ДНК также может быть голой, как описано, например, в и1тег е! а1., δ^ι^, 259:1745-1749 (1993) и рассмотрено в обзоре СоНеп, δ^ι^, 259:1691-1692 (1993). Захват голой ДНК может быть увеличен путем нанесения покрытия ДНК на биоразлагаемые гранулы, которые эффективно транспортируются в клетки. Очевидно, что иммуногенная композиция может содержать и полинуклеотидный, и полипептидный компонент. Такая иммуногенная композиция может обеспечивать повышенный иммунный ответ.
Очевидно, что иммуногенная композиция может содержать фармацевтически приемлемые соли полинуклеотидов и полипептидов, предложенных здесь. Такие соли могут быть получены из фармацевтически приемлемых нетоксичных оснований, включая органические основания (например, соли первичных, вторичных и третичных аминов и основных аминокислот) и неорганические основания (например, натриевые, калиевые, литиевые, аммониевые, кальциевые и магниевые соли).
Поскольку в иммуногенных композициях по данному изобретению может быть использован любой подходящий носитель, известный средним специалистам в данной области, тип носителя будет варьировать в зависимости от способа введения. Композиции по настоящему изобретению могут быть изготовлены для любого подходящего способа введения, включая, например, местное, пероральное, назальное,
- 36 024826 внутривенное, интракраниальное, интраперитонеальное, подкожное или внутримышечное введение. Для парентерального введения, такого как подкожная инъекция, носитель предпочтительно содержит воду, физиологический раствор, спирт, жир, воск или буфер. Для перорального введения могут быть использованы любые из приведенных выше носителей или твердый носитель, такой как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза и карбонат магния. Биоразлагаемые микросферы (например, полилактат-полигликолят) также могут быть использованы в качестве носителей для фармацевтических композиций по данному изобретению. Подходящие биоразлагаемые микросферы раскрыты, например, в патентах США № 4897268, 5075109, 5928647, 5811128, 5820883, 5853763, 5814344 и 5942252. Также может быть использован носитель, содержащий комплексы частиц с белками, описанные в патенте США № 5928647, которые способны индуцировать ограниченные классом I ответы цитотоксических Т-лимфоцитов у хозяина.
Такие композиции также могут содержать буферы (например, нейтральный забуференный физиологический раствор или забуференный фосфатом физиологический раствор), углеводы (например, глюкозу, маннозу, сахарозу или декстраны), маннит, белки, полипептиды или аминокислоты, такие как глицин, антиоксиданты, бактериостатические вещества, хелатирующие агенты, такие как ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или глутатион, адъюванты (например, гидроксид алюминия), растворенные вещества, которые делают композицию изотонической, гипотонической или слабо гипертонической относительно крови реципиента, суспендирующие агенты, загустители и/или консерванты. Альтернативно, композиции по настоящему изобретению могут быть изготовлены в виде лиофилизата. Соединения также могут быть инкапсулированы в липосомы с использованием хорошо известной технологии.
Любой из различных иммуностимуляторов может быть использован в иммуногенных композициях по данному изобретению. Например, может быть включен адъювант. Большинство адъювантов содержат вещество, предназначенное для защиты антигена от быстрого катаболизма, такое как гидроксид алюминия или минеральное масло, и стимулятор иммунных ответов, такой как липид А, ВойабеПа рег1икк1к или виды МусоЬас!егшт или белки, происходящие из МусоЬас!егшт. Например, может быть использован делипидизированный, дегликолипидизированный М.уассае (рУас). Подходящие адъюванты имеются в продаже, например, неполный адъювант и полный адъювант Фрейнда (Эйсо ЬаЬога!опек, □еРой, М1); адъювант 65 от Мегск (Мегск апб Сотрапу, 1пс., КаЬгау, N1); А801В, А802А, А815, А8-2 и их производные (О1ахо8тбЬК1те, РЬбабе1рШа, РА); С\У8 (остов клеточной стенки из туберкулезной бациллы), ТОМ (дикориномиколат трегалозы), ЬеГ (фактор инициации элонгации лейшманий), соли алюминия, такие как гель гидроксида алюминия (квасцы) или фосфат алюминия; соли кальция, железа или цинка; нерастворимая суспензия ацилированного тирозина; ацилированные сахара; катионные или анионные производные полисахаридов; полифосфазены; биоразлагаемые микросферы; монофосфориллипид А (МРЬ®) и 0ш1 А (например, 08-21). В качестве адъювантов также могут быть использованы цитокины, такие как ОМ-С8Р (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор) или интерлейкин-2, -7 или -12.
Термин адъювант относится к компонентам в вакцинной или терапевтической композиции, которые повышают специфический иммунный ответ на антиген (см., например, Ебе1тап, ΆΙΌ8 Кек. Нит. РеЦоЛгикек, 8:1409-1411 (1992)). Адъюванты индуцируют иммунные ответы ТЬ1-типа и ТЬ-2-типа. Цитокины ТЬ1-типа (например, ΙΡΝ-γ, 1Ь-2 и 1Ь-12) имеют тенденцию благоприятно влиять на индукцию клеточно-опосредованного иммунного ответа на вводимый антиген, тогда как цитокины ТЬ2-типа (например, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6 и Ш-10) имеют тенденцию благоприятно влиять на индукцию гуморальных иммунных ответов. Адъюванты, способные к предпочтительной стимуляции ТЬ-1 клеточноопосредованного иммунного ответа, описаны в \УО 94/00153 и \УО 95/17209.
В иммуногенных композициях, предложенных здесь, адъювантная композиция предпочтительно сконструирована для индукции иммунного ответа преимущественно ТЬ1-типа. После применения иммуногенной композиции как предложено здесь, пациент обычно будет поддерживать иммунный ответ, который включает ответы ТЬ1- и ТЬ2-типов. В предпочтительном воплощении, когда ответ представляет собой преимущественно ответ ТЬ1-типа, уровень цитокинов ТЬ1-типа будет повышаться в большей степени, чем уровень цитокинов ТЬ2-типа. Уровни этих цитокинов можно легко оценить с использованием стандартных методов анализа. Для обзора семейств цитокинов см. 1апе\уау,е1 а1., 1ттипоЬю1оду, 5-е изд., 2001.
Композиции на основе Ку3616с обычно содержат один или более чем один адъювант, например, А801В (3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А (3О-МРЬ®) и 0821 в липосомном препарате; см. публикацию патента США № 2003/0143240); А802А (3О-МРЬ® и 0821 и эмульсию типа масло-в-воде; см. Во_)ап§, е! а1., Ьапсе! (2001), 358:1927); ЕNΗΆNΖΥN® (ЭеЮ.х); 3О-МРЬ®; сапонины, в том числе 0ш1 А и его компоненты, например 0821 и миметики сапонинов; С\У8 (остов клеточной стенки из туберкулезной бациллы), ТОМ (дикориномиколат трегалозы), аминоалкилгликозаминид-4-фосфаты (АОР); иммуностимулирующие олигонуклеотиды, например СРО; ЬетГ (фактор инициации элонгации лейшманий) и их производные. В предпочтительном воплощении полипептид Ку3616с вводят с одним или более чем одним адъювантом, выбранным из группы, состоящей из 3П-МРЬ® и 0821 в липосомном препарате,
- 37 024826 например, А801В, и 3^-МΡ^® и 0821 и эмульсии типа масло-в-воде (например, А802А). Адъювантные системы А801В и А802А также описаны в Ρ^сЬуаη§ки1, е1 а1., Vасс^ηе (2004), 22:3831-40.
Если доставку антигена Ку3616с осуществляют в виде нуклеиновой кислоты, то он может быть доставлен, например, в вирусном векторе (то есть, аденовирусном векторе) или в мутантной бактериальной клетке-хозяине (то есть, мутантной, авирулентной клетке-хозяине МусоЪас1егшт, ЬасЮЪасШик или ВасШик, включая бациллу Кальметта-Герена (БЦЖ) и ЬасЮсоссик 1асбк).
Предпочтительные адъюванты для применения с целью индукции преимущественно ответа ТЬ1-типа включают, например, комбинацию монофосфориллипида А (МБЬ®), предпочтительно 3-О-деацилированного монофосфориллипида А (3^-МΡ^®), возможно с солью алюминия (см., например, КтЫ, е1 а1., 1986, 1ттипо1оду апб 1ттипорЬагтасо1оду оГ Вас1епа1 ЕпбоЮхшк, Ρ1еηит ЬиЫ. Согр., ΝΥ, р. 407-419; ОВ 2122204В; ОВ 2220211 и патент США № 4912094). Предпочтительная форма находится в виде эмульсии, имеющей небольшой размер частиц, менее 0,2 мм в диаметре, и способы ее изготовления раскрыты в \УО 94/21292. Водные композиции, содержащие монофосфориллипид А и поверхностно-активное вещество, были описаны в \УО 98/43670. Типичные предпочтительные адъюванты включают А801В (МЬЕ® и 0821 в липосомном препарате), 3^-МΡ^® и 0821 в липосомном препарате, А802А (МЬЕ®® и 0821 и эмульсию типа масло-в-воде), 3^-МΡ^® и 0821 и эмульсию типа масло-в-воде и А815, доступные от О1ахо8тйЬК1ше. Адъюванты на основе МЬЕ® доступны от
О1ахо8тбЬК1ше (см. патенты США № 4436727, 4877611, 4866034 и 4912094).
СрО-содержащие олигонуклеотиды (в которых динуклеотид СрО не метилирован) также индуцируют преимущественно ТЬ1-ответ. СрО представляет собой аббревиатуру для цитозин-гуанозиновых динуклеотидных мотивов, присутствующих в ДНК. Такие олигонуклеотиды хорошо известны и описаны, например, в \УО 96/02555, \УО 99/33488 и патентах США № 6008200 и 5856462. Ииммуностимуляторные последовательности ДНК также описаны, например, в 8а1о е1 а1., 8аепсе, 273:352 (1996). СрО, когда он приготовлен в виде иммуногенных композиций, обычно вводят в свободном виде в растворе вместе со свободным антигеном (\УО 96/02555; МсС'1ик1бе апб Оау1к, выше), или ковалентно конъюгированным с антигеном (\УО 98/16247), или приготовлен в виде препарата с носителем, таким как гидроксид алюминия ((поверхностный антиген вируса гепатита) Оа\ак е1 а1., выше; Вга/о1о1-МП1ап е1 а1., Ьгос. Ν·ιΐ1. Асаб. 8с1. И8А, 1998, 95(26), 15553-8). СрО известен в данной области как адъювант, который можно вводить как системно, так и через слизистую оболочку (\УО 96/02555, ЕР 468520, Оа\ак е1 а1., ί. 1ттипо1, 1998, 160(2):870-876; МсС1икк1е апб ΙΕπικ, I., 1ттипо1., 1998, 161(9):4463-6).
Другим предпочтительным адъювантом является сапонин или миметики либо производные сапонина, такие как Ош1 А, предпочтительно 0821 (Ацш1а ВюрЬагтасеибса1к 1пс., РгатгпдЬат, МА), которые могут быть использованы по отдельности или в комбинации с другими адъювантами. Например, усиленная система включает комбинацию монофосфориллипида А ^ΡΕ·®) и производного сапонина, такую как комбинация 0821 и .ΙΌ-νΕΕ®, как описано в \УО 94/00153, или менее реактогенную композицию, где 0821 погашен холестерином, как описано в \УО 96/33739. Другие предпочтительные композиции содержат эмульсию типа масло-в-воде и токоферол. Особенно сильнодействующая адъювантная композиция, включающая 0821, 3^-МΡ^® и токоферол в эмульсии типа масло-в-воде, описана в \УО 95/17210. Дополнительные сапониновые адъюванты для применения в настоящем изобретении включают 087 (описанный в \УО 96/33739 и \УО 96/11711) и 0817 (описанный в патенте США № 5057540 и ЕР 0362279 В1).
Альтернативно, сапониновые композиции могут быть скомбинированы с наполнителями для вакцин, в состав которых входит хитозан или другие поликатионные полимеры, частицы полилактида и сополимера полилактид-со-гликолид, полимерная матрица на основе поли-^ацетилглюкозамина, частицы, составленные из полисахаридов или химически модифицированных полисахаридов, липосомы и частицы на основе липидов, частицы, составленные из сложных моноэфиров глицерина и т.д. Сапонины также могут быть приготовлены в присутствии холестерина с образованием дисперсных структур, таких как липосомы или 18СОМ®. Более того, сапонины могут быть приготовлены вместе с простым или сложным эфиром полиоксиэтилена, либо в растворе, не содержащем частиц, либо в суспензии или в дисперсной структуре, такой как олиголамеллярная (раисбате1аг) липосома или 18СОМ® (иммуностимулирующий комплекс). Сапонины также могут быть приготовлены в виде препарата с такими эксципиентами как СΑΚВОΡО^®, для увеличения вязкости, или могут быть приготовлены в сухой порошковой форме с порошковым эксципиентом, таким как лактоза.
В одном воплощении адъювантная система включает комбинацию монофосфориллипида А и производного сапонина, такую как комбинация 0821 и адъюванта 3^-МΡ^®, которая описана в \УО 94/00153, или менее реактогенную композицию, где 0821 погашен холестерин-содержащими липосомами, как описано в \УО 96/33739. Другие подходящие композиции содержат эмульсию типа масло-вводе и токоферол. Другая подходящая адъювантная композиция, в которой используют 0821, адъювант 3^-МΡ^® и токоферол в эмульсии типа масло-в-воде, описана в \УО 95/17210.
- 38 024826
Другая усиленная адъювантная система включает комбинацию Ср0-содержащего олигонуклеотида и производного сапонина, в частности комбинацию Ср0 и ЦЗ21 как раскрыто в А0 00/09159. Удобно, когда композиция дополнительно содержит эмульсию типа масло-в-вводе и токоферол.
Другие предпочтительные адъюванты включают М0НТЛ№0Е® Ι3Λ 720 (Зеррю, Ргапсе), ЗАР (СЫгоп, СаПРотта, Иш!ей З!а!е8), ЦС0МЗ® (СЗЬ), МР-59 (СЫгоп), адъюванты серии ЗВАЗ (ЗтйЬКйпе ВеесЬат, К1хеп8аг1, Ве1дшт), ЭеЮх (Сопха), КС-529 (Сопха) и другие аминоалкилглюкозаминид-4фосфаты (А0Р), как, например, описанные в находящихся на рассмотрении заявках на патент США № 08/853826 и 09/074720, описания которых включены здесь во всей своей полноте посредством ссылки, и адъюванты на основе простого эфира полиоксиэтилена, как, например, описанные в А0 99/52549А1. В настоящее время ЗтПЬКЬпе ВеесЬат и Сопха Согрогайоп входят в 01ахоЗтЬЬК1ше.
Другие подходящие адъюванты включают молекулы адъюванта общей формулы (Ι):
Н0(СН2СН20)п-А-К, где п равно 1-50;
А представляет собой связь или -С(0)-;
К представляет собой С^оалкил или фенил-С^оалкил.
Другим представляющим интерес адъювантом является Ь-цепь шига-токсина, использованная, например, как описано в А0 2005/112991.
В одном воплощении настоящего изобретения представлена иммуногенная композиция, содержащая полиоксиэтиленовый простой эфир общей формулы (Ι), где п равен 1-50, предпочтительно 4-24, наиболее предпочтительно 9; компонент К представляет собой С1.50, предпочтительно С4-20алкил и наиболее предпочтительно С^алкил и А представляет собой связь. Концентрация полиоксиэтиленовых простых эфиров должна быть в диапазоне 0,1-20%, предпочтительно 0,1-10% и наиболее предпочтительно в диапазоне 0,1-1%. Предпочтительные полиоксиэтиленовые простые эфиры выбраны из следующей группы: полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-9-стеариловый эфир, полиоксиэтилен-8стеариловый эфир, полиоксиэтилен-4-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-35-лауриловый эфир и полиоксиэтилен-23-лауриловый эфир. Полиоксиэтиленовые простые эфиры, как, например, полиоксиэтиленлауриловый эфир, описаны в Мегск шйех (Справочник именных реакций в органической химии) (12-е изд.: запись 7717). Эти адъювантные молекулы описаны в А0 99/52549.
Любая иммуногенная композиция, предложенная здесь, может быть изготовлена с использованием хорошо известных способов, которые приводят к получению комбинации антигена, усилителя иммунного ответа и подходящего носителя или эксципиента. Композиции, изложенные здесь, могут быть введены в виде части препарата с непрерывным высвобождением (т.е. такого препарата, как капсула, губка или гель (состоящие, например, из полисахаридов), который обеспечивает медленное высвобождение соединения после введения). Как правило, такие препараты можно изготовить, используя хорошо известную технологию (см., например, СоотЬе8 е! а1., Уассте, 14:1429-1438 (1996)), и вводить, например, перорально, ректально или подкожной имплантацией либо путем имплантации в желаемое целевое место. Композиции с непрерывным высвобождением могут содержать полипептид, полинуклеотид или антитело, распределенные в матриксе-носителе и/или содержащиеся в резервуаре, окруженном мембраной, контролирующей скорость высвобождения.
Носители для применения в таких композициях являются биологически совместимыми и также могут быть биоразлагаемыми; предпочтительно композиция обеспечивает относительно постоянный уровень высвобождения активных компонентов. Такие носители включают микрочастицы из сополимера поли(лактид-со-гликолид), полиакрилата, латекса, крахмала, целлюлозы, декстрана и т.п. Другие носители замедленного высвобождения включают надмолекулярные биовекторы, которые содержат нежидкое гидрофильное ядро (например, поперечно-сшитый полисахарид или олигосахарид) и, возможно, внешний слой, содержащий амфифильное соединение, такое как фосфолипид (см., например, патент США № 5151254 и заявки РСТ А0 94/20078, А0 94/23701 и А0 96/06638). Количество активного соединения, содержащегося в препарате с непрерывным высвобождением, зависит от места имплантации, скорости и ожидаемой продолжительности высвобождения.
Любое из множества средств доставки можно использовать в фармацевтических композициях и иммуногенных композициях для того, чтобы облегчить получение антигенспецифического иммунного ответа. Средства доставки включают антигенпредставляющие клетки (АРС), такие как дендритные клетки, макрофаги, В-клетки, моноциты и другие клетки, которые могут быть использованы для конструирования эффективных АРС. Такие клетки могут быть, но не обязательно, генетически модифицированными для увеличения способности презентировать антиген, для улучшения активации и/или поддержания Тклеточного ответа и/или чтобы быть иммунологически совместимыми с получателем (т.е. соответствовать НЬА гаплотипу). АРС обычно могут быть выделены из любых различных биологических жидкостей и органов и могут представлять собой аутологические, аллогенные, сингенные или ксеногенные клетки.
В некоторых предпочтительных воплощениях настоящего изобретения в качестве антигенпредставляющих клеток используют дендритные клетки или их клетки-предшественники. Дендритные клетки являются высоко эффективными АРС (ВапсЬетеаи & З!ештап, №!ите, 392:245-251 (1998)), и показано,
- 39 024826 что они эффективны в качестве физиологического адъюванта для индукции профилактического или терапевтического иммунитета (см. Тйнтегтап & Ьеуу, Апп. Кеу. Меб., 50:507-529 (1999)). Обычно дендритные клетки можно идентифицировать на основании их типичной формы (звездообразной ш 8Йи, с заметными цитоплазматическими отростками (дендритами), видимыми ш уйго), их способности захватывать, процессировать и представлять антигены с высокой эффективностью и их способности активировать ответы наивных Т-клеток. Несомненно, дендритные клетки могут быть сконструированы для экспрессии специфических рецепторов или лигандов клеточной поверхности, которые обычно не обнаруживаются на дендритных клетках ш У1уо или ех У1уо, и такие модифицированные дендритные клетки предложены в настоящем изобретении. В качестве альтернативы дендритным клеткам в иммуногенной композиции могут быть использованы секретируемые везикулы нагруженных антигеном дендритных клеток (называемые экзосомами) (см. 2йуоде1 е! а1., №Циге Меб., 4:594-600 (1998)).
Дендритные клетки и их клетки-предшественники могут быть получены из периферической крови, спинного мозга, лимфатических узлов, селезёнки, кожи, пуповинной крови или любой другой подходящей ткани или жидкости. Например, дендритные клетки могут быть дифференцированы ех У1уо путем добавления комбинации цитокинов, таких как ОМ-СδΡ, 1Ь-4, 1Ь-13 и/или ΊΝΡα, к культурам моноцитов, полученных из периферической крови. Альтернативно, СО34-позитивные клетки, собранные из периферической крови, пуповинной крови или спинного мозга, могут быть дифференцированы в дендритные клетки путем добавления к культуральной среде комбинаций ОМ-СδΡ, 1Ь-3, ТОТа, лиганда СЭ40, ΕΓδ (липополисахарид), лиганда £Й3 и/или другого(их) соединения(ий), которые индуцируют дифференцировку, созревание и пролиферацию дендритных клеток.
Дендритные клетки удобно разделить на такие категории, как незрелые и зрелые клетки, что позволяет просто различать два хорошо охарактеризованных фенотипа. Однако эту номенклатуру не следует толковать как исключающую все возможные промежуточные стадии дифференцировки. Незрелые дендритные клетки характеризуются как АРС с высокой эффективностью к захвату и процессингу антигенов, что коррелирует с высоким уровнем экспрессии Ρсγ-рецептора и маннозного рецептора. Зрелый фенотип обычно характеризуется низким уровнем экспрессии этих маркеров, но высоким уровнем экспрессии молекул клеточной поверхности, ответственных за активацию Т-клеток, таких как молекулы класса I и класса II МНС (главного комплекса гистосовместимости), молекулы адгезии (например, СО54 и СЭ11) и костимуляторные молекулы (например, СЭ40, СЭ80, СЭ86 и 4-1ВВ).
Обычно АРС могут быть трансфицированы полинуклеотидом, кодирующим белок (или его участок или другой вариант), так что полипептид экспрессируется на клеточной поверхности. Такая трансфекция может иметь место ех У1уо, и фармацевтическая композиция или иммуногенная композиция, содержащие такие трансфицированные клетки, затем могут быть использованы, как изложено здесь. Альтернативно, пациенту может быть введено средство для доставки гена, нацеленное на дендритную или другую антигенпредставляющую клетку, что приводит к трансфекции, которая имеет место ш У1уо. Трансфекция дендритных клеток ш У1уо и ех У1уо обычно может быть, например, осуществлена с использованием любых способов, известных в данной области, таких как описанные в νϋ 97/24447, или подхода с применением генной пушки, описанного в Майу1 е! а1., 1ттипо1оду апб Се11 В1о1оду, 75:456-460 (1997). Загрузки дендритных клеток антигенами можно добиться посредством инкубации дендритных клеток или клеток-предшественников с полипептидом, ДНК (голой или в составе плазмидного вектора) или РНК; либо с антиген-экспрессирующими рекомбинантными бактериями или вирусами (например, векторами на основе вируса коровьей оспы, вируса птичьей оспы, аденовируса или лентивируса). Перед загрузкой полипептид может быть ковалентно конъюгирован с иммунологическим партнером, который обеспечивает помощь Т-клеток (например, с молекулой-носителем). Альтернативно, дендритную клетку можно подвергнуть импульсному воздействию неконъюгированного иммунологического партнера, отдельно или в присутствии полипептида.
Иммуногенные композиции и фармацевтические композиции могут быть представлены в однодозовых или многодозовых контейнерах, таких как запаянные ампулы или герметично укупоренные флаконы. Такие контейнеры предпочтительно герметично укупорены для сохранения стерильности композиции вплоть до применения. Как правило, композиции можно хранить в виде суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных наполнителях. Альтернативно, иммуногенную композицию или фармацевтическую композицию можно хранить в лиофилизированном состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя непосредственно перед применением.
В некоторых воплощениях за примированием или первым введением полипептида Ку3616с (включая варианты, иммуногенные фрагменты или слитые белки) или полинуклеотида, кодирующего указанный полипептид, следует одна или более бустер-иммунизаций или последующех введений полипептида Ку3616с (включая варианты, иммуногенные фрагменты или слитые белки) или полинуклеотида, кодирующего указанный полипептид (способ примирования и бустер-иммунизации). Например, за первым введением полипептида Ку3616с (включая варианты, иммуногенные фрагменты или слитые белки) или полинуклеотида, кодирующего указанный полипептид, следуют одно или более чем одно последующее введение полипептида Ку3616с (включая варианты, иммуногенные фрагменты или слитые
- 40 024826 белки) или полинуклеотида, кодирующего указанный полипептид.
В одном воплощении за первым введением полипептида Рν3616с или кодирующего его полинуклеотида следует одно или более чем одно последующее введение полипептида Ку3616с. В одном воплощении за первым введением полипептида Рν3616с или кодирующего его полинуклеотида следует одно или более чем одно последующее введение полинуклеотида, кодирующего Ку3616с. Обычно первое или примирующее введение и второе или бустинг-введение выполняют с интервалом приблизительно 2-12 недель или с интервалом вплоть до 4-6 месяцев. Последующие бустер-введения выполняют с интервалом примерно 6 месяцев или с интервалом 1, 2, 3, 4 или 5 лет. Традиционная бустинг-обработка (например, примирующее введение белка с последующим бустинг-введением белка) также может быть полезна в предупреждении или лечении туберкулеза (например, в предупреждении или лечении латентного туберкулеза, в частности предупреждении или замедлении реактивации туберкулеза).
Антитела.
Антитело относится к полипептиду, содержащему каркасную область, кодируемую иммуноглобулиновым геном, или ее фрагменты, который специфически связывает и распознает антиген. Известные иммуноглобулиновые гены включают гены константных областей каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон и мю, а также несметное количество генов вариабельных областей иммуноглобулинов. Легкие цепи классифицируют как либо каппа, либо лямбда. Тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, которые, в свою очередь, определяют классы иммуноглобулинов 1дС, 1дМ, 1дА, Ι§Ό и 1дЕ соответственно.
Типичная структурная единица иммуноглобулина (антитела) представляет собой тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, при этом каждая пара имеет одну легкую (приблизительно 25 «Да) и одну тяжелую цепь (приблизительно 50-70 кДа). Ν-конец каждой цепи определяет вариабельную область приблизительно из 100-110 или более аминокислот, главным образом ответственную за распознавание антигена. Термины вариабельная легкая цепь (Уц) и вариабельная тяжелая цепь (УН) относятся соответственно к этим легким и тяжелым цепям.
Антитела существуют, например, в виде интактных иммуноглобулинов или в виде множества хорошо охарактеризованных фрагментов, полученных в результате расщепления различными пептидазами. Так, например, пепсин расщепляет антитело ниже дисульфидных связей в шарнирной области с получением Р(аЬ)'2, димера РаЬ, который сам по себе представляет собой легкую цепь, соединенную с УН-СН1 посредством дисульфидной связи. Р(аЬ)'2 можно восстановить в мягких условиях с разрывом дисульфидной связи в шарнирной области, превращая при этом димер Р(аЬ)'2 в мономер РаЬ'. Мономер РаЬ', по существу, представляет собой РаЬ с частью шарнирной области (см. Риибашеи1а1 1шшиио1о§у (Раи1 еб., 3-е изд. 1993)). Несмотря на то что различные фрагменты антитела определяют в терминах расщепления интактного антитела, специалисту будет очевидно, что такие фрагменты можно синтезировать бе иονο или химически, или с использованием методологии рекомбинантной ДНК. Таким образом, термин антитело, как он использован здесь, также включает в себя фрагменты антител, либо полученные в результате модификации целых антител, либо синтезированные бе иονο с использованием методологий рекомбинантной ДНК (например, одноцепочечный фрагмент Ρν), либо идентифицированные с использованием библиотек фагового дисплея (см., например, МсСаГГеДу е! а1., №!иге, 348:552-554(1990)).
Для получения моноклональных или поликлональных антител можно использовать любой известный в данной области метод (см., например, КоЫег & МП51еп1, МШие, 256:495-497 (1975); Ко/Ьог е! а1., 1шшиио1о§у Тобау, 4:72 (1983); Со1е е! а1., р. 77-96 в Моиос1оиа1 АиДЬоб1е5 аиб Саисег ТЬегару (1985)). Методы получения одноцепочечных антител (патент США 4946778) могут быть адаптированы для получения антител к полипептидам по данному изобретению. Кроме того, для экспрессии гуманизированных антител могут быть использованы трансгенные мыши или другие организмы, например, другие млекопитающие. Альтернативно, для идентификации антител и гетеромерных РаЬ-фрагментов, которые специфически связывают выбранные антигены, может быть использована технология фагового дисплея (см., например, МсСаГГеДу е! а1., №!иге, 348:552-554 (1990); Магк5 е! а1., В1о!есЬио1о§у, 10:779-783 (1992)).
Фраза специфически (или селективно) связывается с антителом или специфически (или селективно) иммунореактивен в отношении, когда касается белка или пептида, относится к реакции связывания, которая определяет присутствие белка в гетерогенной популяции белков и других биологических молекул. Таким образом, в разработанных условиях иммуноанализа специфические антитела связываются с конкретным белком по меньшей мере в два раза большем количестве по сравнению с фоном и, по существу, не связываются в значительном количестве с другими белками, присутствующими в образце. Для специфического связывания с антителом в таких условиях может потребоваться антитело, отобранное по его специфичности к конкретному белку. Например, среди поликлональных антител, индуцированных в ответ на слитые белки, можно отобрать только те поликпональные антитела, которые специфически иммунореактивны в отношении слитого белка, а не в отношении индивидуальных компонентов слитых белков. Этот отбор может быть осуществлен путем исключения антител, дающих перекрестную реакцию с индивидуальными антигенами. Для отбора антител, специфически иммунореактивных в отношении конкретного белка, можно использовать ряд иммунологических форматов. Например, для отбора антител, специфически иммунореактивных в отношении белка, обычно используют твердофазные
- 41 024826
ЕЫ8А (твердофазный иммуноферментный анализ) иммуноанализы (см., например, Наг1оу & Ьапе, АпЬЬоЛек, А ЬаЬога!огу Мапиа1 (1988) и Икшд АпЬЬоЛек: А ЬаЬога!огу Мапиа1 (1998) для описания иммуноаналитических форматов и условий, которые могут быть использованы для определения специфической иммунореактивности). Обычно специфическое или селективное взаимодействие должно по меньшей мере в два раза превышать фоновый сигнал или шум и в более типичных случаях превышать фон больше чем в 10, 20 или 100 раз (например, связывание с другими микобактериальными белками, такими как другие белки МусоЬас!егшт !иЬегси1о515). Диагностические средства.
В другом аспекте согласно данному изобретению предложены способы применения одного или более чем одного из полипептидов, описанных выше, для диагностики латентного туберкулеза (например, с использованием основанных на Т-клеточном ответе анализов или основанных на применении антител анализов традиционного формата).
Например, предложен способ определения предшествующей инфекции М.!иЬегси1о515 у индивидуума, включающий:
(а) получение образца отданного индивидуума;
(б) приведение указанного образца в контакт с выделенным полипептидом, содержащим:
(1) последовательность белка Ку3616с, (2) вариант последовательности белка Ку3616с или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ку3616с;
(в) количественное определение ответа образца.
Образец, может представлять собой, например, цельную кровь или очищенные клетки. Удобно, если образец будет содержать мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС). В одном воплощении изобретения индивидуум будет серопозитивным. Во втором воплощении изобретения индивидуум будет серонегативным.
Удобно, если индивидуум не будет являться предварительно вакцинированным против инфекции, вызываемой М.!иЬегси1о515 (например, удобно, если индивидуум не будет являться предварительно вакцинированным БЦЖ).
Ответ образца можно количественно измерить целым рядом способов, известных специалистам в данной области, включая мониторинг пролиферации лимфоцитов или продуцирование специфических цитокинов или антител. Например, ЕЫ8Р0Т (иммуноферментный спот-анализ) Т-клеток можно использовать для мониторинга таких цитокинов, как интерферон-γ (ГРИу), интерлейкин 2 (ГЬ2) и интерлейкин 5 (ГЬ5). ЕЬЬГ8Р0Т-анализ В-клеток можно использовать для мониторинга стимуляции специфических антигенов М.!иЬегси1о515. Клеточный ответ также можно охарактеризовать, применяя внутри- и внеклеточное окрашивание и анализ на проточном цитометре.
Способы количественного определения пролиферативного ответа образца включают:
(1) импульсную обработку культивированных клеток радиоактивной меткой (например, меченным тритием тимидином) и мониторинг захвата трития (например, с использованием газового сцинтилляционного счетчика);
(2) мечение сукцинимидиловым эфиром карбоксифлуоресцеин-диацетата (СР8Е) и мониторинг клеточного деления по флуоресценции с использованием проточной цитометрии.
Количественное определение цитокинового ответа образца включает, в частности, мониторинг продуцирования γ-интерферона.
При использовании таких способов количественного определения положительный ответ на антиген может быть определен по соотношению сигнала и шума (соотношение 8/№), составляющему по меньшей мере 2:1 (например, по меньшей мере 3:1 или по меньшей мере 5:1).
В другом аспекте настоящего изобретения предложены способы диагностики инфекции, вызываемой М.!иЬегси1о515, с использованием кожной пробы. Термин кожная проба, как он использован здесь, представляет собой любой анализ, проведенный непосредственно на пациенте, в котором измеряют реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ИТН) (как, например, набухание, покраснение или дерматит) после внутрикожной инъекции полипептида Ку153с, как описано выше (или его варианта, иммуногенных фрагментов или нуклеотидов, кодирующих их). Такую инъекцию можно осуществить, используя любое подходящее устройство, обеспечивающее приведение в контакт антигенной комбинации с клетками кожи пациента, такое как туберкулиновый шприц или шприц на 1 мл. Реакцию измеряют по окончании периода времени, например по меньшей мере 48 ч после инъекции, в частности 48-72 ч.
Реакция ИТН представляет собой клеточно-опосредованный иммунный ответ, который оказывается более сильным у пациентов, которые ранее подвергались воздействию тестируемого антигена. Такой ответ можно измерить визуально, используя линейку. В общем случае, ответ, превышающий примерно 0,5 см в диаметре, особенно превышающий примерно 1,0 см в диаметре, представляет собой положительный ответ, указывая на наличие предшествующей инфекции М.!иЬегси1о515, что может проявляться или не проявляться в форме активного заболевания.
Для применения в кожной пробе компонент Ку3616с подходящим образом изготовлен в виде фармацевтической композиции, содержащей физиологически приемлемый носитель. Соответственно носи- 42 024826 телем, используемым в таких фармацевтических композициях, является физиологический раствор с соответствующими консервантами, такими как фенол и/или ГОуеем 80™.
Кроме того, согласно настоящему изобретению предложены наборы для применения в любом из вышеупомянутых диагностических способов. Такие наборы обычно содержат два или более чем два компонента, необходимых для проведения диагностического анализа. Такими компонентами могут быть соединения, реагенты, контейнеры и/или оборудование.
Например, один контейнер в наборе может содержать моноклональное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с белком. Такие антитела или фрагменты могут быть предложены присоединенными к веществу-носителю, как описано выше. Один или более дополнительных контейнеров могут содержать в себе элементы, такие как реагенты или буферы, для использования в анализе. Такие наборы могут также, или альтернативно, содержать детектирующий реагент как описанно выше, который содержит репортерную группу, подходящую для прямой или непрямой детекции связывания антител.
Альтернативно, набор может быть разработан для детекции уровня мРНК, кодирующей белок в биологическом образце. Такие наборы обычно содержат по меньшей мере один олигонуклеотидный зонд или праймер, как описано выше, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим белок. Такой олигонуклеотид можно использовать, например, в анализе с использованием ПЦР или гибридизационном анализе. Дополнительные компоненты, которые могут присутствовать в таких наборах, включают второй олигонуклеотид и/или диагностический реагент или контейнер для облегчения детекции полинуклеотида, кодирующего белок по изобретению.
Другие диагностические наборы включают наборы, разработанные для детекции клеточноопосредованных ответов (которые, например, могут быть использованы в диагностических способах по настоящему изобретению). Такие наборы обычно содержат:
(1) устройство для получения соответствующего образца клеток от субъекта;
(2) средства для стимуляции указанного образца клеток полипептидом Ку3616с (или его вариантом, его иммуногенными фрагментами или ДНК, кодирующей такие полипептиды);
(3) средства для детекции или количественного определения клеточного ответа на стимуляцию.
Подходящие средства для количественного определения клеточного ответа включают набор для
Е^I8Р0Τ-анализа В-клеток или альтернативно набор для Е^I8Р0Τ-анализа Τ-клеток, которые известны специалистам в данной области техники.
Один возможный набор содержит:
(а) полипептид по изобретению; и (б) детектирующий реагент, подходящий для прямой или непрямой детекции связывания с антителом.
Особый интерес представляют диагностические наборы, специально разработанные для количественного определения Τ-клеточных ответов.
Диагностический набор, содержащий:
(а) полипептид по изобретению и (б) устройство, обеспечивающее приведение указанного полипептида в контакт с клетками кожи индивидуума.
Диагностический набор, содержащий:
(а) полипептид по изобретению;
(б) устройство, обеспечивающее приведение указанного полипептида в контакт с образцом (например, с цельной кровью или более удобно с РВМС), взятым у индивидуума; и (в) средства для количественного определения Τ-клеточного ответа (например, пролиферации или продукции ΓΡ^γ).
Примеры
Следующие примеры предложены лишь с целью иллюстрации и не являются ограничивающими. Специалисты в данной области техники без труда найдут разнообразные некритические параметры, которые могут быть изменены или модифицированы с получением, по существу, аналогичных результатов.
Пример 1. Идентификация Ку3616с в качестве мишени для вакцины против латентного ΤВ.
Ген Ку3616с кодирует консервативный гипотетический богатый остатками аланина и глицина белок.
Ку3616с был выбран на основании полногеномного анализа генов МусоЬас1егшт 1иЬегси1о818, ассоциированных с поддержанием стадии покоя и инфекционности, как описано в МигрЬу апб Вго\уп, ВМС. Ыес! Όίδ., 2007, 7:84-99. Возможные гены-мишени стадии покоя у МусоЬас1егшт 1иЬегси1о818 были ранжированы в результате проведения биоинформационного мета-анализа опубликованных наборов данных, полученных с использованием полногеномного анализа ДНК на микрочипах, по экспрессии бактериальных генов в искусственно созданных условиях покоя. Далее, для всего генома была проведена субклеточная локализация кодируемых генами белков МЛиЬегси1о818 для идентификации мишеней вакцины.
- 43 024826
Этап 1. Вкратце, экспериментальные условия в моделях покоя были весьма разнообразны, поэтому была разработана система оценки баллов от нуля до пяти для нормирования этих данных на основе двух критериев: 1) соответствия экспериментальных условий состоянию покоя и 2) рангового порядка экспрессии. Максимальный балл для конкретного экспериментального набора данных устанавливался на основании возможного соответствия клинической встречаемости фазы покоя инфекции М.!иЪегси1оз1з. В табл. 1 показаны наборы данных, собранных для этапа 1, вместе с установленным максимальным баллом для каждого набора данных. Дополнительные наборы данных по значимости генов для роста получали из опубликованных исследований, в которых применялись эксперименты по нокауту генов, основанные на использовании транспозонов (Тга8Н). Генам, которые не оказывали никакого эффекта на рост, присваивали балл равный нулю.
Таблица 1
Источники, экспериментальные модели и критерии оценки для экспрессии генов М.!иЪегси1оз1з с использованием анализа ДНК на микрочипах и полногеномного генного нокаута (значимость фазы роста)
Ссылка Экспериментальная модель Временная точка: максимальный балл’
Вейз 1С, е/а/. Голодание в условиях 96 ч: 3
Мо1. МйгоЫо1., 2002,43: 717-731 контроля Ог 24 ч: 2 4 ч: 1
НатрзМге Τ, βί а/. Истощение питательных 62 и 75 сут: 5
ТиЬегси10513 (Ед:пР), 2004, веществ в условиях контроля 49 сут: 4
84: 228-238 о2 18 сут: 2
Мийиситаги ОС βί а/. ТиЬвгси1оз13 (ЕсПлЬ.), 2004, Модель гипоксии Вейна ’ 14 сут (ΝΒΡ-2): 4 7 сут (ΝΠΡ-1): 2
84: 239-246
1/озкиП ΜΙ, βί а/. ТиЬегси1оз13 (ЕсНпЬ.), 2004, 84: 218-227 Модель гипоксии Вейна г 30 И 80 сут: 5 14 и 20 сут: 4 10 и 12 сут: 3 6 И 8 сут: 2
8сНпарр1пдег ϋ, βί а/. 4. Ехр. Ме<1., 2003, 198: Инфекция мышиных макрофагов, +Ζ- γ-ΙΝΡ 24 и 48 ч: 5
693-704
Кагакоиз13 РС, е1а1. 4. Ехр. Мес!., 2004, 200: 647-657 Подкожный имплантат на основе полых волокон у мышей 10 сут: 3
Та1аа( АМ, βί а/. Ргос. Λίθίί. АсзФ 5с/. и.З.А., Инфекция мышей. МТВ, полученный из легкогоь 28 сут: 3
2004, 101:4602-4607
ЗаззеИ СМ, βί а1. Мо1. МкгоЫо!., 2003, 48: 77-84 Тга5Н мутированные библиотеки, выращенные на твердых средах 14 сут: 5
Репдага]ап ϋ βί βί. Ргос. ΝβίΙ. Асад. 5с/. и. 5.А., 2005, 102: 8327-8332 Инфекция мышиных макрофагов, Ч-у-ΐΝΡ с ТгаЗН мутированными библиотеками М. (иЬэгси1оз13 7 сут: 5
ЗаззеФ СМ βί а/. Ргос. Ыа(1. Аса<4. За. и.З.А. 2003, 100: 12989-12994 С57ВЦ63 мыши, инфицированные ТгаЗН мутированными библиотеками М. 1иЬегси1оз1з 7, 14, 28 и 56 сут: 5
а Максимальный балл основанный на релевантности в качестве модели покоя; ч = час; сут = сутки.
Ъ Соотношение М.1иЪегси1оз1з из легкого Ва1Ъ/с и МТВ в аэрируемой культуре для 28 сут.
# УУампе Ь.О. апб Науез Ь.О-., 1пТес!. 1ттип., 1996, 64: 2062-2069.
- 44 024826
Этап 2. При применении второго критерия, рангового порядка генной экспрессии, баллы генов из каждого набора данных были упорядочены от наивысшего до самого низкого на основании экспрессионного соотношения (кратность экспрессии в экспериментальных условиях относительно экспрессии в клетках в логарифмической фазе культуры в жидкой среде). Ген с наивысшим рангом получал максимальный балл для этого конкретного набора данных (перечислены в колонке 3 табл. 1 (например, 5, 4, ..., 1)). Балл уменьшали на 0,005 единицы для каждого гена по порядку вплоть до нуля или до достижения конца набора данных. Таким образом, когда максимальный балл составлял 4 единицы, 100-й по рангу ген получил бы балл 3,500. Для максимального балла в 5 единиц 1000 генов или 25% генома М.!иЬегси1ок1К получили балл. Для экспериментов, в которых собирали данные для нескольких временных точек, в качестве окончательного балла использовали максимальный балл по всем временным точкам.
На этапе 3 баллы для каждого гена в каждом из экспериментальных условий вводили в базу данных МкгокоГ! Ассекк. Для облегчения установления приоритетов добавляли ссылочные поля, такие как КеГкес.] ГО, СепЬапк Гипсйоп, СепЬапк по!е, ТиЬегсийк! с1аккШса!юп и КЕСС и 8апдег Сеп!ег Ппкк. Путем комбинирования данных из различных исследований и источников было достигнуто единодушное мнение относительно конкретных генов и путей, наиболее важных для выживания в состоянии покоя.
На этапе 4 с использованием 400 генов с наивысшим рангом (~10% генома) был получен список приоритетных терапевтических мишеней, дополненный результатами экспертного вычислительного и ручного анализа биохимических путей, энзимологии, удобства манипулирования лекарственным средством, гомологии с генами человека и другим предшествующим уровнем техники. Подавляющее большинство высокоранжированных генов получаются из подмножества, где две или три группы пересекаются.
На этапе 5 была проведена идентификация субклеточной локализации кодируемых генами белков М.!иЬегси1ок1к на целом геноме. Эвристическая процедура, использованная для предсказания мембранных белков, описана в СПа1кег е! а1., ί. Вас!егю1., 2001, 183:1259-1268. Усредненные профили гидрофобности (Н) (моп Неупе С, ί. Мо1. Вю1., 1992, 225:487-494) получали с использованием индексов гидрофобности по СЕ8 (Со1йтап-Епде1тап-81еП/) (Епде1тап ОМ е! а1., Аппи. Кем. ВюрПук. ВюрЬук. СПет., 1986, 15:321-353), взвешенных с использованием окна трапеции (1гаре/о1й \утйо\у). С использованием способа, аналогичного начальным этапам алгоритма ТорРгей II (С1агок М.С. е! а1., Сотри! Арр1. Вюкск, 1994, 10:685-686), для каждой пептидной последовательности были предсказаны спиральные трансмембранные сегменты (ТМ8) посредством отбора 19 аминокислот с центром с наивысшим индексом Н (МахН), защиты их от дальнейшего рассмотрения и повторения процесса до тех пор, пока не останется пиков с Н>0,5. Субклеточные места локализации определяли на основании величины пика МахН, числа сегментов с Н>1,0 и распределения величин пика Н предполагаемых ТМ8. Порог МахН равный 1,15 был выбран, чтобы максимизировать различие между двумя тестовыми наборами данных 8\У1ккРго1ет ге1еаке 34, содержащими трансмембранные и цитоплазматические белки, соответственно (Воуй Ό., е! а1., Рго!еш 8с1., 1998, 7:201-205). Белки с МахН<1,15 классифицировали как цитоплазматические, тогда как белки с МахН>1,15 и по меньшей мере тремя возможными ТМ8 классифицировали как мембранные белки. Заякоренные белки определяли как имеющие строго два ТМ8, один из которых начинается перед аминокислотой (аа) 35 и один из которых имеет Н>1,15, а другой имеет Н не ниже 0,5. Специально для М.Ьас!егшт использовали 81диа1Р с параметрами для грамположительных бактерий с целью идентификации секретируемых белков среди белков, классифицируемых в эвристическом анализе или как цитоплазматические, или как неизвестные (№е1кеп Н., е! а1. Рго!еш Епд., 1997, 10:1-6).
К\'3616с получил очень высокий ранг в качестве вакцинного антигена согласно нескольким критериям:
(1) Ρν3616с неизменно активирован во всех моделях покоя. Среди всего набора из 3999 генов, оцененных в мета-анализе, Р\'3616с был ранжирован в первом квартиле сверхэкспрессируемых генов во всех моделях состояния покоя. Балл активации для К\'3616с составил 6,52, что является благоприятным по сравнению с наивысшим баллом для генов, составляющим 22,28;
(2) Βν3616с ранжирован как имеющий высокую значимость для выживания в модели инфекции селезёнки мыши (оценивается в 4,945 балла из возможных 5);
(3) предсказание внутриклеточной локализации говорит о том, что белок К\'3616с является мембраносвязанным белком и, следовательно, значительно экспонирован вне клетки, что указывает на его пригодность в качестве мишени для вакцины;
(4) К\'3616с может вызывать защитный ответ против начального контрольного заражения туберкулезом;
(5) Βν3616с характеризуется высоким уровнем распознавания в качестве антигена.
- 45 024826
Пример 2. Предсказание эпитопов Ку3616с.
Способ.
Предсказание Т-клеточных эпитопов было основано на следующих подходах.
Прогноз Название иКЦунифицированный указатель ресурса)/Ссылки
С04 и СЭ8 МиШргей вебсайт: ап||деп.|2г.а-з1аг.ейи.зд/ппи11|ргей/ гПапд, О.1_., КП ап, А.М., ЗпМуазап, Κ.Ν., Аидиз1, Й.Т. апй Вгиз1С, V. (2005) “М1Л.Т1РКЕО: а сотри1айопа1 зуз1ет Тог ргеМсйоп οί ргот1зсиоиз НЬА Ыпсйпд рерййез” 14ис1е1с Асйв Рев. 33, ννΐ72 - ννΐ79.
5УМНС вебсайт: млоту-ЬзлМогтайк.ипЦиеЬюдеп.йе/ЗУМНС “Ргей1сйоп οί МНС с1азв 1 кнпйтд рерййез, изтд ЗУМНС.” Ριθγγθ Ооппез апй Агпе ΕΙοίεΒοη ίη: ВМС В|О1п(огтайсз, 2002, 3: 25.
СО4 РгоРгей аебсайт: τιραλν 1гг1есп ге5.1л/гадНауа/ргоргес1/ 5|пдЬ, Н. алс! РадЬауа, С.Р.5. (2001) “РгоРгеб: РгесЛсНоп οί ΗίΑ-ϋΡ Ь1псйпд зкез”. ВкнпГогтаИсз, 17(12), 1236-37.
Τβρί1ορβ2 Программа собственной разработки на основе: Н. В|ап, й. Наттег (2004) “ϋίΒοονθίγ οί ргоггнзсиоиз Н1_А-11-гез1пс(ей Т-се11 ерЛорез ννίίΗ ΤΕΡΙΤΟΡΕ.” Мейюйз, 34:468-75.
СЭ8 пНЬА вебсайт: ют\ла/дт1есН.гез.(п/гздЬауа/пЫаргей/ ВМаз1п М. апй КадПауа О.Р.З. (2006) “А ПуЬпй арргоаоП Тог ргей!сйпд ргоггйвсиоиз МНС с1авз 1 гез1пс1ей Т-се11 ерИорез”; й. Βίοβοί., 32: 31-42.
ΝείΟΤί вебсайт: м™.сЬз.й1и.йк/5ерлсезЛЙе1СТи “Ап 1п1едгайуе арргоасй (о СТ1_ ергйре ргейкйоп. А сотЫпей а1дог№т 1л4едгаЦпд МНС-1 Ыпйтд, ТАР 1гапзроЛ еКй1епсу апй ргоГеазота! с1еауаде ргей1сйопз. 1_агееп МУ, йипйедаагй С., Казрег ЬатЬейЬ, Вииз 5., Вгипак 3„ Ьипй О. апй ΝίβΙββπ М. Еигореап йоигпа! οί 1ттипо1оду. 35(8): 2295-303, 2005.
Ерцеп вебсайт: тлт^деппег.ас.ик/ЕрУеп/ Воу1сИ'|Поуа, 1. А., Р. Оиап, ϋ. К. Р|ом/ег. Ер'1Йеп: а ββινβΓίοΓ ти1й-в1ер Т-се11 ерИоре ргей1сйоп. ВМС ВМп/огтаИсз, 2006, 7, 131.
ЗуТреНЫ вебсайт: «лп™,зу1ре11М,йе/5сг1р1з/МНС5егуег,й11/ЕрИ:ореРгейюйоп, Мт Напз-Сеогд Каттепзее, йийа ВасПтапп, №е1з И|ко1аиз Еттепсй, Озкаг А1ехапйег Васйог, 31е(ап δίενβηονίο: “3ΥΡΡΕΙΤΗΙ: йа(аЬазе Тог МНС Ндапйз апй рерййе то1йз. |ттиподепейсз (1999) 50. 213-219.
- 46 024826
Результаты.
РгеОТАР вебсайт: апИдеп.12г.а-з1аг.ес1и.зд/ргес1ТАР/
гМапд, СХ,, РеГгодаку, Ν., Κννοίι, С.К., АидизГ,1Т. апб Вги51с, V. (2006) “ΡΡΕϋΤΑΡ: а зузГет Гог ргесИсйоп оГ рерМе ЫпсНпд (о (Пе питал ГгапзроИег а550С1а(еР ν/ίΐή апйдеп ргосезз'тд. 1ттипоте Рев. 2(1), 3,
РАРКОС вебсайт: \утт.раргос2.с1е/раргос1/раргос1.И1т1 С, КиШет, А.К, НиззЬаит, Т.Р. 0:ск, Н.-С. Каттепзее, Н. 8сЫИ, К.Р. На6е1ег, “Ап а1доп1Мт Гог ГМе ргесПсГюп оГ ргоГеааота! с1еауадез, 1, ΜοΙ. ΒίοΙ. 298 (2000), 417-429. А.К. МивзЬаит, С. Кийег, К.Р. На6е1ег, Н.-С. Каттепзее, Н. ЗсГГМ, “Р АРгоС: А РгесПсйоп А1доп1Ът Гог Рго(еазота1 С1еауадез ауаНаЫе оп 1Пе ΙΜΛΜΓ, 1ттиподепеисз, 53 (2001), 87-94.
Предсказанные человеческие СЭ4' Т-клеточные эпитопы Ну3616с
Таблица 2
Номер предсказанного СЭ4 эпитопа Положение амино- кислоты Последова- тельность эпитопа ЗЕОГОЫо: ΗίΑ аллель
1 5 Р1ЮРТ13А 5ΕΟ ΙΟ Νο: 29 ϋΚΒ1 0301, ϋΚΒ1 0401, ΟΡΒ1 1101
2 31 ΧΥ83Ι-ΕΥΡ δΕΟ Ю Νο: 30 ϋΚΒ1 0301
3 36 Ι ΕΥΡΕΚΑΙ Ε ЗЕО Ю Νο: 31 ϋΡίΒΙ 1301
4 53 ΥΑΟΚΝΡΝΗν ЗЕО ГО Νο: 32 ϋΡΒ1 0801
5 67 иНСХЗАМАУ 3ΕΟ ΙΟ Νο: 33 ϋΒΒ1 0301, ϋΚΒ1 0401
г 111 РУРРУАУО!. δΕΟ Ю Νο: 34 ΟΚΒ1 0101
7 119 ΓΓΥΙΡννΟΗ ЗЕО Ю Νο: 35 ϋΚΒ1 0401
В 121 γίρνναΗΑΐ- 5Ε0 ΙΟ Νο: 36 ϋΚΒ1 0101
9 151 ΥίννΚΤίΙΝ ЗЕО Ю Νο: 37 ΩΡΒ1 0401
10 152 ίννΚΤίΙΝΑ 3ΕΟ ΙΟ Νο: 38 ΟΚΒ1 1301
11 154 νΚΤΙΙΝΑΤΰ ЗЕО Ю Νο: 39 ϋΚΒ1 0401
12 164 ίΚΙΧΑΚΙΑΕ ЗЕО Ю Νο: 40 ϋΚΒ1 0301, ϋΚΒ1 0801, ΟΡΒ1 1101, ϋΚΒ1 1301
13 173 ΕΥΑΑΑΙΑΟΙ ЗЕО Ю Νο: 41 ϋΚΒ1 0301, ϋΡΒ1 1101, 0ΚΒ1 1301
14 181 ΙΙΒΟνΑβΙΙ ЗЕО Ю Νο: 42 ϋΡΒ1 0301
15 197 ννΕΡΙΤΝΑΙΝ ЗЕО Ю Νο: 43 ϋΚΒ1 0401
16 252 ίΡΟΑΑΟίΒΑ ЗЕО Ю Νο: 44 ΟΚΒ1 1501
17 264 Ι ΑΗΑ03ίΑ3 8Ε0 Ю Νο: 45 ϋΚΒ1 0401
18 270 ЬАЗЗАЗЬРА ЗЕО Ю Νο: 46 ϋΚΒ1 0401
19 288 ροεΐΡ3ίΑα 8ΕΟ ΙΟ Νο. 47 ΟΡΒ1 0401
- 47 024826
Предсказанные человеческие СЭ8' Τ-клеточные эпитопы Ку3616с
Таблица 3
Номер предсказанного С08 эпитопа Положение амино- кислоты Последова- тельность эпитопа 5ΕΟ ΙΟ Νο: ΗίΑ аллель
1 5 Р1ЮРТ18А ЗЕО Ю Νο: 48 Α2
2 6 ΙΙΟΡΤΙ3ΑΙ ЗЕО ГО Νο: 49 Α 0101, Α2
3 9 РТ15АГОС1. ЗЕО Ю Νο: 50 Α2, Α 0201, Β7, Β8
4 10 Т15АЮеЬУ ЗЕО Ю Νο: 51 Α1, Α 0101, Α3,Α 0301
5 12 ЗАЮСЬУОЬ ЗЕО Ю Νο: 52 Α2, В 3501
6 13 ΑΙΙΧ3Ι Υ0Ι Ι ЗЕО Ю Νο: 53 Α 0101, Α 0201, Β44
7 17 1 уои С1С1 ЗЕО !□ Νο. 54 Α24
3 25 ΙΡΝΟΘΘΙΙ,Υ ЗЕО Ю Νο: 55 Β7, Α 0101, В 3501, Β51
9 30 ΘΙίΥδδίΕΥ ЗЕО Ю Νο: 56 Α1, Α 0101, Α3. Α 0301
10 33 УЗЗЬЕУРЕК 3ΕΟ ΙΟ Νο: 57 Α1, Α 0301
11 35 5Ι_ΕΥΡΕΚΑΙ_ ЗЕО Ю Νο: 58 Α_0201, Β7, С»_0401, Си/ 0602
12 38 ΥΡΕΚΑΙ,ΕΕΙ- ЗЕО Ю Νο: 59 Α24, А 2402, Β8, С'Л 0401, Си/ 0602
13 39 ΡΕΚΑίΕΕίΑ 3ΕΟ ΙΟ Νο: 60 В44, В 4403
14 69 ΝΗνΝΡΡΟΕί ЗЕО Ю Νο: 61 А24, Си/ 0602
15 76 ΕίΑΟίϋΒΟί ЗЕО Ю Νο: 62 А 0201
16 77 ίΑϋίΟΚΟίΙ ЗЕО Ю Νο: 63 А 0101, В51
17 79 ΟίϋΚΟίΐεί ЗЕО Ю Νο: 64 А 0101, А 0201
13 80 иэкаизи ЗЕО Ю Νο: 65 А24, В7, В51
19 94 ΑνΟΤΤΒϋΙί ЗЕО Ιϋ Νο: 66 В7
20 103 ΕΘΑΚΚΘίΕΡ 3ΕΟ ΙΟ Νο. 67 А24, В7
21 107 ΚΘίΕΡνΚΡν ЗЕО Ю Νο: 68 А 0201, В51
22 108 ΟίΕΡνΚΡνΑ ЗЕО Ю Νο: 69 Α 0101,А 0301
23 109 ίΕΡνΡΡνΑν ЗЕО Ю Νο: 70 В44
24 111 ΡνΡΡνΑνΟί ЗЕО Ю Νο: 71 В7, В8, В 3501
25 113 РРУАУОСТУ ЗЕО Ю Νο: 72 В7, А 0101, В 3501, В51
26 116 ΑνϋίΤΥΙΡν ЗЕО Ю Νο: 73 А2, А 0201
27 120 ΤΥΙΡννΘΗΑ ЗЕО Ю Νο: 74 А24
23 121 ΥΙΡ\Λ/ΘΗΑί ЗЕО Ю Νο: 75 А 0101, А2, А 0201, В7, В8
29 129 ίδΑΑΡΟΑΡΡ ЗЕО Ю Νο: 76 А1, В7, В 3501
30 130 ЗААРОАРРС ЗЕО Ю Νο: 77 А 0201
31 131 ААРОАРРСА ЗЕО Ю Νο: 78 А 0301, В 3501
- 48 024826
32 133 РОАРРСАСА ЗЕО ГО Νο: 79 А2, А 0201
33 135 АРРСАСАМА 5Ε0 ΙΟ Νο. 80 В7, В 3501
34 136 РРСАСАМАУ ЗЕО ГО Νο: 81 АЗ
35 141 ΑΜΑννΟΘΑί ЗЕО ГО Νο: 82 А2, А 0201, А24, В7
36 143 ΑννΟΟΑίΛΥ ЗЕО ГО Νο: 83 А1,АЗ, А 0301, В7
37 147 <3ΑίΑΥΙ ννΚ ЗЕО ГО Νο: 84 АЗ, А 0301
38 149 ίΑΥίννΚΤί ЗЕО ГО Νο: 85 В8, В44, В51
39 150 ΑΥίννΚΤΙΙ ЗЕО ГО Νο: 86 А24
40 155 ΚΤύΙΝΑΤΟί ЗЕО ГО Νο: 87 А 0201, А2, А 0301, А24
41 156 ΤΈΙΝΑΤαΐ,Ι- ЗЕО ГО Νο: 88 А2, А 0201, АЗ, А 0101, Ст 0401
42 158 ΙΝΑΤΟΙίΚί ЗЕО ГО Νο: 89 В7, В8, Ст 0602
43 159 ΝΑΤ<ΧΙ.ΚΙ_Ι- ЗЕО ГО Νο: 90 А 2402, В7, В 3501, В44, Ст 0401, Ст 0602
44 162 αιχιαίΑκι. ЗЕО ГО Νο: 91 А2, А 0201, А 0301, А 2402, В8, Ст 0401, Ст 0602
45 165 ΚίίΑΚίΑΕί ЗЕО ГО Νο: 92 А2, А 0201, А 0301, В7, В8, Ст 0602
46 166 ίίΑΚίΑΕίν ЗЕО ГО Νο: 93 А2, А 0201, А 0101, В8
47 169 ΚΙΛΕΙΑ/ΛΑΑ ЗЕО ГО Νο: 94 А2
43 170 ίΑΕί,νΑΑΑΙ ЗЕО ГО Νο: 95 Α1, А24, В51
49 173 ίΛ/ΑΑΑΙΑϋΙ ЗЕО ГО Νο: 96 В7, В51
50 177 ΑΙΑϋΙΙδϋν ЗЕО ГО Νο: 97 А2, А 0201, Ст 0602
51 178 ΙΑϋΙΙ3ϋνΑ ЗЕО ГО Νο: 96 А 0101, В 3501
52 182 ΙδϋνΑϋΙΙΚ ЗЕО ГО Νο: 99 А1,А 0301
53 192 ΤίΟΕννΥΕΡΙ ЗЕО ГО Νο: 100 А2, А 0201
54 199 ΡΙΤΝΑίΝΟΟ ЗЕО ГО Νο: 101 А2
55 202 ΝΑΙ_ΝΟΙ_ΚΕΙ- ЗЕО ГО Νο: 102 В51, А 2402, В_3501, Ст 0602
56 213 ΚίΤΟνννΤΘί ЗЕО ΙΟ Νο: 103 А2, А 0201
57 214 ίταννντΘίΡ ЗЕО ГО Νο: 104 А1,А 0101, А24
58 225 ΟΙΛ/δΝίΕδΡΡ ЗЕО ΙΟ Νο: 105 А24
59 228 ΝίΕδΡΡΑΟν ЗЕО ГО Νο: 106 А2, А 0201
60 231 δΡΡΑΟνΡΟί ЗЕО ΙΟ Νο: 107 А2, А 0201, А24, Ст 0401
61 238 СкТСАТЗСЬ ЗЕО ГО Νο: 108 А2, А 0201
62 246 ίβΟνΤΟίΡΟ ЗЕО ГО Νο: 109 А1, В8
63 247 δΟνΤΘΕΡΟΑ ЗЕО ГО Νο: 110 А2
64 258 Ι,δΑδδΟίΑΗ ЗЕО ΙΟ Νο: 111 А1, АЗ, В7, В8
65 260 АЗЗС1АНАО ЗЕО ГО Νο:112 А1, АЗ, А 0301
66 262 ЗС1-АНАО31. ЗЕО ГО Νο: 113 А 0201
67 263 ΟίΑΗΑϋδΙΑ ЗЕО ΙΟ Νο: 114 А 0101, А 0201, А 0301
68 269 3Ι Α58Α5Ι Ρ 5ЕО ГО Νο: 115 А 0201, А 0301
69 271 АЗЗАЗЕРАЬ ЗЕО ГО Νο.116 — -В7-
70 286 ЗСРСС1-Р31. ЗЕО ГО Νο: 117 А2, А 0201, В51
71 291 ЬР51 АС(УНА ЗЕО ГО Νο. 118 В7, В 3501, В51
72 298 НААЗТРОАЬ ЗЕО ГО Νο: 119 В7, ΒΘ, В 3501
73 301 ЗТКОАЬРРР ЗЕО ГО Νο: 120 АЗ, А 0301
74 307 ΡΡΚΑΟΟΡνΟ ЗЕО ГО Νο 121 В7, В 0702, В8, В51
75 319 ЕОУССОЗО!. ЗЕО ГО Νο: 122 В7, В44
76 350 САЗКСТТТК ЗЕО ГО Νο: 123 АЗ, А 0301
77 351 А5КСТТТКК ЗЕО ГО Νο: 124 АЗ, А 0301
78 353 КСТТТККУЗ ЗЕО ГО Νο: 125 А 0301, В8
79 368 ΤΕϋΑΕΚΑΡν ЗЕО ГО Νο: 126 В44
Как можно видеть из табл. 2 и 3, Р\'3616с содержит целый ряд предсказанных СЭ4' и СЭ8 Тклеточных эпитопов. Кроме того, на основании этой информации предполагают, что белок несет эпитопы, которые могут распознаваться НЬА, встречающимися по всему миру (т.е. НЬА у представителей белой европеоидной расы, Африки, Азии или Латинской Америки - см. веб-сайт \у\у\у.а11е1еГгес|иепс1е5.пе1).
Пример 3. Идентификация эпитопов Р\'3616с.
Набор из 30 перекрывающихся пептидов, охватывающих полноразмерный Р\'3616с, (для подробного изучения см. фиг. 1 и δΕφ ΙΌ N0: 127-156) был приготовлен и протестирован по способности этих пептидов стимулировать РВМС от четырех РРО+ доноров.
Из данных, показанных на фиг. 2, ясно, что пептиды 1-7 и 17-30 были иммуногенными для этих индивидуумов.
Следует отметить, что пептиды 8-16 (аминокислотные остатки 92-215) могут быть иммуногенными для других индивидуумов другого НЬА-типа.
- 49 024826
Пример 4. Гомологии Η37Κν.
Последовательности Ку3616с из целого ряда штаммов МбиЬегси1о818 и БЦЖ идентифицировали, используя систему поиска В^А8ΤΡ ΟеηВаηк (инвентарный номер эталонной последовательности Η37Κν NР_218133.1):
Штамм Инвентарный номер % идентичности
СЦС1551 ΝΡ 338263.1 99
Р11 ΥΡ_001289574.1 99
Нааг1ет ΖΡ_02248979.1 99
С ΖΡ_00877472.1 99
БЦЖ ΥΡ_979759.1 99
Выравнивание гомологичных последовательностей указывает на высокий уровень идентичности.
Биологические анализы.
Количественное определение Τ-клеточных ответов на Ку3616с.
Можно провести скрининг полипептидов по их способности активировать Τ-клетки (индукцию пролиферации и/или продуцирование цитокинов) в мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС) или в препаратах цельной крови от инфицированных (например, пораженных латентной инфекцией) индивидуумов.
Пораженных латентной инфекцией индивидуумов обычно идентифицируют по кожной пробе, которая имеет диаметр более 10 мм и протекает бессимптомно, при отсутствии положительного ответа на М1Ь (М1иЬегси1о818) в посеве, при отрицательном ответе мокроты и при отсутствии какого-либо поражения (по результатам рентгенограммы грудной клетки).
Можно использовать ряд анализов ίη уНго, основанных на применении образцов РВМС или цельной крови: после рестимуляции в присутствии антигена (или его варианта/иммуногенного фрагмента, как целесообразно) можно определить пролиферацию клеток (как измерено с использованием СР8Е/проточной цитометрии) или количественно оценить продуцирование цитокинов (присутствующих в супернатанте культивируемых клеток и измеренных посредством ЕЬ18А, или, после внутриклеточного окрашивания СЭ4 и СЭ8 Τ-клеток и анализа посредством проточной цитометрии).
Например, образцы РВМС можно получить из гепаринизированной цельной крови центрифугированием в градиенте плотности фиколл/гипак, следуя стандартным процедурам. Затем клетки можно промыть и заморозить в жидком азоте до проведения тестирования (для дополнительных деталей см. Ьакаш А. е1 а1. ί. ШГесЕ ϋΐδ., 1999, 180:1656-1664).
Τ-клеточная пролиферация.
Специфический иммунный ответ можно охарактеризовать путём проведения анализа пролиферации лимфоцитов с использованием меченного тритием тимидина. В этом методе оценивают размножение клеток после стимуляции антигеном ίη νίίΐΌ. На практике клеточную пролиферацию определяют, оценивая включение меченного тритием тимидина в ДНК, процесс, тесно связанный с последующими изменениями в количестве клеток.
Более подходит, если пролиферацию лимфоцитов можно провести с использованием сукцинимидилового эфира карбоксифлуоресцеин-диацетата (СР8Е). СР8Е спонтанно и необратимо связывается как с внутриклеточными белками, так и белками клеточной поверхности путём взаимодействия с боковыми цепями лизина и другими доступными аминогруппами. Когда клетки лимфоцитов делятся, мечение СР8Е распределяется в равной мере между дочерними клетками, флуоресценция которых ввиду этого составляет половину от флуоресценции родителей. В результате деление пополам клеточной флуоресценции маркирует каждое последующее поколение в популяции пролиферирующих клеток и легко отслеживается с помощью проточной цитометрии (для дополнительных деталей см. Макни, Ρ.Ό., е1 а1., ί. Ехр. Меб., 1996, 184:277-281).
Практически, после оттаивания РМВС могут быть промыты и окрашены СР8Е, после чего подвергнуты культивированию (2х105 клеток) в течение 72 ч с антигеном (10 мкг/мл) в культуральных средах (КРММ640, дополненной глутамином, несущественной аминокислотой, пируватом и инактивированной нагреванием человеческой АВ сывороткой). Затем клетки могут быть собраны и их фенотип охарактеризован с использованием окрашивания поверхности для идентификации СЭ8 и СЭ4' Τ-клеток памяти. После этого можно использовать проточный цитометрический анализ для выявления степени пролиферации лимфоцитов в ответ на каждый антиген (доли клеток с пониженной интенсивностью СР8Е после стимуляции ίη уйго).
Продуцирование иитокинов.
Продуцирование 1Р№у (или продуцирование других цитокинов, таких как, например, 1Ь2, ЮТ-а, 1Ь5, 1Ь12 и т.д.) можно измерить, используя твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЬ18А). ЕИ8Апланшеты могут быть покрыты мышиными моноклональными антителами против человеческого 1Р№у (РЬагМтдеш 8аη О1едо, СА) в РВ8 (забуференном фосфатом физиологическом растворе) в течение 4 ч при комнатной температуре. Затем лунки блокируют, используя РВ8, содержащий 5% (мас./об.) нежирного сухого молока, в течение 1 ч при комнатной температуре. Потом планшеты промывают, например,
- 50 024826 шесть раз в смеси РВ8/0,2% Твин-20, и образцы, разведенные 1:2 в культуральной среде в ЕЫ8Апланшетах, инкубируют в течение ночи при комнатной температуре. Планшеты снова промывают, и в каждую лунку можно добавить поликлональную кроличью сыворотку против ΙΡΝ-γ человека, например, разведенную 1:3000 в смеси РВ8/10% нормальной козьей сыворотки. Затем планшеты инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре, промывают, и можно добавить конъюгированные с пероксидазой хрена анти-кроличьи 1дС (81дша СЬешюа1 8о., 8!. Ьош5, МО), например, в разведении 1:2000 в смеси РВ8/5% нежирного сухого молока. По окончании следующих 2 ч инкубации при комнатной температуре планшеты промывают и добавляют субстрат ТМВ (тетраметилбензидин). Реакция может быть остановлена через 20 мин добавлением 1н. серной кислоты. Затем можно определить оптическую плотность (ΟΌ) при 450 нм, используя 570 нм в качестве длины волны сравнения. Обычно, фракции, дающие в обоих повторах величину ΟΌ, в два раза превышающую среднюю величину ΟΌ для клеток, культивируемых в одной только среде, могут считаться положительными.
Пример 5. Иммуногенность на СВ6Р1 мышах.
Иммуногенность антигена оценивали на СВ6Р1 мышах (первое поколение скрещенных ВАЬВ/с и С57ВЬ/6 мышей).
СВ6Р1 мышей иммунизировали внутримышечно три раза (на 0-, 14- и 28-е сутки) 0,5 мкг белкового антигена в комбинации с адъювантной системой А801Е (липосомная адъювантная композиция, содержащая 3О-МРЬ и Р821).
Использовали следующий план эксперимента:
Группа 0-е сутки 14-е сутки 28-е сутки
1 0,5 мкгКу3616с/А801Е 0,5 мкг Ру3616с/А301Е 0,5 мкг Ку3616с/А301Е
В каждой группе в протоколе суммарно использовали 24 мыши.
Лимфоциты периферической крови (РВЬ) собирали и объединяли в пулы на 21-е сутки (т.е. через 7 суток после второй иммунизации) и 35-е сутки (т.е. через 7 суток после третьей иммунизации) и измеряли антигенспецифические СЭ4 и СЭ8 Т-клеточные ответы (как определяли по количеству СЭ4 или СЭ8 Т-клеток, продуцирующих 1Ь-2, и/или ΙΡΝ-γ, и/или ТОТ^а) посредством проточной цитометрии после рестимуляции ш νίΙΐΌ в течение ночи пулами 15-мерных пептидов, охватывающих представляющие интерес последовательности.
Детекцию мышиных Т-клеток, которые экспрессируют 1Ь-2 и/или ΙΡΝ-γ, и/или ΊΝΡ-α, выполняли, используя кратковременную инициируемую антигеном амплификацию экспрессии цитокинов.
Вкратце, к гепаринизированной периферической крови мышей добавляли раствор РЬагшЬу5е (ВП-РЬагштдеи), чтобы лизировать эритроциты. Полученные РВЬ (лимфоциты периферической крови) промывали и затем инкубировали в присутствии пула 15-мерных пептидов - перекрывающихся по 11 аминокислотам - охватывающих последовательность представляющего интерес антигена, и 1 мкг/мл антител к СЭ28 и СЭ49б (ВП-РЬагштдеи). Каждый 15-мерный пептид использовали в конечной концентрации 1 мкг/мл. Контроли со средой также стимулировали антителами к СЭ28 и СЭ49б.
Блокирующее секрецию цитокинов соединение брефелдин-А (ВП-РЬагшшдеи) добавляли через 2 ч после начала культивирования при 37°С, 5% СО2 и клетки поддерживали при 37°С, 5% СО2 в течение следующих 4 дополнительных часов после инкубации в течение ночи при 4°С.
Затем клетки собирали и окрашивали, используя связанные с РасШс В1ие антитела против СЭ4 (ВО - клон РМ4-5, ВП-РЬагшшдеи) и связанные с комплексом перидинин-хлорофилл-белок А (РегСр) цианина5.5 (Су5.5) антитела против СЭ8 альфа (клон 53-6.7, ВП-РЬагшшдеи).
Затем клетки промывали, фиксировали, подвергали пермеабилизации (набор Су!ойх-су!орегш, ВП-РЬагшшдеи) и окрашивали, используя аллофикоцианин-связанные антитела против ΙΡΝ-γ (клон ХМС1.2, ВПРЬагшшдеи), флуоресцеин-изотиоцианат (НТСД-свяэанные антитела против Ιί-2 (клон 1Е8 6-5Н4, Вескшаи Сои1!ег) и фикоэритрин(РЕ)-связанные антитела против ТЯР-а (клон МР6-ХТ22, ВПРЬагшшдеи). После последних промывок окрашенные клетки анализировали на проточном цитометре Ь8Р ΙΙ (Веск1ои-Пюкш5ои). В СЭ8' подгруппе данные собирали минимум для 10000 клеток.
Для дополнительной информации см. Аа1/ег Т. е! а1., Се11 Iштииο1., 2000, 206(1):16-25 и Маескег Н.Т. е! а1., I. Iштииο1. МеШоб5, 2001, 255(1-2):27-40.
В качестве отрицательных контролей некоторые клетки также культивировали ш νίΙΐΌ в течение ночи в культуральной среде (не стимулировали). Антигенспецифические ответы рассчитывали путём вычитания среднего цитокинового ответа, произведенного нестимулированными клетками, из среднего цитокинового ответа, произведенного пептид-стимулированными клетками.
В каждую временную точку и для каждой группы собирали данные от 4 пулов из 6 мышей в каждом. Приведенные ниже данные представлены в виде % СЭ4 или СЭ8 Т-клеток, продуцирующих ГЬ-2, и/или ΙΡΝ-γ, и/или ТИР-а. На диаграмму наносили данные для каждого индивидуального пула мышей (треугольники), а также среднюю величину в группе (штрих).
На фиг. 3 показано, что на 21-е сутки (т.е. через 7 суток после второй иммунизации) Ку3616сспецифические СЭ4 и СЭ8 Т-клеточные ответы детектируются у мышей, иммунизированных дозой 0,5 мкг Ру3616с/А801Е.
- 51 024826
На фиг. 4 показан цитокиновый профиль СЭ4 Т-клеточного ответа из РВЬ, стимулированных пулом пептидов Ку3616с, (без вычета данных для среды) на 21-е сутки (т.е. через 7 суток после второй иммунизации).
На фиг. 5 показан цитокиновый профиль С'Н8 Т-клеточного ответа из РВЬ, стимулированных пулом пептидов из Ку3616с, (без вычета данных для среды) на 21-е сутки (т.е. через 7 суток после второй иммунизации).
На фиг. 6 показано, что на 35-е сутки (т.е. через 7 суток после третьей иммунизации) Ку3616сспецифические СЭ4 и СЭ8 Т-клеточные ответы детектируются у мышей, иммунизированных дозой 0,5 мкг Ку3616с/А801Е. Третья доза повышает СЭ4 Т-клеточный ответ, но не СЭ8 Т-клеточный ответ. Ввиду технических трудностей доступны данные только для одного пула.
На фиг. 7 показан цитокиновый профиль С'Н4 Т-клеточного ответа из РВЬ, стимулированных пулом пептидов из Ку3616с, (без вычета данных для среды) на 35-е сутки (т.е. через 7 суток после третьей иммунизации). Ввиду технических трудностей доступны данные только для одного пула.
На фиг. 8 показан цитокиновый профиль С'Н8 Т-клеточного ответа из РВЬ, стимулированных пулом пептидов из Ку3616с, (без вычета данных для среды) на 35-е сутки (т.е. через 7 суток после третьей иммунизации). Ввиду технических трудностей доступны данные только для одного пула.
Пример 6. Иммуногенность на С57ВЬ/6 мышах.
Иммуногенность антигена также оценивали на С57ВЬ/6 мышах.
С57ВЬ/6 мышей иммунизировали внутримышечно три раза (на 0-е сутки, 14-е сутки и 28-е сутки) 1 мкг белкового антигена в комбинации с адъювантной системой А801Е (липосомной адъювантной композицией, содержащей 30-МРЙ и Ц821).
Использовали следующий план эксперимента:
Группа 0-е сутки 14-е сутки 28-е сутки
1 1 мкг Ку3616с/А501Е 1 мкг Βν3616ο/Αδ01Ε 1 мкг Еу3616с/А501Е
Лимфоциты периферической крови (РВЬ) собирали и объединяли в пулы на 21-е сутки (т.е. через 7 суток после второй иммунизации) и 35-е сутки (т.е. через 7 суток после третьей иммунизации) и измеряли антигенспецифические СЭ4 и СЭ8 Т-клеточные ответы (которые определяли по числу СЭ4 или СЭ8 Т-клеток, продуцирующих ГЬ-2 и/или ГЕЛ-у, и/или ТНР-а) посредством проточной цитометрии после рестимуляции ш уйго в течение ночи пулами 15-мерных пептидов, охватывающих представляющие интерес последовательности. Процедуру проводили, как описано ранее.
В качестве отрицательных контролей некоторые клетки также культивировали ш уйго в течение ночи в культуральной среде (не стимулировали). Антигенспецифические ответы рассчитывали путём вычитания среднего цитокинового ответа, произведенного нестимулированными клетками, из среднего цитокинового ответа, произведенного пептид-стимулированными клетками.
В каждую временную точку и для каждой группы собирали данные от 4 пулов из 6 мышей в каждом. Приведенные ниже данные представлены в виде % С'Н4 или СЭ8 Т-клеток, продуцирующих ГЬ-2, и/или ГЕЛ-у, и/или ТНР-α. На диаграмму наносили данные для каждого индивидуального пула мышей (треугольники), а также среднюю величину в группе (штрих).
На фиг. 9 показано, что на 21-е сутки (т.е. через 7 суток после второй иммунизации) Ку3616сспецифические СЭ4 и С'Н8 Т-клеточные ответы детектируются у мышей, иммунизированных дозой 1 мкг Ку3616с/А801Е, хотя уровень антигенспецифического СЭ8 Т-клеточного ответа очень низок (поэтому данные цитокинового профиля не показаны).
На фиг. 10 показан цитокиновый профиль С'Н4 Т-клеточного ответа из РВЬ, стимулированных пулом пептидов из Ку3616с, (без вычета данных для среды) на 21-е сутки (т.е. через 7 суток после второй иммунизации).
На фиг. 11 показано, что на 35-е сутки (т.е. через 7 суток после третьей иммунизации) Ку3616сспецифические СЭ4 и СЭ8 Т-клеточные ответы детектируются у мышей, иммунизированных дозой 1 мкг Ку3616с/А801Е. Третья иммунизирующая доза повышает СЭ4 Т-клеточные ответы, а СЭ8 Т-клеточный ответ лишь незначительно.
На фиг. 12 показан цитокиновый профиль С'Н4 Т-клеточного ответа из РВЬ, стимулированных пулом пептидов из Ку3616с, (без вычета данных для среды) на 35-е сутки (т.е. через 7 суток после третьей иммунизации).
На фиг. 13 показан цитокиновый профиль С'Н8 Т-клеточного ответа из РВЬ, стимулированных пулом пептидов из Ку3616с, (без вычета данных для среды) на 35-е сутки (т.е. через 7 суток после третьей иммунизации).
Пример 7. Распознавание ш уйго с использованием РВМС от людей с латентным ТВ.
Эксперименты проводили с целью оценки ответа периферических Т-клеток, специфического в отношении антигена по изобретению, у 4 ранее не подвергавшихся ТВ здоровых взрослых (кожная проба РРЭ = 0 мм) и у 8 латентно инфицированных ТВ здоровых взрослых (кожная проба РРО = 15 мм или выше) из Южной Африки.
- 52 024826
Данные кожной пробы РРБ.
Индивидуальный Ιϋ.
(идентификационный) Диаметр уплотнения
номер (мм)
4 0
5 0
33 0
38 0
зе 15
46 15
13 15
7 16
58 25
74 26
8 53
60 55
Клеточно-опосредованный иммунный (СМЦ ответ оценивали путём измерения цитокинов на выделенных мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС), используя анализ с внутриклеточным окрашиванием цитокинов (Ю8).
Проводимый Ю8 представлял собой адаптацию ранее описанной методологии (см. Уоп Ε8сЬеη е! а1, Нит. Уасст. 2009 5(7)). РВМС стимулировали ш уйго одним из пулов 15-мерных пептидов (с перекрыванием по 11 аминокислотам) охватывающих всю последовательность представляющего интерес антигена. Клетки стимулировали пептидами в течение 2 ч, затем культивировали в течение ночи в присутствии брефелдина А, обрабатывали для ΙΟ8 и анализировали с использованием проточной цитометрии. Измеряли частоты встречаемости антигенспецифических СБ3+СБ4+ или СБ3+СБ8+ Т-клеток, экспрессирующих ΙΡΚ-γ, и/или ТЫР-α, и/или ΙΕ-17. Из ответов, полученных в стимулированных пептидными пулами клетках, вычитали ответы стимулированных средой клеток.
ΙΟ8: антитела:
анти-СБ3 Р0 (Ыуйтодеп - № по каталогу СБ0330), анти-СБ4 РВ (ВБ - № по каталогу 558116), анти-СБ8 ΑРС-Η7 (ВБ - № по каталогу 641400), анти-IРN§ ΑΡ700 (ВБ-РНагтшдеп - № по каталогу 557995), анти-ТЫР РΕ-Су7 (ВБ-РЬагтт§еп - № по каталогу 557647), анти-^ ΑΡ647 (ВБ-РНагтшдеп - № по каталогу 51-7178-71).
Результаты представлены как число антигенспецифических СБ3+СБ4+ Т-клеток, экспрессирующих ТЫР-α и ΙΡΚ-γ, на 1 млн СБ3+СБ4+ Т-клеток, поскольку эти клетки представляют основную популяцию антигенспецифических СБ4 Т-клеток (уровень фонового ответа, обусловленный средой, вычитают). Никаких антигенспецифических СБ3+СБ8+ Т-клеток выявлено не было. Фиг. 14 показывает, что антигенспецифический СБ4 Т-клеточный ответ определяется у 6 из 8 индивидуумов с латентной инфекцией (отсутствует у индивидуумов под номерами 7 и 74) в сравнении с неспецифическим СБ4 Т-клеточным ответом, измеренными у ранее не подвергавшихся инфекции индивидуумов.
В заключение можно отметить, что антиген Ру3616с способен вызывать иммунный ответ как у СВ6Р1, так и С57В1./6 мышей. Кроме того, профиль продуцирования цитокинов указывает, что большая часть антигенспецифических Т-клеток экспрессирует множество ТЫ-ассоциированных цитокинов (т.е. вызывает полифункциональный Т-клеточный ответ). Важно, что после иммунизации присутствуют как СБ4, так и СБ8 антигенспецифические Т-клетки, СБ8-клетки могут быть особенно важны в сценарии латентного ТВ. Значимость Ру3616с для инфекции человека подтверждается высоким уровнем распознавания у индивидуумов с латентной инфекцией из Южной Африки и отсутствием ответов у ранее не подвергавшихся инфекции субъектов. Поэтому можно ожидать, что Ру3616с будет иметь важное значение в предупреждении, лечении и диагностике латентной туберкулезной инфекции.
Хотя приведенное выше изобретение описано несколько подробно посредством иллюстраций и примеров для ясности понимания, среднему специалисту в данной области, благодаря разъяснениям в этом изобретении, будет очевидно, что некоторые изменения и модификации могут быть сделаны в нем без отклонения от сущности или объема прилагаемой формулы изобретения.
Все ссылки, относящиеся к данной заявке, в том числе патенты и заявки на патент, включены в данное описание посредством ссылки в максимально возможной степени, как если бы каждая отдельная публикация или заявка на патент были конкретно и отдельно указаны для включения посредством ссылки.
Во всем описании, реферате и формуле изобретения, которая следует далее, если контекст не требует иного, слово содержать и такие варианты, как содержит и содержащий, будут пониматься как означающие включение наличия указанных целого, стадии, группы целых или группы стадий, но не для исключения любого другого целого, стадии, группы целых или группы стадий.
- 53 024826
Перечень последовательностей <110> ГлаксоСмитКлайн Еайолоджикалз с.а.,
Глаксо Труп Лимитед Меттенс, Паскаль Браун, Джеймс Мерфи, Деннис <120> НОВЫЕ КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ <1зо> увбзоеорст <150> 0561/083720 <151> 2003-07-25 <1б0> 159 <170> РаЬепП1л уегзЬоп 3.5 <2Ю> 1 <211> 392 <212> ПРТ <213> МусоНасСегйилг СиЬегсиЬозХз <220>
<221> М15С_РЕАТиНЕ <223> Штамм Η37Κν <400> 1
Ме£ Зег Агд А1а РНе Не Не Азр Рго ТНг Не Зег А1а Не Агр 01у
1 5 10 15
Ьеи Туг Азр Ьеи Ьеи 61у Г1е С1у 11а Рго Азп еьп С1у С1у Не Ьеи
20 25 30
Туг 5ег Зег Ьеи С1и Туг РНе С1и Ьуз А1а Ьеи С1и С1и Ьеи А1а А1а
35 40 45
А1а РЬе Рго С1у Азр С1у Тгр Ьеи С1у Зег А1а А1а Азр Ьуз Туг А1а
50 55 60
С1у Ьуз Азп Агд Азп Низ Уа1 Азп РНе РНе С1п С1и Ьеи А1а Азр Ьеи
65 70 75 80
Азр Агд С1п Ьеи Не Зег Ьеи Не ΗΪ3 Азр С1п А1а Азп А1а Уа1 С1п
85 90 95
ТНг ТЬг Агд Азр Не Ьеи С1и б1у А1а Ьуз Ьуз С1у Ьеи С1и РНе νπΐ
100 105 110
Агд Рго Уа1 А1а Уа1 Азр Ьеи ТНг Туг Не Рго Уа1 Уа1 СХу ΗΪΞ А1а
115 120 125
Ьеи Зег А1а А1а РЬе С1п А1а Рго РНе Суз А1а С1у А1а МеЬ А1а 7а1
130 135 140
Уа1 С1у С1у А1а Ьеи А1а Туг Ьеи Уа1 7а1 Ьуз ТНг Ьеи Не Азп А1а
145 150 155 160
ТЬг С1п Ьеи Ьеи Ьуз Ьеи Ьеи А1а Ьуз Ьеи А1а С1и Ьеи Уа1 А1а А1а
165 170 175
А1з Не А1а Азр Не Не Зег Азр Уа1 А1а Азр Ые Не Ьуз С1у ТНг
180 185 190
Ьеи С1у С1и 7а1 Тгр СЬи РНе Не ТНг Азп А1а Ьеи Аэп С1у Ьеи Ьуз
195 200 205
С1и Ьеи Тгр Азр Ьуз Ьеи ТНг С1у Тгр УаХ ТНг СХу Ьеи РНе 5ег Агд
210 215 220
С1у Тгр Зег Азп Ьзи С1и Зег РНе РНе А1а С1у Уа1 Рго С1у Ьеи ТНг
225 230 235 240
С1у А1а ТЬг Зег С1у Ьеи 5ег С1п Уа! ТНг С1у Ьеи РНе С1у А1а А1а
245 250 255
- 54 024826
СЬу Ьеи Зег АЬа Зег Зег СЬу Ьеи АЬа 265 ΗΪ5 АЬа Азр Зег 1еи 270 АЬа Зег
260
5ег АЬа Зег Ьеи Рго АЬа Ьеи АЬа СЬу Ые СЬу СЬу СЬу Зег СЬу РНе
275 280 285
СЬу СЬу Ьеи Рго Зег Ьеи АЬа СЬп УаЬ НЬз АЬа АЬа Зег ТНг Агд СЬп
290 295 300
АЬа Ьеи Агд Рго Агд АЬа Азр СЬу Рго УаЬ СЬу АЬа АЬа АЬа СЬи СЬп
305 310 315 320
Уа1 СЬу СЬу СЬп Зег СЬп Ьеи УаЬ Зег АЬа СЬп СЬу Зег СЬп СЬу МеН
325 330 335
СЬу СЬу Рго ν31 СЬу МеЬ СЬу СЬу МеЬ НЬз Рго Зег Зег СЬу АЬа Зег
340 345 330
Ъуз СЬу ТНг ТНг ТНг Ьуз Ьу5 Туг Зег С1и СЬу АЬа АЬа АЬа СЬу ТНг
355 360 365
СЬи Аер АЬа СЬи Агд А1а Рго ν^ι СЬи АЬа Азр АЬа СЬу СЬу СЬу СЬп
370 375 380
Ъуз 7а1 Ьеи 7а1 Агд Азп ν3ϊ ν^ϊ
395 390
<210> 2 <2Π> 1179 <212> ЦНК <213> МусоЬас£ег1 ит Ёи&егсиХозίε <220 <221> лп15с_£еагиге <223> Штамм Η37Ην <400> 2 ардадсадад сдОСсэОсэЛ сдаРссаасд аНсадНдсса НРдасддсНН дТасдассЫ: 60 сЪддддаГЬд дааГасссаа сраадддддЬ арссРЪЪасР ссрсасГада дЬасЬЬсдаа 120 ааадсссЬдд аддадсЬддс адсадсдРРН ссдддОда'Ьд дсьддградд РРсддссдсд 180 дасаааРасд ссддсааааа ссдсаассас д£дааРС1РР иссаддаасс ддсадассСс 240 даОсдЬсадс ГсаРсадссН даРссасдас саддссаасд сддРссадас дасссдсдас 300 аЬесЬддадд дсдссаадаа аддЬсНсдад РНсдНдсдсс сддЬддсНдН ддассРдасс 360
СасаОссодд рсдрсдддоа сдсссСаРсд дссдссЬОсс аддсдссдЬЛ СЬдсдсдддс 420 дсдаЬддссд радРдддсдд сдсдсРРдсс РасЪЪддЪсд ОдаааасдсН даЬсаасдсд 480 ас^саасгсс ссаааЬЬдсС Рдссаазг^д дсддадНйдд (:сдсддссдс саНРдсддас 540 аНсаЬНРсдд аРдЬддсдда саРсаРсаад ддсасссТсд дадаадрд'Ьд ддадЪЬсаЬс 600 асааасдсдс НсаасддссО дааададсНР Ндддасаадс НсасддддТд ддрдассдда 660 сЬдОЬсНсНс дадддНддОс даассЬддад ЬссЫсЫЬд сдддсдНссс сддсННдасс 720 ддсдсдасса дсддсЬЬдЬс дсаадрдасС- ддсРЬдЫсд дСдсддссдд НсгдНссдса 790
НсдНсдддсЬ НддсНсасдс ддаЬадссСд дсдадсСсад ссадсЬСдсс сдсссЬддсс 840 ддсаЬСдддд дсдддРссдд ЬМзГдддддс Ьрдссдадсс 7ддс£саддР ссаЬдссдсс 900
ЕсаасЬсддс аддедсЬаед дссссдадсГ дасддсссдд Ьсддсдссдс Гдссдадсад 960 дНсддсдддс адНсдсадсН ддГсТссдсд садддррссс 33991:61:599 сддэсссд^а 1020 ддсагдддсд дсаНдсассс сгсгРсдддд дсдРсдааад ддасдасдас даадаадРас 1090 ссддааддсд сддсддсддд сасСдаадас дссдадсдсд сдссадгсда адс-дасдед 1140 ддсддЪдддс ааааддСдсР ддЬасдааас дСсдЬсРаа 1179
<2Ю> 3
<2 Ы> 392
<212> ПРТ
<213> МусоЪассеггига ЬиЬегсиЬазхз
<220>
<221> М13С ГЕАГСКЕ
<223> Штамм СОСЬ551
- 55 024826 <4С0> 3
МеН Зег Агд АЬа РНе 11е Ые Азр Рго ТНг Не Зег АЬа Ые Азр <31 у
1 5 10 15
Ьеи Туг Αερ Ьеи Ьеи СЬу 11е С1у 11е Рго Азп еьп С1у С1у ЬЬе Ьеи
20 25 30
Гуг Зег Зег Ьеи СЬи Туг РНе СЬи Ьуз АЬа Ьеи СЬи СЬи Ьеи АЬа АЬа
35 40 45
АЬа РНе Рго С1у Азр С1у Тгр Ьеи С1у Зег АЬа АЬа Αερ Ьуз Туг АЬ а
50 55 60
С1у Ьуз Азп Агд Азп ΗΪ5 УаЬ Азп РНе РНе СЬп СЬи Ьеи АЬа Азр Ьеи
65 70 75 ВО
Азр Агд СЬп Ьеи Пе Зег Ьеи Не НЬз Азр СЬп АЬа Азп АЬа УаЬ СЬп
85 90 95
ТЬг ТНг Агд Азр Не Ьеи СЬи С1у АЬа Ьуз Ьуз С1у Ьеи СЬи РНе УаЬ
100 105 1Ь0
Агд Рго УаЬ АЬа УаЬ Азр Ьеи ТНГ Туг Не Рго УаЬ УаЬ СЬу НЬз АЬа
115 120 125
Ьеи Зег АЬа АЬа РНе СЬп АЬа Рго РНе Суз АЬа СЬу АЬа ПеН АЬа УаЬ
130 135 140
УаЬ СЬу СЬу АЬа Ьеи А1а Туг Ьеи УаЬ УаЬ Ьуз ТНг Ьеи Ые Азп АЬа
145 150 155 160
ТЬг СЬп. Ьеи Ьеи Ьуз Ьеи Ьеи АЬа Ьуз Ьеи АЬа СЬи Ьеи УаЬ АЬа АЬа
165 170 175
АЬа Пе АЬа Азр Ые Ые Зег Азр УаЬ АЬа Азр Не Не Ьуз СЬу ЬЬе
130 185 190
Ьеи СЬу СЬи УаЬ Тгр 01 и РНе Ые ТНг Азп АЬа Ьеи Азп С1у Ьеи Ьуз
195 200 205
СЬи Ьеи Тгр Αερ Ьуз Ьеи ТНг С1у Тгр УаЬ ТНг СЬу Ьеи РНе Зег Агд
210 215 220
СЬу Тгр Зег Азп Ьеи СЬи Зег РНе РНе АЬа С1у УаЬ Рго СЬу Ьеи ТНг
225 250 235 240
СЬу АЬа ТНг Зег СЬу Ьеи Зег СЬп УаЬ ТНг С1у Ьеи РНе СЬу АЬа АЬа
245 250 255
СЬу Ьеи Зег АЬа Зег Зег С1у Ьеи АЬа НЬз АЬа Азр Зег Ьеи АЬа Зег
260 265 270
Зег АЬа Зег Ьеи Рго АЬа Ьеи АЬа СЬу Не СЬу СЬу СЬу Зег С1у РЬе
275 280 285
С1у СЬу Ьеи Рго Зег Ьеи АЬа 61п УаЬ НЬз АЬа АЬа Зег ТНг Агд СЬп
290 295 300
АЬа Ьеи Агд Рго Агд АЬа Азр С1у Рго УаЬ СЬу АЬа АЬа АЬа СЬи СЬп
305 310 315 320
УаЬ СЬу 01 у СЬп Зег СЬп Ьеи УаЬ Зег АЬа СЬп СЬу Зег СЬп. С1у Мег
325 330 335
С1у С1у Рго УаЬ СЬу МеЬ СЬу С1у МеЬ Ηϊε Рго Зег Зег СЬу АЬа Зег
340 345 350
Ъуз СЬу ТНг ТНг ТНг Ьуз Ьуз Туг Зег СЬи С1у АЬ а АЬа АЬа СЬу ТНг
355 360 365
С1и Азр АЬа СЬи Агд АЬа Рго УаЬ СЬи АЬа Азр АЬа С1у СЬу СЬу СЬп
370 375 380
Ьуз УаЬ Ьеи УаЬ Агд Азп УаЬ УаЬ
385 390
<210> 4 <211> 392 <212> ПРТ <213> МусоЬасИегЧит СиЬееси1оз1з <220>
<221> М13С_ГЕАТиВ.Е <223> Штамм Г11
- 56 024826
<40 0> 4
МеН Зег Агд АЬа РЬе 11е Пе Азр Рго ТЬг Ые Зег АЬа Ые Азр СЬу
1 5 10 15
Ьеи Туг Азр Ьеи Ьеи СЬу 11е СЬу Не Рго Азп СЬп СЬу СЬу Не Ъеи
20 25 30
Туг Зег Зег Ьеи СЬи Туг РЬе СЬи Ьуз АЬа Ьеи СЬи СЬи Ъеи АЬа АЬа
35 40 45
АЬа РЬе Рго СЬу Азр СЬу Тгр Ъеи СЬу Зег АЬа АЬа Αδρ Ъуз Туг АЬа
50 55 60
СЬу Ьуз АЗП Агд Азп НЬз УаЬ Аеп РНе РНе СЬп СЬи Ъеи АЬа Азр Ъеи
65 70 75 80
Азр Агд СЬп Ьеи Не Зег Ьеи 11е НЬз Аар СЬп АЬа Азп АЬа УаЬ СЬп
85 90 95
ГЬг ТЬг Агд Азр Пе Ьеи СЬи СЬу АЬа Ьуз Ьуз СЬу Ъеи СЬи РЬе УаЬ
ЬОО 105 НО
Агд Рго УаЬ АЬа УаЬ Азр Ьеи ТНг Туг Не Рго νπ УаЬ СЬу НЬз АЬа
115 120 125
Ьеи Зег А1 а АЬа РЬе СЬп АЬа Рго РНе Суз АЬа СЬу АЬа Мер АЬа УаЬ
130 135 140
Уа1 СЬу СЬу АЬа Ьеи АЬа Туг Ьеи ш \7аЬ Ъуз ТНг Ъеи Ые Азп АЬа
145 150 155 160
ТНг СЬп Ьеи Ьеи Ьуз Ьеи Ьеи АЬа Ъуз Ъеи АЬа СЬи Ъеи ν&1 АЬа АЬа
165 170 175
АЬа Не АЬа Аар 11е 11е Зег Азр УаЬ АЬа Азр Не Ые Ъуз СЬу Ые
160 185 190
Ьеи СЬу СЬи УаЬ Тгр СЬи РНе Не ТНг Азп АЬа Ьеи Азп СЬу Ъеи Ъуз
195 200 205
СЬи Ьеи Тгр Авр Ьуз Ьеи ТНг СЬу Тгр Ш ТНг СЬу Ъеи РЬе Зег Агд
210 215 220
СЬу Тгр Зег Азп Ьеи СЬи Зег РНе РЬе АЬа СЬу УаЬ Рго СЬу Ъеи ТНг
225 230 235 240
СЬу АЬа ТЬг Зег СЬу Ьеи Зег СЬп 7а1 ТНг СЬу Ьеи РЬе СЬу АЬа АЬа
245 250 255
СЬу Ъеи Бег АЬа Бег Зег СЬу Ьеи АЬа ΗΪ5 АЬа Аар Зег Ъеи АЬа 5ег
260 265 270
Зег АЬа Зег Ьеи Рго АЬа Ьеи АЬа СЬу Не СЬу СЬу СЬу Зег СЬу РЬе
275 280 2Θ5
СЬу СЬу Ьеи Рго Зег Ьеи АЬа СЬп 7а1 Нгз АЬа АЬа Зег ТНг Агд СЬп
230 295 300
А1 а Ьеи Агд Рго Агд АЬа Азр СЬу Рго Уа1 СЬу АЬа АЬа АЬа СЬи С1п
305 310 315 320
УаЬ СЬу СЬу СЬп Зег СЬп Ьеи УаЬ Зег АЬа СЬп СЬу Зег СЬп СЬу МеГ
325 330 335
СЬу СЬу Рго УаЬ СЬу МеГ СЬу СЬу Мег НЬз Рго Зег Зег СЬу АЬа Зег
340 345 350
Ьуз СЬу ТЬг ТЬг ТЬг Ьуз Ьуз Туг Зег СЬи СЬу АЬа АЬа АЬа СЬу ТНг
355 360 365
СЬи Азр АЬа СЬи Агд АЬа Рго УаЬ СЬи АЬа Азр АЬа СЬу СЬу СЬу СЬп
370 375 380
Ьуз УаЬ Ьеи Уа1 Агд А5П УаЬ Уа!
ЗЭ5 390
<210> 5 <2Ы> 392 <212> ПРТ <2ЬЗ> МусоЪасСеглшп <220>
<221> М15С ΡΕ,ΑΤυΕΕ
- 57 024826 <223> Штамм НаагЬетп А <400> 5
Мее 1 Зег Агд АЬа РЬе 5 Ые Ые Азр Рго ТНг 10 11е Зег АЬа 11е Азр 15 СЬу
Ьеи Туг Азр Ьеи Ьеи СЬу 11е СЬу Ые Рго Азп Ξΐη СЬу СЬу 11е Ьеи
20 25 30
Туг Зег Зег Ьеи СЬи Туг РНе СЬи Ьуз АЬа Ьеи С1и СЬи Ьеи АЬа АЬа
35 40 45
АЬа РНе Рго СЬу Азр СЬу Тгр Ьеи СЬу Зег АЬа АЬа Азр Ьуз Туг АЬа
50 55 60
СЬу Ьуз Азп Агд Азп НЬз УаЬ Азп РНе РНе СЬп СЬи Ьеи А1а Азр Ьеи
65 70 75 80
Азр Агд С1п Ьеи Не Зег Ьеи Не НЬз Азр С1п АЬа Азп АЬа УаЬ СЬп
65 90 95
тнг ты Агд Азр Не Ьеи СЬи СЬу АЬа Ьуз Ьуз СЬу Ьеи СЬи РНе УаЬ
ЫО 105 110
Агд Рго УаЬ АЬа УаЬ Азр Ьеи ТНг Туг Ые Рго УаЬ УаЬ СЬу НЬз АЬа
115 120 125
Ьеи Зег АЬа АЬа РНе 61п АЬа Рго РНе Суз АЬа СЬу АЬа МеЪ АЬа УаЬ
130 135 140
УаЬ СЬу СЬу АЬа Ьеи АЬ а Туг Ьеи УаЬ УаЬ Ьуз ТНг Ьеи 11е Азп АЬа
145 150 155 160
ТНг СЬп Ьеи Ьеи Ьуз Ьеи Ьеи АЬа Ьуз Ьеи АЬа СЬи Ьеи УаЬ АЬа АЬа
165 170 175
А1а Пе АЬа Азр Ые Ые Зег А5р УаЬ АЬа Азр Ые 11е Ьуз СЬу Ые
180 185 190
Ьеи СЬу СЬи УаЬ Тгр СЬи РНе Ые ТНг Азп АЬа Ьеи Азп СЬу Ьеи Ьуз
195 200 205
СЬи Ьеи Тгр Азр Ьуз Ьеи ТЫ СЬу Тгр УаЬ ТНг СЬу Ьеи РНе Зег Агд
210 215 220
СЬу Тгр Зег Азп Ьеи СЬи Зег РНе РЬе АЬа СЬу УаЬ Рго СЬу Ьеи ГЫ
225 230 235 240
СЬу АЬа ты Зег СЬу Ьеи Зег СЬп УаЬ ТНг СЬу Ьеи РНе СЬу АЬа АЬа
245 250 255
СЬу Ьеи Зег АЬа 5ег Зег СЬу Ьеи АЬа НЬз АЬа Азр Зег Ьеи АЬа Зег
260 265 270
Зег АЬа Зег Ьеи Рго АЬа Ьеи АЬа СЬу 11е СЬу СЬу СЬу Зег СЬу РНе
275 230 285
СЬу СЬу Ьеи Рго 5ег Ьеи АЬа СЬн УаЬ НЬз АЬа АЬа Зег ТНг Агд СЬп
290 295 зоо
АЬа Ьеи Агд Рго Агд АЬа Азр СЬу Рго УаЬ СЬу АЬа АЬа АЬа СЬи СЬи
305 310 315 320
УаЬ □Ьу СЬу сьп Зег СЬп Ьеи УаЬ Зег АЬа СЬп СЬу Зег СЬп СЬу МеН
325 330 335
СЬу СЬу Рго УаЬ СЬу МеО СЬу СЬу МеЬ НЬз Рго Зег Зег СЬу АЬа Зег
340 345 350
Ьуз СЬу ТНг ТЬг ТЬг Ьуз Ьуз Туг Зег СЬи СЬу АЬа АЬа АЬа СЬу ТНг
355 3 60 365
СЬи Айр АЬа СЬи Агд АЬа Рго УаЬ СЬи АЬа Азр АЬа СЬу СЬу СЬу СЬн
370 375 380
Ьуз Уа1 Ьеи УаЬ Агд Азп УаЬ УаЬ
385 390
<210> б <2Ы> 392 <212> ПРТ <213> МусоЬас{:ег1ик1 ЬиЬегси1оз1з <220
- 58 024826 <221> ΜΙ5<:_ΕΈΑΊυβΕ <223> Штамм С <400> 6
МеГ 1 2ег Агд АЬа РНе 5 Ые Ые Азр Рго ТНг 10 Пе Зег АЬа Ые Азр 15 СЬу
Ьеи Туг Азр Ьеи Ьеи СЬу Ые СЬу 11е Рго Азп СЬп СЬу СЬу Пе Ьеи
20 25 30
Туг 5ег Зег Ьеи СЬи Туг РЬе СЬи Ьуз АЬа Ьеи СЬи СЬи Ьеи АЬа АЬа
35 40 45
АЬа РЬе Рго СЬу Азр СЬу Тгр Ьеи СЬу Зег АЬа АЬа Азр Ьуз Туг АЬа
50 55 60
СЬу Ьуз Азп Агд Азп НЬе УаЬ Азп РНе РНе СЬп СЬи Ъеи АЬа Αερ Ьеи
65 70 75 80
А§р Агд СЬп Ьеи ЬЬе Зег Ьеи Ые ΗΪΞ Азр СЬп АЬа Азп АЬа УаЬ СЬп
85 90 95
ТЬг ТНг Агд Азр Не Ьеи СЬи СЬу АЬа Ьуз Ьуз СЬу ьеи СЬи РНе УаЬ
100 105 110
Агд Рго УаЬ АЬа УаЬ Азр Ьеи ТНг Туг Ые Рго УаЬ УаЬ СЬу ΗΪ5 АЬа
115 120 125
Пей Зег АЬа АЬа РЬе СЬп АЬа Рго РЬе Суз АЬа СЬу АЬа МеН АЬа УаЬ
130 135 140
УаЬ СЬу СЬу АЬа Ьеи АЬа Туг Ьеи УаЬ УаЬ Ьуз ТНг Ьеи Ые Азп А1а
145 150 155 160
ТЬг СЬп Ьеи Ьеи Ьуз Ьеи Ьеи АЬа Ьуз Ьеи АЬа СЬи Ьеи УаЬ АЬа АЬа
165 170 175
АЬа Не АЬа Азр Пе ЬЬе Зег Азр УаЬ АЬа Азр Ые Ые Ьуз СЬу Ые
180 185 190
Ъеи СЬу СЬи УаЬ Тгр СЬи РНе Ые ТЬг Азп АЬа Ьеи АЗП СЬу Ьеи Ьуз
195 200 205
СЬи Ьеи. Тгр Азр Ьуз Ьеи ТНг СЬу Тгр УаЬ ТНг СЬу Ьеи РНе Зег Агд
210 215 220
СЬу Тгр Зег А$п Ьеи СЬи Зег РЬе РНе АЬа СЬу УаЬ Рго СЬу Ьеи ТЫ
225 230 235 240
СЬу АЬа ТЬг Зег СЬу Ьеи Зег СЬп УаЬ ТНг СЬу Ьеи РНе СЬу АЬа АЬа
245 250 255
СЬу Ьеи Зег АЬа Зег Зег СЬу Ьеи АЬа НЬз АЬа Азр Зег Ьеи АЬа Зег
260 265 270
Зег АЬа Зег Ьеи Рго АЬа Ьеи АЬа СЬу Ые СЬу СЬу СЬу 5ег СЬу РЬе
275 280 285
СЬу СЬу Ьеи Рго Зег Ьеи АЬа СЬп УаЬ НЬз АЬа АЬа 5ег ТЬг Агд СЬп
2 90 295 300
АЬа Ьеи Агд Рго Агд АЬа Азр СЬу Рго УаЬ СЬу АЬа АЬа АЬа СЬи СЬп
305 310 315 320
УаЬ Ыу СЬу СЬп Зег СЬп Ьеи УаЬ Зег АЬа СЬп СЬу 5ег СЬп СЬу МеН
325 330 335
СЬу СЬу Рго УаЬ СЬу Мен СЬу СЬу Мен ΗΪ5 рго зег Зег СЬу АЬа Зег
340 345 350
Ьуз СЬу ТЬг ТЬг ТЬг Ьуз Ьуз Туг 5ег 61и СЬу АЬа АЬа АЬа СЬу ТНг
355 360 ЗЁ5
СЬи Αερ АЬа СЬи Агд АЬа Рго УаЬ СЬи АЬа Азр АЬа СЬу СЬу СЬу СЬп
370 375 38 0
Ьуз УаЬ Ьеи УаЬ Агд Азп УаЬ УаЬ
3Θ5 390
<210> 7 <211> 392 <212> ПРТ <213> МусоНасНегиипт &ανΐ5
- 59 024826 <220>
<221> М15С_ГЕАТиКЕ <223> Штамм ВЦЖ <400> 7
МеН 1 Зег Агд УаЬ РНе 5 Не Ые Азр Рго ТНг 10 11е Зег АЬа Ые Аар 15 ОЬу
Пей Туг Азр Ьеи Ьеи СЬу Ые С1у Ые Рго Азп СЬп С1у СЬу Ые Ьеи
2ΰ 25 ЭО
Туг Зег Зег Ьеи СЬи Туг РНе СЬи Ьуз АЬа Ьеи СЬи СЬи Ьеи АЬа АЬа
35 40 45
АЬа РНе Рго ОЬу Азр СЬу Тгр Ьеи СЬу 5ег АЬа АЬэ Азр Ьуз Туг АЬа
50 55 60
С1у Ьуз АЗП Агд Азп НЬз УаЬ Азп РНе РНе СЬп СЬи Ьеи АЬа Азр Ьеи
55 70 75 80
Азр Агд ОЬп Ьеи Не Зег Ьеи Не НЬз Азр СЬп АЬа Азп АЬа УаЬ С1п
85 90 95
ТНг ТЬг Агд Азр ЬЬе Ьеи СЬи СЬу АЬа Ьуз Ьуз С1у Ьеи СЬи РНе УаЬ
юо 105 ЫО
Агд Рго УаЬ АЬа УаЬ Азр Ьеи ТНг Туг Ые Рго УаЬ УаЬ С1у Ηί з А1а
115 120 125
Ьеи. 5ег АЬа АЬа РНе СЬп АЬа Рго РНе Суз АЬа СЬу АЬа МеН АЬа УаЬ
130 135 140
УаЬ С1у С1у АЬа Ьеи АЬа Туг Ьеи УаЬ УаЬ Ьуз ТНг Ьеи Ые Азп АЬа
145 150 155 160
ТНг СЬп Ьеи Ьеи Ьуз Ьеи Ьеи АЬа Ьуз Ьеи АЬа СЬи Ьеи УаЬ АЬа АЬа
165 170 175
АЬа Не АЬа Азр 11е Не Зег Азр УаЬ АЬа Азр Ые Ые Ьуз С1у Ые
130 135 190
Ьеи СЬу СЬи УаЬ Ггр СЬи РНе Не ТНг Азп АЬа Ьеи Азп С1у Ьеи Ьуз
195 200 205
СЬи Ьеи Тгр Азр Ьуз Ьеи ТНг СЬу Тгр УаЬ ТНг С1у Ьеи РНе Зег Агд
210 215 220
еьу Тгр Зег Азп Ьеи СЬи Зег РНе РНе АЬа ОЬу УаЬ Рго С1у Ьеи ТНг
225 230 235 240
СЬу АЬа ты Зег С1у Ьеи Зег СЬп УаЬ ТНГ ОЬу Ьеи РНе СЬу АЬа АЬа
245 250 255
С1у Ьеи Зег АЬа Зег Зег СЬу Ьеи АЬа НЬз АЬа Азр Зег Ьеи АЬа Зег
260 265 270
Зег А1а Зег Ьеи Рго АЬа Ьеи АЬа ОЬу Ые С1у ОЬу ОЬу Зег еьу РНе
275 280 295
СЬу СЬу Ьеи Рго Зег Ьеи АЬа СЬп Уа1 Шз АЬа АЬа Зег ТНг Агд СЬп
290 295 300
АЬа Ьеи Агд Рго Агд АЬа Азр С1у Рго УаЬ С1у АЬа АЬа АЬа СЬи СЬп
305 310 315 320
УаЬ С1у ОЬу ОЬп Зег СЬп Ьеи УаЬ Зег АЬа СЬп СЬу Зег СЬп СЬу МеН
325 330 335
СЬу С1у Рго УаЬ С1у Мен СЬу СЬу МеН НЬз Рго Зег Зег СЬу АЬа Зег
340 345 350
Ьуз ОЬу ТНг ТНг ТНг Еув Ьуз Туг Зег СЬи С1у АЬа АЬа АЬа СЬу ГНг
355 360 365
СЬи Азр АЬа СЬи Агд А1а Рго УаЬ СЬи АЬа Азр АЬа СЬу СЬу ОЬу СЬп
370 375 380
Ьуз УаЬ Ьеи Уа! Агд Азп УаЬ УаЬ
385 390
<210> 8 <211> 110 <212> ПРТ <213> МуссНзЫег Юг? СиНегспЬозЬ5
- 60 024826 <220>
<221> таЬ_рер1;Ь0е <222> ¢29). - ¢110) <400> 8
МеЬ Агд Ьеи Зег -25 Ьеи ТЬг АЬа Ьеи Зег -20 АЬа СЬу УаЬ СЬу АЬа -15 УаЬ АЬа
МеЬ Зег Ьеи ТЬг УаЬ С1у АЬа СЬу УаЬ АЬа Зег АЬа Азр Рго УаЬ Азр
-10 -5 -1 1
АЬа УаЬ Пе Азп ТНг ТЬг Суз Азп Туг СЬу СЬп УаЬ УаЬ АЬа АЬа Ьеи
5 10 15 20
Азп АЬа ТЬг Азр Рго СТу АЬа А1а АЬа СЬп РЬе Азп АЬа Зег Рго УаЬ
25 30 35
АЬа СЬп Зег Туг Ьеи Агд А5П РЬе Ьеи АЬа АЬа Рго Рго Рго СЬп Агд
40 45 50
АЬа АЬа МеН АЬа АЬа СЬп Ьеи СЬп АЬа УаЬ Рго СЬу АЬа АЬа СЬп Туг
55 60 65
Не СЬу Ьеи νπ СЬи Зег уы АЬа СЬу Зег Суз Азп Азп Туг
70 75 80
< 210 > 9 <211> 97 <212> ПРТ <213> Мусо&асЪегхит СиЪегсиЬозЬз <400> 9
МеИ Зег Ьеи Ьеи Азр АЬа НЬз Ые Рго СЬп Ьеи УаЬ АЬа Зег СЬп Зег
1 5 10 15
АЬа РЬе АЬа АЬа Ьуз АЬа СЬу Ьеи МеЬ Агд НЬз ТЬг Ые СЬу СЬп АЬа
20 25 30
СЬи СЬп АЬа АЬа МеЬ 5ег АЬа СЬп АЬа РНе НЬз СЬп СЬу СЬи Зег Зег
35 40 45
А1а АЬа РЬе СЬп АЬа АЬа НЬз АЬа Агд РНе УаЬ АЬа АЬа АЬа АЬа Ьуз
50 55 60
УаЬ Азп ТЬг Ьеи Ьеи Азр УаЬ АЬа СЬп АЬа Азп Ьеи СЬу СЬи АЬа АЬа
65 70 75 80
СЬу ТЬг Туг УаЬ АЬа АЬа Азр АЬа АЬа АЬа АЬа Зег ТНг Туг ТНг СЬу
85 90 95
РЬе <210> 10 <211> 94 <2Ь2> ПРТ <213> ЛГусоЬзасСеггияг СиЬегсиЬо^Ьз <400> 10
МеС 1 ТЬг Ые Азп Туг 5 СЬп РНе СЬу Азр УаЬ 10 Азр АЬа НЬз СЬу АЬа 15 МеЬ
1Ье Агд АЬа СЬп АЬа АЬа Зег Ьеи СЬи АЬа СЬи НЬз СЬп АЬа 1Ье УаЬ
20 25 30
Агд Азр УаЬ Ьеи АЬа АЬа СЬу Азр РНе Тгр СЬу СЬу АЬа СЬу Зег УаЬ
35 40 45
АЬа Суз СЬп СЬи РНе 11е ТНг СЬп Ьеи СЬу Агд Азп РНе СЬп Уа1 Ые
50 55 60
Туг СЬп СЬп АЬа Азп АЬа НЬз СЬу СЬп Ьуз УаЬ СЬп АЬа АЬ а СЬу Азп
65 70 75 80
Азп МеН АЬа СЬп ТНг Азр Зег АЬа УаЬ СЬу Зег Зег Тгр АЬа
- 61 024826
<210> 11 а5
<211> 132
<212> ПРТ
<213> МусоЬасСег1и[п £иЬегси1о$ί.5
<400> 11
ТЬг А1а А1а Зег Азр Азп РЬе С1п Ъеи Зег СТп С1у СТу СТп СТу РЬе
1 5 10 15
Л1а 11е Рго Не С1у СТп А1а МеЬ А1а Пе А1а С1у С1п Не Агд Зег
20 25 30
С1у СТу С1у Зег Рго ТЬг УаТ Нгз Не СТу Рго ТЬг А1а РЬе Ъеи ЕТу
35 40 45
Ъеи СТу Уа1 Уа1 Азр Азп Азп СТу Азп Е1у А1а Агд Уа1 С1п Агд Уа1
50 55 60
Уа1 СТу Зег АТа Рго А1а А1а Зег Ъеи С1у Не Зег ТЬг С1у Азр УаТ
65 70 75 ео
Не ТЬг А1а УаТ Азр СТу АТа Рго 11е Азп Зег А1а ТЬг АТа МеЬ АТа
35 90 95
Азр АТа Ъеи Азп С1у ΗΪ3 НТз Рго С1у Азр Уа1 Г1е 5ег Уа1 ТЬг Тгр
100 105 НО
С1п ТЬг Туз Зег СТу СТу ТЬг Агд ТЬг СТу Азп УаТ ТЬг Ъеи АТа С1и
115 120 125
С1у РГО Рго АТа
130
<210> 12
<211> 195
<212> ПРГ
<213> Мусо£асСег21Дп СиЬегсиТозгз
<400> 12
А1а Рго Рго А1а Ъеи Зег С1п Азр Агд РЬе А1а Азр РЬе Рго АТа Ъеи
1 5 то 15
Рго Ъеи Азр Рго Зег АТа МеТ Уа1 А1а С1п Уа1 СТу Рго СТп УаТ Уа1
20 25 30
АЗЛ Не Азп ТЬг Ъуз Ъеи С1у туг Азп Азп А1а Уа1 СТу АТа □1у ГЬг
35 40 45
СТу Пе УаТ Не Азр Рго Азп СТу Уа1 УаТ Ъеи ТЬг Азп Азп ΗΪ5 Уа1
50 55 60
ТТе АТа С1у АТа ТЬг Азр Пе Азп АТа РЬе Зег Уа1 СТу Зег СТу С1п
65 70 75 00
ТЬг Туг С1у Уа1 Азр Уа1 Уа1 СТу Туг Азр Агд ТЬг С1п Азр Уа1 А1а
Э5 90 95
Уа1 Ъеи СТп Ъеи Агд С1у АХа С1у С1у Ъеи Рго Зег А1а А1а Пе СТу
100 105 НО
С1у СТу νπ АТа УаТ С1у С1и Рго Уа1 Уа1 А1а МеЬ С1у Аэп Зег С1у
115 120 125
ОТу СТп СТу С1у ТЬг Рго Агд АТа Уа1 Рго С1у Агд УаТ Уа1 АТа Ъеи
130 135 140
С1у С1п ТЬг УаТ С1п А1а Зег Азр Зег Ъеи ТЬг С1у АТа СТи С1и ТЬг
145 150 155 160
Ъеи АзЬ СТу Ъеи Не СТп РЬе Азр АТа А1а Не С1п Рго СТу Азр Зег
165 170 175
С1у С1у Рго Уа1 УаТ Аэп СТу Ъеи СТу СТп УаТ УаТ СТу МеТ Агп ТЬг
160 105 190
АТа АТа 5ег
195
- 62 024826 <210 13 <211> 391 <212> ΠΡΤ <213> МусоЪас£ег1 υοι {:и&егси±С515 <400> 13
МеН 1 УаТ Азр РНе С1у 5 АТа Ьеи Рго Рго СТи то Ые Азп Зег АЬа Агд 15 МеН
Туг А1а С1у Рго С1у 5ег АЬа Зег Ьеи Уа1 АЬа А1а АЬа СЬп МеН Тгр
20 25 30
Азр Зег Уа1 А1а Зег Азр Ьеи РНе Зег АЬа АЬа Зег АЬа РНе С1п Зег
35 40 45
УаЬ УаЬ Тгр СТу Ьеи ТНг Уа1 С1у Зег Тгр Ые С1у Зег Зег А1а СЬу
50 55 60
Ьеи МеН Уа1 А1а АЬа АЬа Зег Рго Туг Уа1 А1а Тгр МеЬ Зег УаЬ ТНг
65 70 75 80
Ала 61у СЬп А1а С1и Ьеи ТНг АЬа А1а СЬп Уа1 Агд УаЬ АЬа А1а АЬа
35 90 95
А1а Туг С1и ТНг А1а Туг СТу Ьеи ТНг Уа1 Рго Рго Рго Уа1 Ые АЬа
100 105 ЫО
С1и АЗП Агд АЬа СЬи Ьеи Мер Ые Ьеи Не А1а ТНг Азп Ьеи Ьеи СЬу
115 120 125
СТп Азп ТНг Рго АТа Не АТа УаЬ Азп СЬи А1а С1и Туг СЬу С1и МеН
130 135 140
Тгр А1а СЬп Азр А1а АЬа А1а МеН РНе СЬу Туг А1а АЬа АЬа ТНг А1а
145 150 155 160
ТЬг А1а ТНг АТа ТНг Ьеи Ьеи Рго РНе С1и С1и АТа Рго СЬи МеН ТНг
165 170 175
Зег А1а С1у С1у Ьеи Ьеи С1и СТп АЬа АТа А1а Уа1 С1и СЬи АЬа $ег
180 185 190
Азр ТНг А1а АЬа А1а Азп СТп Ьеи МеН А5П Азп УаТ Рго 51п АЬа Ьеи
195 200 205
С1п СЬп Ьеи АЬа С1п Рго ТНг СТп СТу ТНг ТНг Рго Зег Зег Ьуз Ьеи
210 215 220
С Ту СЬу Ьеи Тгр Ьуз ТНг Уа1 Зег Рго Н1з Агд Зег Рго Ые Зег АЕП
225 230 235 240
МеН УаЬ Зег МеН АЬа Азп Азп ΗΪΞ МеН Зег МеН ТНг Азп Зег С1у Уа1
245 250 255
Зег МеН ТНг Абп ТНг Ьеи Зег Зег МеН Ьеи Ьуз СТу РНе АТа Рго АЬа
260 265 270
АТа АЬа АЬа СТп АТа УаТ СТп ТНг А1а А1а СТп Азп СТу Уа1 Агд АЬа
275 280 285
МеН Зег Зег Ьеи СТу Зег Зег Ьеи СТу Зег Зег С1у Ьеи С1у СЬу СЬу
290 295 300
УаТ АЬа АЬа Азп Ьеи СТу Агд АЬа АТа Зег УаТ С1у Зег Ьеи Зег УаЬ
305 это ЗЬ5 320
Рго С1п АЬа Тгр АТа А1а А1а Азп С1п АЬа УаТ ТНг Рго АЬа АЬа Агд
3Ξ5 330 335
АЬа Тен Рго Ьеи ты Зег Ьеи ТНг Зег АЬа АЬа СТи Агд СЬу Рго С1у
340 345 350
СЬп Ме! Ьеи С1у СЬу Ьеи Рго Уэ1 СТу СЬп мен СЬу АЬа Агд АЬа СЬу
355 360 365
СТу СЬу Ьеи Зег С1у УаЬ Ьеи Агд УаТ Рго Рго Агд Рго Туг УаЬ Мен
370 375 зво
Рго Иг5 Зег Рго АТа АЬа СТу
385 390
<210> 14
- 63 024826
<211> 423
<212> ΠΡΤ
<213> МусоЬасСег! игл биЬегсиТозгз
<400> 14
Меб 1 Азр РЬе СТу Ьеи 5 Ьеи Рго Рго С1и Уа1 10 Азп Зег Зег Агд Меб 15 Туг
Зег С1у Рго С1у Рго С1и Йег Меб Ьеи А1а А1а А1а АТа АТа Тгр Азр
20 25 30
С1у Уа1 АТа АТа СТи Ьеи ТЫ Зег АТа АТа Уа1 5ег Туг С1у Зег Уа1
35 40 45
Уа1 Зег ТЬг Ьеи 11е Уа1 С1и Рго Тгр Меб С1у Рго АТа А1а АТа АТа
50 55 60
Меб А1а А1а АТа АТа ТЬг Рго Туг УаТ СТу Тгр Ьеи А1а АТа ТЬг А1а
65 70 75 80
АТа Ьеи А1а Ьуз 61и ТЬг А1а ТЬг С1п А1а Агд А1а А1а АТа СТи АТа
85 90 95
РЬе С1у ТЬг А1а РЬе А1а Меб ТЬг Уа1 Рго Рго Зег Ьеи УаТ А1а А1а
100 105 ПО
Азп Агд Зег Агд Ьеи Меб Зег Ьеи Уа1 А1а А1а Азп Пе Ьеи С1у СТП
115 120 125
Азп 5ег А1а АТа Пе А1а АТа ТЬг С1п АТа С1и Туг А1а С1и Меб Тгр
130 135 140
АТа С1п Агр А1а А1а УаТ Меб Туг Зег Туг СТи С1у АТа Зег АТа А1а
145 150 155 160
АТа Зег АТа Ьеи Рго Рго РЬе ТЬг Рго Рго Уа1 СТп С1у ТЬг ЗТу Рго
165 170 175
А1а С1у Рга А1а А1а АТа А1а АТа АТа ТЬг С1п АТа А1а СТу А1а 61у
1 а о 18 5 190
А1а Уа1 А1а Азр А1а СТп А1а ТЬг Ьеи АТа С1п Ьеи РгО Рго С1у Пе
195 200 205
Ьеи Зег Азр Не Ьеи Зег А1а Ьеи А1а АТа Азп А1а Азр Рго Ьеи ТЬг
210 215 220
Зег СТу Ьеи Ьеи СТу Пе А1а Зег ТЬг Ьеи Азп Рго СТп Уа1 СТу Зег
225 230 235 240
А1а С1п Рго 11е Уа1 Пе Рго ТЬг Рго Пе С1у С1и Ьеи Азр УаТ Пе
245 250 255
А1а Ьеи Туг Пе А1а Зег Пе А1а ТЬг СТу Зег Пе А1а Ьеи АТа Не
260 265 270
ТЬг Азп ТЬг А1а Агд Рго Тгр НТз Пе СТу Ьеи Туг С1у Азп А1а сту
275 280 235
СТу Ьеи С1у Рго ТЬг С1п С1у НТз Рго Ьеи Зег Зег А1а ты Азр С1и
290 295 зоо
Рго СТи Рго ΗΪ5 Тгр 61у Рго РЬе С1у С1у А1а А1а Рго УаТ Зег А1а
305 310 315 320
С1у Уа1 01 у ΗΪΞ А1а АТа Ьеи Уа1 С1у А1а Ьеи Зег УаТ Рго НТ5 Зег
325 330 335
Тгр ТЬг ТЬг АТа АТа Рго С1и Пе СТп Ьеи А1а Уа1 СТп А1а ТЬг Рго
34 0 345 350
ТЬг РЬе Зег Зег Зег А1а С1у А1а Азр Рго ТЬг А1а Ьеи Азп С1у Меб
355 360 365
Рго АТа С1у Ьеи Ьеи Зег С1у Меб АТа Ьеи А1а Зег Ьеи А1е АТа Агд
370 375 зао
С1у ТЬг ТЬг СТу СТу СТу СТу ТЬг Агд Зег С1у ТЬг Зег ТЬг Азр СТу
335 390 395 400
СТп СТи Азр СТу Агд Ьуз Рго Рго УаТ Уа1 УаТ Пе Агд СТи С1п Рго
405 410 415
Рго Рго СТу Азп Рго Рго Агд
420
- 64 024826 <210> 15 <2Π> 95 <212> ПРТ <213> МусоЬасЬег Ьил! ЬиЬегси1оз2з <220 <221> ΙΝΙΤ_ΜΕΤ <222> (1) .. (1) <220>
<221> т,аб_рербЬс!е <222> ί2 У . . (95) <400> 15
Меб ТЬг СЬи СЬп С1п Тгр Аэп РЬе АЬа СЬу Не СЬи АЬа АЬа АЬа Зег
-1 1 5 10 15
АЬа Пе С1п С1 у АЗП УаЬ ТЬг Зег Не НЬз Зег Ьеи Ьеи Азр СЬи СЬу
20 25 30
Ьуз С1п Зег Ьеи ТЬг Ьуз Ьеи АЬа АЬа АЬа Тгр С1у СЬу Зег С1у Зег
35 40 45
СЬи АЬа Туг С1п СЬу УаЬ С1п СЬд Ьуз Тгр Азр АЬа ТЬх А1а ТЬг СЬи
50 55 60
Ьеи Азп Αεη А1а Ье\1 СЬп А$п Ъеи А1& Агд ТЬг Не Зег СЬи АЬа СЬу
65 70 75
С1п АЬа Меб АЬа Зег ТЬг СЬи С1у Азп УаЬ ТЬг СЬу Меб РЬе АЬа
80 85 90
<210> 16
<21 Ь> 338
<212> ПРТ
<213> МусоЬасСегЬит СиЬегсиЬозЬз
<220>
<221> таб рербЬсЗе
<222> (-33) ..(33Θ)
<<Э00> 16
Меб СЬп Ьеи УаЬ Азр Агд УаЬ Агд СЬу АЬа УаЬ ТЬг СЬу Меб 5ег Агд
-40 -35 -30
Агд Ьеи УаЬ УаЬ С1у АЬа УаЬ СЬу АЬа АЬа Ьеи УаЬ Зег СЬу Ьеи УаЬ
-25 -20 -15
СЬу АЬа УаЬ ОЬу ОЬу ТЬг АЬа ТЬг АЬа ОЬу АЬа РЬе Зег Агд Рго С1у
-10 -5 -1 1 5
Ьеи Рго УаЬ СЬи Туг Ьеи СЬп УаЬ Рго Зег Рго Зег Меб СЬу Агд А$р
10 15 20
Не Ьуз УаЬ С1п РЬе СЬп Зег С1у СЬу АЬа Азп Зег Рго АЬа Ьеи Туг
25 30 35
Ьеи Ьеи Азр С1у Ьеи Агд АЬа С1п Азр Азр РЬе Зег ОЬу Тгр Азр ТЬе
40 45 50
Азп ТЬг Рго АЬа РЬе СЬи Тгр Туг Аар СЬп Зег СЬу Ьеи Зег Уа! УаЬ
55 60 65 70
Меб Рго УаЬ С1у СЬу СЬп Зег 5ег РЬе Туг Зег Азр Тгр Туг СЬп Рго
75 еа Θ5
АЬа Суз С1у Ьуз АЬа СЬу Суз СЬп ТЬг Туг Ьуз Тгр СЬи ТЫ РЬе Ьеи
90 95 100
ТЬг Зег СЬи Ьеи Рго СЬу Тгр Ьеи С1п АЬа Азп Агд НЬз УаЬ Ьуз Рго
105 ыо 115
ТЬг С1у Зег АЬа УаЬ УаЬ СЬу Ьеи Зег Меб АЬа АЬа Зег Зег АЬа Ьеи
120 125 130
ТЬг Ьеи АЬа Не Туг НЬз Рго СЬп С1п РЬе УаЬ Туг АЬа СЬу АЬа Меб
- 65 024826
135 140 145 150
Зег СЬу Ьеи Ьеи Азр Рго Зег еьп А1а МеЬ СЬу Рго ТНг Ьеи Пе Й1у
155 160 165
Ьеи АЬа Мег С1у Азр АЬа С1у СЬу Туг Ьуз АЬа Зег Азр МеН Тгр СЬу
170 175 180
Рго Ьуз СЬи Азр Рго АЬа Тгр СЬп Агд Азп Азр Рго Ьеи Ьеи Азп УаЬ
185 190 195
СЬу Ьуз Ьеи Не АЬа Азп Азп ТНг Агд уаь Тгр νπ Туг Суд С1у Азп
200 205 210
С1у Ьуз Рго Зег Азр Ьеи С1у СЬу Азп Азп Ьеи Рго АЬа Ьуз РНе Ьеи
215 220 225 230
С1и СЬу РНе УаЬ Агд ТЬг Зег Азп Не Ьуз РНе СЬп Азр АЬа Туг Азп
235 240 245
АЬа СЬу СЬу СЬу Ηί 5 Азп СЬу УаЬ РЬе Азр РНе Рго Азр Зег С1 у ТЬг
250 255 260
Ηί 5 Зег Тгр СЬи Туг Тгр СЬу АЬа СЬп Ьеи Азп АЬа МеЪ. Ьуз Рго Азр
265 270 275
Ьеи СЬп Агд АЬа Ьеи СЬу АЬа ТЬг Рго Азп ТЬг С1у Рго АЬа Рго СЬп
290 285 290
СЬу АЬа
295
<2Ь0> <211> <212> <213> 17 325 прт ЛГуесфа обеги ш тг СиЬегсиЬоаЬз
<220>
<221> гпаЪ ι рерЫс1е
<222> (41) . . (325)
< 4 00> 17
МеГ ТЬг Абр Уа1 Зег Агд Ьуз Ые Агд АЬа Тгр СЬу Агд Агд Ьеи МеЪ
-40 -35 -30 -25
Не еьу ТЬг АЬа АЬа АЬа Уа1 УаЬ Ьеи Рго СЬу Ьеи УаЬ 61 у Ьеи АЬа
-20 -15 -10
СЬу СЬу АЬа АЬа ТЬг АЬа еьу АЬа РНе Зег Агд Рго С1у Ьеи Рго УаЬ
-5 -1 1 5
СЬи Туг Ьеи СЬп 7а1 Рго Зег Рго Зег МеГ СЬу Агд Азр Ые Ьуз УаЬ
10 15 20
СЬп РНе СЬп Зег СЬу СЬу Азп Азп Зег Рго АЬа УаЬ Туг Ьеи Ьеи Азр
25 30 35 40
С1у Ьеи Агд АЬа СЬп Азр Агр Туг Азп СЬу Тгр Азр Не Азп ТНг Рго
45 50 55
АЬа РЬе Ии Тгр Туг Туг С1п Зег СЬу Ьеи Зег Ые νπΐ МеЬ Рго УаЬ
60 65 70
СЬу СЬу СЬп Зег Зег РЬе Туг Зег Азр Тгр Туг Зег Рго АЬа Суз СЬу
75 80 85
Ьуз АЬа СЬу Суз СЬп ТЬг Туг Ьу5 Ггр С1и ТЬг РНе Ьеи ТНг Зег СЬи
90 95 100
Ьеи Рго СЬп Тгр Ьеи Зег А1а Азп Агд АЬа ν$1 Ьуз Рго ТНг С1у Зег
105 ЫО 115 120
АЬа АЬа 11е еьу Ьеи Зег Мер АЬа СЬу Зег Зег АЬа МеГ Пе Ъеи АЬа
125 130 135
АЬа Туг ΗΪ5 Рго СЬп СЬп РПе Пе Туг АЬа СЬу Зег Ьеи Зег АЬа Ьеи
140 145 150
Ьеи Азр Рго Зег СЬп СЬу Ме£ СЬу Рго Зег Ьеи Х1е СЬу Ьеи АЬа Меб
155 160 165
СЬу Азр АЬа СЬу СЬу Туг Ьуз АЬа АЬа Азр МеГ Тгр СЬу Рго Зег Зег
170 175 ЬВО
- 66 024826
Азр Рго А1а Тгр СЬи Агд Азп Азр Рго ТЬг СЬп СЬп Ле Рго Ьуз Ьеи
1Θ5 190 195 200
УаЬ А1а Азп Азп ТЬг Агд Ьеи Тгр УаЬ Туг Суз СЬу Азп СЬу ТЬг Рго
205 210 215
Азп С1и Ьеи СЬу СЬу АЬа Азп 11е Рго АЬа СЬи РЬе Ьеи СЬи Азп РЬе
220 225 230
Уа1 Агд Зег Зег Азп Ьеи Ьуз РЬе С1п Азр АЬа Туг Азп АЬа АЬа СЬу
235 240 245
С1у ΗΪ5 Азп АЬа УаЬ РЬе Азп РЬе Рго Рго Азп СЬу ТЬг Ыз Зег Тгр
250 255 260
СЬи Туг Тгр СЬу АЬа СЬп Ьеи Азп АЬа Меб Ьуз СЬу Азр Ьеи С1п Зег
265 270 225 280
Зег Ьеи СЬу АЬа СЬу
2Θ5
<21' 0> 18
<21 1> 144
<21: 2> ПРТ
<ξι: 3> Мусо Ьас& егЬит бслЬегс и2 05. 23
<22ϊ 0>
<22: 1> ΙΝΙΤ МЕТ
<22: 2> (1) / . т
<221 3>
<22: 1> таб ] серб: 1с5е
<22; 2> (2} . . (14‘ υ
<4 ОС 18
Меб АЬа ТЬг ТЬг Ьеи Рго УаЬ СЬп Агд НЬз Рго Агд 5ег Ьеи РЬе Рго
-1 1 5 10 15
СЬи РЬе Зег СЬи Ьеи РЬе АЬа АЬа РЬе Рго Зег РЬе АЬа СЬу Ьеи Агд
20 25 30
Рго ТЬг РЬе Азр ТЬг Агд Ьеи МеГ Агд Ьеи СЬи Азр СЬи Меб Ьуз СЬи
35 40 45
СЬу Агд Туг СЬи УаЬ Агд АЬа СЬи Ьеи Рго СЬу УаЬ Азр Рго Азр Ьуз
50 55 60
Азр УаЬ Азр 11е Меб УаЬ Агд Азр СЬу СЬп Ьеи ТПг Ые Ьуз АЬа СЬи
65 70 75
Агд ТЬг СЬи СЬп Ьуз Азр РЬе Азр СЬу Агд Зег СЬи РЬе АЬа Туг СЬу
80 85 90 95
Зег РЬе УаЬ Агд ТЬг УаЬ Зег Ьеи Рго УаЬ СЬу АЬа Азр 61и Азр Азр
100 105 110
Ые Ьуз АЬа ТЬг Туг Агр Ьу5 СЬу Ые Ьеи ТЬг УаЬ Зег УаЬ АЬа Уа!
115 120 125
Зег СЬи С1у Ьуз Рго ТЬг СЬи Ьуз ΗΪ5 Ые СЬп Не Агд Зег ТЬг Азп
130 135 140
<2Ю> 19 <211> 228 <212> ПРТ <213> МугоЬагЬег^и/т СиЬегси1оз1з <220>
<221> таГ_рерЬЬс1е <222> (24] .. (228) <400> 19
Ме£ Агд Не Ьуз Ые РЬе Мег Ьеи Уа! ТЬг АЬа УаЬ Уа1 Ьеи Ьеи
Суэ
- 67 024826
-15 -10
Суз Зег С1у -5 Уа1 А1а ТЬг А1а -1 А1а 1 Рго Ъуз ТЬг Туг Суз 5 С1и С1и Ъеи
Ьу5 С1у ты Азр ТЬг С1у С1п А1а Суз С1п Пе С1п МеГ 5ег Азр Рго
10 15 20 25
А1а Туг Аэп Не Азп Пе Зег Ъеи Рго Зег Туг Туг Рго А5р (Пп Ъуз
30 35 40
Зег Ъеи Й1и Азп Туг Пе А1а С1п ТЬг Агд Аар Ъуз РЬе Ъеи Зег А1а
45 50 55
А1а ТЬг Зег Зег ТЬг Рго Агд (Ни А1а Рго Туг С1и Ъеи Азп Не ТЬг
60 65 70
Зег А1а ТЬг Туг С1п Зег А1а Не Рго Рго Агд С1у ТЬг С1п А1а νβΐ
75 80 85
Уа1 Ъеи Ъуз Уа1 Туг С1п Азп А1а С1у 51у ТЬг ΗΪ3 Рго ТЬг ТЬг ТЬг
90 95 100 105
Туг Ъуз А1а РЬе Азр Тгр Азр С1п А1а Туг Агд Ъуз Рго Не ТЬг Туг
110 115 120
Азр ГЬг Ъеи Тгр С1п А1а Азр ТЬг Азр Рго Ъеи Рго ν^ι Уа1 РЬе Рго
125 130 135
Не Уа1 С1п С1у 61 и Ъеи Зег Ъуз С1п ТЛг С1у СПп С1п Уа1 Бег Не
140 145 150
А1а Рго Азп А1а Й1у Ъеи Азр Рго Уа1 АЭП Туг С1г> Азп РЬе А1а Уа1
155 160 165
ТЬг Азп Азр Г-Ну ν&1 Пе РЬе РЬе РЬе Агп Рго С1у С1и Ъеи Ъеи Рго
170 175 180 185
С1и А1а А1а 01 у Рго ТЬг С1п 7а1 Ъеи Уа1 Рго Агд Зег А1а Пе Азр
190 195 200
Зег Меб Ъеи А1а
205
<210> <211 > <212> <213> 20 355 ПРТ МусоЪа Ыегг и/ τι СиЬегсиЪозхз
<2 20>
<221> таг рерЫЬе
<222> ί 33) ..{355)
<400> 20
Меб Зег Азп Зег Агд Агд Агд Зег Ъеи Агд Тгр Зег Тгр Ъеи Ъеи Зег
-30 -25 -20
Уа1 Ъеи А1а А1а Уа1 С1у Ъеи С1у Ъеи А1а ТЬг А1а Рго А1а С1п АЪа
-15 -10 -5 “1
А1а Рго Рго А1а Ъеи Зег С1п Азр Агд РЬе А1а Азр РЬе Рго А1а Ъеи
1 5 10 15
Рго Ъеи Азр Рго Зег А1а Меб Уа1 А1а еъп Уа1 С1у Рго б!п Уа1 Уа!
20 25 30
Азп Не Азп ТЬг Ъуз Ъеи С1у Туг Азп Азп А1а Уа1 С1у А1а С1у ТЬг
35 40 45
С1у Пе νπ 11е Азр Рго Аеп С1у νπ Уа1 Ъеи ТЬг Азп Азп ΗΪ3 Уа1
50 55 60
Ие А1а С1у А1а ТЬг Аар Пе Азп А1а РЬе Бег ν3ι С1у Зег С1у С1п
65 70 75 80
ТЬг Туг С1у Уа1 Азр Уа1 Уа1 С1у Туг Азр Агд ТЫ (Пп Азр Уа1 А1а
35 90 95
Уа1 Ъеи С1п Ъеи Агд С1у А1а С1у С1у Ъеи Рго Зег А1а А1а Не С1у
ЮС 105 но
С1у С1у ν«ι1 А1а νοί С1у С1и Рго Уа1 Уа1 А1а Меб С1у Аэп Зег С1у
115 120 125
- 68 024826
С1у С1п С1у С1у ТНг 130 Рго Агд А1а 135 νβΐ Рго С1у Агд 140 Уа1 Уа1 А1а Ъеи
С1у СТп ты Уаъ £1п А1а Зег Азр Зег Ьеи ТЬг С1у А1а С1и О1и ТЬг
145 150 155 160
Ъеи Азп С1у Ъеи Не СТп РЬе Азр А1а А1а Пе С1п рго С1у Азр Зег
165 170 175
С1у С1у Рго Уа1 Уа1 Азп С1у Ъеи С1у Е1п Уа1 Уа1 С1у МеТ Азп ТЬг
160 185 190
А1а А1а Зег Азр Азп РЬе С1п Ъеи Зег С1п С1у С1у О1п С1у РЬе А1а
195 200 205
Т1е Рго Пе С1у С1п А1а МеЬ А1а 11е А1э 61у С1п Не Агд Зег С1у
210 21Ь 220
С1у С1у Зег Рго ТЬг Уа1 Ηί з 11е С1у Рго ТЬг А1а РЬе Ьеи С1у Ъеи
225 230 235 240
С1у Уа1 Уа1 Азр Азп А5П С1у Азп С1у А1а Агд Уа1 С1п Агд Уа1 Уа1
245 250 255
С1у 5ег А1а Рго А1а А1а Зег Ьеи С1у Пе Зег ТЬг С1у Азр Уа1 Не
260 265 Ξ70
ТЬг А1а Уа1 Аэр С1у А1а Рго Не Азп Зег А1а ТЬг А1а МеЬ А1а Азр
275 280 235
А1а Ъеи Азп С1у Н1з НЬз Рго С1у Азр 7а1 Пе Зег Уа! ТНг Тгр С1п
290 295 300
ТЬг Ьуз Зег <31у С1у ТЬг Агд ТЬг С1у Азп 7а1 ТЬг Ъеи А1а С1и С1у
305. 310 315 320
Рго Рго А1а <210> 21 <211> 323 <212> ПРГ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 5ег/А1а-мутант зрелого НЬЬ32А <400> 21
А1а Рго Рго АТа Ъеи Зег С1п Азр Агд РЬе А1а Азр РЬе Рго А1а Ъеи
1 5 10 15
Рго Ъеи Азр Рго Зег А1а МеЬ УЫ А1а С1п Уа1 С1у Рго С1п 7а1
20 25 30
Азп 11е Азп ТЬг Ъуз Ъеи С1у Туг Азл Азп А1а Уа1 С1у А1а 31у ГЬг
35 40 45
С1у Не Уа1 Це Азр Рго АзЬ С1у Уа1 Уа1 Ъеи ТЬг Азп Азп ΗΪ5 Уа1
50 55 60
11е А1а С1у А1а ТЬг Азр Не Азп А1а РЬе Зег Уа1 С1у Зег С1у С1п
65 70 75 80
ТЬг Туг С1у Уй1 Азр Уа1 Уа1 С1у Туг Азр Агд ТЬг <31п Азр Уа1 А1а
85 90 95
Уа1 Ъеи 61п Ъеи Агд С1у А1а С1у С1у Ъеи Рго Зег А1а А1а 11е С1у
100 105 по
С1у С1у Уа1 А1а Уа! С1у С1и Рго νπ Уа1 А1а МеЬ С1у Азп Зег Й1у
115 120 125
Ну С1л С1у <31у ТЬг Рго Агд А1а Уа1 Рго С1у Агд Уа1 Уа1 А1а Ъеи
130 135 140
С1у 01л ТЬг Уа1 01п А1а Зег Азр Зег Ъеи ТЬг С1у А1а С1и С1и ТЬг
145 150 155 160
Ъеи Азп С1у Ъеи 11е С1п РЬе Азр А1а А1а Пе С1п Ргс С1у АЗр А1а
165 170 175
С1у С1у Рго Уа1 Уа1 Азп С1у Ъеи С1у С1п Уа1 Уа1 С1у МеЬ Азп ТЬг
180 185 190
- 69 024826
А1а А1а Зег Агр Азп РНе СЬп Ьеи 200 Зег СЬп СЬу Е1у Е1п 205 СЬу РНе АЬа
195
Пе Рго Ые СЬу СЬп АЬа Меб АЬа Ые АЬа СЬу СЬп Пе Агд Зег СЬу
210 215 220
СЬу СЬу 5ег Рго ТНг УаЬ НЬз Ые СЬу Рго ТНг АЬа РНе Ьеи СЬу Ьеи
225 230 235 240
СЬу УаЬ УаЬ Азр Азп Азп СЬу А5П СЬу АЬа Агд УаЬ СЬп Агд УаЬ УаЬ
245 250 255
СЬу Зег АЬа Рго АЬа АЬа Зег Ьеи СЬу ЬЬе Зег ТНг СЬу Азр УаЬ ЬЬе
260 265 270
ТНг АЬа УаЬ Азр СЬу АЬа Рго Пе Аап Зег АЬа ТНг АЬа Меб АЬа Азр
275 280 2Θ5
АЬа Ъеи Азп СЬу НЬз НЬз Рго СЬу Азр УаЬ Ые Зег УаЬ ТНг Тгр СЬп
290 295 300
ТНг Ьуз Зег СЬу СЬу ТНг Агд ТНг СЬу Азп Уаь ТНг Ьеи А1з СЬи СЬу
305 ЗЬО 315 320
Рго Рго АЬа
<211 0> 22
<21: Ь> 96
<21: 2> ПРТ
<2ΐ: 3> МусоНастеггил? СиНего! Ыозиз
<401 ]> 22
Меб Зег СЬп Ые Меб Туг Айп Туг Рго АЬа МеЬ Ьеи СЬу ΗΪΞ АЬа СЬу
1 5 10 15
Азр Меб АЬа СЬу Туг АЬа С1у ТНг Ьеи СЬп Зег Ьеи СЬу АЬа СЬи Ые
20 25 30
АЬа УаЬ СЬи СЬп АЬа АЬа Ьеи С1п Зег АЬа Тгр СЬп СЬу Аер ТНг СЬу
35 40 45
ХЬе ТНг Туг СЬп АЬа Тгр σΐη А1а СЬп Тгр Азп СЬп АЬа Меб СЬи Азр
50 55 60
Ьеи УаЬ Агд АЬа Туг ЙЬе А1а Ме7 Зег Зег ТНг НЬа СЬи АЬа Азп ТНг
65 70 75 Й0
Меб АЬа Мег Меб АЬа Агд Азр ТНг АЬа СЬи АЬа АЬа Ьуз Тгр СЬу СЬу
85 90 95
<210> <211> <212> <213> 23 723 ПРТ Искусственна; ч последовательность
<220
<223> МбЬ72£
<400> 23
Меб ТНг АЬа АЬа Зег Азр Азп РНе СЬп Ьеи Зег СЬп СЬу СЬу СЬп СЬу
1 5 10 15
РНе АЬа 11е Рго Ые СЬу СЬп АЬа Меб АЬа Не АЬа СЬу СЬп Ые Агд
20 25 30
Зег СЬу СЬу СЬу Зег Рго ТНг УаЬ ΗΪ5 11е СЬу Рго ТНг АЬа РНе Ьеи
35 40 45
СЬу Ьеи СЬу УаЬ Уа1 Азр Азп Азп СЬу Азп СЬу АЬа Агд УаЬ СЬп Агд
50 55 60
УаЬ УаЬ СЬу 5ег АЬа Рго АЬа АЬа Зег Ьеи СЬу ЬЬе Зег ТНг СЬу Азр
65 70 ЬЬ 80
УаЬ Ые ТНг АЬа УаЬ Азр СЬу АЬа Рго Ые А5П Зег АЬа ТНг АЬа Меб
85 90 95
- 70 024826
А1а Азр АЬа Ьеи ЬОО Азп СЬу НЬз НЬз Рго 105 СЬу Азр УаЬ 11е Зег 110 УаЬ ТНг
Тгр СЬп ТНг Ьуз Зег СЬу СЬу ТНг Агд ТНг СЬу Азп УаЬ ТНг Ьеи АЬа
115 120 125
С1и СЬу Рго РГО АЬа СЬи РНе Меб УаЬ Азр РНе СЬу АЬа Ьеи Рго Рго
130 135 140
С1и Ые Азп Зег АЬа Агд МеЬ Туг АЬа СЬу Рго СЬу Зег АЬа Зег Ьеи
145 150 155 160
УаЬ АЬа АЬа АЬа СЬп Меб Тгр Азр Зег 7аЬ АЬа Зег Аэр Ьеи РЬе Зег
165 170 175
АЬа АЬа Зег АЬа РНе СЬп Зег УаЬ 7а1 Тгр СЬу Ьеи ТНг УаЬ СЬу Зег
180 185 190
Тгр Ые СЬу Зег Зег АЬа СЬу Ьеи МеЬ УаЬ АЬа АЬа АЬа Зег Рго Туг
195 200 205
УаЬ АЬа Ггр Мег Зег 7а1 ТНг АЬа СЬу С1п А1а СЬи Ьеи ТНг АЬа АЬа
210 215 220
С1п 7а1 Агд Уа1 АЬа АЬа АЬа АЬа Гуг СЬи ТНг АЬа Туг СЬу Ьеи ТНг
225 230 235 240
7аЬ Рго Рго Рго Уа1 Пе АЬа СЬи Азп Агд АЬа СЬи Ьеи Меб 11е Ьеи
245 250 255
ЬЬе А1а ТНг Азп Ьеи Ьеи СЬу СЬп Азп ТНг Рго АЬа Пе АЬа 7аЬ Азп
260 265 270
СЬи АЬа СЬи Туг СЬу СЬи Мег Тгр АЬа СЬп Азр АЬа АЬа АЬа Меб РЬе
275 280 2Э5
СЬу Туг АЬа АЬа АЬа ТНг АЬа ТНг АЬа ТНг АЬа ТНг Ьеи Ьеи Рго РНе
290 295 300
СЬи СЬи АЬа Рго СЬи Меб ТНг Зег АЬа СЬу СЬу Ьеи Ьеи СЬи СЬп АЬа
305 310 315 320
АЬа АЬа 7а1 СЬи СЬи АЬа Зег Азр ТНг АЬа АЬа АЬа Азп СЬп Ьеи Меб
325 330 335
Азп Азп 7а1 Рго СЬп АЬа Ьеи СЬп С1п Ьеи АЬа СЬп Рго ТНг СЬп СЬу
340 345 350
ТНг ТНг Рго Зег Зег Ьуз Ьеи СЬу СЬу Ьеи Тгр Ьуз ТНг 7а1 Зег Рго
355 360 365
НЬз Агд 5ег Рго ГЬе Зег Азп Меб 7а1 Зег Меб АЬа Азп Азп НЬз Меб
370 375 звз
Зег меб ТНг Азп Зег СЬу 7аЬ 5ег меб ТНг Азп ТНг Ьеи Зег Зег Меб
335 390 395 400
Ьеи Ьуз СЬу РНе АЬа Рго АЬа АЬа АЬа АЬа СЬп АЬа Уа1 СЬп ТНг АЬа
405 410 415
АЬа СЬп Абп СЬу Уа1 Агд АЬа Меб Зег Сег Ьеи СЬу Зег Сиг Ьеи СЬу
420 425 430
Зег Зег СЬу Ьеи СЬу СЬу СЬу 7аЬ АЬа АЬа Азп Ьеи СЬу Агд АЬа А1а
435 440 445
Зег УаЬ СЬу Зег Ьеи Зег УаЬ Рго СЬп АЬа Тгр АЬа АЬа АЬа АЗП СЬп
450 455 460
АЬа УаЬ ТНг Рго АЬа АЬа Агд АЬа Ьеи Рго Ьеи ТНг Зег Ьеи ТЬг Зег
465 470 475 460
АЬа АЬа СЬи Агд СЬу Рго СЬу С1п Меб Ьеи СЬу СЬу Ьеи Рго УаЬ СЬу
485 4 90 4 95
СЬп Меб СЬу АЬа Агд АЬа СЬу СЬу СЬу Ьеи Зег СЬу УаЬ Ьеи Агд ν3ι
500 505 510
Рго Ргс Агд Рго Туг 7а1 МеЬ Рго НЬз Зег Рго АЬа АЬа СЬу Авр Ые
515 520 525
АЬа РГО Рго АЬа Ьеи Зег СЬп А5р Агд РНе АЬа Азр РНе Рго АЬз Ьеи
530 535 540
Рго Ьеи Азр Рго Зег АЬа Меб УаЬ АЬа СЬп УаЬ СЬу Рго СЬп Уа1 ν*1
545 550 555 560
Азп Пе Азп ТНг Ьуз Ьеи СЬу Туг Азп Азп АЬа УаЬ СЬу АЬа СЬу ТНг
565 570 575
СЬу Ые 7аЬ Ые Азр Рго Азп СЬу 7аЬ УаЬ Ьеи ТНг ΑΞΠ Азп НЬз 7а1
- 71 024826
530 585 590
Ые АЬа С1у АЬа ТНг Азр Не Азп АЬа РНе Зег УаЬ СЬу Зег ОЬу СЬп
595 600 605
ТНг Туг 51у УаЬ Агр УаЬ УаЬ С1 у Туг Азр Агд ТНг С1л Азр УаЬ АЬа
610 615 620
УаЬ Ьеи 51 п Ьеи Агд С1у АЬа СЬу ОЬу Ьеи Рго Зег АЬа АЬа Ые С1у
625 630 635 640
СЬу С1у УаЬ АЬа УаЬ С1у СЬи Рго УаЬ УаЬ АЬа МеЬ С1у Азп Зег С1у
645 650 655
СЬу СЬп СЬу ОЬу ТНг Рго Агд АЬа УаЬ Рго СЬу Агд УаЬ УаЬ АЬа Ьеи
660 665 670
СЬу СЬп ТНг УаЬ ΰΐη АЬа Зег АЗр Зег Ьеи ТНг СЬу АЬа СЬи СЬи ТНг
675 6В0 685
Ьеи Ав η С1у Ьеи Не СЬп РНе А5р АЬа АЬа Пе СЬп Рго СЬу Азр Зег
690 695 700
СЬу СЬу Рго УаЬ У&1 АЗП СЬу Ьеи СЬу СЬп УаЬ УаЬ СЬу МеН Азп ТНг
705 710 715 720
АЬа А1а Зег
<210> 24 <2Η> 723 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> N272 <400> 24
Мер ТНг АЬа АЬа Зег Адр Адп РНе СЬп Ьеи Зег СЬп С1у СЬу СЬп СЬу
1 5 10 15
РНе АЬа Не Рго Не СЬу СЬп АЬа МеЬ АЬа Не АЬа СЬу СЬп Ые Агд
20 25 30
Зег ОЬу СЬу СЬу £ег Рго ТНг УаЬ НЬз Не 61у Рго ТНг АЬа РНе Ьеи
35 40 45
СЬу Ьеи СЬу УаЬ УаЬ Азр Азп Азп ОЬу Азп С1у АЬа Агд УаЬ СЬп Агд
50 55 60
УаЬ УаЬ СЬу Зег АЬа Рго АЬа АЬа Зег Ьеи С1у Ые Зег ТНг СЬу Азр
65 70 75 80
УаЬ Не ТНг АЬа УаЬ Адр СЬу АЬа Рго Ые Азп Зег АЬа ТНг АЬа МеН
85 90 95
АЬэ Азр АЬа Ьеи Азп СЬу НЬз НЬе Рго СЬу Азр УаЬ Пе Зег УаЬ ТНг
100 105 ыо
Тгр СЬп ТНг Ьуз Зег СЬу СЬу ТНг Агд ТНг СЬу Азп УаЬ ТНг Ьеи А1а
115 120 125
СЬи ОЬу Рго Рго АЬа СЬи РНе МеЬ УаЬ Азр РНе СЬу АЬа Ьеи Рго Рго
ЬЗО 135 140
СЬи Ые Азп Зег АЬа Агд МеЬ Туг АЬа СЬу Рго С1у Зег АЬа Зег Ьеи
145 150 155 160
УаЬ АЬа АЬа АЬа СЬп МеН Тгр Азр Зег УаЬ АЬа Зег Азр Ьеи РНе Зег
165 170 175
АЬа АЬа Зег АЬа РНе СЬп Зег УаЬ УаЬ Тгр СЬу Ьеи ТНг УаЬ С1у Зег
180 185 190
Тгр Не С1у Зег Зег АЬа С1у Ьеи МеЬ УаЬ АЬа АЬа АЬа Зег Рго Туг
195 200 205
УаЬ АЬа Тгр МеЬ Зег УаЬ ТНг АЬа С1у СЬп АЬа СЬи Ьеи ТНг АЬа АЬа
210 215 220
СЬп УаЬ Агд УаЬ АЬа АЬа АЬа АЬа Туг СЬи ТНг АЬа Туг СЬу Ьеи ТНг
225 230 235 240
УаЬ Рго Рго Рго УаЬ Не АЬа СЬи Азп Агд АЬа СЬи Ьеи МеЬ Ые Ьеи
- 72 024826
245 250 255
Ые АЬа ТНг Азп Ьеи Ьеи СЬу СЬп Азп ТНг Рго АЬа Ые АЬа УаЬ Азп
260 265 270
СЬи АЬа СЬи Туг СЬу СЬи Меб Тгр АЬа СЬп Азр АЬа АЬа АЬа Меб РНе
275 200 285
СЬу Туе АЬа АЬа АЬа ТНг АЬа ТНг АЬа ТНг АЬа ТНг Ьеи Ьеи Рго РНе
290 295 300
СЬи СЬи АЬа Рго СЬи Меб ТНг Зег АЬа СЬу СЬу Ьеи Ьеи С1и СЬп А1а
305 310 315 320
АЬа АЬа УаЬ СЬи СЬи АЬа Зег Айр ТНг АЬа АЬа АЬа Азп СЬп Ьеи Меб
325 330 335
Азп Азп УаЬ РГО СЬп АЬа Ьеи СЬп СЬп Ьеи АЬа СЬп Рго ГНг СЬп СЬу
340 345 350
ТНг ТНг Рго Зег Зег Ьуз Ьеи СЬу СЬу Ьеи Тгр Ьуз ТНг УаЬ Зег Рго
355 360 365
НЬз Агд Зег Рго Ые Зег Азп Меб УаЬ 5ег Мег АЬа Азп Азп НЬз Меб
370 375 380
Зег Меб ТНг Азп Зег СЬу УаЬ Зег МеН ТЬг АЗП ТНг Ьеи Зег 5ег Меб
385 390 395 400
Ьеи Ьуз СЬу РЬе АЬа Рго АЬа АЬа АЬа АЬа СЬп АЬа УаЬ СЬп ТНг АЬа
405 410 415
АЬа СЬп А5П СЬу УаЬ Агд АЬа Меб 5ег Зег Ьеи СЬу Зег Зег Ьеи СЬу
420 425 430
Зег Зег СЬу Ьеи СЬу СЬу СЬу УаЬ А1а АЬа Азп Ьеи СЬу Агд АЬа АЬа
435 440 445
Зег УаЬ СЬу Зег Ьеи Зег УаЬ Рго СЬп АЬа Тгр АЬа АЬа АЬа Азп СЬп
450 455 460
АЬа УаЬ ТНг Рго АЬа АЬа Агд АЬа Ьеи Рго Ьеи ГНг Зег Ьеи ТНг Зег
465 470 475 4 В 0
АЬа АЬа СЬи Агд СЬу Рго СЬу СЬп Меб Ьеи СЬу СЬу Ьеи Рго УаЬ СЬу
485 4 90 495
СЬп Мен СЬу АЬа Агд АЬа СЬу СЬу СЬу Ьеи Зег СЬу УаЬ Ьеи Агд УаЬ
500 505 510
Рго Рго Агд Рго Туг УаЬ Меб Рго Нхз Зег Рго АЬа АЬа СЬу Азр Ые
515 520 525
АЬа Рго Ргн АЬа Ьеи Зег СЬп Азр Агд РНе АЬа Азр РНе Рго АЬа Ьеи
530 535 540
Рго Ьеи Азр Рго Зег АЬа Меб УаЬ АЬа СЬп УаЬ СЬу Рго СЬп УаЬ УаЬ
545 550 555 560
Азп Пе А5П ТНг Ьуэ Ьеи СЬу Туг Азп Аэп АЬа УаЬ СЬу АЬа СЬу ТНг
565 570 575
СЬу 11е УаЬ Ые Азр Рго Азп СЬу Уа! УаЬ Ьеи ТНг Азп Азп НЬз УаЬ
530 585 590
Ые АЬа СЬу АЬа ТНг Азр Ые Азп АЬа РНе Зег УаЬ СЬу Зег СЬу СЬп
595 600 605
ТНг Туг СЬу УаЬ Азр УаЬ УаЬ СЬу Туг Азр Агд ТНг СЬп Азр УаЬ АЬа
610 615 620
УаЬ Ьеи СЬп Ьеи Агд СЬу АЬа СЬу СЬу Ьеи Рго Зег АЬа АЬа Ые СЬу
625 630 635 640
СЬу СЬу УаЬ АЬа УаЬ СЬу СЬи Рго УаЬ УаЬ АЬа МеН СЬу АЗП Зег СЬу
645 650 655
СЬу СЬп СЬу СЬу ТНг Рго Агд АЬа УаЬ Рго СЬу Агд УаЬ УаЬ АЬа Ьеи
660 665 670
СЬу СЬп ТЬг УаЬ СЬп АЬа 5ег Айр Зег Ьеи ТНг СЬу АЬа СЬи СЬи ТНг
675 680 685
Ьеи Азп СЬу Ьеи 11й СЬп РНе Азр АЬа АЬа Ые СЬп Рго СЬу Азр АЬа
690 695 700
СЬу СЬу Рго УаЬ УаЬ Азп СЬу Ьеи СЬу СЬп УаЬ УаЬ СЬу Меб Азп ТНг
705 710 715 720
АЬа АЬа 5ег
- 73 024826 <210> 25 <2Ы> 702 <212> ПРТ <2ЬЗ> Искусственная последовательность <220 <223> МЪЬ71£ <400> 25
Азр Рго УаЬ Азр АЬа УаЬ ЬЬе Азп ТНг ТНг Суз Азп Туг СЬу СЬп УаЬ
1 5 10 15
УаЬ АЬа АЬа Теи Азп. АЬа ТНг Азр Рго С1у АЬа АЬа АЬа СЬп РНе Азп
20 25 30
АЬа Зег Рго УаЬ АЬа СЬп Зег Туг Ьеи Агд Αδη РНе Ьеи АЬа АЬа Рго
35 40 45
Рсо Рго СЬп Агд АЬа АЬа МеН АЬа АЬа СЬп Ьеи СЬп АЬа УаЬ Рго СЬу
50 55 60
АЬа АЬа СЬп Туг Пе СЬу Ьеи УаЬ СЬи 5ег УаЬ АЬа СЬу Зег Суз Азп
65 70 75 80
Азп Туг СЬи Ьеи МеТ ТНг ЬЬе Азп Туг СЬп РНе СЬу Авр УаЬ Азр АЬа
85 90 95
НЬз СЬу АЬа МеР Ые Агд АЬа СЬп АЬа АЬа Зег Ьеи СЬи АЬа СЬи Ηίε
100 105 ЫО
СЬп АЬа ЬЬе УаЬ Агд Азр УаЬ Ьеи АЬа АЬа С1у Азр РНе Тгр СЬу С1у
115 120 125
АЬа СЬу Зег УаЬ АЬа Суз СЬп СЬи РНе Ые ТНг СЬп Ьеи СЬу Агд Азп
130 135 140
РНе С 1п УаЬ Пе Туг СЬи СЬп АЬа Аэп АЬа Нгз сьу СЬп Ьуз УаЬ СЬп
145 150 155 160
АЬа АЬа СЬу Азп Аап МеН АЬа СЬп ТНг Азр Зег АЬа УаЬ СЬу Зег Зег
165 170 175
Тгр АЬа ТНг Зег МеР Зег Ьеи Ьеи Азр АЬа НЬа Пе Рго СЬп Ьеи УаЬ
180 105 190
АЬа Зег СЬп Зег АЬа РНе АЬа АЬа Ьуз АЬа СЬу Ьеи МеН Агд НЬе ТНг
195 200 205
Пе СЬу СЬп АЬа СЬи СЬп АЬа АЬа МеР Зег АЬа СЬп АЬа РНе НЬз СЬп
210 215 220
С1у 21ч Зег Зег АЬа АЬа РНе СЬп АЬа АЬа Н15 АЬа Агд РНе УаЬ АЬа
225 230 235 240
АЬа АЬа АЬа Ьуа УаЬ АзП ТНг Ьеи Ьеи Аэр УаЬ АЬа СЬп АЬа Азп Ьеи
245 250 255
С1у СЬи АЬа АЬа С1у ТНГ Туг УаЬ АЬа АЬа Азр АЬа АЬа АЬа АЬа Бег
260 265 270
ТНг Туг ТНг СЬу РНе Азр Ые МеН Азр РНе СЬу Ьеи Ьеи Рго Рго СЬи
275 280 235
УаЬ Азп Зег Зег Агд Мер Туг Зег СЬу Его СЬу Рго СЬи Зег МеТ Ьеи
290 295 300
АЬа АЬа АЬа АЬа АЬа Тгр Азр СЬу УаЬ АЬа АЬа СЬи Ьеи ТНг Зег АЬа
305 310 315 320
АЬа УаЬ Зег Туг СЬу Зег УаЬ УаЬ Зег ТНг Ьеи Ые УаЬ СЬи Рго Тгр
325 ззо 335
МеЬ СЬу Рго АЬа АЬа АЬа АЬа Мег АЬа АЬа АЬа АЬа ТНг Рго Туг УаЬ
340 345 350
СЬу Тгр Теи АЬа АЬа ТНг АЬа АЬа Ьеи АЬа ьуз СЬи ТНг АЬа ТНг СЬп
355 360 365
АЬа Агд АЬа АЬа АЬа СЬи АЬа РНе СЬу ТНг АЬа РНе АЬа МеЪ ТНг УаЬ
370 375 зео
Рго Рго Зег Ьеи УаЬ АЬа АЬа Азп Агд Зег Агд Ьеи МеР Зег Ьеи УаЬ
335 390 395 400
- 74 024826
АЬа АЬа Азп Ые Ьеи СЬу СЬп Азп Зег АЬа АЬа Пе АЬа АЬа ТЫ 415 СЬп
405 4 10
АЬа СЬи Туг АЬа СЬи МЫ Тгр АЬа СЬп Азр АЬа АЬа УаЬ МеО Туг Зег
420 425 430
Туг СЬи СЬу АЬа Зег АЬа АЬа АЬа Зег АЬа Ьеи Рго Рго РНе ТНг Рго
4 35 440 445
Рго УаЬ С1н СЬу ТЫ СЬу Рго АЬа СЬу Рго АЬа АЬа АЬа АЬа АЬа АЬа
4 50 455 4 60
ТЫ С1п АЬ а АЬа СЬу АЬа СЬу АЬа УаЬ АЬа Азр АЬа С1п АЬа ТНг Ьеи
465 470 475 430
А1а СЬп ьеи РГО РГО СЬу Ые Ьеи Зег А5р Ые Ьеи Зег АЬа Ьеи АЬа
4 Θ 5 490 495
АЬа Азп АЬа АЗР Рго Ьеи ТЫ Зег СЬу Ьеи Ьеи СЬу Ые АЬа Зег ТНг
500 505 510
Ъеи Азп Рго СЬп УаЬ СЬу Зег АЬа СЬп Рго 11е УаЬ Ые Рго ТЫ Рго
515 520 525
Пе СЬу С1и Ьеи Агр УаЬ Ые АЬа Ьеи Туг Не АЬа Зег Ые АЬа ТЫ
530 535 540
СЬу Зег Ые АЬа Ьеи АЬа Ые ты Азп ты АЬа Агд Рго Тгр НЬз Ые
545 550 555 560
СЬу Ьеи Туг СЬу Азп АЬа СЬу СЬу Ьеи СЬу Рго ТЫ СЬп СЬу НЬз Рго
565 570 575
Ьеи. Зег Зег АЬа ТЫ Аар СЬи Рго СЬи Рго Είί 3 Тгр СЬу Рго РНе СЬу
560 56 5 590
СЬу АЬа АЬа Рго УаЬ Зег АЬа СЬу УаЬ СЬу НЬз АЬа АЬа Ьеи УаЬ СЬу
595 600 605
АЬа Ьеи Зег УаЬ Рго НЬе Зег Тгр ТЫ ТЬг АЬа АЬа Рго СЬи I Ье сьп
610 615 620
Ьеи АЬа УаЬ С1п АЬа ТЫ Рго ТЫ РНе Зег Зег Зег АЬа СЬу АЬа Азр
625 630 635 640
Рго ТЫ АЬа Ьеи Азп СЬу мы Рго АЬа СЬу Ьеи Ьеи Зег СЬу МеЬ АЬа
645 650 655
Ьеи АЬа Зег Ьеи АЬа АЬа Агд СЬу ты ТЬг СЬу СЬу СЬу СЬу ты Агд
660 665 670
Зег СЬу ТЫ Зег ТЫ Азр СЬу СЬп СЬи Азр СЬу Агд Ьуз Рго Рго УаЬ
675 680 685
УаЬ УаЬ Ые Агд СЬи С1п Рго Рго Рго С1у Азп Рго Рго Агд
690 695 700
<210> 26 <2Ы> 920 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> М72-МЫ9.9-МЫ9. Θ <4С0> 26
Мес ТЬг АЬа АЬа Зег Азр АЗП РЬе СЬп Ьеи Зег СЬп СЬу СЬу СЬп СЬу
1 5 10 15
РЬе АЬа Ые Рго 11е СЬу С1п АЬа МеЪ АЬа Ые АЬа СЬу СЬп Ые Агд
20 25 30
Зег СЬу СЬу СЬу Зег Рго ТЬг УаЬ НЬб Ые СЬу Рго ТЫ АЬа РНе Ьеи
35 40 45
СЬу Ьеи СЬу УаЬ УаЬ Азр Азп Азп СЬу Азп СЬу АЬа Агд УаЬ СЬп Агд
50 55 60
УаЬ УаЬ СЬу 5ег АЬа Рго АЬа АЬа Зег Ьеи СЬу 11е Зег ТЬг СЬу Азр
65 70 75 80
УаЬ Ые ГЫ АЬа УаЬ Азр СЬу АЬа Рго Пе Азп Зег АЬа ТЬг АЬа МеЬ
Θ5 90 95
- 75 024826
АЬа Азр АЬа Ьеи 100 Азп СЬу НЬз Ηίδ Рго 105 СЬу Аар УаЬ Ые Зег ЫО УаЬ ТНг
Тгр СЬп ТНг Ьуз Зег СЬу СЬу Т1гг Агд ТНг СЬу Азп Уа1 ТНг Ьеи АЬа
115 120 125
СЬи СЬу Рго Рго АЬа СЬи РНе Меб Уа1 Азр РНе СЬу АЬа Ьеи Рго Рго
ЬЗО 135 140
СЬи Ые Азп Зег АЬа Агд МеН Туг А1а СЬу Рго СЬу Зег АЬа Зег Ьеи
145 150 155 160
УаЬ АЬа АЬа АЬа СЬп МеН Тгр Азр Зег УэЬ АЬа Зег Аэр Ьеи РНе Зег
Ь 65 170 175
АЬа АЬа Зег АЬа РНе СЬп Зег Уа1 νβΐ Тгр СЬу Ьеи ТНг ν^Ι СЬу Зег
180 185 190
Тгр 11© СЬу Зег Зег АЬа СЬу Ъеи Мер УаЬ АЬа АЬа АЬа Зег Рго Туг
195 200 205
ν31 АЬа Тгр МеН Зег ν31 ТНг А1а 01 у СЬп АЬа СЬи Ьеи ТНг АЬа АЬа
210 215 220
СЬп УаЬ Агд 7а1 АЬа АЬа АЬа А1а Туг СЬи ТЬг АЬа Туг СЬу Ьеи ТНг
225 230 235 240
Уа1 Рго Рго Рго Уа1 Ые АЬа С1и Аэп Агд АЬа СЬи Ьеи МеН Ые Ьеи
245 250 255
Ые АЬа ТНг Аэп Ьеи Ьеи ОЬу С1п Азп ТНг Рго АЬа Ые АЬа УаЬ Азп
260 265 270
СЬи АЬа СЬи Туг СЬу СЬи МеН Тгр А1а СЬп Аер АЬа АЬа АЬа МеН РНе
275 280 285
СЬу Туг АЬа АЬа АЬа ТНг АЬа ТЬг А1а ТНг АЬа ТНг Ьеи Ьеи Рго РНе
290 295 300
СЬи СЬи АЬа Рго СЬи МеН ТНг Зег А1а СЬу СЬу Ьеи Ьеи СЬи СЬп АЬа
305 310 315 320
АЬа АЬа Уа1 СЬи СЬи АЬа Зег Азр ТНг АЬа АЬа АЬа Азп СЬп Ьеи МеН
325 330 335
Азп Азп УаЬ Рго СЬп АЬа Ьеи <31п С1п Ьеи АЬа СЬп Рго ТНг СЬп СЬу
340 345 350
Ткг ТНг Рго Зег Зег Ьуз Ьеи С1у О1у Ьеи Тгр Ьуз ТНг УаЬ Зег Рго
355 360 365
ΗΪΞ Агд Зег Рго Ые Зег Аэп Мер Уа1 Зег МеН АЬа Азп Азп НЬз МеН
370 375 380
Зег Мен ТНг Азп Зег ОЬу УаЬ 8ег Меб ТНг Азп ТНг Ьеи Зег Зег МеН
385 390 395 400
Ьеи Ьуз СЬу РЬе АЬа Рго АЬа А1а А1а АЬа СЬп АЬа УаЬ СЬп ТНг АЬа
405 410 4Ь5
АЬа СЬп Азп СЬу УаЬ Агд АЬа МеР Зег Зег Ьеи СЬу Зег Зег Ьеи СЬу
420 425 4 30
Зег Зег СЬу Ьеи СЬу СЬу СЬу νβΐ А1а АЬа Азп Ьеи СЬу Агд АЬа АЬа
435 440 445
Зег УаЬ СЬу Зег Ьеи Зег УаЬ Рго С1п АЬа Тгр АЬа АЬа АЬа Азп СЬп
450 455 460
АЬа УаЬ ТНг Рго АЬа АЬа Агд Й1а Ъеи Рго Ьеи ТНг Зег Ьеи ТНг Зег
465 470 475 4 Θ 0
АЬа АЬа СЬи Агд сьу Рго СЬу С1п Меб Ьеи СЬу СЬу Ьеи Рго УаЬ СЬу
485 490 495
СЬп Мен СЬу АЬа Агд АЬа СЬу С1у С1у Ьеи Зег СЬу νηΐ Ьеи Агд 7а1
500 505 510
Рго Рго Агд Рго Туг УаЬ МеН Рго ΗΪ3 Зег Рго АЬа АЬа СЬу Азр Ые
515 520 525
АЬа Рго Рго АЬа Ьеи Зег СЬп Азр Агд РНе АЬа Азр РНе Рго АЬа Ьеи
530 535 540
Рго Ьеи Азр Рго 5ег АЬа МеН Уа1 А1а СЬп УаЬ СЬу Рго СЬп УаЬ УаЬ
545 550 555 560
Азп Ые Азп ТНг Ьуз Ьеи СЬу Туг Азп Азп АЬа УаЬ СЬу АЬа СЬу ТЬг
565 570 575
СЬу Ые Уа! 11е Азр Рго Азп С1у ν&ι 7аЬ Ьеи ТНг Азп Азп ΗΪ5 7а1
- 76 024826
590 595 590
11е А1а С1у АТа ТЬг Азр Не Азл АТа РЛе 5ег УаТ С1у Зег СТу С1п
595 600 605
ТЬг Туг СТу Ш Азр Уа! УаТ СТу Туг Азр Агд ТЬг С1л Азр Уа1 АТа
610 615 620
Уа1 Ъеи С1л Ъеи Агд С1у А1а С1у СТу Ъеи Рго Зег А1а А1а Пе С1у
625 630 635 640
С1у С1у Уа1 А1а ν&ι СТу С1и Рго УаТ Уа1 А1а МеЛ С1у Азл Зег СТу
645 650 655
С1у С1л 51у С1у ТЬг Рго Агд А1а УаТ Рго С1у Агд Уа1 Уа1 А1а Ъеи
660 665 670
С1у С1п ГЬг Уа1 С1п А1а Зег Азр Зег Ъеи ТЛг С1у А1а С1и СТи ТЛг
675 690 685
Ъеи Αδη С1у Ъеи Пе СТп РЬе Азр А1а А1а Не С1п Рго С1у Азр А1а
690 695 700
СТу СТу Ргс νπ Уа1 Азп СТу Ъеи СТу СТп УаТ УаТ СТу МеТ Азл ТЛг
705 710 715 720
А1 а А1а Зег Зег ТЬг МеГ ТЬг Не Азл Туг С1п РЬе СТу Азр Уа1 Азр
725 730 735
А1а ΗΪ5 еъу АТа Мее 11е Агд А1а С1п А1а А1а Зег Ъеи С1и АТа С1и
740 745 750
НТз СТл А1а 11е νπ Агд Азр УаТ Ъеи А1а А1а С1у Азр РЬе Тгр С1у
755 760 7 65
01 у А1а С1у Зег УаТ А1а суз С1п С1и РЛе Не ТЬг С1п Ъеи С1у Агд
770 775 780
Азп. РЛе С1п Уа1 11е Туг С1и С1п АТа Азл АТа ΗΪ5 СТу С1п Ъуз Уа1
785 790 795 800
СТп А1а А1а С1у Азл Азп МеЛ АТа С1п ТЛг Азр Зег А1а Уа1 СТу Зег
305 810 815
Зег Тгр АТа ТЬг Зег МеЛ Зег Ъеи. Ъеи. Азр АТа НТз На Рго СТл Ъеи
820 825 ВЗО
Уа1 А1а Зег С1л Зег АТа РЬе АТа АТа Ъуз АТа С1у Ъеи МеЛ Агд НТё
835 840 Θ45
ТЬг 11е С1у 61п А1а СТи СТп А1а А1а МеТ Зег А1а С1п А1а РЬе Нгз
850 055 060
СТп С1у С1и Зег Зег АТа А1а РЬе С1п А1а А1а НТз АТа Агд РЬе Уа1
865 870 875 880
А1а АТа А1а А1а Ъуз Уа1 Азп ТЬг Ъеи Ъеи Азр Уа1 А1а С1п А1а Азл
8Θ5 890 895
Ъеи С1у С1и АТа А1а С1у ТЬг Туг Уа1 А1а АТа Азр АТа А1а АТа АТа
900 905 910
Зег ТЬг Туг ТЬг СТу РЬе РГО Тгр
915 920
<210 27 <211> 1010 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательнесть <220>
<223> ММ3 <400> 27
МеЛ ТЛг А1а АТа Зег Азр Азп рье С1п Ъеи Зег СТп СТу С1у С1п СТу
1 5 10 15
РЛе АТа Не Ргс Не С1у 01л А1а МеЛ АТа Пе АТа СТу 61п Не Агд
20 25 30
Зег СТу 61у С1у Зег Рго ТЬг УаТ НТз 11е СТу Рго ТЛг А1а РЛе Ъеи
35 40 45
СТу Ъеи СТу УаТ УаТ Азр Азл Азл С1у Азп СТу АТа Агд Уа1 СТп Агд
- 77 024826
50 55 60
УаЬ УаЬ СЬу Зег АЬа Рго АЬа АЬа Зег Ъеи СЬу Ые Зег ТНг СЬу Азр
65 70 75 80
УаЬ Ые ТЬг АЬа УаЬ Азр СЬу АЬа Рго Ые Аэп Зег АЬа ТНг АЬа МеС
05 90 95
АЬа Азр АЬа Ьеи Азп СЬу Нгз НЬз Рго СЬу Агр УаЬ Ые Зег УаЬ ТНг
100 105 ЫО
Тгр СЬп ТЬг Ъуз Зег СЬу СЬу ТНг Агд ТНг СЬу Азп УаЬ ТНг Ъеи АЬа
115 120 125
СЬи СЬу РГО РГО АЬа СЬи РЬе МеС УаЬ АЗр РЬе еьу АЬа Ъеи Рго Рго
130 135 140
СЬи Ые Азп Зег АЬа Агд МеС Туг АЬа СЬу Рго СЬу Зег АЬа Зег Ъеи
145 150 155 160
УаЬ АЬ а АЬа АЬа СЬп МеС Тгр Азр Зег УаЬ АЬа Зег Азр Ъеи РЬе Зег
165 170 175
АЬа АЬа Зег АЬа РЬе СЬп Зег УаЬ УаЬ Тгр СЬу Ъеи ТЫ УаЬ СЬу Зег
13 0 1Э5 190
Тгр Ые СЬу Зег Зег АЬа СЬу Ъеи МеС УаЬ АЬа АЬа АЬа Зег Рго Туг
195 200 205
УаЬ АЬа Тгр МеС Зег УаЬ ТЬг АЬа СЬу СЬп АЬа СЬи Ъеи ТЬг АЬа АЬа
210 215 220
СЬп УаЬ Агд УаЬ АЬа АЬа АЬа АЬа Туг СЬи гы АЬа Туг СЬу Ъеи ГЫ
225 230 235 240
Уа! Рго Рго Рго УаЬ Ые АЬа СЬи Азп Агд АЬа СЬи Ъеи МеС 1Ье Ъеи
245 250 255
11е АЬа ТПг Аэп Ъеи Ъеи СЬу СЬп Азп ТЫ Рго АЬа Ые АЬа УаЬ Азп
260 265 270
С1и АЬа СЬи Туг СЬу СЬи МеС Тгр АЬа СЬп Азр АЬа АЬа АЬа МеС РЬе
275 280 285
СЬу Туг АЬа АЬа АЬа ТЬг АЬа ТЬг АЬа ТЬг АЬа ТЬГ Ъеи Ъеи Рго РЬе
290 295 300
СЬи СЬи АЬа Рго СЬи МеС ТЬг Зег АЬа СЬу СЬу Ъеи Ъеи СЬи СЬп АЬа
305 310 315 320
АЬа АЬа УаЬ СЬи СЬи АЬа Зег Азр ТЬг АЬа АЬа АЬа Азп СЬп Ъеи МеС
325 330 335
Азп Абп УаЬ Рго СЬп АЬа Ъеи СЬп СЬп Ъеи АЬа СЬп Рго ТНг СЬп СЬу
340 345 350
ТЬг ТЬг Рго Зег Зег Ъуз Ъеи СЬу СЬу Ъеи Тгр Ъуз ТНг УаЬ Зег Рго
355 360 365
НЬз Агд Зег Рго Ые Зег Азп Мес УаЬ Зег МеС АЬа Азп Азп НЬз МеС
370 375 380
5ег МеС ТЬг Азп Зег СЬу УаЬ Зег МеС ТЬг Азп ТЬг Ъеи Зег Зег МеС
385 390 395 400
Ьеи Ьуз СЬу РЬе АЬа Рго АЬа АЬа АЬа АЬа СЬп АЬа УаЬ СЬп ТЬг АЬа
405 410 415
АЬа СЬп АзП СЬу УаЬ Агд АЬа МеС Зег Зег Ъеи СЬу Зег Зег Ъеи СЬу
420 425 430
Зег Зег СЬу Ъеи СЬу СЬу СЬу УаЬ АЬа АЬа Азп Ъеи СЬу Агд АЬа АЬа
435 440 445
Зег УаЬ СЬу Зег Ъеи Зег Уа1 Рго СЬп АЬа Тгр АЬа АЬа АЬа Аэп СЬп
450 455 4 60
АЬа УаЬ ТЬг Рго АЬа А1а Агд АЬа Ъеи Рго Ъеи ТЬг Зег Ъеи ТНг Зег
4 65 470 475 400
АЬа АЬа СЬи Агд СЬу Рго СЬу СЬп МеС Ъеи СЬу СЬу Ъеи Рго УаЬ СЬу
485 430 495
СЬп МеС СЬу АЬа Агд АЬа СЬу СЬу СЬу Ъеи Зег СЬу УаЬ Ъеи Агд УаЬ
500 505 510
Рго Рго Агд Рго Туг УаЬ МеС Рго Ηΐ5 Зег Рго АЬа АЬа СЬу Азр Ые
515 520 525
АЬа Рго Рго АЬа Ъеи Зег СЬп Азр Агд РЬе АЬа Азр РЬе Рго АЬа Ъеи
530 535 540
- 78 024826
Рго Ъеи Азр 545 Рго Зег АЬа 550 МеН УаЬ АЬа СЬп УаЬ 555 СЬу Рго СЬп УаЬ УаЬ 560
Αξγϊ Ые Азп ТНг Ьуз Ьеи СЬу Туг Азп Азп АЬа УаЬ СЬу АЬа СЬу ТНг
565 570 575
СЬу Ые УаЬ Ые Аэр Рго Азп СЬу УаЬ УаЬ Ьеи ТНг Азп АЗП НЬз УаЬ
590 585 590
Ые АЬа СЬу АЬа ТНг Азр Ые Азп АЬа РЬе Зег УаЬ СЬу Зег СЬу СЬп
595 600 605
ТНг Туг СЬу УаЬ Азр УаЬ УаЬ СЬу Туг Азр Агд ТНг С1п Азр УэЬ АЬа
610 615 620
УаЬ Ьеи СЬп Ьеи Агд СЬу АЬа СЬу СЬу Ьеи Рго Зег АЬа АЬа Ые СЬу
625 630 Й35 640
СЬу СЬу УаЬ АЬа УаЬ СЬу СЬи Рго УаЬ УаЬ АЬа МеН СЬу Азп Зег СЬу
645 650 655
СЬу СЬп СЬу СЬу ТНг Рго Агд АЬа УаЬ Рго СЬу Агд УаЬ УаЬ АЬа Ьеи
660 665 670
СЬу СЬп ТНг УаЬ СЬп АЬа Зег Азр Зег Ьеи ТНг СЬу АЬа СЬи СЬи ТНг
675 690 685
ьеи Азп СЬу Ьеи Ые СЬп РНе Азр АЬа АЬа Пй СЬп Рго СЬу Аэр АЬа
690 695 700
СЬу СЬу Рго УаЬ УаЬ Азп СЬу Ьеи СЬу СЬп УаЬ УаЬ СЬу МеН Азп ТНг
705 710 715 720
АЬа АЬа Зег Зег СЬу РНе 5ег Агд Рго СЬу Ьеи Рго УаЬ СЬи Туг Ьеи
725 730 735
СЬп УаЬ Рго Зег Рго Зег МеН СЬу Агд Азр Ые Ьуз УаЬ СЬп РНе СЬп
740 745 750
Зег СЬу СЬу Азп Азп Зег Рго АЬа УаЬ Туг Ьеи Ьеи Азр СЬу Ьеи Агд
755 760 765
АЬа СЬп Азр Азр Туг Азп СЬу Тгр Азр 11е Азп ТНг Рго АЬа РНе СЬи
770 775 780
Тгр Туг Туг СЬп Зег СЬу Ьеи Зег Ые УаЬ МеН Рго УаЬ СЬу СЬу СЬп
785 790 795 800
Зег Зег РЬе Туг Зег Азр Тгр Туг Зег Рго АЬа Суз СЬу Ьуз АЬа СЬу
805 810 815
Суз СЬп ТНг Туг Ьуз Тгр ЙЬи ТНг РНе Ьеи ТНг Зег СЬи Ьеи Рго СЬп
920 825 830
Тгр Ьеи Зег АЬа Азп Агд АЬа УаЬ Ьуз Рго ТНг СЬу Зег АЬа АЬа Ые
935 840 845
СЬу Ьеи Зег МеН АЬа СЬу Зег Зег АЬа Мен Ые Ьеи АЬа АЬа Туг Нгз
850 855 860
Рго СЬп СЬп РНе Ые Туг АЬа СЬу Зег Ьеи Зег АЬа Ьеи Ьеи Азр Рго
865 870 875 080
Зег С1п С1у Мен СЬу РГО Зег Ьеи Ые СЬу Ьеи АЬа МеН СЬу Аэр АЬа
385 8 90 895
СЬу СЬу Туг Ьуэ АЬа АЬа Азр МеН Тгр СЬу Рго Зег Зег Азр Рго АЬа
900 905 910
Тгр СЬи Агд Азп Азр Рго ТНг СЬп СЬп Не Рго Ьуз Ьеи УаЬ АЬа Азп
915 920 925
Азп ТНг Агд Ьеи Тгр УаЬ Туг Суз СЬу Азп СЬу ТНг Рго Азп СЬи Ьеи
930 935 940
СЬу СЬу АЬа Αδη 11е Рго АЬа СЬи РНе Ьеи СЬи Азп РНе УаЬ Агд Зег
945 950 955 960
Зег Азп Ьеи Ьуз РНе СЬп Азр АЬа Туг Азп АЬа АЬа СЬу СЬу НЬз Азп
965 970 97 5
АЬа УаЬ РНе Азп РЬе Рго Рго Азп СЬу ТНг НЬз Зег Тгр СЬи Туг Тгр
980 985 990
СЬу АЬа СЬп Ьеи Азп АЬа МеН Ьуз С1у Азр ι Ьеи СЬп Зег Зег Ьеи С1
995 1000 1005
АЬа СЬу 1010
- 79 024826 <210> 28 <2Ы> 114а <212> ПРТ <2ЬЗ> Искусственная последовательность <220>
<223> М114 <400> 28
Меб ТНг АЬа АЬа Зег А$р А$п РНе СЬп Ьеи Зег СЬп С1у СЬу С1п СЬу
1 5 10 15
РНе АЬа 11е Рго Ые СЬу С1п АЬа Меб АЬа 1Ье АЬа СЬу С1п Ые Агд
20 25 50
Зег СЬу С1у СЬу Зег Рго ТНг УаЬ НЬз Ые С1у Рго ТНг АЬа РНе Ьеи
35 40 45
СЬу Ьеи С1у УаЬ УаЬ Азр Азп Азп СЬу Азп С1у АЬа Агд Уа1 СЬп Агд
50 55 60
νπ УаЬ СЬу Зег АЬа Рго АЬа АЬа Зег Ьеи СЬу Ые Зег ТНг СЬу Азр
65 70 75 60
УаЬ Ые ТНг АЬа УаЬ Азр СЬу АЬа Рго Пе Азп Зег АЬа ТНг АЬа Меб
85 90 95
АЬа Азр АЬа Ьеи Азп СЬу НЬз НЬз Рго СЬу Азр УаЬ Ые Зег УаЬ ТНг
100 105 ыо
Тгр С1п Тпг ьуз Зег сьу СЬу ТНг Агд ТНг С1у Азп УаЬ ТНг Ьеи АЬа
115 120 125
СЬи СЬу Рго Рго АЬа СЬи РНе Меб УаЬ Азр РНе СЬу АЬа Ьеи Рго Рго
130 135 140
СЬи Ые Азп. Зег АЬа Агд Меб Туг АЬа ОЬу Рго С1у Зег АЬа Зег Ьеи
145 150 155 160
УаЬ АЬа АЬа АЬа С1п Меб Тгр Азр Зег УаЬ АЬа Зег Азр Ьеи РНе Зег
165 170 175
АЬа АЬа Зег АЬа РНе С1п Зег УаЬ УаЬ Тгр С1у Ьеи ТНг УаЬ СЬу Зег
180 185 190
Тгр Ые С1у Зег Зег АЬа СЬу Ьеи Меб УаЬ АЬа АЬа АЬа Зег Рго Туг
195 200 205
УаЬ АЬа Тгр Меб Зег УаЬ ТНг А1а С1у СЬп А1а СЬи Ьеи ТНг АЬа АЬа
210 215 220
СЬп УаЬ Агд УаЬ АЬа АЬа АЬа АЬа Туг СЬи ТНг АЬа Туг С1у Ьеи ТНг
225 230 235 240
УаЬ Рго Рго Рго УаЬ Ые АЬа СЬи Азп Агд АЬа СЬи Ьеи Меб Ые Ьеи
245 250 255
Ые АЬа ТНг Азп Ьеи Ьеи С1у С1п Азп ТНг Рго АЬа Ые АЬа. УаЬ Азл
260 265 270
СЬи АЬа СЬи Туг СЬу СЬи Меб Тгр АЬа СЬп Азр АЬа АЬа АЬа Меб РНе
275 280 285
С1у Туг АЬа АЬа АЬа ТНг АЬа ТНг АЬа ТНг АЬа ТНг Ьеи Ьеи Рго РНе
290 295 300
СЬи СЬи АЬа Рго СЬи Меб ТНг Зег АЬа еьу С1у Ьеи Ьеи СЬи С1п АЬа
305 зьо 515 320
АЬа АЬа УаЬ СЬи СЬи АЬа Зег Азр ТНг АЬа АЬа АЬа Азп С1п Ьеи. Меб
325 ззо 335
Азп Азп УаЬ Рго СЬп АЬа Ьеи С1п С1п Ьеи АЬа СЬп Рго ТНг б1п С1у
340 345 350
ТНг ТНг Рго Зег Зег Ьуз Ьеи СЬу СЬу Ьеи Тгр Ьу5 ТНг УаЬ Зег Рго
355 360 365
НЬз Агд Зег Рго Не Зег Азп Меб УаЬ Зег Меб АЬа Азп Азп НЬз Меб
370 375 300
Зег Меб ТНг Азп Зег С1у УаЬ Зег Меб ТНг Азп ТНг Ьеи Зег Зег Меб
385 390 395 400
Ьеи Ьуз СЬу РНе АЬа Рго АЬа АЬа А1э АЬа СЬп АЬа УаЬ СЬп ТНг АЬа
- 80 024826
405 410 4 15
АЬа СЬп Азп СЬу УаЬ Агд АЬа Меб Зег Зег Ьеи СЬу Зег Зег Ъеи СЬу
420 425 430
Зег Зег СЬу Ьеи СЬу СЬу СЬу УаЬ АЬа АЬа Азп Ъеи СЬ у Агд АЬа АЬа
435 440 445
Зег УаЬ СЬу 5ес Ьеи Зег УаЬ Рго СЬп АЬа Тгр АЬа АЬ а АЬа Азп СЬп
450 455 460
АЬа УаЬ ТНг Рго АЬа АЬа Агд АЬа Ьеи Рго Ъеи ТНг Зег Ъеи ТНг Зег
465 470 475 480
АЬа АЬа СЬи Агд СЬу Рго СЬу СЬп Меб Ъеи СЬу СЬу Ъеи Рго УаЬ СЬу
485 490 495
СЬп Меб СЬу АЬа Агд АЬа СЬу СЬу СЬу Ъеи Зег СЬу УаЬ Ъеи Агд УаЬ
500 505 510
Рго Рго Агд Рго Туг УаЬ Меб Рго НЬз Зег Рго АЬа АЬа СЬу Азр Ые
5Ь5 520 525
АЬа Рго Рго АЬа Ьеи Зег СЬп Азр Агд РНе АЬа Азр РНе Рго АЬа Ъеи
530 535 540
Рго Ьеи Азр Рго Зег АЬа Меб УаЬ АЬа СЬп УаЬ СЬу Рго СЬп УаЬ УаЬ
545 550 555 560
Азп Ые Азп ТНг Ьуз Ъеи СЬу Туг Аеп Азп АЬа УаЬ СЬу АЬа СЬу ТНг
565 570 575
СЬу Ые УаЬ Ые Азр Рго Азп СЬу УаЬ Уа1 Ьеи ТНг Азп Азп НЬз УаЬ
580 565 590
ЬЬе АЬа СЬу АЬа ТНг Азр Ые Азп АЬа РНе Зег УаЬ СЬу Зег СЬу СЬп
595 600 605
ТНг Туг СЬу УаЬ Азр УаЬ УаЬ СЬу Туг Азр Агд ТНг СЬп Азр УаЬ АЬа
610 615 620
УаЬ Ьеи СЬп Ьеи Агд СЬу АЬа СЬу СЬу Ьеи Рго 2ег АЬа А1а Ые СЬу
625 630 635 640
СЬу СЬу УаЬ А1а УаЬ СЬу СЬи Рго УаЬ УаЬ АЬа Меб СЬу Азп Зег СЬу
645 650 655
СЬу СЬп СЬу СЬу ТНг Рго Агд АЬа УаЬ Рго СЬу Агд УаЬ УаЬ АЬа Ъеи
660 665 670
еьу СЬп ТНг УаЬ еьп АЬа Зег Азр Зег Ьеи ТНг СЬу АЬа СЬи СЬи ТНг
675 680 635
Ьеи. Азп СЬу Ьеи Ые СЬп РНе Азр АЬа АЬа 11е СЬп Рго СЬу Азр АЬа
690 695 700
СЬу СЬу Рго УаЬ УаЬ Азп СЬу Ьеи СЬу СЬп УаЬ УаЬ СЬу Меб Азп ТНг
705 710 715 720
АЬа АЬа Зег Зег ТЬг Меб Азр РЬе СЬу Ьеи Ьеи Рго Рго СЬи УаЬ Азп
725 730 735
5ег Зег Агд Меб Туг Зег СЬу Рго СЬу Рго Ыи Зег Меб Ъеи АЬа АЬа
740 745 750
АЬа АЬа АЬа Тгр Аар СЬу УаЬ АЬа АЬа СЬи Ьеи ТНг Зег АЬа АЬа УаЬ
755 760 765
Зег Туг СЬу Зег УаЬ УаЬ Зег ТНг Ъеи Ые УаЬ СЬи Рго Тгр Меб СЬу
770 775 7 а о
Рго АЬа АЬа АЬа АЬа Меб АЬа А1а АЬа АЬа ТНг РГО Туг УаЬ СЬу Тгр
785 790 795 600
Ьеи АЬа АЬа ТЬг АЬа АЬа Ьеи АЬа Ьу5 СЬи ТНг А1а ТЬг СЬп АЬа Агд
805 810 815
АЬа АЬа АЬа СЬи АЬа РНе СЬу ТНг АЬа РНе АЬа Меб ТЬг УаЬ Рго Рго
320 825 Θ30
Зег Ьеи УаЬ АЬа АЬа Азп Агд Зег Агд Ъеи Меб Зег Ъеи УаЬ АЬа АЬа
835 840 845
Азп 11е Ьеи СЬу СЬп Азп Зег АЬа АЬа 11е АЬа АЬа ТНг СЬп АЬа СЬи
850 855 860
Туг АЬа СЬи Меб Тгр АЬа СЬп Азр АЬа А1а УаЬ Меб Туг Зег Туг СЬи
865 870 875 880
СЬу АЬа Зег АЬа АЬа АЬа Зег АЬа Ьеи Рго Рго РНе ТНг Рго Рго УаЬ
885 890 895
- 81 024826
СЬп СЬу ТНг СЬу 900 Рго АЬа СЬу Рго АЬа 905 А1а А1а А1а А1а АЬа 910 ТНг СЬп
АЬа АЬа СЬу АЬа СЬу АЬа 7аЬ АЬа Азр АЬа СЬп АЬа ТНг Ьеи АЬа СЬп
915 920 925
Ъеи Рго Рго С1у Ие Ъеи Зег Азр Ые Ьеи Зег АЬа Ьеи АЬа АЬа Азп
930 935 940
АЬа Аар Рго Ьеи ты Зег С1у Ьеи Ьеи СЬу Ые АЬа 5ег ТНг Ъеи Азп
945 950 955 960
Рго СЬп УаЬ СЬу Зег АЬа СЬп Рго Ые 7а1 Ые Рго ТНг Рго Ые СЬу
965 970 975
СЬи Ьеи Азр УаЬ Ые АЬа Ьеи Туг Ые АЬа Зег Ые АЬ а ТНг СЬу Зег
980 985 990
Пе АЬа Ьеи АЬа Ые ТЫ Азп ТНг АЬа ι Агд г Ргс ι Тгр ' ΗΪ5 : Ые СЬу Ьеи
995 1000 1005
Туг СЬу 1010 Азп АЬа СЬу С1у Ьеи 1015 С1у Рго ТНг СЬп СЬу 1020 НЬз Рго Ьеи
Зег Зег АЬа ТНг Азр СЬи Рго СЬи Рго НЬЗ Тгр еьу Рго РНе СЬу
1025 1030 1035
СЬу АЬа АЬа Рго УаЬ Бег АЬа СЬу УаЬ СЬу НЬз АЬа АЬа Ьеи УаЬ
1040 1045 1050
СЬу АЬа Ъеи Зег УаЬ Рго НЬз Зег Тгр ТНг ТНг АЬа АЬа Рго СЬи
1055 1060 1065
Ые СЬп Ьеи АЬа УаЬ СЬп АЬи ТНг Рго ТНг РНе Зег Зег Зег АЬа
1070 1075 1080
СЬу АЬа Азр Рго ТНг АЬа Ъеи Азп С1у МЫ Рго АЬа СЬу Ьеи Ьеи
1065 1090 1095
Зег С1у МеГ АЬа Ьеи АЬа Зег Ьеи АЬа АЬ θ Агд СЬу ТНг ТНг еьу
ыоо 1105 1110
СЬу С1у С1у ТНг Агд Зег С1у ТНг Бег ТНГ Азр СЬу СЬп СЬи Азр
1115 1120 1125
СЬу Агд Ьув Рго Рго УаЬ УаЬ УаЬ Ые Агд СЬи СЬп Рго Рго Рго
ИЗО 1135 1140
СЬу Азп Рго Рго Агд
1145 <210> 29 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬас&еггигп СиЪегси1оз15 <400> 29
РЬе Ые 11е Азр Рго ТЬг Ые Зег АЬа 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> ПРТ <213> Мусо&асЬег1ит СиЬегсиЬозгз <40О> 30
11е Ьеи Туг Зег Зег Ьеи СЬи Туг РЬе 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> ПРТ <213> ЛГусоЪасСегЬит биЬегоиЬозЬз
- 82 024826 <400 31
Ъеи С1и Туг РЬе 51и Ъуз А1а Ъеи 21и
1 5
<210 <211 > <212> <213> 32 9 ПРТ МусоЬасСег! ил? СиЬегои1 оз ί 5
<400 32
Туг А1а &1у Ъуэ Азп Агд Азп НЪз УаЪ
1 5
<210 <211> <212> <213> 33 9 ПРТ МусоЬао&егХилз СиЬегоиЪозТз
<400 33
Ъеи 11е ΗΪ2 Азр С1п А1а Азп А1а Уа1
1 5
<210> <211> <212> <213? 34 9 ПРТ МусоЪасСег! ил? СиЬегоиТозиз
<400> 34
РЬе Уа1 Агд Рго Уа1 А1а Уа1 Азр Ъеи
1 5
<210 <211> <212> <213> 35 9 ПРТ МусоЬас1:ег1и?п биЪегсиЗозиэ
<400 35
Ъеи ТЬг Туг Не Рго Уа1 Уа1 С1у Нйз
1 5
<21(0 <211> <212> <213> 36 9 ПРТ МусоЬасСег!ит биЬэгси1о515
<400> 36
Туг Ие Рго Уа1 \/а1 С1у Ήίε А1а Ъеи
1 5
<210> <211> <212> <213> 37 9 ПРТ МусоЬасбегί ит ЬиЬегсиЪоэиз
<400> 37
- 83 024826
Туг Ьеи УаЬ УаЬ Ьуз ТНг Ьеи Ые Азп 1 5 <2Ь0> 38 <211> 9 <2Ь2> ПРТ <213> МусрЬасЬегЬиш (:иЬегси2озЬз <400> 38
Ьеи УаЬ УаЬ Ьуз ТЬг Ьеи Ые Азп АЬа 1 5 <2Ю> 39 <211> 9 <212> ПРТ <213> Л/усод^сЬегЬиш саЬегсиЬоаЬз <400> 39
УаЬ Ьуз ТЬг Ьеи Ые Азп АЬа ТНг ОЬп 1 5 <210 40 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬассепит £иЬегси1оз1з <400> 40
Ьеи Ьуз Ьеи Ьеи АЬа Ьуз Ьеи АЬа ОЬи 1 5 <210> 41 <2Ь1> 9 <2Ь2> ПРТ <213> МусоЪасЬегтит С.иЬегси1оз13 <400> 41
Ьеи УаЬ АЬа АЬа АЬа Т1е АЬа Азр Ые 1 5 <210> 42 <211> 9 <212? ПРТ <213> Мусо&ас£ег1ит £иЬегси1оз13 <400> 42
11е 11е Зег Азр УаЬ А1а Азр 11е Ые 1 5 <210> 43 <21Ь> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬарсегги® ЬиЬегс эЬидЬ/з <400> 43
Тгр СЬи РЬе Ые ТНг Аеп АЬа Ьеи Азп
- 84 024826 <210> 44 <211> 9 <212> ΠΡΤ <213> Ь'уссЬзсТегТшл СиТзегсиТозТг <400> 44
Ьеи РКе СТу АТа А1а СТу Ьеи Зег А1е 1 5 <210> 45 <211> 9 <2Т2> ПРТ <21_3> МусоЬас£ег/ит {:иЪегси2о£Т£ <400> 4 5
Ьеи ДТа Ηϊε АТа Азр Зег Ьеи А1а Зег 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬаоТегТшп £иЬегси1а51з <400> 46
Ьеи АТа Зег Зег А1а Зег Ьеи Рго АТа 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> ПРТ <213> Мусора с ТегТдлп СиЬеге^ТозТз <400> 47
РЬе СТу С1у Ьеи Рго Зег Ьеи А1а СТп. 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> ПРТ <213> ЛГусоТзасТегТигп СиЬегсиТозТз <400> 48
РЬе 11е 11е Азр Рго ТЬг 11е Зег АТа
5 <210> 49 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЪ#сСегАщп ЬиЬегеиТо^Т^ <400> 49
11е 11е Азр Рго ТЬг Пе Зег А1а 11е 1 5
- 85 024826 <210> 50 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬаоГегЬит ГиЬзегсиЬозЬз <4О0> 50
Рго ТЬг Ые Зег АЬа Ые Азр СЬу Ъеи
5 <210> 51 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусойасСегЬид? <:иЬегси1озЬз <400> 51
ТЬг 11е Зег АЬа 11е Азр СЬу Ъеи Туг 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> ОРТ <213> Мусо£>ассег1ит сиЬегсиЬозЬз <400> 52
Зег АЬа Ые Азр <31у Ъеи Туг Азр Ъеи 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> ПРТ <213> Мусо^ас^ег^ит £иЪегси1оз15 <400> 53
АЬа Ые Азр СЬу Ъеи Туг Азр Ъеи Ъеи 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЪас£егз.ит ЕиЬегси1оз1$ <400> 54
Ъеи Туг Азр Ъеи Ъеи СЬу 11е СЬу Ые 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСегЬилг сиЪегсиЬозЬз <400> 55
Ые Рго Азп СЬп С1у СЬу Пе Ъеи Туг 1 5
- 86 024826 <210> 56 <211> 9 <212> ПРТ <213> Мусо&$сСег.2.ит бидегсиЬозί$ <400> 56
СЬу 11е Ьеи Туг Зег Зег Ьеи СЬи Туг 1 5 <2Ь0> 57 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬас!егЬид! СиЪегсиЬозЫ <400> 57
Туг Зег Зег Ьеи С1и Туг РЬе СЬи Ьуз 1 5 <2Ю> 58 <21Ь> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСегЬига биЬегсиЬозЬз <400> 58
Зег Ьеи СЬи Туг РНе СЬи Ьуз АЬа Ьеи 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСегхил·! СиЪегсиЬозЬз <400> 59
Туг РЬе СЬи Ьуз АЬа Ьеи СЬи СЬи Ьеи 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> ПРТ <21Э> МусоЪасбегЬилз Сги&егсиЬозЬз <400> 60
РЬе СЬи Ьуз АЬа Ьеи СЬи. СЬи Ьеи АЬа 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬ<ас£ег1 игл £иЬегси1оз1з <400> 61
Азп НЬз УаЬ Азп РНе РНе СЬп СЬи Ьеи 1 5
- 87 024826 <210> 62 <2Ы> 9 <212> ПРТ <213> МусойасСегЬшп СиЬегсиЬазгз <400> 62
СЬи Ьеи АЬа Аар Ьеи Аар Агд СЬп Ьеи 1 5 <210> 63 <211> 9 <2Ь2> ПРТ <213> Мусо&асЕ&ггит £иЬегси1о51$ <400> 63
Ьеи АЬа Азр Ьеи Азр Агд СЬп Ьеи Ые 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬ>асСегЬил1 СиНегсиЬозЬз <400> 64
Азр Ьеи Азр Агд СЬп Ьеи Ые 5ег Ьеи 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> ПРТ <213> МуссЬасСегд.ит биЬегсиЫзгз <400> 65
Ьеи Азр Агд СЬп Ьеи 11е Зег Ьеи ЬЬе 1 5 <210> 66 <2Ь1> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСег^ит £иЬегси1о$13 <400> 66
АЬа \7а1 СЬп ТНг ТЬг Агд Азр 11е Ьеи 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоНасбегЬит СиЬегсиЬозЬз <400> 67
СЬи СЬу АЬа Ьуэ Ьуз СЬу Ьеи СЬи РНе 1 5 <210> 69
- 88 024826 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасЬегЬит СиЬегси2о£Аз <400> 58
Ьуз СЬу Ьеи СЬи РЬе УаЬ Агд Рго УаЬ 1 5 <2Ю> 69 <211> 9 <гь2> прт <213> МусоЫсСегЬшп ЬиЬегсиЬозЬз <400> 69
СЬу Ьеи СЬи РЬе УаЬ Агд Рго УаЬ АЬа 1 5 <21й> 70 <211> 9 <2Ь2> ПРТ <213> Мусо&асЬегЬит гиЬегсиЬозЬз <400> 70
Ьеи СЬи РЬе УаЬ Агд Рго УаЬ АЬа УаЬ 1 5 <210> 71 <211> 9 <2Ь2> ПРТ <213> МусоЪасСег1ит СиЬегси1о51з <400> 71
РЬе УаЬ Агд Рго УаЬ АЬа УаЬ Азр Ьеи 1 5 <210> 72 <211> 9 <212> ГТРГ <213> МусоЪас^еглит ГиЪегсиЬозЬ5 <400> 72
Агд Рго УаЬ АЬа УаЬ Аар Ьеи ТЬг Туг 1 5 <210? 73 <211? 9 <212? ПРТ <213? МусойасСеггит £иЬегси1с>513 <400? 73
АЬа УаЬ Аер Ьеи ТЬг Туг 11е Рго УаЬ 1 5 <210? 74 <211? 9
- 89 024826 <212> ПРТ <213? МусоЬасСегПт СиЪегси1оз1з <4С0> 74
ТЬг Туг 11е Рго Уа1 Уа1 С1у ΗΪ5 А1а 1 5 <2Ю> 75 <211> 9 <212> ПРТ <213? МусоЬасСегТит СийегоиЪоз!з <400? 75
Туг 11е Рго νβί Уа1 61у Ηίβ А1а Ъеи 1 5 <210? 76 <211> 9 <212? ПРТ <213? МусоЪаосегхшп сиЬегси1оз±5 <400? 76
Ъеи Зег А1а А1а РЬе С1п А1а Рго РЬе 1 5 <210? 77 <211? 9 <212? ПРТ <213> МуооЬасСег!илз сиЬегои1о51з <400 77
Зег А1а А1а РЬе С1п А1а Рго РЬе Суз 1 5 <210 78 <211> 9 <212? ПРТ <213? МусоЬас1:ег1и!п еиЬегсиЗозхз <400 78
А1а А1а РЬе С1п А1а Рго РЬе Суз А1а 1 5 <210 79 <211? 9 <212? ПРТ <213? МусоЬасЬегЗит <400? 79
РЬе С1п А1а Рго РЬе Суз А1а С1у А1е 1 5 <210? Θ0 <211> 9 <212? ПРТ
- 90 024826 <213> Мусо&ассегТит ЕиЬегсиТозТз <400 80
АТа Рго РЬе Суз А1а 51у А1а МеЛ А1а 1 5 <210 31 <211> 9 <212> ЛРТ <213> МусойасСегТил? ТиЬегсцТозП <40 0 31
Рго РЬе Суз АТа С1у А1а Мел АТа Уа1 1 5 <210 82 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЛаоЛегТид! лидегсиТозТе <400> 92
АТа МеЛ АТа УаТ Уа1 СТу СТу А1а Ьеи 1 5 <210> 83 <211> 9 <212> ПРТ <213> деусоЬзссегТилт СиЪегсиТозТз <400 аз
А1а Уа1 УаТ 6Ту СТу А1а Ъеи АТа Туг 1 5 <210> 84 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬаслегТив! сиЬегсиТозТз <400> 84
С1у АТа Ьеи А1а Туг Ъеи Уа1 Уа1 Ъуз 1 5 <210> 85 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬаслегТил СиЬегсиТозТз <400> 95
Ъеи АТа Туг Ъеи УаТ УаТ Ъуз ТЬг Ъеи 1 5 <210 86 <211> 9 <212> ПРТ <213> Мус&Ъас£ег!ит ТиЪегсиТоз25
- 91 024826 <400> 86
АЬа Туг Ьеи УаЬ УаЬ Ьуз ТЬг Ьеи Ые 1 5 <210> 87 <21Ь> 9 <212> ПРТ <213> МуссЪасСег2шл СиЬегсиЬозЬз <400 87
Ьуз ТЬг Ьеи Пе Азп АЬа ТЬг СЬп Ьеи 1 5 <210 88 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬаосегЬига СиЬегси1о$1з <400> 38
ТЬг Ьеи Ые Азп АЬа ТЬг СЬп Ьеи Ьеи 1 5 <210 89 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасеегЬид? СиЬегсиЬогЬз <400> 89
ЬЬе Азп АЬа ТЬг СЬп Ьеи Ьеи Ьуз Ьеи
5 <210> 90 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЪасСегЬил? СиЪеГСиЬозЬа <400> 90
Азп АЬа ТЬг СЬп Ьеи Ьеи Ьуз Ьеи Ьеи Ь 5 <210 9Ь <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСегЬилт сиЬегсиЬозЬз <400 91
СЬп Ьеи Ьеи Ьуз Ьеи Ьеи АЬа Ьуз Ьеи 1 5 <210 92 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЪасЬег^ил ЕиЬегси1оз3.з
- 92 024826 <400> 92
Ьуз Ъеи Ъеи А1а Ъуз Ъеи А1а С1и Ъеи 1 5 <210> 93 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасЁеПип ЁиЪегсиЪозЪз <400> 93
Ъеи Ъеи А1а Ъуз Ъеи А1а С1и Ъеи Уа1 1 5 <210> 94 <2П> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасЬеггит сиЬегси1оз1з <400> 94
Ъу£ Ъеи АЪа С1и Ъеи Уэ.1 А1а АЪа А1а 1 5 <210> 95 <211> 9 <212> ПРТ <21Э> Мусо&асСёг! шп £иЬ&гсц1о51з <400> 95
Ъеи А1а С1и Ъеи Уа1 АЪа А1а А1а Не 1 5 <210> 96 <211> 9 <212> ГЕРТ <213> МусоЬассеглит сиЬегсиЪозие <4ΰ0> 96
Ъеи УаЪ АЪа АЪа АЪа Пе АЪа Азр Не 1 5 <210> 97 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусойасСегЪил сик>егси1о51з <400> 97
АЪа Не АЪа Азр Пе 11е Зег Азр УаЪ
1 5
<210 99
<211> 9
<212> ПРТ
<213> МусоЬас£ег1ит £уЬегси1оз15
<4 00> 99
- 93 024826
Ые АЬа Азр 11е 11« 5«г Азр УаЬ АЬа
1 5
<210> <211> <212> <213> 99 9 ПРТ МуеоЪас£егХил1 СиЬегсиЬозЬз
<400> 99
11е Зег Азр УаЬ АЬа Азр ЬЬе 11е Ьуз
5
<2Ю> <2 Ы > <212> <213> 100 9 ПРТ /УусоЬ|ЗеСегЬ ил? СиЬегсиЬоз 25
<400> ΪΟΟ
ТЬг Ьеи ОЬу СЬи УаЬ Тгр СЬи РЬе Ые 1 5
<210> <211> <21£> <213> 101 9 ПРТ МусоЬа сЗп ит 1 и&егси 1θ5ί5
<400> ЮЬ
РЬе 11е ТЬг Азп АЬа Ьеи Азп СЬу Ьеи
1 5
<210> <211> <212> <213> 102 9 ПРТ МусоЬасСегуит СиЬегсиЬо^Ьз
<400> 102
Азп АЬа Ьеи Азп СЬу Ьеи Ьуз СЬи Ьеи
1 5
<210> <211> <212> <213> 103 9 ПРТ Му^оЬаСбегЬип! сиЬегсиЬозЫ
<400> 103
Ьуз Ьеи ТЬг СЬу Тгр Уэ1 ТЬг СЬу Ьеи
1 5
<21 □> <211> <212> <213> 104 9 ПРТ МусиЬасСегίит СиЬегсиЬозЬз
<400> 104
Ьеи ТЬг СЬу Тгр УаЬ ТЬг СЬу Ьеи РЬе
- 94 024826 <210> 105 <211> 9 <212> ΠΡΤ <213> МусоКасСег! илг биЪйгсЫоЫ.з <400> 105
С1у Тгр Зег Азп Ьеи СТи Зег РКе РКе 1 5 <210> 106 <211> 3 <212> ПРТ <213> АГусоЬасСегТип СийегсиТо-зиз <400> 106
Агп Ьеи С1и Зег РКе РКе А1а С1у УаЬ 1 5 <210> 107 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬас£ег1ит ЬиЬегси1оз1з <400> 107
5ег РКе РКе А1а С1у Уа1 Рго С1у Ъеи 1 5 <2Ю> 108 <211> 9 <212> ПРГ <213> ЛГусоЬасСегТипг СиЬегсиТоЫз <400> 109
СТу Ьеи ТКг С1у А1э ТКг Зег С1у Ьеи 1 5 <2Ю> 109 <211> 3 <212> ПРТ <213> МусоЬаГбегТилт СиЬегсЫсЫз <400> 109
Ьеи Зег 01п УаТ ТКг С1у Ьеи РКе С1у 1 5 <2Ю> 110 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасЬегхит ЬидегсиТозиз <400> 110
5ег С1п Уа1 ТКг С1у Ьеи РКе С1у А1а 1 5
- 95 024826 <210> 111 <2Ы> 9 <212> ПРТ <213> Мусс’ЬасГеггшп ЬиЪегсиЬсзίз <400> 111
Ъеи. Бег АЬа Зег Зег С1у Ъеи А1а НЬз 1 5 <210> 112 <2Ы> 9 <212> ПРТ <2ЪЗ> МуооЬасГег!ист Сийегси1о525 <4ΰΰ> 112
АЬа Зег Зег С1у Ъеи АЬа Ηίε АЬа Азр 1 5 <210> 113 <211> 9 <212> ПРТ <213> А?усоЬасГег1ит СиЬегсиЬозие <400> 113
Зег С1у Ъеи АЬа НЬз А1а Азр Зег Ъеи 1 5 <210> 114 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЪас£ег3.ит СиЪегси1о5з.з <400> 114
СЬу Ъеи АЬа Нгз АЬа Аэр Зег Ъеи АЬа 1 Ь <210> 115 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬассегЬил? РиЬегсиЪозйз <400> 115
Зег Ъеи АЬа Зег Зег АЬа Зег Ъеи Рго 1 5 <210> 116 с211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЪас£ег1шп СиЬегси1оз1з <400> 116
АЬа Зег Зег АЬа Зег Ъеи Рго АЬа Ъеи 1 5
- 96 024826 <210> 117 <211> 9 <212> ПРТ <213> ДОусоНа с^егЬ ил сиЬегси1о515 <400> 117
Зег СЬу РНе СЬу СЬу Ьеи Рго Зег Ьеи 1 5 <210> 118 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬ&СЕегг ил СиЬе.гСиЬоаЬ-з <400> 118
Ьеи Рго Зег Ьеи АЬа СЬп УаЬ НЬз АЬа 1 5 <210> 119 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬзс^ег1ит сиЪегаи1оз1з <400> 119
НЬз АЬа АЬа Зег ТНг Агд СЬп АЬа Ьеи 1 5 <2Ь0> 120 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСегЬил НиЬегсиЬозиз <400 120
Зег ТНг Агд СЬп АЬа Ьеи Агд Рго Агд 1 5 <21С> 121 <211> 9 <212> ПРТ <213? МусоЬа с Неги ил сийегсиЬоЫя <400> 121
Агд рго Агд АЬа Азр СЬу Рго УаЬ СЬу 1 5 <210 122 <211? 9 <212? ПРТ <213> МуооЪасСегЬил СиЬегсиЬозЬа <400> 122
СЬи СЬп Уз1 СЬу СЬу СЬп Зег СЬп Ьеи 1 5
- 97 024826 <210 123 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬаЫегЬил! ГиЬегсиЬозЬз <400> 123
СЬу АЬа Зег Ьуз СЬу ТНг ТНг ТНг Ьуз 1 5 <210> 124 <211> 9 <212> ПРТ <213> Л/усоЬасСегЬил? СиЬегсиЬозЬз <40О> 124
АЬа Зег Ьуз СЬу ТНг ТНг ГЫ Ьу5 Ьуз
5 <210> 125 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСеглит ЬиЪегсиЬозлз <400> 125
Ьуз СЬу ТНг ТНг ТНг Ьуз Ьуз Туг Зег 1 5 <210> 126 <21Ь> 9 <212> ПРТ <213> МусоЫЫегЬига сиЬегсиЬозЬз <400> 126
ТНг (31 □ Азр АЬа СЬи Агд АЬа Рго Уа1 1 5
<400> 128
Ые Азр С1у Ьеи Туг Азр Ьеи Ьеи СЬу 11е СЬу 1Ье Рго Азл СЬп СЬу 15 10 15
СЬу Пе Ьеи Туг
- 98 024826 <210> 129 <21Ь> 20 <212> ПРТ <213> ЯусойасгегЬи/л СидегсиЬозЬз <400> 129
Азп С1п СЬу СЬу 11е Ьеи Туг Зег Зег Ъеи СЬи Туг РНе СЬи Ъуз АЬа 15 10 15
Ьеи СЬи СЬи Ьеи <210> 130 <21Ь> 20 <2Ь2> ПРТ <213> МусоЬзсЁегЬил! биНегсиЬозЬз <400> 130
СЬи Ьуз АЬа Ьеи СЬи СЬи Ъеи АЬа АЬа АЬа РНе Рго СЬу Азр СЬу Тгр 15 10 15
Ьеи СЬу 5ег АЬа <210> 131 <2Ы> 20 <212> ПРТ <213> Мусо&ас£ег±ил1 сиЬегсиТозЬз <400> 131
Азр СЬу Тгр Ьеи СЬу Зег АЬа АЬа Азр Ьуз Туг АЬа СЬу Ьуз Азп Агд 15 10 15
Азп ΗΪ5 УаЬ Азп <2Ю> 132 <2Ы> 20 <212> ПРТ <213> МуссЬассеггит гиЬегси1оз1$ <400> 132
Ъуз Азп Агд Азп НЬз УаЬ Азп РНе РНе СЬп СЬи Ьеи АЬа Азр Ьеи Азр 15 10 15
Агд СЬп Ьеи Ые <210> 133 <211> 20 <212> ПРТ <213> МусоЬас1:ег2.шп £иЬегси1о$15 <400> 133
Азр Ьеи Азр Агд СЬп Ьеи ТЬе Зег Ьеи 11е НЬз Азр СЬп АЬа Азп АЬа 15 10 15
Уа1 СЬп ТЬг ТНг
- 99 024826 <210> 134 <211> 20 <2Ь2> ΠΡΤ <213> МусоНасбегЬил? биЬегсиЬоЫз <400> 134
АЬа Азп АЬа УаЬ 51 η ТНг ТНг Агд Азр ТЬе Ьеи СЬи СЬу АЬа Ьуз Ьуз
1 5 10 Ь5
СТу Ьеи СЬи РЬе
20
<210> Ϊ35
<211> 20
<2Ь2> ПРТ
<213> Мусора с беги и/п СцЬегсиЬозЬз
<400> 135
АЬа Ьуэ Ьуз С1у Ьеи, СЬи РНе ν&1 Агд Рго УаЬ АЬа УаЬ Аар Ьеи ТНг
1 5 10 Ь5
Туг ТЬе Рго УаЬ
20
<210> 136
<2И> 27
<212> ПРТ
<213> МусоЪаеб ι егЬил? биНегс! 21о$1з
< 4 00> 136
РЬе УаЬ Агд Рго \Га1 АЬа УаЬ Аэр Ьеи ТНг Туг ТЬе Рго Уа1 Уа1 61у
1 5 10 15
НЬз АЬа Ьеи Зег АЬа АЬа РНе СЬп АЬа Рго РНе
20 25
<2Ь0> 137
<211> 20
<212> прт
<213> МусоЬасСегЬип СиНегсиЬозЬз
< 4 00> 137
АЬа АЬа РЬе СЬп АЬа Рго РНе Суз АЬа Е1у АЬа Меб АЬа УаЬ 7аЬ СЬу
1 5 ТО 15
СЬу АЬа Ьеи АЬа
20
<2 Х0> 138
<2П> 20
<212> ПРТ
<213> МусоЬасСегЬит биЬегеиЬозЬз
<400> ьзе
УаЬ УаЬ бЬу С1у АЬа Ьеи АЬа Туг Ьеи УаЬ УаЬ Ьуз ТНг Ьеи 11е Азп
1 5 10 Ь5
А1а ТЬг СЬп Ьеи 20
- 100 024826 <2Ь0> 139 <211> 20 <21Ξ> ΠΡΤ <213> Мусора с СегЬшп биНегсиЬозлз· <400? 139
Ьеи 11е Αεη АЬа ТНг СЬп Ъеи. Ъеи Ъуз Ъеи Ъеи АЬа Ъуз Ъеи АЬа СЬи Ь 5 Ю 15
Ъеи УаЬ АЬа АЬа <210> <211> <2Ь2>
0
ПРТ <213> ЛуссЬасбегЬил} Си&ёгси! озЬз <400> 140
Ъеи АЬа СЬи Ъеи УаЬ АЬа АЬа АЬа 1Ье АЬа А5р 11е Ые Зег Азр УаЬ 15 10 15
АЬа Азр Ые Ые <210> 141 <2Ь1> 20 <212> ПРТ <213> МусоЬасСегхит £иЬегси1оз13 <400> 141
Зег Азр УаЬ АЬа Азр 11а Ь1е Ъуз СЬу ТНг Ъеи СЬу СЬи УаЬ Тгр СЬи 15 10 15
РНе Пе ТНг Азп <210>
<211>
<212>
142
ПРТ <213> МуссФасСеггшл СиЬегсиЬоздз <400> 142
УаЬ Тгр СЬи РНе 11е ТНг Азп АЬа Ъеи Αεη СЬу Ъеи Ъуз СЬи Ъеи Тгр 15 10 15
Азр Ъуз Ъеи ТНг <210? 143 <211? 20 <212? ПРТ <213? МусоЬасСегги/л (:иЬегси1оз1з <400> 143
СЬи Ъеи Тгр Азр Ъуз Ъеи ТНг СЬу Тгр УаЬ ТНг СЬу Ъеи РНе 5ег Агд 15 10 15
СЬу Тгр Бег Азп
- 101 024826 <210> 144 <211> 20 <212> ПРТ <213> АГусоЬасбегЬил сиЬегсиЬоаЬз <400> 144
РНе Зег Агд СЬу Тгр Зег Абп Ьеи СЬи Зег РНе РНе АЬа СЬу 7а1 Рго 15 10 15
СЬу Ьеи ТНг СЬу <210> 145 <211> 20 <212> ПРТ <213> Л/усоНасбегЬип £иЪе.гси1о515 <400> 145
СЬу 7а1 Рго СЬу Ьеи ТНг СЬу АЬа ТНг Зег СЬу Ьеи Зег СЬп УаЬ ТНг 15 10 15
СЬу Ьеи РНе СЬу <210> 146 <гы> го <212> ПРТ
<213> МусоЬасбегЬит (:иЪегси1оз15
<400> 146 СЬп УаЬ ТНг СЬу Ьеи РНе СЬу АЬа АЬа СЬу Ьеи Зег АЬз Зег Зег СЬу
1 5 10 15
Ьеи АЬа НЬэ АЬа 20
<210> 147
<211> 20
<212> ПРТ
<213> МусоЪасСеггит СиЬ>егсиЬоБГ5
<4 00> 147
Зег Зег СЬу Ьеи А1а Нтз А1а Азр Зег Ьеи А1а Зег Зег АЬа Зег Ьеи
1 5 10 15
Рго АЬа Ьеи А1а
20
<210> <211> <212> <213> 14Θ 20 ПРТ МусоЬа с бег ϊιηπ &иЬегси1озЬэ
<400> 148
АЬа Зег Ьеи Рго АЬа Ьеи АЬа СЬу 11е 61у СЬу С1у Зег СЬу РНе С1у
Ь 5 10 15
СЬу Ьеи Рго Зег 20 <2Ю> 149
- 102 024826 <211? 20 <212? ПРТ <213? МусойасТегЬит сиЪегсиЬоз·!.?
<400? 149
СЬу РЬе СЬу СЬу Ьеи Рго Зег Ьеи АЬа С1п УаЬ НЬз АЬа АЬа Зег ТЬг 15 10 15
Агд С1п АЬа ьеи <210> 150 <211> 20 <212? ПРТ <213? Мусо&ас^еггшп сцЬегси!озЬё <400? 150
АЬа Зег ТНг Агд СЬп АЬа Ьеи. Агд Рго Агд А1а Азр СЬу Рго УаЬ СЬу 15 10 15
А1а АЬа АЬа СЬи <210? 151 <211? 20 <212? ПРТ <213? МусоЪасСвг!ит £и&егси1о$15 <400? 151
Рго Уа1 С1у АЬа А1а АЬа СЬи С1п УаЬ СЬу СЬу СЬп Зег СЬп Ьеи УаЬ 15 10 15
Зег АЬа С1п СЬу <210? 152 <211? 19 <212? ПРТ <213? МусоЬасСег1ит СиЬегсиЬозЬз <400? 152
СЬп Ьеи УаЬ Зег АЬа С1п СЬу Зег СЬп СЬу МеТ СЬу СЬу Рго УаЬ СЬу 15 10 15
МеТ СЬу СЬу <210> 153 <211? 20 <212> ПРТ
<213> МусоЬас^егьит ТиЬегсиЬозί$
<4 0 0> 153
рго УаЬ СЬу МеТ СЬу СЬу МеТ К1з Рго Зег Зег СЬу АЬа Зег Ьуз СЬу
1 5 10 15
ТЫ ТЫ ТЬг Ьуз 20 <210> 154 <211? 20
- 103 024826 <212> ПРТ <213> МусаЪас-сегхит сиЬегси1о51з <400> 154
Зег Ъуз С1у ГЬг ТЬг ТЬг Ъуз Ъуз Туг Зег 61и С1у А1а А1а А1а С1у 15 10 15
ТЬе 01ц Азр А1а <210> 155 <211> 20 <212> ПРТ <213> МусоЬасьеггит С[зЬегс:и1оз1з <400> 155
А1а А1а С1у ТЬг С1и Азр А1а Е1и Агд А1а Рго 7а1 С1ц А1э Азр А1а 15 10 15
С1у С1у С1у С1п <2Ю> 156 <211> 20 <212> ПРТ <213> МусоЬа сбег! игй 1иЬегс?и1оз1з <400> 156
Агд А1а Рго Уа1 С1и А1а Азр А1а 61у б1у С1у С1п Ъуз Уа1 Ъеи Уа1 15 10 15
Агд Азп νβΐ Уа1 <210? 157 <211> 1053 <212> ПРТ <213> МусоЬассеглил? биЪегсиЪоздз <400> 157
Меб Азп РЬе Зег Уа1 Ъеи Рго Рго С1и Не Аеп Зег А1а Ъеи 11е РЬе
1 5 10 15
А1а С1у А1а С1у Рго С1и Рго Меб А1а АЪа АЪа А1а ТЬг АЪа Тгр Азр
20 25 30
С1у Ъеи А1а Меб С1и Ъеи А1а Зег А1а А1а АЪа Зег РЬе С1у Зег ν3ι
35 40 45
ТЬг Зег <51у Ъеи Уа1 С1у С1у А1а Тгр 61п 31у А1а Зег Зег Зег АЪа
50 55 60
Меб А1а А1а А1а А1а А1а Рго Туг АЪа А1а Тгр Ъеи А1а А1а АЪа АЪа
65 70 75 30
Уа1 С1п А1а С1и С1п ТЬг А1а А1а С1п А1а А1а А1а Меб Не А1а СЪи
85 90 95
РЬе С1и А1а 7а1 Ъуз ТЬг АЪа Уа1 Уа1 С1п Рго Меб Ъеи Уа1 АЪа А1а
100 105 НО
Азп Агд А1а Азр Ъеи Уа1 Зег Ъеи Уа1 Меб Зег А$л Ъеи РЬе С1у 01п
115 120 125
Азп А1а Рго А1а Не А1а А1а Пе С1и А1а ТЬг Туг С1и С1п Меб Тгр
130 135 140
А1а А1а Азр Уа1 Зег А1а Меб Зег А1а Туг ΗΪ5 А1а С1у АЪа Зег АЪа
145 150 155 160
Х1е А1а Зег А1а Ъеи Зег Рго РЬе Зег Ъуз Рго Ъеи С1п Азп Ъеи АЪа
- 104 024826
165 170 175
01 γ Ьеи Рго АЬа Тгр Ьеи АЬа Зег Е1у АЬа Рго А1а АЬа АЬа МеГ ТЬг
180 185 190
А1а АЬа АЬа СЬу Ые Рго АЬа Ьеи АЬа СЬу С1у Рго ТНг АЬа 11е Азп
195 200 205
Ьеи С1у Ые АЬа Аеп УаЬ СЬу СЬу СЬу Азп УаЬ СЬу Азп АЬа Азп Азп
210 215 220
С1у Ьеи АЬа Азп Ые Й1у Азп АЬа Азп Ьеи СЬу Аэп Туг Азп РНе СЬу
225 230 235 240
Зег ОЬу Азп РНе С1у Азп Зег Азп 11е С1у Зег АЬа Зег Ьеи С1у Азл
245 250 255
Азп Азп Ые СЬу РНе <31 у Азп Ьеи СЬу Зег Азп АЗП УаЬ Ыу УаЬ СЬу
260 265 270
Азп Ьеи 51у Азп Ьеи Азп ТЬг С1у РНе АЬа Азп ТЬг СЬу Ьеи С1у Азп
275 280 285
РНе С1у РЬе С1у Азп ТНг 31у Аэп Азгг Азп Ые СЬу Ые СЬу Ьеи ТЬг
290 295 300
С1у Азп Азп СЬп Ые СЬ у Ые СЬу СЬу Ьеи АЗП Зег СЬу ТНг СЬу Азп
305 310 315 320
ЕНе С1у Ьеи РНе Азп Зег С1у Зег С1у Азп УаЬ С1 у РНе РНе Азп Зег
525 330 335
СЬу Азп С1у АЗП РНе СЬу Ые СЬу Азп Зег С1у Азп РЬе Азп ТЬг С1у
340 345 350
СЬу Тгр Азп Зег СЬу НЬз СЬу Азп ТНг СЬу РНе РНе Азп АЬа С1у Зег
355 360 365
РНе Азп ТНг С1у МеЬ Ьеи Азр Уа1 С1у Азп АЬа Аеп ТЬг С1у Зег Ьеи
370 375 заа
Азп ТЬг С1у Зег Туг Аэп МеГ СЬу Азр РНе Азп Рго еьу Зег Зег Азп
3Θ5 390 395 400
ТЬг С1у ТЬг РНе Азп ТЬг С1у Азп АЬа Азп ТНг СЬу РНе Ьеи Азп АЬа
405 910 415
С1у Азп Ые Азп ТЬг С1у УаЬ РНе Азп 11е СЬу НЬЗ МеН Азп Азп С1у
420 425 430
Ьеи РНе Азп ТЬг С1у Азр МеЬ Азп Азп СЬу УаЬ РНе Туг Агд С1у УаЬ
435 440 445
Й1у ΰΐη СЬу 5ег Ьеи СЬп РНе Зег 11е ТЬг ТЬг Рго Авр Ьеи ТНг Ьеи
450 455 460
Рго Рго Ьеи СЬп Ые Рго СЬу Ые Зег УаЬ Рго АЬа РЬе 5ег Ьеи Рго
4 65 470 475 480
АЬа Ые ТЬг Ьеи Рго Зег Ьеи Азп Ые Рго АЬа АЬа ТЬг ТНг Рго АЬа
465 490 495
Азп Не ТЬг УаЬ С1у АЬа РНе Зег Ьеи Рго С1у Ьеи ТЬг Ьеи Рго Зег
500 505 510
Ьеи Азп Ые Рго АЬа АЬа ТЬг ТЬг Рго АЬа Азп Не ТЬг УаЬ СЬу АЬа
515 520 525
РНе Зег Ьеи Рго СЬу Ьеи ТЬг Ьеи Рго Зег Ьеи Азп Ые Рго АЬа АЬа
530 535 540
ТЬг ТНг Рго АЬа Азп Ые ТЬг УаЬ С1у АЬа РНе Зег Ьеи Рго СЬу Ьеи
545 550 555 560
ТЬг Ьеи Рго Зег Ьеи Азп Пе Рго А1а АЬа ТЬг ТНг Рго АЬа А&п Пе
565 570 575
ТЬг УаЬ С1у АЬа рье Зег Ьеи Рго <31у Ьеи ТЬг Ьеи Рго Зег Ьеи А5П
580 5Э5 590
Пе Рго АЬа АЬа ТНГ ТНг Рго АЬа Азп Ые ТЬг УаЬ СЬу АЬа РНе Зег
595 600 605
Ьеи Его С1у Ьеи ТЬг Ьеи Рго Зег Ьеи АЗП Ые Рго АЬа АЬа ТНг ТНг
610 615 620
Рго АЬа Азп Ые ТЬг УаЬ Зег еьу РЬе СЬп Ьеи Рго Рго Ьеи Зег Не
625 630 635 640
Рго Зег УаЬ АЬа Ые Рго Рго УаЬ ТЬг УаЬ Рго Рго Ые ТЬг УаЬ СЬу
645 650 655
- 105 024826
АЬа РНе Азп Ъеи 660 Рго Рго Ъеи ОЬп Ые 665 Рго СЬи УаЬ ТНг Ые 670 Рго С1п
Ьеи ТНг Ые Рго АЬа С1у Пе ТНг Не СЬу СЬу РЬе Зег Ъеи Рго АЬа
675 6 В 0 685
Ые НЬз ТНг С1п Рго Ые ТНг УаЬ С1у С1п Ые С1у УаЬ СЬу СЬп РНе
690 695 700
С1 у Ъеи Рго Зег Ые еьу Тгр Азр УаЬ РНе Ъеи 5ег ТНг Рго Агд Ые
705 710 715 720
ТНг УаЬ Рго АЬа РНе С1у Ые Рго РНе ТНг Ъеи С1п РНе еьп ТНг Азп
725 730 735
УаЬ Рго АЬа Ъеи СЬп Рго Рго С1у ОЬу СЬу Ъеи Зег ТЫ РНе ТНг Агп
740 745 750
СЬу АЬа Ъеи Ые РНе СЬу СЬи РНе Азр Ъеи Рго СЬп Ъеи УаЬ УаЬ НЬз
755 750 765
Рго Туг ТНг Ъеи ТНг СЬу Рго Ие УаЬ Пе СЬу Зег РНе РНе Ъеи Рго
770 775 780
АЬа РНе Азп ЬЬе Рго С1у Ые Азр УаЬ Рго АЬа Ые Адп УаЬ Азр С1у
735 790 795 800
РНе ТНг Ъеи Рго СЬп ТЬе ТНг ТЬг РгО АЬа Пе ТНг ТНг Рго СЬи РНе
Θ05 510 815
АЬа Ые Рго Рго Ые С1у УаЬ СЬу СЬу РНе ТНг Ъеи Рсо С1п 11е ТНг
ΒΞΟ Θ25 830
ТНг С1п СЬи Ые Ые ТНг Рго СЬи Ъеи ТНг ТЬе Азп Зег Ые СЬу УаЬ
935 840 845
С1у СЬу РНе ТНг Ъеи Рго СЬп Ые ТНг ТНг Рго Рго Ые ТНг ТНг Рго
850 855 860
Рго Ъеи ТНг Ые Азр Рго Пе Азп Ъеи ТНг С1у РНе ТНг Ъеи Рго СЬп
965 870 875 880
Ые ТНг ТНг Рго Рго Ые ТНг ТНг Рго Рго Ъеи ТНг Ые Азр Рго Ые
865 890 895
Азп Ъеи ТНг С1у РНе ТНг Ъеи Рго СЬп Ые ТНг ТНг Рго Рго 11е ТНг
900 905 910
ТНг Рго Рго Ъеи ТНг 11е СЬи Рго 11© С1у УаЬ С1у С1у РНе ТНг ТНг
915 92 0 925
Рго Рго Ъеи ТНг УаЬ Рго СЬу Ые НЬз Ъеи Рго Зег ТНг ТНг Г1е 51 у
930 935 940
АЬа РНе АЬа Ые Рго СЬу СЬу Рго СЬу Туг РНе Азп Зег Зег ТНг АЬа
945 950 955 960
Рго Зег Зег еьу РНе РНе Азп Зег СЬу АЬа СЬу С1у Азп Зег С1у РНе
965 97 0 975
СЬу Азп Азп С1у Зег СЬу Ъеи Зег ОЬу Тгр РНе Азп ТНг Азп Рго АЬа
930 985 990
С1у Ъеи Ъеи С1у С1у Зег СЬу Туг С1п Азл ι РНе СЬу СЬ> • Ъеи Зег 5«;
995 1000 1005
С1у РНе 1010 Зег Азп Ъеи СЬу Зег 1015 СЬу УаЬ Зег СЬу РНе 1020 АЬа Азп Агд
С1у Ые Ъеи Рго РНе Зег УаЬ АЬа Зег УаЬ УаЬ Зег СЬу РНе АЬа
1025 1030 1035
Αεη ТЬе С1у ТНг Аэп Ъеи АЬа С1у РНе РНе СЬп СЬу ТНг ТНг Зег
1040 1045 1050
<210> 158 <2Ы> 450 <212> ПРТ <213> МусоЬас£е.Г1шп £иЪегси1оз15 <400> 153
Меб Зег СЬи Ьеи Зег УаЬ АЬа ТНг СЬу АЬа УаЬ Зег ТНг АЬа Зег Зег
1 5 10 15
Зег Ые Рго Меб Рго АЬа С1у УаЬ Азп Рго АЬа Азр Ъеи АЬа АЬа СЬи
- 106 024826
20 25 30
Ьеи А1а А1а УаТ УаТ ТЬг СТи 5ег Уэ1 Азр С1и Азр Туг Ьеи Ьеи Туг
35 40 45
СТ и Суз Азр С1у СТп Тгр Уа1 Ьеи А1а А1а С1у УаЬ СТп А1а МеЛ Уа1
50 55 60
61и Ьеи Азр Зег Азр С1и Ьеи Агд УаТ 11е Агд Азр С1у Уа1 ТЬг Агд
65 70 75 80
Агд С1п С1п Тгр Зег СТу Агд Рго 61у А1а АТа Ьеи С1у С1и АТа Уа1
85 90 95
Азр Агд Ьеи Ьеи Ьеи СТи ТЬг Азр СТп А1а РЬе С1у Тгр УаТ АТа РЬе
ТОО 105 110
С1и РНе С1у Уа1 НТз Агд Туг С1У Ьеи СТп СТп Агд Ьеи А1а Рго НТз
115 120 125
ТЬг Рго Ьеи АТа Агд УаТ РЬе Зег Рго Агд ТЬг Агд 11е Мер Уа1 Зег
130 135 140
С1и Ьуз С1и ТТе Агд Ьеи РЬе Азр АТа СТу Не Агд Нгз Агд С1и А1а
145 150 155 160
±1е Азр Агд Ьеи Ьеи АТа ТЬг СТу Уа1 Агд С1и УаТ Рго СТп Зег Агд
165 170 Т75
Зег Уа1 Азр Ы 5ег Азр Азр Рго Зег С1у РЬе Агд Агд Агд Уа1 А1а
180 те 5 190
Уа1 АТа Уа1 Азр СТи ТТе А1а А1а С1у Агд Туг НТз Ьу5 УаТ Пе Ьеи
195 200 205
Зег Агд Суз Уа1 С1и Уа1 Рго РЬе А1а Пе Азр РЬе Рго Ьеи ТЬг Туг
210 215 220
Агд Ьеи СТу Агд Агд НТз Азп ГЬг Рго УаТ Агд Зег РЬе Ьеи Ьеи Б1п
225 230 235 240
Ьеи СТу С1у Не Агд АТа Ьеи С1у Туг Зег Рго СТи Ьеи УаТ ТЬг А1а
245 250 255
νπ Агд А1а Азр С1у Уа1 УаТ Пе ТЬг С1и Рго Ьеи А1а С1у ТЬг Агд
260 265 270
АТа Ьеи СТу Агд С1у Рго АТа Не Азр Агд Ьеи А1а Агд Азр Азр Ьеи
275 280 285
С1и Зег Азп Зег Ьуз СТи Пе УаТ С1и НТз А1а 11е Зег УаЬ Агд 5ег
290 295 300
Зег Ьеи О1и СЬи Не ТЬг Азр 11е А1а СТи Рго С1у Зег А1а АТа Уа1
305 зто 315 320
11е Азр РЬе МеЛ ТЬг УаТ Агд С1и Агд СТу Зег Уа1 СТп ΗΪ5 Ьеи СТу
325 330 335
Зег ТПг Не Агд А1а Агд Ьеи Азр Рго Еег 5ег Азр Агд МеЛ А1а А1а
340 345 350
Ьеи С1и АТа Ьеи РЬе Рго А1а УаТ ТЬг АТа Зег С1у 11е Рго Ьуз А1а
355 360 365
А1а СТу Уа1 С1и А1а Пе РЬе Агд Ьеи Азр СТи Суз Рго Агд С1у Ьеи
370 375 330
Туг Зег СТу А1а УаТ УаТ Мел Ьеи Зег АТа Азр СТу СТу Ьеи Азр А1а
385 390 395 400
А1а Ьеи ТЬг Ьеи Агд АТа АТа Туг С1п Уа1 С1у С1у Агд ТЬг Тгр Ьеи
405 410 415
Агд АТа С1у А1а С1у 115 Не С1и С1и 5ег С1и Рго С1и Агд С1и РЬе
420 425 430
С1и СТи ТЬг Суз СТи Ьуз Ьеи Зег ТЬг Ьеи ТЬг Рго Туг Ьеи УаТ АТа
435 440 445
Агд СТп
450
<210> 159 <211> 324 <212> ПРТ <213> Мусо&ассег!ил! СидегсиТозТ5
- 107 024826
<4 00> 159
Мен Зег Азр СЬп УаЬ Рго Ьуз Рго НЬз Агд НЬз НЬз Ые Тгр Агд Пе
1 5 10 15
ТНг Агд Агд ТНг Ьеи Зег Ьуз Зег Тгр Азр Азр Зег Ые РНе Зег СЬи
20 25 30
Зег АЬа СЬп АЬа АЬа РНе Тгр Зег АЬа Ьеи Зег Ьеи Рго Рго Ьеи Ьеи
35 40 45
Ьеи СЬу МеН Ьеи СЬу Зег Ьеи АЬа Туг УаЬ АЬа Рго Ьеи РНе СЬу Рго
50 55 60
Азр ТЬг Ьеи Рго АЬа Ые СЬи Ьуз Зег АЬа Ьеи Зег ТНг АЬа НЬз Зег
65 70 75 80
РНе РНе 5ег Рго Зег УаЬ УаЬ Азл С1и Ые Ые СЬи Рго ТНг Ые СЬу
35 90 95
Азр Ые ТНг Азп Азп АЬа Агд СЬу СЬи УаЬ АЬа Зег Ьеи СЬу РНе Ьеи
100 105 ыо
Пе Зег Ьеи Тгр АЬа СЬу Зег Зег А1а Ые Зег АЬа РНе УаЬ Азр АЬа
Ы5 120 125
УаЬ УаЬ СЬи АЬа НЬе Азр СЬп ТНг Рго Ьеи Агд ΗΪΕ Рго УаЬ Агд СЬп
130 135 140
Агд РНе РНе АЬа Ьеи РНе Ьеи Туг УаЬ УаЬ Мес Ьеи УаЬ РНе Ьеи УаЬ
145 150 155 160
АЬа ТНг АЬа Рго УаЬ МеН УаЬ УаЬ СЬу Рго Агд Ьуз УаЬ Зег СЬи НЬз
165 170 175
ХЬе Рго СЬи Зег Ьеи А1а Азл Ьеи Ьеи Агд Тук СЬу Туг Туг Рго АЬа
100 185 190
Ьеи Ые ьеи СЬу Ьеи ТНг УаЬ СЬу Уа1 Пе Ьеи Ьеи Туг Агд УаЬ А1а
195 200 205
Ьеи Рго УаЬ Рго Ьеи Рго ТНг НЬз Агд Ьеи УаЬ Ьеи СЬу А1а УаЬ Ьеи
210 215 220
АЬа. Пе АЬа УаЬ РНе Ьеи Ые АЬа ТНг Ьеи СЬу Ьеи Агд УаЬ Туг Ьеи
225 230 235 240
АЬа Ггр ТЬе ТНг Агд ТНг СЬу Туг ТНг Туг СЬу АЬа Ьеи АЬа ТНг Рго
245 250 255
Ые АЬа РНе Ьеи Ьеи РНе АЬа РНе РНе СЬу СЬу РНе АЬа Ые МеН Ьеи
260 265 270
СЬу АЬа СЬи Ьеи Азп АЬа АЬа УаЬ СЬп СЬи СЬи Тгр Рго АЬа Рго АЬа
275 2 Θ 0 285
ТНг НЬз А1а НЬй Агд Ьеи СЬу Азп Тгр Ьеи Ьу5 АЬа Агд Ые СЬу УаЬ
Ξ90 295 300
СЬу ТНг ТНг ТНг Туг Зег Зег ТНг АЬа СЬп НЬз Зег АЬа УаЬ АЬа АЬа
305 310 315 320
СЬи Рго Рго Зег
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (2)

    ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
  1. (1) последовательность белка Ку3616с с 8ЕО ГО NΟ: 1 или 3-7;
    (1) последовательность белка Ку3616с с 8ЕО ГО NΟ: 1 или 3-7;
    (2) вариант последовательности белка Еу3616с, имеющий по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности 8ЕО ГО NΟ: 1; или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ку3616с, имеющий последовательность 8ЕО ГО 127, 128, 130, 131-133, 135, 143-148 или 150-156, субъекту, нуждающемуся в этом, где указанный полипептид вызывает иммунный ответ.
    20. Способ лечения латентного туберкулеза, включающий введение безопасного и эффективного количества полинуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, представляющий собой антиген, ассоциированный с МусоЬас!егшш !иЬегси1о515, где указанный полипептид содержит:
    (1) последовательность белка Ку3616с с 8ЕЦ ГО N0: 1 или 3-7;
    (2) вариант последовательности белка Ку3616с, имеющий по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности 8ЕЦ ГО N0: 1; или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ку3616с, имеющий последовательности 81®) ГО N0: 127, 128, 130, 131-133, 135, 143-148 или 150-156, в изготовлении лекарственного средства для лечения латентного туберкулеза.
    2. Применение по п.1, где выделенный полипептид содержит последовательность белка Ку3616с с 81®) ГО N0: 1 или 3-7.
    3. Применение по п.2, где выделенный полипептид содержит последовательность белка Ку3616с с 81®) ГО N0: 1.
    4. Применение по п.1, где выделенный полипептид содержит вариант последовательности белка Ку3616с, имеющий по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности 8ЕЦ ГО N0: 1.
    5. Применение по п.1, где выделенный полипептид содержит иммуногенный фрагмент последовательности белка Ку3616с, имеющий последовательность 8ЕЦ ГО N0: 127, 128, 130, 131-133, 135, 143-148 или 150-156.
    6. Применение по любому из пп.1-5 в изготовлении лекарственного средства для предупреждения реактивации туберкулеза.
    7. Применение по любому из пп.1-5 в изготовлении лекарственного средства для замедления реактивации туберкулеза.
    8. Применение по любому из пп.1-7, где лекарственное средство представляет собой фармацевтическую композицию, дополнительно содержащую фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
    9. Применение по любому из пп.1-7, где лекарственное средство представляет собой иммуногенную композицию, дополнительно содержащую неспецифический усилитель иммунного ответа.
    10. Применение выделенного полинуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, представляющий собой антиген, ассоциированный с МусоЬас!егшт !иЬегси1о818, где указанный полипептид содержит:
    - 108 024826 (1) последовательность белка Ку3616с с 8ЕО ГО NΟ: 1 или 3-7;
    (2) вариант последовательности белка Ку3616с, имеющий по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности 8Е0 ГО NΟ: 1; или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Еу3616с, имеющий последовательность 8ЕО ГО 127, 128, 130, 131-133, 135, 143-148 или 150-156, в изготовлении лекарственного средства для лечения латентного туберкулеза.
    11. Применение по п.10, где указанный полипептид содержит последовательность белка Еу3616с с
    8ЕО ГО 1 или 3-7.
    12. Применение по п.10, где указанный полипептид содержит последовательность белка Еу3616с с
    8ЕО ГО 1.
    13. Применение по п.10, где указанный полипептид содержит вариант последовательности белка Еу3616с, имеющий по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности 8ЕО ГО NΟ: 1.
    14. Применение по п.10, где указанный полипептид содержит иммуногенный фрагмент последовательности белка Ку3616с, имеющий последовательность 8ЕО ГО NΟ: 127, 128, 130, 131-133, 135, 143-148 или 150-156.
    15. Применение по любому из пп.10-14 в изготовлении лекарственного средства для предупреждения реактивации туберкулеза.
    16. Применение по любому из пп.10-14 в изготовлении лекарственного средства для замедления реактивации туберкулеза.
    17. Применение по любому из пп.10-16, где лекарственное средство представляет собой фармацевтическую композицию, дополнительно содержащую фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
    18. Применение по любому из пп.10-16, где лекарственное средство представляет собой иммуногенную композицию, дополнительно содержащую неспецифический усилитель иммунного ответа.
    19. Способ лечения латентного туберкулеза, включающий введение безопасного и эффективного количества полипептида, представляющего собой антиген, ассоциированный с МусоЬас!егшш !иЬегси1о515, где указанный полипептид содержит:
    1. Применение выделенного полипептида, представляющего собой антиген, ассоциированный с МусоЬас!егшт !иЬегси1о818, содержащего:
  2. (2) вариант последовательности белка Ку3616с, имеющий по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности 8ЕО ГО NΟ: 1; или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ку3616с, имеющий последовательность 8ЕО ГО 127, 128, 130, 131-133, 135, 143-148 или 150-156, субъекту, нуждающемуся в этом, где указанный полинуклеотид вызывает иммунный ответ.
EA201100072A 2008-07-25 2009-07-24 Способ лечения латентного туберкулеза EA024826B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8372008P 2008-07-25 2008-07-25
PCT/EP2009/059580 WO2010010177A1 (en) 2008-07-25 2009-07-24 Novel compositions and methods

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201100072A1 EA201100072A1 (ru) 2011-10-31
EA024826B1 true EA024826B1 (ru) 2016-10-31

Family

ID=41217660

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201100072A EA024826B1 (ru) 2008-07-25 2009-07-24 Способ лечения латентного туберкулеза

Country Status (24)

Country Link
US (2) US20110117119A1 (ru)
EP (1) EP2315773B1 (ru)
JP (1) JP5873332B2 (ru)
KR (1) KR20110044883A (ru)
CN (1) CN102164952B (ru)
AU (1) AU2009273130B2 (ru)
BR (1) BRPI0916703A2 (ru)
CA (1) CA2731499C (ru)
CO (1) CO6341637A2 (ru)
CY (1) CY1118200T1 (ru)
DK (1) DK2315773T3 (ru)
EA (1) EA024826B1 (ru)
ES (1) ES2602430T3 (ru)
HR (1) HRP20161458T1 (ru)
HU (1) HUE031044T2 (ru)
IL (1) IL210559A0 (ru)
LT (1) LT2315773T (ru)
MX (1) MX2011000983A (ru)
PL (1) PL2315773T3 (ru)
PT (1) PT2315773T (ru)
SG (1) SG192456A1 (ru)
SI (1) SI2315773T1 (ru)
UA (1) UA107330C2 (ru)
WO (1) WO2010010177A1 (ru)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2333073T3 (es) * 1998-11-04 2010-02-16 Isis Innovation Limited Prueba diagnostica de tuberculosis.
BRPI0916704A2 (pt) 2008-07-25 2020-08-18 Glaxosmithkline Biologicals S.A. composições farmacêutica, e imunogênica, usos de um polipeptídeo, e de um polinucleotídeo, proteína de fusão, e, polinucleotídeo
ES2647321T3 (es) * 2008-07-25 2017-12-20 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Composiciones y procedimientos novedosos
EP2156945A1 (en) 2008-08-13 2010-02-24 Novelis Inc. Clad automotive sheet product
US9074001B2 (en) 2009-04-24 2015-07-07 Statens Serum Institut Tuberculosis TB vaccine to prevent reactivation
MY156697A (en) 2010-01-27 2016-03-15 Glaxosmithkline Biolog Sa Modified tuberculosis antigens
ES2693150T3 (es) 2013-09-27 2018-12-07 Codexis, Inc. Filtración automática de variantes de enzimas
DK3049979T3 (da) * 2013-09-27 2020-02-17 Codexis Inc Struktur-baseret prædiktiv konstruktion
GB201405921D0 (en) * 2014-04-02 2014-05-14 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel methods for inducing an immune response
CN106546737A (zh) * 2016-10-24 2017-03-29 广州迪澳医疗科技有限公司 一种体外检测活动性结核的方法
GB201621686D0 (en) 2016-12-20 2017-02-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods for inducing an immune response
GB201707700D0 (en) 2017-05-12 2017-06-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Dried composition
IE20190085A3 (en) 2017-05-30 2023-07-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods for manufacturing an adjuvant
EP3717001A1 (en) 2017-12-01 2020-10-07 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Saponin purification
JP7640473B2 (ja) 2019-06-05 2025-03-05 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム サポニン精製
CN115073612B (zh) * 2022-06-22 2024-09-27 宁夏大学 一种结核分枝杆菌Zera-71cA蛋白纳米颗粒、制备方法及其用途
GB202318595D0 (en) * 2023-12-05 2024-01-17 Sec Dep For Environment Food And Rural Affairs Acting Through Animal And Plant Health Agency Diagnostic proteins and reagents

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998053075A2 (en) * 1997-05-20 1998-11-26 Corixa Corporation Compounds for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis and methods of their use
WO2001062893A2 (en) * 2000-02-25 2001-08-30 Corixa Corporation Compounds and methods for diagnosis and immunotherapy of tuberculosis
US20040086523A1 (en) * 2000-06-20 2004-05-06 Yasir Skeiky Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis
US20040197896A1 (en) * 2001-02-22 2004-10-07 Stewart Cole Comparative mycobacterial geneomics as a tool for identifying targets for the diagnosis, prophylaxis or treatment of mycobacterioses
WO2008007942A1 (en) * 2006-07-10 2008-01-17 Het Nederlands Kanker Instituut Means and methods for manipulating sequential phagolysomal-cytosolic translocation of mycobacteria, and uses thereof

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ302870B6 (cs) * 1998-04-07 2011-12-28 Corixa Corporation Polynukleotid, polypeptid, farmaceutický prostredek, vakcínový prostredek a jejich použití k lécbe a prevenci infekce tuberkulózou
US7135280B2 (en) * 2001-01-08 2006-11-14 Isis Innovation Limited Assay to determine efficacy of treatment for mycobacterial infection
US20030236393A1 (en) * 2002-03-22 2003-12-25 United States Of America Dept Of Vetrans Affairs Virulence genes of M. marinum and M. tuberculosis
US7678379B2 (en) * 2004-06-17 2010-03-16 Beckman Coulter, Inc. Mycobacterium tuberculosis epitopes and methods of use thereof
DK2426141T3 (da) 2005-04-29 2014-11-10 Glaxosmithkline Biolog Sa Fremgangsmåde til forebyggelse eller behandling af M tuberkuloseinfektioner
KR101188045B1 (ko) * 2005-06-23 2012-10-05 스태튼스 세룸 인스티튜트 감염 잠복기 동안 발현되는 항원을 포함하는 결핵 백신
WO2008140478A2 (en) * 2006-11-01 2008-11-20 Immport Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immunodominant antigens
US9074001B2 (en) * 2009-04-24 2015-07-07 Statens Serum Institut Tuberculosis TB vaccine to prevent reactivation
MY156697A (en) 2010-01-27 2016-03-15 Glaxosmithkline Biolog Sa Modified tuberculosis antigens

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998053075A2 (en) * 1997-05-20 1998-11-26 Corixa Corporation Compounds for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis and methods of their use
WO2001062893A2 (en) * 2000-02-25 2001-08-30 Corixa Corporation Compounds and methods for diagnosis and immunotherapy of tuberculosis
US20040086523A1 (en) * 2000-06-20 2004-05-06 Yasir Skeiky Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis
US20040197896A1 (en) * 2001-02-22 2004-10-07 Stewart Cole Comparative mycobacterial geneomics as a tool for identifying targets for the diagnosis, prophylaxis or treatment of mycobacterioses
WO2008007942A1 (en) * 2006-07-10 2008-01-17 Het Nederlands Kanker Instituut Means and methods for manipulating sequential phagolysomal-cytosolic translocation of mycobacteria, and uses thereof

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Harrison's Principles of Internal Medicine (16th Edition)", vol. 1, 1 January 2005, MCGRAW-HILL, MEDICAL PUBLISHING DIVISION, ISBN: 978-0-07-139140-5, article RAVIGLIONE MC, O�BRIEN RJ: "Chapter 150: Tuberculosis + TITELSEITE + ISBN SEITE", pages: 953 - 966, XP009125114 *
AL TTIYAH R. ET AL.: "In vitro cellular immune responses to complex and newly defined recombinant antigens of Mycobacterium tuberculosis", CLINICAL AND EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, vol. 138, no. 1, October 2004 (2004-10), pages 139-144, XP002554333, ISSN: 0009-9104, the whole document, in particular, Tables 1, 3, 4 and 5 *
FORTUNE S M ET AL: "Mutually dependent secretion of proteins required for mycobacterial virulence", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, US, vol. 102, no. 30, 26 July 2005 (2005-07-26), US, pages 10676 - 10681, XP002554331, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/pnas.0504922102 *
MCLAUGHLIN BRYANT ET AL: "A mycobacterium ESX-1-Secreted virulence factor with unique requirements for export", PL O S PATHOGENS (PRINT), PUBLIC LIBRARY OF SCIENCE, US, vol. 3, no. 8, 1 August 2007 (2007-08-01), US, pages 1051 - 1061, XP002554334, ISSN: 1553-7366, DOI: 10.1371/journal.ppat.0030105 *
MUSTAFA A S ET AL: "Immunogenicity of Mycobacterium tuberculosis antigens in Mycobacterium bovis BCG-vaccinated and M-bovis-infected cattle", INFECTION AND IMMUNITY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY., US, vol. 74, no. 8, 1 August 2006 (2006-08-01), US, pages 4566 - 4572, XP002554332, ISSN: 0019-9567, DOI: 10.1128/IAI.01660-05 *
RAGHAVAN SRIDHARAN ET AL: "Secreted transcription factor controls Mycobacterium tuberculosis virulence", NATURE, NATURE PUBLISHING GROUP, UNITED KINGDOM, vol. 454, no. 7205, 7 August 2008 (2008-08-07), United Kingdom, pages 717 - 722, XP002554335, ISSN: 0028-0836, DOI: 10.1038/nature07219 *
REED, S. LOBET, Y.: "Tuberculosis vaccine development; from mouse to man", MICROBES AND INFECTION, ELSEVIER, PARIS, FR, vol. 7, no. 5-6, 1 May 2005 (2005-05-01), FR, pages 922 - 931, XP004936675, ISSN: 1286-4579, DOI: 10.1016/j.micinf.2005.03.011 *
SIMEONE, R. ; BOTTAI, D. ; BROSCH, R.: "ESX/type VII secretion systems and their role in host-pathogen interaction", CURRENT OPINION IN MICROBIOLOGY, CURRENT BIOLOGY LTD, GB, vol. 12, no. 1, 1 February 2009 (2009-02-01), GB, pages 4 - 10, XP026194629, ISSN: 1369-5274, DOI: 10.1016/j.mib.2008.11.003 *

Also Published As

Publication number Publication date
IL210559A0 (en) 2011-03-31
ES2602430T3 (es) 2017-02-21
US20110117119A1 (en) 2011-05-19
SG192456A1 (en) 2013-08-30
MX2011000983A (es) 2011-03-02
CN102164952A (zh) 2011-08-24
US9795663B2 (en) 2017-10-24
AU2009273130B2 (en) 2014-10-16
SI2315773T1 (sl) 2016-12-30
CA2731499A1 (en) 2010-01-28
JP5873332B2 (ja) 2016-03-01
KR20110044883A (ko) 2011-05-02
PL2315773T3 (pl) 2017-07-31
EP2315773B1 (en) 2016-08-24
EP2315773A1 (en) 2011-05-04
WO2010010177A1 (en) 2010-01-28
BRPI0916703A2 (pt) 2019-12-24
CY1118200T1 (el) 2017-06-28
UA107330C2 (ru) 2014-12-25
AU2009273130A1 (en) 2010-01-28
HUE031044T2 (en) 2017-06-28
CN102164952B (zh) 2016-05-25
LT2315773T (lt) 2016-11-10
CA2731499C (en) 2017-01-10
CO6341637A2 (es) 2011-11-21
EA201100072A1 (ru) 2011-10-31
US20140178423A1 (en) 2014-06-26
HRP20161458T1 (hr) 2016-12-16
JP2011528895A (ja) 2011-12-01
PT2315773T (pt) 2016-11-23
DK2315773T3 (en) 2016-12-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA024826B1 (ru) Способ лечения латентного туберкулеза
US10639361B2 (en) Method for preventing or treating M tuberculosis infection
EA022203B1 (ru) Способы и композиции для лечения или предупреждения туберкулёза
US10286053B2 (en) Compositions and methods
JP6503309B2 (ja) 改変された結核抗原
EA014527B1 (ru) Вакцины против хламидиоза
HUE028452T2 (en) Mycobacterium antigenic preparations
US20210138058A1 (en) Compositions
US11911459B2 (en) Nant COVID vaccine cross reactivity

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU