EA022203B1 - Способы и композиции для лечения или предупреждения туберкулёза - Google Patents

Способы и композиции для лечения или предупреждения туберкулёза Download PDF

Info

Publication number
EA022203B1
EA022203B1 EA201100071A EA201100071A EA022203B1 EA 022203 B1 EA022203 B1 EA 022203B1 EA 201100071 A EA201100071 A EA 201100071A EA 201100071 A EA201100071 A EA 201100071A EA 022203 B1 EA022203 B1 EA 022203B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
sequence
protein
zeo
polypeptide
tuberculosis
Prior art date
Application number
EA201100071A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201100071A1 (ru
Inventor
Джеймс Браун
Паскаль Меттенс
Деннис Мерфи
Original Assignee
Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Глаксо Груп Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А., Глаксо Груп Лимитед filed Critical Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Publication of EA201100071A1 publication Critical patent/EA201100071A1/ru
Publication of EA022203B1 publication Critical patent/EA022203B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/04—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/35—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/12—Pulmonary diseases

Abstract

Настоящее изобретение относится к полипептиду, содержащему: (1) последовательность белка Rv1753c; (2) вариант последовательности белка Rv1753c или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Rv1753c. В других аспектах изобретение относится к ассоциированным полинуклеотидам, слитым белкам и способам лечения или предупреждения туберкулеза.

Description

Настоящее изобретение относится к полипептидам и полинуклеотидам для применения в лечении или предупреждении туберкулеза, в частности для применения в лечении или предупреждении латентного туберкулеза и в предупреждении или замедлении реактивации туберкулеза (и также к родственным способам). Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим и иммуногенным композициям, содержащим указанные полипептиды и полинуклеотиды, и к способам диагностики туберкулеза (в частности, латентного туберкулеза).
Предшествующий уровень техники
Туберкулез (ТВ) представляет собой хроническое инфекционное заболевание, вызываемое инфекцией МусоЪас1егшт ЬиЬегси1о515 и другими видами МусоЪас1егшт. Это заболевание является основным заболеванием в развивающихся странах, а также представляет собой нарастающую проблему в развитых частях света. Считается, что более 2 миллиардов людей инфицированы бациллами ТВ, примерно с 9,2 млн новых случаев ТВ и 1,7 млн смертей ежегодно. У 10% инфицированных бациллами ТВ развивается активный ТВ, при этом каждый человек с активным ТВ в течение года заражает в среднем 10-15 других людей. Несмотря на то, что ежегодные показатели коэффициентов заболеваемости достигли своего пика во всем мире, количество смертельных исходов и случаев туберкулеза по-прежнему растет ввиду роста численности населения (Всемирная организация здравоохранения, ТиЪегси1о515 Рас15, 2008).
МусоЪас1егшт 1иЪегси1о515 инфицирует людей через дыхательные пути. Альвеолярные макрофаги осуществляют захват этой бактерии, однако она способна выживать и пролиферировать благодаря ингибированию слияния фагосом с содержащими кислую среду лизосомами. Результатом является комплексный иммунный ответ, вовлекающий СЭ4+ и СЭ8+ Т-клетки, в конечном итоге приводящий к образованию гранулёмы. Важным для успешного действия МусоЪас1егшт 1иЪегси1о515 как патогена является тот факт, что изолированные, но не искорененные бактерии могут сохраняться в течение длительных периодов времени, в результате чего индивидуум остается восприимчивым к развитию впоследствии активного ТВ.
Менее чем у 5% инфицированных индивидуумов активный ТВ развивается в первые годы после инфекции. Гранулёма может сохраняться десятилетиями, и предполагают, что она содержит живые МусоЪас1егшт 1иЪегси1о515 в состоянии покоя, без кислорода и питательных веществ. Однако недавно выдвинуто предположение, что большая часть бактерий в состоянии покоя локализована в типах клеток, не являющихся макрофагами, распределенных по всему организму (ЬосН! е! а1., Ехрей Ορίη. Вю1. ТНег, 2007, 7(11): 1665-1677). Развитие активного ТВ происходит, когда баланс между природным иммунитетом хозяина и патогенным микроорганизмом изменяется, например, в результате иммуносупрессорного события (Апбегкоп Р., Тгепбк ίη М1сгоЪю1о§у, 2007, 15(1): 7-13; ЕЫегк §., 1п1сс1юп, 2009, 37(2): 87-95).
Также предложена динамическая гипотеза, описывающая баланс между латентным ТВ и активным ТВ (Сагбапа Р. 1., 1пДатта1юп & А11ег§у - Эгид Тагде15, 2006, 6:27-39; Сагбапа Р. 1., Шесйоп, 2009, 37(2): 80-86).
Несмотря на то, что инфекция может быть бессимптомной в течение значительного периода времени, активное заболевание в подавляющем большинстве случаев проявляется как острое воспаление легких, приводящее к повышенной утомляемости, потере массы, лихорадке и непрекращающемуся кашлю. При отсутствии лечения типичным результатом являются серьёзные осложнения и смерть.
Обычно туберкулез можно контролировать с использованием длительной терапии антибиотиками, хотя такое лечение не является достаточным для предупреждения распространения заболевания. Инфицированные индивидуумы могут в течение некоторого периода времени не проявлять симптомов, но быть заразными. Кроме того, несмотря на то, что соблюдение схемы лечения является критическим, поведение пациента трудно контролировать. Некоторые пациенты не завершают курс лечения, что может приводить к неэффективности лечения и развитию лекарственной устойчивости.
Мультирезистентный ТВ (МЭР-ТВ) представляет собой форму, которая не отвечает на лекарственные средства первой линии. 5% всех случаев ТВ представляют собой МЭР-ТВ, при этом в течение каждого года возникает приблизительно 490000 новых случаев МЭР-ТВ. ТВ с широкой лекарственной устойчивостью (ХЭР-ТВ) возникает, когда помимо МЭР-ТВ развивается резистентность к лекарственным средствам второй линии. По оценкам ежегодно возникает 40000 новых случаев фактически неизлечимого ХЭР-ТВ (Всемирная организация здравоохранения, ТиЪегси1о515 Рас15, 2008).
Даже если полный курс лечения антибиотиками пройден, инфекция М. 1иЪегси1о515 может не быть искоренена в инфицированном индивидууме, а может оставаться в виде латентной инфекции, которая может реактивироваться.
Для того чтобы контролировать распространение туберкулеза, крайне важным являются эффективная вакцинация и точный ранний диагноз заболевания.
Диагностику латентной ТВ инфекции обычно выполняют, применяя туберкулиновую кожную пробу, которая включает внутрикожное введение очищенного от белков туберкулина (РРЭ). Антигенспецифические Т-клеточные ответы приводят к измеряемому уплотнению в месте инъекции через 48-72 ч после инъекции, что указывает на контакт с микобактериальными антигенами. Однако проблемой этого теста является чувствительность и специфичность, и индивидуумов, вакцинированных БЦЖ, не всегда
- 1 022203 можно легко отличить от инфицированных индивидуумов (это особенно важно в свете того факта, что БЦЖ не защищает от латентной инфекции). В общем, индивидуумы, получившие БЦЖ, но не инфицированные М. 1иЪегси1о818, демонстрируют реакцию на ΡΡΌ менее 10 мм в диаметре, в то время как люди с реакцией на ΡΡΌ более 10 мм в диаметре считаются инфицированными М. 1иЪегси1о818. Однако это правило не применимо к индивидуумам с иммуносупрессией вследствие ВИЧ-инфекции, которая может приводить к реакции на ΡΡΌ менее 10 мм в диаметре; или в эндемичных странах, где люди, инфицированные нетуберкулезными микобактериями, могут демонстрировать реакцию на ΡΡΌ более 10 мм в диаметре.
В последние годы наблюдается прогресс в разработке анализов ίη νίίτο с использованием Т-клеток, основанных на высвобождении интерферона-гамма и использовании антигенов, которые более специфичны к М. 1иЪетси1о818, чем ΡΡΌ, а именно ΕδΆΤ-6 (6 кДа ранний секреторный антиген) и ΟΡΡ-10 (10 кДа белок культурального фильтрата). По-видимому, эти высокоспецифичные тесты имеют по меньшей мере такую же чувствительность, как и туберкулиновая кожная проба, и, кроме того, демонстрируют меньшую перекрестную реактивность, обусловленную вакцинацией БЦЖ. В качестве последнего обзора диагностики латентного ТВ см. Ραί М. е1 а1., Ехрей Κον. Мо1. Όίαβίτ 2006 6(3): 413-422. Однако, поскольку ΕδΆΤ-6/ΟΡΡ-10 являются антигенами ранней стадии, анализы, основанные на ΕδΆΤ-6/ΟΡΡ-10, оптимально можно выполнить только на недавно инфицированных людях. Следовательно идентификация новых антигенов, специфически ассоциированных с латентным туберкулезом, может помочь разработке более чувствительных методов анализа, с помощью которых можно было бы обнаружить долгосрочные латентные инфекции.
Сохраняется потребность в эффективных стратегиях для лечения и предупреждения туберкулеза, в частности лечения и предупреждения латентного ТВ и предупреждения реактивации ТВ.
Краткое изложение сущности изобретения
В целом настоящее изобретение относится к идентификации Р.у1753с в качестве антигена ТВ (в частности, антигена, ассоциированного с латентным ТВ) и к родственным способам и применениям в предупреждении и лечении ТВ, особенно в предупреждении и лечении латентного ТВ и в предупреждении или замедлении реактивации ТВ.
Согласно настоящему изобретению предложен выделенный полипептид, содержащий:
(1) последовательность белка Ку1753с;
(2) вариант последовательности белка Ру1753с или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ру1753с.
Согласно настоящему изобретению также предложен полипептид, содержащий:
(1) последовательность белка Ку1753с;
(2) вариант последовательности белка Ру1753с или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ру1753с для применения в качестве лекарственного средства.
Следующий аспект изобретения относится к способу лечения или предупреждения ТВ, включающий введение безопасного и эффективного количества полипептида, содержащего:
(1) последовательность белка Ку1753с;
(2) вариант последовательности белка Ру1753с; или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ру1753с;
субъекту, нуждающемуся в этом, где указанный полипептид вызывает иммунный ответ, в частности иммунный ответ против МусоЪас1егшт 1иЪегси1о818.
Применение полипептида, содержащего:
(1) последовательность белка Ку1753с;
(2) вариант последовательности белка Ру1753с или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ру1753с;
в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения ТВ представляет собой другой аспект изобретения.
Согласно настоящему изобретению предложен выделенный полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, содержащий:
(1) последовательность белка Ку1753с;
(2) вариант последовательности белка Ру1753с; или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ру1753с. Также предложен полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, содержащий:
(1) последовательность белка Ку1753с;
(2) вариант последовательности белка Ру1753с или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ру1753с для применения в качестве лекарственного средства.
Следующий аспект изобретения относится к способу лечения или предупреждения ТВ, включающему введение безопасного и эффективного количества полинуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, содержащий:
- 2 022203 (1) последовательность белка Ку1753е;
(2) вариант последовательности белка Ру1753е или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ру1753е; субъекту, нуждающемуся в этом, где указанный полинуклеотид вызывает иммунный ответ, в частности иммунный ответ против МусоЬас1сгшт 1иЬегеи1о818.
Применение полинуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, содержащий:
(1) последовательность белка Ку1753е;
(2) вариант последовательности белка Ру1753е или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ру1753е;
в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения ТВ представляет собой другой аспект изобретения.
В дополнение к этому предложена фармацевтическая композиция, содержащая:
(а) полипептид, содержащий:
(1) последовательность белка Ку1753е;
(2) вариант последовательности белка Ру1753е или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ру1753е; или (б) полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид из (а); и (в) фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
Кроме того, предложена иммуногенная композиция, содержащая:
(а) полипептид, содержащий:
(1) последовательность белка Ку1753е;
(2) вариант последовательности белка Ру1753е или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ру1753е; или (б) полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид из (а); и (в) неспецифический усилитель иммунного ответа.
Также предложен экспрессирующий вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, содержащий:
(1) последовательность белка Ку1753е;
(2) вариант последовательности белка Ру1753е; или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ру1753е.
Клетки хозяина, трансформированные указанным экспрессирующим вектором, образуют следующий аспект изобретения. Дополнительно предложена клетка-хозяин, которая рекомбинантно экспрессирует полипептид, содержащий:
(1) последовательность белка Ку1753е;
(2) вариант последовательности белка Ру1753е; или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ру1753е. Кроме того, предложен способ получения полипептида, содержащего:
(1) последовательность белка Ку1753е;
(2) вариант последовательности белка Ру1753е; или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ру1753е; причем указанный способ включает стадию рекомбинантной экспрессии указанного полипептида в клетке хозяина.
Дополнительно предложено антитело или его фрагмент, которые специфично связываются с полипептидом, содержащим:
(1) последовательность белка Ру1753е;
(2) вариант последовательности белка Ру1753е; или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ру1753е.
Также предложено применение указанных антител в диагностике (как например, в способах диагностики туберкулеза, включающих определение присутствия антитела или его фрагмента, которые специфично связываются с полипептидами по изобретению в биологическом образце, взятом у тестируемого субъекта).
Также предложены диагностические наборы, содержащие:
(а) полипептид по настоящему изобретению;
(б) устройство, обеспечивающее приведение указанного полипептида в контакт с образцом (например, с цельной кровью или более удобно с РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови)), взятым у индивидуума; и (в) средства для количественного определения Т-клеточного ответа образца.
Другой аспект изобретения относится к диагностическому набору, содержащему:
(а) полипептид по настоящему изобретению; и (б) устройство, обеспечивающее приведение указанного полипептида в контакт с клетками кожи
- 3 022203 пациента.
В одном воплощении субъект, получающий полипептид, полинуклеотид или композицию по изобретению, может иметь активный туберкулез (например, активную инфекцию М. 1иЬетси1о818). Во втором воплощении субъект может иметь латентный туберкулез (например, скрытую инфекцию М. 1иЬетси1о818). В третьем воплощении субъект может не иметь туберкулеза (например, не иметь инфекции М. 1иЬегси1о818).
Субъект, получающий полипептид, полинуклеотид или композицию по изобретению, может быть предварительно вакцинированным от туберкулеза (например, вакцинированным против инфекции М. 1иЬегси1о818), например, вакцинированным бациллой Кальметта-Герена (БЦЖ). Альтернативно, субъект, получающий полипептид, полинуклеотид или композицию по изобретению, может быть не вакцинированным предварительно от туберкулеза (например, не вакцинированным против инфекции М. 1иЬегси1о818), например, не вакцинированным бациллой Кальметта-Герена (БЦЖ).
Описание графических материалов
Фиг. 1. Процент СЭ4 и СЭ8 клеток от иммунизированных СВ6Р1 мышей, экспрессирующих цитокины ΙΡΝ-гамма и/или 1Ь-2, и/или ΤΝΡ-альфа, на 21-е сутки (то есть через 7 суток после второй иммунизации).
Фиг. 2. Цитокиновый профиль на 21-е сутки (то есть через 7 суток после второй иммунизации) антиген-специфического СЭ4-ответа у иммунизированных СВ6Р1 мышей.
Фиг. 3. Цитокиновый профиль на 21-е сутки (то есть через 7 суток после второй иммунизации) антиген-специфического СЭ8-ответа у иммунизированных СВ6Р1 мышей.
Фиг. 4. Процент СЭ4 и СЭ8 клеток от иммунизированных СВ6Р1 мышей, экспрессирующих цитокины ΙΡΝ-гамма и/или 1Ь-2, и/или ΤΝΡ-альфа на 35-е сутки (то есть через 7 суток после третьей иммунизации).
Фиг. 5. Цитокиновый профиль на 35-е сутки (то есть через 7 суток после третьей иммунизации) антиген-специфического СЭ4-ответа у иммунизированных СВ6Р1 мышей.
Фиг. 6. Цитокиновый профиль на 35-е сутки (то есть через 7 суток после третьей иммунизации) антиген-специфического СЭ8-ответа у иммунизированных СВ6Р1 мышей.
Фиг. 7. Процент СЭ4 и СЭ8 клеток от иммунизированных С57ВБ/6 мышей, экспрессирующих цитокины ΙΡΝ-гамма и/или 1Ь-2, и/или ΤΝΡ-альфа на 21-е сутки (то есть через 7 суток после второй иммунизации).
Фиг. 8. Цитокиновый профиль на 21-е сутки (то есть через 7 суток после второй иммунизации) антиген-специфического СО4-ответа у иммунизированных С57ВБ/6 мышей.
Фиг. 9. Цитокиновый профиль на 21-е сутки (то есть через 7 суток после второй иммунизации) антиген-специфического СО8-ответа у иммунизированных С57ВБ/6 мышей.
Фиг. 10. Антиген-специфические СЭ4-Т-клеточные ответы у ранее не подвергавшихся инфекции людей и людей с латентной инфекцией.
Описание списка последовательностей ЗЕОЮЫо:1: полипептидная последовательность Κν1753ο из штамма Η37Κν М. 1иЬегси1оз1$.
ЗЕО Ю Νο: 2: полинуклеотидная последовательность Βν1753ο из штамма Η37Ρν М. (иЬегси1оз13.
ЗЕО Ю Νο: 3: полипептидная последовательность Βν1753ο из штамма СОС1551 М. 1иЬегси1оз!з.
- 4 022203
ЗЕО ГО Νο: 4: полипептидная последовательность РМ753с из
штамма Р11 М. 1иЬегси1оз13.
ЗЕО ГО Νο: 5: полипептидная последовательность РМ753с из
штамма Нааг1ет А М. 1иЬегси1о&$.
ЗЕО ГО Νο: 6: полипептидная последовательность Ρν1753ο из
штамма С М. 1иЬвгси1оз!з.
ЗЕО ГО Νο: 7: полипептидная
ЗЕО Ю Νο: 8: полипептидная
ЗЕО ГО Νο: 9: полипептидная
ЗЕО ГО Νο: 10: полипептидная
ЗЕО ГО Νο: 11: полипептидная
ЗЕО ГО Νο: 12: полипептидная
ЗЕО ГО Νο: 13: полипептидная
ЗЕО ГО Νο: 14: полипептидная
ЗЕО ГО Νο: 15: полипептидная
ЗЕО ГО Νο: 16: полипептидная
ЗЕО ГО Νο: 17: полипептидная
ЗЕО ГО Νο: 18: полипептидная
ЗЕО ГО Νο: 19: полипептидная кристаллина.
ЗЕО ГО Νο: 20: полипептидная
ЗЕО ГО Νο: 21: полипептидная
ЗЕО ГО Νο: 22: полипептидная мутантного зрелого М1Ь32А.
ЗЕО ГО Νο: 23: полипептидная
ЗЕО ГО Νο: 24: полипептидная
ЗЕО ГО Νο: 25: полипептидная
ЗЕО ГО Νο: 26: полипептидная
ЗЕО ГО Νο: 27: полипептидная конструкции М92.
ЗЕО ГО Νο: 28: полипептидная конструкции М103.
последовательность Ρν1753ο из БЦЖ. последовательность М1Ь8.4. последовательность М1Ь9.8. последовательность М(Ь9.9. последовательность Ра12. последовательность Ра35. последовательность ТЬН9. последовательность М(Ь40. последовательность М1Ь41. последовательность ЕЗАТ-6. последовательность Ад85А. последовательность Ад85В.
последовательность альфапоследовательность МРТ64. последовательность М1Ь32А.
последовательность Зег/А)апоследовательность ТВ 10.4. последовательность М1Ь721. последовательность М72. последовательность М1Ь711, последовательность слитой последовательность слитои
- 5 022203
5ЕО ГО Νο: 29: конструкции М114.
ЗЕО ГО Νο: 30: ЗЕО ГО Νο: 31: ЗЕО ГО Νο: 32: ЗЕО ГО Νο: 33: ЗЕО ГО Νο: 34: ЗЕО ГО Νο: 35: ЗЕО ГО Νο: 36: ЗЕО ГО Νο: 37: ЗЕО ГО Νο: 38: ЗЕО ГО Νο: 39: ЗЕО ГО Νο: 40: ЗЕО ΙϋΝο:41: ЗЕО ГО Νο: 42: ЗЕО ГО Νο: 43: ЗЕО ГО Νο: 44: ЗЕО ГО Νο: 45: ЗЕО ГО Νο: 46: ЗЕО ГО Νο: 47: ЗЕО ГО Νο: 48: ЗЕО ГО Νο: 49: ЗЕО ГО Νο: 50: ЗЕО ГО Νο: 51: ЗЕО ГО Νο: 52: ЗЕО ГО Νο: 53: ЗЕО ГО Νο: 54: ЗЕО ГО Νο: 55: ЗЕО ГО Νο: 56: ЗЕО ГО Νο: 57: ЗЕО ГО Νο: 58: ЗЕО ГО Νο: 59: ЗЕО ГО Νο: 60:
лолипептидная последовательность слитой предсказанный СЭ4 клеточный эпитоп 1 человека, предсказанный СЭ4 клеточный эпитоп 2 человека, предсказанный С04 клеточный эпитоп 3 человека, предсказанный ССИ клеточный эпитоп 4 человека, предсказанный СО4 клеточный эпитоп 5 человека, предсказанный СО4 клеточный эпитоп 6 человека, предсказанный СЭ4 клеточный эпитоп 7 человека, предсказанный СЭ4 клеточный эпитоп 8 человека, предсказанный СО4 клеточный эпитоп 9 человека, предсказанный ССИ клеточный эпитоп 10 человека, предсказанный ССИ клеточный эпитоп 11 человека, предсказанный ССИ клеточный эпитоп 12 человека, предсказанный С(И клеточный эпитоп 13 человека, предсказанный С[И клеточный эпитоп 14 человека, предсказанный СО4 клеточный эпитоп 15 человека, предсказанный СО4 клеточный эпитоп 16 человека, предсказанный Οϋ4 клеточный эпитоп 17 человека, предсказанный СО4 клеточный эпитоп 18 человека, предсказанный СО4 клеточный эпитоп 19 человека, предсказанный СО4 клеточный эпитоп 20 человека, предсказанный СЭ4 клеточный эпитоп 21 человека, предсказанный СО4 клеточный эпитоп 22 человека, предсказанный СО4 клеточный эпитоп 23 человека, предсказанный СО4 клеточный эпитоп 24 человека, предсказанный СО4 клеточный эпитоп 25 человека, предсказанный СО4 клеточный эпитоп 26 человека, предсказанный СО4 клеточный эпитоп 27 человека, предсказанный СЭ4 клеточный эпитоп 28 человека, предсказанный СЭ4 клеточный эпитоп 29 человека, предсказанный СЭ4 клеточный эпитоп 30 человека, предсказанный С08 клеточный эпитоп 1 человека.
- 6 022203
ЗЕО ГО Νο: 61: ЗЕО ГО Νο: 62: ЗЕО ГО Νο: 63: ЗЕО ГО Νο: 64: ЗЕО ГО Νο: 65: ЗЕО ГО Νο: 66: ЗЕО ГО Νο: 67: ЗЕО ГО Νο: 68: ЗЕО ГО Νο: 69: ЗЕО ГО Νο: 70: ЗЕО ГО Νο: 71: ЗЕО ГО Νο: 72: ЗЕО ГО Νο: 73: ЗЕО ГО Νο: 74: ЗЕО ГО Νο: 75: ЗЕО ГО Νο: 76: ЗЕО ГО Νο: 77: ЗЕО ГО Νο: 78: ЗЕО ГО Νο: 79: ЗЕО ГО Νο: 80: ЗЕО ГО Νο: 81: ЗЕО ГО Νο: 82: ЗЕО ГО Νο: 83: ЗЕО ГО Νο: 84: ЗЕО ГО Νο: 85: ЗЕО ГО Νο: 86: ЗЕО ГО Νο: 87: ЗЕО ГО Νο: 88: ЗЕО ГО Νο: 89: ЗЕО ГО Νο: 90: ЗЕО ГО Νο: 91: ЗЕО ГО Νο: 92: ЗЕО ГО Νο: 93:
предсказанный СО8 клеточный эпитоп 2 человека, предсказанный Οϋ8 клеточный эпитоп 3 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 4 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 5 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 6 человека, предсказанный Οϋ8 клеточный эпитоп 7 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 8 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 9 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 10 человека, предсказанный СР8 клеточный эпитоп 11 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 12 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 13 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 14 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 15 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 16 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 17 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 18 человека, предсказанный Όϋ8 клеточный эпитоп 19 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 20 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 21 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 22 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 23 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 24 человека, предсказанный Οϋ8 клеточный эпитоп 25 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 26 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 27 человека, предсказанный Οϋ8 клеточный эпитоп 28 человека, предсказанный С08 клеточный эпитоп 29 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 30 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 31 человека, предсказанный С08 клеточный эпитоп 32 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 33 человека, предсказанный С08 клеточный эпитоп 34 человека.
- 7 022203
ЗЕО ΙΟ Νο: 94: ЗЕО ГО Νο: 95: 3ΕΟ ΙΟ Νο: 96: 5ΕΟ ΙΟ Νο: 97: ЗЕО ΙΟ Νο: 98: ЗЕО ГО Νο: 99: ЗЕО Ю Νο: 100: ЗЕО ГО Νο: 101: 3ΕΟ ΙΟ Νο: 102: 5ΕΟ ΙΟ Νο: 103: ЗЕО ГО Νο: 104: ЗЕО ГО Νο: 105: ЗЕО ГО Νο: 106: ЗЕО ГО Νο: 107: ЗЕО ГО Νο: 108: ЗЕО ГО Νο: 109: ЗЕО ГО Νο: 110: ЗЕО ГО Νο: 111: ЗЕО ГО Νο: 112: ЗЕО ГО Νο: 113: ЗЕО ГО Νο: 114: ЗЕО ГО Νο: 115: ЗЕО ГО Νο: 116: ЗЕО ГО Νο: 117: ЗЕО ГО Νο: 118: ЗЕО ГО Νο; 119: ЗЕО ГО Νο: 120: ЗЕО ГО Νο: 121: ЗЕО ГО Νο: 122: ЗЕО ГО Νο: 123: ЗЕО ГО Νο: 124: ЗЕО ГО Νο: 125: ЗЕО ГО Νο: 126:
предсказанный Сй8 клеточный эпитоп 35 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 36 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 37 человека, предсказанный СЭ8 клеточный эпитоп 38 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 39 человека, предсказанный ϋϋδ клеточный эпитоп 40 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 41 человека, предсказанный СЭ8 клеточный эпитоп 42 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 43 человека, предсказанный Сй8 клеточный эпитоп 44 человека, предсказанный Οϋ8 клеточный эпитоп 45 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 46 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 47 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 48 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 49 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 50 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 51 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 52 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 53 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 54 человека, предсказанный СОЗ клеточный эпитоп 55 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 56 человека, предсказанный С08 клеточный эпитоп 57 человека, предсказанный С08 клеточный эпитоп 58 человека, предсказанный С08 клеточный эпитоп 59 человека, предсказанный С08 клеточный эпитоп 60 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 61 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 62 человека, предсказанный Οϋ8 клеточный эпитоп 63 человека, предсказанный СР8 клеточный эпитоп 64 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 65 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 66 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 67 человека.
- 8 022203
ЗЕО ГО Νο: 127: ЗЕО ГО Νο: 128: ЗЕО ГО Νο: 129: ЗЕО ГО Νο: 130: ЗЕО ГО Νο: 131: ЗЕО ГО Νο: 132: ЗЕО ГО Νο: 133: ЗЕО ГО Νο: 134: ЗЕО ГО Νο: 135: ЗЕО ГО Νο: 136: ЗЕО ГО Νο: 137: ЗЕО ГО Νο: 138: ЗЕО ГО Νο: 139: ЗЕО ГО Νο: 140: ЗЕО ГО Νο: 141: ЗЕО ГО Νο: 142: ЗЕО ГО Νο: 143: ЗЕО ГО Νο: 144: ЗЕО ГО Νο: 145: ЗЕО ГО Νο: 146: ЗЕО ГО Νο: 147: ЗЕО ГО Νο: 148: ЗЕО ГО Νο; 149: ЗЕО ГО№: 150: ЗЕО ГО Νο: 151; ЗЕО ГО Νο: 152: ЗЕО ГО Νο: 153: ЗЕО ГО Νο: 154: ЗЕО ГО Νο: 155: ЗЕО ГО Νο: 156: ЗЕО ГО Νο: 157: ЗЕО ГО Νο: 158: ЗЕО ГО Νο: 159:
предсказанный Οϋβ клеточный эпитоп 68 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 69 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 70 человека, предсказанный СЭ8 клеточный эпитоп 71 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 72 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 73 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 74 человека, предсказанный С08 клеточный эпитоп 75 человека, предсказанный Οϋ8 клеточный эпитоп 76 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 77 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 78 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 79 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 80 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 81 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 82 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 83 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 84 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 85 человека, предсказанный СОЗ клеточный эпитоп 86 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 87 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 88 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 89 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 90 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 91 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 92 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 93 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 94 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 95 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 96 человека, предсказанный Οϋ8 клеточный эпитоп 97 человека, предсказанный С08 клеточный эпитоп 98 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 99 человека, предсказанный С08 клеточный эпитоп 100 человека.
- 9 022203
ЗЕО ГО Νο: 160 ЗЕО Ю Νο: 161 ЗЕО ΙΟ Νο: 162 ЗЕО ГО Νο: 163 ЗЕО ГО Νο: 164 ЗЕО ГО Νο: 165 ЗЕО ГО Νο: 166 ЗЕО ГО Νο: 167 ЗЕО ГО Νο: 168 ЗЕО ГО Νο: 169 ЗЕО ГО Νο: 170 ЗЕО ГО Νο: 171 ЗЕО ГО Νο: 172 ЗЕО ГО Νο: 173 ЗЕО ГО Νο: 174 ЗЕО ГО Νο: 175 ЗЕО ΙϋΝο: 176 ЗЕО ГО Νο: 177 ЗЕО ГО Νο: 178 ЗЕО ГО Νο: 179 ЗЕО ГО Νο: 180 ЗЕО ГО Νο: 181 ЗЕО ГО Νο: 182 ЗЕО ГО Νο: 183 ЗЕО ГО Νο: 184 ЗЕО ГО Νο: 185 ЗЕО ГО Νο: 186 ЗЕО ГО Νο: 187 ЗЕО ГО Νο: 188 ЗЕО ГО Νο: 189 ЗЕО ГО Νο: 190 ЗЕО ГО Νο: 191 ЗЕО ГО Νο: 192 предсказанный СО8 клеточный эпитоп 101 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 102 человека, предсказанный СЭ8 клеточный эпитоп 103 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 104 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 105 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитол 106 человека, предсказанный СР8 клеточный эпитоп 107 человека, предсказанный СЭ8 клеточный эпитоп 108 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 109 человека, предсказанный СЭ8 клеточный эпитоп 110 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 111 человека, предсказанный СЭ8 клеточный эпитол 112 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 113 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 114 человека, предсказанный СЭ8 клеточный эпитоп 115 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 116 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 117 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 118 человека, предсказанный СЭ8 клеточный эпитоп 119 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 120 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 121 человека, предсказанный СЭ8 клеточный эпитоп 122 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 123 человека, предсказанный €ϋ8 клеточный эпитоп 124 человека, предсказанный Οϋ8 клеточный эпитоп 125 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 126 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 127 человека, предсказанный СЬ8 клеточный эпитоп 128 человека, предсказанный СЬ8 клеточный эпитоп 129 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 130 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 131 человека, предсказанный Οϋ8 клеточный эпитоп 132 человека, предсказанный СО8 клеточный эпитоп 133 человека.
- 10 022203
ЗЕО ГО Νο: 193: предсказанный Οϋ8 клеточный эпитоп 134 человека ЗЕО ГО Νο: 194: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 135 человека ЗЕО ГО Νο: 195: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 136 человека ЗЕО ГО Νο: 196: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 137 человека ЗЕО ГО Νο: 197: предсказанный С08 клеточный эпитоп 138 человека ЗЕО ГО Νο: 198: предсказанный Οϋ8 клеточный эпитоп 139 человека ЗЕО ГО Νο: 199: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 140 человека ЗЕО ΙΟ Νο: 200: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 141 человека ЗЕО ГО Νο: 201: предсказанный С08 клеточный эпитоп 142 человека. ЗЕО ГО Νο: 202: предсказанный Οϋ8 клеточный эпитоп 143 человека ЗЕО ГО Νο: 203: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 144 человека ЗЕО ГО Νο: 204: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 145 человека. ЗЕО ГО Νο: 205: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 146 человека ЗЕО Ю Νο: 206: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 147 человека ЗЕО ГО Νο: 207: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 148 человека. ЗЕО ГО Νο: 208: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 149 человека ЗЕО ГО Νο: 209: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 150 человека ЗЕО ГО Νο: 210: предсказанный Οϋ8 клеточный эпитоп 151 человека. ЗЕО ГО Νο: 211: предсказанный Οϋ8 клеточный эпитоп 152 человека. ЗЕО ГО Νο: 212: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 153 человека, ЗЕО ГО Νο: 213: предсказанный Οϋ8 клеточный эпитоп 154 человека. ЗЕО ГО Νο: 214: предсказанный Οϋ8 клеточный эпитоп 155 человека. ЗЕО ΙΟ Νο: 215: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 156 человека. ЗЕО ΙΟ Νο: 216: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 157 человека. ЗЕО ГО Νο: 217: предсказанный 008 клеточный эпитоп 158 человека. ЗЕО ГО Νο: 218: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 159 человека. ЗЕО ГО Νο: 219: предсказанный 008 клеточный эпитоп 160 человека. ЗЕО ГО Νο: 220: предсказанный 008 клеточный эпитоп 161 человека. ЗЕО ГО Νο: 221: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 162 человека. ЗЕО ГО Νο: 222: предсказанный 008 клеточный эпитоп 163 человека. ЗЕО ГО Νο: 223: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 164 человека. ЗЕО ГО Νο: 224: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 165 человека. ЗЕО ГО Νο: 225: предсказанный 008 клеточный эпитоп 166 человека.
- 11 022203
ЗЕО Ю Νο: 226: предсказанный СС8 клеточный эпитоп 167 человека.
ЗЕО Ю Νο; 227: предсказанный ΟΌ8 клеточный эпитоп 168 человека.
ЗЕО ГО Νο: 228: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 169 человека.
ЗЕО ГО Νο: 229: предсказанный Οϋ8 клеточный эпитоп 170 человека.
ЗЕО ГО Νο: 230: предсказанный Οϋ8 клеточный эпитоп 171 человека.
ЗЕО ГО Νο: 231: предсказанный Οϋ8 клеточный эпитоп 172 человека.
ЗЕО ГО Νο: 232: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 173 человека.
ЗЕО ГО Νο: 233: предсказанный Όϋ8 клеточный эпитоп 174 человека.
ЗЕО ГО Νο: 234: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 175 человека.
ЗЕО ГО Νο: 235: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 176 человека.
ЗЕО ГО Νο: 236: предсказанный Οϋ8 клеточный эпитоп 177 человека.
ЗЕО ГО Νο: 237: предсказанный С08 клеточный эпитоп 178 человека.
ЗЕО ГО Νο: 238: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 179 человека.
ЗЕО ГО Νο: 239: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 180 человека.
ЗЕО ГО Νο: 240: предсказанный Οϋ8 клеточный эпитоп 181 человека.
ЗЕО ГО Νο: 241: предсказанный ΟΩ8 клеточный эпитоп 182 человека.
ЗЕО ГО Νο: 242: предсказанный ΟΌ8 клеточный эпитоп 183 человека.
ЗЕО ГО Νο: 243: предсказанный Οϋ8 клеточный эпитоп 184 человека.
ЗЕО ГО Νο: 244: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 185 человека.
ЗЕО ГО Νο: 245: предсказанный Οϋ8 клеточный эпитоп 186 человека.
ЗЕО ГО Νο: 246: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 187 человека.
ЗЕО ГО Νο: 247: предсказанный СО8 клеточный эпитоп 188 человека.
ЗЕО ГО Νο: 248: полипелтидная последовательность Еу238бс из штамма Η37Πν М. 1иЬегси1оз1$.
ЗЕО ГО Νο: 249: полипелтидная последовательность Ку2707с из штамма Η37Κν М. 1иЬвгси1оз15.
Подробное описание
В настоящее время вакцинация живыми бактериями является наиболее эффективным способом индукции защитного иммунитета. Наиболее часто используемой для этой цели микобактерией является бацилла Кальметта-Герена (БЦЖ), авирулентный штамм М. Βονίδ, который был разработан более 60 лет назад. Однако безопасность и эффективность БЦЖ являются предметом дискуссии: защищая от тяжелого проявления болезни у детей, БЦЖ не предотвращает возникновение латентного ТВ или реактивацию болезни легких во взрослой жизни. Кроме того, в некоторых странах, таких как Соединенные Штаты, широкую вакцинацию населения этим агентом не проводят.
Почти все вакцины против ТВ нового поколения, которые в настоящее время находятся в стадии клинической разработки, были разработаны как вакцины прединфекционной профилактики. Они включают субъединичные вакцины, которые особенно эффективны в повышении иммунитета, индуцируемого предшествующей вакцинацией БЦЖ, и усовершенствованные живые микобактериальные вакцины, которые предназначены для того, чтобы заменить БЦЖ на более эффективные и/или безопасные штаммы. Несмотря на то, что эти вакцины предназначены для улучшения устойчивости к инфекции, по всей вероятности они менее эффективны в качестве постинфекционных или терапевтических вакцин в случаях латентного ТВ (Ьт Μ.Υ. с1 а1., Епбостте, МеЮЬоПс & 1ттипе Όίδοτάθτδ - Эгид ТагдеК 2008, 8: 15-29).
Показано, что некоторые белки, которые интенсивно экспрессируются на ранних стадиях микобактериальной инфекции, обеспечивают высокую защитную эффективность в моделях вакцинации на животных. Тем не менее, вакцинация антигенами, которые интенсивно экспрессируются на ранних стадиях инфекции, не может обеспечить оптимальный иммунный ответ на более поздних стадиях инфекции. Для адекватного контроля на более поздних стадиях инфекции могут потребоваться Т-клетки, которые являются специфичными к определенным антигенам, которые экспрессируются на тот момент времени.
Постинфекционные вакцины, которые нацелены непосредственно на находящиеся в состоянии покоя персистирующие бактерии, могут оказывать содействие в защите от реактивации ТВ, тем самым усиливая контроль над ТВ или даже давая возможность устранения инфекции. Поэтому вакцина, нацеленная на латентный ТВ, могла бы значительно и экономично снизить общие уровни зараженности ТВ.
- 12 022203
Субъединичные вакцины на основе антигенов поздних стадий также могут быть использованы в комбинации с антигенами ранних стадий для приготовления мультифазной вакцины. Альтернативно, антигены поздних стадий могли бы быть использованы для дополнения и улучшения вакцинации БЦЖ (либо путём усиления ответа на БЦЖ, либо путём разработки усовершенствованных рекомбинантных штаммов БЦЖ).
Недавно на основании биоинформационного анализа полного генома М. !иЬетси1ок1к (Ζνί е! а1., ВМС Меб1са1 Оепебск, 2008, 1:18) и тестирования дифференциально экспрессируемых белков у индивидуумов, пораженных активной и латентной инфекцией (5>с1шск δ.Ό. е! а1., РЬо8 ΟΝΕ, 2009, 4(5): е5590), была предложена группа вакцин-кандидатов против М. !иЬетси1ок1к.
В то время как макрофаги, как было показано, действуют в качестве главных эффекторов иммунитета к МусоЬасЮ1шт, Т-клетки являются преобладающими индукторами такого иммунитета. Существенную роль Т-клеток в защите против туберкулеза иллюстрирует повышенная частота реактивации ТВ у индивидуумов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека, вследствие связанного с этим истощения СИ4+ Т-клеток. Более того, показано, что адоптивный перенос СИ4+ Т-клеток, полученных на пике первичного иммунного ответа на М. !иЬетси1ок1к, предоставляет защиту против М. !иЬетси1ок1к дефицитным по Т-клеткам мышам (Огте е! а1., 1. Εχρ. Меб, 1983, 158:74-83).
Показано, что МусоЬасктшт-реактивные СИ4+ Т-клетки являются мощными продуцентами γинтерферона (ΙΡΝ-γ), для которого, в свою очередь, показано, что он запускает антимикобактериальные эффекты макрофагов у мышей (Р1уии е! а1., I. Εχρ. Меб., 1993, 178: 2249-2254). В то время как роль ΙΡΝΥ у людей менее понятна, исследования показали, что 1,25-дигидроксивитамин Ό3, либо сам по себе, либо в комбинации с ΙΡΝ-γ или фактором некроза опухоли-альфа, активирует макрофаги человека для ингибирования инфекции М. !иЬетси1ок1к. Кроме того, известно, что ΙΡΝ-γ стимулирует макрофаги человека к продукции 1,25-дигидроксивитамина Ό3. Аналогично показано, что интерлейкин-12 (1Ь-12) играет роль в стимуляции устойчивости к инфекции, вызываемой М. !иЬетси1ок1к. Для обзора иммунологии инфекции, вызываемой М. !иЬегси1ок1к, см. С1ап & Каийтапп, ТиЬегси1ок1к: Ра!йодепек1к, Ртоксбоп апб Соп!го1 (В1оот еб., 1994), ТиЬетси1ок1к (2-е изд., Кот апб Оатау, ебк., 2003) и Наткоп'к Рппс1р1е5 ой 1п!егпа1 Мебюше, СЬар!ет 150, ρρ. 953-966 (16-е изд., Вгаип^а1б, е! а1., ебк., 2005).
В целом настоящее изобретение относится к идентификации Р\4753с в качестве антигена ТВ (в частности, антигена, ассоциированного с латентным ТВ) и к родственным способам и применениям в предупреждении и лечении ТВ, особенно в предупреждении и лечении латентного ТВ и в предупреждении или замедлении реактивации ТВ.
Таким образом, согласно изобретению предложен белок Р\'1753с, его вариант или его иммуногенный фрагмент, либо полинуклеотид, кодирующий указанный белок, вариант или фрагмент, для применения в лечении или предупреждении ТВ. Удобно, когда применение может быть специфично в предупреждении и лечении латентного ТВ (особенно лечении латентного ТВ). Альтернативно, применение может заключаться в предупреждении или замедлении реактивации ТВ (особенно замедлении реактивации ТВ, например, на период времени в несколько месяцев, лет или даже на неограниченный период времени).
Термин виды МусоЬасктшт туберкулезного комплекса включает такие виды, которые традиционно считаются вызывающими заболевание туберкулез, а также присутствующие в окружающей среде и условно-патогенные виды МусоЬасктшт, которые вызывают туберкулез и болезнь легких у иммунологически скомпрометированных (иптипе ΜΐηρίΌΐηί:^) пациентов, таких как пациенты со СПИДом, например, М. !иЬетси1ок1к, М. Ьо11к или М. айтюапит, БЦЖ, М. таит, М. т!гасе11и1ате, М. се1а!ит, М. депщ'епке, М. ΗаетоρΗ^1ит. М. капкаки, М. китае, М. тссае, М. йойийит и М. ксгойи1асеит (см., например, Наткоп'к Р^п^кк ой 1п!егпа1 Мебюше, СЬаρ!е^ 150, ρρ. 953-966 (16-е изд., Вгаиптак, е! а1., ебк., 2005). Настоящее изобретение относится особенно к инфекции, вызываемой М. !иЬетси1ок1к.
Термин активная инфекция относится к инфекции (например, инфекции, вызываемой М. !иЬетси1ок18) с проявляющимися симптомами заболевания и/или поражениями (соответственно с проявляющимися симптомами заболевания).
Термины неактивная инфекция, скрытая инфекция или латентная инфекция относятся к инфекции (например, инфекции, вызываемой М. 1иЬегси1ок1к) без проявляющихся симптомов заболевания и/или поражений (соответственно без проявляющихся симптомов заболевания).
Термин первичный туберкулез относится к клинической форме заболевания (проявлению симптомов заболевания), следующей непосредственно за инфекцией (например, инфекцией, вызываемой М. !иЬетси1ок1к). См. Наткоп'к Р^^пс^ρ1ек ой 1п!егпа1 Мебюше, СЬаρ!е^ 150, ρρ. 953-966 (16-е изд., Вгаиптак, е! а1., ебк., 2005).
Термины вторичный туберкулез или постпервичный туберкулез относятся к реактивации скрытой, неактивной или латентной инфекции (например, инфекции, вызываемой М. !иЬетси1ок1к). См. Наткоп'к Р^п^кк ой 1п!егпа1 Мебюше, Οιηρ^Γ 150, ρρ. 953-966 (16-е изд., ВтаиптаМ, е! а1., ебк., 2005).
Термин реактивация туберкулеза относится к более позднему проявлению симптомов заболевания у индивидуума, который имеет положительные результаты в тесте на инфекцию (например, в туберкулиновой кожной пробе, подходящим образом в анализе ш νίΙΐΌ, основанном на использовании Т- 13 022203 клеток), но не имеет очевидных симптомов заболевания. Положительный результат диагностического теста указывает на то, что индивидуум инфицирован, однако этот индивидуум может иметь или может не иметь ранее проявлявшихся активных симптомов заболевания, которые были подвергнуты лечению в достаточной степени для того, чтобы перевести туберкулез в неактивное или латентное состояние. Общепризнано, что способы предупреждения, замедления или лечения реактивации туберкулеза могут быть инициированы у индивидуума, демонстрирующего активные симптомы заболевания.
Термин туберкулез устойчивый к лекарственным средствам относится к инфекции (например, инфекции, вызываемой М. 1иЬегси1о818), при которой инфицирующий штамм не останавливается в развитии или не убивается (то есть является устойчивым к) одним или более чем одним так называемым химиотерапевтическим агентом первой линии, эффективным в лечении туберкулеза (например, изониазидом, рифампином, этамбутолом, стрептомицином и пиразинамидом).
Термин мультирезистентный туберкулез относится к инфекции (например, инфекции, вызываемой М. 1иЬетси1о818), при которой инфицирующий штамм устойчив к двум или более химиотерапевтическим агентам первой линии, эффективным в лечении туберкулеза.
Химиотерапевтический агент относится к фармакологическому агенту, который известен и используется в данной области для лечения туберкулеза (например, инфекции, вызываемой М. 1иЬегси1о818). Типичные фармакологические агенты, используемые для лечения туберкулеза, включают амикацин, аминосалициловую кислоту, капреомицин, циклосерин, этамбутол, этионамид, изониазид, канамицин, пиразинамид, рифамицины (то есть рифампин, рифапентин и рифабутин), стрептомицин, офлоксацин, ципрофлоксацин, кларитромицин, азитромицин и фторхинолоны, но этим не ограничиваются. Химиотерапевтические агенты первой линии или передовой линии, используемые для лечения туберкулеза, не обладающего лекарственной устойчивостью, включают изониазид, рифампин, этамбутол, стрептомицин и пиразинамид. Химиотерапевтические агенты второй линии, используемые для лечения туберкулеза, демонстрирующего лекарственную устойчивость к одному или более чем одному лекарственному средству первой линии, включают офлоксацин, ципрофлоксацин, этионамид, аминосалициловую кислоту, циклосерин, амикацин, канамицин и капреомицин. Обзор таких фармакологических агентов приведен в главе 48 Сообщай апб Сйтап'8 ТЬе РЬаттасо1одюа1 Ва818 о£ ТЬегареибс8, Натбтаи апб ЫтЬиб еб8., 2001.
Термины полипептид, пептид и белок используются здесь взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Данные термины также применяются к аминокислотным полимерам, в которых один или более чем один аминокислотный остаток представляет собой искусственный химический миметик соответствующей природной аминокислоты, а также к природным полимерам аминокислот и неприродным полимерам аминокислот. Удобно, когда полипептид по настоящему изобретению будет состоять только из природных аминокислотных остатков, особенно таких аминокислот, которые кодируются генетическим кодом.
Термин аминокислота относится к природным и синтетическим аминокислотам, а также к аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые функционируют аналогично природным аминокислотам. Природные аминокислоты представляют собой аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также аминокислоты, которые подвергаются более поздним модификациям, например гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат и О-фосфосерин. Термин аналоги аминокислот относится к соединениям, которые имеют такую же основную химическую структуру, что и природная аминокислота, то есть αуглерод, который связан с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и группой К, например гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионинметилсульфоний. Такие аналоги имеют модифицированные группы К (например, норлейцин) или модифицированные пептидные остовы, но сохраняют такую же основную химическую структуру, как у природной аминокислоты. Термин миметики аминокислот относится к химическим соединениям, которые имеют структуру, отличающуюся от общей химической структуры аминокислоты, но которые функционируют подобно природной аминокислоте. Удобно, когда аминокислота представляет собой природную аминокислоту или аналог аминокислоты, особенно природную аминокислоту и, в частности, те аминокислоты, которые кодируются генетическим кодом.
Нуклеиновая кислота относится к дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам и их полимерам как в одноцепочечной, так и в двухцепочечной форме. Термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги нуклеотидов или модифицированные остатки или связи в остове, которые являются синтетическими, природными и неприродными, которые имеют связывающие свойства, подобные связывающим свойствам эталонной нуклеиновой кислоты, и которые метаболизируются аналогично эталонным нуклеотидам. Примеры таких аналогов включают, без ограничения, фосфоротиоаты, фосфорамидаты, метилфосфонаты, хиральные метилфосфонаты, 2-О-метилрибонуклеотиды, пептидонуклеиновые кислоты (ПНК). Соответственно, термин нуклеиновая кислота относится к природным дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам и их полимерам.
Если не указано иное, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также полностью охватывает ее консервативно модифицированные варианты (например, замены вырожденных кодонов) и
- 14 022203 комплементарные последовательности, а также подробно указанную последовательность (удобно, когда это относится к подробно указанной последовательности). Конкретно, замены вырожденных кодонов могут быть получены путем создания последовательностей, в которых третье положение в одном или более выбранных (или всех) кодонов содержит замены на остатки смешанных оснований и/или дезоксиинозина (ВаЧегеГ а1., ШсШс Λοίά Кек., 19: 5081 (1991); ОШкика е! а1., 1. ΒίοΙ. Сйеш., 260: 2605-2608 (1985); Κοκκοίίηί е! ац Μοί. Се11. РтоЬек, 8: 91-98 (1994)). Термин нуклеиновая кислота используется взаимозаменяемо с терминами ген, кДНК, мРНК, олигонуклеотид и полинуклеотид.
Аминокислоты здесь могут быть обозначены либо в соответствии с их общеизвестными трехбуквенными символами, либо в соответствии с однобуквенными символами, рекомендованными Комиссией по биохимической номенклатуре Международного союза по теоретической и прикладной химии/Международного биохимического союза (ШРАС-ШВ). Аналогично, нуклеотиды могут быть обозначены в соответствии с их общепринятыми однобуквенными кодами.
Под термином последовательность белка Ку1753е, как он использован здесь, понимается полипептидная последовательность, приведенная в δΕΟ ГО Νο: 1, или её гомолог из вида ΜусοЬас!е^^ит туберкулезного комплекса, например такого вида, как М. ШЬегси^хк, Μ. Ьον^к или М. айтсапит, или вида ΜусοЬас!е^^ит, который присутствует в окружающей среде или является условно-патогенным и который вызывает оппортунистические инфекции, такие как легочные инфекции, у хозяев с ослабленным иммунитетом (например, у пациентов со СПИДом), например, БЦЖ, М. аущт, Μ. ш!тасе11и1ате, Μ. се1а!ит, М. депауепке, Μ. 1κκιηορ1ιί1ιιιη. Μ. капкаки, Μ. кншае. Μ. уассае, Μ. ΓοΠτιίΙτιιη и М. ксгоййасеит (см., например, Нап·^··!^ Ргшщркк οΓ 1п!егпа1 Μеά^с^ηе, Сйар!ег 150, рр. 953-966 (16-е изд., ВгаиитаИ, е! ац ебк., 2005).
Для обеспечения высокого показателя эффективности среди вакцинируемых реципиентов компоненты вакцины должны быть высоко консервативными среди штаммов клинической значимости. Подходящим образом белок Ку1753с происходит из Η37Κν Μ. ЩЬегсиКкР (то есть полипептидной последовательности, приведенной в δΕΟ ГО Νο: 1) или является его гомологом из другого штамма М. ШЬетси^ык (такого как штаммы СЭС1551, Е11, Нааг1ет А и С). Штаммы М. ШЬетси^ык, которые ассоциированы с лекарственной устойчивостью, представляют собой особенно важную основу для последовательности белка Κν1753с. Представляющие интерес штаммы включают:
СИС1551 - трансмиссивный и вирулентный штамм;
семейство Нааг1ет (как например, Нааг1ет А) - штаммы с лекарственной устойчивостью, обнаруженные в местах проживания большого количества людей. Члены семейства Нааг1ет из штаммов М. !и^Γ0ϋ1ο8Ϊ8 обнаружены во многих частях мира. Первый представитель данного семейства был открыт в Харлеме (Нааг1ет, Тйе №1йет1апбк);
ΚΖΝ4207 - чувствительный к лекарственным средствам изолят, полученный от пациентов КвазулуНатал (Южная Африка);
ΚΖΝ1435 - мультирезистентный (ΜΌΚ) изолят, полученный от пациентов Квазулу-Натал (Южная Африка);
ΚΖΝ605 - изолят с широкой лекарственной устойчивостью (ХЭК), полученной от пациентов Квазулу-Натал (Южная Африка);
С - широко распространенный в Нью-Йорке. В одном исследовании было обнаружено, что этот штамм наиболее часто встречается среди принимающих инъекционные преператы, и что он устойчив к химически активным промежуточным соединениям азота (Епебтап е! а1. 1. 1пГес!. Э1к. 1997 176(2):47884);
94_М4241А - выделенный в Сан-Франциско в 1994 г. от пациента, рожденного в Китае. Этот штамм ранее был изучен с использованием делеционного анализа генома (Садпеих е! а1., ΡΝΑδ, 2006, 103(8): 2869-2873);
02_1987 - выделенный в Сан-Франциско в 2002 г. от пациента, рожденного в Южной Корее. Этот штамм ранее был изучен с использованием анализа делеционного анализа генома (Садпеих ей а1., ΡΝΑδ, 2006, 103(8): 2869-2873);
Т92 - выделенный в Сан-Франциско в 1999 г. от пациента, рожденного на Филиппинах. Данные об этом штамме опубликованы в Шткй е! а!. ΡΝΑδ, 2004, 101:4871-4876;
Т85 - выделенный в Сан-Франциско в 1998 г. от пациента, рожденного в Китае. Данные об этом штамме опубликованы в Шткй е! а1. ΡΝΑδ, 2004, 101: 4871-4876;
ΕΑδ054 - выделенный в Сан-Франциско в 1993 г. от пациента, рожденного в Индии. Этот штамм ранее был изучен с использованием делеционного анализа генома (Садпеих е! а1., ΡΝΑδ, 2006, 103(8): 2869-2873).
Садпеих е! а1., ΡΝΑδ, 2006, 103(8): 2869-2873 и НегЬег! е! а1. 1пйес!. 1ттип., 2007, 75(12): 5798-5805 обеспечивают полезные знания в отношении группы известных существующих штаммов М. ШЬетси^ык.
Наиболее удобно, когда белок Ку1753с выбран из полипептидных последовательностей, приведенных в δΕΟ ΙΌ Νο: 1 и 3-7, в частности δΕΟ ΙΌ Νο: 1 и 3-6, например δΕΟ ΙΌ Νο: 1.
Представляющими особый интерес полинуклеотидами являются полинуклеотиды, содержащие последовательность, кодирующую (как например, состоящие из последовательности, кодирующей):
- 15 022203 (1) последовательность белка Ку1753с;
(2) вариант последовательности белка Ку1753с; или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ку1753с. Полинуклеотиды соответствующим образом будут содержать (например, состоять из) вариант(а) 8ЕЦ ГО N0: 2 или фрагмент(а) 8ЕЦ ГО N0: 2, который кодирует иммуногенный фрагмент белка Ку1753с.
Комбинации
Ку1753с-родственные полипептиды по настоящему изобретению могут дополнительно содержать другие компоненты, сконструированные для усиления их иммуногенности или для улучшения этих антигенов в других отношениях. Например, улучшенному выделению полипептидных антигенов может способствовать добавление последовательности из остатков гистидина (широко известный как Ык-метка) к одному концу антигена.
Термин Ык-метка относится к последовательности из остатков гистидина, в типичном случае из шести остатков, которые встроены в эталонную последовательность. Чтобы свести к минимуму нарушение активности, связанной с эталонной последовательностью, Ык-метку обычно встраивают на Ν-конце, обычно сразу же после инициирующего остатка метионина, или же на С-конце. Они обычно являются гетерологичными в отношении нативной последовательности, но их вводят, поскольку они облегчают выделение путем улучшения связывания белка со смолами для аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом (1МАС). Вообще, наличие или отсутствие Ык-метки не существенно с точки зрения индукции желаемого иммунного ответа против эталонного белка. Однако, чтобы избежать риска неблагоприятной реакции против самой Ык-метки, считается, что лучше всего свести к минимуму длину Ыкметки, например до четырех или менее чем четырех остатков, в частности, до двух остатков (или полностью исключить применение Ык-метки).
Для того чтобы улучшить величину и/или широту охвата вызываемого иммунного ответа, композиции, полипептиды и нуклеиновые кислоты по изобретению могут содержать многочисленные копии антигена по изобретению и/или дополнительных гетерологичных полипептидов (или полинуклеотидов, кодирующих их) из вида МусоЪаЫегшт (в частности, М. 1иЪегси1ок1к).
Специалисту в данной области техники будет понятно, что если в комбинации используют несколько компонентов, то точная форма представления может быть различной. Например, компонент Ку1753с и дополнительная копия антигена по изобретению или дополнительный гетерологичный антигенный компонент могут быть представлены:
(1) в виде двух индивидуальных полипептидных компонентов;
(2) в виде слитого белка, содержащего оба полипептидных компонента;
(3) в виде одного полипептидного и одного полинуклеотидного компонента;
(4) в виде двух индивидуальных полинуклеотидных компонентов;
(5) в виде единого полинуклеотида, кодирующего два отдельных полипептидных компонента; или (6) в виде единого полинуклеотида, кодирующего слитый белок, содержащий оба полипептидных компонента.
Такая гибкость применима в равной мере к ситуациям, когда в комбинации используют три или более чем три компонента. Однако для удобства часто желательно, чтобы в случае, если присутствует несколько компонентов, они содержались в едином слитом белке или полинуклеотиде, кодирующем единый слитый белок. В одном воплощении изобретения все антигенные компоненты предложены в виде полипептидов (например, в едином слитом белке). В альтернативном воплощении изобретения все антигенные компоненты предложены в виде полинуклеотидов (например, единого полинуклеотида, например, полинуклеотида, кодирующего единый слитый белок).
Термин гетерологичный, когда он используется в отношении участков нуклеиновой кислоты, означает, что нуклеиновая кислота содержит две или более чем две подпоследовательности, которые не обнаруживаются в таком же взаимном расположении относительно друг друга в природе. Например, нуклеиновую кислоту обычно получают с помощью технологии рекомбинантных нуклеиновых кислот, таким образом, что она имеет две или более последовательностей из неродственных генов, расположенных так, чтобы создать новую функциональную нуклеиновую кислоту, например, промотор из одного источника, а кодирующая область из другого источника. Аналогично, термин гетерологичный белок означает, что белок содержит две или более чем две подпоследовательности, которые не обнаруживаются в таком же взаимном расположении относительно друг друга в природе (например, слитый белок).
Термин слитый полипептид или слитый белок относится к белку, имеющему по меньшей мере два гетерологичных полипептида (например, по меньшей мере два полипептида из МусоЬас1епит кр.), связанных ковалентно либо непосредственно, либо через аминокислотный линкер. Полипептиды, образующие слитый белок, обычно связаны С-концом к Ν-концу, хотя они также могут быть связаны Сконцом к С-концу, Ν-концом к Ν-концу или Ν-концом к С-концу. Полипептиды слитого белка могут располагаться в любом порядке. Этот термин также относится к консервативно модифицированным вариантам, полиморфным вариантам, аллелям, мутантам, иммуногенным фрагментам и межвидовым гомологам антигенов, из которых составлен слитый белок. Антигены МусоЪаЫегшт 1нЬегсн1ок1к описаны в Со1е е1 а1., ΝηΙηγο. 393: 537 (1998), в которой полностью раскрыт геном МусоЪаЫегшт 1нЬегсн1ок1к. Анти- 16 022203 гены из другого вида МусоЬас1спит. соответствующие антигенам М. 1иЬетси1о515, можно идентифицировать, например, используя алгоритмы сравнения последовательностей, как изложено здесь, или другие методы, известные специалистам в данной области техники, например, гибридизационные анализы и анализы связывания антител.
Термин слитый относится к ковалентной связи между двумя полипептидами в слитом белке. Обычно полипептиды соединены посредством пептидной связи либо непосредственно друг с другом, либо через аминокислотный линкер. Возможно, пептиды могут быть соединены посредством непептидных ковалентных связей, известных специалистам в данной области.
Типичные антигены М. 1иЬетси1о515, которые можно комбинировать с Ку1753с, включают один или более чем один (например, 1-5, как например, 1-3, в частности 1) антиген из следующих (например, один или более чем один из (1)-(12)):
(1) М!Ь8.4 (также известный как ΌΡν и Ку1174с), полипептидная последовательность которого описана в ЗЕО ГО Νο: 102 в АО 97/09428 (кДНК в ЗЕО ГО Νο: 101) и в Со1ег е! а1., .Тоигпа1 оГ 1ттипо1оду,
1998, 161: 2356-2364. Особый интерес представляет последовательность зрелого М!Ь8.4, у которого отсутствует лидерный сигнальный пептид (то есть аминокислотные остатки 15-96 из ЗЕО ГО №: 102 в АО97/09428). Полноразмерная полипептидная последовательность М!Ь8.4 показана в ЗЕО ГО №: 8;
(2) М!Ь9.8 (также известный как МЗЬ и Κν0287), полипептидная последовательность которого описана в ЗЕО ГО №: 109 в АО 98/53075 (фрагменты МЗЬ описаны в ЗЕО ГО №: 110-124 в АО98/53075, причём ЗЕО ГО №: 119 и 120 представляют особый интерес) и также в Со1ег е! а1., Vасс^ηе, 2009, 27: 223233 (в частности, активные фрагменты показаны здесь на фиг. 2). Полноразмерная полипептидная последовательность М!Ь9.8 показана в ЗЕО ГО №: 9;
(3) М!Ь9.9 (также известный как М!Ь9.9А, МТ1, МТ1-А и Κν1793), полипептидная последовательность которого описана в ЗЕО ГО №: 19 в АО 98/53075 и в А1бегкоп е! а1., 1оигпа1 оГ Е\рептеп1а1 Меб1сше, 2000, 7: 551-559 (фрагменты МТ1 описаны в ЗЕО ГО №: 17 и 51-66 в АО 98/53075, причём ЗЕО ГО №: 17, 51, 52, 53, 56 и 62-65 представляют особый интерес). Несколько полипептидных вариантов МТ1 описаны в ЗЕО ГО №: 21, 23, 25, 27, 29 и 31 в АО98/53075 и в А1бегкоп е! а1., 1оигпа1 оГ Е\рептеп!а1 Мебюше, 2000, 7: 551-559. Полноразмерная полипептидная последовательность М!Ь9.9 показана в ЗЕО ГО №: 10;
(4) Ка12 (также известный как С-концевой антиген М!Ь32А), полипептидная последовательность которого описана в ЗЕО ГО №: 10 в АО 01/98460 и в Зке1ку е! а1., 1оигпа1 оГ 1ттипо1оду, 2004, 172: 7618-7682. Полноразмерная полипептидная последовательность Ка12 показана в ЗЕО ГО №: 11;
(5) Ка35 (также известный как Ν-концевой антиген М!Ь32А), полипептидная последовательность которого описана в ЗЕО ГО №: 8 в АО 01/98460 и в Зке1ку е! а1., .Тоигпа1 оГ 1ттипо1оду, 2004, 172: 76187682. Полноразмерная полипептидная последовательность Ка35 показана в ЗЕО ГО №: 12;
(6) ТЬН9 (также известный как М!Ь39, М!Ь39А, ТЬН9РЬ и Κν1196), полипептидная последовательность которого описана в ЗЕО ГО №: 107 в АО 97/09428, а также в ЭШоп е! а1., 1пГес!юп апб 1тшипЬу,
1999, 67(6): 2941-2950 и Зке1ку е! а1., .Тоигпа1 оГ 1ттипо1оду, 2004, 172: 7618-7682. Полноразмерная (РЬ) полипептидная последовательность ТЬН9 показана в ЗЕО ГО №: 13;
(7) М!Ь40 (также известный как НТСС1 и Ру3616с), полипептидная последовательность которого описана в ЗЕО ГО №: 138 в АО 98/53075 (кДНК в ЗЕО ГО №: 137). Полноразмерная полипептидная последовательность М!Ь40 показана в ЗЕО ГО №: 14;
(8) М!Ь41 (также известный как МТСС2 и Ру0915с), полипептидная последовательность которого описана в ЗЕО ГО №: 142 в АО 98/53075 (кДНК в ЗЕО ГО №: 140) и в Зке1ку е! а1., .Тоигпа1 оГ 1ттипо1оду, 2000, 165: 7140-7149. Полноразмерная полипептидная последовательность М!Ь41 показана в ЗЕО ГО №: 15;
(9) ЕЗАТ-6 (также известный как ек\А и Κν3875), полипептидная последовательность которого описана в ЗЕО ГО №: 103 в АО 97/09428 (кДНК в ЗЕО ГО №: 104) и в Зогепкеп е! а1., 1пГес!юп апб 1ттипйу, 1995, 63(5): 1710-1717. Полноразмерная полипептидная последовательность ЕЗАТ-6 показана в ЗЕО ГО №: 16;
(10) антигены комплекса Ад85 (например, Ад85А, также известного как ГЬрА и Ру3804с; или Ад85В, также известного как ГЬрВ и Ру1886с), обсуждение которых приведено, например, в Соп!еп! е! а1.,. 1пГес!юп апб 1ттипйу, 1991, 59: 3205-3212 и в Ниудеп е! а1., №Циге Мебюше, 1996, 2(8): 893-898. Полноразмерная полипептидная последовательность для Ад85А показана в ЗЕО ГО №: 17 (зрелый белок с остатками 43-338, то есть не имеющий сигнального пептида, представляющий особый интерес). Полноразмерная полипептидная последовательность для Ад85В показана в ЗЕО ГО №: 18 (зрелый белок с остатками 41-325, то есть не имеющий сигнального пептида, представляющий особый интерес);
(11) альфа-кристаллин (также известный как ЬкрХ (белок теплового шока X) и Ру2031с), который описан в Vе^Ьοη е! а1., .Тоигпа1 оГ Вас!етю1оду, 1992, 174: 1352-1359 и Рпкаа е! а1., Сйшса1 апб Е\рептеп!а1 1ттипо1оду, 1995, 102: 53-57 (представляющими особый интерес являются фрагменты, соответствующие остаткам 71-91, 21-40, 91-110 и 111-130). Полноразмерная полипептидная последовательность альфа-кристаллина показана в ЗЕО ГО №: 19;
(12) Мр!64 (также известный как Ру1980с), который описан в КосЬе е! а1., Зсапбшаугап 1оигпа1 оГ
- 17 022203
1ттипо1оду, 1996, 43: 662-670. Полноразмерная полипептидная последовательность МРТ64 показана в §ЕЦ ГО №: 20 (зрелый белок с остатками 24-228, то есть не имеющий сигнального пептида, представляющий особый интерес);
(13) М£Ь32Л, полипептидная последовательность которого описана в §ЕЦ ГО №: 2 (полноразмерная), а остатки 8-330 в §ЕЦ ГО №: 4 (зрелая форма) в \УО 01/98460, особенно варианты, имеющие мутацию по меньшей мере в одной каталитической триаде (например, каталитический остаток серина, который может быть, например мутирован в аланин). Полноразмерная полипептидная последовательность для М)Ь32Л показана в §ЕЦ ГО №: 21. Зрелая форма М!Ь32А имеющая мутацию 8ег/А1а показана в §ЕЦ ГО №: 22;
(14) ТВ10.4, полноразмерная полипептидная последовательность для ТВ10.4 показана в §ЕЦ ГО №: 23;
(15) Ку2386с, полноразмерная полипептидная последовательность для Ку2386с из МусоЬас!егшт 1иЬегси1о818 Η37Κν показана в §ЕЦ ГО №: 248; и/или (16) Κ.ν2707ο, полноразмерная полипептидная последовательность К.\'2707с из МусоЬас!егшт 1иЬегси1о818 Η37Κν показана в §ЕЦ ГО №: 249;
или их комбинаций, таких как (например, таких комбинаций, как (а)-(ж)):
(а) комбинация компонентов Ка12, ТЬН9 и Ка35, например в форме слитого белка, такого как М(Ь72Г. Полипептидная последовательность М(Ь72Г описана в §ЕЦ ГО №: 6 в \УО 2006/117240 (кДНК в §ЕЦ ГО №: 5) и в §ке1ку е1 а1., 1оигпа1 оГ 1ттипо1оду, 2004, 172: 7618-7682 (где она включает возможную Н18-метку для облегчения очистки; при использовании в настоящем изобретении М(Ь72Г подходящим образом не содержит дополнительных остатков гистидина). Полипептидная последовательность для М(Ь72Гпоказана в §ЕЦ ГО №: 24;
(б) комбинация компонентов Ка12, ТЬН9 и Ка35 с мутацией §ег/Л1а (то есть где каталитический остаток серина заменен на аланин), например в форме слитого белка, такого как М72. Полипептидная последовательность М72 описана в §ЕЦ ГО №: 4 в \УО 2006/117240 (кДНК в §ЕЦ ГО №: 3) где она возможно включает два рядом расположенных гистидина для облегчения получения; при использовании в настоящем изобретении М72 также может включать два рядом расположенных гистидина, хотя подходящим образом М72 может не содержать двух рядом расположенных гистидинов (то есть остатки 4-725 в §ЕЦ ГО №: 4 в \УО 2006/117240 представляют особый интерес). Полипептидная последовательность М72 показана в §ЕЦ ГО №: 25;
(в) комбинация компонентов М(Ь8.4. М(Ь9.8. М(Ь9.9 и М(Ь41. например в форме слитого белка, такого как М(Ь71Г. Полипептидная последовательность М(Ь71Г описана в §ЕЦ ГО №: 16 в \УО 99/051748 (кДНК в §ЕЦ ГО №: 15), где она включает возможную Н18-метку для облегчения очистки; при использовании в настоящем изобретении М(Ь71Г подходящим образом соответствует аминокислотным остаткам 9-710 в §ЕЦ ГО №: 16 из \УО 99/051748. Полипептидная последовательность для М1Ь71Г показана в §ЕЦ ГО №: 26;
(г) комбинация М(Ь72Г или М72 (подходящим образом без дополнительных остатков гистидина для облегчения экспрессии) с М(Ь9.8 и М(Ь9.9, например в слитом белке. Полипептидная последовательность для слитой конструкции М72-М(Ь9.9-М1Ь9.8 показана в §ЕЦ ГО №: 27 (слитая конструкция М92); при использовании в настоящем изобретении слитая конструкция М72-М(Ь9.9-М1Ь9.8 может дополнительно включать два рядом расположенных гистидина после инициирующего остатка метионина для облегчения получения;
(д) комбинация М(Ь72Г или М72 (подходящим образом без дополнительных остатков гистидина для облегчения экспрессии) с Ад85В, например в слитом белке, таком как М(Ь103Г. Полипептидная последовательность М1Ы03Г описана в §ЕЦ ГО №: 18 в \УО 03/070187 (кДНК в §ЕЦ ГО №: 10), где она включает возможную Н18-метку для облегчения очистки; при использовании в настоящем изобретении М1Ь103Г подходящим образом соответствует аминокислотным остаткам 8-1016 в §ЕЦ ГО №: 18 из \УО 03/070187. Также особый интерес представляет М103, то есть М1Ь103Г, включающий мутацию 8ег/А1а в компоненте Ка35; при использовании в настоящем изобретении М103 подходящим образом соответствует аминокислотным остаткам 8-1016 в §ЕЦ ГО №: 18 из \УО 03/070187, где остаток §ег в положении 710 заменен на А1а. Полипептидная последовательность М103 показана в §ЕЦ ГО №: 28, при использовании в настоящем изобретении слитая конструкция М72-М(Ь9.9-М1Ь9.8 может дополнительно включать два рядом расположенных гистидина после инициирующего остатка метионина для облегчения получения;
(е) комбинация М(Ь72Г или М72 (подходящим образом без возможных остатков гистидина для облегчения экспрессии) с М(Ь41, например в слитом белке, таком как М1Ь114Г. Полипептидная последовательность М1Ы14Г описана в §ЕЦ ГО №: 16 в \УО 03/070187 (кДНК в §ЕЦ ГО №: 9), где она включает возможную Н18-метку для облегчения очистки; при использовании в настоящем изобретении М(Ь114Г подходящим образом соответствует аминокислотным остаткам 8-1154 в §ЕЦ ГО №: 16 из \УО 03/070187. Также особый интерес представляет М114, то есть М1Ь114Г, включающий мутацию 8ег/А1а в компоненте Ка35; при использовании в настоящем изобретении М114 подходящим образом соответствует аминокислотным остаткам 8-1154 в §ЕЦ ГО №: 16 из \УО 03/070187, где остаток §ег в положении 710 заменен на А1а. Полипептидная последовательность М114 показана в §ЕЦ ГО №: 29, при использовании в настоя- 18 022203 щем изобретении слитая конструкция М72-М1Ь9.9-М1Ь9.8 возможно может включать два рядом расположенных гистидина после инициирующего остатка метионина для облегчения получения;
(ж) комбинация компонентов Ад85В и Е8АТ-6, как например, в слитой конструкции, описанной в ОоНеПу е! а1., 1оигпа1 о£ Шесйоик П18еа8е8, 2004, 190: 2146-2153; и/или (з) комбинация компонентов Ад85В и ТВ10.4, как например, в слитой конструкции, описанной в 01е1псН е! а1., 1оигиа1 о£ 1ттипо1о§у, 2005, 174(10): 6332-6339 190:2146-2153.
Комбинации компонента Ку1753с и компонента М!Ь40 представляют особый интерес. Очевидно, такие комбинации возможно могут содержать другие дополнительные антигенные компоненты (например, компонент М72).
Другая представляющая интерес комбинация содержит компонент Ку1753с и компонент М72.
Следующая представляющая интерес комбинация содержит компонент Ку1753с и компонент Ку2386с.
Другие представляющие интерес комбинации включают комбинации, содержащие компонент Ку1753с и компонент Ку2707с.
Дополнительная представляющая интерес комбинация содержит компонент Ку1753с и компонент альфа-кристаллин.
Специалисту будет понятно, что комбинации не обязательно должны основываться на специфических последовательностях, описанных выше в (1)-(16) и (а)-(з), и что для получения такого же практического эффекта можно использовать консервативно модифицированные варианты (например, с идентичностью по меньшей мере 70%, как например, с идентичностью по меньшей мере 80%, в частности с идентичностью по меньшей мере 90% и особенно с идентичностью по меньшей мере 95%) или иммуногенные фрагменты (например, по меньшей мере 20% полноразмерного антигена, как, например, по меньшей мере 50% антигена, в частности по меньшей мере 70% и особенно по меньшей мере 80%) описанных последовательностей.
Каждая из вышеупомянутых индивидуальных антигенных последовательностей также раскрыта в Со1е е! а1. Ыа1иге, 1998, 393: 537-544 и Сатиз, МюгоЬю1о§у, 2002, 148: 2967-2973. Геном Н37Ку М. 1иЬегси1о515 находится в открытом доступе, например на веб-сайте Ае1соте Тгиз! 8апдег 1и8Й1и1е (№№№.8апдег.ас.ик/Рго.|ес18/М_1иЬегси1о818/) и в других местах.
Многие из упомянутых выше антигенов также раскрыты в заявках на патент США №№ 08/523435, 08/523436, 08/658800, 08/659683, 08/818111, 08/818112, 08/942341, 08/942578, 08/858998, 08/859381, 09/056556, 09/072596, 09/072967, 09/073009, 09/073010, 09/223040, 09/287849 и в патентных заявках РСТ РСТ/И898/10407, РСТ/И898/10514, РСТ/И899/03265, РСТ/и899/03268, РСТ/И899/07717, АО 97/09428 и АО 97/09429, АО 98/16645, АО 98/16646, каждая из которых здесь включена посредством ссылки.
Композиции, полипептиды и нуклеиновые кислоты по изобретению также могут содержать дополнительные полипептиды из других источников. Например, композиции и слитые белки по изобретению могут включать полипептиды или нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, где данный полипептид усиливает экспрессию антигена, например, N81 белка вируса гриппа, (см., например, АО 99/40188 и АО 93/04175). Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть сконструированы на основе предпочтения кодонов у выбранного вида, например у человека (в случае экспрессии ίη У1уо) или у конкретной бактерии (в случае продуцирования полипептидов).
Компонент Ку1753с также может быть введен с одним или более чем одним химиотерапевтическим агентом, эффективным против туберкулеза (например, инфекции, вызываемой М. 1иЬегси1о818). Примеры таких химиотерапевтических агентов включают, но не ограничиваются этим, амикацин, аминосалициловую кислоту, капреомицин, циклосерин, этамбутол, этионамид, изониазид, канамицин, пиразинамид, рифамицины (то есть рифампин, рифапентин и рифабутин), стрептомицин, офлоксацин, ципрофлоксацин, кларитромицин, азитромицин и фторхинолоны. Такая химиотерапия определяется решением лечащего врача, использующего предпочтительные комбинации лекарственных средств. Химиотерапевтические агенты первой линии, используемые для лечения туберкулеза (например, инфекции, вызываемой М. 1иЬегси1о818), не обладающего лекарственной устойчивостью, включают изониазид, рифампин, этамбутол, стрептомицин и пиразинамид. Химиотерапевтические агенты второй линии, используемые для лечения туберкулеза (например, инфекции, вызываемой М. 1иЬегси1о818). демонстрирующего лекарственную устойчивость к одному или более чем одному лекарственному средству первой линии, включают офлоксацин, ципрофлоксацин, этионамид, аминосалициловую кислоту, циклосерин, амикацин, канамицин и капреомицин.
Традиционные химиотерапевтические агенты обычно вводят в течение относительно длительного периода времени (приблизительно 9 месяцев). Сочетание применения традиционных химиотерапевтических агентов с введением компонента Ку1753с по настоящему изобретению может способствовать уменьшению продолжительности химиотерапевтического лечения (например, до 8 месяцев, 7 месяцев, 6 месяцев, 5 месяцев, 4 месяцев, 3 месяцев или меньше) без уменьшения эффективности.
Особый интерес представляет применение компонента Ку1753с вместе с бациллой КальметтаГерена (БЦЖ). Например, в форме модифицированной БЦЖ, которая рекомбинантно экспрессирует Ку1753с (или его вариант или фрагмент, как изложено здесь). Альтернативно, компонент Ку1753с может
- 19 022203 быть использован для усиления ответа субъекта на вакцинацию БЦЖ либо путём совместного введения, либо путём повторной иммунизации после предыдущей вакцинации БЦЖ. Очевидно, что компонент Ру1753с, когда его используют для усиления ответа субъекта на вакцинацию БЦЖ, может быть представлен в форме полипептида или полинуклеотида (возможно вместе с дополнительными антигенными компонентами как описано выше).
Специалисту будет понятно, что комбинации компонентов не обязательно вводят совместно и что они могут быть применены: по отдельности или в комбинации; одновременно, последовательно или в пределах короткого периода времени; и введены одинаковыми или разными путями. Тем не менее, для удобства обычно желательно (там где режимы введения совместимы) вводить комбинацию компонентов в виде единой композиции.
Полипептиды, полинуклеотиды и композиции по настоящему изобретению в общем случае будут введены людям, но они эффективны и для других млекопитающих, включая домашних животных (например, собак, кошек, кроликов, крыс, мышей, морских свинок, хомячков, шиншилл) и сельскохозяйственных млекопитающих (например, коров, свиней, овец, коз, лошадей).
Иммуногенные фрагменты
Т-клеточные эпитопы представляют собой короткие непрерывные отрезки из аминокислот, которые распознаются Т-клетками (например, СЭ4+ или СЭ8+ Т-клетками). Идентификация Т-клеточных эпитопов может быть достигнута с помощью экспериментов по эпитопному картированию, которые хорошо известны специалисту в данной области техники (см., например, Раи1, Рипбатеп1а1 1ттипо1оду, 3-е изд., 243-247 (1993); ВеьвЪагШ е! а1., Вюш£огтайс5, 2005, 21(§ирр1. 1): Ϊ29-Ϊ37).
Альтернативно, эпитопы можно предсказать, используя подходы, обсуждаемые в разделе примеры.
Исходя из решающего значения Т-клеточного ответа при туберкулезе очевидно, что фрагменты полноразмерного полипептида Ру1753с, содержащие по меньшей мере один Т-клеточный эпитоп, будут иммуногенными и могут вносить вклад в иммунологическую защиту. Такие фрагменты называются здесь иммуногенными фрагментами.
Иммуногенные фрагменты по настоящему изобретению обычно будут содержать по меньшей мере 9 следующих друг за другом аминокислот из полноразмерной полипептидной последовательности (например, по меньшей мере 10), как например, по меньшей мере 12 следующих друг за другом аминокислот (например, по меньшей мере 15 или по меньшей мере 20 следующих друг за другом аминокислот), в частности по меньшей мере 50 следующих друг за другом аминокислот, как например, по меньшей мере 100 следующих друг за другом аминокислот (например, по меньшей мере 200 следующих друг за другом аминокислот). Соответственно, иммуногенные фрагменты будут составлять по меньшей мере 20%, например, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 70% или по меньшей мере 80% длины полноразмерной полипептидной последовательности.
Понятно, что в разнотипной аутбредной популяции, такой как люди, наличие различных типов НЬА (антигенов тканевой совместимости человека) означает, что специфические эпитопы могут не распознаваться всеми членами популяции. Следовательно, чтобы максимизировать уровень распознавания и величину иммунного ответа на полипептид, как правило желательно, чтобы иммуногенный фрагмент содержал множество эпитопов из полноразмерной последовательности (соответствующим образом все эпитопы).
Конкретные фрагменты белка Ру1753с, которые могут быть использованы, включают фрагменты, содержащие по меньшей мере один СЭ4+ эпитоп, соответственно по меньшей мере два СЭ4+ эпитопа и в особенности все СЭ4+ эпитопы (как например, эпитопы, описанные в разделе Примеры и в §Еф ГО Ыо: 30-59, в частности эпитопы, ассоциированные с большинством НЬА-аллелей, например, эпитопы, ассоциированные с 2, 3, 4, 5 или более аллелями).
Другие фрагменты белка Ру1753с, которые могут быть использованы, включают фрагменты, содержащие по меньшей мере один СГО8 эпитоп, соответственно по меньшей мере два СГО8 эпитопа и в особенности все СЭ8 эпитопы (как например, эпитопы, описанные в разделе примеры и в §Еф ГО Ыо: 60247, в частности эпитопы, ассоциированные с множеством НЬА-аллелей, например эпитопы, ассоциированные с 2, 3, 4, 5 или более аллелями).
Когда используют индивидуальный фрагмент полноразмерного полипептида, такой фрагмент считают иммуногенным, если он вызывает ответ, составляющий по меньшей мере 20%, подходящим образом по меньшей мере 50% и в особенности по меньшей мере 75% (как например, по меньшей мере 90%) активности эталонной последовательности в анализе ш убго рестимуляции РВМС или цельной крови специфическими антигенами (например, рестимуляции в течение периода времени от нескольких часов до двух недель, как например, до одних суток, от 1 суток до 1 недели или 1-2 недель), в котором измеряют активацию клеток посредством измерения лимфопролиферации, продукции цитокинов в супернатанте культуры (измеряемых с помощью ЕЫ8А, СВА (Су1оте1пс Ъеаб аггау) и так далее) или определения параметров Т- и В-клеточных ответов с помощью внутри- и внеклеточного окрашивания (например, с применением антител, специфичных к иммунным маркерам, таким как СЭ3, СГО4. СГО8. 1Ь2 (интерлейкин-2), ТЫРа (фактор некроза опухоли-а), 1РЫд (д-интерферон), СЭ40Ь, СЭ69 и так далее) с последующим анализом на проточном цитометре. Соответствующим образом, фрагмент считается иммуногенным,
- 20 022203 если он вызывает ответ, составляющий по меньшей мере 20%, подходящим образом по меньшей мере 50% и в особенности по меньшей мере 75% (как например, по меньшей мере 90%) активности эталонной последовательности в анализе Т-клеточной пролиферации и/или продукции ΙΡΝ-гамма.
В некоторых случаях для получения эквивалентного биологического ответа на саму полноразмерную последовательность можно использовать множество фрагментов полноразмерного полипептида (которые могут перекрываться или не перекрываться и могут охватывать или не охватывать полноразмерную последовательность целиком). Например, по меньшей мере два иммуногенных фрагмента (например, три, четыре или пять), как описано выше, которые в комбинации обеспечивают по меньшей мере 50%, соответственно по меньшей мере 75% и в особенности по меньшей мере 90% активности эталонной последовательности в анализе ίη νίΐτο рестимуляции РВМС или цельной крови (например, в анализе Тклеточной пролиферации и/или продукции ΙΡΝ-гамма).
Варианты
Термин варианты или консервативно модифицированные варианты применяется как к аминокислотным последовательностям, так и к последовательностям нуклеиновой кислоты. Что касается конкретных последовательностей нуклеиновой кислоты, то термин консервативно модифицированные варианты относится к тем нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности, или когда нуклеиновая кислота не кодирует какую-либо аминокислотную последовательность, по существу, к идентичным последовательностям.
Вследствие вырожденности генетического кода любой заданный белок кодируется большим числом функционально идентичных нуклеиновых кислот. Например, все кодоны ОСА, ССС, ОСО и ОСИ кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в любом положении, где аланин задается кодоном, данный кодон может быть изменен на любой из соответствующих описанных кодонов, не вызывая изменений в кодируемом полипептиде. Такие варианты нуклеиновых кислот приводят к молчащим или вырожденным вариантам, которые являются одним из видов консервативно модифицированных вариантов. Каждая приведенная здесь последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, также описывает каждый возможный молчащий вариант нуклеиновой кислоты. Специалисту будет понятно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением АИО, который обычно представляет собой единственный кодон для метионина, и ТОО, который обычно представляет собой единственный кодон для триптофана) может быть модифицирован с получением функционально идентичной молекулы. Соответственно, каждый молчащий вариант нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, подразумевается в каждой описанной последовательности.
Полинуклеотид по изобретению может содержать несколько молчащих вариантов (например, могут быть изменены 1-50, как например, 1-25, в частности 1-5 кодонов и в особенности 1 кодон) по сравнению с эталонной последовательностью. Полинуклеотид по изобретению может содержать несколько не являющихся молчащими консервативных вариантов (например, могут быть изменены 1-50, как например, 1-25, в частности 1-5 кодонов и в особенности 1 кодон) по сравнению с эталонной последовательностью. Не молчащими вариантами являются такие, которые вызывают изменение в кодируемой аминокислотной последовательности (либо путём замены, либо делеции, либо вставки аминокислотных остатков). Специалистам в данной области будет понятно, что конкретная полинуклеотидная последовательность может содержать как молчащие, так и не молчащие консервативные варианты.
Что касается вариантов белковой последовательности, то специалисту будет понятно, что индивидуальные замены, делеции или вставки в полипептиде, приводящие к изменению, добавлению или делеции одной аминокислоты или небольшого процента аминокислот, представляют собой консервативно модифицированный вариант, когда данное изменение(я) приводит к замене аминокислоты функционально аналогичной аминокислотой или к замене/делеции/вставке остатков, которые, по существу, не затрагивают биологической функции данного варианта.
Таблицы консервативных замен, обеспечивающих функционально аналогичные аминокислоты, хорошо известны в данной области. Такие консервативно модифицированные варианты присутствуют в дополнение к полиморфным вариантам, межвидовым гомологам и аллелям по изобретению и не исключают их.
Полипептид по изобретению может содержать ряд консервативных замен (например, могут быть изменены 1-50, как например 1-25, в частности 1-10 аминокислотных остатков и в особенности 1 аминокислотный остаток) по сравнению с эталонной последовательностью. В общем случае, такие консервативные замены будут попадать в пределы одной из групп аминокислот, определенных ниже, хотя в некоторых случаях могут быть возможны и другие замены без существенного воздействия на иммуногенные свойства антигена. Каждая из следующих ниже восьми групп содержит аминокислоты, которые являются типично консервативными заменами друг для друга:
1) аланин (А), глицин (О);
2) аспарагиновая кислота (Ό), глутаминовая кислота (Е);
3) аспарагин (Ν), глутамин (О);
4) аргинин (К), лизин (К);
5) изолейцин (I), лейцин (Ь), метионин (М), валин (V);
- 21 022203
6) фенилаланин (Р), тирозин (Υ), триптофан (V);
7) серин (8), треонин (Т) и
8) цистеин (С), метионин (М) (см., например, Сте1дЫоп, РгоЮиъ. 1984).
Соответственно, такие замены не присутствуют в участке эпитопа и поэтому не оказывают существенного воздействия на иммуногенные свойства антигена.
Варианты белков также могут включать такие варианты, где дополнительные аминокислоты вставлены по сравнению с эталонной последовательностью, например, такие вставки могут присутствовать в 1-10 местах локализации (как например, 1-5 местах локализации, подходящим образом в 1 или 2 местах локализации, в частности в 1 месте локализации) и могут, например, включать добавление 50 или меньшего количества аминокислот в каждом месте локализации (как например, 20 или меньше, в частности, 10 или меньше, в особенности 5 или меньше). Соответственно, такие вставки не присутствуют в участке эпитопа и поэтому не оказываютсущественного воздействия на иммуногенные свойства антигена. Один из примеров вставок включает короткий участок остатков гистидина (например, 2-6 остатков) для облегчения экспрессии и/или очистки рассматриваемого антигена.
Варианты белков включают такие варианты, где аминокислоты делетированы по сравнению с эталонной последовательностью, например, такие делеции могут присутствовать в 1-10 местах локализации (как например, в 1-5 местах локализации, удобно, если в 1 или 2 местах локализации, в частности в 1 месте локализации) и могут, например, включать делецию из 50 или меньшего количества аминокислот в каждом месте локализации (как например, 20 или меньше, в частности, 10 или меньше, в особенности 5 или меньше). Соответственно, такие делеции не присутствуют в участке эпитопа и поэтому не оказывают существенного воздействия на иммуногенные свойства антигена.
Специалисту будет понятно, что конкретный варианты белка может содержать замены, делеции и вставки (или любую их комбинацию).
Способы определения эпитопных участков антигена описаны и проиллюстрированы в разделе примеры.
Варианты предпочтительно демонстрируют по меньшей мере примерно 70% идентичности, более предпочтительно по меньшей мере примерно 80% идентичности и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 90% идентичности (как например, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 98% или по меньшей мере примерно 99%) с соответствующей эталонной последовательностью.
Термины идентичный или процент идентичности в контексте двух или более нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей относятся к двум или более чем двум последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент одинаковых аминокислотных остатков или нуклеотидов (то есть идентичны на 70%, возможно идентичны на 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% в определенной области), при сравнении и выравнивании на максимальное соответствие в окне сравнения или внутри указанной области, что измеряется с использованием одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или посредством выравнивания вручную и визуального просмотра. О таких последовательностях далее говорится, что они по существу идентичны. Это определение также относится к комплементу тестируемой последовательности.
Возможно, идентичность существует в области, длина которой составляет по меньшей мере от примерно 25 до примерно 50 аминокислот или нуклеотидов, или возможно в области длиной 75-100 аминокислот или нуклеотидов. Подходящим образом сравнение выполняют в окне, соответствующем полной длине эталонной последовательности.
Для сравнения последовательностей обычно одна последовательность выступает в роли эталонной последовательности, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, при необходимости указывают координаты подпоследовательностей и задают параметры программы алгоритма сравнения последовательностей. Можно использовать параметры программы по умолчанию или можно задать альтернативные параметры. Далее с использованием алгоритма сравнения последовательностей, на основании параметров программы, рассчитывают процент идентичности последовательностей для тестируемых последовательностей относительно эталонной последовательности.
Термин окно сравнения, как он используется здесь, содержит ссылку на сегмент, в котором последовательность можно сравнивать с эталонной последовательностью с тем же числом следующих один за другим положений, после того, как эти две последовательности оптимально выровнены. Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено, например, с помощью алгоритма локальной гомологии по 8ιηί11ι & \Уа1егтац Λάν. Αρρί. МаЛ 2: 482 (1981), с помощью алгоритма гомологичного выравнивания по ЫееЛетап & ХУшъск 1. Μοί. Βίοί. 48: 443 (1970), с помощью поиска (вариантов) согласно методу подобия по Реатвоп & Пртап, Ргос. №Ц'1. Асаб. 8οΐ. И8А, 85: 2444 (1988), с помощью компьютеризированных воплощений этих алгоритмов (ОАР, ΒΕ8ΤΡΙΤ, РА8ТА и ТРА8ТА в \νίδсоп51п Оепейсв 8ой^ате Раскаде, Оепейсв СошрШег Отоир, 575 8с1епсе Ότ., МаЛвоп, XVI) или с помощью выравнивания вручную и визуального просмотра (см., например, СиттепЬ Рто1осо1в ш Мо1еси1аг Вю1оду
- 22 022203 (приложение к АикиЬе1 е) а1., ебк. 1995)).
Одним примером полезного алгоритма является РГЬЕиР. РГЬЕиР формирует множественное выравнивание последовательностей из группы родственных последовательностей с использованием прогрессивного, попарного выравнивания с целью выявления взаимосвязи и процента идентичности последовательностей. Он также производит построение дерева или дендрограммы, показывающего(ей) соотношения между кластерами, используемые для выравнивания. РГЕЕИР использует упрощение метода прогрессивного выравнивания по Рейд & ОооШИе, 1. Мо1. Ενοί., 35: 351-360 (1987). Используемый метод аналогичен методу, описанному Шддшк & ЗЬатр, САВГОЗ, 5: 151-153 (1989). Данная программа может выравнивать вплоть до 300 последовательностей, каждая с максимальной длиной 5000 нуклеотидов или аминокислот. Процедура множественного выравнивания начинается с попарного выравнивания двух наиболее похожих последовательностей с образованием кластера из двух выровненных последовательностей. Затем этот кластер выравнивают со следующей наиболее родственной последовательностью или кластером выровненных последовательностей. Два кластера последовательностей выравнивают путем простого удлинения попарного выравнивания двух индивидуальных последовательностей. Окончательное выравнивание достигается в результате серии прогрессивных попарных выравниваний. Программа действует путем определения специфических последовательностей и их аминокислотных или нуклеотидных координат для сравнения участков последовательностей и путем указания программных параметров. Используя РГЬЕиР, сравнивают эталонную последовательность с другими тестируемыми последовательностями с целью определения соотношения процента идентичности последовательностей, используя следующие параметры: вес бреши по умолчанию (3.00), вес длины бреши по умолчанию (0.10) и взвешенные концевые бреши. РГЬЕиР можно взять из пакета программ для анализа последовательности ОСО, например, версии 7.0 (^еνе^еаиx е) а1., Иис. Ашбк Кек., 12: 387-395 (1984)).
Другим примером алгоритма, который является подходящим для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, являются алгоритмы ВЬАЗТ и ВЬАЗТ 2.0, которые описаны в А1)ксЬи1 е) а1., Иис. Ашбк Кек., 25: 3389-3402 (1977) и А1)ксйи1 е) а1., I. Мо1. ΒίοΙ., 215: 403-410 (1990) соответственно. Программное обеспечение для проведения анализа с использованием ВЬАЗТ общедоступно через Национальный центр биотехнологической информации (Иа)юпа1 Сеп)ег Тот Вю)есйпо1о§у ГпГоттабоп (ИСВ1)) (вебсайт \у\у\у.псЬкп1пт1п11.до\'/). Этот алгоритм включает прежде всего идентификацию пар последовательностей с высоким баллом (НЗР) посредством идентификации коротких слов длиной в анализируемой последовательности, которые или соответствуют, или удовлетворяют некоторому положительно оцениваемому пороговому баллу Т при выравнивании со словом той же длины в последовательности из базы данных. Т обозначает пороговый балл для соседнего слова (А1)ксйи1 е) а1., выше). Эти изначальные соседние удачные слова (Ы)к) действуют в качестве затравок для инициирования поиска вариантов с целью нахождения более длинных НЗР, содержащих их. Удачные слова удлиняются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности настолько, насколько может быть увеличен кумулятивный балл выравнивания. Для нуклеотидных последовательностей кумулятивные баллы рассчитывают с использованием параметров М (балл-вознаграждение за пару соответствующих остатков; всегда > 0) и N (штрафной балл за ошибочно спаренные остатки; всегда < 0). Для расчета кумулятивного балла в отношении аминокислотных последовательностей используют матрицу баллов. Удлинение удачных слов в каждом направлении останавливается, когда: кумулятивный балл выравнивания падает на величину X от его максимально достигнутой величины; кумулятивный балл доходит до нуля или ниже вследствие аккумуляции одного или более чем одного выравнивания остатков с отрицательными баллами; или при достижении конца любой из двух последовательностей. Параметры XV, Т и X алгоритма ВЬАЗТ определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа ВЬАЗТИ (для нуклеотидных последовательностей) использует по умолчанию длину слова (^), равную 11; математическое ожидание (Е), равное 10, М = 5, N = -4 и сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей программа ВЬАЗТР использует по умолчанию длину слова, равную 3; и математическое ожидание (Е), равное 10; и выравнивания (В) по матрице баллов ВЬОЗИМ62 (см. НешкоГГ & НешкоГГ, Ргос. Иа)1. Асаб. Зск ИЗА, 89: 10915 (1989)), равные 50; математическое ожидание (Е), равное 10, М = 5, N = -4 и сравнение обеих цепей.
Алгоритм ВЬАЗТ также осуществляет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, КатНп & А1)ксйи1, Ргос. Иа)'1. Асаб. Зск ИЗА, 90: 5873-5787 (1993)). Одной из мер сходства, предоставляемых алгоритмом ВЬАЗТ, является наименьшая суммарная вероятность (Р(И)), которая дает указание на вероятность того, что совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями будет случайным. Например, считается, что нуклеиновая кислота аналогична эталонной последовательности, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестируемой нуклеиновой кислоты с эталонной нуклеиновой кислотой меньше чем примерно 0,2, более предпочтительно меньше чем примерно 0,01 и наиболее предпочтительно меньше чем примерно 0,001.
Настоящее изобретение также распространяется на полинуклеотиды, содержащие первую нуклеотидную последовательность, которая селективно гибридизуется в умеренно жестких условиях (как например, в жестких условиях) с комплементом второй нуклеотидной последовательности, кодирующей
- 23 022203 полипептид, содержащий:
(1) последовательность белка Ку1753е;
(2) вариант последовательности белка Ку1753е; или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ку1753е. Фраза жесткие условия гибридизации относится к условиям, при которых зонд будет гибридизоваться со своей подпоследовательностью-мишенью, обычно в сложной смеси, содержащей нуклеиновую кислоту, а ни с какими-либо другими последовательностями. Жесткие условия зависят от последовательности и в разных обстоятельствах будут различаться. Более длинные последовательности специфически гибридизуются при более высоких температурах. Исчерпывающее руководство по гибридизации нуклеиновых кислот можно найти в Τί|ккеп, ТесНп1циек ίη В|осНст151гу аиб Мо1еси1аг Βίο1θ8Υ-Ηνόπ6ίζαΙίοη \νί11ι Νυοίοίο РгоЬек, Ονβτνίβ^ о£ ρΓίηοίρΙοδ о£ ЬуЬ^^б^ζаΐ^оη апб 1Не к1та!е§у о£ пис1е1с ааб аккаук (1993). Как правило, жесткие условия выбирают так, чтобы температура была примерно на 5-10°С ниже, чем термическая точка плавления (Тт) для конкретной последовательности при определенных значениях ионной силы и рН. Тт представляет собой температуру (при определенных значениях ионной силы, рН и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зондов, комплементарных мишени, гибридизуются с последовательностьюмишенью при равновесии (поскольку последовательности-мишени присутствуют в избытке, то при Тт 50% зондов в равновесии находятся в связанном состоянии). Жесткими условиями будут такие, при которых концентрация соли ниже примерно 1,0 М для ионов натрия, в типичном случае концентрация ионов натрия (или других солей) составляет примерно 0,01-1,0 М при рН 7,0-8,3, а температура равна по меньшей мере примерно 30°С для коротких зондов (например, 10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере примерно 60°С для длинных зондов (например, больше 50 нуклеотидов). Жесткие условия также могут быть достигнуты путём добавления дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Для селективной или специфической гибридизации положительный сигнал по меньшей мере в два раза превышает фон, возможно в 10 раз превышает фоновую гибридизацию.
Типичные жесткие условия гибридизации могут быть следующими: 50% формамида, 5х§§С (раствор хлорида и цитрата натрия) и 1% δΌδ (додецилсульфат натрия), инкубация при 42°С, или 5х §§С, 1% δΌδ, инкубация при 65°С, с промывкой в 0,2х§§С и 0,1% δΌδ при 65°С.
Нуклеиновые кислоты, которые не гибридизуются друг с другом в жестких условиях, остаются попрежнему функционально эквивалентными, если полипептиды, которые они кодируют, являются, по существу, идентичными. Это имеет место, например, когда копия нуклеиновой кислоты создана с использованием максимальной вырожденности кодонов, допускаемой генетическим кодом. В таких случаях нуклеиновые кислоты обычно гибридизуются в умеренно жестких условиях гибридизации.
Типичные умеренно жесткие условия гибридизации включают гибридизацию в буфере из 40% формамида, 1 М №С1, 1% δΌδ, при 37°С и промывку в 1х §§С при 45°С. Положительная гибридизация превышает фон по меньшей мере в два раза. Средние специалисты легко поймут, что для обеспечения условий аналогичной жесткости могут быть использованы альтернативные условия гибридизации и промывки.
Фраза селективно (или специфически) гибридизуется с относится к связыванию, образованию дуплекса или гибридизации молекулы только с конкретной нуклеотидной последовательностью в жестких условиях гибридизации, когда данная последовательность присутствует в сложной смеси (например, суммарной клеточной или библиотечной ДНК или РНК).
Во всяком случае, варианты полипептидной последовательности будут обладать, по существу, той же активностью, что и эталонная последовательность (в случае полинуклеотидов, варианты полинуклеотидных последовательностей будут кодировать полипептид, который обладает, по существу, той же активностью, что и эталонная последовательность). Под по существу той же активностью понимают по меньшей мере 50%, подходящим образом по меньшей мере 75% и в особенности по меньшей мере 90% активности эталонной последовательности в анализе ίη νίΙΐΌ рестимуляции РВМС или цельной крови специфическими антигенами (например, рестимуляции в течение периода времени от нескольких часов вплоть до двух недель, как например, вплоть до одних суток, от 1 суток до 1 недели или 1-2 недель), в котором измеряют активацию клеток посредством измерения лимфопролиферации, продукции цитокинов в супернатанте культуры (измеряемых с помощью ЕЬ1§Л, СВА и так далее) или определения параметров Т- и В-клеточных ответов с помощью внутри- и внеклеточного окрашивания (например, с использованием антител, специфичных к иммунным маркерам, таким как СЭ3, СЭ4, СЭ8, 1Ь2, ТОТа, ΙΡΝ§, СП40Ь, СЭ69 и так далее) с последующим анализом на проточном цитометре. Соответственно, под по существу, той же активностью понимают по меньшей мере 50%, соответственно по меньшей мере 75% и в особенности по меньшей мере 90% активности эталонной последовательности в анализе Т-клеточной пролиферации и/или продукции ΙΡΝ-гамма.
Полинуклеотидные композиции
Как он использован здесь, термин полинуклеотид относится к молекуле, выделенной в свободном от суммарной геномной ДНК состоянии из конкретного образца. Поэтому полинуклеотид, кодирующий полипептид, относится к сегменту полинуклеотида, который содержит одну или более чем одну коди- 24 022203 рующую последовательность, уже, по существу, изолированному или очищенному от общей геномной ДНК видов, из которых получен данный полинуклеотид.
Как будет понятно специалистам в данной области, полинуклеотиды по данному изобретению могут включать геномные последовательности, экстрагеномные и кодируемые плазмидами последовательности и более мелкие генно-инженерные сегменты генов, которые экспрессируют или которые могут быть адаптированы для экспрессии, белки, полипептиды, пептиды и тому подобное. Такие сегменты могут быть выделены из природных источников или синтетически модифицированы человеком.
Термин выделенный, как он использован здесь, означает, что полинуклеотид, по существу, свободен от других кодирующих последовательностей и что данный полинуклеотид не содержит больших порций неродственной кодирующей ДНК, таких как большие хромосомные фрагменты или другие функциональные гены, или участки, кодирующие полипептиды. Выделенная нуклеиновая кислота отделена от других открытых рамок считывания, которые фланкируют ген и кодируют белки, отличающиеся от тех, которые кодирует данный ген. Несомненно, это относится к сегменту ДНК как он выделен изначально и не исключает генов или кодирующих участков, позже добавленных к данному сегменту человеком.
Как будет понятно специалисту в данной области, полинуклеотиды могут быть одноцепочечными (кодирующими или антисмысловыми) или двухцепочечными и могут представлять собой молекулы ДНК (геномной, кДНК или синтетической) или РНК. Молекулы РНК включают молекулы гяРНК (гетерогенная ядерная РНК), которые содержат интроны и соответствуют молекуле ДНК по типу один-к-одному (опе-Ю-опе), и молекулы мРНК, которые не содержат интронов. Дополнительные кодирующие или некодирующие последовательности могут, но не обязательно, находиться в пределах полинуклеотида по настоящему изобретению, и полинуклеотид может быть, но не обязательно, соединен с другими молекулами и/или веществами-носителями.
Полинуклеотиды могут содержать нативную последовательность (то есть эндогенную последовательность, которая кодирует антиген МусоЬас1етшт или его часть) или могут содержать вариант или биологический либо функциональный эквивалент такой последовательности. Полинуклеотидные варианты могут содержать одну или более чем одну замену, добавление, делецию и/или вставку, что также описано ниже, предпочтительно таких, чтобы иммуногенность кодируемого полипептида относительно эталонного белка не уменьшалась. Обычно влияние кодируемого полипептида на иммуногенность можно оценить, как изложено здесь.
В дополнительных воплощениях настоящего изобретения предложены выделенные полинуклеотиды и полипептиды, содержащие различные отрезки следующих один за другим участков последовательности, идентичной одной или более чем одной последовательности, раскрытой здесь, или комплементарной одной или более чем одной последовательности, раскрытой здесь. Например, согласно этому изобретению предложены полинуклеотиды, которые содержат по меньшей мере примерно 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 или 1000 или более следующих один за другим нуклеотидов эталонной последовательности, раскрытой здесь, а также все находящиеся между ними промежуточные отрезки. Легко понять, что промежуточные отрезки в этом контексте означают отрезки любой длины, находящейся между приведенными величинами, как например 30, 31, 32 и так далее; 50, 51, 52, 53 и так далее; 100, 101, 102, 103 и так далее; 150, 151, 152, 153 и так далее; в том числе все целочисленные значения в диапазонах 200-500; 500-1000 и тому подобное.
Более того, специалистам в данной области будет очевидно, что в результате вырожденности генетического кода существует много нуклеотидных последовательностей, которые кодируют полипептид как раскрыто здесь. Некоторые из этих полинуклеотидов имеют относительно низкую идентичность с нуклеотидной последовательностью любого нативного гена. Однако в настоящем изобретении особенно рассматриваются полинуклеотиды, которые варьируют вследствие различий при использовании кодонов, например, полинуклеотиды, которые оптимизированы для отбора кодонов человека и/или приматов. Более того, аллели генов, содержащих полинуклеотидные последовательности, предложенные здесь, находятся в пределах объема настоящего изобретения. Аллели представляют собой эндогенные гены, которые изменяются в результате одной или более мутаций, таких как делеции, добавления и/или замены нуклеотидов. Полученные мРНК и белок могут, но не обязательно, иметь измененную структуру или функцию. Аллели могут быть идентифицированы с использованием стандартных методов (таких как гибридизация, амплификация и/или сравнение последовательностей из базы данных).
Идентификация и характеристика полинуклеотидов
Полинуклеотиды могут быть идентифицированы, получены с использованием любого из множества общепризнанных методов и/или на них можно воздействовать с использованием множества общепризнанных методов. Например, полинуклеотид может быть идентифицирован, как описано более подробно ниже, путём скрининга на микрочипах кДНК. Такие скрининги могут быть проведены, например, с использованием микрочипа 8уп1еп1 (Ра1о А11о, СА) в соответствии с инструкциями производителя (и, по существу, как описано в 8сЬеиа е! а1., Ргос. Ыаб. Асаб. 8ск И8А, 93: 10614-10619 (1996) и Не11ег е! а1., Ргос. Νηΐ1. Асаб. 8ск И8А, 94: 2150-2155 (1997)). Альтернативно, полинуклеотиды могут быть амплифицированы на основании кДНК, полученной из клеток, экспрессирующих белки, раскрытые здесь, таких
- 25 022203 как клетки М. 1иЬегси1о818. Такие полинуклеотиды могут быть амплифицированы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для этого подхода на основании предложенных здесь последовательностей могут быть сконструированы сиквенс-специфические праймеры, и их можно приобрести или синтезировать.
Амплифицированный участок полинуклеотида может быть использован для выделения полноразмерного гена из подходящей библиотеки (например, библиотеки кДНК М. 1иЬетси1о818) с использованием хорошо известных методов. В таких методах библиотеку (кДНК или геномную) подвергают скринингу, используя один или более чем один полинуклеотидный зонд или праймер, подходящих для амплификации. Предпочтительно, чтобы библиотека была отобрана по размеру для включения молекул большего размера. Библиотеки, полученные с использованием случайных праймеров также могут быть предпочтительны для идентификации 5'- и расположенных выше участков генов. Геномные библиотеки являются предпочтительными для получения интронов и протяженных 5'-последовательностей.
Что касается методов гибридизации, то частичная последовательность может быть мечена (например, посредством ник-трансляции или концевого мечения с помощью 32Р) с использованием хорошо известных методов. Затем бактериальную или бактериофаговую библиотеку обычно подвергают скринингу посредством гибридизации на фильтрах, содержащих денатурированные бактериальные колонии (или газонах, содержащих фаговые бляшки), с меченым зондом (см. ЗатЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1 (2000)). Гибридизующиеся колонии или бляшки отбирают и размножают, и ДНК выделяют для дальнейшего анализа. Клоны кДНК могут быть проанализированы с целью определения количества дополнительной последовательности посредством, например, ПЦР с использованием праймера из частичной последовательности и праймера из вектора. Для идентификации одного или более чем одного перекрывающегося клона могут быть созданы рестрикционные карты и частичные последовательности. Затем можно определить полную последовательность с использованием стандартных методов, которые могут вовлекать создание ряда делеционных клонов. Полученные перекрывающиеся последовательности затем могут быть собраны в единую непрерывную последовательность. Полноразмерную молекулу кДНК можно создать путём лигирования подходящих фрагментов, используя хорошо известные методы.
Альтернативно, существуют многочисленные методы амплификации для получения полноразмерной кодирующей последовательности из частичной последовательности кДНК. В таких методах амплификацию обычно осуществляют с помощью ПЦР. Для осуществления стадии амплификации можно использовать любой из множества имеющихся в продаже наборов. Праймеры можно конструировать с использованием, например, программного обеспечения, хорошо известного в данной области. Праймеры предпочтительно имеют длину 22-30 нуклеотидов, имеют содержание ОС по меньшей мере 50% и отжигаются с последовательностью-мишенью при температуре примерно 68-72°С. Амплифицированный участок может быть секвенирован, как описано выше, и перекрывающиеся последовательности собраны в непрерывную последовательность.
Одной такой методикой амплификации является инвертированная ПЦР (см. ТпдПа е! а1., Ыис1. АсШ8 Ке8., 16: 8186 (1988)), в которой используют рестриктазы для создания фрагмента в известном участке гена. Затем этот фрагмент подвергают циркуляризации посредством внутримолекулярного лигирования и используют в качестве матрицы для ПЦР с применением дивергентных праймеров, полученных исходя из последовательности известного участка. В рамках альтернативного подхода последовательности, примыкающие к неполной последовательности, могут быть восстановлены путём амплификации с использованием праймера к линкерной последовательности и праймера, специфичного к известному участку. Обычно амплифицированные последовательности подвергают второму раунду амплификации с использованием того же самого линкерного праймера и второго праймера, специфичного к известному участку. Вариант этой процедуры, в котором используют два праймера, инициирующие удлинение в противоположных направлениях от известной последовательности, описан в νθ 96/38591. Другая такая методика известна как быстрая амплификация концов кДНК или КАСЕ. Эта методика включает применение внутреннего праймера и внешнего праймера, который гибридизуется с полиА участком или последовательностью вектора, для идентификации последовательностей, расположенных в 5'- и 3'направлениях от известной последовательности. Дополнительные методики включают ПЦР с захватом (Ьадег81тот е! а1., РСК Ме1Ноб8 Аррйс, 1: 111-19 (1991)) и ПЦР-прогулку (Рагкег е! а1., Ыиск АсШ8. Ке8. 19: 3055-60 (1991)). Другие способы, использующие амплификацию, также могут быть использованы для получения полноразмерной последовательности кДНК.
В некоторых случаях существует возможность получения полноразмерной последовательности кДНК путём анализа последовательностей, приведенных в базе данных экспрессируемых маркерных последовательностей (ЕЗТ, Ехрте88еб Зесщепсе Тад), таких как те, которые доступны из ОепВапк. Поиски перекрывающихся ЕЗТ обычно могут быть осуществлены с использованием хорошо известных программ (например, поиски ЫСВ1 ВЬАЗТ), и такие ЕЗТ могут быть использованы для создания непрерывной полноразмерной последовательности. Полноразмерные последовательности ДНК также можно получить путём анализа геномных фрагментов.
Экспрессия полинуклеотидов в клетках хозяина
- 26 022203
Полинуклеотидные последовательности или их фрагменты, кодирующие полипептиды по изобретению или слитые белки либо их функциональные эквиваленты, могут быть использованы в молекулах рекомбинантной ДНК для того, чтобы направить экспрессию полипептида в соответствующих клетках хозяина. Вследствие природной вырожденности генетического кода могут быть получены другие последовательности ДНК, которые кодируют, по существу, такую же или функционально эквивалентную аминокислотную последовательность, и эти последовательности могут быть использованы для клонирования и экспрессии указанного полипептида.
Как будет понятно специалистам в данной области, в некоторых случаях может иметь преимущество получение полипептид-кодирующих нуклеотидных последовательностей, имеющих неприродные кодоны. Например, для увеличения скорости экспрессии белка или для продуцирования рекомбинантного РНК транскрипта, имеющего такие желаемые свойства, как период полувыведения, который продолжительнее такового у транскрипта, созданного из последовательности природного происхождения, могут быть выбраны кодоны, предпочтительные для конкретного прокариотического или эукариотического хозяина.
Более того, можно конструировать полинуклеотидные последовательности, применяя способы, общеизвестные в данной области для того, чтобы изменять полипептид-кодирующие последовательности по ряду причин, включая, но этим не ограничиваясь, изменения, которые модифицируют клонирование, процессинг и/или экспрессию генного продукта. Например, для конструирования нуклеотидных последовательностей можно использовать перетасовку ДНК путем случайной фрагментации и вторичной сборки генных фрагментов и синтетических олигонуклеотидов с помощью ПЦР. В дополнение к этому, сайт-направленный мутагенез можно использовать для вставки новых рестрикционных сайтов, изменения характера гликозилирования, изменения предпочтения кодонов, получения сплайс-вариантов или введения мутаций и так далее.
Природные, модифицированные или рекомбинантные последовательности нуклеиновой кислоты могут быть лигированы с гетерологичной последовательностью для того, чтобы кодировать слитый белок. Например, скрининг пептидных библиотек в отношении ингибиторов полипептидной активности может быть полезным для кодирования химерного белка, который может распознаваться имеющимся в продаже антителом. Также слитый белок может быть сконструирован так, чтобы он содержал сайт расщепления, локализованный между полипептид-кодирующей последовательностью и гетерологичной белковой последовательностью, так чтобы полипептид можно было отщепить и очистить от гетерологичной группировки.
Последовательности, кодирующие желаемый полипептид, можно синтезировать, целиком или частично, используя химические способы, хорошо известные в данной области техники (см. Саги1кегк, Μ. Н. е! а1., Ыис1. АсИк Ке8. 8утр. 8ег, рр. 215-223 (1980), Нот е! а1., Ыис1. АсИк Кек. 8утр. 8ег, рр. 225-232 (1980)). Альтернативно, сам белок можно получить, используя химические способы синтеза аминокислотной последовательности полипептида или его участка. Например, пептидный синтез может быть осуществлен с использованием различных твердофазных методов (КоЬегде е! а1., 8с1епсе, 269: 202-204 (1995)), а автоматизированного синтеза можно достичь, например, с использованием пептидного синтезатора ΑΒΙ 431А (Регкт Е1тег, Ра1о Л11о, СА).
Вновь синтезированный пептид можно в значительной степени очистить с помощью препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (например, СгшдЫоп, Рго1е1пк, 81гис1игек апб Мо1еси1аг Ргтс1р1ек (1983)) или других сравнимых методов, доступных в данной области. Состав синтетических пептидов может быть подтвержден аминокислотным анализом или секвенированием (например, процедурой деградации по Эдману). Кроме того, аминокислотную последовательность полипептида или любого его участка можно изменить в процессе прямого синтеза и/или скомбинировать, используя химические способы, с последовательностями из других белков или любого их участка с целью продуцирования вариантного полипептида.
Для того чтобы экспрессировать желаемый полипептид, нуклеотидные последовательности, кодирующие этот полипептид или его функциональные эквиваленты, можно встроить в соответствующий экспрессирующий вектор, то есть вектор, содержащий необходимые элементы для транскрипции и трансляции встроенной кодирующей последовательности. Способы, которые хорошо известны специалистам в данной области, могут быть использованы для конструирования экспрессирующих векторов, содержащих последовательности, кодирующие представляющий интерес полипептид, и соответствующие транскрипционные и трансляционные контрольные элементы. Эти способы включают методы рекомбинантной ДНК ш νίίΐΌ, методы синтеза и методы генетической рекомбинации ш νί\Ό. Такие методы описаны в 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1отпд, А ЬаЬога!огу Мапиа1 (2000) и АикиЬе1 е! а1., Сиггеп! Рго!осо1к т Мо1еси1аг Вю1оду (обновляемые ежегодно).
Ряд систем экспрессирующий вектор/хозяин можно использовать для содержания и экспрессии полинуклеотидных последовательностей. Они включают, но не ограничиваются этим, микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантными бактериофаговыми, плазмидными или космидными ДНК-экспрессирующими векторами; дрожжи, трансформированные дрожжевыми векторами экспрессии; клеточные системы насекомых, инфицированные вирусными векторами экспрессии (напри- 27 022203 мер, бакуловирусными); растительные клеточные системы, трансформированные вирусными векторами экспрессии (например, на основе вируса мозаики цветной капусты (СаМУ; вируса табачной мозаики (ТМУ) или бактериальными векторами экспрессии (например, плазмидами Τι или рВК322); или животные клеточные системы.
Контрольные элементы или регуляторные последовательности, присутствующие в экспрессирующем векторе, представляют собой нетранслируемые участки вектора - энхансеры, промоторы, 5'- и З'-нетранслируемые участки, которые взаимодействуют с клеточными белками хозяина для осуществления транскрипции и трансляции. Такие элементы могут варьировать по своей эффективности и специфичности. В зависимости от применяемых векторной системы и хозяина можно использовать любое количество подходящих транскрипционных и трансляционных элементов, включая конститутивные и индуцибельные промоторы. Например, при клонировании в бактериальных системах можно использовать индуцибельные промоторы, такие как гибридный промотор 1ас2 фагмиды РВЕИЕ8СК1РТ (8!га!адепе, Ьа Йо11а, СаНГ.) или плазмиды Р8РОКТ1 (О1Ьсо ВКЬ, ОаккещЬигд, ΜΌ) и тому подобное. В клеточных системах млекопитающих обычно предпочтительны промоторы из генов млекопитающих или из вирусов млекопитающих. Если необходимо создать клеточную линию, которая содержит множественные копии последовательности, кодирующей полипептид, преимущество в использовании имеют векторы на основе 8ν40 (обезьяньего вируса 40) или ΕΒν (вируса Эпштейна-Барр) с соответствующим селектируемым маркером.
В бактериальных системах количество экспрессирующих векторов может быть выбрано в зависимости от применения, предполагаемого для экспрессируемого полипептида. Например, когда требуются большие количества, например, для индукции антител, то можно использовать векторы, приводящие к высокому уровню экспрессии слитых белков, которые можно легко очистить. Такие векторы включают, но не ограничиваются этим, многофункциональные клонирующие и экспрессирующие в Е. соП векторы, такие как ВЬиЕ8СК1РТ (8!га!адепе), в которых последовательность, кодирующая представляющий интерес полипептид, может быть лигирована в этот вектор в рамке считывания с последовательностями для аминоконцевого Ме! и последующих 7 остатков β-галактозидазы, таким образом, что продуцируется гибридный белок; векторы ρΙΝ Уап Нееке & 8ски51ег, 1. Вю1. Скет., 264: 5503-5509 (1989)) и тому подобное. Векторы рОЕХ (Рготеда, Май18оп, ^18.) также могут быть использованы для экспрессии чужеродных полипептидов в виде слитых белков с глутатион-8-трансферазой (О8Т). Обычно такие слитые белки растворимы и могут быть легко очищены из лизированных клеток путём адсорбции на глутатионагарозных гранулах с последующим элюированием в присутствии свободного глутатиона. Белки, полученные в таких системах, можно конструировать таким образом, чтобы включить сайты гепарина, сайты расщепления тромбином или протеазой фактор ХА, с тем, чтобы при желании представляющий интерес клонированный полипептид можно было освободить от О8Т-группировки.
В дрожжах 8асскаготусе§ сеге\л51ае могут быть использованы различные векторы, содержащие конститутивные или индуцибельные промоторы, такие как промоторы альфа-фактора, алкогольоксидазы и РОН. Другие векторы, содержащие конститутивные или индуцибельные промоторы, включают промоторы генов ОАР (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа), РОК (фосфоглицераткиназа), ОАЬ (галактозидаза) и АЭН (алкогольдегидрогеназа). В качестве обзоров см. Аи8иЬе1 е! а1. (выше) и Огап! е! а1., Ме!койк Еп/уток, 153: 516-544 (1987) и Котак е! а1. Уеак!, 8: 423-88 (1992).
В случаях использования растительных экспрессирующих векторов экспрессия последовательностей, кодирующих полипептиды, может управляться любым из множества промоторов. Например, вирусные промоторы, такие как промоторы 358 и 198 СаМУ могут быть использованы по отдельности или в комбинации с омега-лидерной последовательностью из ΤΜV (Таката18и, ЕМВО 1., 6: 307-311 (1987)). Альтернативно, могут быть использованы растительные промоторы, такие как промоторы генов малой субъединицы КИВ18СО (рибулозобисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа) или белков теплового шока (Согп/ζί е! а1., ЕМВО 1., 3: 1671-1680 (1984); ВгодИе е! а1., 8шепсе, 224: 838-843 (1984); и ХУпИег е! а1., Кекикк РгоЬ1. Се11 Ю1ГГег., 17: 85-105 (1991)). Эти конструкции могут быть введены в растительные клетки путем прямой трансформации ДНК или путём патоген-опосредованной трансфекции. Такие методы описаны в ряде обычно доступных обзоров (см., например, НоЬЬк в МсОгате НШ УеагЬоок оГ 8аепсе апй Тескпо1оду, рр. 191-196 (1992)).
Систему (клеток) насекомых также можно использовать для экспрессии представляющего интерес полипептида. Например, в одной такой системе в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов в клетках 8ройор!ега £гид1регйа или в Тпскор1и81а кигае используют вирус ядерного полиэдроза АпЮдгарка сакГогшса (Ас№у. Последовательности, кодирующие полипептид, можно клонировать в несущественный участок вируса, например полиэдриновый ген, и поместить под контроль полиэдринового промотора. Успешная вставка полипептид-кодирующей последовательности будет делать полиэдриновый ген неактивным и давать рекомбинантный вирус, не имеющий белка оболочки. Затем рекомбинантные вирусы могут быть использованы для инфицирования, например, клеток 8. £гид1регйа или Тпскор1и81а кигае, в которых может экспрессироваться представляющий интерес полипептид (Епде1кагй е! а1., Ргос. №И. Асай. 8с1. и.8.А., 91: 3224-3227 (1994)).
В клетках-хозяевах млекопитающих обычно доступен ряд экспрессирующих систем на основе ви- 28 022203 русов. Например, в случаях, где аденовирус используется в качестве экспрессирующего вектора, последовательности, кодирующие представляющий интерес полипептид, могут быть лигированы в аденовирусный транскрипционный/трансляционный комплекс, состоящий из позднего промотора и трехкомпонентной лидерной последовательности. Вставку в несущественный участок Е1 или Е3 вирусного генома можно использовать для получения жизнеспособного вируса, способного экспрессировать полипептид в инфицированных клетках-хозяевах (Ьодап & §йепк, Ггос. Ν;·ιΐ1. Асаб. §сг И.8.А., 81: 3655-3659 (1984)). Дополнительно для увеличения экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих можно использовать энхансеры транскрипции, такие как энхансер вируса саркомы Рауса (К§У). Обзоры способов и протоколов для работы с аденовирусными векторами приведены в \Уо1<Р Абепо\агнк МеШобк апб Ριγ^μΕ. 1998. Дополнительные ссылки, касающиеся применения аденовирусных векторов, можно найти в Абепо\агик: А Мебюа1 Оюбопагу, ЫЫюдгарйу, апб Аппо1а1еб РекеагсН Ошбе Ю 1п1егпе1 КеГегепсек, 2004.
Для достижения более эффективной трансляции последовательностей, кодирующих представляющий интерес полипептид, также могут быть использованы специфические сигналы инициации. Такие сигналы включают инициирующий кодон ΆΤΟ и примыкающие последовательности. В тех случаях, когда последовательности, кодирующие полипептид, его инициирующий кодон и расположенные выше последовательности встроены в соответствующий экспрессирующий вектор, никаких дополнительных транскрипционных или трансляционных контрольных сигналов может не потребоваться. Однако в случаях, когда встроены только кодирующая последовательность или ее участок, необходимо обеспечить экзогенные трансляционные контрольные сигналы, включая инициирующий кодон АГО. Более того, инициирующий кодон должен находиться в правильной рамке считывания, чтобы гарантировать трансляцию всей вставки. Экзогенные трансляционные элементы и инициирующие кодоны могут быть различного происхождения, как природными, так и синтетическими. Эффективность экспрессии можно повысить путем включения энхансеров, которые являются соответствующими конкретной используемой клеточной системе, которая применяется, как например энхансеров, которые описаны в литературе (ЗсйагГ. е1 а1., КекиПк ЙоЫ. Се11 ПГГег., 20: 125-162 (1994)).
Кроме того, можно выбрать штамм клеток хозяина по его способности модулировать экспрессию встроенных последовательностей или осуществлять процессинг экспрессируемого белка желательным образом. Такие модификации полипептида включают, но не ограничиваются этим, ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидизацию и ацилирование. Посттрансляционный процессинг, при котором происходит расщепление препро-формы белка, также можно использовать для облегчения правильной вставки, фолдинга и/или функции. Различные клетки-хозяева, такие как клетки СНО (яичников китайского хомячка), НеЬа, МОСК, НЕК293 (почек эмбриона человека) и ^ν!38, которые имеют специфический клеточный аппарат и специфические механизмы для таких посттрансляционных активностей, могут быть выбраны для обеспечения правильной модификации и процессинга чужеродного белка.
Для продолжительного продуцирования рекомбинантных белков с высоким выходом обычно предпочтительна стабильная экспрессия. Например, клеточные линии, которые стабильно экспрессируют представляющий интерес полинуклеотид, могут быть трансформированы с использованием экспрессирующих векторов, которые могут содержать вирусные точки инициации репликации и/или эндогенные элементы экспрессии и селектируемый маркерный ген в том же или в отдельном векторе. После введения вектора клетки можно оставить расти в течение 1-2 суток в обогащенной среде, прежде чем перевести их в селективную среду. Задача селектируемого маркера заключается в том, чтобы придать устойчивость к селекции, и его присутствие делает возможным рост и выделение клеток, успешно экспрессирующих введенные последовательности. Устойчивые клоны стабильно трансформированных клеток могут быть размножены с использованием методов культивирования тканей, подходящих для данного типа клеток.
Для получения трансформированных клеточных линий можно использовать любое количество систем селекции. Они включают, но не ограничиваются этим, гены тимидинкиназы (1.к) (νίβΚΓ е1 а1., Се11, 11: 223-32 (1977)) и аденинфосфорибозилтрансферазы (арй) вируса простого герпеса (Ьо^у е1 а1., Се11, 22: 817-23 (1990)), которые могут быть использованы соответственно в Гк.кир.- или аргТкир.- клетках. Кроме того, в качестве основы для селекции можно использовать устойчивость к антиметаболитам, антибиотикам или гербицидам; например, бЬГг (дигидрофолатредуктаза), который придает устойчивость к метотрексату (νίβΚΓ е! а1., Ггос. №ιΐ1. Асаб. 8сг И.8.А., 77: 3567-70 (1980)); пр! (неомицинфосфотрансфераза), который придает устойчивость к аминогликозидам, неомицину и О-418 (Со1ЪегеОагарш е1 а1., ί. Мо1. Бю1., 150: 1-14 (1981)); и а1к (ацетолактатсинтаза) или ра! (фосфинотрицинацетилтрансфераза), которые придают устойчивость соответственно к хлорсульфурону и фосфинотрицину (Миггу, выше). Были описаны дополнительные селектируемые гены, например, 1грВ (триптофансинтаза), который позволяет клеткам утилизировать индол вместо триптофана, или 1йкЭ (гистидинолдегидрогеназа), который позволяет клеткам утилизировать гистидинол вместо гистидина (Найтап & МиШдап, Ггос. №·ιΐ1. Асаб. 8сг И.8.А., 85: 8047-51 (1988)). Недавно применение видимых маркеров сделало популярным использование таких маркеров, как антоцианины, β-глюкуронидаза и ее субстрат ОИ8, люцифераза и ее субстрат люциферин, причем их широко используют не только для идентификации трансфор- 29 022203 мантов, но также для количественного определения величины временной или стабильной экспрессии белка, присущей конкретной векторной системе (Кйобев е1 а1., МеЛобв Мо1. Вю1., 55: 121-131 (1995)).
Хотя наличие/отсутствие экспрессии маркерного гена предполагает, что представляющий интерес ген также присутствует, его присутствие и экспрессия могут нуждаться в подтверждении. Например, если последовательность, кодирующую полипептид, встраивают в последовательность маркерного гена, рекомбинантные клетки, содержащие последовательности, могут быть идентифицированы по отсутствию функции маркерного гена. Альтернативно, маркерный ген можно разместить в тандеме с полипептид-кодирующей последовательностью под контролем одного промотора. Экспрессия маркерного гена в ответ на индукцию или селекцию обычно также указывает на экспрессию тандемного гена.
Альтернативно, клетки хозяина, содержащие и экспрессирующие желаемую полинуклеотидную последовательность, можно идентифицировать различными методами, известными специалистам в данной области. Эти методы включают, но не ограничиваются этим, ДНК-ДНК или ДНК-РНК гибридизации и методы биоанализа или иммуноанализа белков, которые включают мембранные технологии, технологии в растворах или технологии на основе чипов для детекции и/или количественного определения нуклеиновой кислоты или белка.
В данной области техники известно множество протоколов детекции и измерения экспрессии полинуклеотид-кодируемых продуктов с использованием либо поликлональных, либо моноклональных антител, специфичных к данному продукту. Примеры включают твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А), радиоиммуноанализ (К1А) и метод флуоресцентно-активированной сортировки клеток (РАС8). Для некоторых применений предпочтительным может быть двухстадийный, основанный на моноклональных антителах иммунологический анализ, в котором используются моноклональные антитела, реагирующие с двуми неперекрывающимися эпитопами на указанном полипептиде, но также можно использовать анализ конкурентного связывания. Эти и другие анализы описаны, наряду с другими источниками, в НатрЬоп е1 а1., 8ето1одюа1 МеЛобв, а Б-аЪогаЮгу Мапиа1 (1990) и Маббох е1 а1., 1. Ехр. Меб., 158: 1211-1216(1983).
Большое разнообразие меток и методов конъюгирования известны специалистам в данной области, и их можно использовать в различных анализах нуклеиновых кислот и аминокислот. Способы получения меченых гибридизационных или ПЦР-зондов для детекции последовательностей, относящихся к полинуклеотидам, включают олигомечение, ник-трансляцию, концевое мечение или ПЦР-амплификацию с использованием меченого нуклеотида. Альтернативно, последовательности или любые их участки можно клонировать в вектор для продуцирования мРНК-зонда. Такие векторы известны в данной области, имеются в продаже и их можно использовать для синтеза РНК-зондов ш \йго путем добавления соответствующей РНК-полимеразы, например, Т7, Т3 или 8Р6, и меченых нуклеотидов. Эти процедуры можно проводить, используя различные имеющиеся в продаже наборы. Подходящие репортерные молекулы или метки, которые могут быть использованы, включают радионуклиды, ферменты, флуоресцентные, хемилюминесцентные или хромогенные агенты, а также субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и тому подобное.
Клетки хозяина, трансформированные представляющей интерес полинуклеотидной последовательностью, можно культивировать в условиях, подходящих для экспрессии и выделения белка из клеточной культуры. Белок, продуцируемый рекомбинантной клеткой, может секретироваться или оставаться внутри клетки в зависимости от используемых последовательности и/или вектора. Как будет очевидно специалистам в данной области, экспрессирующие векторы, содержащие полинуклеотиды, могут быть сконструированы таким образом, чтобы содержать в себе сигнальные последовательности, которые управляют секрецией кодируемого полипептида через мембрану прокариотических или эукариотических клеток. Другие рекомбинантные конструкции могут быть использованы для присоединения последовательностей, кодирующих представляющий интерес полипептид, к нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептидный домен, который будет облегчать очистку растворимых белков. Такие облегчающие очистку домены включают, но не ограничиваются этим, металл-хелатирующие пептиды, такие как гистидин-триптофановые модули, позволяющие осуществлять очистку на иммобилизованных металлах, домены белка А, позволяющие осуществлять очистку на иммобилизованном иммуноглобулине, и домен, используемый в системе РЬАО8-удлинения/аффинной очистки (1ттипех Согр., 8еай1е, Vа5Κ). Встраивание расщепляемых линкерных последовательностей, таких как линкерные последовательности, специфичные к фактору ХА или энтерокиназе ОтЦгодеп, 8ап О|едо, СайТ.), между доменом очистки и кодируемым полипептидом можно использовать для облегчения очистки. Один такой экспрессирующий вектор обеспечивает экспрессию слитого белка, содержащего представляющий интерес полипептид, и этот вектор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую 6 гистидиновых остатков, находящихся перед тиоредоксиновым или энтерокиназным сайтом расщепления. Гистидиновые остатки облегчают очистку на 1М1АС (аффинная хроматография с использованием иммобилизованных ионов металлов), как описано в РотаЛ е1 а1., РгоЬ Ехр. Рнгй., 3: 263-281 (1992), в то время как сайт расщепления энтерокиназой обеспечивает средство для очистки желаемого полипептида из слитого белка. Обсуждение векторов, кодирующих слитые белки, приведено в Кго11 е1 а1., НЫА Се11 Вю1., 12: 441-453 (1993)).
Методы доставки полинуклеотидов ΐη νίνο
- 30 022203
В дополнительных воплощениях генетические конструкции, содержащие один или более полинуклеотидов по изобретению, вводят в клетки ш У1уо. Этого можно достичь с использованием любого из различных хорошо известных подходов; некоторые из них приведены ниже с целью иллюстрации.
1. Аденовирус
Один из предпочтительных способов для ш уьуо доставки одной или более чем одной последовательности нуклеиновой кислоты включает применение аденовирусного экспрессирующего вектора. Подразумевается, что аденовирусный экспрессирующий вектор включает такие конструкции, которые содержат аденовирусные последовательности, достаточные для (а) поддержания упаковки конструкции и (б) для экспрессии полинуклеотида, клонированного в нем в смысловой или антисмысловой ориентации. Конечно, в контексте антисмысловой конструкции экспрессия не требует, чтобы продукт гена синтезировался.
Экспрессирующий вектор содержит генноинженерную форму аденовируса. Знание генетической организации аденовируса, представляющего собой вирус с линейной двухцепочечной ДНК, 36 т.п.н., позволяет производить замену больших участков аденовирусной ДНК чужеродными последовательностями вплоть до 7 т.п.н. (ОгипНаиБ & Ноглуй/, 1992). В противоположность ретровирусу, аденовирусная инфекция клеток хозяина не приводит к хромосомной интеграции, потому что аденовирусная ДНК может реплицироваться в виде эписомы без потенциальной генотоксичности. Кроме того, аденовирусы структурно стабильны и после активной амплификации не отмечено никакой геномной перестройки.
Аденовирус может инфицировать фактически все эпителиальные клетки независимо от стадии их клеточного цикла. До настоящего времени аденовирусная инфекция обнаруживается связанной, повидимому, только с легкой формой заболевания, такого как острое респираторное заболевание, у людей.
Аденовирус особенно подходит для применения его в качестве вектора для переноса генов из-за среднего размера его генома, легкости манипулирования, высокого титра, широкого диапазона клетокмишеней и высокой инфекционности. Оба конца вирусного генома содержат инвертированные повторы длиной 100-200 пар оснований (1ТР), которые представляют собой цис-элементы, необходимые для репликации и упаковки вирусной ДНК. Ранние (Е) и поздние (Ь) участки генома содержат разные транскрипционные единицы, которые разделены точкой начала репликации вирусной ДНК. Участок Е1 (Е1А и Е1В) кодирует белки, отвечающие за регуляцию транскрипции вирусного генома и нескольких клеточных генов. Экспрессия участка Е2 (Е2А и Е2В) приводит к синтезу белков для репликации вирусной ДНК. Эти белки вовлечены в репликацию ДНК, экспрессию поздних генов и отключение клеткихозяина (Репап, 1990). Продукты поздних генов, включая большую часть капсидных вирусных белков, экспрессируются только после значительного процессинга одного первичного транскрипта под контролем главного позднего промотора (МЬР). МЬР (расположенный на 16,8 единицы карты) особенно эффективен в поздней фазе инфекции, и все мРНК, контролируемые этим промотором, содержат 5'тройственную лидерную (ТРЬ) последовательность, которая делает их предпочтительными мРНК для трансляции.
В настоящей системе рекомбинантный аденовирус получают в результате гомологичной рекомбинации между челночным вектором и провирусным вектором. Вследствие возможной рекомбинации между двумя провирусными векторами в результате этого процесса может быть получен аденовирус дикого типа. Поэтому крайне необходимым является выделение единичного клона вируса из индивидуальной бляшки и проверка его геномной структуры.
Получение и размножение существующих в настоящее время аденовирусных векторов, которые дефектны по репликации, зависит от уникальной линии хелперных клеток, обозначенной 293, которая представляет собой клетки почки эмбриона человека, трансформированные фрагментами ДНК Аб5 (аденовируса 5 серотипа), и которая конститутивно экспрессирует белки Е1 (ОгаНат е! а1., 1977). Поскольку участок Е3 является необязательным в аденовирусном геноме (1опеБ & 8Непк, 1978), существующие в настоящее время аденовирусные векторы с помощью клеток 293 несут чужеродную ДНК либо в участке Е1, либо Ό3, либо в обоих этих участках (ОгаНат & Ргеуес, 1991). В природе аденовирус может упаковывать приблизительно 105% генома дикого типа (ОНоБН-СНоибНигу е! а1., 1987), обеспечивая емкость приблизительно для 2 дополнительных т.п.н. ДНК. В сочетании с приблизительно 5,5 т.п.н. ДНК, которые могут быть заменены в участках Е1 и Е3, максимальная емкость существующих в настоящее время аденовирусных векторов составляет менее 7,5 т.п.н. или примерно 15% от общей длины вектора. Более 80% вирусного генома аденовируса остается в остове вектора и является источником трансмиссивной цитотоксичности. На этом дефектность по репликации Е1-делетированного вируса не заканчивается. Например, при использовании доступных в настоящее время векторов с высокой множественностью заражения (МО1) наблюдалась утечка экспрессии вирусных генов (МиШдап, 1993).
Хелперные клеточные линии могут происходить из клеток человека, таких как клетки почки эмбриона человека, мышечные клетки, гемопоэтические клетки или другие мезенхимальные или эпителиальные клетки эмбриона человека. Альтернативно, хелперные клетки могут происходить из клеток других видов млекопитающих, пермиссивных для аденовируса человека. Такие клетки включают, например, клетки Уего (клетки почки зеленой мартышки) или другие эмбриональные мезенхимальные или эпителиальные клетки обезьяны. Как указано выше, в настоящее время предпочтительной хелперной клеточной
- 31 022203 линией является линия 293.
Касйег е! а1. (1995) описали улучшенные способы культивирования клеток 293 и размножения аденовируса. В одном из форматов агрегаты природных клеток выращивают путем инокуляции индивидуальных клеток в силиконизированных вращающихся колбах объемом 1 л (Тесйпе, СатЬпйде, ИК), содержащих по 100-200 мл среды. После перемешивания при 40 об/мин оценивают жизнеспособность клеток с использованием трипанового синего. В другом формате используют микроносители Е1Ьга-Се1 (ВЛЬу δ^ιΉπ, δίοΐ'^, ИК) (5 г/л) следующим образом. Клеточный инокулят, ресуспендированный в 5 мл среды, добавляют к носителю (50 мл) в колбе Эрленмейера объемом 250 мл и оставляют в стационарном состоянии на 1-4 ч с перемешиванием время от времени. Затем среду заменяют на 50 мл свежей среды и начинают встряхивание. Для продуцирования вируса клетки оставляют расти до конфлюентности примерно 80%, после чего среду меняют (до 25% конечного объема) и добавляют аденовирус при ΜΟΙ 0,05. Культуры оставляют в стационарном состоянии на ночь, после чего объем увеличивают до 100% и начинают встряхивание, которое продолжают в течение еще 72 ч.
Помимо требования, чтобы аденовирусный вектор был дефектным или по меньшей мере условно дефектным по репликации, природа аденовирусного вектора, по-видимому, не является решающей для успешного практического применения изобретения. Аденовирус может представлять собой любой из 42 разных известных серотипов или подгрупп Α-Е. Аденовирус 5 типа подгруппы С является предпочтительным исходным материалом для получения условно дефектного по репликации аденовирусного вектора для применения в настоящем изобретении, поскольку аденовирус 5 типа является человеческим аденовирусом, о котором известно огромное количество биохимической и генетической информации, и исторически его используют для большинства конструкций, использующих аденовирус в качестве вектора.
Как указано выше, типичный вектор по настоящему изобретению дефектен по репликации и не будет иметь аденовирусного участка Е1. Таким образом, удобнее всего будет вводить полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес ген, в положение, из которого удалены Е1-кодирующие последовательности. Однако положение вставки конструкции в аденовирусных последовательностях не критично для этого изобретения. Полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес ген, также может быть встроен вместо делетированного участка Е3 в Е3-замещающих векторах, как описано КаИкю!'! е! а1. (1986), или в участок Е4, где линия хелперных клеток или хелперный вирус комплементирует дефект Е4.
Аденовирус легко выращивать, им легко манипулировать, и он демонстрирует широкий круг хозяев ш νί!το и ш νίνο. Эта группа вирусов может быть получена с высокими титрами, например, 109-10п бляшкообразующих единиц на один мл, и они обладают высокой инфекционностью. Жизненный цикл аденовируса не требует интеграции в геном клетки-хозяина. Чужеродные гены, доставляемые посредством аденовирусных векторов, являются эписомными и, следовательно, имеют низкую генотоксичность в отношении клеток хозяина. Не сообщалось ни о каких побочных эффектах при исследованиях вакцинации аденовирусом дикого типа (ΟουΛ е! а1., 1963; Шр е! а1., 1971), что демонстрирует их безопасность и терапевтический потенциал в качестве векторов для переноса генов ш νίνο.
Аденовирусные векторы использовали в экспрессии эукариотических генов (Ьетгего е! а1., 1991; ^те/^зх е! а1., 1992) и разработке вакцин (Сгнпйанк & ^№31/, 1992; Сгайат & Ггехес, 1992). Недавно исследования на животных показали, что рекомбинантный аденовирус может быть использован для генной терапии (δΐΗΐίΓοΓύ^ΓΓΧΗΐιώ;! & Ρе^^^саийе!, 1991; δ!^аίΓο^й-Ρе^^^саийе! е! а1., 1990; Кюй е! а1., 1993). Исследования при введении рекомбинантного аденовируса в разные ткани включают инстилляцию трахеи (^кепКИ е! а1., 1991; ^кепКИ е! а1., 1992), мышечную инъекцию (Кадο! е! а1., 1993), периферические внутривенные инъекции (Нет/ & Сепий, 1993) и стереотактическую инокуляцию в головной мозг (Ье Са1 Ьа 8а11е е! а1., 1993).
Аденовирусные векторы могут происходить из человеческого аденовируса. Альтернативно, они могут происходить из аденовируса других видов, например шимпанзе, что может иметь преимущество, поскольку данные вирусные векторы не нейтрализуются антителами против человеческого аденовируса, циркулирующего в крови многих человеческих субъектов (см., например: Та!ык Ν. е! а1., Сепе Тйегару, 2006, 13: 421-429).
Аденовирус 35 типа, который является относительно редко встречающимся, и поэтому против самого этого вектора имеются низкие уровни предсуществующего иммунитета, использовали в качестве системы доставки в некоторых противотуберкулезных вакцинах, находящихся в стадии разработки (см. например, Ка^^ю е! а1., 1пГес1юп апй 1ттипйу, 2007, 75(8): 4105-4115). Аденовирус 35 типа также может быть особенно полезен в настоящем изобретении в качестве вектора для доставки.
2. Ретровирусы
Ретровирусы представляют собой группу вирусов, содержащих одноцепочечную РНК, характеризующихся способностью превращать свою РНК в двухцепочечную ДНК в инфицированных клетках посредством процесса обратной транскрипции (СοΓйη, 1990). Полученная ДНК затем стабильно интегрируется в клеточные хромосомы в виде провируса и направляет синтез вирусных белков. Интеграция приводит к сохранению последовательностей вирусных генов в реципиентной клетке и ее потомках. Ретровирусный геном содержит три гена: дад, рο1 и ему, которые кодируют капсидные белки, фермент полимера- 32 022203 зу и компоненты оболочки, соответственно. Последовательность, обнаруженная выше гена дад, содержит сигнал для упаковки генома в вирионы. На 5'- и 3'-концах вирусного генома имеются две последовательности длинных концевых повторов (ЬТК). Они содержат сильные промоторные и энхансерные последовательности и также необходимы для интеграции в геном клетки-хозяина (СоГПп. 1990).
Для того чтобы создать ретровирусный вектор, нуклеиновую кислоту, кодирующую одну или более представляющих интерес олигонуклеотидных или полинуклеотидных последовательностей, встраивают в вирусный геном в место расположения определенных вирусных последовательностей для получения вируса, дефектного по репликации. Для получения вирионов конструируют упаковывающую клеточную линию, содержащую гены дад, ро1 и епу, но не содержащую ЬТК и упаковывающие компоненты (Мапп е! а1., 1983). Когда в эту клеточную линию вводят (например, путем осаждения фосфатом кальция) рекомбинантную плазмиду, содержащую кДНК, вместе с ретровирусными ЬТК и упаковывающими последовательностями, упаковывающая последовательность способствует упаковке транскрипта РНК рекомбинантной плазмиды в вирусные частицы, которые затем секретируются в культуральную среду (№со1а8 & КнЬеп81е1п, 1988; Тетш, 1986; Мапп е! а1., 1983). Среды, содержащие рекомбинантные ретровирусы, затем собирают, возможно концентрируют и используют для переноса генов. Ретровирусные векторы способны инфицировать широкий спектр клеточных типов. Однако для интеграции и стабильной экспрессии необходимо деление клеток хозяина (Ра8кшД е! а1., 1975).
Недавно был разработан новый подход, который делает возможным специфическое прицеливание ретровирусных векторов, основанный на химической модификации ретровируса путем химического присоединения остатков лактозы к вирусной оболочке. Благодаря этой модификации смогли осуществить специфическое заражение гепатоцитов через сиалогликопротеиновые рецепторы.
Был применен другой подход для прицеливания рекомбинантных ретровирусов, в котором использовали биотинилированные антитела против ретровирусного оболочечного белка и против специфического клеточного рецептора. Антитела соединяли друг с другом через биотиновые компоненты путем использования стрептавидина (Коих е! а1., 1989). С использованием антител против антигенов класса I и класса II главного комплекса гистосовместимости они продемонстрировали, что имеет место инфекция различных человеческих клеток, несущих такие поверхностные антигены, экотропным вирусом ш νίΙΐΌ (Коих е! а1., 1989).
3. Аденоассоциированные вирусы (ААУ)
ААУ (КМдетау, 1988; Негтопа! & Мн/ус8ка, 1984) представляет собой парвовирус, открытый в виде контаминации аденовирусных штаммов. Он является повсеместно распространенным вирусом (антитела имеются у 85% человеческой популяции в США), связи которого с какой-либо болезнью не установлены. Кроме того, его классифицируют как депендовирус, поскольку его репликация зависит от присутствия хелперного вируса, такого как аденовирус. Были выделены пять серотипов, из которых лучше всего охарактеризован ААУ-2. ААУ имеет одноцепочечную линейную ДНК, которая заключена в капсидную оболочку с капсидными белками УР1, УР2 и УР3 с образованием икосаэдрического вириона с диаметром 20-24 нм (Ми/ус/ка & МсЬаидЬИп, 1988).
ДНК ААУ имеет длину приблизительно 4,7 тысяч оснований. Она содержит две открытые рамки считывания и фланкирована двумя 1ТК. В геноме ААУ имеются два основных гена: гер и сар. Ген гер кодирует белки, ответственные за вирусные репликации, тогда как сар кодирует капсидный белок УР1-3. Каждый 1ТК образует Т-образную шпилечную структуру. Эти концевые повторы являются единственными существенными цис-компонентами ААУ для интеграции в хромосомы. Поэтому ААУ может быть использован в качестве вектора со всеми вирусными кодирующими последовательностями, удаленными и замененными кассетой генов для доставки. Идентифицированы три вирусных промотора, и они обозначены как р5, р19 и р40, в соответствии с их положением на карте. Транскрипция с р5 и р19 приводит к продуцированию белков гер, а транскрипция с р40 приводит к продуцированию капсидных белков (Негтопа! & Ми/ус/ка, 1984).
Существует несколько факторов, которые побуждали исследователей к изучению возможности использования гААУ (рекомбинантного ААУ) в качестве экспрессирующего вектора. Один из них заключается в том, что необходимых условий для доставки гена для интеграции в хромосому хозяина удивительно мало. Необходимо иметь инвертированные повторы (1ТК) размером 145 п.н., что составляет только 6% генома ААУ. Это оставляет место в векторе для составления вставки ДНК длиной 4,5 т.н. Несмотря на то, что такая несущая емкость может препятствовать доставке больших генов с использованием ААУ, она в достаточной степени подходит для доставки антисмысловых конструкций.
Кроме того, ААУ представляет собой хороший выбор в качестве средств доставки ввиду своей безопасности. Существует относительно сложный механизм его высвобождения: для мобилизации гААУ требуются не только аденовирус дикого типа, но также гены ААУ. Более того, ААУ не является патогенным и не ассоциирован с каким-либо заболеванием. Удаление вирусных кодирующих последовательностей минимизирует иммунные ответы на экспрессию вирусных генов и, следовательно, гААУ не индуцирует воспалительный ответ.
4. Другие вирусные векторы в качестве экспрессирующих конструкций
Для доставки олигонуклеотидных или полинуклеотидных последовательностей в клетку-хозяина в
- 33 022203 качестве экспрессирующих конструкций в настоящем изобретении можно использовать другие вирусные векторы. Можно использовать векторы, происходящие из таких вирусов, как вирус оспы коров (Ктбдетеау, 1988; Соираг е! а1., 1988), лентивирусы, полиовирусы и герпесвирусы. Также можно ожидать, что будут использованы другие векторы, происходящие из поксвирусов, как, например, векторы на основе вируса оспы птиц. Они обладают некоторыми привлекательными свойствами для различных клеток млекопитающих (Рпебтаии, 1989; Юбдетау, 1988; СоирагеГ а1., 1988; НотеюЬ е! а1., 1990).
Благодаря недавнему открытию дефектных вирусов гепатита В было достигнуто новое понимание структурно-функциональной взаимосвязи разных вирусных последовательностей. Исследования ίη νίίΐΌ показали, что вирус может сохранять способность к хелпер-зависимой упаковке и обратной транскрипции, несмотря на удаление вплоть до 80% его генома (НогдасЬ е! а1., 1990). Это навело на мысль, что большие участки генома могут быть заменены чужеродным генетическим материалом. Г епатотропизм и персистенция (интеграция) являлись особенно привлекательными свойствами для печень-направленного переноса генов. СЬаид е! а1. (1991) ввели ген хлорамфениколацетилтрансферазы (САТ) в геном вируса гепатита В утки в место расположения последовательностей, кодирующих полимеразу, поверхностную и предповерхностную (рге-8иг£асе) кодирующие области. Осуществили его котрансфецию вместе с вирусом дикого типа в клеточную линию гепатомы птиц. Для инфицирования первичных утиных гепатоцитов использовали культуральные среды, содержащие высокие титры рекомбинантного вируса. Стабильную экспрессию гена САТ детектировали в течение по меньшей мере 24 суток после трансфекции (СЬаид е! а1., 1991).
Дополнительные вирусные векторы включают вирусоподобные частицы (УЪР) и фаги.
5. Невирусные векторы
Для того, чтобы осуществить экспрессию олигонуклеотидных или полинуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению, экспрессирующая конструкция должна быть доставлена в клетку. Эта доставка может быть осуществлена ш νίΙΐΌ, как в лабораторных методах трансформации клеточных линий, или 1и νί\Ό или ех νί\Ό, как при лечении некоторых болезненных состояний. Как описано выше, один из предпочтительных механизмов доставки осуществляется через вирусную инфекцию, когда экспрессирующая конструкция инкапсулируется в инфекционную вирусную частицу.
После доставки экспрессирующей конструкции в клетку нуклеиновая кислота, кодирующая желаемые олигонуклеотидные или полинуклеотидные последовательности, может располагаться и экспрессироваться в разных сайтах. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота, кодирующая такую конструкцию, может стабильно интегрироваться в геном клетки. Эта интеграция может осуществляться в специфическом положении и ориентации посредством гомологичной рекомбинации (замена генов), или она может интегрироваться в случайном, неспецифическом положении (генная аугментация). В следующих других воплощениях нуклеиновая кислота может стабильно поддерживаться в клетке в виде отдельного эписомного сегмента ДНК. Такие сегменты нуклеиновой кислоты или эписомы кодируют последовательности, достаточные для поддержания и репликации независимо от клеточного цикла хозяина или синхронизироанно с ним. То, каким образом экспрессирующая конструкция доставляется в клетку и где в клетке сохраняется нуклеиновая кислота, зависит от типа используемой экспрессирующей конструкции.
В некоторых воплощениях изобретения экспрессирующая конструкция, содержащая одну или более олигонуклеотидных или полинуклеотидных последовательностей, может просто состоять из голой рекомбинантной ДНК или плазмиды. Перенос такой конструкции может быть осуществлен, например, любым способом, который физически или химически увеличивает проницаемость клеточной мембраны. Это особенно применимо для переноса ш νίΙΐΌ, но также может быть использовано для применения ш νί\Ό. ИиЬеи8ку е! а1. (1984) успешно инъецировали полиомавирусную ДНК в форме кальций-фосфатных преципитатов в печень и селезёнку взрослых и новорожденных мышей, продемонстрировав активную вирусную репликацию и острую инфекцию. ВенуегщК и Ке8Ье£ (1986) также продемонстрировали, что прямая внутрибрюшинная инъекция осажденных фосфатом кальция плазмид приводит к экспрессии трансфицированных генов. Рассматривается возможность того, что ДНК, кодирующая представляющий интерес ген, также может быть перенесена аналогичным образом ш νί\Ό и может экспрессировать генный продукт.
Другое воплощение изобретения, касающееся переноса в клетки экспрессирующей конструкции, представляющей собой голую ДНК, может включать бомбардировку частицами. Этот способ зависит от способности ускорять ДНК-покрытые бомбардирующие микрочастицы до высокой скорости, позволяющей им проходить через клеточные мембраны и проникать в клетки, не вызывая их гибели (К1еш е! а1., 1987). Разработано несколько устройств для ускорения небольших частиц. В основе одного такого устройства лежит высоковольтный разряд с целью генерирования электрического тока, что в свою очередь обеспечивает движущую силу (Уаи§ е! а1., 1990). Используемые микрочастицы состоят из биологически инертных веществ, таких как вольфрамовые или золотые гранулы.
Выбранные органы, включая печень, кожу и мышечную ткань крыс и мышей, подвергали бомбардировке ш νί\Ό (Уаи§ е! а1., 1990; 2е1ети е! а1., 1991). Для этого может потребоваться хирургическое воздействие на ткань или клетки с целью исключения любой мешающей ткани, находящейся между пушкой
- 34 022203 и органом-мишенью, то есть, обработка ех νί\Ό. И снова, ДНК, кодирующая конкретный ген, может быть доставлена с помощью этого способа и кроме того может быть встроена.
В качестве способа доставки также можно использовать бактерии (например, листерии, см. \УО 2004/11048) и, в особенности, БЦЖ.
Полипептидные композиции
В других аспектах согласно настоящему изобретению предложены полипептидные композиции.
Как правило, полипептид по изобретению будет представлять собой выделенный полипептид (то есть отделенный от тех компонентов, вместе с которыми его обычно можно обнаружить в природе).
Например, природный белок является выделенным, если он отделен от некоторых или всех сопутствующих веществ в природной системе. Предпочтительно, такие полипептиды являются чистыми по меньшей мере примерно на 90%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно на 99%. Полинуклеотид считается выделенным, если, например, он клонирован в вектор, не являющийся частью природного окружения.
Полипептиды могут быть получены с использованием любого из множества хорошо известных методов. Рекомбинантные полипептиды, кодируемые последовательностями ДНК, которые описаны выше, можно легко получить из последовательностей ДНК с использованием любого из различных экспрессирующих векторов, известных средним специалистам в данной области. Можно добиться экспрессии в любой подходящей клетке хозяина, которая трансформирована или трансфицирована экспрессирующим вектором, содержащим молекулу ДНК, которая кодирует рекомбинантный полипептид. Подходящие клетки хозяина включают прокариоты, дрожжи и клетки высших эукариот, такие как клетки млекопитающих и клетки растений. Предпочтительно, используемыми клетками хозяина являются Е. соП, дрожжи или линия клеток млекопитающих, такая как СОЗ (клетки африканской зеленой мартышки) или СНО (клетки яичников китайского хомячка). Супернатанты из подходящих систем хозяин/вектор, секретирующих рекомбинантный белок или полипептид в культуральную среду, сначала могут быть сконцентрированы с использованием имеющегося в продаже фильтра. После концентрирования концентрат может быть нанесен на подходящий матрикс для очистки, такой как аффинный матрикс или ионообменная смола. Наконец, для дальнейшей очистки рекомбинантного полипептида может быть использована одна или более чем одна стадия обращенно-фазовой ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография).
Полипептиды по изобретению, их иммуногенные фрагменты и другие варианты, имеющие меньше чем примерно 100 аминокислот и обычно меньше чем примерно 50 аминокислот, могут быть также получены способами синтеза с использованием методов, хорошо известных средним специалистам в данной области техники. Например, такие полипептиды могут быть синтезированы с использованием любого из коммерчески доступных твердофазных методов, таких как метод твердофазного синтеза по Меррифильду, в котором аминокислоты последовательно добавляют к растущей аминокислотной цепи. См. Метйе1б, 1. Ат. СНет. Зос. 85: 2149-2154 (1963). Оборудование для автоматизированного синтеза полипептидов имеется в продаже у таких поставщиков, как Регкш Е1тет/Аррйеб ВюЗук)етк ОМкюп (Рок)ег СПу, СА), и на нем можно работать в соответствии с инструкциями производителя.
В некоторых конкретных воплощениях полипептид может представлять собой слитый белок, который содержит множество полипептидов как описано здесь, или который содержит по меньшей мере один полипептид как описано здесь и неродственную последовательность, примеры таких белков включают белки возбудителей столбняка, туберкулеза и гепатита (см., например, З)ои)е е) а1., Ие\у Епд1. 1. Меб, 336: 86-91 (1997)). Партнер слияния может, например, содействовать обеспечению Т-хелперных эпитопов (иммунологический партнер слияния), предпочтительно Т-хелперных эпитопов, распознаваемых людьми, или может содействовать экспрессии белка (усилитель экспрессии) с более высокими выходами, чем у нативного рекомбинантного белка. Некоторые предпочтительные партнеры слияния являются и иммунологическими, и усиливающими экспрессию партнерами слияния. Другие партнеры слияния могут быть выбраны так, чтобы увеличивать растворимость белка или позволять белку достигать желаемых внутриклеточных компартментов. Другие партнеры слияния включают аффинные метки, которые облегчают очистку белка.
Слитые белки в общем случае могут быть получены с использованием стандартных методов, включая химическое конъюгирование. Предпочтительно, слитый белок экспрессируется в виде рекомбинантного белка, позволяя осуществлять продуцирование с повышенными уровнями относительно неслитого белка в экспрессирующей системе. Коротко, последовательности ДНК, кодирующие полипептидные компоненты, могут быть собраны по отдельности и лигированы в соответствующий экспрессирующий вектор. 3'-конец последовательности ДНК, кодирующей один полипептидный компонент, лигируют, с пептидным линкером или без него, с 5'-концом последовательности ДНК, кодирующей второй полипептидный компонент, таким образом, чтобы рамки считывания последовательностей находятся в фазе. Это позволяет осуществлять трансляцию в виде единого слитого белка, который сохраняет биологическую активность обоих полипептидных компонентов.
Пептидную линкерную последовательность можно использовать для отделения первого и второго полипептидных компонентов расстоянием, достаточным для того, чтобы обеспечить то, что каждый полипептид будет сворачиваться в свою вторичную и третичную структуры. Такую пептидную линкерную
- 35 022203 последовательность встраивают в слитый белок, используя стандартные методы, хорошо известные в данной области. Подходящие пептидные линкерные последовательности могут быть выбраны на основании следующих факторов: (1) их способности принимать гибкую вытянутую конформацию; (2) их неспособности принимать вторичную структуру, которая могла бы взаимодействовать с функциональными эпитопами на первом и втором полипептидах; и (3) отсутствия гидрофобных или заряженных остатков, которые могли бы взаимодействовать с полипептидными функциональными эпитопами. Предпочтительные пептидные линкерные последовательности содержат остатки С1у, Аки и §ет. Другие почти нейтральные аминокислоты, такие как ТНг и А1а, также могут быть использованы в линкерной последовательности. Аминокислотные последовательности, которые можно успешно использовать в качестве линкеров, включают последовательности, раскрытые в Мата1еа е1 а1., Сепе, 40: 39-46 (1985); МигрНу е1 а1, Ргос. №11. Асаб. δα. И8А, 83: 8258-8262 (1986); патенте США № 4935233 и патенте США № 4751180. Линкерная последовательность обычно может иметь длину от 1 до примерно 50 аминокислот. Линкерные последовательности не требуются, когда первый и второй полипептиды имеют несущественные Ν-концевые аминокислотные участки, которые могут быть использованы для отделения функциональных доменов и предупреждения пространственной интерференции.
В предпочтительных воплощениях иммунологический партнер слияния происходит из белка Ό, поверхностного белка грамотрицательной бактерии НаеторНЛик тЛиег^а В (\УО 91/18926). Предпочтительно, когда производное белка Ό содержит приблизительно первую треть белка (например, первые Νконцевые 100-110 аминокислот), и производное белка Ό может быть липидизировано. В некоторых предпочтительных воплощениях первые 109 остатков партнера слияния липопротеина Ό включены на Νконце для получения полипептида с дополнительными экзогенными Т-клеточными эпитопами и для увеличения уровня экспрессии в Е. соН (таким образом, функционируя как усилитель экспрессии). Липидный хвост обеспечивает оптимальное представление антигена антигенпредставляющим клеткам. Другие партнеры слияния включают неструктурный белок из вируса гриппа: Νδ1 (гемагглютинин). Обычно используют 81 Ν-концевую аминокислоту, хотя можно использовать разные фрагменты, которые включают Т-хелперные эпитопы.
В другом воплощении иммунологическим партнером слияния является белок, известный как ЬУТА, или его участок (предпочтительно С-концевой участок). ЬУТА происходит из 51гер1ососсик рпеитошае, который синтезирует Ν-ацетил-Ь-аланин-амидазу, известную как амидаза ЬУТА (кодируемую геном Ьу1А; Сепе, 43: 265-292 (1986)). ЬУТА представляет собой аутолизин, который специфически расщепляет определенные связи в пептидогликановом остове. С-концевой домен белка ЬУТА отвечает за сродство к холину или некоторым аналогам холина, таким как ΌΕΛΕ (диэтиламиноэтил). Это свойство использовали для разработки Е. соН С-ЬУТА-экспрессирующих плазмид, полезных для экспрессии слитых белков. Описана очистка гибридных белков, содержащих фрагмент С-ЬУТА на аминоконце (см. Вю1есНпо1оду, 10: 795-798 (1992)). В предпочтительном воплощении повторяющийся участок ЬУТА может быть встроен в слитый белок. Повторяющийся участок обнаружен в С-концевой области, начиная с остатка 178. Особенно предпочтительный повторяющийся участок включает в себя остатки 188-305.
Т-клетки
Иммунотерапевтические композиции могут также, или альтернативно, содержать Т-клетки, специфичные к антигену МусоЬас1егнпп. Такие клетки обычно могут быть получены ш νίΙΐΌ или ех νί\Ό с использованием стандартных процедур. Например, Т-клетки можно выделить из спинного мозга, периферической крови или фракции спинного мозга или периферической крови пациента, используя имеющуюся в продаже систему для разделения клеток, такую как система 1ко1ех™, доступная от №хе11 ТНегареиНск, 1пс. Дгапе, СА; см. также патент США № 5240856; патент США № 5215926; \УО 89/06280; \УО 91/16116 и \УО 92/07243). Альтернативно, Т-клетки могут быть получены от родственников или не родственников, от млекопитающих, не являющихся людьми, из клеточных линий или культур.
Т-клетки могут быть стимулированы полипептидом по изобретению, полинуклеотидом, кодирующим такой полипептид, и/или антигенпрезентирующей клеткой (АРС), которая экспрессирует такой полипептид. Такую стимуляцию проводят в условиях и в течение времени, достаточных для того, чтобы обеспечить продукцию Т-клеток, специфичных к полипептиду. Предпочтительно полипептид или полинуклеотид присутствует в средстве для доставки, таком как микросфера, для облегчения продуцирования специфических Т-клеток.
Т-клетки считаются специфичными к полипептиду по изобретению, если эти Т-клетки специфически пролиферируют, секретируют цитокины или уничтожают клетки-мишени, покрытые полипептидом или экспрессирующие ген, кодирующий полипептид. Т-клеточную специфичность можно оценить, используя любую из множества стандартных методов. Например, в анализе с высвобождением хрома или анализе пролиферации увеличение индекса стимуляции более чем в два раза в лизисе и/или пролиферации по сравнению с отрицательными контролями указывает на Т-клеточную специфичность. Такие анализы могут быть проведены, например, как описано в СНеп е1 а1., Сапсег Кек., 54: 1065-1070 (1994). Альтернативно, определение пролиферации Т-клеток может быть выполнено с помощью различных известных методов. Например, Т-клеточную пролиферацию можно определить путем измерения возрастающей скорости синтеза ДНК (например, с применением импульсно меченых культур Т-клеток с использовани- 36 022203 ем меченного тритием тимидина и измерения количества меченного тритием тимидина, включенного в ДНК). Контакт с полипептидом по изобретению (100 нг/мл -100 мкг/мл, предпочтительно 200 нг/мл - 25 мкг/мл) в течение 3-7 суток должен приводить по меньшей мере к двукратному увеличению пролиферации Т-клеток. Описанный выше контакт в течение 2-3 ч должен приводить к активации Т-клеток, как измерено с использованием стандартных цитокиновых анализов, в которых двукратное увеличение в уровне высвобождения цитокина (например, ΤΝΡ или ΙΡΝ-γ) является индикатором Т-клеточной активации (см. СоНдаи е! а1., Сиггеп! Рго!осо1к ш Iттипо1о§у, \ό1. 1 (1998)). Т-клетки, которые были активированы в ответ на полипептид, полинуклеотид или полипептид-экспрессирующие АРС, могут представлять собой ί'Ό4+ и/или СЭ8+. Белок-специфические Т-клетки могут быть размножены с использованием стандартных методов. В предпочтительных воплощениях Т-клетки получают от пациента, донорародственника или донора, не являющегося родственником, и их вводят пациенту после стимуляции и размножения.
Для терапевтических целей ί'Ό4+ или СЭ8+ Т-клетки, которые пролиферируют в ответ на полипептид, полинуклеотид или АРС, могут быть количественно размножены или ш \'Пго, или ш νί\Ό. Пролиферацию таких Т-клеток ш \'Пго можно осуществить различными способами. Например, Т-клетки могут быть повторно экспонированы полипептиду или короткому пептиду, соответствующему иммуногенному участку такого полипептида, с добавлением или без добавления Т-клеточных ростовых факторов, таких как интерлейкин-2, и/или стимуляторными клетками, которые синтезируют полипептид. Альтернативно, одна или более Т-клеток, которые пролиферируют в присутствии белка, могут быть количественно размножены путем клонирования. Способы клонирования клеток хорошо известны в данной области и включают серийное разведение.
Фармацевтические композиции
В дополнительных воплощениях полинуклеотидные, полипептидные, Т-клеточные композиции и/или композиции антител, раскрытые здесь, будут изготовлены в фармацевтически приемлемых или физиологически приемлемых растворах для введения в клетку или животному либо отдельно, либо в комбинации с одним или более чем одним другим способом терапии.
Также следует понимать, что при желании сегмент нуклеиновой кислоты (например, РНК или ДНК), экспрессирующий полипептид как раскрыто здесь, можно вводить также в комбинации с другими агентами, такими как, например, другие белки или полипептиды или различные фармацевтически активные агенты, включая химиотерапевтические агенты, эффективные против инфекции, вызываемой М. !иЬетси1ок1к. На самом деле, фактически нет никакого ограничения в отношении других компонентов, которые также могут быть включены, при условии, что дополнительные агенты не вызывают значительного неблагоприятного эффекта при контакте с клетками-мишенями или тканями хозяина. Таким образом, композиции могут быть доставлены вместе с различными другими агентами, как необходимо в конкретном случае. Такие композиции могут быть очищены из клеток хозяина или других биологических источников либо, альтернативно, могут быть химически синтезированы, как изложено здесь. Более того, такие композиции могут также включать композиции замещенных РНК или ДНК или их производных.
Технология приготовления фармацевтически приемлемых эксципиентов и растворов-носителей хорошо известна специалистам в данной области техники, поскольку относится к разработке подходящих режимов дозирования и схем лечения для применения конкретных композиций, раскрытых здесь, в ряде схем лечения, включая, например, пероральное, парентеральное, внутривенное, интраназальное и внутримышечное введение, и в изготовлении препаратов. Другие пути введения включают введение через поверхности слизистых.
Обычно с помощью композиций, содержащих терапевтически эффективное количество, доставляют от примерно 0,1 до примерно 1000 мкг полипептида за одно введение, в более типичных случаях от примерно 2,5 до примерно 100 мкг полипептида за одно введение. Что касается полинуклеотидных композиций, то обычно доставляют от примерно 10 мкг до примерно 20 мг полинуклеотида по изобретению за одно введение, в более типичных случаях примерно от 0,1 до примерно 10 мг полинуклеотида по изобретению за одно введение.
Естественно, количество активного(ых) соединения(й) в каждой терапевтически полезной композиции, которая может быть изготовлена, делают таким, чтобы в любой указанной стандартной дозе соединения получить подходящую дозировку. Такие факторы, как растворимость, биодоступность, биологический период полувыведения, путь введения, срок годности продукта, а также другие фармакологические полезные свойства, будут подразумеваться специалистом в области изготовления таких фармацевтических композиций, и, по существу, могут быть желательными различные дозировки и схемы лечения.
1. Пероральная доставка
В некоторых применениях фармацевтические композиции, раскрытые здесь, могут быть доставлены посредством перорального введения животному. По существу, эти композиции могут быть изготовлены с использованием инертного разбавителя или с использованием усваиваемого пищевого носителя, или они могут быть помещены в желатиновую капсулу с твердой или мягкой оболочкой, или они могут быть спрессованы в таблетки, или они могут быть введены непосредственно с пищей рациона.
Активные соединения могут быть даже объединены с эксципиентами и использованы в форме про- 37 022203 глатываемых таблеток, трансбуккальных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и тому подобного (Μ;·ι11ιίο\νίΙζ е! а1., 1997; Н\\апд е! а1., 1998; патент США 5641515; патент США 5580579 и патент США 5792451, каждый из которых конкретно включен в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки). Таблетки, пастилки, пилюли, капсулы и тому подобное могут также содержать следующее: связующее вещество, такое как трагакантовая камедь, аравийская камедь, кукурузный крахмал или желатин; эксципиенты, такие как дикальцийфосфат; разрыхлитель, такой как кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота и тому подобное; смазывающее вещество, такое как стеарат магния; и может быть добавлен подсластитель, такой как сахароза, лактоза или сахарин, или корригент, как, например, перечная мята, масло гаультерии или вишневый корригент. Когда стандартная лекарственная форма представляет собой капсулу, тогда она может содержать, в дополнение к веществам вышеприведенного типа, жидкий носитель. Различные другие вещества могут присутствовать в качестве покрытий или каким-либо иным образом модифицировать физическую форму лекарственной единицы. Например, таблетки, пилюли или капсулы могут быть покрыты шеллаком, сахаром или и тем и другим. Сироп эликсира может содержать активное соединение, сахарозу в качестве подсластителя, метил- и пропилпарабены в качестве консервантов, краситель и корригент, как например, вишневый или апельсиновый корригент. Конечно, любое вещество, используемое в изготовлении любой стандартной лекарственной формы, должно быть фармацевтически чистым и, по существу, нетоксичным в используемых количествах. Кроме того, активные компоненты могут быть включены в препарат и композиции с непрерывным высвобождением.
Для перорального введения композиции по настоящему изобретению могут быть альтернативно введены с одним или более эксципиентами в форме жидкости для полоскания рта, средства для чистки зубов, трансбуккальных таблеток, перорального спрея или сублингвальной, вводимой в ротовую полость композиции. Например, жидкость для полоскания рта может быть приготовлена путем введения активного ингредиента в необходимом количестве в соответствующий растворитель, такой как раствор бората натрия (раствор Добелла). Альтернативно, активный ингредиент может быть включен в пероральный раствор, такой как раствор, содержащий борат натрия, глицерин и бикарбонат калия, или диспергирован в средстве для чистки зубов, или добавлен в терапевтически эффективном количестве к композиции, которая может содержать воду, связующие вещества, абразивные вещества, корригенты, пенообразователи и увлажнители. Альтернативно, композиции могут быть изготовлены в форме таблетки или раствора, которые можно поместить под язык или каким-либо иным образом растворить во рту.
2. Доставка путем инъекции
В некоторых случаях будет желательно доставлять фармацевтические композиции, раскрытые здесь, парентерально, внутривенно, внутримышечно, интрадермально или даже интраперитонеально, как описано в патенте США 5543158, патенте США 5641515 и патенте США 5399363 (каждый из которых конкретно включен здесь во всей своей полноте посредством ссылки). Растворы активных соединений в виде свободного основания или фармакологически приемлемых солей могут быть приготовлены в воде, смешанной соответственно с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Также могут быть приготовлены дисперсии в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях и в маслах. В обычных условиях хранения и применения эти композиции содержат консервант для предупреждения роста микроорганизмов.
Фармацевтические формы, подходящие для применения путем инъекции, включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий (патент США 5466468, конкретно включенный здесь во всей своей полноте посредством ссылки). Во всех случаях форма должна быть стерильной и должна быть жидкой в такой степени, чтобы ее можно было легко вводить с помощью шприца. Она должна быть стабильной в условиях изготовления и хранения и должна быть защищена от контаминирующего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и тому подобное), подходящие их смеси и/или растительные масла. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путём применения покрытия, такого как лецитин, путём поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсии и путём применения поверхностно-активных веществ. Предотвращение воздействия микроорганизмов можно облегчить путём использования различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимеросала и тому подобного. Во многих случаях предпочтительным будет включение изотонических агентов, например сахаров или хлорида натрия. Пролонгированное всасывание инъекционных композиций можно осуществить путём применения в композициях агентов, замедляющих всасывание, например моностеарата алюминия и желатина.
Для парентерального введения в водном растворе, например, раствор должен быть, при необходимости, соответствующим образом забуферен, и жидкий разбавитель должен быть сначала приготовлен изотоническим с использованием достаточного количества физиологического раствора или глюкозы. Такие специфические водные растворы особенно подходят для внутривенного, внутримышечного, подкожного и интраперитонеального введения. В связи с этим, в свете настоящего описания, специалистам в
- 38 022203 данной области техники будет известна стерильная водная среда, которая может быть использована. Например, одну дозировку можно растворить в 1 мл изотонического раствора ЫаС1 и либо добавить к 1000 мл жидкости для введения в подкожную клетчатку, либо инъецировать в предполагаемое место инфузии (см., например, КепипдЮп'к РЬагтасеиИса1 8с1епсек, 15-е издание, рр. 1035-1038 и 1570-1580). Обязательно будет иметь место некоторая вариация в дозировке в зависимости от состояния подвергаемого лечению субъекта. Лицо, ответственное за введение, в любом случае будет определять соответствующую дозу для индивидуального субъекта. Более того, для введения человеку препараты должны удовлетворять стандартам стерильности, пирогенности и общей безопасности и чистоты, согласно требованиям ΡΌΑ (Управление по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных препаратов) на основании стандартов для биопрепаратов.
Стерильные инъекционные растворы готовят путем введения активных соединений в необходимом количестве в соответствующий растворитель с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, при необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием. Обычно дисперсии готовят путем введения различных стерилизованных активных ингредиентов в стерильный наполнитель, содержащий основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из тех, которые перечислены выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами изготовления являются методы вакуумной сушки и лиофилизации, с помощью которых получают порошок активного ингредиента и любого дополнительного желаемого ингредиента из их предварительно стерильно отфильтрованного раствора.
Композиции, раскрытые здесь, могут быть изготовлены в нейтральной или солевой форме. Фармацевтически приемлемые соли включают соли присоединения кислоты (образованные со свободными аминогруппами белка) и которые образованы с неорганическими кислотами, такими как, например, соляная или фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и тому подобное. Кроме того, соли, образованные свободными карбоксильными группами, могут происходить из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и тому подобное. После приготовления растворы будут введены способом, совместимым с лекарственной формой, и в таком количестве, которое является терапевтически эффективным. Композиции легко вводят в разнообразных лекарственных формах, таких как инъекционные растворы, капсулы с высвобождением лекарственного средства и тому подобное.
Термин носитель, как он использован здесь, включает каждый и все растворители, дисперсионные среды, наполнители, покрытия, разбавители, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие всасывание агенты, буферы, растворы-носители, суспензии, коллоиды и тому подобное. Применение таких сред и агентов для фармацевтических активных веществ хорошо известно в данной области техники. За исключением случаев, когда любая традиционная среда или агент не совместимы с активным ингредиентом, их применение в терапевтических композициях предполагается. В композиции также могут быть включены дополнительные активные ингредиенты.
Фраза фармацевтически приемлемый относится к молекулярным структурам и композициям, которые не дают аллергической или подобной неблагоприятной реакции при введении человеку. Изготовление водной композиции, содержащей белок в качестве активного ингредиента, хорошо известно в данной области. Обычно такие композиции изготавливают в виде инъецируемых форм, либо в виде жидких растворов, либо в виде суспензий; также могут быть изготовлены твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией. Композиция также может быть эмульгирована.
3. Назальная и трансбуккальная доставка
В некоторых воплощениях фармацевтические композиции можно доставлять посредством интраназальных спреев, трансбуккальных спреев, ингаляции и/или других приспособлений для доставки аэрозолей. Способы доставки генов, нуклеиновых кислот и пептидных композиций непосредственно в легкие, например, посредством назальных и трансбуккальных аэрозольных спреев, описаны, например, в патенте США 5756353 и патенте США 5804212 (каждый из которых конкретно включен здесь во всей своей полноте посредством ссылки). Кроме того, в области фармацевтики также хорошо известна доставка лекарственных средств с использованием интраназальных смол в виде микрочастиц (Такепада е! а1., 1998) и лизофосфатидил-глицериновых соединений (патент США 5725871, конкретно включенный здесь во всей своей полноте посредством ссылки). Кроме того, трансмукозальная доставка лекарственного средства в форме основного вещества с носителем из политетрафторэтилена описана в патенте США 5780045 (конкретно включенном здесь во всей своей полноте посредством ссылки).
4. Доставка, опосредованная липосомами, нанокапсулами и микрочастицами
В некоторых воплощениях авторы изобретения предполагают применение липосом, нанокапсул, микрочастиц, микросфер, липидных частиц, везикул и тому подобного для введения композиций по настоящему изобретению в подходящие клетки хозяина. В частности, композиции по настоящему изобретению могут быть изготовлены для доставки инкапсулированными либо в липидную частицу, либо липосому, либо везикулу, либо наносферу, либо наночастицу или тому подобное.
- 39 022203
Такие композиции могут быть предпочтительны для введения фармацевтически приемлемых композиций нуклеиновых кислот или конструкций, раскрытых здесь. Образование и использование липосом обычно известно специалистам в данной области техники (см. например, Соиугеиг е! а1., 1977; Соиугеиг, 1988; Ьа81с, 1998; где описано применение липосом и нанокапсул в направленной антибиотикотерапии внутриклеточных бактериальных инфекций и заболеваний). Недавно были разработаны липосомы с улучшенными стабильностью в сыворотке и периодами полувыведения из кровотока (СаЫ/оп и РараНаб|орои1о8. 1988; А11еп и СНоип, 1987; патент США 5741516, конкретно включенный здесь во всей своей полноте посредством ссылки). Кроме того, представлены обзоры различных способов изготовления липосомных и липосомоподобных композиций в качестве потенциальных лекарственных носителей (Такакига, 1998; СНапбгап е! а1., 1997; МатдаН!, 1995; патент США 5567434; патент США 5552157; патент США 5565213; патент США 5738868 и патент США 5795587, каждый из которых конкретно включен здесь во всей своей полноте посредством ссылки).
Липосомы были успешно использованы с различными типами клеток, которые в норме резистентны к трансфекции другими методами, включая Т-клеточные суспензии, первичные культуры гепатоцитов и клетки РС 12 (Кеппе18еп е! а1., 1990; Ми11ег е! а1., 1990). Кроме того, липосомы не имеют ограничений по длине ДНК, которые обычны для систем доставки на основе вирусов. Липосомы были эффективно использованы для введения генов, лекарственных средств (Неа!Н и МатНп, 1986; Неа!Н е! а1., 1986; Ва1а/8о\л18 е! а1., 1989; Рте8!а и Рид1181, 1996), радиотерапевтических агентов (Р1ки1 е! а1., 1987), ферментов (Пши/ипи е! а1., 1990а; Пши/ипи е! а1., 1990Ь), вирусов (Ра11ет и ВаШтоте, 1984), транскрипционных факторов и аллостерических эффекторов (№со1аи и Оег8опбе, 1979) в различные культивируемые клеточные линии и животных. Кроме того, завершено несколько успешных клинических испытаний, в которых исследована эффективность опосредованной липосомами лекарственной доставки (Ъоре/-Веге81ет е! а1., 1985а; 1985Ь; Соипе, 1988; ЗсиНет е! а1., 1988). Кроме того, некоторыми исследованиями доказано, что применение липосом не ассоциировано с аутоиммунными ответами, токсичностью или гонадной локализацией, как после системной доставки (Моп и Рика!8и, 1992).
Липосомы образуются из фосфолипидов, которые диспергируются в водной среде и самопроизвольно образуют мультиламеллярные концентрические бислойные везикулы (также названные мультиламеллярными везикулами (МЬУ)). Обычно МЬУ имеют диаметры от 25 нм до 4 мкм. Обработка МЬУ ультразвуком приводит к образованию небольших униламеллярных везикул (ЗИУ) с диаметрами в диапазоне 200-500 А, содержащих водный раствор в сердцевине.
Липосомы имеют сходство с клеточными мембранами и предложены для применения согласно настоящему изобретению в качестве носителей для пептидных композиций. Они подходят для широкого применения, поскольку могут захватывать вещества, растворимые как в воде, так и в липидах, то есть в водных пространствах и внутри самого бислоя соответственно. Существует возможность использования липосом, несущих лекарственное средство, даже для сайт-специфической доставки активных агентов посредством селективной модификации липосомной композиции.
В дополнение к учению Соиугеиг е! а1. (1977; 1988) для получения липосомных композиций может быть использована следующая информация. При диспергировании в воде фосфолипиды могут образовывать ряд структур, отличающихся от липосом, в зависимости от молярного соотношения липида и воды. При низких соотношениях предпочтительной структурой является липосома. Физические характеристики липосом зависят от рН, ионной силы и присутствия двухвалентных катионов. Липосомы могут демонстрировать низкую проницаемость в отношении ионных и полярных веществ, но при повышенных температурах подвергаются фазовому переходу, который заметно изменяет их проницаемость. Фазовый переход включает изменение от плотно упакованной, упорядоченной структуры, известной как состояние геля, до слабо упакованной, менее упорядоченной структуры, известной как жидкое состояние. Это происходит при характеристической температуре фазового перехода и приводит к увеличению проницаемости в отношении ионов, сахаров и лекарственных средств.
Помимо температуры, экспозиция с белками может изменять проницаемость липосом. Некоторые растворимые белки, такие как цитохром с, связываются с двойным слоем, деформируют его и проникают через него, вызывая при этом изменения в проницаемости. Холестерин ингибирует это проникновение белков, очевидно посредством более плотной упаковки фосфолипидов. Считается, что наиболее полезные липосомные композиции для доставки антибиотиков и ингибиторов будут содержать холестерин.
Способность захватывать растворенные вещества варьирует у разных типов липосом. Например, МЬУ умеренно эффективны в отношении захвата растворенных веществ, а ЗИУ в высшей степени неэффективны. ЗИУ дают преимущество в гомогенности и воспроизводимости в распределении по размерам, однако, компромисс между размером и эффективностью захвата обеспечивается при использовании больших униламеллярных везикул (ШУ). Их получают путём упаривания из эфира, и они в три-четыре раза более эффективны в отношении захвата растворенных веществ по сравнению с МЬУ.
В дополнение к липосомным характеристикам важной детерминантой в захвате соединений являются физико-химические свойства самого соединения. Полярные соединения захватываются в водных пространствах, а неполярные соединения связываются с липидным бислоем везикулы. Полярные соединения высвобождаются путем проникновения или при разрушении бислоя, а неполярные соединения
- 40 022203 остаются соединенными с бислоем, пока он не разрушится под действием температуры или экспозиции с липопротеинами. Оба типа демонстрируют максимальные скорости истечения при температуре фазового перехода.
Липосомы взаимодействуют с клетками посредством четырех разных механизмов: эндоцитоза фагоцитарными клетками ретикулоэндотелиальной системы, такими как макрофаги и нейтрофилы; адсорбции на клеточной поверхности либо под действием неспецифических слабых гидрофобных или электростатических сил, либо путем специфических взаимодействий с компонентами клеточной поверхности; слияния с плазматической клеточной мембраной путем вставки липидного бислоя липосомы в плазматическую мембрану с одновременным высвобождением содержимого липосомы в цитоплазму; и путем переноса липосомных липидов в клеточные или субклеточные мембраны или наоборот без какой-либо ассоциации с содержимым липосом. Часто бывает трудно определить, какой механизм действует, и в одно и то же время может действовать более чем один механизм.
Судьба и место размещения внутривенно инъецируемых липосом зависит от их физических свойств, таких как размер, текучесть и поверхностный заряд. Они могут персистировать в тканях в течение часов или суток в зависимости от своего состава, а полупериоды существования в крови изменяются в диапазоне от минут до нескольких часов. Более крупные липосомы, такие как МЬУ и ЬИУ, быстро захватываются фагоцитарными клетками ретикулоэндотелиальной системы, однако физиология системы кровообращения ограничивает выход таких больших разновидностей в большинство мест. Они могут выйти только в местах, где имеются большие отверстия или поры в эндотелии капилляров, таких как синусоидные капилляры печени или селезёнки. Поэтому эти органы являются предпочтительным местом захвата. С другой стороны, §ИУ демонстрируют более широкое распределение в тканях, но накапливаются все же в высокой степени в печени и селезёнке. Обычно такое поведение ίη νί\Ό ограничивает возможную направленную доставку липосом только теми органами и тканями, которые доступны для их большого размера. Они включают кровь, печень, селезёнку, спинной мозг и лимфоидные органы.
Вообще, направленная доставка не является ограничением в контексте настоящего изобретения. Однако при необходимости специфической направленной доставки должны быть выполнены способы, доступные для этой цели. Можно использовать антитела для связывания с поверхностью липосомы и для направления антитела и её лекарственных составляющих к специфическим антигенным рецепторам, расположенным на поверхности конкретного клеточного типа. Также можно использовать углеводные детерминанты (гликопротеиновые или гликолипидные компоненты клеточной поверхности, которые играют роль в межклеточном распознавании, взаимодействии и адгезии) в качестве сайтов узнавания, поскольку они обладают способностью направлять липосомы к конкретным типам клеток. В основном подразумевают, что будет использоваться внутривенная инъекция липосомных композиций, однако другие пути введения также возможны.
Альтернативно, согласно изобретению предложены фармацевтически приемлемые нанокапсулярные препараты композиций по настоящему изобретению. Обычно нанокапсулы могут захватывать соединения стабильным и воспроизводимым образом (Непгу-М1сйе11апй е! а1., 1987; ОшШапаг-Сиеггего е! а1., 1998; Иоид1а8 е! а1., 1987). Во избежание побочных эффектов, обусловленных внутриклеточной полимерной перегрузкой, необходимо конструировать такие ультрамелкие частицы (размером около 0,1 мкм) с использованием полимеров, способных разлагаться ίη νί\Ό. Предполагается, что биоразлагаемые полиалкил-цианоакрилатные наночастицы, которые удовлетворяют этим требованиям, подходят для применения в настоящем изобретении. Такие частицы могут быть легко изготовлены, как описано (Соиугеиг е! а1., 1980; 1988; ζιιγ МиЫеп е! а1., 1998; 2атЬаих е! а1. 1998; Рт!о-А1рЬап±у е! а1., 1995; и патент США 5145684, конкретно включенные здесь во всей своей полноте посредством ссылки).
Для чрескожной доставки также могут быть использованы трансдермальные пластыри. Иммуногенные композиции
В некоторых предпочтительных воплощениях настоящего изобретения предложены иммуногенные композиции. Обычно иммуногенные композиции будут содержать один или более полипептидов или полинуклеотидов, таких как описаны выше, в комбинации с иммуностимулятором. Иммуностимулятор может представлять собой любое вещество, которое усиливает или потенцирует иммунный ответ (антительный и/или клеточно-опосредованный) на экзогенный антиген. Примеры иммуностимуляторов включают адъюванты, биоразлагаемые микросферы (например, галактид полимера молочной кислоты) и липосомы (в которые включено соединение; см., например, Ρи11е^ιоη. патент США № 4235877).
Изготовление иммуногенных композиций в целом описано, например, в Ро\уе11 & №\утап, еЙ8., Уассше Ие81дп (субъединичный и адъювантный подход) (1995). Фармацевтические композиции и иммуногенные композиции, включенные в объем настоящего изобретения, также могут содержать другие соединения, которые могут быть биологически активными или неактивными. Например, в фармацевтической или иммуногенной композиции может присутствовать один или более чем один иммуногенный участок других антигенов М. !иЬегси1о818, либо встроенных в слитый полипептид, либо в виде отдельного соединения.
Приведенные в качестве иллюстрации иммуногенные композиции могут содержать полинуклеотид (например, ДНК), кодирующий один или более полипептидов, которые описаны выше, так что полипеп- 41 022203 тид образуется ш кПи (тем самым вызывая иммунный ответ). Как отмечено выше, ДНК может находиться в любой из множества систем доставки, известных средним специалистам в данной области, включая экспрессирующие системы на основе нуклеиновых кислот, бактериальные и вирусные экспрессирующие системы. Многочисленные методы генной доставки общеизвестны в данной области, как например, описанные в Ко11апб, С’гП. Кеу. ТЬегар. Эгид Сатег Зук!етк, 15: 143-198 (1998) и приведенных там ссылках. Соответствующие экспрессирующие системы на основе нуклеиновых кислот содержат необходимые последовательности ДНК для экспрессии у пациента (такие как подходящий промотор и сигнал терминации). Бактериальные системы доставки включают введение бактериальной клетки-хозяина (например, штамм МусоЬас!епит, ВасШик или Ьас!оЬасШик, включая бациллу Кальметта-Герена (ВасШик-Са1тейеОиети) или Ьас!ососсик 1ас!1к), которая экспрессирует полипептид (например, на своей клеточной поверхности или секретирует данный полипептид) (см., например, Реггета, е! а1., Ап. Асаб. Вгак. С1епс. (2005) 77: 113-124; и КаЬа, е! а1., Арр1. М1сгоЪю1. Вю!есЬпо1. (2005) РиЬМеб ГО 15635459). В предпочтительном воплощении ДНК может быть введена с использованием вирусной экспрессирующей системы (например, вируса коровьей оспы или другого поксвируса, ретровируса или аденовируса), которая может включать применение непатогенного (дефектного), компетентного по репликации вируса. Подходящие системы раскрыты, например, в Р1кЬег-НосЬ е! а1., Ргос. №!1. Асаб. За. ИЗА, 86: 317-321 (1989); Р1е\пег е! а1., Апп. Ν.Υ. Асаб. δοΐ., 569: 86-103 (1989); Р1е\пег е! а1., νίκαι^, 8: 17-21 (1990); патентах США №№ 4603112, 4769330 и 5017487; АО 89/01973; патенте США № 4777127; ОВ 2200651; ЕР 0345242; АО 91/02805; Вегкпег, Вю!есЬтдиек, 6: 616-627 (1988); КокепГе1б е! а1., Заепсе, 252: 431-434 (1991); Ко11к е! а1., Ргос. N311. Асаб. За. ИЗА, 91: 215-219 (1994); Какк-ЕШег е! а1., Ргос. N311. Асаб. За. ИЗА, 90: 1149811502 (1993); Ои/тап е! з1., С1гси1а!юп, 88: 2838-2848 (1993) и Ои/тап е! з1., Си. Кек., 73: 1202-1207 (1993). Методы включения ДНК в такие экспрессирующие системы хорошо известны средним специалистам в данной области техники. ДНК также может быть голой, как описано, например, в И1тег е! а1., Заепсе, 259: 1745-1749 (1993) и рассмотрено в обзоре СоЬеп, Заепсе, 259: 1691-1692 (1993). Захват голой ДНК может быть увеличен путем нанесения покрытия ДНК на биоразлагаемые гранулы, которые эффективно транспортируются в клетки. Очевидно, что иммуногенная композиция может содержать и полинуклеотидный и полипептидный компонент. Такая иммуногенная композиция может обеспечивать повышенный иммунный ответ.
Очевидно, что иммуногенная композиция может содержать фармацевтически приемлемые соли полинуклеотидов и полипептидов, предложенных здесь. Такие соли могут быть получены из фармацевтически приемлемых нетоксичных оснований, включая органические основания (например, соли первичных, вторичных и третичных аминов и основных аминокислот) и неорганические основания (например, натриевые, калиевые, литиевые, аммониевые, кальциевые и магниевые соли).
Поскольку в иммуногенных композициях по данному изобретению может быть использован любой подходящий носитель, известный средним специалистам в данной области, тип носителя будет варьировать в зависимости от способа введения. Композиции по настоящему изобретению могут быть изготовлены для любого подходящего способа введения, включая, например, местное, пероральное, назальное, внутривенное, интракраниальное, интраперитонеальное, подкожное или внутримышечное введение. Для парентерального введения, такого как подкожная инъекция, носитель предпочтительно содержит воду, физиологический раствор, спирт, жир, воск или буфер. Для перорального введения могут быть использованы любые из приведенных выше носителей или твердый носитель, такой как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза и карбонат магния. Биоразлагаемые микросферы (например, полилактат-полигликолят) также могут быть использованы в качестве носителей для фармацевтических композиций по данному изобретению. Подходящие биоразлагаемые микросферы раскрыты, например, в патентах США №№ 4897268, 5075109, 5928647, 5811128, 5820883, 5853763, 5814344 и 5942252. Также может быть использован носитель, содержащий комплексы частиц с белками, описанные в патенте США № 5928647, которые способны индуцировать ограниченные классом I ответы цитотоксических Т-лимфоцитов у хозяина.
Такие композиции также могут содержать буферы (например, нейтральный забуференный физиологический раствор или забуференный фосфатом физиологический раствор), углеводы (например, глюкозу, маннозу, сахарозу или декстраны), маннит, белки, полипептиды или аминокислоты, такие как глицин, антиоксиданты, бактериостатические вещества, хелатирующие агенты, такие как ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или глутатион, адъюванты (например, гидроксид алюминия), растворенные вещества, которые делают композицию изотонической, гипотонической или слабо гипертонической относительно крови реципиента, суспендирующие агенты, загустители и/или консерванты. Альтернативно, композиции по настоящему изобретению могут быть изготовлены в виде лиофилизата. Соединения также могут быть инкапсулированы в липосомы с использованием хорошо известной технологии.
Любой из различных иммуностимуляторов может быть использован в иммуногенных композициях по данному изобретению. Например, может быть включен адьювант. Большинство адъювантов содержат вещество, предназначенное для защиты антигена от быстрого катаболизма, такое как гидроксид алюминия или минеральное масло, и стимулятор иммунных ответов, такой как липид А, Войабе11а рейикык или виды МусоЬас!егшт или белки, происходящие из МусоЬас!егшт. Например, может быть использован
- 42 022203 делипидизированный, дегликолипидизированный М. уассае (рУас). Подходящие адъюванты имеются в продаже, например, неполный адъювант и полный адъювант Фрейнда (Эбсо ЬаЪогаФпеБ, Эе1гоб, М1); адъювант 65 от Мегск (Мегск апб Сотрапу, 1пс., РаНтау, N1); А801В, А802А, А815, А8-2 и их производные (О1ахо8тбЪК1те, РЫ1абе1рЫа, РА); С\У8 (остов клеточной стенки из туберкулезной бациллы), ТЭМ (дикориномиколат трегалозы), ЬегГ (фактор инициации элонгации лейшманий), соли алюминия, такие как гель гидроксида алюминия (квасцы) или фосфат алюминия; соли кальция, железа или цинка; нерастворимая суспензия ацилированного тирозина; ацилированные сахара; катионные или анионные производные полисахаридов; полифосфазены; биоразлагаемые микросферы; монофосфориллипид А (МРЬ®); и С|ш1 А (например, 08-21). В качестве адъювантов также могут быть использованы цитокины, такие как ОМ-С8Р (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор) или интерлейкин-2, -7 или -12.
Термин адъювант относится к компонентам в вакцинной или терапевтической композиции, которые повышают специфический иммунный ответ на антиген (см., например, Ебе1тап, ΆΙΌ8 Рек. Нит. Ре1гоу1ги5е5, 8: 1409-1411 (1992)). Адъюванты индуцируют иммунные ответы ТН1-типа и ТН-2-типа. Цитокины ТН1-типа (например, ΙΡΝ-γ, 1Ь-2 и ГЬ-12) имеют тенденцию благоприятно влиять на индукцию клеточно-опосредованного иммунного ответа на вводимый антиген, тогда как цитокины ТН2-типа (например, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6 и 1Ь-10) имеют тенденцию благоприятно влиять на индукцию гуморальных иммунных ответов. Адъюванты, способные к предпочтительной стимуляции ТН-1 клеточноопосредованного иммунного ответа, описаны в \УО 94/00153 и \УО 95/17209.
В иммуногенных композициях, предложенных здесь, адъювантная композиция предпочтительно сконструирована для индукции иммунного ответа преимущественно ТН1-типа. После применения иммуногенной композиции как предложено здесь, пациент обычно будет поддерживать иммунный ответ, который включает ответы ТН1- и ТН2-типов. В предпочтительном воплощении, когда ответ представляет собой преимущественно ответ ТН1-типа, уровень цитокинов ТН1-типа будет повышаться в большей степени, чем уровень цитокинов ТН2-типа. Уровни этих цитокинов можно легко оценить с использованием стандартных методов анализа. Для обзора семейств цитокинов см. 1апетеау, е! а1., 1ттипоЪю1оду, 5-е издание, 2001.
Композиции на основе Ру1753с обычно содержат один или более чем один адъювант, например, А801В (3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А (3Э-МРЬ®) и 0821 в липосомной композиции; см. публикацию патента США № 2003/0143240); А802А (3Э-МРЬ® и ф821 и эмульсию типа масло-вводе; см. Во)апд, е! а1., Ьапсе! (2001) 358: 1927); ЕЫНАЫ2УЫ® (Эе!ох); 3Э-МРЬ®; сапонины, в том числе Оиб А и его компоненты, например 0821 и миметики сапонинов; С\У8 (остов клеточной стенки из туберкулезной бациллы), ТОМ (дикориномиколат трегалозы), аминоалкилглюкозаминид-4-фосфаты (АОР); иммуностимулирующие олигонуклеотиды, например СРО; ЬегГ (фактор инициации элонгации лейшманий); и их производные. В предпочтительном воплощении полипептид Ру1753с вводят с одним или более чем одним адъювантом, выбранным из группы, состоящей из 3Э-МРЬ® и 0821 в липосомной композиции, например, А801В, и 3Э-МРЬ® и 0821 и эмульсии типа масло-в-воде (например, А802А). Адъювантные системы А801В и А802А также описаны в РюНуапдки1, е! а1., Уассше (2004) 22: 3831-40.
Если доставку антигена Ру1753с осуществляют в виде нуклеиновой кислоты, то он может быть доставлен, например, в вирусном векторе (то есть, аденовирусном векторе) или в мутантной бактериальной клетке-хозяине (то есть, мутантной, авирулентной клетке-хозяине МусоЪас1егшт, РасФЪасШиБ или Васб1и5, включая бациллу Кальметта-Герена (БЦЖ) и РасФсоссиБ 1асб5).
Предпочтительные адъюванты для применения с целью индукции преимущественно ответа ТН1типа включают, например, комбинацию монофосфориллипида А (МРЬ®), предпочтительно 3-Одеацилированного монофосфориллипида А (3Э-МРЬ®), возможно с солью алюминия (см., например, Р1Ы, е! а1., 1986, 1ттипо1оду апб 1ттипорНагтасо1оду оГ Вас!епа1 ЕпбоЮхиъ, Р1епит РиЪ1. Согр., ΝΥ, рр. 407-419; ОВ 2122204В; ОВ 2220211; и патент США 4912094). Предпочтительная форма 3Э-МРЬ® находится в виде эмульсии, имеющей небольшой размер частиц, менее 0,2 мм в диаметре, и способы ее изготовления раскрыты в \УО 94/21292. Водные композиции, содержащие монофосфориллипид А и поверхностно-активное вещество, были описаны в \УО 98/43670. Типичные предпочтительные адъюванты включают А801В (МРЬ® и 0821 в липосомной композиции), 3О-МРЬ® и 0821 в липосомной композиции, А802А (МРЬ® и 0821 и эмульсию типа масло-в-воде), 3О-МРЬ® и 0821 и эмульсию типа масло-вводе, и А815, доступные от О1ахо8тбНК1ше. Адъюванты на основе МРЬ® доступны от О1ахо8тбНКбпе (см. патенты США №№ 4436727, 4877611, 4866034 и 4912094).
СрО-содержащие олигонуклеотиды (в которых динуклеотид СрО не метилирован) также индуцируют преимущественно ТН1-ответ. СрО представляет собой аббревиатуру для цитозин-гуанозиновых динуклеотидных мотивов, присутствующих в ДНК. Такие олигонуклеотиды хорошо известны и описаны, например, в \УО 96/02555, \УО 99/33488 и патентах США №№ 6008200 и 5856462. Ииммуностимуляторные последовательности ДНК также описаны, например, в 8а!о е! а1., 8с1епсе, 273: 352 (1996). СрО, когда он приготовлен в виде иммуногенных композиций, обычно вводят в свободном виде в растворе вместе со свободным антигеном (\УО 96/02555; МсС1и5к1е апб Эаугк, выше), или ковалентно конъюгиро- 43 022203 ванным с антигеном (νθ 98/16247), или приготовлен в виде препарата с носителем, таким как гидроксид алюминия ((поверхностный антиген вируса гепатита) Οπνίδ е! а1., выше; Вга/о1о1-МП1ап е! а1., Ргос. Ыаб. Асаб. 8с1. И8А, 1998, 95(26), 15553-8). СрО известен в данной области как адьювант, который можно вводить как системно, так и через слизистую оболочку (νθ 96/02555, ЕР 468520, Оа\л5 е! а1., 1. 1ттипо1, 1998, 160(2): 870-876; МсСЛвЫе апб Вата, 1. 1ттипо1., 1998, 161(9): 4463-6).
Другим предпочтительным адъювантом является сапонин или миметики либо производные сапонина, такие как 0ш1 А, предпочтительно 0821 (Ациба ВюркагтасеибсаЕ 1пс., Ргатшдкат, МА), которые могут быть использованы по отдельности или в комбинации с другими адъювантами. Например, усиленная система включает комбинацию монофосфориллипида А (МРЬ®) и производного сапонина, такую как комбинация 0821 и 3В-МРЬ®, как описано в νθ 94/00153, или менее реактогенную композицию, где 0821 погашен холестерином, как описано в νθ 96/33739. Другие предпочтительные композиции содержат эмульсию типа масло-в-воде и токоферол. Особенно сильнодействующая адъювантная композиция, включающая 0821, 3В-МРЬ® и токоферол в эмульсии типа масло-в-воде, описана в νθ 95/17210. Дополнительные сапониновые адъюванты для применения в настоящем изобретении включают 087 (описанный в νθ 96/33739 и νθ 96/11711) и 0817 (описанный в патенте США № 5057540 и ЕР 0362279 В1).
Альтернативно, сапониновые композиции могут быть скомбинированы с наполнителями для вакцин, в состав которых входит хитозан или другие поликатионные полимеры, частицы полилактида и сополимера полилактид-со-гликолид, полимерная матрица на основе поли-Ы-ацетилглюкозамина, частицы, составленные из полисахаридов или химически модифицированных полисахаридов, липосомы и частицы на основе липидов, частицы, составленные из сложных моноэфиров глицерина и так далее. Сапонины также могут быть приготовлены в присутствии холестерина с образованием дисперсных структур, таких как липосомы или 18СОМ®. Более того, сапонины могут быть приготовлены вместе с простым или сложным эфиром полиоксиэтилена, либо в растворе, не содержащем частиц, либо в суспензии или в дисперсной структуре, такой как олиголамеллярная (раисбате1аг) липосома или 18СОМ® (иммуностимулирующий комплекс). Сапонины также могут быть приготовлены в виде препарата с такими эксципиентами как САКВОРОЬ®, для увеличения вязкости, или могут быть приготовлены в сухой порошковой форме с порошковым эксципиентом, таким как лактоза.
В одном воплощении адъювантная система включает комбинацию монофосфориллипида А и производного сапонина, такую как комбинация 0821 и адъюванта 3В-МРЬ®, которая описана в VО 94/00153, или менее реактогенную композицию, где 0821 погашен холестерин-содержащими липосомами, как описано в VО 96/33739. Другие подходящие композиции содержат эмульсию типа масло-в-воде и токоферол. Другая подходящая адъювантная композиция, в которой используют 0821, адъювант 3ΌМРЬ® и токоферол в эмульсии типа масло-в-воде, описана в VО 95/17210.
Другая усиленная адъювантная система включает комбинацию СрО-содержащего олигонуклеотида и производного сапонина, в частности комбинацию СрО и 0821 как раскрыто в VО 00/09159. Удобно, когда композиция дополнительно содержит эмульсию типа масло-в-вводе и токоферол.
Другие предпочтительные адъюванты включают МОЫТАЫШЕ® 18А 720 (8еррю, Ргапсе), 8АР (СЛгоп, СаНГогта, Ипкеб 81а1ев), 18СОМ8® (С8Ь), МР-59 (СЛгоп), адъюванты серии 8ВА8 (8тккКкпе Веескат, Юхепвай, Ве1дшт), ЭеЮх (Сопха), КС-529 (Сопха) и другие аминоалкилглюкозаминид-4фосфаты (АОР), как например, описанные в находящихся на рассмотрении заявках на патент США №№ 08/853826 и 09/074720, описания которых включены здесь во всей своей полноте посредством ссылки, и адъюванты на основе простого эфира полиоксиэтилена, как, например, описанные в VО 99/52549А1. В настоящее время 8тккК1ше Веескат и Сопха Согрогакоп входят в О1ахо8тккК1ше.
Другие подходящие адъюванты включают молекулы адъюванта общей формулы (Ι):
НО(СН2СН2О)п-А-К, где п равно 1-50, А представляет собой связь или -С(О)-, К представляет собой С1-50алкил или фенил-С1-50алкил.
Другим представляющим интерес адъювантом является Ъ-цепь шига-токсина, использованная, например, как описано в VО 2005/112991.
В одном воплощении настоящего изобретения представлена иммуногенная композиция, содержащая полиоксиэтиленовый простой эфир общей формулы (Ι), где п равен 1-50, предпочтительно 4-24, наиболее предпочтительно 9; компонент К представляет собой С1.50, предпочтительно С4-С20алкил и наиболее предпочтительно С^алкил, и А представляет собой связь. Концентрация полиоксиэтиленовых простых эфиров должна быть в диапазоне 0,1-20%, предпочтительно 0,1-10% и наиболее предпочтительно в диапазоне 0,1-1%. Предпочтительные полиоксиэтиленовые простые эфиры выбраны из следующей группы: полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-9-стеариловый эфир, полиоксиэтилен-8стеариловый эфир, полиоксиэтилен-4-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-35-лауриловый эфир и полиоксиэтилен-23-лауриловый эфир. Полиоксиэтиленовые простые эфиры, как например, полиоксиэтиленлауриловый эфир, описаны в Мегск шбех (Справочник именных реакций в органической химии) (12-е издание: запись 7717). Эти адъювантные молекулы описаны в VО 99/52549.
- 44 022203
Любая иммуногенная композиция, предложенная здесь, может быть изготовлена с использованием хорошо известных способов, которые приводят к получению комбинации антигена, усилителя иммунного ответа и подходящего носителя или эксципиента. Композиции, изложенные здесь, могут быть введены в виде части препарата с непрерывным высвобождением (т.е. такого препарата, как капсула, губка или гель (состоящие, например, из полисахаридов), который обеспечивает медленное высвобождение соединения после введения). Как правило, такие препараты можно изготовить, используя хорошо известную технологию (см., например, СоотЬек е! а1., Уассше, 14: 1429-1438 (1996)), и вводить, например, перорально, ректально или подкожной имплантацией либо путем имплантации в желаемое целевое место. Композиции с непрерывным высвобождением могут содержать полипептид, полинуклеотид или антитело, распределенные в матриксе-носителе и/или содержащиеся в резервуаре, окруженном мембраной, контролирующей скорость высвобождения.
Носители для применения в таких композициях являются биологически совместимыми и также могут быть биоразлагаемыми; предпочтительно композиция обеспечивает относительно постоянный уровень высвобождения активных компонентов. Такие носители включают микрочастицы из сополимера поли(лактид-со-гликолид), полиакрилата, латекса, крахмала, целлюлозы, декстрана и тому подобного. Другие носители замедленного высвобождения включают надмолекулярные биовекторы, которые содержат нежидкое гидрофильное ядро (например, поперечно-сшитый полисахарид или олигосахарид) и, возможно, внешний слой, содержащий амфифильное соединение, такое как фосфолипид (см., например, патент США № 5151254 и заявки РСТ АО 94/20078, АО 94/23701 и АО 96/06638). Количество активного соединения, содержащегося в препарате с непрерывным высвобождением, зависит от места имплантации, скорости и ожидаемой продолжительности высвобождения.
Любое из множества средств доставки можно использовать в фармацевтических композициях и иммуногенных композициях для того, чтобы облегчить получение антиген-специфического иммунного ответа. Средства доставки включают антигенпредставляющие клетки (АРС), такие как дендритные клетки, макрофаги, В-клетки, моноциты и другие клетки, которые могут быть использованы для конструирования эффективных АРС. Такие клетки могут быть, но не обязательно, генетически модифицированными для увеличения способности презентировать антиген, для улучшения активации и/или поддержания Тклеточного ответа и/или чтобы быть иммунологически совместимыми с получателем (то есть соответствовать НЬА гаплотипу). АРС обычно могут быть выделены из любых различных биологических жидкостей и органов и могут представлять собой аутологические, аллогенные, сингенные или ксеногенные клетки.
В некоторых предпочтительных воплощениях настоящего изобретения в качестве антигенпредставляющих клеток используют дендритные клетки или их клетки-предшественники. Дендритные клетки являются высоко эффективными АРС (Вапсйегеаи & §!ештап, №!ите, 392: 245-251 (1998)), и показано, что они эффективны в качестве физиологического адъюванта для индукции профилактического или терапевтического иммунитета (см. Типтегтап & Рему, Апп. Кем. Меб., 50: 507-529 (1999)). Обычно дендритные клетки можно идентифицировать на основании их типичной формы (звездообразной ш кПи, с заметными цитоплазматическими отростками (дендритами), видимыми ш νίΙΐΌ), их способности захватывать, процессировать и представлять антигены с высокой эффективностью и их способности активировать ответы наивных Т-клеток. Несомненно, дендритные клетки могут быть сконструированы для экспрессии специфических рецепторов или лигандов клеточной поверхности, которые обычно не обнаруживаются на дендритных клетках ш νί\Ό или ех νί\Ό, и такие модифицированные дендритные клетки предложены в настоящем изобретении. В качестве альтернативы дендритным клеткам в иммуногенной композиции могут быть использованы секретируемые везикулы нагруженных антигеном дендритных клеток (называемые экзосомами) (см. Ζ^!νоде1 е! а1., №!ите Меб., 4: 594-600 (1998)).
Дендритные клетки и их клетки-предшественники могут быть получены из периферической крови, спинного мозга, лимфатических узлов, селезёнки, кожи, пуповинной крови или любой другой подходящей ткани или жидкости. Например, дендритные клетки могут быть дифференцированы ех νί\Ό путем добавления комбинации цитокинов, таких как ОМ-СδΡ, Ш-4, Ш-13 и/или ΤΝΡα, к культурам моноцитов, полученных из периферической крови. Альтернативно, СО34-позитивные клетки, собранные из периферической крови, пуповинной крови или спинного мозга, могут быть дифференцированы в дендритные клетки путем добавления к культуральной среде комбинаций ОМ-СδΡ, Ш-3, ΤΝΡα, лиганда СЭ40, ЬР8 (липополисахарид), лиганда й1!3 и/или другого(их) соединения(ий), которые индуцируют дифференцировку, созревание и пролиферацию дендритных клеток.
Дендритные клетки удобно разделить на такие категории, как незрелые и зрелые клетки, что позволяет просто различать два хорошо охарактеризованных фенотипа. Однако эту номенклатуру не следует толковать как исключающую все возможные промежуточные стадии дифференцировки. Незрелые дендритные клетки характеризуются как АРС с высокой эффективностью к захвату и процессингу антигенов, что коррелирует с высоким уровнем экспрессии Ρсγ-рецептора и маннозного рецептора. Зрелый фенотип обычно характеризуется низким уровнем экспрессии этих маркеров, но высоким уровнем экспрессии молекул клеточной поверхности, ответственных за активацию Т-клеток, таких как молекулы
- 45 022203 класса I и класса II МНС (главного комплекса гистосовместимости), молекулы адгезии (например, СЭ54 и СЭ11) и костимуляторные молекулы (например, СЭ40, СЭ80, СЭ86 и 4-1ВВ).
Обычно АРС могут быть трансфицированы полинуклеотидом, кодирующим белок (или его участок или другой вариант), так что полипептид экспрессируется на клеточной поверхности. Такая трансфекция может иметь место ех νίνο, и фармацевтическая композиция или иммуногенная композиция, содержащие такие трансфицированные клетки, затем могут быть использованы, как изложено здесь. Альтернативно, пациенту может быть введено средство для доставки гена, нацеленное на дендритную или другую антигенпредставляющую клетку, что приводит к трансфекции, которая имеет место ш νίνο. Трансфекция дендритных клеток ш νίνο и ех νίνο обычно может быть, например, осуществлена с использованием любых способов, известных в данной области, таких как описанные в \УО 97/24447, или подхода с применением генной пушки, описанного в Μ;·ι1ινί е! а1., ^тию^ду апй Се11 Вю^ду, 75: 456-460 (1997). Загрузки дендритных клеток антигенами можно добиться посредством инкубации дендритных клеток или клеток-предшественников с полипептидом, ДНК (голой или в составе плазмидного вектора) или РНК; либо с антиген-экспрессирующими рекомбинантными бактериями или вирусами (например, векторами на основе вируса коровьей оспы, вируса птичьей оспы, аденовируса или лентивируса). Перед загрузкой полипептид может быть ковалентно конъюгирован с иммунологическим партнером, который обеспечивает помощь Т-клеток (например, с молекулой-носителем). Альтернативно, дендритную клетку можно подвергнуть импульсному воздействию неконъюгированного иммунологического партнера, отдельно или в присутствии полипептида.
Иммуногенные композиции и фармацевтические композиции могут быть представлены в однодозовых или многодозовых контейнерах, таких как запаянные ампулы или герметично укупоренные флаконы. Такие контейнеры предпочтительно герметично укупорены для сохранения стерильности композиции вплоть до применения. Как правило, композиции можно хранить в виде суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных наполнителях. Альтернативно, иммуногенную композицию или фармацевтическую композицию можно хранить в лиофилизированном состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя непосредственно перед применением.
В некоторых воплощениях за примированием или первым введением полипептида Ку1753с (включая варианты, иммуногенные фрагменты или слитые белки) или полинуклеотида, кодирующего указанный полипептид, следует одна или более бустер-иммунизаций или последующех введений полипептида Ку1753с (включая варианты, иммуногенные фрагменты или слитые белки) или полинуклеотида, кодирующего указанный полипептид (способ примирования и бустер-иммунизации). Например, за первым введением полипептида Ку1753с (включая варианты, иммуногенные фрагменты или слитые белки) или полинуклеотида, кодирующего указанный полипептид, следуют одно или более чем одно последующее введение полипептида Ку1753с (включая варианты, иммуногенные фрагменты или слитые белки) или полинуклеотида, кодирующего указанный полипептид.
В одном воплощении за первым введением полипептида Ку1753с или кодирующего его полинуклеотида следует одно или более чем одно последующее введение полипептида Ку1753с. В одном воплощении за первым введением полипептида Ку1753с или кодирующего его полинуклеотида следует одно или более чем одно последующее введение полинуклеотида, кодирующего Ку1753с. Обычно первое или примирующее введение и второе или бустинг-введение выполняют с интервалом приблизительно 212 недель или с интервалом вплоть до 4-6 месяцев. Последующие бустер-введения выполняют с интервалом примерно 6 месяцев или с интервалом 1, 2, 3, 4 или 5 лет. Традиционная бустинг-обработка (например, примирующее введение белка с последующим бустинг-введением белка) также может быть полезна в предупреждении или лечении туберкулеза (например, в предупреждении или лечении латентного туберкулеза, в частности предупреждении или замедлении реактивации туберкулеза).
Антитела
Антитело относится к полипептиду, содержащему каркасную область, кодируемую иммуноглобулиновым геном, или ее фрагменты, который специфически связывает и распознает антиген. Известные иммуноглобулиновые гены включают гены константных областей каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон и мю, а также несметное количество генов вариабельных областей иммуноглобулинов. Легкие цепи классифицируют как либо каппа, либо лямбда. Тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, которые в свою очередь определяют классы иммуноглобулинов 1дС, ΙβΜ, Ι§Α, 1дЭ и 1др соответственно.
Типичная структурная единица иммуноглобулина (антитела) представляет собой тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, при этом каждая пара имеет одну легкую (приблизительно 25 кДа) и одну тяжелую цепь (приблизительно 50-70 кДа). Ν-конец каждой цепи определяет вариабельную область приблизительно из 100-110 или более аминокислот, главным образом ответственную за распознавание антигена. Термины вариабельная легкая цепь (Уъ) и вариабельная тяжелая цепь (УН) относятся соответственно к этим легким и тяжелым цепям.
Антитела существуют, например, в виде интактных иммуноглобулинов или в виде множества хорошо охарактеризованных фрагментов, полученных в результате расщепления различными пептидазами. Так, например, пепсин расщепляет антитело ниже дисульфидных связей в шарнирной области с получе- 46 022203 нием Р(аЬ)'2, димера РаЬ, который сам по себе представляет собой легкую цепь, соединенную с УН-СН1 посредством дисульфидной связи. Р(аЬ)'2 можно восстановить в мягких условиях с разрывом дисульфидной связи в шарнирной области, превращая при этом димер Р(аЬ)'2 в мономер РаЬ'. Мономер РаЬ', по существу, представляет собой РаЬ с частью шарнирной области (см. Рипбатейа1 1ттипо1оду (Раи1 еб., 3-е изд. 1993)). Несмотря на то что различные фрагменты антитела определяют в терминах расщепления интактного антитела, специалисту будет очевидно, что такие фрагменты можно синтезировать бе ηονο или химически, или с использованием методологии рекомбинантной ДНК. Таким образом, термин антитело, как он использован здесь, также включает в себя фрагменты антител, либо полученные в результате модификации целых антител, либо синтезированные бе ηονο с использованием методологий рекомбинантной ДНК (например, одноцепочечный фрагмент Ρν), либо идентифицированные с использованием библиотек фагового дисплея (см., например, МсСайебу е) а1., Иа)иге, 348: 552-554(1990)).
Для получения моноклональных или поликлональных антител можно использовать любой известный в данной области метод (см., например, КоН1ег & МПк)еш, Иа)иге, 256: 495-497 (1975); Ко/Ьог е) а1., 1ттипо1оду Тобау, 4: 72 (1983); Со1е е) а1., рр. 77-96 в Мопос1опа1 АпбЬоб1ек апб Сапсег ТНегару (1985)). Методы получения одноцепочечных антител (патент США 4946778) могут быть адаптированы для получения антител к полипептидам по данному изобретению. Кроме того, для экспрессии гуманизированных антител могут быть использованы трансгенные мыши или другие организмы, например, другие млекопитающие. Альтернативно, для идентификации антител и гетеромерных РаЬ-фрагментов, которые специфически связывают выбранные антигены, может быть использована технология фагового дисплея (см., например, МсСаГГебу е) а1., Иа)иге, 348: 552-554 (1990); Магкк е) а1., Вю)есЬпо1оду, 10: 779-783 (1992)).
Фраза специфически (или селективно) связывается с антителом или специфически (или селективно) иммунореактивен в отношении, когда касается белка или пептида, относится к реакции связывания, которая определяет присутствие белка в гетерогенной популяции белков и других биологических молекул. Таким образом, в разработанных условиях иммуноанализа специфические антитела связываются с конкретным белком по меньшей мере в два раза большем количестве по сравнению с фоном и, по существу, не связываются в значительном количестве с другими белками, присутствующими в образце. Для специфического связывания с антителом в таких условиях может потребоваться антитело, отобранное по его специфичности к конкретному белку. Например, среди поликлональных антител, индуцированных в ответ на слитые белки, можно отобрать только те поликлональные антитела, которые специфически иммунореактивны в отношении слитого белка, а не в отношении индивидуальных компонентов слитых белков. Этот отбор может быть осуществлен путем исключения антител, дающих перекрестную реакцию с индивидуальными антигенами. Для отбора антител, специфически иммунореактивных в отношении конкретного белка, можно использовать ряд иммунологических форматов. Например, для отбора антител, специфически иммунореактивных в отношении белка, обычно используют твердофазные ЕЫЗА (твердофазный иммуноферментный анализ) иммуноанализы (см., например, Наг1оте & Ьапе, АпбЬоб1ек, А ЬаЬота)оту Мапиа1 (1988) и Икшд АпбЬоб1ек: А ЬаЬота)оту Мапиа1 (1998) для описания иммуноаналитических форматов и условий, которые могут быть использованы для определения специфической иммунореактивности). Обычно специфическое или селективное взаимодействие должно по меньшей мере в два раза превышать фоновый сигнал или шум и в более типичных случаях превышать фон больше чем в 10, 20 или 100 раз (например, связывание с другими микобактериальными белками, такими как другие белки МусоЬас)ебит )иЬетси1ок1к).
Диагностические средства
В другом аспекте согласно данному изобретению предложены способы применения одного или более чем одного из полипептидов, описанных выше, для диагностики туберкулеза (например, с использованием основанных на Т-клеточном ответе анализов или основанных на применении антител анализов традиционного формата).
Например, предложен способ определения предшествующей инфекции М. )иЬетси1ок1к у индивидуума, включающий:
(а) получение образца от данного индивидуума;
(б) приведение указанного образца в контакт с выделенным полипептидом, содержащим:
(1) последовательность белка Ку1753с;
(2) вариант последовательности белка Ку1753с; или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Ку1753с;
(в) количественное определение ответа образца.
Образец, может представлять собой, например, цельную кровь или очищенные клетки. Удобно, если образец будет содержать мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС). В одном воплощении изобретения индивидуум будет серопозитивным. Во втором воплощении изобретения индивидуум будет серонегативным.
Удобно, если индивидуум не будет являться предварительно вакцинированным против инфекции, вызываемой М. )иЬетси1ок1к (например, удобно, если индивидуум не будет являться предварительно вакцинированным БЦЖ).
Ответ образца можно количественно измерить целым рядом способов, известных специалистам в
- 47 022203 данной области, включая мониторинг пролиферации лимфоцитов или продуцирование специфических цитокинов или антител. Например, ЕЫ8РОТ (иммуноферментный спот-анализ) Т-клеток можно использовать для мониторинга таких цитокинов, как интерферон-гамма (ΙΡΝγ), интерлейкин 2 (1Ь2) и интерлейкин 5 (1Ь5). ЕЬЫ8РОТ-анализ В-клеток можно использовать для мониторинга стимуляции специфических антигенов М. 1иЬегси1о818. Клеточный ответ также можно охарактеризовать, применяя внутри- и внеклеточное окрашивание и анализ на проточном цитометре.
Способы количественного определения пролиферативного ответа образца включают:
(1) импульсную обработку культивированных клеток радиоактивной меткой (например, меченным тритием тимидином) и мониторинг захвата трития (например, с использованием газового сцинтилляционного счетчика);
(2) мечение сукцинимидиловым эфиром карбоксифлуоресцеин-диацетата (СР8Е) и мониторинг клеточного деления по флуоресценции с использованием проточной цитометрии.
Количественное определение цитокинового ответа образца включает, в частности, мониторинг продуцирования гамма-интерферона.
При использовании таких способов количественного определения положительный ответ на антиген может быть определен по соотношению сигнала и шума (соотношение 8/Ν), составляющему по меньшей мере 2:1 (например, по меньшей мере 3:1 или по меньшей мере 5:1).
В другом аспекте настоящего изобретения предложены способы диагностики инфекции, вызываемой М. 1иЬегси1о818, с использованием кожной пробы. Термин кожная проба, как он использован здесь, представляет собой любой анализ, проведенный непосредственно на пациенте, в котором измеряют реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ЭТН) (как например, набухание, покраснение или дерматит) после внутрикожной инъекции полипептида К\'г153с как описано выше (или его варианта, иммуногенных фрагментов или нуклеотидов, кодирующих их). Такую инъекцию можно осуществить, используя любое подходящее устройство, обеспечивающее приведение в контакт антигенной комбинации с клетками кожи пациента, такое как туберкулиновый шприц или шприц на 1 мл. Реакцию измеряют по окончании периода времени, например, по меньшей мере 48 ч после инъекции, в частности, 48-72 ч.
Реакция ЭТН представляет собой клеточно-опосредованный иммунный ответ, который оказывается более сильным у пациентов, которые ранее подвергались воздействию тестируемого антигена. Такой ответ можно измерить визуально, используя линейку. В общем случае, ответ, превышающий примерно 0,5 см в диаметре, особенно превышающий примерно 1,0 см в диаметре, представляет собой положительный ответ, указывая на наличие предшествующей инфекции М. 1иЬегси1о818, что может проявляться или может не проявляться в форме активного заболевания.
Для применения в кожной пробе удобно, если компонент К.\'1753с изготовлен в виде фармацевтической композиции, содержащей физиологически приемлемый носитель. Соответственно носителем, используемым в таких фармацевтических композициях, является физиологический раствор с соответствующими консервантами, такими как фенол и/или Тетееп 80™.
Кроме того, согласно настоящему изобретению предложены наборы для применения в любом из вышеупомянутых диагностических способов. Такие наборы обычно содержат два или более чем два компонента, необходимых для проведения диагностического анализа. Такими компонентами могут быть соединения, реагенты, контейнеры и/или оборудование.
Например, один контейнер в наборе может содержать моноклональное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с белком. Такие антитела или фрагменты могут быть предложены присоединенными к веществу-носителю, как описано выше. Один или более дополнительных контейнеров могут содержать в себе элементы, такие как реагенты или буферы, для использования в анализе. Такие наборы могут также, или альтернативно, содержать детектирующий реагент как описанно выше, который содержит репортерную группу, подходящую для прямой или непрямой детекции связывания антител.
Альтернативно, набор может быть разработан для детекции уровня мРНК, кодирующей белок в биологическом образце. Такие наборы обычно содержат по меньшей мере один олигонуклеотидный зонд или праймер, как описано выше, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим белок. Такой олигонуклеотид можно использовать, например, в анализе с использованием ПЦР или гибридизационном анализе. Дополнительные компоненты, которые могут присутствовать в таких наборах, включают второй олигонуклеотид и/или диагностический реагент или контейнер для облегчения детекции полинуклеотида, кодирующего белок по изобретению.
Другие диагностические наборы включают наборы, разработанные для детекции клеточноопосредованных ответов (которые, например, могут быть использованы в диагностических способах по настоящему изобретению). Такие наборы обычно содержат:
(1) устройство для получения соответствующего образца клеток от субъекта;
(2) средства для стимуляции указанного образца клеток полипептидом К\'1753с (или его вариантом, его иммуногенными фрагментами или ДНК, кодирующей такие полипептиды);
(3) средства для детекции или количественного определения клеточного ответа на стимуляцию.
- 48 022203
Подходящие средства для количественного определения клеточного ответа включают набор для ΕΕΙδΡΟΤ-анализа В-клеток или альтернативно набор для ΕΕΙδΡΟΤ-анализа Т-клеток, которые известны специалистам в данной области техники.
Один возможный набор содержит:
(а) полипептид по изобретению и (б) детектирующий реагент, подходящий для прямой или непрямой детекции связывания с антителом.
Особый интерес представляют диагностические наборы, специально разработанные для количественного определения Т-клеточных ответов: Диагностический набор, содержащий:
(а) полипептид по изобретению и (б) устройство, обеспечивающее приведение указанного полипептида в контакт с клетками кожи индивидуума;
Диагностический набор, содержащий:
(а) полипептид по изобретению, (б) устройство, обеспечивающее приведение указанного полипептида в контакт с образцом (например, с цельной кровью или более удобно с РВМС), взятым у индивидуума, и (в) средства для количественного определения Т-клеточного ответа (например, пролиферации или продукции ΙΡΝ-гамма).
Примеры
Следующие примеры предложены лишь с целью иллюстрации и не являются ограничивающими. Специалисты в данной области техники без труда найдут разнообразные некритические параметры, которые могут быть изменены или модифицированы с получением, по существу, аналогичных результатов.
Пример 1. Идентификация Ку1753с в качестве мишени для вакцины против латентного ТВ.
Ген Ку1753с, также известного как РРЕ24, кодирует белок, являющийся членом РРЕ-семейства МусоЪас1егшт 1иЪегси1ок1к О1у-, Акп-богатых белков.
Ку1753с был выбран на основании полногеномного анализа генов МусоЪас1егшт 1иЪегси1ок1к, ассоциированных с поддержанием стадии покоя и инфекционности, как описано в МигрЕу апб Вго\\п. ВМС. 1пГес1. Эй., 2007, 7: 84-99. Возможные гены-мишени стадии покоя у МусоЪас1егшт 1иЪегси1ок1к были ранжированы в результате проведения биоинформационного мета-анализа опубликованных наборов данных, полученных с использованием полногеномного анализа ДНК на микрочипах, по экспрессии бактериальных генов в искусственно созданных условиях покоя. Далее, для всего генома была проведена субклеточная локализация кодируемых генами белков М. 1иЪегси1ок1к для идентификации мишеней вакцины.
Вкратце, экспериментальные условия в моделях покоя были весьма разнообразны, поэтому была разработана система оценки баллов от нуля до пяти для нормирования этих данных на основе двух критериев: 1) соответствия экспериментальных условий состоянию покоя и 2) рангового порядка экспрессии. Максимальный балл для конкретного экспериментального набора данных устанавливался на основании возможного соответствия клинической встречаемости фазы покоя инфекции М. 1иЪегси1ок1к. В табл. 1 показаны наборы данных, собранных для этапа 1, вместе с установленным максимальным баллом для каждого набора данных. Дополнительные наборы данных по значимости генов для роста получали из опубликованных исследований, в которых применялись эксперименты по нокауту генов, основанные на использовании транспозонов (ΤπιδΗ). Генам, которые не оказывали никакого эффекта на рост, присваивали балл, равный нулю.
Таблица 1. Источники, экспериментальные модели и критерии оценки для экспрессии генов М. 1иЪегси1оык с использованием анализа ДНК на микрочипах и полногеномного генного нокаута (значимость фазы роста)
Ссылка Экспериментальная модель Временная точка: максимальный балл’
Вейз ЗС, е( а/. Голодание в условиях 96 ч: 3
Мо1. М/сюЫо1., 2002, 43: 717- контроля О2 24 ч: 2
731 4 ч: 1
- 49 022203
НатрзЫге Τ, βί а/, ТиЬегси1о$18 (ЕдюЬ.), 2004, 84: 228-238 Истощение питательных веществ в условиях контроля о2 62 и 75 сут: 5 49 сут: 4 18 сут: 2
МиПиситаги ϋΘ βί а/. ТиЬегси1о$!$ (ЕсИпЬ,), 2004, 84: 239-246 Модель гипоксии Вейна * 14 сут (ΝΡΡ-2), 4 7 сут (ΝΚΡ-1): 2
Х/овкиЛ ΜΙ, βί βί. ТиЬвгси1оз18 (ЕсПпЬ.), 2004, 84: 218-227 Модель гипоксии Вейна * 30 и 80 сут: 5 14 и 20 сут: 4 10 и 12 сут: 3 6 и 8 сут: 2
ЗсЬпаррюдег ϋ, βί а/, д. Ехр. Мед., 2003, 198: 693-704 Инфекция мышиных макрофагов, +/- у-ΙΝΡ 24 и 48 ч: 5
Кагакоиз15 РС, βί а/. Л Ехр. Мед., 2004, 200: 647-657 Подкожный имплантат на основе полых волокон у мышей 10 сут: 3
Та1аа1АМ, е(а1. Рте. Νβϋ. Асад. Зек и.З А., 2004, 101: 4602-4607 Инфекция мышей. МТВ, полученный из легкого ь 28 сут: 3
8аззе№ СМ, βί а/. Мо1. МююЫо!., 2003, 48: 77-84 ТгаЗН мутированные библиотеки, выращенные на твердых средах 14 сут: 5
Кепдага]ап ΰ βί а/. Рте. Май, Асад. За. и.З.А., 2005, 102: 8327-8332 Инфекция мышиных макрофагов, +/- у-ΙΝΡ с ТгаЗН мутированными библиотеками М. 1иЬегси1ож 7 сут: 5
ЗаззеШ СМ βί а/. Ргос. Νβ(Ι. Асад. За. и.З.А., 2003, 100: 12989-12994 С57В1Л63 мыши, инфицированные ТгаЗН мутированными библиотеками М. 1иЬети1оз!з 7, 14, 28 и 56 сут: 5
Максимальный балл, основанный на релевантности в качестве модели покоя; ч = час; сут = сутки.
ЬСоотношение М. !иЬетси1о818 из легкого Ва1Ь/с и МТВ в аэрируемой культуре для 28 сут. # ^ауие Ь.С. аиб Науе8 Ь.С., 1и£ес!. 1ттии., 1996, 64: 2062-2069.
Этап 2. При применении второго критерия, рангового порядка генной экспрессии, баллы генов из каждого набора данных были упорядочены от наивысшего до самого низкого на основании экспрессионного соотношения (кратность экспрессии в экспериментальных условиях относительно экспрессии в клетках в логарифмической фазе культуры в жидкой среде). Ген с наивысшим рангом получал максимальный балл для этого конкретного набора данных (перечислены в колонке 3 табл. 1 (например, 5, 4 ..., 1 единица)). Балл уменьшали на 0,005 единицы для каждого гена по порядку вплоть до нуля или до достижения конца набора данных. Таким образом, когда максимальный балл составлял 4 единицы, 100-й по рангу ген получил бы балл 3,500. Для максимального балла в 5 единиц, 1000 генов или 25% генома М. !иЬегси1о818 получили балл. Для экспериментов, в которых собирали данные для нескольких временных точек, в качестве окончательного балла использовали максимальный балл по всем временным точкам.
На этапе 3 баллы для каждого гена в каждом из экспериментальных условий вводили в базу данных М1сго8ой Ассе88. Для облегчения установления приоритетов добавляли ссылочные поля, такие как Ке£8ед ГО, СеиЬаик Гиисйои, СеиЬаик ио!е, ТиЬегсиШ! с1а881Йсайои и КЕСС и 8аидег Сеи!ег Ьик8. Путем комбинирования данных из различных исследований и источников было достигнуто единодушное мнение относительно конкретных генов и путей, наиболее важных для выживания в состоянии покоя.
На этапе 4 с использованием 400 генов с наивысшим рангом (~10% генома) был получен список приоритетных терапевтических мишеней, дополненный результатами экспертного вычислительного и ручного анализа биохимических путей, энзимологии, удобства манипулирования лекарственным средством, гомологии с генами человека и другим предшествующим уровнем техники. Подавляющее большинство высокоранжированных генов получаются из подмножества, где две или три группы пересекаются.
На этапе 5 была проведена идентификация субклеточной локализации кодируемых генами белков М. !иЬегси1о818 на целом геноме. Эвристическая процедура, использованная для предсказания мембранных белков, описана в СЬа1кег е! а1., ί. Вас!ейо1., 2001, 183: 1259-1268. Усредненные профили гидрофоб- 50 022203 ности (Н) (уоп Неупе О., 1. Мо1. Бю1., 1992, 225: 487-494) получали с использованием индексов гидрофобности по ОЕ8 (Оо1Ьтап-Епде1тап-81е11/) (Епде1тап Э.М. е! а1., Аппи. Кеу. В1орЬу8. ВюрЬу8. СЬет., 1986, 15: 321-353), взвешенных с использованием окна трапеции Пгаре/оИ \ут0о\у). С использованием способа, аналогичного начальным этапам алгоритма ТорРгеД II (С1аго8 МО е! а1., Сотри!. Арр1. В^сг, 1994, 10: 685-686), для каждой пептидной последовательности были предсказаны спиральные трансмембранные сегменты (ТМ8) посредством отбора 19 аминокислот с центром с наивысшим индексом Н (МахН), защиты их от дальнейшего рассмотрения и повторения процесса до тех пор, пока не останется пиков с Н > 0,5. Субклеточные места локализации определяли на основании величины пика МахН, числа сегментов с Н > 1,0 и распределения величин пика Н предполагаемых ТМ8. Порог МахН, равный 1,15 был выбран, чтобы максимизировать различие между двумя тестовыми наборами данных 8\У188Рго1ет ге1еа8е 34, содержащими трансмембранные и цитоплазматические белки, соответственно (ВоуД Ό. е! а1., Рго!еш 8с1., 1998, 7: 201-205). Белки с МахН < 1,15 классифицировали как цитоплазматические, тогда как белки с МахН > 1,15 и по меньшей мере тремя возможными ТМ8 классифицировали как мембранные белки. Заякоренные белки определяли как имеющие строго два ТМ8, один из которых начинается перед аминокислотой (аа) 35, и один из которых имеет Н > 1,15, а другой имеет Н не ниже 0,5. Специально для М. Ьас!егшт использовали 81дпа1Р с параметрами для грамположительных бактерий с целью идентификации секретируемых белков среди белков, классифицируемых в эвристическом анализе или как цитоплазматические, или как неизвестные (№екеп Н, е! а1. Рго!еш Епд., 1997, 10: 1-6).
Ку1753с получил очень высокий ранг в качестве вакцинного антигена согласно нескольким критериям:
(1) Ку1753с неизменно активирован во всех моделях покоя. Среди всего набора из 3999 генов, оцененных в мета-анализе, Ку1753с был ранжирован 116-м как один из 10% сверхэкспрессируемых генов во всех моделях покоя. Балл активации для Ку1753с составил 13,29, что является благоприятным по сравнению с наивысшим баллом гена, составляющим 22,28. Ку1753с не подвергался негативной регуляции ни в одной из моделей состояния покоя, оценивается в 0 баллов (по сравнению с -18,13 для гена, подверженного наиболее значительной негативной регуляции).
(2) Ку1753с ранжирован как значимый для роста согласно моделям роста ш уЬго для выживаемости М. !иЬегси1о818 (оценивается в 2,07 балла из возможных 5).
(3) Предсказание субклеточной локализации говорит о том, что белок Ку1753с секретируется и, следовательно, значительно экспонирован вне клетки, что указывает на его пригодность в качестве мишени для вакцины.
Пример 2. Идентификация эпитопов Ку1753с
Способ.
Предсказание Т-клеточных эпитопов было основано на следующих подходах.
Прогноз Название ивЦунифицированный указатель ресурса)/Ссылки
С 04 и С08 ΜυΚίρΓβά вебсайт: ап1|деп.!2г.а-з1аг.еби.зд/ти1йргес1/ гИапд, ΘΧ., КЬап, А.М., Згнжазап, Κ.Ν., Аидиз!, 1Т. аггс! Вгизгс, V. (2005) “МиСПРВЕО: а сотрШаЬопа! зуз1ет (ог ргесПсЬоп οί ргонизсиоиз НЬА ЬикЛпд рерЬбез ΝιιοΙβίο АсИз Вез. 33, М172 - ΧΛ/179.
- 51 022203
ЗУМНС вебсайт: \лл™/-Ьв.1п1огта1|к.ип1-1иеЫпдеп.бе/3\/МНС “РгебгсИоп οί МНС с1авз 1 Ьтбтд рерйбев, ивюд 3\/МНС.” Ρίβιτβ ϋόηηβδ апб Агпе ΕΙοίέδοη ίη: ВМС ВюМогтаНсв, 2002, 3: 25.
Сй4 РгоРгеб вебсайт: ν/νην. ίωίβοίι. гев. 1п/гадЬауа/ргоргеб/ ЗтдЬ, Н. апб РадЬауа, С.Р.5. (2001) “РгоРгеб: Ргеб1с«оп οί ΗίΑ-ΟΚ Ыпб1пд вИез”. ВюМогтаИсз, 17(12), 1236-37.
Терйоре2 Программа собственной разработки на основе: Η. Βίβη, б. Наттег (2004) ‘ϋίΒοονθιγ οί ргопцзсиоив Н1_А-И-гев1пс1еб Т-се11 ерйорез ν/ίίίι ΤΕΡΙΤΟΡΕ.” МеЙюбз, 34: 468-75.
Οϋδ пНЬА вебсайт: \тлл7бгп1есЬ.гезбп/гадЬауа/пЬ1аргеб/ ВЬав1П М. апб РадЬауа С.Р.З. (2006) “А ЬуЬпб арргоасЬ Тог ргеб1с(1пд ргот1зсиоиз МНС с!авв 1 гев1пс!еб Т-се11 ерйорез”; б. Βίοεοί., 32: 31-42.
ΝβίΟΤί вебсайт: и/7№.сЬз.б1и.бк/зегу|сев/Не(СТ1/ “Ап 1п(едга(|уе арргоасЬ (о СТ1_ ерйоре ргебгсйоп. А сотЫпеб а1дог№Ьт т1едгайпд МНС-1 Ьтбтд, ТАР 1гапзроб ейюепсу апб рго1еавопла| с1еауаде ргеб1сйопз.” Ьагвеп МАЛ, Цтбедаагб С., Казрег 1_атЬет1Ь, Вииз 3., Вгипак 3., 1_ипб О. апб №е1зеп М. Еигореап боигпа! οί 1ттипо1оду. 35(8): 2295-303, 2005.
Ερί)βη вебсайт: иптл)еппег.ас.ик/Ер1беп/ йоукгМпоуа, 1. А., Р. Сиап, ϋ. К. ΡΙοννβΓ. Έρί6βπ: а зегуег ίοΓ ти1Й-з1ер Т-се11 ерМоре ргебюЙоп. ВМС Βίοίηίοιτηβίκβ, 2006, 7, 131.
- 52 022203
δγίρβίίΗί вебсайт: иуйп/7.зу1ре|(Ь|.бе/5спр(з/МНС8егуег.б11/Ер|1ореРгеб1с(1оп. Мт
Напз-Оеогд Раттепзее, биИа ВасЬтапп, ΝίβΙβ №ко1аиз ЕттепсЬ, Озкаг А1ехапбег ВасЬог, 3(е(ап δίβνβηονίο: “5ΥΡΡΕΙΤΗΙ: ба(аЬазе(ог МНС Пдапбз апб рерЬбе то(Ив. 1ттиподепе(гсз (1999) 50: 213-219.
РгебТАР вебсайт: апйдеп.|2г.а-з1аг.еби.зд/ргебТАР/ гЬапд, 0.1.., Рекоузку, Ν., КигаЬ, С.К., Аидиз1, б.Т. апб Вгизю, V. (2006) “ΡΡΕϋΤΑΡ: а зуз(ет (ог ргеб1Сбоп οί рерИбе Ьюбтд (о (Ье Ьитап (гапзробег аззоаа(еб апйдеп ргосеззтд.” 1ттипоте Рез. 2(1), 3.
РАРРОС вебсайт: утт.раргос2.бе/раргос1/раргос1 .Мт1 С. Кий1ег, А.К. ЫиззЬаит, Т.Р. Оюк, Η.-Θ. Раттепзее, Н. ЗсЬНб, К.Р. Набе1ег, “Ап а1доМЬт (ог (Ье ргебюЬоп οί рго(еазота! с1еа7адез”, б. ΜοΙ. ΒίοΙ. 298 (2000), 417-429. А.К. МиззЬаит, С. КиИ1ег, К.Р. Набе1ег, Η.-Θ. Раттепзее, Н. ЗсЬНб, “РАРгоС: А Ргебюбоп А1доп(Ьт 1ог Рго(еазота, С1еауадез ауаНаЫе оп (Ье ν/νννν, 1ттиподепе(1сз, 53 (2001), 87-94.
Результаты
Таблица 2. Предсказанные человеческие СЭ4+ Т-клеточные эпитопы Ку1753с
Номер предсказанного СО4 эпитопа Положение амино* кислоты Последова- тельность эпитопа ЗЕО Ю Νο: ΗίΑ аллель
1 57 УУСЮАЗЗЗАМ ЗЕО ΙΟ Νο: 30 ϋΚΒ1 0401
2 81 νΟΑΕΟΤΑΑα ЗЕО Ю Νο: 31 ϋΡΒ1 0401
3 100 νκτΑννοΡΜ ЗЕО Ю Νο: 32 ΟΡΒ1 0301, ϋΡΒ1 1301
4 105 νΟΡΜΙΆΆΑΝ ЗЕО Ю Νο: 33 ϋΚΒ1 1301
5 109 ΙΛ/ΑΑΝΡΑΟΙ. ЗЕО Ю Νο: 34 ΘΡΒ1 0301, ϋΡΒ1 0801, ΘΡΒ1 1101, ϋΡΒ1 1301, ΘΡΒ1 1501
6 117 Ι ν5Ι νΜ5ΝΙ. ЗЕО Ю Νο: 35 ΘΡΒ1 1501
7 120 ΙΛ/ΜδΝίΡΟΟ ЗЕО Ю Νο: 36 ΘΡΒ1 0401, ϋΡΒ1 1301
8 140 ΥΕΟΜννΑΑϋν ЗЕО Ю Νο: 37 ϋΡΒ1 0101
9 144 ννΑΑϋν5ΑΜ5 ЗЕО Ю Νο: 38 σΡΒΐ 0401
10 172 ΐΟΝΐΑΟΐΡΑ ЗЕО Ю Νο: 39 ΘΡΒ1 0101, ϋΡΒ1 1101, ЭРВ1 1501
11 261 ΡΟΝίΘδΝΝν ЗЕО Ю Νο: 40 ΘΡΒ1 0401
12 291 ΡΘΝΤΟΝΝΝΙ ЗЕО Ю Νο: 41 ϋΡΒ1 0401
13 413 ΡίΝΑΘΝΙΝΤ ЗЕО Ю Νο: 42 ϋΡΒ1 0401
14 453 ШР31ТТРО ЗЕО Ю Νο: 43 ΘΡΒ1 0401
15 673 ίΤΙΡΑΟΙΤΙ ЗЕО Ю Νο: 44 ϋΡΒ1 1501
16 725 РО1РРТЮР ЗЕО Ю Νο: 45 ϋΡΒ1 0401, ΘΡΒ1 1101
17 731 ΐΟΡΟΤΝ'/ΡΑ ЗЕО Ю Νο: 46 ϋΡΒ1 0401
18 733 ΡΟΤΝνΡΑίΟ ЗЕО Ю Νο: 47 ΟΡΒ1 0401, ΘΡΒ1 0801, ΟΡΒ1 1101
19 770 ΥΤΐΤΟΡίνΐ ЗЕО Ю Νο: 48 ΘΡΒ1 0101, ϋΡΒ1 0401, ϋΡΒ1 1101
20 782 ΡΙΡΑΡΝΙΡΟ ЗЕО Ю Νο: 49 ϋΡΒ1 0401
21 866 ίΤΙϋΡΙΝΐΤ ЗЕО Ю Νο: 50 ϋΡΒ1 0401
22 891 ίΤΙϋΡΙΝίΤ ЗЕО Ю Νο: 51 ϋΡΒ1 0301, ΘΡΒ1 1501
23 954 ΥΕΝδδΤΑΡδ ЗЕО Ю Νο: 52 ΟΡΒ1 0401, ϋΡΒ1 1101
24 955 ΡΝ55ΤΑΡ38 ЗЕО Ю Νο: 53 ϋΡΒ1 0401
25 976 ΡΘΝΝΘδΘΙδ ЗЕО Ю Νο; 54 ЭРВ1 0401
26 1000 ΥΟΝΡΘΟΐδδ 8ΕΟ ΙΟ Νο. 55 ϋΡΒ1 0101, ϋΡΒ1 0801, ϋΡΒ1 1101, ϋΡΒ1 1501
27 1003 ΡΘΟίδδΟΡδ ЗЕО Ю Νο: 56 ϋΡΒ1 0401
28 1020 ΡΑΝΡΟΙΐΡΡ ЗЕО Ю Νο: 57 □ΡΒ1 0801
29 1025 ΙΙΡΡβνΑδν 8Ε0 Ю Νο: 58 θρβι 1301
30 1037 ΡΑΝΙΘΤΝίΑ 8Е<2 Ю Νο: 59 ΘΡΒ1 0401, ϋΡΒ1 1101
- 53 022203
Таблица 3. Предсказанные человеческие ί'.Ό8+ Т-клеточные эпитопы К.\'1753с
I Номер предсказан- ΗΟΓοΘϋβ 1 эпитопа Положение амино- кислоты Последова- тельность эпитопа 8ЕО ГО Νο: НЬА аллель
1 2 ΝΡδνίΡΡΕΙ 5ЕО ГО Νο: 60 А24
2 5 νίΡΡΕΙΝ3Α 8ΕΩ ГО Νο: 61 А2, А 0201
3 6 Ι-ΡΡΕΙΝ5ΑΙ- ЗЕО ГО Νο: 62 В7, В8, В 3501,В51
4 8 ΡΕΙΝ5ΑΙ-ΙΡ ЗЕО ГО Νο: 63 В44
5 9 ΕΙΝ5ΑΙ.ΙΡΑ ЗЕО ГО Νο: 64 А 0201, А 0301
6 18 САСРЕРМАА ЗЕО ГО Νο: 65 А 0101, В 3501
Г Ξ 20 СРЕРМАААА ЗЕО ГО Νο: 66 В7, В 3501
8 22 ЕРМААААТА ЗЕО ГО Νο: 67 В7, В 0702, В8, В 3501, В51
9 26 АААТА1ЛГОС1 3ΕΟ ΙΟ Νο: 68 А1, В8, В 3501
10 28 АТА1ЛГОС1 АМ ЗЕО ГО Νο: 69 В7
11 30 АЖКЗЬАМЕЬ ЗЕО ГО Νο: 70 А1, А 2402, В44, Си 0602
12 33 ΟΙΑΜΕίΑδΑ ЗЕО ГО Νο: 71 А 0101, А 0301, А2, А 0201
13 34 1АМЕ1А5АА ЗЕО ГО Νο: 72 АЗ, А 0301, В51
14 48 νΤδΟίνΟΟΑ ЗЕО ГО Νο: 73 А 0101, А 0301
15 64 ΑΜΑΑΑΑΑΡΥ ЗЕО ГО Νο: 74 А1, АЗ, А 0301, А 0101, В 4403
16 66 ΑΑΑΑΑΡΥΑΑ ЗЕО ГО Νο. 75 А 0301, В 3501
17 68 ΑΑΑΡΥΑΑ\Λ/1 ЗЕО ГО Νο: 76 А1,А24, В 3501, В51
18 69 ΑΑΡΥΑΑ\Μ Α ЗЕО ГО Νο: 77 А1, А 0301, В 3501
19 70 ΑΡΥΛΑννίΑΑ ЗЕО ГО Νο: 78 АЗ, А 0301, В7, В 0702, В8, В 3501
20 72 ΥΑΑΙΛ/ίΑΑΑΑ ЗЕО ГО Νο: 79 А 0301, В8, В 3501
21 73 ААЖААААУ ЗЕО ГО Νο: 80 А2, А 0201, В7, В51
22 75 ννίΑΑΑΑνΟΑ ЗЕО ГО Νο: 81 А2, АЗ, А 0201
23 82 ΟΑΕΟΤΑΑΟΑ ЗЕО ГО Νο: 82 А1, А 0301
24 83 ΑΕΟΤΑΑΟΑΑ ЗЕО ГО Νο: 83 В44, В 4403
25 86 ΤΑΑΟΑΑΑΜΙ ЗЕО ГО Νο: 84 АЗ, В8, В51
26 91 ΑΑΜΙΑΕΡΕΑ ЗЕО ГО Νο: 85 А 0201, А 0301, В„3501
27 92 ΑΜΙΑΕΡΕΑν ЗЕО ГО Νο: 86 А2, А 0201
28 95 ΑΕΡΕΑνΚΤΑ ЗЕО ГО Νο: 87 В44
29 97 ΡΕΑνΚΤΑ\Λ/ ЗЕО ГО Νο: 88 В8, В44
30 98 ΕΑνΚΤΑΥΛ/Ο ЗЕО ГО Νο: 89 В8, В 3501
31 101 ΚΤΑννΟΡΜί ЗЕО ГО Νο: 90 А 0101, А 0201
32 106 ΟΡΜΙΛ/ΑΑΝΒ ЗЕО ГО Νο: 91 АЗ, В7, В 0702, В 3501, В51
33 107 ΡΜίΛ/ΑΑΝΚΑ ЗЕО ГО Νο: 92 А2, А 0201, В8
34 109 ίΛ/ΑΑΝΚΑΟΙ. ЗЕО ГО Νο: 93 В7
35 112 ΑΝΚΑΟίΛ/Βί ЗЕО ГО Νο: 94 В7, В44
36 114 ΗΑϋΐνβίνΜ ЗЕО ГО Νο: 95 В7, В 3501
37 118 ν3Ι.νΜ3ΝΙ.Ρ ЗЕО ГО Νο: 96 А24, А 0101
38 124 ΝΙ-ΡΟΟΝΑΡΑ ЗЕО ГО Νο: 97 А2
39 130 ΑΡΑΙΑΑΙΕΑ ЗЕО ГО Νο: 98 В7, В 3501
40 132 ΑΙΑΑΙΕΑΤΥ ЗЕО ГО Νο: 99 А1, А 0101, АЗ, А 0301
41 138 ΑΤΥΕΟΜννΑΑ ЗЕО ГО Νο: 100 АЛ01А2, А 0301
42 142 ΟΜννΑΑϋνβΑ ЗЕО ГО Νο: 101 А2, А 0201
43 150 ΑΜ5ΑΥΗΑΘΑ ЗЕО ГО Νο: 102 А2, А 0201
44 152 3ΑΥΗΑΟΑ3Α ЗЕО ГО Νο: 103 В7, В 3501
45 153 ΑΥΗΑΟΑ3ΑΙ ЗЕО ГО Νο: 104 А1.А 0201, АЗ, А 2402, А 0301, А24
46 157 ΘΑ8ΑΙΑ3ΑΙ. ЗЕО ГО Νο: 105 В7, В 3501
47 160 ΑΙΑ3Α1.5ΡΡ ЗЕО ГО Νο: 106 А„0301, В7
48 164 Α1-5ΡΡ5ΚΡΙ ЗЕО ГО Νο: 107 А 0101, А2, А 0201
49 167 РРЗКРЮЫЬ ЗЕО ГО Νο: 108 А24, А 2402, Си 0401
50 170 ΚΡίΟΝίΑΘΙ. ЗЕО ΙϋΝο: 109 В7, В.35О1, В51
51 174 ΝΙ Α<3Ι ΡΑννΐ ЗЕО ГО Νο: 110 А2, А 0201, В7, Си 0602
- 54 022203
52 175 ίΑΟίΡΑννίΑ ЗЕО Ю Νο: 111 Α 0101, Α 0301
53 178 1 РАМ1 А5СА ЗЕО ΙΟ Νο: 112 Β7, Β 3501
54 181 ЖАЗСАРАА ЗЕОГОНо: 113 Α 0201
55 185 САРАААМТА ЗЕО ΙΟ Νο: 114 АЗ, Α 0301, Β8
56 186 АРАААМТАА ЗЕО Ю Νο: 115 АЗ, Β 3501, Β7
57 189 ΑΑΜΤΑΑΑΘΙ 3ΕΟ ΙΟ Νο: 116 Α1, Α 2402, Β51
58 192 ΤΑΑΑΘΙΡΑί 3ΕΟ ΙΟ Νο: 117 Β7, Β51, Сад 0602
59 193 ΑΑΑΘΙΡΑίΑ 3ΕΟΙΟΝο: 118 Α 0101, Α 0301
60 199 А1АССРТА1 ЗЕО Ю Νο: 119 Α1, Α 0101, Α2,Α 0201, Α 0301
61 201 ΑΘΘΡΤΑΙΝί ЗЕО Ю Νο: 120 Α1, Α24, Β51
62 203 ΘΡΤΑΙΝίΘΙ ЗЕО Ю Νο: 121 Α 2402, Β7, Β 0702, Β8, Β 3501, Β51
63 206 ΑΙΝίΟΙΑΝν 3ΕΟ ΙΟ Νο: 122 Α2, Α 0201
64 231 ΝΑΝίΟΝΥΝΡ ЗЕО Ю Νο: 123 Α24, Β 3501
65 236 ΝΥΝΡΘ3ΘΝΡ ЗЕО Ю Νο: 124 Α24
66 263 ΝίΘΒΝΝνΘν 3ΕΟ ΙΟ Νο: 125 Α2, Α 0201
67 383 3ίΝΤΘ3ΥΝΜ ЗЕО Ю Νο: 126 Α2
68 408 ΝΑΝΤΘΡΙΝΑ ЗЕО Ю Νο: 127 Α 0101, Α 0301
69 413 ΡίΝΑΘΝΙΝΤ ЗЕО Ю Νο: 128 Α2
70 418 ΝΙΝΤΟνΡΝΙ ЗЕО Ю Νο: 129 Α 0201, Α 0301
71 447 ΘνΘΘΘβίΟΡ 3ΕΟ ΙΟ Νο: 130 Β7, Β 3501
72 456 31ΤΤΡΟΙΤΙ ЗЕО Ю Νο: 131 Α 0101, Α 0201, Α 0301
73 459 ΤΡΟΠΊΡΡΙ- 3ΕΟ ΙΟ Νο: 132 Β7, Β 3501, Β51
74 461 ϋΐ τι ρρι αι ЗЕО Ю Νο: 133 Α 0101, Α 0201
75 466 ΡίΘΙΡΘΙβν ЗЕО Ю Νο: 134 Α 0201
76 469 ΙΡΟΙβνΡΑΡ ЗЕО Ю Νο: 135 Β7, Β 3501
77 471 ΘΙ3νΡΑΡ3ί ЗЕО Ю Νο: 136 Α 0101, Α 0201, Α 0301, Β44
78 474 ΎΡΑΡ5ίΡΑΙ ЗЕО Ю Νο: 137 Β7, Β51
79 476 ΑΡ3ίΡΑ1Τί 3ΕΘ Ю Νο: 138 Α 0201, Α24, Β7
80 479 ίΡΑΙΤίΡ3ί ЗЕО Ю Νο: 139 Α24, Β7, Β 3501, Β51, Β 0702, Сад 0401, Сад 0602
81 481 ΑΙΤίΡ5ίΝΙ 3ΕΟ ΙΟ Νο: 140 А 0101, А 0301
82 483 ΤίΡβίΝΙΡΑ ЗЕО Ю Νο: 141 А2, А 0201, А 0301
83 484 ίΡ3ίΝΙΡΑΑ ЗЕО Ю Νο: 142 В7, В 3501, В51
84 492 ΑΤΤΡΑΝΠΛ/ ЗЕО Ю Νο: 143 А1, А 0101, А2, А 0201
85 494 ΤΡΑΝΙΤνΟΑ ЗЕО Ю Νο: 144 В7, В 3501
86 497 ΝΙΤΥΘΑΡ3ί 3ΕΘ Ю Νο: 145 А2, А 0201, А 0301, А24
87 502 ΑΡδίΡΘίΤί ЗЕО Ю Νο: 146 А24, А 2402, В7
88 505 ίΡΘίΤίΡβί ЗЕО Ю Νο: 147 В7, В 3501, В51, В 0702, Сад 0602
89 509 ΤίΡΒίΝΙΡΑ 3ΕΟ ΙϋΝο: 148 А2
90 518 ΑΤΤΡΑΝΠΛ/ ЗЕО Ю Νο: 149 А1, А2
91 523 ΝΙΤ\/ΘΑΡ5ί 3ΕΟ Ю Νο: 150 А2, А24.А 0201
92 528 ΑΡ5ίΡΘίΤί ЗЕО Ю Νο: 151 А 2402, В7
93 531 ίΡΘίΤίΡδί ЗЕО Ю Νο: 152 В7, В 0702, В 3501, В51, Сад 0602
94 535 ΤίΡ5ίΝΙΡΑ ЗЕО Ю Νο: 153 А2
- 55 022203
95 544 ΑΤΤΡΑΝΙΤν ЗЕО Ю Νο: 154 Α1, Α2
96 549 ΝίτνοΑΡδί. ЗЕО Ю Νο: 155 Α2, Α24, Α 0201
97 554 ΑΡδίΡΟίΤί ЗЕО Ю Νο: 156 Α 2402, Β7
98 557 ΕΡΟΙ_ΤΙ_Ρ3Ι_ δΕΟ Ю Νο: 157 Β7, Β 0702, Β 3501, Β51, Ονν 0602
99 561 ΤίΡδίΝΙΡΑ δΕΟ Ю Νο: 158 Α2
100 570 ΑΤΤΡΑΝΙΤν δΕΟ Ю Νο: 159 Α1, Α2
101 575 ΝΙΤνΟΑΡδΙ. δΕΟ Ю Νο: 160 Α2, Α24, Α 0201
102 580 ΑΡδίΡΟΠΊ. δΕΟ Ю Νο: 161 Α 2402, Β7
103 583 ι_ροι_τι_ρδΐ_ δΕΟ Ю Νο: 162 Β7, Β 0702, Β 3501, Β51, Ονν 0602
104 587 ΤίΡδίΝΙΡΑ 8ΕΟ Ю Νο: 163 Α2
105 596 ΑΤΤΡΑΝΙΤν 8ΕΟ Ю Νο: 164 Α1, Α2
106 601 ΝΙΤνΟΑΡδΙ. δΕΟ Ю Νο: 165 Α2, Α24
107 609 ίΡΟίΤίΡδί ЗЕО Ю Νο: 166 Β7, Β_0702, Β_3501, Β51, Ονν 0602
108 622 ΑΤΤΡΑΝΙΤν ЗЕО Ю Νο: 167 Α1, Α2
109 625 ΡΑΝΙίνδΘΡ δΕΟ ΙΟ Νο: 168 Α24, Β 3501
110 627 ΝΙΤνδΘΡΟί ЗЕО Ю Νο: 169 Α 0201, Α 0301
111 635 ι,ρρί-δίρδν ЗЕО ΙΟ Νο: 170 Β7, Β51
112 636 ρρι,δίΡδνΑ ЗЕО Ю Νο: 171 Β7, Β 3501
113 640 ΙΡδνΑΙΡΡν ЗЕО Ю Νο: 172 Β7, Β51
114 645 ΙΡΡντνΡΡΙ ЗЕО Ю Νο: 173 Β7, Β51
115 650 νΡΡΙΤνΟΑΡ 3Ε0 ΙΟ Νο: 174 Β7, Β 3501
116 662 ΡΙ<2ΙΡΕνΤΙ ЗЕО Ю Νο: 175 Α 0201
117 665 ΙΡΕνΤΙΡΟΙ. ЗЕО Ю Νο: 176 Β7, Β 3501, Β51
118 669 ΤΙΡΟΙ.ΤΙΡΑ ЗЕО Ю Νο: 177 Α 0201, Α 0301
119 673 ίΤΙΡΑΟΙΤΙ ЗЕО Ю Νο: 178 Α 0101, Α 0201, Β51
120 678 ΟΙΤΙΟΟΡδί ЗЕО Ю Νο: 179 Α 0101, Α 0201, Α 0301
121 686 ίΡΑΙΗΤΟΡΙ ЗЕО Ю Νο: 180 Β7, Β8, Β51
122 688 ΑΙΗΤΟΡΙΤν ЗЕО Ю Νο: 181 Α 0101, Α 0201 ,Α 0301
123 693 ΡΙΤνΘΟΙΘν ЗЕО Ю Νο: 182 Α 0201
124 698 αιονοοροι. δΕΟ Ю Νο: 183 Α 0201
125 705 ΟίΡδίοννϋν ЗЕО Ю Νο: 184 Α2,Α 0201
126 706 ίΡδίοννονρ 3ΕΟ ΙΟ Νο. 185 Β7, Β 3501
127 712 ονρί,δτρκι ЗЕО Ю Νο: 186 Α 0201
128 714 ΡίδΤΡΚΙΤν ЗЕО Ю Νο: 187 Α 0101, Α2,Α 0201, Β8
129 717 ΤΡΡΙΤνΡΑΡ ЗЕО Ю Νο: 188 Β7, Β8, Β 3501
130 725 ΡΟΙΡΡΤίΟΡ ЗЕО Ю Νο: 189 Α 0201, Β8, Β 3501
131 729 ΡΤίΟΡΟΤΝν ЗЕО Ю Νο: 190 Α 0101, Α2,Α 0201
132 732 ΟΡΟΤΝνΡΑί ЗЕО Ю Νο: 191 Α24
133 739 ΑίΟΡΡΟΘΟί ЗЕО Ю Νο; 192 Α 0101, Α 0201
134 747 ίδΤΡΤΝΟΑί δΕΟ Ю Νο: 193 Α 0101, Β7
135 748 δΤΡΤΝΘΑίΙ ЗЕО Ю Νο: 194 Α 0101, Α 0201, Α 0301, Α24
136 749 ΤΡΤΝΟΑίΙΡ ЗЕО Ю Νο: 195 Α24
137 754 ΑίΙΡΘΕΡϋί ЗЕО Ю Νο: 196 Α„0101, Α2,Α 0201
138 758 ΟΕΡϋίΡΟίν ЗЕО Ю Νο: 197 Β44
139 762 ίΡΟίννΗΡΥ ЗЕО Ю Νο: 198 Β7, Β51
- 56 022203
140 764 ΟίννΗΡΥΠ ЗЕО Ιϋ Νο: 199 Α 0101, Α2, Α 0201, Β8
141 768 ΗΡΥΠΤΘΡΙ 3ΕΟ Ιϋ Νο: 200 Β7, Β8, Β51
142 770 ΥΠΤΘΡΜ 3ΕΘ ΙΟ Νο: 201 Α 0101, Α2,Α 0201
143 774 ΘΡΜΘ3ΡΡ ЗЕО Ιϋ Νο: 202 Α24, Β7, Β 3501
144 775 ρινιοερρι ЗЕО Ю Νο: 203 Α 0101, Α 0301
145 780 3ΡΡΙ.ΡΑΡΝΙ 5ЁО Ю Νο: 204 Α24
146 783 ίΡΑΡΝΙΡΘΙ ЗЕО Ю Νο: 205 Β7, Β51
147 788 ΙΡΟΙϋνΡΑΙ ЗЕО Ιϋ Νο: 206 Β7, Β51
148 790 ΘΙϋνΡΑΙΝν 3ΕΟ ΙΟ Νο: 207 Α 0101, Α 0201, Α 0301
149 793 νΡΑΙΝνϋΘΡ ЗЕО ΙΟ Νο: 208 Β7, Β 3501
150 795 ΑΙΝνϋΘΡΠ 8ΕΘ ΙΟ Νο: 209 Α 0101, Α 0201, Α 0301, Β44
151 802 ΠΡΘΙΤΤΡΑ 5Ε0 Ιϋ Νο: 210 Α2
152 803 Ι-ΡΟΠΤΡΑΙ 3ΕΟ ΙΟ Νο: 211 Β7, Β8, Β51
153 808 ΤΡΑΙΤΤΡΕΡ ЗЕО Ιϋ Νο: 212 Β7, Β 3501
154 810 ΑΙΤΤΡΕΡΑΙ 3ΕΘ ΙΟ Νο: 213 Α 0101, Α 0201,Α 0301
155 813 ΤΡΕΡΑΙΡΡΙ 3ΕΟ ΙΟ Νο: 214 Β7, Β51
156 818 ΙΡΡΙΟνΘΘΡ 5ЕС1 ΙΟ Νο: 215 Β7, Β 3501
157 820 ΡΙΘνΘΘΡΠ ЗЕО Ю Νο: 216 Α 0101, Α 0201, Α 0301
158 828 ίΡΘΙΤΤΟΕΙ ЗЕО Ю Νο: 217 Β7, Β51
159 829 ροιττθειι ЗЕО Ιϋ Νο: 218 Α 0101
160 835 ЕНТРЕ1-Т1 ЗЕО Ю Νο: 219 Α 0101, Α 0201, Α 0301
161 838 ΤΡΕΙ.ΤΙΝ5Ι ЗЕО Ю Νο: 220 Β7, Β51
162 840 ΕΙ ΤΙΝ3ΙΘν 3ΕΟ Ю Νο: 221 Α 0201
163 845 δίΘνοορπ 5ΕΘ ΙΟ Νο: 222 Α 0201,Α 0301
164 853 ίροιπρρι ЗЕО Ю Νο: 223 Β7, Β51
165 858 ΤΡΡΙΤΤΡΡί ЗЕО Ю Νο: 224 Β7, Β 3501, Β51
166 860 ΡΙΤΤΡΡίΤΙ ЗЕО Ιϋ Νο: 225 Α 0101, Α 0201, Α 0301
167 863 ΤΡΡίΤΙϋΡΙ ЗЕО Ю Νο: 226 Β7, Β51
168 870 ΡΙΝίΤΘΡΤί 3Ε<2 Ιϋ Νο: 227 Α 0101, Α 0301
169 913 ΤΡΡίΤΙΕΡΙ ЗЕО Ю Νο: 228 Β7, Β51
170 915 ΡίΤΙΕΡΙΟν ЗЕО Ю Νο: 229 Α 0101, Α 0201
171 918 ΙΕΡΙΟνΟΟΡ ЗЕО Ю Νο: 230 Β44
172 929 ΡΡίΤνΡΘΙΗ 3Ε<3 ΙΟ Νο: 231 Β 3501
173 930 ΡίΠ/ΡΘΙΗί 3ΕΟ ΙΟ Νο: 232 Α 0101, Α 0201
174 935 ΘΙΗίΡδΤΤΙ ЗЕО Ю Νο: 233 Α 0101, Α 0301
175 937 трзттюА 3ΕΟ ΙΟ Νο: 234 Α2
176 938 ίΡ3ΤΤΙΟΑΡ 5ΕΟ ΙΟ Νο: 235 Β7, Β8, Β 3501
177 946 ΡΑΙΡΘΘΡΘΥ 8ЕС5 ГО Νο: 236 Α 0101, Α 0301, Β 3501
178 958 3ΤΑΡ35ΘΡΡ ЗЕО Ιϋ Νο: 237 Α1,Α 0101, Α24
179 986 \Λ/ΡΝΤΝΡΑΘί ЗЕО Ιϋ Νο: 238 Α24
180 1002 ΝΡΘΘί53ΘΡ ЗЕО Ιϋ Νο: 239 Α24
181 1005 Θί33ΘΡ3Νί ЗЕО Ιϋ Νο: 240 Α 0101, Α2,Α 0201
182 1012 ΝίΘ5Θν3ΘΡ ЗЕО Ιϋ Νο: 241 Α 0201
183 1020 ΡΑΝΚΘΙίΡΡ ЗЕО Ιϋ Νο: 242 Β8, Β 3501
184 1022 ΝΚΟΙίΡΡ3ν ЗЕО Ιϋ Νο: 243 Α2, Α24, Β51
185 1025 ΙΙ ΡΡ5νΑ3ν ЗЕО Ιϋ Νο: 244 Α2, Α 0201
186 1026 ίΡΡ3νΑ5νν ЗЕО Ιϋ Νο: 245 Β7, Β51
187 1029 3νΑ5\Λ/3ΘΡ ЗЕО Ιϋ Νο: 246 Α24, Β7
188 1036 ΘΡΑΝΙΘΤΝί ЗЕО Ю Νο: 247 Α24, С» 0401, С» 0602
Как можно видеть из табл. 2 и 3, Ку1753с содержит ряд предсказанных СЭ4+ и СЭ8 Т-клеточных эпитопов. Кроме того, на основании этой информации предполагают, что белок несет эпитопы, которые могут распознаваться НЬА, встречающимися по всему миру (то есть НЬА у представителей белой европеоидной расы, Африки, Азии или Латинской Америки - см. вебсайт \у\у\у.а11е1еГгес|иепс1е8.пе1).
Пример 3. Гомологи Н37КУ
Последовательности Ку1753с из ряда штаммов М. !иЬегси1о818 и БЦЖ идентифицировали, используя систему поиска ВЬАЗТР ОепВапк (инвентарный номер эталонной последовательности Н37Ку УР_177830.1):
Штамм Инвентарный номер % идентичности
СОС1551 ΝΡ_336255.1 95
Ρ11 ΥΡφΟ1287714.1 80
НааНет ΖΡ_02247061.1 82
С ΖΡ_00878894.1 96
БЦЖ ΥΡ 977884.1 83
Выравнивание гомологичных последовательностей указывает на высокий уровень идентичности в Ν-концевых и С-концевых областях, причем наибольшая вариация имеет место в центральном связывающем участке.
- 57 022203
Биологические анализы
Количественное определение Т-клеточных ответов на Ку1753е
Можно провести скрининг полипептидов по их способности активировать Т-клетки (индукцию пролиферации и/или продуцирование цитокинов) в мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС) или в препаратах цельной крови от инфицированных (например, пораженных латентной инфекцией) индивидуумов.
Пораженных латентной инфекцией индивидуумов обычно идентифицируют по кожной пробе, которая имеет диаметр более 10 мм и протекает бессимптомно, при отсутствии положительного ответа на М!Ь (М. !иЬетси1ок1к) в посеве, при отрицательном ответе мокроты и при отсутствии какого-либо поражения (по результатам рентгенограммы грудной клетки).
Можно использовать ряд анализов ш νίΙΐΌ, основанных на применении образцов РВМС или цельной крови: после рестимуляции в присутствии антигена (или его варианта/иммуногенного фрагмента, как целесообразно) можно определить пролиферацию клеток (как измерено с использованием СΡ8Ε/проточной цитометрии) или количественно оценить продуцирование цитокинов (присутствующих в супернатанте культивируемых клеток и измеренных посредством ЕЫ8А, или, после внутриклеточного окрашивания ί'Ό4 и СЭ8 Т-клеток и анализа посредством проточной цитометрии).
Например, образцы РВМС можно получить из гепаринизированной цельной крови центрифугированием в градиенте плотности фиколл/гипак, следуя стандартным процедурам. Затем клетки можно промыть и заморозить в жидком азоте до проведения тестирования (для дополнительных деталей см. Ьакат А е! а1. 1. Мес!. ϋΐδ., 1999, 180: 1656-1664).
Т-клеточная пролиферация
Специфический иммунный ответ можно охарактеризовать путём проведения анализа пролиферации лимфоцитов с использованием меченного тритием тимидина. В этом методе оценивают размножение клеток после стимуляции антигеном ш νίΙΐΌ. На практике клеточную пролиферацию определяют, оценивая включение меченного тритием тимидина в ДНК, процесс, тесно связанный с последующими изменениями в количестве клеток.
Более подходит, если пролиферацию лимфоцитов можно провести с использованием сукцинимидилового эфира карбоксифлуоресцеин-диацетата (Ο’ΡδΕ). СΡ8Ε спонтанно и необратимо связывается как с внутриклеточными белками, так и белками клеточной поверхности путём взаимодействия с боковыми цепями лизина и другими доступными аминогруппами. Когда клетки лимфоцитов делятся, мечение СΡ8Ε распределяется в равной мере между дочерними клетками, флуоресценция которых ввиду этого составляет половину от флуоресценции родителей. В результате деление пополам клеточной флуоресценции маркирует каждое последующее поколение в популяции пролиферирующих клеток и легко отслеживается с помощью проточной цитометрии (для дополнительных деталей см. Нобдкшк Р.Э., е! а1., 1. Εχρ. Меб., 1996, 184:277-281).
Практически, после оттаивания РМВС могут быть промыты и окрашены СΡ8Ε, после чего подвергнуты культивированию (2 χ 105 клеток) в течение 72 ч с антигеном (10 мкг/мл) в культуральных средах (КРМЫ640, дополненной глутамином, несущественной аминокислотой, пируватом и инактивированной нагреванием человеческой АВ сывороткой). Затем клетки могут быть собраны и их фенотип охарактеризован с использованием окрашивания поверхности для идентификации ί'Ό8 и СЭ4+ Т-клеток памяти. После этого можно использовать проточный цитометрический анализ для выявления степени пролиферации лимфоцитов в ответ на каждый антиген (доли клеток с пониженной интенсивностью СΡ8Ε после стимуляции ш νίΙΐΌ).
Продуцирование цитокинов
Продуцирование ΙΡΝ-γ (или продуцирование других цитокинов, таких как, например, ΙΕ2, ΤΝΡальфа, ΙΕ5, Ш12 и так далее) можно измерить, используя твердофазный иммуноферментный анализ (ΕΕΙδΑ). ΕΕΙδΑ-планшеты могут быть покрыты мышиными моноклональными антителами против человеческого ΙΡΝ-γ (РЬатМшдеп, Зап 01едо, СА) в РВЗ (забуференном фосфатом физиологическом растворе) в течение четырех часов при комнатной температуре. Затем лунки блокируют, используя РВЗ, содержащий 5% (мас./об.) нежирного сухого молока, в течение 1 ч при комнатной температуре. Потом планшеты промывают, например шесть раз в смеси РВЗ/0,2% Твин-20, и образцы, разведенные 1:2 в культуральной среде в БЕША-планшетах, инкубируют в течение ночи при комнатной температуре. Планшеты снова промывают, и в каждую лунку можно добавить поликлональную кроличью сыворотку против ΙΡΝ-γ человека, например, разведенную 1:3000 в смеси РВЗ/10% нормальной козьей сыворотки. Затем планшеты инкубируют в течение двух часов при комнатной температуре, промывают, и можно добавить конъюгированные с пероксидазой хрена анти-кроличьи ^О (З1дша СНет1са1 Зо., З!. Ьошк, МО), например, в разведении 1:2000 в смеси РВЗ/5% нежирного сухого молока. По окончании следующих двух часов инкубации при комнатной температуре планшеты промывают и добавляют субстрат ТМВ (тетраметилбензидин). Реакция может быть остановлена через 20 мин добавлением 1 н. серной кислоты. Затем можно определить оптическую плотность (ΟΌ) при 450 нм, используя 570 нм в качестве длины волны сравнения. Обычно, фракции, дающие в обоих повторах величину ΟΌ, в два раза превышающую среднюю величину
- 58 022203
ОЭ для клеток, культивируемых в одной только среде, могут считаться положительными.
Пример 4. Иммуногенность на СВ6Р1 мышах
Иммуногенность антигена оценивали на СВ6Р1 мышах (первое поколение скрещенных ВАЬВ/с и С57ВБ/6 мышей).
СВ6Р1 мышей иммунизировали внутримышечно три раза (на 0-е сутки, 14-е сутки и 28-е сутки) 0,5 или 2 мкг белкового антигена в комбинации с адъювантной системой А801Е (липосомная адъвантная композиция, содержащая 3О-МРЬ и 0821).
Использовали следующий план эксперимента:_
Группа 0-е сутки 14-е сутки 28-е сутки
1 2 мкг Κν1753ο/Α501Ε 2 мкг Еу1753с/А501Е 2 мкг Ву1753с/А801Е
2 0,5 мкгРМ753с/А501Е 0,5 мкг Ку1753с/А801Е 0,5 мкг Ην1753ο/Α301Ε
В каждой группе в протоколе суммарно использовали 24 мыши.
Лимфоциты периферической крови (РВЬ) собирали и объединяли в пулы на 21-е сутки (то есть через 7 суток после второй иммунизации) и 35-е сутки (то есть через 7 суток после третьей иммунизации) и измеряли антиген-специфические СЭ4 и СЭ8 Т-клеточные ответы (как определяли по количеству СЭ4 или СЭ8 Т-клеток, продуцирующих 1Ь-2, и/или ΙΡΝ-гамма, и/или ТМР-альфа) посредством проточной цитометрии после рестимуляции ш уНго в течение ночи пулами 15-мерных пептидов, охватывающих представляющие интерес последовательности.
Детекцию мышиных Т-клеток, которые экспрессируют ΙΕ-2 и/или ΙΡΝ-гамма, и/или ТМР-альфа, выполняли, используя кратковременную инициируемую антигеном амплификацию экспрессии цитокинов.
Вкратце, к гепаринизированной периферической крови мышей добавляли раствор РкагтЬуке (ВЭРкагттдеп), чтобы лизировать эритроциты. Полученные РВЬ (лимфоциты периферической крови) промывали и затем инкубировали в присутствии пула 15-мерных пептидов - перекрывающихся по 11 аминокислотам - охватывающих последовательность представляющего интерес антигена, и 1 мкг/мл антител к СЭ28 и СЭ49Й (ВО-Ркагннпдеп). Каждый 15-мерный пептид использовали в конечной концентрации 1 мкг/мл. Контроли со средой также стимулировали антителами к СЭ28 и СЭ49Й.
Блокирующее секрецию цитокинов соединение брефелдин-А (ВО-Ркагттдеп) добавляли через 2 ч после начала культивирования при 37°С, 5% СО2 и клетки поддерживали при 37°С, 5% СО2 в течение следующих 4 дополнительных часов после инкубации в течение ночи при +4°С.
Затем клетки собирали и окрашивали, используя связанные с РасШс В1ие антитела против СЭ4 (ВО клон КМ4-5, ВО-Ркапшпдеп) и связанные с комплексом перидинин-хлорофилл-белок А (РегСр) цианина5.5 (Су5.5) антитела против СЭ8 альфа (клон 53-6.7, ВО-Ркагтшдеп).
Затем клетки промывали, фиксировали, подвергали пермеабилизации (набор Су!ойх-су!орегт, ВЭРкагттдеп) и окрашивали, используя аллофикоцианин-связанные антитела против ΙΡΝ-д (клон ХМО1.2, ВОРкагтюдеп), флуоресцеин-изотиоцианат(ЫТС)-связанные антитела против ΙΕ-2 (клон 1Е8 6-5Н4, Весктап Соикег) и фикоэритрин(РЕ)-связанные антитела против ТНР-альфа (клон МР6-ХТ22, ВЭРкагтщдеп). После последних промывок окрашенные клетки анализировали на проточном цитометре Ь8К ΙΙ (ВескЮп-Эюкпъоп). В СЭ8+ подгруппе данные собирали минимум для 10000 клеток.
Для дополнительной информации см. \Уа1/ег Т. е! а1., Се11 ^шипоР, 2000, 206(1): 16-25 и Маескег НТ е! а1., 1. Iттиηο1. Ме!коЙ5, 2001, 255(1-2): 27-40.
В качестве отрицательных контролей некоторые клетки также культивировали ш уНго в течение ночи в культуральной среде (не стимулировали). Антиген-специфические ответы рассчитывали путём вычитания среднего цитокинового ответа, произведенного нестимулированными клетками, из среднего цитокинового ответа, произведенного пептид-стимулированными клетками.
В каждую временную точку и для каждой группы собирали данные от 4 пулов из 6 мышей в каждом. Приведенные ниже данные представлены в виде % СЭ4 или СЭ8 Т-клеток, продуцирующих ΙΕ-2 и/или ΙΡΝ-гамма, и/или ТНР-альфа. На диаграмму наносили данные для каждого индивидуального пула мышей (треугольники), а также среднюю величину в группе (штрих).
На фиг. 1 показано, что на 21-е сутки (то есть через 7 суток после второй иммунизации) Рν1753сспецифические СЭ4 и СЭ8 Т-клеточные ответы детектируются у мышей, иммунизированных любой из двух доз Ку1753с/А801Е. Уровни Рν1753с-специфических Т-клеточных ответов оказываются выше у мышей, иммунизированных 2 мкг Ку1753с/А801Е, чем у мышей, иммунизированных 0,5 мкг Ку1753с/А801Е.
На фиг. 2 показан цитокиновый профиль СЭ4 Т-клеточного ответа из РВЬ, стимулированных пулом пептидов из Ку1753с, (без вычета данных для среды) на 21-е сутки (то есть через 7 суток после второй иммунизации).
На фиг. 3 показан цитокиновый профиль СЭ8 Т-клеточного ответа из РВЬ, стимулированных пулом пептидов из Ку1753с, (без вычета данных для среды) на 21-е сутки (то есть через 7 суток после второй иммунизации).
- 59 022203
На фиг. 4 показано, что на 35-е сутки (то есть через 7 суток после третьей иммунизации) Ку1753сспецифические СЭ4 и СЭ8 Т-клеточные ответы детектируются у мышей, иммунизированных любой из двух доз Ку1753с/АЗ01Е. Уровни Ку1753с-специфических Т-клеточных ответов оказываются выше у мышей, иммунизированных 2 мкг Ку1753с/АЗ01Е, нежели у мышей, иммунизированных 0,5 мкг Ку1753с/АЗ01Е.
Третье введение повышает СЭ4 Т-клеточный ответ, наблюдаемый на 21-е сутки, в более низкой дозе 0,5 мкг, но не в высокой дозе антигена, равной 2 мкг. Антиген-специфический СЭ8 Т-клеточный ответ оказывается более низким на 35-е сутки, нежели на 21-е сутки.
На фиг. 5 показан цитокиновый профиль СЭ4 Т-клеточного ответа из РВЬ, стимулированных пулом пептидов из Ку1753с, (без вычета данных для среды) на 35-е сутки (то есть через 7 суток после третьей иммунизации). Ввиду технических трудностей данные для третьего пула клеток в дозе 2 мкг оказались не доступны.
На фиг. 6 показан цитокиновый профиль СЭ8 Т-клеточного ответа из РВЬ, стимулированных пулом пептидов из Ку1753с, (без вычета данных для среды) на 35-е сутки (то есть через 7 суток после третьей иммунизации). Ввиду технических трудностей данные для третьего пула клеток в дозе 2 мкг оказались не доступны.
Пример 5. Иммуногенность на С57ВЬ/6 мышах
Иммуногенность антигена также оценивали на С57ВЬ/6 мышах.
С57ВЬ/6 мышей иммунизировали внутримышечно три раза (на 0-е сутки, 14-е сутки и 28-е сутки) белковым антигеном (1 мкг или 4 мкг) в комбинации с адъювантной системой АЗ01Е (липосомной адъвантной композицией, содержащей 3О-МРЬ и ОЗ21).
Использовали следующий план эксперимента:
Группа 0-е сутки 14-е сутки 28-е сутки
1 4 мкг Κν1753ο/Α501Ε 4 мкг РУ1753с/А301Е 4 мкг РМ753с/А501Е
2 1 мкг Ρν1753ο/Α301Ε 1 мкг Ю1753с/А301Е 1 мкг Щ/1753с/А301Е
Лимфоциты периферической крови (РВЬ) собирали и объединяли в пулы на 21-е сутки (то есть через 7 суток после второй иммунизации) и 35-е сутки (то есть через 7 суток после третьей иммунизации) и измеряли антиген-специфические СЭ4 и СЭ8 Т-клеточные ответы (как определяли по количеству СЭ4 или СЭ8 Т-клеток, продуцирующих 1Ь-2, и/или ΙΡΝ-гамма, и/или ТИР-альфа) посредством проточной цитометрии после рестимуляции ш У1)го в течение ночи пулами 15-мерных пептидов, охватывающих представляющие интерес последовательности. Процедуру проводили, как описано ранее.
В качестве отрицательных контролей некоторые клетки также культивировали ш У1)го в течение ночи в культуральной среде (не стимулировали). Антиген-специфические ответы рассчитывали путём вычитания среднего цитокинового ответа, произведенного нестимулированными клетками, из среднего цитокинового ответа, произведенного пептид-стимулированными клетками.
В каждую временную точку и для каждой группы собирали данные от 4 пулов из 6 мышей в каждом. Приведенные ниже данные представлены в виде % СЭ4 или СЭ8 Т-клеток, продуцирующих 1Ь-2 и/или ΙΡΝ-гамма, и/или ТИР-альфа. На диаграмму наносили данные для каждого индивидуального пула мышей (треугольники), а также среднюю величину в группе (штрих).
На фиг. 7 показано, что на 21-е сутки (то есть через 7 суток после второй иммунизации) Ру1753сспецифические СЭ4 и СЭ8 Т-клеточные ответы детектируются у мышей, иммунизированных любой из двух доз Ку1753с/АЗ01Е. Уровни Ку753с-специфических СЭ4 Т-клеточных ответов одинаковы независимо от иммунизирующей дозы Ку1753с. И наоборот, мыши, иммунизированные 1 мкг Ку1753с/АЗ01Е, проявляли более сильные Ку1753с-специфические СЭ8 Т-клеточные ответы, чем мыши, иммунизированные 4 мкг Ку1753с/АЗ01Е.
На фиг. 8 показан цитокиновый профиль СЭ4 Т-клеточного ответа из РВЬ, стимулированных пулом пептидов из Ку1753с, (без вычета данных для среды) на 21-е сутки (то есть через 7 суток после второй иммунизации). Ввиду технических трудностей данные для первого пула клеток при дозе 1 мкг оказались не доступны.
На фиг. 9 показан цитокиновый профиль СЭ8 Т-клеточного ответа из РВЬ, стимулированных пулом пептидов из Ку1753с, (без вычета данных для среды) на 21-е сутки (то есть через 7 суток после второй иммунизации). Ввиду технических трудностей данные для первого пула клеток при дозе 1 мкг оказались не доступны.
Иммунологические данные на 35-е сутки все еще не были получены на момент времени, когда эта заявка была подготовлена.
Пример 6. Распознавание ш убто с использованием РВМС от людей с латентным ТВ
Эксперименты проводили с целью оценки ответа периферических Т-клеток, специфического в отношении антигена по изобретению, у 4 ранее не подвергавшихся ТВ здоровых взрослых (кожная проба РРО = 0 мм) и у 8 латентно инфицированных ТВ здоровых взрослых (кожная проба РРО = 15 мм или выше) из Южной Африки.
- 60 022203
Данные кожной пробы ΡΡϋ
Индивидуальный ГО (идентификационный) Диаметр уплотнения
номер (мм)
4 0
5 0
33 0
38 0
зе 15
46 15
13 15
7 16
58 25
74 26
8 53
60 55
Оценку клеточно-опосредованного иммунного (СМ1) ответа выполняли путём измерения цитокинов на выделенных мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС), используя анализ с внутриклеточным окрашиванием цитокинов (1СЗ).
Проводимый 1СЗ представлял собой адаптацию ранее описанной методологии (см. ЕксЬеп е! з1, Нит. νικαιι. 2009 5(7)). РВМС стимулировали ш \йго одним из пулов 15-мерных пептидов (с перекрыванием по 11 аминокислотам) охватывающих всю последовательность представляющего интерес антигена. Клетки стимулировали пептидами в течение 2 ч, затем культивировали в течение ночи в присутствии брефелдина А, обрабатывали для 1СЗ и анализировали с использованием проточной цитометрии. Измеряли частоту встречаемости антиген-специфических СИ3+СИ4+ или СИ3+СИ8+ Т-клеток, экспрессирующих ΙΡΝ-гамма, и/или ТОТ-альфа, и/или 1Ь-17. Из ответов, полученных в стимулированных пептидными пулами клетках, вычитали ответы стимулированных средой клеток.
1СЗ: антитела:
анти-СИ3 РО (1п\''Пгодеп - № по каталогу СИ0330), анти-СИ4 РВ (ВИ - № по каталогу 558116), анти-СИ8 АРС-Н7 (ВИ - № по каталогу 641400), анти-1РХд АР700 (В^-ΡЬа^т^нден - № по каталогу 557995), анти-ТОТ1 РЕ-Су7 (В^-ΡЬз^т^нден - № по каталогу 557647), анти-1Ь17 АР647 (В^-ΡЬа^т^нден - № по каталогу 51-7178-71).
Результаты представлены в виде числа антиген-специфических СИ3+СИ4+ Т-клеток, экспрессирующих ТХР-альфа и ΙΡΝ-гамма, на миллион СИ3+СИ4+ Т-клеток, поскольку эти клетки представляют основную популяцию антиген-специфических СИ4 Т-клеток (уровень фонового ответа, обусловленный средой, вычитают). Не было выявлено никаких антиген-специфических СИ3+СИ8+ Т-клеток. Фиг. 10 показывает, что антиген-специфический СИ4 Т-клеточный ответ определяется у 7 из 8 индивидуумов с латентной инфекцией (отсутствует у индивидуума под номером 60) в сравнении с неспецифическим СИ4 Т-клеточным ответом, измеренным у ранее не подвергавшихся инфекции индивидуумов.
В заключение можно отметить, что антиген Ку1753с способен вызывать иммунный ответ как у СВ6Р1, так и С57ВИ/6 мышей. Кроме того, профиль продуцирования цитокинов указывает, что большая часть антиген-специфических Т-клеток экспрессирует множество ТЬ1-ассоциированных цитокинов (то есть вызывает полифункциональный Т-клеточный ответ). Важно, что после иммунизации присутствуют как СИ4, так и СИ8 антиген-специфические Т-клетки, СИ8-клетки могут быть особенно важны в сценарии латентного ТВ. Значимость Ку1753с для инфекции человека подтверждается высоким уровнем распознавания у индивидуумов с латентной инфекцией из Южной Африки и отсутствием ответов у ранее не подвергавшихся инфекции субъектов. Поэтому ожидается, что Ку1753с будет иметь важное значение в предупреждении, лечении и диагностике латентной туберкулезной инфекции.
Хотя приведенное выше изобретение описано несколько подробно посредством иллюстраций и примеров для ясности понимания, среднему специалисту в данной области, благодаря разъяснениям в этом изобретении, будет очевидно, что некоторые изменения и модификации могут быть сделаны в нем без отклонения от сущности или объема прилагаемой формулы изобретения.
Все ссылки, относящиеся к данной заявке, в том числе патенты и заявки на патент, включены в данное описание посредством ссылки в максимально возможной степени, как если бы каждая отдельная публикация или заявка на патент были конкретно и отдельно указаны для включения посредством ссылки.
Во всем описании, реферате и формуле изобретения, которая следует далее, если контекст не требует иного, слово содержать и такие варианты, как содержит и содержащий, будут пониматься как
- 61 022203 означающие включение наличия указанных целого, стадии, группы целых или группы стадий, но не для исключения любого другого целого, стадии, группы целых или группы стадий.
<110> ГлаксоСмитКлайн Байолоджикалз с.а.,
Глаксо Труп Лимитед Меттенс, Паскаль Браун, Джеймс Мерфи, Деннис <120> НОВЫЕ КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ <130> УВ63087РСТ <150> 0861/083692 <151> 2009-07-25 <1б0> 249 <170> РаСепС1п νβΓΞίοη 3.5 <210> 1 <211> 1053 <212> ПРТ <213> МусоЪасСег1ит СиЬегси1оз1е <220 <221> М13С_ГЕАТиКЕ <223> Штамм Η37Κν <400> 1
Мер Азп РЬе Зег УаЬ Ьеи Рго Рго СЬи Пе Азп Зег АЬа Ьеи Пе РЬе
1 5 10 15
АЬа С1у АЬа СЬу Рго СЬи Рго МеС АЬа АЬа АЬа АЬа ТЫ АЬа Тгр Азр
20 25 30
СЬу Ьеи АЬа МеС СЬи Ьеи АЬа Зег АЬа АЬа АЬа Зег РЬе СЬу Зег УаЬ
35 40 45
ТЬг Зег СЬу Ьеи УаЬ СЬу СЬу АЬа Тгр СЬп СЬу АЬа Зег Зег Зег АЬа
50 55 60
МеС А1а АЬа АЬа АЬа АЬа Рго Туг АЬа АЬа Тгр Ьеи АЬа АЬа АЬа АЬа
65 70 75 Θ0
УаЬ СЬп АЬа СЬи СЬп ТНг АЬа АЬа СЬп АЬа А1а АЬа МеС Пе АЬа СЬи
35 90 95
РНе СЬи АЬа УаЬ Ьуз ТЬг АЬа УаЬ УаЬ СЬп Рго МеС Ьеи УаЬ АЬа АЬа
100 105 ПО
Азп Агд АЬа Азр Ьеи УаЬ Зег Ьеи УаЬ МеС Зег Азп Ьеи РЬе СЬу СЬп
115 120 125
Αξπ АЬа Рго АЬа 11е АЬа АЬа Пе СЬи АЬа ТЬг Туг СЬи СЬп МеС Тгр
130 135 140
А1а АЬа Азр УаЬ Зег АЬа МеС Зег АЬа Туг НЬз АЬа СЬу АЬа Зег АЬа
145 150 155 160
Не А1а Зег АЬа Ьеи 5ег Рго РНе Зег Ьуз Рго Ьеи СЬп Азп Ьеи АЬа
165 170 175
СЬу Ьеи Рго АЬа Тгр Ьеи АЬа Зег СЬу АЬа Рго АЬа АЬа АЬа МеС ТЬг
180 195 190
АЬа А1а А1а СЬу Не Рго АЬа Ьеи АЬа СЬу СЬу Рго ТЬг АЬа 11е Азп
195 200 205
Ьеи СЬу Пе АЬа Азп УаЬ СЬу С1у СЬу Азп УаЬ СЬу Азп АЬа Азп Азп
210 215 220
СЬу Ьеи АЬа Азп Пе СЬу Азп А1а Азп Ьеи СЬу Азп Туг Азп РЬе СЬу
225 230 235 240
- 62 022203
Зег С1у Азп РЬе СЬу 245 Азп Зег Азп Не СЬу 250 Зег АЬа Зег Ьеи СЬу 255 Азп
Азп Азп Не СЬу РЬе СЬу Азп Ьеи С1у Зег Азп Азп УаЬ СЬу УаЬ С1у
260 265 270
Азп Ьеи С1у Азп Ьеи Азп ТЬг СЬу РЬе АЬа Азп ТЬг СЬу Ьеи СЬу Азп
275 280 285
РЬе <31у РЬе СЬу Азп ТЬг С1у Азп Азп Азп 11е СЬу 11е СЬу Ьеи ТЬг
290 295 300
СЬу Азп Азп СЬп 1Ье СЬу 11е СЬу С1у Ьеи Αδη Зег СЬу ТЫ СЬу Азп
305 310 315 320
РЬе С1у Ьеи РЬе Азп Зег 51у Зег С1у Азп Уа1 СЬу РЬе РЬе Азп Зег
325 330 335
СЬу Азп 01у Азп РЬе СЬу 11е СЬу Азп Зег б1у Азп РЬе Азп ТЬг С1у
340 345 350
СЬу Тгр Азп Зег СЬу НЬз С1у Азп ТЬг СЬу РЬе РЬе Азп АЬа СЬу Зег
355 360 365
РЬе А5П ТЬг СЬу МеЬ Ьеи Азр УаЬ С1у Азп А1а Азп ТЬг СЬу Зег Ьеи
370 375 380
Азп Тпг С1у Зег Туг Азп МеГ СЬу Азр РЬе Азп Рго СЬу Зег Зег Азп
385 390 395 400
ТЬг С1у ТЬг РЬе Азп ТЬг С1у Азп А1а Азп ТЬг СЬу РЬе Ьеи Азп А1а
405 410 415
СЬу Агп 11е Азп ТЬг СЬу Уа1 РЬе Азп 11е С1у НЬз МеГ Азп Азп С1у
420 425 430
Ьеи РЬе Азп ТЬг СЬу Азр Мег Азп Азп СЬу Уа1 РЬе Туг Агд СЬу νπ
435 440 445
СЬу 51п С1у Зег Ьеи СЬп РЬе Зег 11е ТЬг ТЬг Рго Азр Ьеи ТЬг Ьеи
450 455 460
Рго Рго Ьеи СЬп 1Ье Рго С1у 11е Зег УаЬ Рго АЬа РЬе Зег Ьеи Рго
4 65 470 475 480
АЬа Не ТЬг Ьеи Рго Зег Ьеи Азп 11е Рго А1а АЬа ТЬг ТЬг Рго А1а
485 490 495
Азп Пе ТЬг УаЬ СЬу АЬа РЬе Зег Ьеи Рго С1у Ьеи ТЬг Ьеи Рго Зег
500 505 510
Ьеи Азп 11е Рго АЬа АЬа ТЬг ТЬг Рго АЬа Азп Ые ТЬг УаЬ СЬу А1а
515 520 525
РЬе Зег Ьеи Рго СЬу Ьеи ТЬг Ьеи Рго Зег Ьеи Азп Ые Рго АЬа А1а
530 535 540
ТЬг ТНг Рго АЬа Азп Ые ТЬг УаЬ С1у АЬа РЬе Зег Ьеи Рго СЬу Ьеи
545 550 555 560
ТЬг Ьеи Рго Зег Ьеи Азп 11е Рго А1а АЬа ТЬг ТЬг Рго АЬа Азп Не
565 570 575
ТЬг ν31 С1у АЬа РЬе Зег Ьеи Рго С1у Ьеи ТЬг Ьеи Рго Зег Ьеи Азп
580 585 590
Ые Рго А1а АЬа ТЬг ТЫ Рго АЬа Азп I Ье ТЬг УаЬ СЬу АЬа РЬе Зег
595 600 605
Ьеи Рго С1у Ьеи ТЬг Ьеи Рго Зег Ьеи Азп Не Рго АЬа АЬа ТЬг ТЬг
610 615 620
Рго А1а Азп 1Ье ТЬг УаЬ Зег СЬу РЬе СЬп Ьеи Рго Рго Ьеи Зег Не
625 630 635 640
Рго Зег Уа1 АЬа Ые Рго Рго УаЬ ТЬг УаЬ Рго Рго Ые ТЬг УаЬ С1у
645 650 655
АЬа РНе Αδη Ьеи Рго Рго Ьеи СЬп Не Рго С1и УаЬ ТЬг Ые Рго С1п
660 665 670
Ьеи ТЫ Г1е Рго АЬа СЬу Не ТЬг Не СЬу С1у РЬе Зег Ьеи Рго А1а
675 680 685
Ые Н1з ТЬг СЬп Рго 11е ТЬг УаЬ <31у СЬп Не СЬу УаЬ СЬу СЬп РЬе
690 695 700
СЬу Ьеи Рго Зег Ые СЬу Тгр Азр Уа1 РЬе Ьеи Зег ТЬг Рго Агд Пе
705 710 715 720
ТЬг Уа1 Рго АЬа РЬе СЬу 11е Рго РЬе ТЬг Ьеи СЬп РЬе СЬп ТЬг Азп
- 63 022203
725 730 735
ναΐ Рго АЬа Ьеи СЬп Рго Рго СЬу СЬу 740 745 С1у Ьеи Зег ТЬг РЬе ТЬг Азп 750
С1у АЬа Ьеи Не РЬе СЬу СЬи РЬе Азр 755 760 Ьеи Рго СЬп Ьеи УаЬ УаЬ НЬз 765
Рго Туг ТЬг Ьеи ТЬг СЬу Рго ТЬе УаЬ 770 775 Не СЬу Зег РЬе РЬе Ьеи Рго 780
А1а 785 РЬе Азп ТЬе Рго СЬу ТЬе Аэр УаЬ 790 Рго АЬа 795 11е Азп УаЬ Азр СЬу 800
РЪе ТЬг Ьеи Рго СЬп Не ТЬг ТЬг Рго 805 АЬа Не 810 ТЬг ТЬг Рго СЬи РЬе 815
А1а Не Рго Рго ТЬе СЬу УаЬ СЬу СЬу 820 825 РЬе ТЬг Ьеи Рго СЬп 11е ТЬг 8 30
ТНг СЬп СЬи 1Ье 1Ье ТЬг Рго С1и Ьеи 835 840 ТЬг Не Азп Зег 11е СЬу УаЬ 845
61у СЬу РЬе ТЬг Ьеи Рго СЬп 11е ТЬг 850 855 ТЬг Рго Рго 11е ТЬг ТЬг Рго 8 60
Рго 865 Ьеи ТЬг ТЬе Азр Рго Не Азп Ьеи 870 ТЬг СЬу 875 РЬе ТЬг Ьеи Рго СЬп 880
Пе ТЬг ТЬг Рго Рго Не ТЬг ТЫ Рго 885 Рго Ьеи 890 ТЬг Не Азр Рго 11е 895
Азп Ьеи ТЬг СЬу РЬе ТЬг Ьеи Рго СЬп 900 905 Не ТЬг ТЬг Рго Рго 11е ТЬг 910
ТНг Рго Рго Ьеи ТЬг 11е СЬи Рго 11е 915 920 СЬу УаЬ СЬу СЬу РЬе ТЬг ТЬг 925
Рго Рго Ьеи ТЬг УаЬ Рго СЬу 11е НЬз 930 935 Ьеи Рго Зег ТЬг ТЬг 11е 61у 940
А1а 945 РЬе АЬа Не Рго СЬу СЬу Рго СЬу 950 Туг РЬе 955 Азп Зег Зег ТЬг АЬа 960
Рго Зег Еег СЬу РЬе РЬе Аэп Зег СЬу 965 АЬа СЬу 970 С1у Азп Зег С1у РЬе 975
С1у Азп Азп СЬу Зег СЬу Ьеи Зег СЬу 980 985 Тгр РЬе Азп ТЬг Азп Рго А1а 990
СЬу Ьеи Ьеи СЬу СЬу Зег СЬу Туг СЬп Азп РЬе СЬу СЬу Ьеи Зег 3. 995 1000 1005
СЬу РЬе Зег Азп Ьеи С1у Зег 1015 С1у УаЬ Зег СЬу РНе 1020 А1а Аэп Агд
1010
С1у Не Ьеи Рго РЬе Зег ναΐ АЬа Зег УаЬ УаЬ Зег С1у РЬе А1а
1025 1030 1035
Азп Не С1у ТЬг Азп Ьеи А1а СЬу РЬе РЬе СЬп С1у ТНг ТЬг Зег
1040 1045 1050
<210> 2 <2Η> 3162 <212> βΗΚ <213> МусоЬасСеггиш £иЬегси1оз1з <220>
<221> пи5с_£еа£иге <223> Штамм Η37Εν <400> 2 агдааггггг ссддаассда дссдсадссН
ЪсдЪсдЪсдд д^ссаддссд аадасддсдд дсдасд^сда дадсааабдб с£дЪас£дсс
Нддсддсддс сЪЬЪсддсЪс сдаЪддсддс адсадасддс
Ндд1:дсадсс ассЪдсъЪдд дддсЬдссда дссддадаИс сдсдасддсс адДдасагсс адсддсадсс сдс£.саддс£ даЬдсгдд£д асадаасдс£ бд^дбсддсд ааННсадсдс
НдддасдддН ддасНсд^дд ссс£а£дсдд дсддсдабда дсддссаасс ссддсдаЪсд аНдЪсЛдссЪ
ЪдаНаЪДсдс £ддсса£дда дсддддсдИд сд£ддс££дс £адссдадн дСдссдассг сгдссаНда ассаЬдссдд сддддсаддд аНЪддсс£сд дсадддсдсд сдсддсддсд £даадсдд£с ддСд£сдс£д адссасд£ас ддсаСсддсд
120
1Θ0
240
300
360
420
480
- 64 022203 аЬсдссЬсдд сдсСд^сссс дЬЬсадЬааа ссдсЬдсада ассЬддсСдд сЬЬдссддсЬ 540 ^ддЪЪддсса дсддсдсдсс ^дсддссдсс а1:дассдсад ссдсаддсаЬ ассддсдсМ: 600 дсдддсддас ссассдссаС саассСдддс аТадссаасд ЬсддсддСдд саасдЬсддс 660 аасдссааса асддссЬЬдс саасаСсддс аасдссаасс ггддсаас^а сааЪЫхсддд 720 гссддаааги есдд£аас£с сааСаСсддс Ьсадсаадсс Тддд^ааЬаа сааса^сддс 780 ££сдддаасс Ьсддсадсаа сааСдЬсддс дГдддааасс ЫддсааЬсТ: саасассддд 840 £Ы:дссааса ссддстГддд саасМзсддс ИТИддсааса ссддсаасаа сааса^сддс 900 аСсддСсССа ссддсаасаа ссадаСсдда атсддсдддс СсаасСсддд сассдддааС 960 ССсддаССдС. СсаасСсддд садсддааас дСсддсЬСсС СсаасСссдд сааСддааас 1020 сгсддсассд дааасьсддд гааСССсаас ассддЪддсС ддааССсСдд асасдддаас 1080 асдддсССсС СсааСдсддд сСсдСССаас ассддСаСдЬ СддасдИсдд саасдсдаас 1140 асаддсадсс Сдаасассдд садССаСаас асдддсдасС СсааСссддд дИсдЬссаас 1200 ассддсасдС Ссазсасддд аааЪдсСаас асдддСЬСсс Ссаасдссдд аааЬаЪсаас 1260 ассддгдссь СсааЪаСЬдд ссасаСдааЬ ааСдддсСдС Ссаасасддд СдасаСдаас 1320 ааСддсдСсС СсСассдддд сдСддддсад ддсадссЬдс адССсадСаС. СасдасассС 1380 даСсСдасСс СдссдссдсС дсаэаСассд дддаСаСсдд Ъ£сссдсс££ садСсСдссд 14 40 дсааСаасдс СдссдЬсдсЬ даасаСсссд дссдссасса сассддссаа саСсассдСс 1500 ддсдссССса дссСдсссдд дССдасдЬСд ссдСсдССда асаЪсссддс сдссассаса 1560 ссадссааса СсассдСддд ЬдссСЛсадс сСдсссдддС ЬдасдЪСдсс дСсдСЬдаас 1620 аСсссддссд ссассасасс адссаасаСс ассдСсддсд ссССсадсст дсссдддЬСд 1680 асдССдссдС сдССдаасаС сссддссдсс ассасассад ссаасаСсас сдСсддсдсс 1740 ССсадссСдс ссдддССдас дССдссдСсд ССдаасаСсс сддссдссас сасассадес 1800 аасаСсассд СсддсдссСС садссСдссс дддССдасдС. СдссдЬсдЬС даасаСсссд 1860 дссдссасса сасссдссаа саСсассдСа адсддсССЪс адЫдссйсс дсСдадСаСС 1920 ссССссдСад ссаССссдсс ддСдасддСс ссдсссаССа сддТдддЬдс ССССааСССд 1980 ссдссаССдс адаССссдда адСаасСаСС ссдсадсСда сдаСасссдс дддСаСсаса 2040 аСсддСддсС ссадСсСасс СдсдаСасас асСсаассда СаасддСсдд ссадаССддс 2100 дСдддссааС ССддссСдсс сСссаСаддс СдддаСдССС. СссСаадсас ассСаддаСа 2160 асадСассдд сСССЬддааС. асссСССасс сЬасааССсс адассааСдС. дссСдсдсЫ: 2220 садссдсссд дсддсдддсС СадСасССЬс ассааСддсд сссЬсаСсЬС сддСдадСЬС 2280 дасССассас ааЬЪддЪддЪ СсасссаСас асаЬСдассд дсссСаССдС. саСсддССса 2340 ^СсСССсСдс ссдссЬ'Ьсаа саСасссддд аСсдаСд^сс ссдсСаСсаа сдСсдаСддс 2400 ССсасссСдс сдсадаЪсас сассссадсС аСсассассс сддадЬСсдс даСсссЬссд 2460 аСсддсдЬдд дсддсСЛсас сссдссдсад аСсассассс аддааассас еассссддад 2520 сСаассаСса асСсдаСсдд сдСсддсддд СЬсасссСдс сдсаааСсас сассссассс 2580 аСсассассс сассдсСдас саСсдасссс аЪсаассСса ссддсССсас ссСсссссаа 2640 аСсассассс сасссаСсас сассссассд сСдассаСсд ассссаСсаа ссСсассддс 2700 ССсасссРсс сссаааСсас сассссассс аСсассассс сассдсРсас саРсдадссд 2760 аСсддсдСдд ддддсССсас сасдсссссд сСсассдССс ссддсаЬсса ссЬдсссадс 2620 ассасдаСсд дддссгСсдс даСссссддд дддссдддсС асЬСсаас^с дадсассдсд 2880 ссССсдЬсдд дсСЬсССсаа ЬСссддСдсд ддсддсаасЪ сдддсЬЬсдд саасаасддс 2940 СсдддссСсС. сдддССддСС саасассаас ссддссдддс СдССдддсдд сСсдддсСаС. 3000 садаасРСсд дсдддсИаСс сСсдддсИСС ЬссаассСГд дсадоддсдС сСсаддсСЪс 3060 дссаасаддд дсаСссСдсс дССсИсддСа дссадсдСсд СССссддсСС СдссааЬа^с 3120 ддсассаасс ЪддсдддЪЪЬ сЫссааддс ассасдСссЬ аа 3162 <210> 3 <211> 1105 <212> ПРТ <213> МусоЬа с С ег ΐ υπι СиЬегсиЬо^Ьз <220>
<221> М15С_ЕЕАТиВЕ <223> Штамм СЮС1551 <400> 3
МеТ Азп РЬе Зег УаЬ Ьеи Рго Рго 61и Не Азп Зег А1а Ьеи 11е РНе
1 5 10 15
А1а С1у АЬа С1у Рго СЬи Рго МеЬ А1а А1а А1а АЬа ТНг А1а Тгр Аэр
20 25 30
- 65 022203
С1у Ьеи А1а 35 МеГ СЬи Ьеи АЬа Зег А1а А1а А1а 40 Зег РЬе 45 СЬу Зег Уа1
ТНг Зег СЬу Ьеи УаЬ СЬу СЬу АЬа Тгр 61п СЬу АЬа Зег Зег Зег АЬа
50 55 60
МеС АЬа АЬа АЬа А1а АЬа Рго Туг АЬа А1а Тгр Ьеи АЬа АЬа АЬа АЬа
65 70 75 80
Уа1 еьп АЬа СЬи СЬп ТЬг А1а АЬа СЬп А1а А1а АЬа МеЬ Пе АЬа СЬи
85 90 95
РЬе СЬи АЬа УаЬ Ьуз ТЬг А1а УаЬ УаЬ С1п Рго МеЬ Ьеи Уа1 АЬа АЬа
100 105 110
Азп Агд АЬа Азр Ьеи УаЬ Зег Ьеи УаЬ МеЪ Зег Азп Ьеи РЬе С1у СЬп
115 120 125
Азп АЬа Рго А1а Пе АЬа АЬа Пе СЬи А1а ТЬг Туг СЬи СЬп МеГ Тгр
130 135 140
АЬа АЬа Азр УаЬ Зег АЬа МеГ Зег АЬа Туг Шз АЬа СЬу АЬа Зег АЬа
14 5 150 155 160
Не АЬа Зег АЬа Ьеи Зег Рго РНе Зег Ьуз Рго Ьеи СЬп Азп Ьеи АЬа
165 170 175
СЬу Ьеи Рго А1а Тгр Ьеи А1а Зег СЬу А1а Рго АЬа АЬа А1а МеГ ТЬг
180 185 190
АЬа АЬа АЬа СЬу Пе Рго АЬа Ьеи АЬа С1у СЬу Рго ТЬг АЬа Пе Азп
195 200 205
Ьеи СЬу Не АЬа Азп УаЬ СЬу СЬу СЬу Аэп УаЬ СЬу Азп А1а Азп Азп
210 215 220
СЬу Ьеи АЬа Азп Пе СЬу Азп АЬа Азп Ьеи СЬу Азп Туг АЗП РНе СЬу
22 5 230 235 240
Зег СЬу Азп РЬе С1у Аэп Зег Азп Пе С1у Зег АЬа Зег Ьеи С1у Азп
245 250 255
Азп Азп Не СЬу РЬе СЬу АЗП Ьеи СЬу Зег Азп Азп УаЬ СЬу Уа1 СЬу
260 265 270
Азп Ьеи СЬу Азп Ьеи Азп ТЬг СЬу РЬе АЬа Азп ТЬг СЬу Ьеи С1у Азп
275 280 285
РНе СЬу РЬе СЬу Азп ТЬг СЬу Азп Азп Азп Пе СЬу ЬЬе СЬу Ьеи ТНг
290 2 95 300
еьу Азп Азп СЬп Пе СЬу Пе СЬу СЬу Ьеи Азп Зег СЬу ТЬг СЬу Азп
305 310 315 320
РЬе СЬу Ьеи РНе АЗП Зег СЬу Зег СЬу Азп УаЬ СЬу РЬе РЬе Азп Зег
325 330 335
СЬу Азп СЬу Азп РЬе СЬу Пе СЬу Азп 5ег С1у Азп РЬе Азп ТЬг СЬу
340 34 5 350
С1у Тгр Аэп Зег СЬу Шз СЬу Азп ТЬг СЬу РЬе РЬе Азп АЬа СЬу Зег
355 360 365
РНе Азп ТЬг СЬу МеГ Ьеи Азр УаЬ СЬу Αδη А1а Азп ТЬг СЬу Зег Ьеи
370 375 380
Азп ТНг СЬу Зег Туг Азп МеГ СЬу Азр РЬе Азп Рго СЬу Зег Зег Азп
385 390 395 400
ТЬг СЬу ТНг РЬе Азп ТНг СЬу Азп АЬа Αδη ТЬг СЬу РЬе Ьеи Азп АЬа
405 410 415
СЬу Азп Не Азп ТЬг С1у УаЬ РЬе Азп 11е СЬу ЯЬз МеЬ Азп Азп СЬу
420 425 4 30
Ьеи РНе Азп ТЬг С1у Азр МеГ АЗП Азп С1у УаЬ РЬе Туг Агд С1у Уа1
435 440 445
СЬу СЬп СЬу Зег Ьеи СЬп РНе Зег Пе ТЬг ТЬг Рго Азр Ьеи ТЬг Ьеи
450 455 460
Рго Рго Ьеи СЬп Ые Рго СЬу Пе Зег Уа1 Рго АЬа РНе Зег Ьеи Рго
4 65 470 475 480
АЬа Не ТЬг Ьеи Рго Зег Ьеи ТЬг Пе Рго АЬа АЬа ТНг ТЬг Рго АЬа
485 4 90 495
Азп Не ТНг УаЬ СЬу АЬа РНе Зег Ьеи Рго СЬу Ьеи ТНг Ьеи Рго Зег
500 505 510
Ьеи Азп Не Рго АЬа А1а ТНг ТЬг Рго А1а Азп Не ТЬг УаЬ СЬу АЬа
515 520 525
РНе Зег Ьей Рго С1у Ьей ТЬг Ъеи Рго Зег Ъеи Азп Пе Рго А1а А1а
530 535 540
ТЬг ТЬг Рго А1а Азп Пе ТНг Уа1 С1у А1а РНе Зег Ъеи Рго С1у Ъеи
545 550 555 560
ТНг Ьей Рго Зег Ьей Азп Пе Рго А1а А1а ТНг ТНг Рго А1а Азп Пе
565 570 575
ТНг Уа1 С1у А1а РНе Зег Ьей Рго С1у Ъеи ТНг Ъеи Рго Зег Ъеи Азп
530 585 590
Пе Рго А1а А1а ТНг ТНг Рго А1а Азп 11е ТНг Уа1 С1у А1а РНе Зег
5 95 600 605
Ъеи Рго С1у Ьей ТНг Ъеи Рго Зег Ъеи Азп Пе Рго А1а А1а ТЬг ТНг
610 615 620
Рго А1а Азп Пе ТНг 7а1 С1у А1а РНе Зег Ъеи Рго С1у Ъеи ТНг Ъеи
625 630 635 640
Рго Зег Ъеи Азп Пе Рго А1а А1а ТНг ТНг Рго А1а Азп 11е ТНг Уа1
64 5 650 655
С1у А1а РНе Зег Ъеи Рго С1у Ъеи ТНг Ъеи Рго Зег Ъеи Азп Пе Рго
660 665 670
А1а А1а ТНг ТНг Рго А1а Азп Пе ТНг Ча1 Зег С1у РНе С1п Ъеи Рго
675 680 685
Рго Ъеи Зег 11е Рго Зег \'а1 А1а Пе Рго Рго Уа1 ТНг Уа1 Рго Рго
690 695 700
Пе ТНг Уа1 С1у А1а РНе Азп Ъеи Рго Рго Ъеи С1п 11е Рго С1и Уа1
705 710 715 720
ТНг Пе Рго С1п Ъеи ТНг Пе Рго А1а 61у 11е ТЬг Пе Е1у С1у РНе
725 730 735
Зег Ъеи Рго А1а Пе Н15 ТНг С1п Рго Пе ТЫ Уа1 С1у 61п 11е С1у
740 745 750
Уа1 Е1у С1п РНе С1у Ъеи Рго Зег Пе С1у Тгр Азр Уа1 РНе Ъеи Зег
755 760 765
ТНг Рго Агд 11е ТНг Уа1 Рго А1а РНе 61у Пе Рго РНе ТЬг Ъеи СЪп
770 775 780
РНе С1п ТЬг Азп Уа1 Рго А1а Ъеи С1п Рго Рго С1у С1у С1у Ъеи Зег
785 790 795 800
ТНг РНе ТНг Азп С1у А1а Ъеи Пе РНе С1у С1и РНе Азр Ъеи Рго СЪп
805 810 815
Ъеи Уа1 Уа1 НЪз Рго Туг ТНг Ъеи ТЬг С1у Рго 11е Уа1 Пе С1у Зег
820 825 830
РНе РНе Ъеи Рго А1а РНе Азп 11е Рго Е1у Пе Азр Уа1 Рго А1а Пе
835 840 845
Азп Уа1 Азр С1у РНе ТНг Ъеи Рго СЪп Пе ТНг ТНг Рго А1а Пе ТНг
350 355 860
ТНг Рго С1и РНе А1а Пе Рго Рго Пе С1у Уа1 С1у С1у РНе ТНг Ъеи
865 870 875 880
Рго 61п Пе ТНг ТНг Е1п С1и Пе Пе ТНг Рго 61и Ъеи ТЬг Пе Азп
885 890 895
Зег Пе С1у Уа1 С1у 61у РНе ТНг Ъеи Рго С1п Пе ТНг ТЬг Рго Рго
900 905 910
Пе ТНг ТНг Рго Рго Ъеи ТНг Пе Азр Рго Пе Азп Ъеи ТЬг С1у РНе
915 920 925
ТНг Ъеи Рго С1п 11е ТЬг ТНг Рго Рго Пе ТНг ТНг Рго Рго Ъеи ТНг
930 935 940
Пе Азр Рго Пе Азп Ъеи ТНг С1у РНе ТНг Ъеи Рго С1п Пе ТНг ТНг
945 950 955 960
Рго Рго Пе ТНг ТНг Рго Рго Ъеи ТНг Пе С1и Рго Пе СЪу Уа1 СЪу
965 970 975
С1у РНе ТНг ТЬг Рго Рго Ъеи ТНг Уа1 Рго С1у Пе Шз Ъеи Рго Зег
980 985 990
ТНг ТЫ Пе С1у А1а РНе А1а Пе Рго С1у С1у Рго С1у Туг РНе А;
995 1000 1005
- 67 022203
Зег Зег ТЬг А1а Рго Зег Зег 1015 С1у РЬе РЬе Азп Зег 1020 61у А1а 61 у
1010
С1у Азп Зег 61у РЬе С1у Азп Азп 61у Зег 61у Ьеи Зег 61у Тгр
1025 1030 1035
РЬе Азп ТЬг Азп Рго А1а С1у Ьеи Ьеи 61у 61 у Зег 61 у Туг С1п
1040 1045 1050
Азп РЬе С1у 61 у Ьеи Зег Зег 61у РЬе Зег Азп Ьеи С1у Зег 61у
1055 1060 1065
Уа1 Зег 61у РЬе А1а Азп Агд С1у 11е Ьеи Рго РЬе Зег Уа1 А1а
1070 1075 1080
Зег Уа1 Уа1 Зег 61у РЬе АХа Азп 11е 61у ТЫ АЗП Ьеи АХа 61 у
1085 1090 1095
РЬе РЬе 61п 61у ТЬг ТЬг Зег
1100 1105
<210> 4 <211> 975 <212> ПРТ <213> МусоЬасСег!шп <:иЬегси1о$1В <220>
<221> М13С_ЕЕАТиКЕ <223> Штамы Γ11 <400> 4
МеГ Азп РЬе Зег Уа1 Ьеи Рго Рго 61и 11е Азп Зег А1а Ьеи 11е РЬе
1 5 10 15
А1а 61у А1а 61у Рго 61и Рго МеГ А1а А1а А1а А1а ТЬг А1а Тгр Азр
20 25 30
61 у Ьеи АХа МеГ 61и Ьеи А1а Зег А1а А1а А1а Зег РЬе 61 у Зег Уа1
35 40 45
ТЬг Зег 61у Ьеи Уа1 С1у 61у А1а Тгр 61п 61у А1а Зег Зег Зег А1а
50 55 60
МеГ АХа А1а А1а А1а А1а Рго Туг А1а А1а Тгр Ьеи А1а А1а А1а А1а
65 70 75 ео
Уа1 61п А1а 61и 61п ТЬг А1а А1а 61п А1а А1а А1а МеГ 11е А1а С1и
85 90 95
РЬе 61и А1а Уа1 Ьуз ТЬг АХа Уа1 Уа1 61п Рго МеГ Ьеи Уа1 А1а А1а
100 105 110
Азп Агд А1а Азр Ьеи Уа1 Зег Ьеи Уа1 МеГ Зег Азп Ьеи РЬе 61у 61п
115 120 125
Азп А1а Рго А1а 11е А1а А1а 11е 61и А1а ТЬг Туг С1и 61п Меи Тгр
130 135 140
А1а АХа Азр Уа1 Зег А1а МеГ Зег А1а Туг Нйз А1а 61у А1а Зег А1а
145 150 155 160
11е А1а Зег А1а Ьеи Зег Рго РЬе Зег Ьуз Рго Ьеи 61п Азп Ьеи А1а
165 170 175
61у Ьеи Рго АХа Тгр Ьеи А1а Зег 61у А1а Рго А1а А1а А1а МеГ ТЬг
180 185 190
А1а АХа А1а 61у 11е Рго А1а Ьеи А1а 61 у 61у Рго ТЬг АХа 11е Азп
195 200 205
Ьеи 61у Пе А1а Аэп Уа1 61у С1у 61у Азп Уа1 51у Азп А1а Азп Азп
210 215 220
61у Ьеи АХа Азп 11е С1у Азп А1а АЗП Ьеи С1у Азп Туг Азп РЬе 61у
225 230 235 240
Зег 61у Азп РЬе 61у Азп Зег Азп 11е 61у Зег А1а Зег Ьеи 61у Азп
245 250 255
Азп Азп 11е 61у РЬе 61у Азп Ьеи 61у Зег Азп Азп Уа1 61у Уа1 61у
260 265 270
Азп Ьеи 61у Азп Ьеи Азп ТЬг 61у РЬе А1а Азп ТЬг 61у Ьеи 61 у Азп
275 280 285
РЬе СЬу РЬе СЬу Азп ТЬг СЬу Азп Азп Азп Не СЬу Ые СЬу Ьеи ТЬг
290 295 300
СЬу Азп Азп СЬп 11е СЬу Ые СЬу СЬу Ьеи Азп Зег СЬу ТЬг СЬу Азп
305 310 315 320
РЬе СЬу Ьеи РЬе Азп Зег СЬу Зег СЬу Азп УаЬ СЬу РЬе РЬе Азп Зег
325 330 335
СЬу Азп СЬу Азп РЬе СЬу Ые СЬу Азп Зег СЬу Азп РЬе Азп ТЬг С1у
340 345 350
СЬу Тгр Азп Зег СЬу НЬз СЬу Азп ТЬг СЬу РЬе РЬе Азп АЬа СЬу Зег
355 360 365
РЬе Азп ТЬг СЬу меь Ьеи Азр УаЬ СЬу Азп АЬа Азп ТЬг СЬу Зег Ьеи
370 375 380
Азп ТЬг СЬу Зег Туг Азп МеЬ СЬу Азр РЬе Азп Рго СЬу Зег Зег Азп
385 390 395 400
ТЬг СЬу ТЬг РЬе Азп ТЬг СЬу Азп АЬа Азп ТЬг СЬу РЬе Ьеи Азп АЬа
405 410 415
СЬу Азп Не Азп ТЬг СЬу УаЬ РЬе Азп Ые СЬу НЬз Мес Азп Азп СЬу
420 425 4 30
Ьеи РЬе Азп ТЬг СЬу Азр Мес Азп Азп СЬу Уа1 РЬе Туг Агд 61у УаЬ
435 440 445
СЬу СЬп СЬу Зег Ьеи СЬп РЬе Зег Ые ТЬг ТЬг Рго Азр Ьеи ТЬг Ьеи
450 455 460
Рго Рго Ьеи СЬп Ые Рго СЬу Ые Зег Уа1 Рго АЬа РЬе Зег Ьеи Рго
4 65 470 475 480
АЬа Ые ТЬг Ьеи Рго Зег Ьеи ТЬг Ые Рго АЬа АЬа ТЬг ТЬг Рго АЬа
485 490 495
Азп Ые ТЬг УаЬ СЬу АЬа РЬе Зег Ьеи Рго СЬу Ьеи ТЬг Ьеи Рго Зег
500 505 510
Ьеи Азп Ые Рго АЬа АЬа ТЫ ТЬг Рго АЬа АЗП Ые ТЬг УаЬ СЬу АЬа
515 520 525
РЬе Зег Ьеи Рго СЬу Ьеи ТЬг Ьеи Рго Зег Ьеи Азп Ые Рго АЬа АЬа
530 535 540
ТЬг ТЬг Рго АЬа Азп Ые ТЬг УаЬ Зег СЬу РЬе СЬп Ьеи Рго Рго Ьеи
545 550 555 560
Зег Ые Рго Зег УаЬ АЬа Ые Рго Рго УаЬ ТЬг УаЬ Рго Рго 11е ТЬг
565 570 575
УаЬ СЬу АЬа РЬе Азп Ьеи Рго Рго Ьеи СЬп Ые Рго СЬи УаЬ ТЬг Ые
530 585 590
Рго СЬп Ьеи ТЬг Ые Рго АЬа СЬу Ые ТЬг Ые СЬу СЬу РЬе Зег Ьеи
595 600 605
Рго АЬа Ые Н1з ТЬг СЬп Рго Ые ТЬг УаЬ СЬу СЬп Ые СЬу УаЬ СЬу
610 615 620
С1п РЬе СЬу Ьеи Рго Зег Ые СЬу Тгр Азр УаЬ РЬе Ьеи Зег ТЬг Рго
625 630 635 640
Агд Ые ТЬг УаЬ Рго АЬа РЬе СЬу 11е Рго РЬе ТЬг Ьеи СЬп РЬе СЬп
645 650 655
ТЬг Азп УаЬ Рго АЬа Ьеи 61п Рго Рго СЬу СЬу СЬу Ьеи Зег ТЬг РЬе
660 665 670
ТЬг Азп СЬу АЬа Ьеи Ые РЬе СЬу СЬи РЬе Азр Ьеи Рго СЬп Ьеи Уа1
675 680 685
Уа1 НЬз Рго Туг ТЬг Ьеи ТЬг СЬу Рго Ые УаЬ 11е СЬу Зег РЬе РЬе
690 695 700
Ьеи Рго АЬа РЬе Азп Ые Рго СЬу Ые Азр УаЬ Рго АЬа Ые Азп Уа1
705 710 715 720
Азр СЬу РЬе ТЬг Ьеи Рго СЬп Ые ТЬг ТЬг Рго АЬа Ые ТЬг ТЬг Рго
725 730 735
СЬи РЬе АЬа Ые Рго Рго Ые СЬу Уа1 СЬу С1у РЬе ТЬг Ьеи Рго СЬп
740 745 750
Не ТЬг ТЬг СЬп СЬи Ые Ые ТЬг Рго СЬи Ьеи ТЬг Ые Азп Зег Ые
755 760 765
СЬу УаЬ 770 СЬу СЬу РЬе ТЬг Ьеи 775 Рго СЬп Ые ТЬг ТЬг 780 Рго Рго Не ТЬг
ТЬг Рго Рго Ьеи ТЬг Ые Азр Рго Ые Азп Ьеи ТЫ СЬу РЬе ТЬг Ьеи
785 790 795 800
Рго С1п ЬЬе ТЬг ТЬг Рго Рго Ые ТЬг ТЬг Рго Рго Ьеи ТЬг Ые Азр
805 810 815
Рго Ые Азп Ьеи ТЬг СЬу РЬе ТЬг Ьеи Рго СЬп ТЬе ТЬг ТЬг Рго Рго
820 825 830
Не ТЬг ТЬг Рго Рго Ьеи ТЬг Ые СХи Рго Ые СЬу УаЬ СЬу СЬу РЬе
835 840 845
ТЬг ТЬг Рго Рго Ьеи ТЬг УаЬ Рго СЬу Ые НЬз Ьеи Рго Зег ТЬг ТЬг
850 855 860
Ые СЬу АЬа РЬе АЬа Ые Рго СЬу СЬу Рго СЬу Туг РЬе Азп Зег Зег
865 870 875 880
ТЬг АЬа Рго Зег Зег СЬу РЬе РЬе Азп Зег СЬу АЬа СЬу СЬу Азп Зег
805 890 895
СЬу РЬе СЬу Азп Азп СЬу Зег СЬу Ьеи Зег СЬу Тгр РЬе Азп ТЬг Азп
900 905 910
Рго АЬа СЬу Ьеи Ьеи СЬу СЬу Зег СЬу Туг СЬп Азп РЬе СЬу СЬу Ьеи
915 920 925
Зег Зег СЬу РЬе Зег Азп Ьеи СЬу Зег СЬу УаЬ Зег СЬу РЬе АЬа Азп
930 935 940
Агд СЬу Ые Ьеи Рго РЬе Зег УаЬ АЬа Зег УаЬ УаЬ Зег СЬу РЬе АЬа
945 950 955 960
Азп Пе СЬу ТЬг Азп Ьеи АЬа СЬу РЬе РЬе СЬп СЬу ТЬг ТЬг Зег
965 970 975
<210> 5
<211> 1050
<212> ПРТ
<213> МусоЪасЕег1ип1 киЬегси1оз1в
<220>
<221> М13С ΓΕΑΤϋΚΕ
<223> Штамм НаагГегп А
<400> 5
Меб Азп РЬе Зег УаЬ Ьеи Рго Рго СЬи Пе Азп Зег АЬа Ьеи Ые РЬе
1 5 10 15
АЬа СЬу АЬа СЬу Рго С1и Рго Меб АЬа АЬа АЬа АЬа ТЬг АЬа Тгр Азр
20 25 30
СЬу Ьеи АЬа Меб С1и Ьеи АЬа Зег АЬа АЬа АЬа Зег РЬе СЬу Зег УаЬ
35 40 45
ТЬг Зег СЬу Ьеи УаЬ СЬу СЬу АЬа Тгр СЬп СЬу АЬа Зег Зег Зег АЬа
50 55 60
Меб АЬа АЬа АЬа АЬа АЬа Рго Туг АЬа АЬа Тгр Ьеи АЬа АЬа АЬа АЬа
65 70 75 80
УаЬ СЬп АЬа С1и СЬп ТЫ АЬа АЬа СЬп АЬа АЬа АЬа Меб Ые АЬа СЬи
85 90 95
РЬе сьи АЬа УаЬ Ьуз ТЫ АЬа УаЬ УаЬ СЬп Рго Меб Ьеи УаЬ АЬа АЬа
100 105 110
Азп Агд АЬа Азр Ьеи УаЬ Зег Ьеи УаЬ Меб Зег Азп Ьеи РЬе СЬу СЬп
115 120 125
Азп АЬа Рго АЬа Ые АЬа АЬа Ые С1ц АЬа ТНг Туг СЬи СЬп Меб Тгр
130 135 140
АЬа АЬа Азр УаЬ Зег АЬа Меб Зег АЬа Туг НЬз АЬа СЬу АЬа Зег АЬа
145 150 155 160
Ые АЬа Зег АЬа Ьеи Зег Рго РЬе Зег Ьуз Рго Ьеи СЬп Азп Ьеи АЬа
165 170 175
СЬу Ьеи Рго АЬа Тгр Ьеи АЬа Зег СЬу АЬа Рго АЬа АЬа АЬа Меб ТЬг
- 70 022203
180 185 190
АЬа АЬа АЬа СЬу Пе Рго АЬа Ьеи АЬа СЬу СЬу Рго ТЬг АЬа Не Азп
195 200 205
Ьеи СЬу 11е АЬа Азп УаЬ СЬу СЬу СЬу Азп УаЬ СЬу Азп АЬа Азп Азп
210 215 220
СЬу Ьеи АЬа Азп Не СЬу Азп АЬа Азп Ьеи СЬу Азп Туг Азп РЬе СЬу
225 230 235 240
Зег СЬу Азп РЬе СЬу Азп Зег АЗП ЬЬе СЬу Зег АЬа Зег Ьеи СЬу Азп
245 250 255
Азп Азп 11е СЬу РЬе СЬу Азп Ьеи СЬу Зег Азп Азп УаЬ СЬу УаЬ СЬу
260 265 270
Азп Ьеи СЬу Азп Ьеи Азп ТЬг СЬу РЬе АЬа Азп ТЬг СЬу Ьеи СЬу Азп
275 280 285
РЬе СЬу РЬе СЬу Азп ТЬг СЬу Азп Азп Азп Не СЬу 11е СЬу Ьеи ТЬг
290 295 300
СЬу Азп Азп СЬп Не СЬу Не СЬу СЬу Ьеи Азп Зег СЬу ТЬг СЬу Азп
305 310 315 320
РНе СЬу Ьеи РЬе Азп Зег СЬу Зег СЬу Азп УаЬ СЬу РЬе РНе Азп Зег
325 330 335
СЬу Азп СЬу Азп РЬе СЬу 1Ье СЬу Азп Зег СЬу Азп РЬе Азп ТЬг СЬу
340 345 350
СЬу Тгр Азп Зег СЬу НЬз СЬу Азп ТНг СЬу РНе РЬе Азп АЬа СЬу Зег
355 360 365
РНе Азп ТНг СЬу МеЬ Ьеи Азр УаЬ СЬу Азп АЬа Азп ТЬг СЬу Зег Ьеи
37 0 375 380
Азп ТНг СЬу Зег Туг Азп МеЬ СЬу Азр РЬе Азп Рго СЬу Зег Зег Азп
385 390 395 400
ТНг СЬу ТЬг РНе Азп ТЬг СЬу Азп АЬа Азп ТЬг СЬу РЬе Ьеи Азп АЬа
405 410 415
СЬу Азп 11е Азп ТЬг СЬу УаЬ РЬе Азп Пе СЬу НЬз МеЬ Азп Азп СЬу
420 425 430
Ьеи РЬе Азп ТЬг СЬу Азр МеЬ Азп Азп СЬу УаЬ РЬе Туг Агд СЬу УаЬ
435 440 445
СЬу СЬп СЬу Зег Ьеи СЬп РЬе Зег Не ТЬг ТНг Рго Азр Ьеи ТЫ Ьеи
450 455 460
Рго Рго Ьеи СЬп ЬЬе Рго СЬу Пе Зег УаЬ Рго АЬа РЬе Зег Ьеи Рго
465 470 475 480
АЬа ЬЬе ТНг Ьеи Рго Зег Ьеи ТЬг Не Рго АЬа АЬа ТНг ТЬг Рго АЬа
485 490 495
Азп Пе ТНг УаЬ СЬу АЬа РЬе Зег Ьеи Рго СЬу Ьеи ТНг Ьеи Рго Зег
500 505 510
Ьеи Азп Не Рго АЬа АЬа ТНг ТЬг Рго АЬа Азп ЬЬе ТНг УаЬ СЬу АЬа
515 520 525
РЬе Зег Ьеи Рго СЬу Ьеи ТЬг Ьеи Рго Зег Ьеи Азп Пе Рго АЬа АЬа
530 535 540
ТЬг ТЬг Рго АЬа Азп Не ТЬг УаЬ Зег СЬу РЬе СЬп Ьеи Рго Рго Ьеи
545 550 555 560
Зег Не Рго Зег УаЬ АЬа Пе Рго Рго УаЬ ТЫ УаЬ Рго Рго Не ТЬг
565 570 575
УаЬ СЬу АЬа РЬе Азп Ьеи Рго Рго Ьеи СЬп ЬЬе Рго СЬи УаЬ ТЬг Не
580 585 590
Рго СЬп Ьеи ТЬг Не Рго АЬа СЬу Не ТЬг Пе СЬу СЬу РЬе Зег Ьеи
595 600 605
Рго АЬа Пе НЬз ТЬг СЬп Рго Не ТЬг УаЬ СЬу СЬп ЬЬе СЬу УаЬ СЬу
610 615 620
СЬп РНе СЬу Ьеи Рго Зег Не СЬу Тгр Азр УаЬ РЬе Ьеи Зег ТЬг Рго
625 630 635 640
Агд Не ТЬг УаЬ Рго АЬа РЬе СЬу 11е Рго РЬе ТНг Ьеи СЬп РЬе СЬп
645 650 655
ТЬг Азп УаЬ Рго АЬа Ьеи СЬп Рго Рго СЬу СЬу СЬу Ьеи Зег ТЬг РЬе
660 665 670
- 71 022203
ТЬг Азп 61у А1а Ьеи Не РЬе 61у 61и 680 РЬе Азр Ьеи Рго 685 61п Ьеи Уа1
675
Уа1 Шз Рго Туг ТЬг Ьеи ТЬг 61у Рго Не Уа1 Не 61у Зег РЬе РЬе
690 695 700
Ьеи Рго А1а РЬе Азп Не Рго 61у 11е Азр Уа1 Рго А1а Не Азп Уа1
705 710 715 720
Азр 61у РЬе ТЬг Ьеи Рго С1п Не ТЬг ТЬг Рго А1а Не ТЬг ТЬг Рго
725 730 735
С1и РЬе А1а Не Рго Рго Не 61у Уа1 61у 61у РЬе ТЬг Ьеи Рго 61п
740 745 750
Не ТЬг ТЬг 61п (Ни Не Не ТЬг Рго 61и Ьеи ТЬг Не Азп Зег 11е
755 760 765
61у Уа1 61у 61у РЬе ТЬг Ьеи Рго С1п Не ТЬг ТЬг Рго Рго Не ТЬг
770 775 780
ТЬг Рго Рго Ьеи ТЬг Не Азр Рго Не Азп Ьеи ТЬг 61у РЬе ТЬг Ьеи
785 790 7 95 800
Рго 61п Не ТЬг ТЬг Рго Рго Не ТЬг ТЬг Рго Рго Ьеи ТЬг Не Азр
805 810 315
Рго Не Азп Ьеи ТЬг 61 у РЬе ТЬг Ьеи Рго 61п Не ТЬг ТЬг Рго Рго
820 825 830
Не ТЬг ТЬг Рго Рго Ьеи ТЬг Не Азр Рго 11е Азп Ьеи ТЬг С1у РЬе
835 840 845
ТЬг Ьеи Рго 61п Не ТЬг ТЬг Рго Рго Не ТЬг ТЬг Рго Рго Ьеи ТЬг
850 855 860
Не Агр Рго 11е Азп Ьеи ТЬг 61у РЬе ТЬг Ьеи Рго 61п 11е ТЬг ТЬг
865 970 875 880
Рго Рго Не ТЬг ТЬг Рго Рго Ьеи ТЬг Не Азр Рго 11е Азп Ьеи ТЬг
885 890 395
61у РЬе ТЬг Ьеи Рго С1п Не ТЬг ТЬг Рго Рго Не ТЬг ТЬг Рго Рго
900 905 910
Ьеи ТЬг Не 61и Рго Не 61у Уа1 С1у 61у РЬе ТЬг ТЬг Рго Рго Ьеи
915 920 925
ТЬг Уа1 Рго 61у Не Шз Ьеи Рго Зег ТЬг ТЬг 11е 61у А1а РЬе А1а
930 935 940
Не Рго С1у С1у Рго С1у Туг РЬе Азп Зег Зег ТЬг А1а Рго Зег Зег
9+5 950 955 960
С1у РЬе РЬе Азп Зег 61у А1а 61у 61у Азп Зег 61 у РЬе 61у Азп Азп
965 970 975
С1у Зег 61у Ьеи Зег 61 у Тгр РЬе Азп ТЬг Азп Рго А1а 61у Ьеи Ьеи
980 985 990
С1у 61у Зег 61у Туг 61п Азп РЬе С1у С1у Ьеи Зег Зег С1у РЬе
995 1000 1005
Азп Ьеи О1у Зег 61у Уа1 Зег 1015 61у РЬе А1а Азп Агд 1020 61у 11е Ьеи
1010
Рго РЬе Зег 7а 1 А1а Зег \7а1 Уа1 Зег 61у РЬе А1а Азп Не С1у
1025 1030 1035
ТЬг Азп Ьеи А1а 61у РЬе РЬе 61п 61у ТЬг ТЬг Зег
1040 1045 1050
<210> 6 <211> 1073 <212> ПРТ <213> МусоЬас^егАид! СиЬегси1оз1з <220>
<221> М15С_ΡΕΑΤϋΚΕ <223> Штамм С <400> 6
МеЬ Азп РЬе Зег Уа1 Ьеи Рго Рго 61и Не Азп Зег А1а Ьеи Не РЬе
- 72 022203
1 5 10 15
А1а С1у А1а 61у Рго С1и Рго Меб А1а А1а А1а А1а ТЬг А1а Тгр Азр
20 25 30
С1у Ьеи А1а МеЬ С1и Ьеи А1а Зег А1а А1а А1а Зег РЬе С1у Зег Уа1
35 40 45
ТНг Зег С1у Ьеи Уа1 01 у С1у А1а Тгр 61п 61у А1а Зег Зег Зег А1а
50 55 60
МеГ А1а А1а А1а А1а А1а Рго Туг А1а А1а Тгр Ьеи А1а А1а А1а А1а
65 70 75 80
Уа1 С1п Д1а С1и С1п ТЬг А1а А1а С1п А1а А1а А1а Мес Пе А1а С1и
85 90 95
РЬе 61и А1а Уа1 Ьуз ТЬг А1а Уа1 Уа1 61п Рго Меб Ьеи Уа1 А1а А1а
100 105 но
Азп Агд А1а Азр Ьеи νβΐ Зег Ьеи Уа1 Меб Зег Азп Ьеи РЬе 61у С1п
115 120 125
Азп А1а Рго А1а Не А1а А1а Не 61и А1а ТЬг Туг 61и 61п Меб Тгр
130 135 140
А1а А1э Азр Уа1 Зег А1а Меб Зег А1а Туг ΗΪ3 А1а 61у А1а Зег А1а
145 150 155 160
11е А1а Зег А1а Ьеи Зег Рго РЬе Зег Ьуз Рго Ьеи 61п Азп Ьеи А1а
165 170 175
61у Ьеи Рго А1а Тгр Ьеи А1а Зег 61у А1а Рго А1а А1а А1а Меб ТЬг
180 185 190
А1а А1а А1а С1у 11е Рго А1а Ьеи А1а 61у С1у Рго ТЫ А1а Не Азп
195 200 205
Ьеи 61у Не А1а Азп Уа1 С1у 61у 61у Азп Уа1 61у Азп А1а Азп Азп
210 215 220
С1у Ьеи А1а Азп Пе С1у Азп А1а Азп Ьеи 61у Азп Туг Азп РЬе 61 у
225 230 235 240
Зег С1у Азп РЬе С1у Азп Зег Азп Пе 61у Зег А1а Зег Ьеи 61у Азп
245 250 255
Азп Азп 11е 61у РЬе 61у Азп Ьеи С1у Зег Азп Азп Уа1 С1у Уа1 61у
2 60 265 270
Азп Ьеи 61у Азп Ьеи Азп ТЬг С1у РЬе А1а Азп ТЬг 61у Ьеи С1у Азп
275 280 285
РЬе 61у РЬе С1у Аап ТЬг С1у Азп Азп Аап Пе 61у Не 61у Ьеи ТЬг
290 295 300
С1у Азп Азп С1п 11е С1у 11е С1у 61у Ьеи Азп Зег С1у ТЬг 61у Азп
305 310 315 320
РЬе 61у Ьеи РЬе Азп Зег С1у Зег С1у Азп 7а1 С1у РЬе РЬе Азп Зег
325 330 335
С1у Азп С1у Азп РЬе С1у Пе С1у Азп Зег 61у Азп РЬе Азп ТЬг С1у
340 345 350
С1у Тгр Азп Зег С1у Ηίδ 61 у Азп ТЬг 61у РЬе РЬе Азп А1а 61у Зег
355 360 365
РЬе Азп ТНг С1у Меб Ьеи Азр Уа1 С1у Азп А1а Азп ТЬг С1у Зег Ьеи
370 375 380
Азп ТНг С1у Зег Туг Азп Меб С1у Азр РЬе Азп Рго С1у Зег Зег Азп
385 390 395 400
ТНг 61у ТНг РЬе Азп ТЬг 61 у Азп А1а Азп ТЬг С1у РЬе Ьеи Азп А1а
405 410 415
61у Азп Не Азп ТЬг 61у Уа1 РЬе Азп 11е 61 у Шз Меб Азп Азп 61у
420 425 430
Ьеи РЬе Азп ТЬг 61у Азр Меб Азп Азп С1у Уа1 РЬе Туг Агд С1у Уа1
435 440 445
61у С1п С1у Зег Ьеи С1п РЬе Зег Пе ТЬг ТЬг Рго Азр Ьеи ТЬг Ьеи
4 50 455 460
Рго Рго Ьеи С1п Пе Рго С1у 11е Зег Уа1 Рго А1а РЬе Зег Ьеи Рго
465 470 475 480
А1а Не ТЬг Ьеи Рго Зег Ьеи Азп Не Рго А1а А1а ТЬг ТЬг Рго А1а
485 4 90 495
- 73 022203
Азп 11е ты УаЬ 500 СЬу А1а РЬе Зег Ьеи 505 Рго СЬу Ьеи ТЬг Ьеи 510 Рго Зег
Ьеи Азп Не Рго АЬа А1а ТЬг ТЬг Рго АЬа Азп Пе ТЫ УаЬ СЬу АЬа
515 520 525
РЬе Зег Ьеи Рго СЬу Ьеи ТЬг Ьеи Рго Зег Ьеи Азп Пе Рго АЬа АЬа
530 535 540
ТЬг ТЬг Рго АЬа Азп 11е ТЬг νθΐ СЬу АЬа РЬе Зег Ьеи Рго СЬу Ьеи
545 550 555 560
ТЬг Ьеи Рго Зег Ьеи Азп 11е Рго АЬа АЬа ТЬг ТЬг Рго АЬа Азп Пе
565 570 575
ТЬг Уа1 СЬу АЬа РЬе Зег Ьеи Рго СЬу Ьеи ТЬг Ьеи Рго Зег Ьеи Азп
530 585 590
11е Рго АЬа А1а ТЬг ТЬг Рго А1а Азп Пе ТЬг УаЬ СЬу АЬа РЬе Зег
595 600 605
Ьеи Рго СЬу Ьеи ТЬг Ьеи Рго Зег Ьеи Азп Пе Рго АЬа А1а ТЬг ТЬг
610 615 620
Рго АЬа Азп Пе ты УаЬ Зег СЬу РЬе СЬп Ьеи Рго Рго Ьеи Зег Пе
625 630 635 640
Рго Зег УаЬ АЬа Пе Рго Рго УаЬ ТЬг УаЬ Рго Рго Пе ТЬг УаЬ СЬу
645 650 655
АЬа РЬе Азп Ьеи Рго Рго Ьеи СЬп Пе Рго СЬи УаЬ ТЬг 11е Рго СЬп
660 665 670
Ьеи ТЬг Пе Рго А1а СЬу Пе ТЬг Пе СЬу СЬу РЬе Зег Ьеи Рго АЬа
675 680 635
11е НЬз ТЬг СЬп Рго Не ТЬг Уа1 СЬу СЬп Пе СЬу νβΐ СЬу СЬп РЬе
690 695 700
СЬу Ьеи Рго Зег Пе СЬу Тгр Азр УаЬ РЬе Ьеи Зег ТЬг Рго Агд Пе
705 710 715 720
ТЬг УаЬ Рго А1а РЬе СЬу Пе Рго РЬе ТЬг Ьеи СЬп РЬе СЬп ТЬг Азп
725 730 735
УаЬ Рго АЬа Ьеи СЬп Рго Рго СЬу СЬу СЬу Ьеи Зег ТЬг РЬе ТЬг Азп
740 745 750
СЬу АЬа Ьеи Пе РЬе СЬу СЬи РЬе Азр Ьеи Рго СЬп Ьеи УаЬ УаЬ НЬз
755 760 765
Рго Туг ТЬг Ьеи ТЬг СЬу Рго Пе УаЬ Пе СЬу Зег РЬе РЬе Ьеи Рго
770 775 780
АЬа РЬе Азп Пе Рго СЬу Пе Азр УаЬ Рго А1а Пе Азп УаЬ Азр СЬу
785 790 795 800
РЬе ТЬг Ьеи Рго СЬп Не ТЬг ТЬг Рго АЬа Не ТЬг ТЬг Рго СЬи РЬе
805 810 815
АЬа Не Рго Рго Пе СЬу νβΐ СЬу СЬу РЬе ТЬг Ьеи Рго СЬп Пе ТЬг
820 825 830
ТЬг СЬп СЬи Пе Пе ТЬг Рго СЬи Ьеи ТЬг Пе Азп Зег Пе СЬу УаЬ
835 840 845
СЬу СЬу РЬе ТЬг Ьеи Рго СЬп Пе ТЬг ТЬг Рго РГО Пе ТЬг ТЬг Рго
850 855 860
Рго Ьеи ТЬг Пе Азр Рго Пе Азп Ьеи ТЬг СЬу РЬе ТЬг Ьеи Рго СЬп
865 870 875 880
Не ТЬг ТЬг Рго Рго 11е ТЬг ТЬг Рго Рго Ьеи ТЬг Пе Азр Рго 11е
885 890 895
Азп Ьеи ТЬг СЬу РЬе ТЬг Ьеи Рго СЬп Пе ТЬг ТЬг Рго Рго Пе ТЬг
900 905 910
ТЬг Рго Рго Ьеи ТЬг Пе Азр Рго Пе Азп Ьеи ТЬг СЬу РЬе ТЬг Ьеи
915 920 925
Рго СЬп Пе ТЬг ТЬг Рго Рго Пе ТЬг ТЬг Рго Рго Ьеи ТЬг Пе СЬи
930 935 940
Рго Пе 31 у УаЬ СЬу СЬу РЬе ТЬг ТЬг Рго Рго Ьеи ТЬг УаЬ Рго СЬу
945 950 955 960
11е НЬз Ьеи Рго Зег ТЫ ТЬг Пе СЬу АЬа РЬе А1а Не Рго СЬу СЬу
965 970 975
Рго СЬу Туг РЬе Азп Зег Зег ТЬг А1а Рго Зег Зег СЬу РЬе РЬе Азп
- 74 022203
980 985 990
Зег СЬу АЬа СЬу СЬу Азп Зег СЬу РЬе СЬу Азп Азп СЬу Зег СЬу Ьеи
995 1000 1005
Зег С1у Тгр РЬе Азп ТЬг Азп 1015 Рго А1а СЬу Ьеи Ьеи 1020 СЬу СЬу Зег
1010
61 у Туг СЬп Азп РЬе СЬу СЬу Ьеи Зег Зег СЬу РЬе Зег Азп Ьеи
1025 1030 1035
С1у Зег СЬу УаЬ Зег СЬу РНе АЬа АЗП Агд СЬу Не Ьеи Рго РЬе
1040 1045 1050
Зег УаЬ А1а Зег УаЬ УаЬ Зег СЬу РЬе АЬа Азп 11е СЬу ТЬг Азп
1055 1060 1065
Ьеи АЬа СЬу РЬе РЬе СЬп СЬу ТЬг ТЬг Зег
1070 1075
<210> 7 <211> 1026 <212> ПРТ <21Э> МусоЬасСегьига Ьоуьз <220>
<221> М13С_ЕЕАТ0КЕ <223> Штамм БЦЖ <400> 7
МеЬ Азп РЬе Зег УаЬ Ьеи Рго Рго СЬи 11е Азп Зег АЬа Ьеи Не РЬе
1 5 10 15
АЬа СЬу АЬа СЬу Рго СЬи Рго Μβί АЬа АЬа АЬа АЬа ТЬг АЬа Тгр Азр
20 25 30
СЬу Ьеи АЬа МеС СЬи Ьеи АЬа Зег АЬа АЬа АЬа Зег РЬе СЬу Зег УаЬ
35 40 45
ТЬг Зег СЬу Ьеи УаЬ СЬу СЬу АЬа Тгр СЬп СЬу АЬа Зег Зег Зег АЬа
50 55 60
МеЬ АЬа АЬа АЬа АЬа АЬа Рго Туг АЬа АЬа Тгр Ьеи АЬа АЬа АЬа АЬа
65 70 75 80
УаЬ СЬп АЬа СЬи СЬп ТЬг АЬа АЬа СЬп АЬа АЬа АЬа Меь Не АЬа СЬи
85 90 95
РНе СЬи АЬа УаЬ Ьуз ТЬг АЬа УаЬ УаЬ СЬп Рго Мер Ьеи УаЬ АЬа АЬа
100 105 110
Азп Агд АЬа Азр Ьеи УаЬ Зег Ьеи УаЬ МеЬ Зег Азп Ьеи РЬе СЬу СЬп
115 120 125
Азп АЬа Рго АЬа 11е АЬа АЬа 11е СЬи АЬа ТЬг Туг СЬи СЬп МеЬ Тгр
130 135 140
АЬа АЬа Азр УаЬ Зег АЬа МеЬ Зег АЬа Туг НЬз АЬа СЬу АЬа Зег АЬа
145 150 155 160
11е АЬа Зег АЬа Ьеи Зег Рго РЬе Зег Ьуз Рго Ьеи СЬп Азп Ьеи АЬа
165 170 175
СЬу Ьеи Рго АЬа Тгр Ьеи А1а Зег СЬу АЬа Рго АЬа АЬа АЬа МеЬ ТЬг
180 195 190
АЬа АЬа АЬа СЬу Не Рго АЬа Ьеи АЬа СЬу СЬу Рго ТЬг АЬа Не Азп
195 200 205
Ьеи СЬу 11е АЬа Азп УаЬ СЬу СЬу СЬу Азп УаЬ СЬу Азп АЬа Азп Азп
210 215 220
СЬу Ьеи АЬа Азп 11е СЬу Азп АЬа Азп Ьеи СЬу Азп Туг Азп РЬе СЬу
2 25 230 235 240
Зег СЬу Азп РЬе СЬу Азп Зег Азп Не СЬу Зег АЬа Зег Ьеи СЬу Азп
245 250 255
Азп Азп Пе СЬу РЬе СЬу Азп Ьеи СЬу Зег Азп Азп УаЬ СЬу УаЬ СЬу
260 265 270
АЗП Ьеи С1у Азп Ьеи Азп ТНг СЬу РЬе АЬа Азп ТЬг СЬу Ьеи СЬу Азп
275 280 285
РНе СЪу РНе СЪу Азп ТНг СЪу Азп Азп Азп 295 ЪЪе СЪу 300 Пе СЪу Ъеи ТНг
290
СЪу Азп Аэп СЪп ЪЪе СЪу ЪЪе СЪу СЪу Ъеи Азп Зег СЪу ТНг СЪу Агп
305 310 315 320
РНе СЪу Ъеи РНе Азп Зег СЪу Зег СЪу Азп УаЪ СЪу РНе РНе Азп Зег
325 330 335
СЪу Азп СЪу Азп РНе СЪу 11е СЪу Азп Зег СЪу Азп РНе Азп ТЫ СЪу
340 34 5 350
СЪу Тгр Азп Зег СЪу НЪз СЪу Азп ТЬг СЪу РНе РНе Азп АЪа СЪу Зег
355 360 365
РНе Азп ТЬг СЪу Мер Ъеи Азр УаЪ СЪу Азп АЪа Азп ТЬг СЪу Зег Ъеи
370 375 380
Азп ТНг СЪу Зег Туг Азп Меб СЪу Азр РНе Азп Рго СЪу Зег Зег Азп
385 390 395 400
ТНг СЪу ТНг РНе Азп ТНг СЪу Азп АЪа Азп ТНг СЪу РНе Ъеи Азп АЪа
405 410 415
СЪу Азп Ие Азп ТЬг СЪу УаЪ РНе Азп Пе СЪу НЪз Меб Азп Азп СЪу
420 425 430
Ъеи РНе Азп ТЬг СЪу Азр Меб Азп Азп СЪу УаЪ РНе Туг Агд СЪу УаЪ
435 440 445
СЪу СЪп СЪу Зег Ъеи СЪп РНе Зег Пе ТНг ТНг Рго Азр Ъеи ТНг Ъеи
450 455 4 60
Рго Рго Ъеи СЪп Пе Рго СЪу 11е Зег УаЪ Рго АЪа РНе Зег Ъеи Рго
465 470 475 480
АЪа не ТНг Ъеи Рго Зег Ъеи ТНг Пе Рго АЪа АЪа ТНг ТНг Рго АЪа
485 4 90 495
Азп Пе ТНг УаЪ СЪу АЪа РНе Зег Ъеи Рго СЪу Ъеи ТНг Ъеи Рго Зег
500 505 510
Ьей Азп 11е Рго АЪа АЪа ТНг ТНг Рго АЪа Азп 11е ТНг УаЪ СЪу АЪа
515 520 525
РНе Зег Ъеи Рго СЪу Ъеи ТНг Ъеи Рго Зег Ъеи Азп Пе Рго АЪа АЪа
530 535 540
ТЬг ТНг Рго АЪа Азп Пе ТНг УаЪ СЪу АЪа РНе Зег Ъеи Рго СЪу Ъеи
545 550 555 560
ТНг Ъеи Рго Зег Ъеи Азп 11е Рго АЪа АЪа ТНг ТЬг Рго АЪа Азп Пе
5 65 570 575
ТНг УаЪ Зег СЪу РНе СЪп Ъеи Рго Рго Ъеи Зег Пе Рго Зег УаЪ АЪа
580 585 590
ЪЪе Рго Рго УаЪ ТНг УаЪ Рго Рго ЪЪе ТНг УаЪ СЪу АЪа РНе Азп Ъеи
595 600 605
Рго Рго Ъеи СЪп ХЪе Рго СЪи УаЪ ТНг 11е Рго СЪп Ъеи ТНг Пе Рго
610 615 620
АЪа СЪу 11е ТНг 11е СЪу СЪу РНе Зег Ъеи Рго АЪа Пе НЪз ТЬг СЪп
625 630 635 640
Рго ЪЪе ТНг УаЪ СЪу СЪп Пе СЪу УаЪ СЪу СЪп РНе СЪу Ъеи Рго Зег
645 650 655
Пе СЪу Тгр Азр УаЪ РНе Ъеи Зег ТНг Рго Агд 11е ТНг УаЪ Рго АЪа
660 665 670
РНе СЪу ЪЪе Рго РНе ТНг Ъеи СЪп РНе СЪп ТНг Азп УаЪ Рго АЪа Ъеи
67 5 680 685
СЪп Рго Рго СЪу СЪу СЪу Ъеи Зег ТНг РНе ТЬг Азп СЪу АЪа Ъеи 11е
690 695 700
РНе СЪу СЪи РНе Азр Ъеи Рго СЪп Ъеи УаЪ УаЪ НЪз Рго Туг ТНг Ъеи
705 710 715 720
ТНг СЪу Рго Пе 7а 1 Пе СЪу Зег РНе РНе Ъеи Рго АЪа РНе Азп 11е
725 730 735
Рго СЪу Не Азр Уаъ Рго АЪа Пе Азп УаЪ Азр СЪу РНе ТНг Ъеи Рго
740 745 750
СЪп 11е ТНг ТЬг Рго АЪа Не ТНг ТНг Рго СЪи РНе АЪа 11е Рго Рго
755 760 765
11е СЪу УаЪ СЪу СЪу РНе ТНг Ъеи Рго СЪп Пе ТЬг ТНг СЪп СЪи Пе
770 775 780
Не ТЬг Рго С1и Ьеи ТЬг 11е Азп Зег Пе С1у Уа1 С1у С1у РЬе ТЬг
785 790 795 800
Ьеи Рго С1п 11е ТЬг ТЬг Рго Рго 11е ТЬг ТЬг Рго Рго Ьеи ТЬг Не
905 810 815
Азр Рго Пе Азп Ьеи ТЬг С1у РЬе ТЬг Ьеи Рго 01п Не ТЬг ТЬг Рго
820 825 830
Рго Не ТЬг ТЬг Рго Рго Ьеи ТЬг 11е Азр Рго Не Азп Ьеи ТЬг С1у
835 840 845
РЬе ТЬг Ьеи Рго С1п 11е ТЬг ТЫ Рго Рго Не ТЬг ТЬг Рго Рго Ьеи
850 855 860
ТЬг 11е Азр Рго 11е Азп Ьеи ТЬг С1у РЬе ТЬг Ьеи Рго С1п Не ТЬг
865 870 875 880
ТЬг Рго Рго Пе ТЬг ТЬг Рго Рго Ьеи ТЬг Не С1и Рго Не С1у Уи1
885 890 895
С1у С1у РЬе ТЬг ТЬг Рго Рго Ьеи ТЬг УП Рго С1у Не Нгз Ьеи Рго
900 905 910
Зег ТЬг ТЬг 11е 61у А1а РЬе А1а 11е Рго 61у С1у Рго С1у Туг РЬе
915 920 925
Азп Зег Зег ТЬг А1а Рго Зег Зег С1у РЬе РЬе Азп Зег 01у А1а С1у
930 935 940
С1у Азп Зег С1у РЬе С1у Азп Азп С1у Зег С1у Ьеи Зег С1у Тгр РЬе
945 950 955 960
Азп ТЬг Азп Рго А1а С1у Ьеи Ьеи С1у С1у Зег С1у Туг С1п Азп РЬе
965 970 975
С1у С1у Ьеи Зег Зег С1у РЬе Зег Азп Ьеи С1у Зег С1у Уа1 Зег С1у
980 985 990
РЬе А1а Азп Агд С1у 11е Ьеи Рго РЬе Зег Уа1 А1а Зег '7а1 Уа1 Зег
995 1000 1005
С1у РЬе А1а Азп Не С1у ТЬг Азп Ьеи А1а 51у РНе РЬе 61п С1у 1010 1015 1020
ТЬг ТЬг Зег 1025 <210> 8 <211> 110 <212> ПРТ <213> МусоЬаскегАшп 6и1>егси1оз1з <220>
<221> шаЬ_рерЫс1е <222> (29) . . (НО) <400> 8
Мег Агд Ьеи Зег Ьеи -25 ТЬг А1а Ьеи Зег -20 А1а 51у Уа1 61у А1а -15 Уа1 А1а
Ме! Зег Ьеи ТЬг Уа1 61у А1а С1у Уа1 А1а Зег А1а Азр Рго Уа1 Азр
-10 -5 -1 1
А1а Уа1 Не Азп ТЬг ТЬг Суз Азп Туг С1у С1п Уа1 Уа1 А1а А1а Ьеи
5 10 15 20
Азп А1а ТЬг Азр Рго 61у А1а А1а А1а С1п РЬе Азп А1а Зег Рго Уа1
25 30 35
А1а С1п Зег Туг Ьеи Агд Азп РЬе Ьеи А1а А1а Рго Рго Рго С1п Агд
40 45 50
А1а А1а Ме! А1а А1а С1п Ьеи С1п А1а Уа1 Рго С1у А1а А1а С1п Туг
55 60 65
Не С1у Ьеи Уа1 С1и Зег Уа1 А1а С1у Зег Суз Азп Азп Туг
70 75 80
- 77 022203 <210> 9 <211> 97 <212> ПРТ <213> МусоЬаеСегиит сийегсиЬозиз <400> 9
Мер Зег Ьеи Ьеи Азр АЬа Низ Ые Рго СЬп Ьеи УаЬ АЬа Зег СЬп Зег
1 5 10 15
АЬа РЬе АЬа АЬа Ьуз АЬа СЬу Ьеи Меь Агд Низ ТЬг Ые СЬу СЬп АЬа
20 25 30
СЬи СЬп АЬа АЬа МеЬ Зег АЬа СЬп АЬа РЬе Низ СЬп СЬу СЬи Зег Зег
35 40 45
АЬа АЬа РЬе СЬп АЬа АЬа Ηι3 АЬа Агд РЬе УаЬ АЬа АЬа АЬа АЬа Ьуз
50 55 60
УаЬ Азп ТЬг Ьеи Ьеи Азр УаЬ АЬа СЬп АЬа Азп Ьеи СЬу СЬи АЬа АЬа
65 70 75 80
СЬу ТЬг Туг УаЬ АЬа АЬа Азр АЬа АЬа АЬа АЬа Ёег ТЬг Туг ТЬг СЬу
35 90 95
РЬе <210> 10 <211> 94 <212> ПРТ <213> МусоЬасЕеп игл СиЬегси1оз13 <400> 10
МеЬ ТЬг Ые Азп Туг СЬп РЬе СЬу Азр УаЬ Азр АЬа Низ СЬу АЬа МеЬ
1 5 10 15
Ые Агд АЬа СЬп АЬа АЬа Зег Ьеи СЬи АЬа СЬи Низ СЬп АЬа Ые УаЬ
20 25 30
Агд Азр УаЬ Ьеи АЬа АЬа СЬу Азр РЬе Тгр СЬу СЬу АЬа СЬу Зег УаЬ
35 40 45
АЬа Суз СЬп СЬи РЬе Ые ТЬг СЬп Ьеи СЬу Агд Азп РЬе СЬп УаЬ Ые
50 55 60
Туг СЬи СЬп АЬа Азп АЬа Низ СЬу СЬп Ьуз УаЬ СЬп АЬа АЬа СЬу Азп
65 70 75 80
Азп МеЬ АЬа СЬп ТЬг Азр Зег АЬа УаЬ СЬу Зег Зег Тгр АЬа
85 90
<210> 11 <211> 132 <212> ПРТ <213> МусоЬасСепит СиЬегси1оз!з <400> 11
ТЬг АЬа АЬа Зег Азр Азп РЬе СЬп Ьеи Зег СЬп СЬу СЬу СЬп СЬу РЬе
1 5 10 15
АЬа Ые Рго Ые СЬу СЬп АЬа МеЬ АЬа Ые АЬа СЬу СЬп Ые Агд Зег
20 25 30
СЬу СЬу СЬу Зег Рго ТЬг УаЬ Низ Ые СЬу Рго ТЬг АЬа РЬе Ьеи СЬу
35 40 45
Ьеи СЬу УаЬ УаЬ Азр Азп Азп СЬу Азп СЬу АЬа Агд УаЬ СЬп Агд УаЬ
50 55 60
УаЬ СЬу Зег АЬа Рго АЬа АЬа Зег Ьеи СЬу Ые Зег ТЬг СЬу Азр УаЬ
65 70 75 80
Ые ТЬг АЬа УаЬ Азр СЬу АЬа Рго Ые Азп Зег АЬа ТЬг АЬа Ме£ АЬа
85 90 95
Азр АЬа Ьеи Азп СЬу Низ Низ Рго СЬу Азр УаЬ Ые Зег УаЬ ТЬг Тгр
100 105 110
СЬп ТЬг Ьуз Зег СЬу СЬу ТЬг Агд ТЬг СЬу Азп УаЬ ТЬг Ьеи АЬа С1и
115 120 125
СЬу Рго Рго АЬа
130
<210> 12
<2Ы> 195
<212> ПРТ
<213> . МусоЬасбеглит £иЬегси1о$1з
<400> 12
АЬа Рго Рго АЬа Ьеи Зег СЬп Азр Агд РЬе АЬа Азр РЬе Рго АЬа Ьеи
1 5 10 15
Рго Ьеи Азр Рго Зег АЬа Меб УаЬ АЬа СЬп УаЬ СЬу Рго СЬп УаЬ УаЬ
20 25 30
Азп 11е Азп ТЬг Ьуз Ьеи сьу Туг Азп Азп АЬа УаЬ СЬу АЬа СЬу ТЬг
35 40 45
СЬу Ые УаЬ Ые Азр Рго Азп СЬу УаЬ УаЬ Ьеи ТЬг Азп Азп НЬз УаЬ
50 55 60
Ые АЬа СЬу АЬа ТЬг Азр Ые Азь АЬа РЬе Зег УаЬ СЬу Зег СЬу СЬп
65 70 75 80
ТЬг Туг СЬу УаЬ Азр Уа1 УаЬ СЬу Туг Азр Агд ТЬг СЬп Азр УаЬ АЬа
35 90 95
УаЬ Ьеи СЬп Ьеи Агд СЬу АЬа СЬу С1у Ьеи Рго Зег АЬа АЬа Ые СЬу
100 105 ыо
СЬу СЬу УаЬ АЬа УаЬ СЬу СЬи Рго УаЬ УаЬ АЬа Меб СЬу Азп Зег СЬу
115 120 125
СЬу СЬп СЬу СЬу ТЬг Рго Агд АЬа УаЬ Рго СЬу Агд УаЬ УаЬ АЬа Ьеи
130 135 140
СЬу СЬп ТЬг УаЬ СЬп АЬа Зег Азр Зег Ьеи ТЬг СЬу АЬа СЬи СЬи ТЬг
145 150 155 160
Ьеи Азп СЬу Ьеи Ые СЬп РЬе Азр АЬа АЬа Ые СЬп Рго СЬу Азр Зег
165 170 175
СЬу СЬу Рго УаЬ УаЬ Азп СЬу Ьеи СЬу СЬп УаЬ УаЬ СЬу Меб Азп ТЬг
180 185 190
АЬа АЬа Зег
195
<210> 13
<211> 391
<212> ПРТ
<213> ЛГусоЬасбегЬига СиЬегсиЬозЬз
<400> 13
Меб УаЬ Азр РЬе СЬу АЬа Ьеи Рго Рго СЬи Не Азп Зег АЬа Агд Меб
1 5 10 15
Туг АЬа 61 у Рго СЬу Зег АЬа Зег Ьеи УаЬ АЬа АЬа АЬа СЬп Меб Тгр
20 25 30
Азр Зег УаЬ АЬа Зег Азр Ьеи РЬе Зег АЬа АЬа Зег АЬа РЬе СЬп Зег
35 40 45
УаЬ УаЬ Тгр 61у Ьеи ТЬг УаЬ СЬу Зег Тгр Ые СЬу Зег Зег АЬа СЬу
50 55 60
Ьеи Меб УаЬ АЬа АЬа АЬа Зег Рго Туг УаЬ АЬа Тгр Меб Зег УаЬ ТНг
65 70 75 80
АЬа СЬу СЬп АЬа СЬи Ьеи ТЬг АЬа АЬа СЬп УаЬ Агд УаЬ АЬа АЬа АЬа
85 90 95
АЬа Туг СЬи ТЬг АЬа Туг СЬу Ьеи ТЬг УаЬ Рго Рго Рго УаЬ Ые АЬа
100 105 110
- 79 022203
СЬи Азп Агд 115 А1а СЬи Ьеи МеХ Ые 120 Ьеи 11е АЬа ТЬг Азп 125 Ьеи Ьеи СЬу
С1п Азп ТЬг Рго А1а Не АЬа УаЬ Азп СЬи АЬа СЬи Туг СЬу СЬи МеХ
130 135 140
Тгр АЬа 61П АЗр АЬа АЬа АЬа МеХ РЬе СЬу Туг А1а АЬа АЬа ТЬг АЬа
145 150 155 160
ТЬг А1а ТЬг А1а ТЬг Ьеи Ьеи Рго РЬе СЬи СЬи А1а Рго СЬи МеХ ТЬг
165 170 175
Зег АЬа СЬу СЬу Ьеи Ьеи СЬи СЬп АЬа АЬа АЬа УаЬ СЬи СЬи АЬа Зег
130 185 190
Азр ТЬг АЬа А1а А1а Азп СЬп Ьеи МеХ Азп АЗП Уа1 Рго СЬп АЬа Ьеи
195 200 205
СЬп СЬп Ьеи А1а СЬп Рго ТЬг СЬп СЬу ТЬг ТЬг Рго Зег Зег Ьуз Ьеи
210 215 220
СЬу СЬу Ьеи Тгр Ьуз ТЬг УаЬ Зег Рго НЬз Агд Зег Рго Ые Зег Азп
225 230 235 240
МеХ УаЬ Зег МеХ А1а Азп Азп НЬз мех Зег МеХ ТЬг АЗП Зег СЬу УаЬ
245 250 255
Зег МеХ ТЬг Азп ТЬг Ьеи Зег Зег МеХ Ьеи Ьуз СЬу РЬе А1а Рго АЬа
260 265 270
АЬа АЬа АЬа СЬп АЬа УаЬ СЬп ТЬг АЬа АЬа СЬп Азп СЬу УаЬ Агд АЬа
275 280 285
Мех Зег Зег Ьеи СЬу Зег Зег Ьеи СЬу Зег Зег СЬу Ьеи СЬу СЬу СЬу
290 295 300
Уа1 АЬа А1а Азп Ьеи СЬу Агд АЬа АЬа Зег УаЬ СЬу Зег Ьеи Зег УаЬ
305 310 315 320
Рго СЬп А1а Тгр АЬа АЬа АЬа Азп СЬп А1а УаЬ ТЬг Рго АЬа АЬа Агд
325 330 335
АЬа Ьеи Рго Ьеи ТЬг Зег Ьеи ТЬг Зег АЬа АЬа СЬи Агд СЬу Рго СЬу
340 345 350
СЬп Мех Ьеи 51 у СЬу Ьеи Рго УаЬ СЬу СЬп МеХ СЬу АЬа Агд АЬа СЬу
355 360 365
СЬу СЬу Ьеи Зег СЬу УаЬ Ьеи Агд УаЬ Рго РГО Агд Рго Туг УаЬ МеХ
370 375 380
Рго НЬз Зег Рго АЬа АЬа СЬу
385 390 <210> 14 <211> 392 <212> ПРТ <213> МусоЪасХегЬия ХиЪегсиЬозЬз <400> 14
МеХ Зег Агд АЬа РЬе Ые Ые Азр Рго ТЬг Ые Зег АЬа Ые Азр СЬу
1 5 10 15
Ьеи Туг Азр Ьеи Ьеи СЬу Ые СЬу Ые Рго Азп СЬп СЬу СЬу Ые Ьеи
20 25 30
Туг Зег Зег Ьеи СЬи Туг РЬе СЬи Ьуз АЬа Ьеи СЬи СЬи Ьеи АЬа АЬа
35 40 45
АЬа РЬе Рго СЬу Азр СЬу Тгр Ьеи СЬу Зег АЬа АЬа Азр Ьуз Туг АЬа
50 55 60
СЬу Ьуз Азп Агд Азп НЬз УаЬ Азп РЬе РЬе СЬп СЬи Ьеи АЬа Азр Ьеи
65 70 75 80
Азр Агд СЬп Ьеи Ые Зег Ьеи Ые НЬз Азр СЬп АЬа Азп АЬа УаЬ СЬп
85 90 95
ТЬс ТЬг Агд Азр Ые Ьеи СЬи СЬу АЬа Ьуз Ьуз СЬу Ьеи СЬи РЬе УаЬ
100 105 110
Агд Рго УаЬ АЬа УаЬ Азр Ьеи ТЬг Туг Ые Рго УаЬ УаЬ СЬу НЬз АЬа
115 120 125
Ьеи Зег АЬа АЬа РЬе СЬп АЬа Рго РЬе Суз АЬа СЬу А1а МеХ АЬа УаЬ
130 135 140
Уа1 С1у 61у А1а Ьеи А1а Туг Ьеи Уа1 Уа1 Ьуз ТЬг Ьеи 11е Азп А1а
145 150 155 160
ТЬг С1п Ьеи Ьеи Ьуз Ьеи Ьеи АХа Ьуз Ьеи А1а С1и Ьеи Уа1 АХа А1а
165 170 175
А1а Пе А1а Азр Пе 11е Зег Азр Уа1 А1а Азр 11е 11е Ьуз 61у 11е
180 185 190
Ьеи 61у С1и Уа1 Тгр 61и РЬе Пе ТЬг Азп А1а Ьеи Азп 61у Ьеи Ьуз
195 200 205
С1и Ьеи Тгр Азр Ьуз Ьеи ТЬг 61 у Тгр Уа1 ТЬг С1у Ьеи РЬе Зег Агд
210 215 220
Е1у Тгр Зег Азп Ьеи 61и Зег РЬе РЬе А1а 61у Уа1 Рго 61у Ьеи ТЬг
225 230 235 240
С1у А1а ТЬг Зег 61 у Ьеи Зег С1п Уа1 ТЬг С1у Ьеи РЬе С1у А1а А1а
245 250 255
61у Ьеи Зег А1а Зег Зег С1у Ьеи А1а Нйз А1а Азр Зег Ьеи А1а Зег
260 265 270
Зег А1а Зег Ьеи Рго А1а Ьеи А1а 61у Пе 61у 61у С1у Зег 61у РЬе
275 280 285
С1у С1у Ьеи Рго Зег Ьеи А1а С1п Уа1 Нйз А1а А1а Зег ТЬг Агд 61п
290 295 300
А1а Ьеи Агд Рго Агд А1а Азр 61 у Рго Уа1 61у А1а А1а А1а 61и 61п
305 310 315 320
Уа1 61у 61у 61п Зег 61п Ьеи Уа1 Зег АХа 61л 61у Зег С1п 61у МеГ
325 330 335
С1у С1у РГО Уа1 С1у МеГ 61у С1у МеГ Нйз Рго Зег Зег 61 у А1а Зег
340 345 350
Ьуз С1у ТЬг ТЬг ТЬг Ьуз Ьуз Туг Зег С1и 61у А1а А1а А1а 61 у ТЬг
355 360 365
С1и Азр А1а 61и Агд А1а Рго Уа1 61и А1а Азр А1а 61у 61у 61у 61п
370 375 380
Ьуз Уа1 Ьеи Уа1 Агд Азп Уа1 Уа1
385 390 <210 15 <211> 423 <212> ПРТ <213> МусоЬасСеггит киЬегси1оз1з <400 15
МеГ Азр РЬе 61у Ьеи Ьеи Рго Рго С1и νβΐ Азп Зег Зег Агд МеГ Туг
1 5 10 15
Зег 61 у Рго С1у Рго С1и Зег МеГ Ьеи А1а А1а А1а А1а АХа Тгр Азр
20 25 30
С1у Уа1 А1а А1а 61и Ьеи ТЬг Зег А1а А1а Уа1 Зег Туг 61 у Зег Уа1
35 40 45
Уа1 Зег ТЬг Ьеи Пе Уа1 61и Рго Тгр МеГ 61у Рго А1а А1а А1а А1а
50 55 60
Мес А1а А1а А1а А1а ТЬг Рго Туг Уа1 61у Тгр Ьеи А1а А1а ТЬг А1а
65 70 75 80
А1а Ьеи А1а Ьуз 61и ТЬг АХа ТЬг С1п А1а Агд А1а А1а АХа 61и А1а
85 90 95
РЬе 61 у ТЬг А1а РЬе АХа МеГ ТЬг Уа1 Рго Рго Зег Ьеи Уа1 А1а А1а
100 105 110
Азп Агд Зег Агд Ьеи МеГ Зег Ьеи Уа1 А1а А1а Азп 11е Ьеи 61у 61п
115 120 125
Азп Зег АХа А1а 11е А1а А1а ТЬг 61п А1а 51и Туг А1а С1и МеГ Тгр
130 135 140
А1а С1п Азр А1а А1а Уа1 МеГ Туг Зег Туг 61и С1у А1а Зег А1а А1а
145 150 155 160
АЬа Зег АЬа Ьеи Рго 165 Рго РНе ТНг Рго Рго УаЬ 170 СЬп СЬу ТЬг СЬу 175 Рго
АЬа СЬу Рго АЬа АЬа АЬа АЬа АЬа АЬа ТНг СЬп АЬа АЬа СЬу АЬа СЬу
180 185 190
АЬа УаЬ АЬа Азр АЬа СЬп АЬа ТНг Ьеи АЬа СЬп Ьеи Рго Рго СЬу Ые
195 200 205
Ьеи Зег Аар 11е Ьеи Зег АЬа Ьеи АЬа АЬа Азп АЬа Азр Рго Ьеи ТНг
210 215 220
Зег СЬу Ьеи Ьеи СЬу 11е АЬа Зег ТНг Ьеи Азп Рго СЬп УаЬ СЬу Зег
225 230 235 240
АЬа СЬп Рго Ые УаЬ Ые Рго ТНг Рго Ые СЬу СЬи Ьеи Азр УаЬ Ые
245 250 255
АЬа Ьеи Туг Ые АЬа Зег Ые АЬа ТНг СЬу Зег Ые АЬа Ьеи АЬа Ые
260 265 270
ТНг Азп ТНг АЬа Агд Рго Тгр НЬз 1Ье СЬу Ьеи Туг СЬу Азп АЬа СЬу
275 280 285
СЬу Ьеи СЬу Рго ТНг СЬп СЬу НЬз Рго Ьеи Зег Зег АЬа ТНг Азр СЬи
290 295 300
Рго СЬи Рго НЬз Тгр СЬу РГО РНе СЬу СЬу АЬа АЬа Рго УаЬ Зег АЬа
305 310 315 320
СЬу УаЬ СЬу ньа АЬа АЬа Ьеи УаЬ СЬу АЬа Ьеи Зег Уаь Рго НЬз Зег
325 330 335
Тгр ТНг ТНг АЬа АЬа Рго СЬи Ые СЬп Ьеи АЬа УаЬ СЬп АЬа ТЬг Рго
340 345 350
ТНг РНе Зег Зег Зег АЬа СЬу АЬа Азр Его ТНг АЬа Ьеи Азп СЬу МеГ
355 360 365
Рго АЬа СЬу Ьеи Ьеи Зег СЬу Мер АЬа Ьеи АЬа Зег Ьеи АЬа АЬа Агд
370 375 380
СЬу ТНг ТНг СЬу СЬу СЬу СЬу ТНг Агд Зег СЬу ТНг Зег ТНг Азр СЬу
385 390 395 400
СЬп СЬи Азр СЬу Агд Ьуз Рго Рго УаЬ УаЬ УаЬ Ые Агд СЬи СЬп Рго
405 410 415
Рго Рго СЬу Азп Рго Рго Агд
420
<210> <211> <212> <213> 16 95 ПРТ МусоЬас Сегίит СиЬегсиЬозЬз
<220>
<221> ΙΝΙΤ МЕТ
<222> (Ы · · (Ы
<220>
<221 > таь рернЬНе
<222> (2) . . (95)
<4 00> 16
МеЬ ТНг СЬи СЬп СЬп Тгр Азп РЬе А1а СЬу Ые СЬи АЬа АЬа АЬа Зег
-1 1 5 10 15
АЬа 11е С1п СЬу Азп УаЬ ТНг Зег Ые НЬз Зег Ьеи Ьеи Азр СЬи СЬу
20 25 30
Ьуз СЬп Зег Ьеи ТНг Ьуз Ьеи АЬа АЬа АЬа Тгр СЬу СЬу Зег СЬу Зег
35 40 45
СЬи АЬа Туг СЬп СЬу УаЬ СЬп СЬп Ьуз Тгр Азр АЬа ТНг АЬа ТЬг 61и
50 55 60
Ьеи Азп Азп АЬа Ьеи СЬп Азп Ьеи АЬа Агд ТНг 11е Зег СЬи АЬа СЬу
65 70 75
СЬп АЬа МеЬ АЬа Зег ТНг СЬи СЬу Азп УаЬ ТНг СЬу МеН РНе АЬа
35 90 <210> 17 <2Ы> 328 <212> ПРТ <213> МусоЪасСег1шп СиЬегси1ов13 <220>
<221> таС_рерЫ<1е <222> (43)..(338) <400> 17
Мер СЬп Ьеи -40 УаЬ Азр Агд УаЬ Агд СЬу -35 АЬа УаЬ ТЬг СЬу -30 Меб Зег Агд
Агд Ьеи УаЬ УаЬ СЬу АЬа УаЬ СЬу АЬа АЬа Ьеи УаЬ Зег СЬу Ьеи УаЬ
-25 -20 -15
СЬу АЬа УаЬ СЬу СЬу ТЬг АЬа ТЬг АЬа СЬу АЬа РЬе Зег Агд Рго СЬу
-10 -5 -1 1 5
Ьеи Рго УаЬ СЬи Туг Ьеи СЬп УаЬ Рго Зег Рго Зег Меб СЬу Агд Азр
10 15 20
Не Ьуз УаЬ СЬп РЬе СЬп Зег СЬу СЬу АЬа Азп Зег Рго АЬа Ьеи Туг
25 30 35
Ьеи Ьеи Азр СЬу Ьеи Агд АЬа СЬп Азр Азр РЬе Зег СЬу Тгр Азр Не
40 45 50
Азп ТЬг Рго АЬа РЬе СЬи Тгр Туг Азр СЬп 5ег СЬу Ьеи Зег УаЬ Уаь
55 60 65 70
Меб Рго УаЬ СЬу СЬу СЬп Зег Зег РЬе Туг Зег Азр Тгр Туг СЬп Рго
75 00 85
АЬа Суз 61у Ьуз АЬа СЬу Суз СЬп ТЬг Туг Ьуз Тгр СЬи ТЬг РЬе Ьеи
90 95 100
ТЬг Зег СЬи Ьеи Рго СЬу Тгр Ьеи СЬп АЬа Азп Агд НЬз УаЬ Ьуз Рго
105 110 115
ТЬг СЬу Зег АЬа УаЬ УаЬ СЬу Ьеи Зег МеЬ АЬа АЬа Зег Зег АЬа Ьеи
120 125 130
ТЬг Ьеи АЬа 11е Туг ΗΪ5 Рго СЬп СЬп РЬе УаЬ Туг АЬа СЬу АЬа Мер
135 140 145 150
Зег СЬу Ьеи Ьеи Азр Рго Зег СЬп АЬа Меб СЬу Рго ТЬг Ьеи Не СЬу
155 160 165
Ьеи АЬа Меб СЬу Азр АЬа СЬу СЬу Туг Ьуз АЬа Зег Азр Меб Тгр СЬу
170 175 180
Рго Ьуз СЬи Азр Рго АЬа Тгр СЬп Агд Азп Азр Рго Ьеи Ьеи Азп УаЬ
185 190 195
СЬу Ьуз Ьеи 11е АЬа Азп Азп ТЬг Агд УаЬ Тгр УаЬ Туг Суз СЬу Азп
200 205 210
СЬу Ьуз Рго Зег Азр Ьеи СЬу СЬу Азп Азп Ьеи Рго АЬа Ьуз РЬе Ьеи
215 220 225 230
СЬи СЬу РЬе УаЬ Агд ТЫ Зег Азп Не Ьуз РЬе СЬп Азр АЬа Туг Азп
235 240 245
АЬа СЬу С1у СЬу НЬз Азп СЬу УаЬ РЬе Азр РЬе Рго Азр Зег СЬу ТЬг
250 255 260
НЬз Зег Тгр СЬи Туг Тгр СЬу АЬа СЬп Ьеи Азп АЬа Меб Ьуз Рго Азр
265 270 275
Ьеи СЬп Агд АЬа Ьеи СЬу АЬа ТЬг Рго Азп ТЬг СЬу Рго АЬа Рго СЬп
280 285 290
СЬу АЬа
2 95
<210> 18
<211> 325
<212> ПРТ
- 83 022203 <213> МусоЬасНегЬига СиЬегсиЬозЬз <220>
<221> таН_рернЬс!е <222> (41) . . (325) <400> 18
МеН ТЬг Азр УаЬ Зег Агд Ьуз Не Агд АЬа Тгр СЬу Агд Агд Ьеи МеН
-40 -35 -30 -25
Не СЬу ТЬг АЬа АЬа АЬа УаЬ УаЬ Ьеи Рго СЬу Ьеи УаЬ СЬу Ьеи АЬа
-20 -15 -10
СЬу СЬу АЬа АЬа ТЬг АЬа СЬу АЬа РЬе Зег Агд Рго СЬу Ьеи Рго УаЬ
-5 -1 1 5
СЬи Туг Ьеи СЬп УаЬ Рго Зег Рго Зег МеН СЬу Агд Азр Ые Ьуз УаЬ
10 15 20
СЬп РЬе СЬп Зег СЬу СЬу Азп Азп Зег Рго АЬа УаЬ Туг Ьеи Ьеи Азр
25 30 35 40
СЬу Ьеи Агд АЬа СЬп Азр Азр Туг Азп СЬу Тгр Азр Не Азп ТНг Рго
45 50 55
АЬа РЬе СЬи Тгр Туг Туг СЬп Зег СЬу Ьеи Зег Ые УаЬ МеН Рго УаЬ
60 65 70
СЬу СЬу СЬп Зег Зег РЬе Туг Бег Азр Тгр Туг Бег Рго АЬа Суз СЬу
75 30 85
Ьуз АЬа СЬу Суз СЬп ТЬг Туг Ьуз Тгр СЬи ТЬг РНе Ьеи ТНг Бег СЬи
90 95 100
Ьеи Рго СЬп Тгр Ьеи Зег АЬа Азп Агд АЬа УаЬ Ьуз Рго ТЬг СЬу Бег
105 но 115 120
АЬа АЬа Не СЬу Ьеи Зег МеН АЬа СЬу Зег Зег АЬа МеН Не Ьеи АЬа
125 130 135
АЬа Туг НЬз Рго СЬп СЬп РНе Не Туг АЬа СЬу Зег Ьеи Зег АЬа Ьеи
140 145 150
Ьеи Азр Рго Зег СЬп СЬу Мер СЬу Рго Зег Ьеи Ые СЬу Ьеи АЬа МеН
155 160 165
СЬу Азр АЬа СЬу СЬу Туг Ьуз АЬа АЬа Азр МеН Тгр СЬу Рго Зег Зег
170 175 180
Азр Рго АЬа Тгр СЬи Агд Азп Азр Рго ТЬг СЬп СЬп Ые Рго Ьуз Ьеи
185 190 195 200
УаЬ А1а Азп Азп ТЬг Агд Ьеи Тгр УаЬ Туг Суз СЬу Азп СЬу ТНг Рго
205 210 215
Азп СЬи Ьеи СЬу СЬу АЬа Азп Ые Рго АЬа СЬи РНе Ьеи СЬи Азп РЬе
220 225 230
УаЬ Агд Зег Зег Азп Ьеи Ьуз РЬе СЬп Азр АЬа Туг Азп АЬа АЬа СЬу
235 240 245
СЬу НЬз Азп АЬа УаЬ РЬе Азп РЬе Рго Рго Азп СЬу ТНг НЬз Зег Тгр
250 255 260
СЬи Туг Тгр СЬу АЬа СЬп Ьеи Азп АЬа Меб Ьуз СЬу Азр Ьеи СЬп зег
265 270 275 260
Зег Ьеи СЬу АЬа СЬу
285
<210> 19 <211> 144 <212> ПРТ <213> МусоЬасЬег!ит СиЬегси1оз1з <220>
<221> ΙΝΙΤ_ΜΕΤ <222> (1)..(1) <220>
- 84 022203
<221> ] иаЬ рерЫде
<222> (2) . .(144)
<400> 19
МеЬ АЬа ТНг ТЫ Ьеи Рго УаЬ С1п Агд НЬз Рго Агд Зег Ьеи РНе Рго
-1 1 5 10 15
61и РНе Зег С1и Ьеи РЬе АЬа АЬа РНе Рго Зег РЬе АЬа 61у Ьеи Агд
20 25 30
Рго ТНг РЬе Азр ТНг Агд Ьеи МеЬ Агд Ьеи С1и Азр С1и МеЬ Ьуз ОЬи
35 40 45
С1у Агд Туг С1и УаЬ Агд АЬа 61и Ьеи Рго СЬу Уа1 Азр Рго Азр Ьуз
50 55 60
Азр Уа1 Азр Не МеЬ УаЬ Агд Азр С1у С1п Ьеи ТЬг Пе Ьуз А1а ОЬи
65 70 75
Агд ТЬг 61и 6Ьл Ьуз Азр РНе Азр 61у Агд Зег 61и РЬе А1а Туг СЬу
30 35 90 95
Зег РНе Уа1 Агд ТЬг УаЬ Зег Ьеи Рго Уа1 СЬу АЬа Азр 61и Азр Азр
100 105 110
Пе Ьуз АЬа ТЫ Туг Азр Ьуз С1у Пе Ьеи ТЬг Уа1 Зег УаЬ АЬа УаЬ
115 120 125
Зег С1и 51у Ьуз Рго ТНг С1и Ьуз Ыз Пе 01п Пе Агд Зег ТНг Азп
130 135 140
<210> 20
<211> 228
<212> ПРТ
<213> МусоЬасСегтши СиЬегси1оз13
<220>
<221> таи рерШйе
<222> (24) .,(228)
<400> 20
МеЬ Агд Пе Ьуз Пе РЬе МеЬ Ьеи УаЬ ТЬг АЬа УаЬ УаЬ Ьеи Ьеи Суз
-20 -15 -10
Суз Зег СЬу УаЬ АЬа ТЬг АЬа АЬа Рго Ьуз ТЫ Туг Суз СЬи С1и Ьеи
-5 -1 1 5
Ьуз СЬу ТНг Азр ТЬг 61у СЬп АЬа Суз СЬп Ие СЬп МеЬ 5ег Азр Рго
10 15 20 25
АЬа Туг Азп Пе Азп Пе Зег Ьеи Рго Зег Туг Туг Рго Азр СЬп Ьуз
30 35 40
Зег Ьеи СЬи Азп Туг Пе АЬа СЬп ТЬг Агд Азр Ьуз РЬе Ьеи Зег АЬа
45 50 55
АЬа ТНг Зег Зег ТЬг Рго Агд СЬи АЬа Рго Туг СЬи Ьеи Азп Пе ТЬг
60 65 70
Зег А1а ТЬг Туг СЬп Зег АЬа Пе Рго Рго Агд СЬу ТЬг СЬп АЬа УаЬ
75 80 85
УаЬ Ьеи Ьуз УаЬ Туг СЬп Азп АЬа СЬу СЬу ТЬг НЬз Рго ТНг ТЬг ТЬг
90 95 100 105
Туг Ьуз АЬа РНе Азр Тгр Азр СЬп АЬа Туг Агд Ьуз Рго Пе ТЫ Туг
110 115 120
Азр ТНг Ьеи Тгр СЬп АЬа Азр ТНг Азр Рго Ьеи Рго УаЬ УаЬ РНе Рго
125 130 135
Пе УаЬ СЬп 61у СЬи Ьеи Зег Ьуз СЬп ТЬг СЬу СЬп СЬп Уа1 Зег Пе
140 145 150
А1а Рго Азп АЬа СЬу Ьеи Азр Рго УаЬ Азп Туг СЬп Азп РНе АЬа Уа1
155 160 165
ТНг Азп Азр 61у УаЬ Пе РЬе РЬе РЬе Азп Рго СЬу СЬи Ьеи Ьеи Рго
170 175 180 185
СЬи АЬа А1а еьу Рго ТНг СЬп УаЬ Ьеи УаЬ Рго Агд Зег АЬа Пе Азр
190 195 200
Зег МеГ Ьеи АЬа 205 <210> 21 <211> 355 <212> ПРТ <213> МусоЬасСегЬит СиЬегсиЬозЬз <220>
<221> таГ_рерГЬ<Ье <222> (33)..(355) <400> 21
МеГ Зег Азп -30 Зег Агд Агд Агд Зег -25 Ьеи Агд Тгр Зег Тгр -20 Ьеи Ьеи Зег
УаЬ Ьеи АЬа АЬа УаЬ СЬу Ьеи СЬу Ьеи АЬа ТЬг АЬа Рго АЬа СЬп АЬа
-15 -10 -5 -1
А1а Рго Рго АЬа Ьеи Зег СЬп Азр Агд РЬе АЬа Азр РЬе Рго АЬа Ьеи
1 5 10 15
Рго Ьеи Азр Рго Зег АЬа МеГ УаЬ АЬа СЬп УаЬ СЬу Рго СЬп УаЬ УаЬ
20 25 30
Азп Ые Азп ТЬг Ьуз Ьеи СЬу Туг Азп Азп АЬа УаЬ СЬу АЬа СЬу ТЬг
35 40 45
СЬу Ые УаЬ Ые Азр Рго Азп СЬу УаЬ УаЬ Ьеи ТНг Азп Азп НЬз УаЬ
50 55 60
Ые АЬа СЬу А1а ТЫ Азр ые Азп АЬа РЬе Зег УаЬ СЬу Зег СЬу СЬп
65 70 75 80
ТЬг Туг СЬу УаЬ Азр УаЬ УаЬ СЬу Туг Азр Агд ТНг СЬп Азр УаЬ АЬа
85 90 95
УаЬ Ьеи СЬп Ьеи Агд СЬу АЬа СЬу СЬу Ьеи Рго Зег АЬа АЬа Пе СЬу
100 105 110
СЬу СЬу УаЬ АЬа УаЬ СЬу СЬи Рго УаЬ УаЬ АЬа МеГ СЬу Азп Зег СЬу
115 120 125
СЬу СЬп СЬу СЬу ТЬг Рго Агд АЬа УаЬ Рго СЬу Агд УаЬ УаЬ АЬа Ьеи
130 135 140
СЬу СЬп ТЬг УаЬ СЬп АЬа Зег Азр Зег Ьеи ТЬг СЬу АЬа СЬи СЬи ТЬг
145 150 155 160
Ьеи Азп СЬу Ьеи Ые СЬп РЬе Азр АЬа АЬа Ые СЬп Рго СЬу Азр Зег
165 170 175
СЬу СЬу Рго УаЬ УаЬ Азп СЬу Ьеи СЬу СЬп УаЬ УаЬ СЬу МеГ Азп ТЬг
180 185 190
АЬа АЬа Зег Азр Азп РЬе СЬп Ьеи Зег СЬп СЬу СЬу ст СЬу РЬе АЬа
195 200 205
11е Рго Ые СЬу СЬп АЬа МеГ АЬа Ые АЬа СЬу СЬп Ые Агд Зег СЬу
210 215 220
СЬу СЬу Зег Рго ТЬг УаЬ НЬз Ые СЬу Рго ТЬг АЬа РЬе Ьеи СЬу Ьеи
225 230 235 240
СЬу УаЬ УаЬ Азр Азп Азп СЬу Азп СЬу АЬа Агд УаЬ СЬп Агд УаЬ УаЬ
245 250 255
СЬу Зег АЬа Рго АЬа АЬа Зег Ьеи СЬу 11е Зег ТЬг СЬу Азр УаЬ Ые
260 265 270
ТЬг АЬа УаЬ Азр СЬу АЬа Рго Ые Азп Зег АЬа ТЬг АЬа МеГ АЬа Азр
275 280 285
АЬа Ьеи Азп СЬу НЬз НЬз Рго СЬу Азр УаЬ Ые Зег УаЬ ТЬг Тгр СЬп
290 295 300
ТЬг Ьуз Зег СЬу СЬу ТЬг Агд ТЬг СЬу Азп УаЬ ТЬг Ней АЬа СЬи СЬу
305 310 315 320
Рго Рго АЬа
- 86 022203 <210> 22 <211> 323 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 5ег/А1а-мутант зрелого МСЬ32А <400> 22
А1а 1 Рго Рго А1а Ьеи 5 Зег С1п Азр Агд РЬе 10 А1а Азр РЬе Рго А1а 15 Ьеи
Рго Ьеи Азр Рго Зег А1а МеС Уа1 А1а С1п Уа1 С1у Рго С1п Уа1 Уа1
20 25 30
Азп 11е Азп ТЬг Ьуз Ьеи С1у Туг Азп Азп А1а Уа1 С1у А1а С1у ТЬг
35 40 45
С1у 11е Уа1 11е Азр Рго Азп 51у Уа1 Уа1 Ьеи ТЬг Азп Азп Шз Уа1
50 55 60
11е А1а С1у А1а ТЫ Азр 11е Азп А1а РЬе Зег Уа1 С1у Зег 51 у С1п
65 70 75 80
ТЬг Туг С1у Уа1 Азр Уа1 Уа1 С1у Туг Азр Агд ТЬг С1п Азр Уа1 А1а
85 90 95
Уа1 Ьеи С1п Ьеи Агд С1у А1а С1у С1у Ьеи Рго Зег А1а А1а Пе С1у
100 105 но
С1у 61у Уа1 А1а Уа1 С1у 61и Рго Уа1 Уа1 А1а МеС С1у Азп Зег С1у
115 120 125
С1у С1п С1у 61у ТЬг Рго Агд А1а Уа1 Рго 61у Агд Уа1 Уа1 А1а Ьеи
130 135 140
С1у С1п ТЫ Уа1 61п А1а Зег Азр Зег Ьеи ТЬг С1у А1а С1и С1и ТЬг
145 150 155 160
Ьеи Азп С1у Ьеи 11е С1п РЬе Азр А1а А1а 11е С1п Рго 61у Азр А1а
165 170 175
61у С1у Рго Уа1 Уа1 Азп С1у Ьеи 61у С1п Уа1 Уа1 61у МеС Азп ТЫ
180 185 190
А1а А1а Зег Азр Азп РЬе 61п Ьеи Зег 61п С1у С1у 61п 61у РЬе А1а
195 200 205
11е Рго 11е 61у С1п А1а Мер А1а 11е А1а 61у С1п 11е Агд Зег 51 у
210 215 220
С1у 61у Зег Рго ТЬг Уа1 Шз 11е 61у Рго ТЬг А1а РЬе Ьеи 61у Ьеи
225 230 235 240
С1у Уа1 Уа1 Азр Азп Азп С1у Азп 61у А1а Агд Уа1 <31п Агд Уа1 Уа1
245 250 255
С1у Зег А1а Рго А1а А1а Зег Ьеи С1у 11е Зег ТЬг С1у Азр Уа1 11е
260 265 270
ТЬг А1а Уа1 Азр С1у А1а Рго 11е Азп Зег А1а ТЬг А1а МеС А1а Азр
275 280 285
А1а Ьеи Азп 61у Шз Шз Рго С1у Азр Уа1 11е Зег Уа1 ТЬг Тгр 51п
290 295 300
ТЬг Ьуз Зег С1у С1у ТЬг Агд ТЬг С1у Азп Уа1 ТЬг Ьеи А1а С1и 61у
305 310 315 320
Рго Рго А1а
<210> 23
<211> 96
<212> ПРТ
<213> МуссЬас1;ег1и1п <:иЬегси1озаз
<400> 23
Мер 1 Зег СЬп Ые Мер 5 Туг Азп Туг Рго АЬа ЬО Мер Ьеи СЬу НЬз АЬа 15 СЬу
Азр Мер АЬа СЬу Туг АЬа СЬу ТНг Ьеи СЬп Зег Ьеи СЬу АЬа СЬи Ые
20 25 30
АЬа УаЬ СЬи СЬп АЬа АЬа Ьеи СЬп Зег АЬа Тгр СЬп СЬу Азр ТЬг СЬу
35 40 45
Ые ТНг Туг СЬп АЬа Тгр СЬп АЬа СЬп Тгр Азп СЬп АЬа МеР СЬи Азр
50 55 60
Ьеи УаЬ Агд АЬа Туг НЬз АЬа Мер Зег Зег ТЬг НЬз СЬи АЬа Азп ТЬг
65 70 75 80
Мер АЬа Мер Мер АЬа Агд Азр ТЬг АЬа СЬи АЬа АЬа Ьуз Тгр СЬу СЬу
95 90 95
<210> 24 <2Ы> 723 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> МРЬ72Р <400> 24
мер 1 ТЬг АЬа АЬа Зег 5 Азр Азп РЬе
РЬе АЬа Ые Рго 20 Ые СЬу СЬп АЬа
Зег СЬу СЬу 35 СЬу Зег Рго ТЬг УаЬ 40
СЬу Ьеи 50 СЬу УаЬ УаЬ Азр Азп 55 Азп
УаЬ 65 УаЬ СЬу Зег АЬа Рго 70 АЬа АЬа
УаЬ Ые ТЬг АЬа УаЬ 35 Азр СЬу АЬа
АЬа Азр АЬа Ьеи 100 Азп СЬу НЬз НЬз
Тгр СЬп ТЬг 115 Ьуз Зег СЬу СЬу ТЬг 120
СЬи СЬу 130 Рго Рго АЬа СЬи РЬе 135 МеР
СЬи 145 Ые Азп Зег АЬа Агд 150 Мер Туг
УаЬ АЬа АЬа АЬа СЬп 165 Мер Тгр Азр
АЬа АЬа Зег АЬа 180 РЬе СЬп Зег УаЬ
Тгр Ые СЬу 195 Зег Зег АЬа СЬу Ьеи 200
УаЬ АЬа 210 Тгр Мер Зег УаЬ ТЬг 215 АЬа
СЬп 225 УаЬ Агд УаЬ АЬа АЬа 230 АЬа АЬа
УаЬ Рго Рго Рго УаЬ 245 Ые АЬа СЬи
11е АЬа ТЬг Азп 260 Ьеи Ьеи СЬу СЬп
СЬи АЬа СЬи 275 Туг СЬу СЬи Мер Тгр 280
СЬу Туг 290 АЬа АЬа АЬа ТЬг АЬа 295 ТЬг
СЬп Ьеи 10 Зег СЬп СЬу СЬу СЬп 15 СЬу
Мер 25 АЬа Ые АЬа СЬу СЬп 30 Ые Агд
НЬз Ые СЬу Рго ТЬг 45 АЬа РЬе Ьеи
СЬу Азп СЬу АЬа 60 Агд УаЬ СЬп Агд
Зег Ьеи СЬу 75 Ые Зег ТЬг СЬу Азр 80
Рго Ые 90 Азп Зег АЬа ТЬг АЬа 95 МеР
Рго 105 СЬу Азр УаЬ Ые Зег 110 УаЬ ТЬг
Агд ТЬг СЬу Азп УаЬ 125 ТЬг Ьеи АЬа
УаЬ Азр РЬе СЬу 140 АЬа Ьеи Рго Рго
АЬа СЬу Рго 155 СЬу Зег АЬа Зег Ьеи 160
Зег УаЬ 170 АЬа Зег Азр Ьеи РЬе 175 Зег
УаЬ 185 Тгр СЬу Ьеи ТЬг УаЬ 190 СЬу Зег
Мер УаЬ АЬа АЬа АЬа 205 Зег Рго Туг
СЬу СЬп АЬа СЬи 220 Ьеи ТЬг АЬа АЬа
Туг СЬи ТЬг 235 АЬа Туг СЬу Ьеи ТЬг 240
Азп Агд 250 АЬа СЬи Ьеи МеР Ые 255 Ьеи
Азп 265 ТЬг Рго АЬа Ые АЬа 270 УаЬ Азп
АЬа СЬп Азр АЬа АЬа 285 АЬа Мер РЬе
АЬа ТЬг АЬа ТЬг 300 Ьеи Ьеи Рго РЬе
- 88 022203
СЬи СЬи АЬа Рго СЬи МеГ ТНг Зег АЬа СЬу СЬу Ьеи Ьеи СЬи СЬп АЬа
305 310 315 320
АЬа АЬа УаЬ СЬи СЬи АЬа Зег Азр ТНг АЬа АЬа А1а Азп СЬп Ьеи МеГ
325 330 335
Азп Азп УаЬ Рго СЬп АЬа Ьеи СЬп СЬп Ьеи АЬа СЬп Рго ТНг СЬп СЬу
340 345 350
ТНг ТНг Рго Зег Зег Ьуз Ьеи СЬу СЬу Ьеи Тгр Ьуз ТНг УаЬ Зег Рго
355 360 365
НЬз Агд Зег Рго 11е Зег Азп МеГ УаЬ Зег МеГ АЬа Азп Азп НЬз МеГ
370 375 380
Зег Мен ТНг Азп Зег СЬу УаЬ Зег Мег ТНг Азп ТНг Ьеи Зег Зег МеГ
385 390 395 400
Ьеи Ьуз СЬу РНе АЬа Рго АЬа АЬа АЬа АЬа СЬп АЬа УаЬ СЬп ТНг АЬа
405 410 415
АЬа СЬп Азп СЬу УаЬ Агд АЬа МеГ Зег Зег Ьеи СЬу Зег Зег Ьеи СЬу
420 425 430
Зег Зег СЬу Ьеи СЬу СЬу СЬу УаЬ АЬа АЬа Азп Ьеи СЬу Агд АЬа АЬа
435 440 445
Зег УаЬ СЬу Зег Ьеи Зег УаЬ Рго СЬп АЬа Тгр АЬа АЬа АЬа Азп СЬп
450 4 55 460
АЬа УаЬ ТНг Рго АЬа АЬа Агд АЬа Ьеи Рго Ьеи ТНг Зег Ьеи ТНг Зег
465 470 475 480
АЬа АЬа СЬи Агд СЬу Рго СЬу СЬп МеГ Ьеи СЬу СЬу Ьеи Рго УаЬ СЬу
485 490 4 95
СЬп МеГ СЬу АЬа Агд АЬа СЬу СЬу СЬу Ьеи Зег СЬу УаЬ Ьеи Агд УаЬ
500 505 510
Рго РГО Агд Рго Туг УаЬ МеГ Рго НЬз Зег Рго АЬа АЬа СЬу Азр Не
515 520 525
АЬа Рго Рго АЬа Ьеи Зег СЬп Азр Агд РНе АЬа Азр РНе Рго АЬа Ьеи
530 535 540
Рго Ьеи Азр Рго Зег АЬа МеГ УаЬ АЬа СЬп УаЬ СЬу Рго СЬп УаЬ УаЬ
545 550 555 560
Азп Не Азп ТНг Ьуз Ьеи СЬу Туг Азп Азп АЬа УаЬ СЬу АЬа СЬу ТЬг
565 570 575
СЬу Не УаЬ Не Азр Рго Азп СЬу УаЬ УаЬ Ьеи ТНг Азп Азп НЬз УаЬ
580 585 590
Пе АЬа СЬу АЬа ТНг Азр Не Азп АЬа РЬе зег УаЬ СЬу Зег СЬу СЬп
595 600 605
ТНг Туг СЬу УаЬ Азр УаЬ УаЬ СЬу ТУГ Азр Агд ТНг СЬп Азр УаЬ АЬа
610 615 620
УаЬ Ьеи СЬп Ьеи Агд СЬу АЬа СЬу СЬу Ьеи Рго Зег АЬа АЬа Не СЬу
625 630 635 640
СЬу СЬу УаЬ АЬа УаЬ СЬу СЬи Рго УаЬ УаЬ АЬа МеГ СЬу Азп Зег СЬу
645 650 655
СЬу СЬп СЬу СЬу ТНг Рго Агд АЬа УаЬ Рго СЬу Агд УаЬ УаЬ АЬа Ьеи
660 665 670
СЬу СЬп ТНг УаЬ СЬп АЬа Зег Азр Зег Ьеи ТНг СЬу АЬа СЬи СЬи ТНг
675 680 685
Ьеи Азп СЬу Ьеи Не СЬп РНе Азр АЬа АЬа Не СЬп Рго СЬу Азр Зег
690 695 700
СЬу СЬу Рго УаЬ УаЬ Азп СЬу Ьеи СЬу СЬп УаЬ УаЬ СЬу МеГ Азп ТЬг
705 710 715 720
АЬа АЬа Зег
<210> 25 <211> 723 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 89 022203 <220>
<223> М72 <400> 25
Меб ТНг А1а А1а Зег Азр Азп РЬе 61п Ьеи Зег С1п 61 у 61у С1п 61 у
1 5 10 15
РНе А1а 11е Рго 11е 61 у 61п А1а Меб А1а 11е А1а 61у 61п 11е Агд
20 25 30
Зег С1у 61у С1у Зег Рго ТЬг Уа1 Н1з 11е 61 у Рго ТЬг А1а РЬе Ьеи
35 40 45
С1у Ьеи 61у 7а1 Уа1 Азр Азп Азп 61 у Азп С1у А1а Агд Уа1 С1п Агд
50 55 60
Уа1 Уа1 С1у Зег А1а Рго А1а А1а Зег Ьеи 01у Не Зег ТЬг 61у Αερ
65 70 75 80
Уа1 Пе ТЬг А1а Уа1 Азр 61у А1а Рго 11е Азп Зег А1а ТЬг А1а Меб
85 90 95
А1а Азр А1а Ьеи Азп 61 у Ηίε Ηί з Рго С1у Азр Уа1 11е Зег Уа1 ТНг
100 105 110
Тгр 61п ТЬг Ьуз Зег С1у 61у ТЬг Агд ТЬг С1у Азп Уа1 ТЬг Ьеи А1а
115 120 125
С1и 61у Рго Рго А1а 61и РЬе Меб Уа1 Азр РЬе 61 у А1а Ьеи Рго Рго
130 135 140
61и Пе Азп Зег А1а Агд Меб Туг А1а С1у Рго С1у Зег А1а Зег Ьеи
145 150 155 160
Уа1 А1а А1а А1а 61п Меб Тгр Азр Зег Уа1 А1а Зег Азр Ьеи РЬе Зег
165 170 175
А1а А1а Зег А1а РЬе 61п Зег Уа1 Уа1 Тгр 61у Ьеи ТЬг Уа1 61у Зег
180 185 190
Тгр Не С1у Зег Зег А1а С1у Ьеи Меб Уа1 А1а А1а А1а Зег Рго Туг
195 200 205
Уа1 А1а Тгр Меб Зег Уа1 ТЬг А1а 61у 61п А1а 61и Ьеи ТЬг А1а А1а
210 215 220
61п Уа1 Агд Уа1 А1а А1а А1а А1а Туг 61и ТЬг А1а Туг 61у Ьеи ТЬг
225 230 235 240
Уа1 Рго Рго Рго Уа1 11е А1а С1и Азп Агд А1а С1и Ьеи Меб 11е Ьеи
245 250 255
11е А1а ТЬг Азп Ьеи Ьеи 61у 61п Азп ТЬг Рго А1а Пе А1а Уа1 Αεη
260 265 270
61и А1а 51X1 Туг 61 у 61и Меб Тгр А1а С1п Азр А1а А1а А1а Меб РЬе
27 5 280 285
С1у Туг А1а А1а А1а ТЬг А1а ТЬг А1а ТЬг А1а ТЬг Ьеи Ьеи Рго РЬе
290 295 300
С1и 61 и А1а Рго С1и Меб ТЬг Зег А1а С1у 61у Ьеи Ьеи 61и С1п А1а
305 310 315 320
А1а А1а Уа1 С1и С1и А1а Зег Азр ТЬг А1а А1а А1а Азп 61п Ьеи Меб
325 330 335
Азп Азп Уа1 Рго С1п А1а Ьеи С1п С1п Ьеи А1а С1п Рго ТЬг 61п С1у
340 345 350
тнг ТЬг Рго Зег Зег Ьуз Ьеи 61у 61у Ьеи Тгр Ьуз ТЬг Уа1 Зег Рго
355 360 365
Н1з Агд Зег Рго Пе Зег Азп Меб Уа1 Зег Меб А1а Азп Азп Ηί$ Меб
370 375 380
Зег Меб ТЬг Азп Зег С1у Уа1 Зег Меб ТЬг Азп ТЬг Ьеи Зег Зег Меб
385 390 395 400
Ьеи Ьуз 61у РЬе А1а Рго А1а А1а А1а А1а С1п А1а Уа1 61п ТЫ А1а
405 410 415
А1а 61п Азп 61у Уа1 Агд А1а Меб Зег Зег Ьеи 61у Зег Зег Ьеи 61у
420 425 430
Зег Зег 61у Ьеи 61у 61у С1у Уа1 А1а А1а Азп Ьеи 61у Агд А1а А1а
435 440 445
Зег Уа1 61у Зег Ьеи Зег Уа1 Рго 61п А1а Тгр А1а А1а А1а Азп 61п
450 455 4 60
А1а Уа1 ТНг Рго А1а А1а Агд А1а Ьеи Рго Ьеи ТЬг Зег Ьеи ТЬг Зег
4 65 470 475 480
А1а А1а 61и Агд С1у Рго С1у С1п Ме! Ьеи 61 у 61 у Ьеи Рго νβΐ 61у
435 490 495
С1п Ме! <31 у А1а Агд А1а 61у 61у 51у Ьеи Зег С1у Уа1 Ьеи Агд Уа1
500 505 510
Рго Рго Агд Рго Туг \Га1 Ме! Рго НГЗ Зег Рго А1а А1а С1у Азр Не
515 520 525
А1а Рго Рго А1а Ьеи Зег 61п Азр Агд РНе А1а Азр РЬе Рго А1а Ьеи
530 535 540
Рго Ьеи Азр Рго Зег А1а Ме! Уа1 А1а 61п Уа1 61 у Рго С1п Уа1 Уа1
545 550 555 560
Азп Не Азп ТНг Ьуз Ьеи 61у Туг Азп Азп А1а Уа1 С1у А1а 61у ТЬг
565 570 575
61у 11е Уа1 Не Азр Рго Азп С1у Уа1 Уа1 Ьеи ТЬг Азп Азп ΗΪ5 Уа1
530 585 590
Не А1а С1у А1а ТНг Азр Пе Азп А1а РЬе Зег Уа1 С1у Зег 61у 61п
595 600 605
ТНг Туг 01у Уа1 Азр Уа1 Уа1 С1у Туг Азр Агд ТЬг С1п Азр Уа1 А1а
610 615 620
Уа1 Ьеи С1п Ьеи Агд 61у А1а С1у 61у Ьеи Рго Зег А1а А1а 11е 61у
625 630 635 640
61у 61у Уа1 А1а Уа1 61у С1и Рго Уа1 Уа1 А1а Ме! С1у Азп Зег С1у
645 650 655
С1у 61п С1у С1у ТЬг Рго Агд А1а Уа1 Рго 61у Агд Уа1 Уа1 А1а Ьеи
660 665 670
<31у 61п ТНг Уа1 61п А1а Зег Азр Зег Ьеи ТНг 61у А1а 61и 61и ТЬг
675 680 685
Ьеи Азп 61у Ьеи Не <31п РЬе Азр А1а А1а Пе С1п Рго 01у Азр А1а
690 695 700
С1у 61у Рго Уа1 Уа1 АЗП 61у Ьеи 61у ст Уа1 νβΐ С1у Μθΐ. Азп ТЫ
705 710 715 720
А1а А1а Зег
<210> 26
<211> 702
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220
<223> МСЬ71£
<400> 26
Азр Рго Уа1 Азр А1а Уа1 Не Азп ТЬг ТЬг Суз Азп Туг 61у С1п Уа1
1 5 10 15
Уа1 А1а А1а Ьеи Азп А1а ТЬг Азр Рго 61у А1а А1а А1а 61п РЬе Азп
20 25 30
А1а Зег Рго Уа1 А1а С1п Зег Туг Ьеи Агд Азп РЬе Ьеи А1а А1а Рго
35 40 45
Рго Рго 61п Агд А1а А1а Ме! А1а А1а 61п Ьеи <31п А1а Уа1 Рго О1у
50 55 60
А1а А1а 61п Туг Не 61у Ьеи Уа1 61и Зег Уа1 А1а 61 у Зег Суз Азп
65 70 75 80
Азп Туг 61и Ьеи Ме! ТЬг Не Азп Туг 61п РЬе С1у Азр Уа1 Азр А1а
85 90 95
Ηί5 61у А1а Ме! Не Агд А1а С1п А1а А1а Зег Ьеи С1и А1а С1и Нгз
100 105 110
61п А1а Не Уа1 Агд Азр Уа1 Ьеи А1а А1а 61у Азр РЬе Тгр С1у <31у
- 91 022203
115 120 125
АЬа С1у Зег УаЬ АЬа Суз СЬп СЬи РНе Ые ТНг СЬп Ьеи СЬу Агд Азп
130 135 140
РЬе СЬп УаЬ 11е Туг СЬи СЬп АЬа Азп АЬа НЬз СЬу СЬп Ьуз УаЬ СЬп
145 150 155 160
АЬа АЬа еьу Азп Азп Меб АЬа СЬп ТНг Азр Зег АЬа УаЬ СЬу Зег Зег
165 170 175
Тгр АЬа ТНг Зег Меб Зег Ьеи Ьеи Азр АЬа НЬз Ые Рго СЬп Ьеи УаЬ
180 185 190
АЬа Зег СЬп Зег АЬа РНе АЬа АЬа Ьуз АЬа СЬу Ьеи Меб Агд НЬз ТНг
195 200 205
Ые СЬу СЬп АЬа СЬи СЬп АЬа АЬа Меб Зег АЬа СЬп АЬа РЬе НЬз СЬп
210 215 220
СЬу С1и Зег Зег АЬа АЬа РЬе СЬп АЬа А1а НЬз АЬа Агд РЬе УаЬ АЬа
225 230 235 240
АЬа АЬа АЬа Ьуз УаЬ Азп ТНг Ьеи Ьеи Азр УаЬ АЬа СЬп АЬа Азп Ьеи
245 250 255
СЬу С1и АЬа АЬа СЬу ТНг Туг УаЬ АЬа АЬа Азр АЬа АЬа АЬа АЬа Зег
2 60 265 270
ТНг Туг ТНг СЬу РНе Азр Пе Меб Азр РНе СЬу Ьеи Ьеи Рго Рго СЬи
275 280 285
УаЬ Азп Зег Зег Агд Меб Туг Зег СЬу Рго С1у Рго СЬи Зег Меб Ьеи
290 295 300
АЬа АЬа АЬа АЬа АЬа Тгр Азр СЬу УаЬ АЬа АЬа СЬи Ьеи ТНг Зег АЬа
305 310 315 320
АЬа УаЬ Зег Туг СЬу Зег УаЬ УаЬ Зег ТНг Ьеи 11е УаЬ СЬи Рго Тгр
325 330 335
Меб С1у Рго АЬа АЬа АЬа АЬа Меб АЬа АЬа АЬа АЬа ТНг Рго Туг УаЬ
340 345 350
С1у Тгр Ьеи АЬа АЬа ТНг АЬа АЬа Ьеи АЬа Ьуз С1и ТНг АЬа ТЬг СЬп
355 360 365
АЬа Агд АЬа АЬа АЬа СЬи АЬа РЬе еьу ТНг АЬа РЬе АЬа Меб ТЬг УаЬ
370 375 380
Рго Рго Зег Ьеи УаЬ АЬа АЬа Азп Агд Зег Агд Ьеи Меб Зег Ьеи УаЬ
385 390 395 400
АЬа АЬа Азп Пе Ьеи СЬу СЬп Азп Зег АЬа АЬа Ые АЬа АЬа ТЬг СЬп
405 410 415
АЬа С1и Туг АЬа С1и Меб Тгр А1а СЬп Азр АЬа АЬа УаЬ Меб Туг Зег
420 425 430
Туг СЬи СЬу АЬа Зег АЬа АЬа АЬа Зег АЬа Ьеи Рго Рго РНе ТНг Рго
435 440 445
Рго УаЬ СЬп СЬу ТЬг СЬу Рго АЬа СЬу Рго АЬа АЬа АЬа АЬа АЬа АЬа
4 50 455 4 60
ТНг СЬп АЬа АЬа СЬу АЬа СЬу АЬа УаЬ АЬа Азр АЬа СЬп АЬа ТЫ Ьеи
465 470 475 480
АЬа СЬп Ьеи Рго Рго СЬу Ые Ьеи Зег Азр 11е Ьеи Зег АЬа Ьеи АЬа
485 490 495
А1а Азп АЬа Азр Рго Ьеи ТЬг Зег СЬу Ьеи Ьеи СЬу Ые АЬа Зег ТНг
500 505 510
Ьеи Азп Рго СЬп УаЬ СЬу Зег АЬа СЬп Рго Ые УаЬ Ые Рго ТЬг Рго
515 520 525
Ые СЬу СЬи Ьеи Азр УаЬ Ые АЬа Ьеи Туг Ые АЬа Зег Ые АЬа ТНг
530 535 540
С1у Зег 11е АЬа Ьеи АЬа Ые ТЬг Азп ТНг АЬа Агд Рго Тгр НЬз 11е
545 550 555 560
61у Ьеи Туг С1у Азп АЬа СЬу СЬу Ьеи С1у Рго ТНг СЬп СЬу НЬз Рго
5 65 570 575
Ьеи Зег Зег АЬа ТНг Азр СЬи Рго СЬи Рго НЬз Тгр СЬу Рго РНе СЬу
530 585 590
СЬу АЬа АЬа Рго УаЬ Зег АЬа СЬу УаЬ СЬу НЬз АЬа АЬа Ьеи УаЬ С1у
595 600 605
- 92 022203
АЪа Ъеи Зег 610 УаЪ Рго НЪз Зег 615 Тгр ТЬг ТЬг АЬа АЪа 620 Рго СЪи ЪЪе СЪп
Ъеи АЪа УаЪ СЪп АЪа ТЬг Рго ТЬг РЬе Зег Зег Зег АЪа СЪу АЪа Азр
625 630 635 640
РгО ТЬг АЪа Ъеи Азп СЪу Меб Рго АЪа СЪу Ьей Ъеи Зег СЪу Меб АЪа
645 650 655
Ъеи АЪа Зег Ъеи АЪа АЪа Агд СЪу ТЬг ТЬг СЬу СЪу СЪу СЪу ТЬг Агд
660 665 670
Зег СЪу ТЬг Зег ТЬг Азр СЪу СЪп СЪи Азр СЬу Агд Ъуз Рго Рго УаЪ
675 680 685
УаЪ УаЪ Ие Агд СЪи СЪп Рго Рго Рго СЪу Азп Рго Рго Агд
690 695 700
<21 0> 27
<21 1> 920
<21: 2> ПРТ
<21 3> Иску< зственная лос эледовательность
<2 21 0>
<22: 3> М72-МбЬ9 . 9-МбЬ9.1 3
<401 0> 27
Меб ты АЪа АЪа Зег Азр Азп РЬе СЪп Ъеи Зег СЪп СЪу СЪу СЪп СЪу
1 5 10 15
РЬе АЪа не Рго 11е СЪу СЪп АЪа Меб АЪа 11е АЪа СЪу СЪп Пе Агд
20 25 30
Зег СЪу СЪу СЪу Зег Рго ТЬг УаЪ НЪз 11е СЪу Рго ТЬг АЪа РЬе Ъеи
35 40 45
СЪу Ъеи СЪу УаЪ УаЪ Азр Азп Азп СЪу Азп СЪу АЪа Агд УаЪ СЪп Агд
50 55 60
УаЪ УаЪ СЪу Зег АЪа Рго АЪа АЪа Зег Ъеи СЪу 11е Зег ТЫ СЪу Азр
65 70 75 30
УаЪ Пе ТЬг АЪа УаЪ Азр СЪу АЪа Рго Пе Азп Зег АЪа ТЬг АЪа Меб
85 90 95
АЪа Азр АЪа Ъеи Азп СЪу НЪз НЪз Рго СЪу Азр УаЪ Не Зег УаЪ ТЬг
100 105 110
Тгр СЪп ТЬг Ъуз Зег СЪу СЪу ТЬг Агд ТЬг СЪу Азп УаЪ ТЬг Ъеи АЪа
115 120 125
СЪи СЪу Рго Рго АЪа СЪи РЬе Меб УаЪ Азр РЬе СЪу АЪа Ъеи Рго Рго
130 135 140
СЪи 1Ъе Азп Зег АЪа Агд Меб Туг АЪа СЪу Рго СЪу Зег АЪа Зег Ъеи
145 150 155 160
УаЪ АЪа АЪа АЪа СЪп Меб Тгр Азр Зег УаЪ АЪа Зег Азр Ъеи РЬе Зег
165 170 175
АЪа АЪа Зег АЪа РЬе СЪп Зег УаЪ УаЪ Тгр СЪу Ъеи ТЬг УаЪ СЪу Зег
180 185 190
Тгр 11е СЪу Зег Зег АЪа СЪу Ъеи Меб УаЪ АЪа АЪа АЪа Зег Рго Туг
195 200 205
УаЪ АЪа Тгр Меб Зег УаЪ ТЬг АЪа СЪу СЪп АЪа СЪи Ъеи ТЬг АЪа АЪа
210 215 220
СЪп УаЪ Агд УаЪ АЪа АЪа АЪа АЪа Туг СЪи ТЬг АЪа Туг СЪу Ъеи ТЬг
225 230 235 240
УаЪ Рго Рго Рго УаЪ Ие АЪа СЪи Азп Агд АЪа СЪи Ъеи Меб Пе Ъеи
245 250 255
11е АЪа ТЬг Азп Ъеи Ъеи СЪу СЪп Азп ТЬг Рго АЪа Пе АЪа УаЪ Азп
260 265 270
СЪи АЪа СЪи Туг С1у СЪи Меб Тгр АЪа СЪп Азр АЪа АЪа АЪа Меб РЬе
275 280 285
СЪу Туг АЪа АЪа АЪа ТЫ АЪа ТЫ АЪа ТЬг АЪа ТЬг Ъеи Ъеи Рго РЬе
290 295 300
С1и СЬи АЬа Рго СЬи Меб ТЬг Зег АЬа СЬу СЬу Ьеи Ьеи СЬи СЬп АЬа
305 310 315 320
АЬа АЬа ν^Ι СЬи СЬи АЬа Зег Азр ТЬг АЬа АЬа АЬа Азп СЬп Ьеи МеЬ
325 330 335
Азп Азп ν3ι Рго СЬп АЬа Ьеи СЬп СЬп Ьеи АЬа СЬп Рго ТНг СЬп СЬу
340 345 350
ТНг ТЬг Рго Зег Зег Ьуз Ьеи СЬу СЬу Ьеи Тгр Ьуз ТЫ Уа1 Зег Рго
355 360 365
НЬз Агд Зег Рго Не Зег Азп МеЬ УаЬ 5ег Меб АЬа Азп Азп НЬз МеЬ
370 375 390
Зег МеЬ ТЬг Азп Зег СЬу УаЬ Зег МеЬ ТНг Азп ТНг Ьеи Зег Зег МеГ
385 390 395 400
Ьеи Ьуз СЬу РЬе АЬа Рго АЬа АЬа АЬа АЬа СЬп АЬа УаЬ СЬп ТЫ АЬа
405 410 415
АЬа СЬп Азп СЬу УаЬ Агд АЬа МеЬ Зег Зег Ьеи СЬу Зег Зег Ьеи СЬу
420 425 430
Зег Зег СЬу Ьеи СЬу СЬу СЬу УаЬ АЬа АЬа Азп Ьеи СЬу Агд АЬа АЬа
435 440 445
Зег УаЬ СЬу Зег Ьеи Зег Уа1 Рго СЬп АЬа Тгр АЬа АЬа АЬа Азп СЬп
450 455 460
АЬа УаЬ ТЬГ Рго АЬа АЬа Агд АЬа Ьеи Рго Ьеи ТНг Зег Ьеи ТЬг Зег
465 470 475 490
АЬа АЬа СЬи Агд СЬу Рго СЬу СЬп МеГ Ьеи СЬу СЬу Ьеи Рго УаЬ СЬу
485 490 4 95
СЬп МеЬ СЬу АЬа Агд АЬа СЬу СЬу СЬу Ьеи Зег СЬу УаЬ Ьеи Агд УаЬ
500 505 510
Рго Рго Агд Рго Туг Уа1 МеН Рго НЬз Зег Рго АЬа АЬа СЬу Аэр 11е
515 520 525
АЬа Рго Рго АЬа Ьеи Зег СЬп Азр Агд РЬе АЬа Азр РЬе Рго АЬа Ьеи
530 535 540
Рго Ьеи Азр Рго Зег АЬа Ме- УаЬ АЬа СЬп УаЬ СЬу Рго СЬп УаЬ УаЬ
545 550 555 560
Азп Не Азп ты Ьуз Ьеи С1у Туг Азп Азп АЬа УаЬ СЬу АЬа СЬу ТНг
565 570 575
СЬу 11е УаЬ 11е Азр Рго Азп СЬу УаЬ УаЬ Ьеи ТНг Азп Азп НЬз УаЬ
560 585 590
Не АЬа СЬу АЬа ТЫ Азр Не Азп АЬа РЬе Зег Уа1 СЬу Зег СЬу СЬп
595 600 605
ТЬг Туг СЬу УаЬ Азр УаЬ Уа1 СЬу Туг Азр Агд ТНг СЬп Азр \ГаЬ АЬа
610 615 620
УаЬ Ьеи СЬп Ьеи Агд СЬу АЬа СЬу СЬу Ьеи Рго Зег АЬа АЬа Не СЬу
625 630 635 640
СЬу СЬу УаЬ А1а УаЬ СЬу СЬи Рго УаЬ УаЬ АЬа МеЬ СЬу Азп Зег СЬу
645 650 655
СЬу СЬп С1у СЬу ТНг Рго Агд АЬа Уа1 Рго СЬу Агд Уа1 УаЬ АЬа Ьеи
660 665 670
СЬу С1п ТЬг УаЬ СЬп АЬа Зег Азр Зег Ьеи ТЬг СЬу А1а СЬи СЬи ТНг
675 680 685
Ьеи Аэп С1у Ьеи Не СЬп РНе Азр АЬа АЬа Не СЬп Рго СЬу АЗр АЬа
690 695 700
СЬу СЬу Рго ν3ι УаЬ Азп СЬу Ьеи СЬу СЬп νβΐ Уа1 СЬу МеС. Азп ТНг
705 710 715 720
АЬа АЬа Зег Зег ТЬг Меб ТНг Не Азп Туг СЬп РНе СЬу Азр УаЬ Азр
725 730 735
АЬа НЬз 51у АЬа Меб 11е Агд АЬа СЬп АЬа АЬа Зег Ьеи СЬи АЬа СЬи
740 745 750
Ηί з СЬп АЬа 11е УаЬ Агд Азр УаЬ Ьеи АЬа АЬа СЬу Азр РНе Тгр СЬу
755 760 7 65
СЬу А1а СЬу Зег УаЬ АЬа Суз СЬп СЬи РНе Не ТНг СЬп Ьеи СЬу Агд
770 775 780
Азп РЬе СЬп УаЬ Не Туг СЬи СЬп АЬа Азп АЬа НЬз СЬу СЬп Ьуз УаЬ
- 94 022203
785 7 90 795 800
СЬп А1а АЬа С1у Азп Азп Мех А1а <31п ТЬг Азр Зег АЬа УаЬ СЬу Зег
805 810 815
Зег Тгр АЬа ТНг Зег МеХ Зег Ьеи Ьеи Азр АЬа НЬз Ые Рго СЬп Ьеи
820 825 830
Уа1 А1а Зег С1п Зег А1а РЬе А1а АЬа Ьуз А1а СЬу Ьеи МеХ Агд НЬз
835 840 845
ТЬг 11е СЬу <31п А1а С1и СЬп А1а АЬа МеХ Зег АЬа СЬп АЬа РНе Й13
850 855 860
СЬп СЬу СЬи Зег Зег А1а А1а РЬе СЬп А1а АЬа НЬз АЬа Агд РЬе УаЬ
865 870 875 880
АЬа А1а АЬа А1а Ьуз УаЬ Азп ТЫ Ьеи Ьеи Азр УаЬ АЬа СЬп АЬа Азп
885 8 90 395
Ьеи С1у СЬи А1а А1а СЬу ТЬг Туг Уа1 АЬа АЬа Азр АЬа АЬа АЬа АЬа
900 905 910
Зег ТНг Туг ТЬг С1у РНе Рго Тгр
915 920 <210> 28 <211> 1010 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> М1ОЗ <400> 28
Мей ТЫ АЬа АЬа Зег Азр Азп РЬе СЬп Ьеи Зег СЬп СЬу С1у СЬп СЬу
1 5 10 15
РНе АЬа Ые Рго Ые СЬу СЬп АЬа МеХ АЬа 11е АЬа СЬу СЬп Ые Агд
20 25 30
Зег СЬу СЬу С1у Зег Рго ТЬг УаЬ НЬз 11е СЬу Рго ТЬг АЬа РЬе Ьеи
35 40 45
СЬу Ьеи СЬу УаЬ УаЬ Азр Азп Азп СЬу Азп СЬу АЬа Агд УаЬ СЬп Агд
50 55 60
Уа1 УаЬ СЬу Зег АЬа Рго АЬа АЬа Зег Ьеи СЬу Ые Зег ТНг СЬу Азр
65 70 75 80
Уа1 Не ТЫ АЬа УаЬ Азр СЬу АЬа Рго Ые Азп Зег А1а ТНг АЬа Мей
85 90 95
АЬа Азр АЬа Ьеи Азп С1у НЬз НЬз Рго СЬу Азр УаЬ 11е Зег УаЬ ТНг
100 105 110
Тгр СЬп ТЬг Ьуз Зег С1у СЬу ТЬг Агд ТНг СЬу Азп УаЬ ТНг Ьеи АЬа
115 120 125
СЬи СЬу Рго Рго АЬа СЬи РЬе МеХ УаЬ Азр РЬе СЬу А1а Ьеи Рго Рго
130 135 140
СЬи Ые Азл Зег АЬа Агд Мех Туг АЬа СЬу Рго СЬу Зег АЬа Зег Ьеи
145 150 155 160
УаЬ АЬа АЬа АЬа СЬп МеХ Тгр Азр Зег УаЬ АЬа Зег Аар Ьеи РЬе Зег
165 170 175
АЬа АЬа Зег АЬа РЬе С1п Зег Уа1 УаЬ Тгр СЬу Ьеи ТНг Уа1 СЬу Зег
130 185 190
Тгр 1Ье СЬу Зег Зег АЬа СЬу Ьеи МеХ УаЬ АЬа АЬа А1а Зег Рго Туг
195 200 205
Уа1 АЬа Тгр МеХ Зег УаЬ ТЬг А1а СЬу СЬп А1а СЬи Ьеи ТНг АЬа АЬа
210 215 220
СЬп УаЬ Агд Уа1 АЬа АЬа АЬа АЬа Туг СЬи ТНг АЬа Туг <31 у Ьеи ТНг
225 230 235 240
Уа1 Рго Рго Рго УаЬ Не АЬа СЬи Азп Агд АЬа СЬи Ьеи МеХ Ые Ьеи
245 250 255
11е АЬа ТЬг Азп Ьеи Ьеи СЬу СЬп Аэп ТЬг Рго АЬа Ые АЬа УаЬ Азп
260 265 270
СЬи АЬа СЬи Туг СЬу СЬи МеН Тгр АЬа СЬп Азр АЬа АЬа АЬа МеН РНе
275 280 285
СЬу Туг АЬа АЬа АЬа ТЫ АЬа ТНг АЬа ТЫ АЬа ТНг Ьеи Ьеи Рго РНе
290 295 300
СЬи СЬи АЬа Рго СЬи Мен ТНг Зег АЬа СЬу СЬу Ьеи Ьеи СЬи СЬп АЬа
305 310 315 320
АЬа АЬа УаЬ СЬи СЬи АЬа Зег Аэр ТНг АЬа АЬа АЬа Азп СЬп Ьеи МеН
325 330 335
Азп Азп УаЬ Рго СЬп АЬа Ьеи СЬп СЬп Ьеи АЬа СЬп Рго ТНг СЬп СЬу
340 345 350
ТНг ТНг Рго Зег Зег Ьуз Ьеи СЬу СЬу Ьеи Тгр Ьуз ТНг УаЬ Зег Рго
355 360 365
Нхз Агд Зег Рго 1Ье Зег Азп МеН УаЬ Зег МеН АЬа Азп Азп ΗΪ5 МеН
370 375 380
Зег МеН ТНг Азп Зег СЬу УаЬ Зег МеН ТНг Азп ТНг Ьеи Зег Зег МеН
385 390 395 400
Ьеи Ьуз СЬу РНе АЬа Рго АЬа АЬа АЬа АЬа СЬп АЬа УаЬ СЬп ТНг АЬа
405 410 415
А1а СЬп Азп СЬу УаЬ Агд АЬа МеН Зег Зег Ьеи СЬу Зег Зег Ьеи СЬу
420 425 430
Зег Зег СЬу Ьеи СЬу СЬу СЬу УаЬ АЬа АЬа Азп Ьеи СЬу Агд АЬа АЬа
435 440 445
Зег УаЬ СЬу Зег Ьеи Зег УаЬ Рго СЬп АЬа Тгр АЬа АЬа АЬа Азп СЬп
450 455 4 60
АЬа УаЬ ТНг Рго АЬа АЬа Агд АЬа Ьеи Рго Ьеи ТНг Зег Ьеи ТНг Зег
4 65 470 475 480
АЬа АЬа СЬи Агд СЬу Рго СЬу СЬп МеН Ьеи СЬу СЬу Ьеи Рго УаЬ СЬу
485 490 495
СЬп МеН СЬу АЬа Агд АЬа СЬу СЬу СЬу Ьеи Зег СЬу УаЬ Ьеи Агд УаЬ
500 505 510
Рго Рго Агд Рго Туг УаЬ МеН Рго НЬз Зег Рго АЬа АЬа СЬу Азр 11е
515 520 525
АЬа Рго Рго АЬа Ьеи Зег СЬп Азр Агд РНе АЬа Азр РНе Рго АЬа Ьеи
530 535 540
Рго Ьеи Азр Рго Зег АЬа МеН УаЬ А1а СЬп УаЬ СЬу Рго СЬп УаЬ УаЬ
545 550 555 560
А5П Ые Азп ТНг Ьуг Ьеи СЬу Туг Азп Азп АЬа УаЬ СЬу АЬа СЬу ТНг
565 570 575
СЬу 11е УаЬ 11е Азр Рго Азп СЬу УаЬ УаЬ Ьеи ТНг Азп Азп НЬз УаЬ
580 585 590
Ые АЬа СЬу АЬа ТЬг Азр Ые Азп АЬа РНе Зег УаЬ СЬу Зег СЬу СЬп
595 600 605
ТНг Туг СЬу Уа1 Агр УаЬ УаЬ СЬу Туг Азр Агд ТНг СЬп Аер УаЬ АЬа
610 615 620
УаЬ Ьеи СЬп Ьеи Агд СЬу АЬа СЬу СЬу Ьеи Рго Зег АЬа АЬа Ые СЬу
625 630 635 640
СЬу СЬу УаЬ АЬа УаЬ СЬу СЬи Рго УаЬ УаЬ АЬа МеН СЬу Азп Зег СЬу
645 650 655
СЬу СЬп СЬу СЬу ТЬг Рго Агд АЬа УаЬ Рго СЬу Агд УаЬ УаЬ АЬа Ьеи
660 665 670
СЬу СЬп ТЬг УаЬ ет АЬа Зег Авр Зег Ьеи ТНг СЬу АЬа СЬи СЬи ТНг
675 680 685
Ьеи Азп СЬу Ьеи Ые СЬп РНе Азр АЬа АЬа Не СЬп Рго СЬу Азр А1а
690 695 700
СЬу СЬу Рго УаЬ УаЬ Азп СЬу Ьеи СЬу СЬп УаЬ УаЬ СЬу МеН Азп ТНг
705 710 715 720
АЬа АЬа Зег Зег СЬу РНе Зег Агд Рго СЬу Ьеи Рго УаЬ СЬи Туг Ьеи
725 730 735
СЬп УаЬ Рго Зег Рго Зег МеН СЬу Агд Азр Ые Ьуз УаЬ СЬп РНе СЬп
740 745 750
- 96 022203
Зег СЬу СЬу 755 Азп Азп Зег Рго АЬа УаЬ Туг Ьеи Ьеи Азр СЬу Ьеи Агд
760 765
АЬа С1п 770 Азр Азр Туг Азп СЬу 775 Тгр Азр Не Азп ТЬг Рго 780 АЬа РЬе СЬи
Тгр 785 Туг Туг СЬп Зег СЬу 790 Ьеи Зег Пе УаЬ Мер Рго УаЬ 795 СЬу СЬу СЬп 800
Зег Зег РЬе Туг Зег Агр 305 Тгр Туг Зег Рго 810 АЬа Суз СЬу Ьу5 АЬа 815 СЬу
Суз СЬп ТЬг Туг 820 Ьуз Тгр СЬи ТЬг РЬе Ьеи 825 ТЬг Зег СЬи Ьеи 830 Рго СЬп
Тгр Ьеи 5ег 835 АЬа Азп Агд АЬа Ι/аЬ Ьуз Рго 840 ТЬг СЬу Зег 345 АЬа АЬа 11е
61у Ьеи 850 5ег Мер АЬа СЬу Зег 855 Зег А1а Мег. 11е Ьеи АЬа 360 АЬа Туг НЬз
Рго 865 С1п СЬп РЬе Пе Туг 370 АЬа СЬу Зег Ьеи Зег АЬа Ьеи 875 Ьеи Азр Рго 880
Зег СЬп СЬу Мер СЬу Рго 835 Зег Ьеи 11е СЬу 8Э0 Ьеи АЬа Мер СЬу Азр 8 95 АЬа
СЬу СЬу Туг Ьуз 900 АЬа АЬа Азр МеГ Тгр СЬу 905 Рго Зег Зег Азр 910 Рго АЬа
Тгр СЬи Агд 915 Азп Азр Рго ТЬг СЬп СЬп Не 920 Рго Ьуз Ьеи 925 УаЬ АЬа Азп
Азп ТЬг 930 Агд Ьеи Тгр УаЬ Туг 935 Суз СЬу Азп СЬу ТЬг Рго 940 Азп СЬи Ьеи
61у 945 СЬу АЬа Азп ЬЬе Рго 950 АЬа СЬи РЬе Ьеи СЬи Азп РЬе 955 Уа1 Агд Зег 960
Зег Азп Ьеи Ьуз РЬе СЬп 965 Азр АЬа Туг Азп 970 АЬа АЬа СЬу СЬу НЬз 975 Азп
АЬа УаЬ РЬе А5П 930 РЬе Рго Рго Азп СЬу ТЬг 985 НЬз Зег Тгр СЬи 990 Туг Тгр
С1у АЬа АЬа СЬп 995 СЬу 1010 Ьеи Азп А1а Мер Ьуз СЬу Азр Ьеи СЬп Зег Зег Ьеи СЬу 1000 1005
<210> 29 <211> 1148 <212> ПРТ
<2ЬЗ> Искусственная последоаательносгь
<220> <223> М114
<400> 29 Мер ТЬг АЬа АЬа Зег Азр Азп РЬе СЬп Ьеи Зег СЬп СЬу СЬу СЬп СЬу
1 5 10 15
РЬе АЬа 11е Рго Не СЬу СЬп АЬа МеГ АЬа 11е АЬа СЬу еьп 11е Агд
20 25 30
Зег СЬу СЬу СЬу Зег Рго ТЬг УаЬ НЬз Пе СЬу Рго ТЫ АЬа РЬе Ьеи
35 40 45
СЬу Ьеи СЬу УаЬ νπ Азр Азп Азп СЬу Азп СЬу АЬа Агд Уа1 СЬп Агд
50 55 60
УаЬ УаЬ СЬу Зег АЬа Рго АЬа АЬа Се г Ьеи СЬу 11е Зег ТЬг СЬу Азр
65 70 75 80
УаЬ Пе ТЬг АЬа νβΐ Азр СЬу АЬа Рго 11е Азп Зег АЬа ТЬг А1а Мер
35 90 95
АЬа Азр АЬа Ьеи Азп СЬу НЬз НЬз Рго СЬу АЗр УаЬ 11е Зег УаЬ ТЬг
100 105 110
Тгр СЬп ТЬг Ьуз Зег СЬу СЬу ТЫ Агд ТЬг СЬу Азп УаЬ ТЬг Ьеи АЬа
115 120 125
С1и С1у Рго 130 Рго АЬа СЬи РЬе 135 МеН УаЬ Азр РНе СЬу 140 АЬа Ьеи Рго Рго
СЬи 11е Азп Зег АЬа Агд МеН Туг АЬа СЬу Рго СЬу Зег АЬа Зег Ьеи
145 150 155 150
УаЬ АЬа АЬа АЬа СЬп МеН Тгр Азр Зег УаЬ АЬа Зег Азр Ьеи РНе Зег
165 170 175
АЬа АЬа Зег АЬа РЬе СЬп Зег УаЬ УаЬ Тгр СЬу Ьеи ТНг УаЬ СЬу Зег
180 185 190
Тгр Ые СЬу Зег Зег АЬа СЬу Ьеи МеН УаЬ АЬа А1а АЬа Зег Рго Туг
195 200 205
УаЬ АЬа Тгр МеН Зег УаЬ ТЬг АЬа СЬу СЬп АЬа СЬи Ьеи ТНг А1а АЬа
210 215 220
СЬп УаЬ Агд УаЬ АЬа АЬа АЬа АЬа Туг СЬи ТНг АЬа Туг СЬу Ьеи ТНг
225 230 235 240
УаЬ Рго Рго Рго УаЬ Не АЬа СЬи Азп Агд АЬа СЬи Ьеи МеН Не Ьеи
245 250 255
11е АЬа ТЬг Азп Ьеи Ьеи СЬу СЬп Азп ТЬг Рго А1а Не АЬа УаЬ Азп
260 265 270
СЬи АЬа СЬи Туг СЬу СЬи МеН Тгр АЬа СЬп Азр АЬа АЬа АЬа МеН РНе
275 280 285
СЬу Туг АЬа АЬа АЬа ТЬг АЬа ТЬг АЬа ТНг АЬа ТНг Ьеи Ьеи Рго РНе
2 90 295 300
СЬи СЬи АЬа Рго СЬи МеН ТНг Зег АЬа СЬу СЬу Ьеи Ьеи СЬи СЬп АЬа
305 310 315 320
АЬа АЬа УаЬ СЬи СЬи АЬа Зег Азр ТНг АЬа АЬа АЬа Азп СЬп Ьеи МеН
325 330 335
Азп Азп УаЬ Рго СЬп АЬа Ьеи С1п СЬп Ьеи АЬа СЬп Рго ТНг СЬп СЬу
340 345 350
ТЬг ТЬг Рго Зег Зег Ьуз Ьеи СЬу СЬу Ьеи Тгр Ьуз ТЬг УаЬ Зег Рго
355 360 365
НЬз Агд Зег Рго Не Зег Азп МеН УаЬ Зег МеН АЬа Азп Азп НЬз МеН
370 375 380
Зег МеН ТЬг Азп Зег СЬу УаЬ Зег МеН ТЬг Азп ТНг Ьеи Зег Зег МеН
385 390 395 400
Ьеи Ьуз СЬу РЬе АЬа Рго АЬа АЬа АЬа АЬа СЬп АЬа УаЬ СЬп ТНг АЬа
405 410 415
АЬа СЬп Азп СЬу УаЬ Агд АЬа МеН Зег Зег Ьеи СЬу Зег Зег Ьеи СЬу
420 425 430
Зег Зег 61 у Ьеи СЬу СЬу СЬу УаЬ АЬа АЬа Азп Ьеи СЬу Агд АЬа АЬа
435 440 445
Зег УаЬ СЬу Зег Ьеи Зег УаЬ Рго СЬп АЬа тгр АЬа АЬа АЬа Азп СЬп
450 455 460
АЬа УаЬ ТЫ Рго АЬа АЬа Агд АЬа Ьеи Рго Ьеи ТНг Зег Ьеи ТЬг Зег
465 470 475 4 80
АЬа АЬа СЬи Агд СЬу Рго СЬу СЬп МеН Ьеи СЬу СЬу Ьеи Рго УаЬ СЬу
435 490 4 95
СЬп МеН СЬу А1а Агд АЬа СЬу СЬу СЬу Ьеи Зег СЬу УаЬ Ьеи Агд УаЬ
500 505 510
Рго Рго Агд Рго Туг УаЬ МеН Рго НЬз Зег Рго АЬа АЬа СЬу Азр Не
515 520 525
АЬа Рго Рго АЬа Ьеи Зег СЬп Азр Агд РЬе АЬа Азр РНе Рго АЬа Ьеи
530 535 540
Рго Ьеи Азр Рго Зег АЬа МеН УаЬ АЬа СЬп УаЬ СЬу Рго СЬп УаЬ УаЬ
545 550 555 560
Азп Не Азп ТЬг Ьуз Ьеи СЬу Туг Азп Азп АЬа УаЬ СЬу АЬа СЬу ТНг
565 570 575
СЬу Не УаЬ Не Азр Рго Азп СЬу УаЬ УаЬ Ьеи ТНг Азп Азп НЬз УаЬ
530 585 590
Не АЬа СЬу АЬа ТЬг Азр Ые Азп АЬа РНе Зег УаЬ СЬу Зег СЬу СЬп
595 600 605
ТЬг Туг СЬу УаЬ Азр УаЬ УаЬ СЬу Туг Азр Агд ТНг СЬп Азр УаЬ АЬа
- 98 022203
610 615 620
УаЬ 625 Ьеи СЬп Ьеи Агд СЬу АЬа СЬу СЬу 630 Ьеи Рго Зег АЬа АЬа Ые СЬу 635 640
СЬу СЬу УаЬ АЬа УаЬ СЬу СЬи Рго УаЬ 645 УаЬ АЬа Меб СЬу Азп Зег СЬу 650 655
С1у СЬп СЬу СЬу ТЬг Рго Агд АЬа УаЬ 660 665 Рго СЬу Агд УаЬ УаЬ АЬа Ьеи 670
СЬу СЬп ТЬг УаЬ СЬп АЬа Зег Азр Зег 675 690 Ьеи ТЬг СЬу АЬа СЬи СЬи ТЬг 685
Ьеи Азп 690 СЬу Ьеи ЬЬе СЬп РЬе Азр АЬа 695 АЬа Ые СЬп Рго СЬу Азр АЬа 700
СЬу 705 СЬу Рго УаЬ УаЬ Азп СЬу Ьеи СЬу 710 СЬп УаЬ УаЬ СЬу Меб Азп ТЬг 715 720
АЬа АЬа Зег Зег ТЬг Меб Азр РЬе СЬу 725 Ьеи Ьеи Рго Рго СЬи УаЬ Азп 730 735
Зег Зег Агд Меб Туг Зег СЬу Рго СЬу 740 745 Рго СЬи Зег Меб Ьеи АЬа АЬа 750
АЬа АЬа АЬа Тгр Азр СЬу УаЬ АЬа АЬа 755 760 СЬи Ьеи ТЬг Зег АЬа АЬа УаЬ 765
Зег Туг 770 СЬу Зег УаЬ УаЬ Зег ТЬг Ьеи 775 Ые УаЬ СЬи Рго Тгр Меб СЬу 780
Рго 785 АЬа АЬа АЬа АЬа МеО АЬа АЬа АЬа 790 АЬа ТЬг Рго Туг УаЬ СЬу Тгр 795 800
Ьеи АЬа АЬа ТЬг АЬа АЬа Ьеи АЬа Ьуз 805 СЬи ТЬг АЬа ТЬг СЬп АЬа Агд 810 815
АЬа АЬа АЬа СЬи АЬа РЬе СЬу ТЬг АЬа 820 825 РЬе АЬа Меб ТЬг УаЬ Рго Рго 830
Зег Ьеи УаЬ АЬа АЬа Азп Агд Зег Агд 835 340 Ьеи Меб Зег Ьеи УаЬ АЬа АЬа 845
Азп ЬЬе 850 Ьеи СЬу СЬп Азп Зег АЬа АЬа 855 Ые АЬа АЬа ТНг СЬп АЬа СЬи 8 60
Туг 865 АЬа СЬи МеС Тгр АЬа СЬп Азр АЬа 870 АЬа УаЬ Меб Туг Зег Туг СЬи 875 880
СЬу АЬа Зег АЬа АЬа АЬа Зег АЬа Ьеи 885 Рго Рго РЬе ТЬг Рго Рго УаЬ 890 895
еьп СЬу ТЬг СЬу Рго АЬа СЬу Рго АЬа 900 905 АЬа АЬа АЬа АЬа АЬа ТЬг СЬп 910
АЬа АЬа СЬу АЬа СЬу АЬа УаЬ АЬа Азр 915 920 АЬа СЬп АЬа ТЬг Ьеи АЬа СЬп 925
Ьеи Рго 930 Рго СЬу Ые Ьеи Зег Азр Ые 935 Ьеи Зег АЬа Ьеи АЬа АЬа Азп 940
АЬа 945 Азр Рго Ьеи ТЬг Зег СЬу Ьеи Ьеи 950 СЬу Ые АЬа Зег ТЬг Ьеи Азп 955 960
Рго СЬп УаЬ СЬу Зег АЬа СЬп Рго Ые 965 УаЬ Ые Рго ТЬг Рго Ые СЬу 970 975
СЬи Ьеи Азр УаЬ Ые АЬа Ьеи Туг Ые 980 985 АЬа Зег 11е АЬа ТЬг СЬу Зег 990
Ые АЬа Ьеи АЬа Ые ТЬг Азп ТЬг АЬа Агд Рго Тгр НЬз Ые СЬу Ье 995 1000 1005
Туг СЬу 1010 Азп АЬа СЬу СЬу Ьеи 1015 СЬу Рго ТЬг СЬп СЬу 1020 НЬз Рго Ьеи
Зег Зег АЬа ТЬг Азр СЬи Рго СЬи Рго НЬз Тгр СЬу Рго РЬе СЬу
1025 1030 1035
СЬу А1а АЬа Рго УаЬ Зег АЬа СЬу УаЬ СЬу НЬз АЬа АЬа Ьеи УаЬ
1040 1045 1050
СЬу АЬа Ьеи Зег УаЬ Рго НЬз Зег Тгр ТЬг ТЬг АЬа АЬа Рго СЬи
1055 1060 1065
Ые СЬп Ьеи АЬа УаЬ СЬп АЬа ТЬг Рго ТЫ РЬе Зег Зег Зег АЬа
1070 1075 1080
СЬу АЬа Азр Рго ТЬг АЬа Ьеи Азп СЬу Меб Рго АЬа СЬу Ьеи Ьеи
1085 1090 1095
- 99 022203
Зег СЬу 1100 Μβί А1а Ьеи А1а Зег 1105 Ьеи АЬа АЬа Агд СЬу 1110 ТНг ТНг С1у
СЬу С1у С1у ТНг Агд Зег С1у ТНг Зег ТНг Агр СЬу С1п СЬи Азр
1115 1120 1125
СЬу Агд Ьуз Рго Рго 7а1 Уа1 Уа1 Пе Агд СЬи СЬп Рго Рго Рго
ИЗО 1135 1140
СЬу Азп Рго Рго Агд
1145
<210> 30 <211> 9 <212> ΠΡΤ <213> МусоЬасЬегЗит £иРегси1о31в <400> 30
Тгр С2п С1у А1а Зег Зег Зег А1а Мег 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасеегг ши СиЬегсиЬозгз <400> 31
УаЬ СЬп АЬа СЬи СЬп ТЫ АЬа АЬа СЬп 1 5 <210?· 32 <211> 9 <212? ПРТ <213? МусоЬасЬег1иш ЬиРегсиЗозтз <400? 32
УаЬ Ьуз ТНг АЬа УаЬ УаЬ СЬп Рго МеГ 1 5 <210? 33 <211? 9 <212? ПРТ <213? МусоЬасЕег! шп Сидегси1оз1з <400? 33
Уа1 С1п Рго МеГ Ьеи УаЬ АЬа АЬа Азп 1 5 <210> 34 <211? 9 <212? ПРТ <213> МусоЬасСегЬиш ПьЬегсиЬогЬз <400? 34
Ьеи Уа1 А1а АЬа Азп Агд АЬа Азр Ьеи
5 <210? 35
- 100 022203 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСег1ит сиЬегси1оз13 <400> 35
Ьеи Уа1 Зег Ьеи Уа1 МеГ Зег Азп Ьеи 1 5
<210> <211> <212> <213> 36 9 ПРТ МусоЪас£ег1ип1 £иЪегси1оз1з
<400> 36
Ьеи Уа1 МеГ Зег Азп Ьеи РЬе С1у С1п
1 5
<210> <211> <212> <213> 37 9 ПРТ МуеоРасГеПит ГиРегсиЗозйз
<400 37
Туг С1и С1п МеГ Тгр А1а А1а Азр Уа1
1 5
<210> <211> <212> <213> 38 9 ПРТ МусоЪасГегйида гиЬегси1оз1з
<400> 38
Тгр А1а А1а Азр Уа1 Зег А1а МеГ Зег
1 5
<210> <211> <212> <213> 39 9 ПРТ МусоЪасСегйит ЕиЪегси1оз1з
<400> 39
Ьеи 61п Азп Ьеи А1а С1у Ьеи Рго А1а
1 5
<210> <211> <212> 40 9 ПРТ
<213> МусоЬаекеггшп £и&егси1оз13 <400> 40
РНе С1у Азп Ьеи С1у Зег Азп Азп Уа1 1 5 <210> 41
- 101 022203 <2Ы> 9 <212> ПРТ <213> МусодасСегхит £иЬегси1о51$ <400> 41
РЬе СЬу Азп ТЬг СЬу Азп Азп Азп Ые 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСегхшп £иЪегси1аз1з <400> 42
РЬе Ьеи Азп АЬа СЬу Азп Ые Азп ТЬг 1 5 <210> 43 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСеггит сиЬегси1озг$ <400> 43
Ьеи СЬп РЬе Зег Ые ТЬг ТЬг Рго Азр 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасЬегЬ ит СиЬегсиЬозЬз <400> 44
Ьеи ТЬг Ые Рго АЬа СЬу Ые ТЬг Ые 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> ПРТ <2ЬЗ> МусоЬасСегЬига СиЬегсиЬозЬз <400 45
РЬе СЬу Ые Рго РЬе ТЬг Ьеи СЬп РЬе 1 5 <210> 46 <2Ы> 9 <212> ПРТ <213> ЛусоЪасГеггит сиЬегсиЬозгз <4С0> 46
Ьеи СЬп РЬе СЬп ТЬг Азп УаЬ Рго АЬа 1 5 <210> 47 <211> 9
- 102 022203 <2Ь2> ПРТ <213> МусоЬасЕепит ЕиЪегси1оз13 <400> 47
РЬе СЬп ТНг Азп УаЬ Рго АЬа Ьеи СЬп 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЪасЕепит ЕиЬегси1озгз <400> 48
Туг ТНг Ьеи ТНг СЬу Рго Не УаЬ Не 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСепит СиЬегсиЬозлз <400> 49
РНе Ьеи Рго АЬа РНе Азп Не Рго СЬу
5 <210> 50 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасЕепит ЕиЬегеи1оз13 <400> 50
Ьеи ТЬг 11е Азр Рго Не Азп Ьеи ТНг 1 5 <210> 51 <2Н> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасЕепит ЕиЬегси1оз1з <400> 51
Ьеи ТНг Не Азр Рго Не Азп Ьеи ТНг 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасЕепит ЕиЬегси1оз13 <400> 52
Туг РНе Азп Зег Зег ТНг АЬа Рго Йег 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> ПРТ
- 103 022203 <213> МусойасСегЬит СийегсиЬозЬз <400> 53
РНе Азп Зег Зег ТНг АЬа Рго Зег Зег 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусаЪас£ег1ит £иЪегси1оз1з <400> 54
РЬе СЬу Азп Азп СЬу Зег СЬу Ьеи 5ег 1 5 <2Ь0> 55 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЪас(:ег1ип1 1:иЬвгси1оз1з <400> 55
Туг СЬп Азп РЬе СЬу СЬу Ьеи Зег Зег 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЪасСегэит СиЪегси1оз13 <400> 56
РЬе СЬу СЬу Ьеи Зег Зег СЬу РНе Зег Ь 5 <210> 57 <21Ь> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬас СегЬшл ЕийегсиЬозЬз <400> 57
РЬе АЬа Азп Агд СЬу ЬЬе Ьеи Рго РЬе Ь 5 <210> 58 <211> 9 <2Ь2> ПРТ <213> МусоЪасЬегаит СиЬегсиЗозЬз <400> 58
ЬЬе Ьеи Рго РЬе Зег УаЬ АЬа Зег УаЬ Ь 5 <210 59 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусойасСегЬигл СийегсиЬозЬз
- 104 022203 <400> 59
РЬе АЬа Азп Ые СЬу ТЬг Азп Ьеи А1а 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСегЬит ЕиЬегсиЬозЬз <400> 60
Азп РЬе Зег УаЬ Ьеи Рго Рго СЬи ЬЬе 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> ПРТ <213> Л/усойасСегЬит ЕиЬегсиЬозЬз <400> 61
УаЬ Ьеи Рго Рго СЬи 11е Азп Зег АЬа 1 5 <210> 62 <2Ы> 9 <212> ПРТ <213> МусойасСегхит £иЪегси1о51з <40О> 62
Ьеи Рго Рго СЬи Ые Азп Зег АЬа Ьеи 1 5 <210> 63 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасГегЬит сиЬегсиЬсзЬз <400> 63
Рго СЬи Ые Азп Зег А1а Ьеи Ые РЬе 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасЕегйига гиЬегоиЬозЬз <400> 64
СЬи Ые Азп Зег АЬа Ьеи 11е РЬе АЬа 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЪаеСегЬшп ЬиЬегсиЬоаЬз
- 105 022203 <400> 65
С1у А1а С1у Рго С1и Рго МеГ А1а А1а 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЪааепип ГиЬегси1ояга <400> 66
61у Рго 61и Рго МеГ А1а А1а А1а А1а
5 <210> 67 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬас^епит сиЬегси1оз15 <400> 67
С1и Рго МеГ А1а А1а А1а А1а ТЬг А1а 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> ПРТ <213> Му соЪа с Сепии сиЬегси1ов15 <400> 68
А1а А1а А1а ТЬг А1а Тгр Азр С1у Ьеи 1 5 <210> 69 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЪаскепит СиЬегси1оз13 <400> 69
АХа ТЬг А1а Тгр Азр С1у Ьеи А1а МеГ 1 5 <210> 70 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬас£епит СиРегси1оз13 <400> 70
А1а Тгр Азр С1у Ьеи АХа МеГ С1и Ьеи
1 5
<210> 71
<211> 9
<212> ПРТ
<213> МусоЬасСепиш £иЬегси1оз13
<40О> 71
- 106 022203
СЬу Ьеи АЬа Меб СЬи Ьеи АЬа Зег АЬа
ь 5
<210> <211> <212> <213> 72 9 ПРТ МуооЬасбегЬия биЬегсиЬоаЬз
<400> 72
Ьеи АЬа Меб СЬи Ьеи АЬа Зег АЬа АЬа 1 5
<210> <21Ь> <212> <213> 73 9 ПРТ МусоЪасСегьит £и&егси1$513
<400> 73
УаЬ ТЬг Зег СЬу Ьеи Та! СЬу СЬу АЬа
1 5
<210> <211> <212> <213> 74 9 ПРТ Мусс>Ьа с сегЬия! ί иЬегси1с>з15
<400> 74
АЬа Меб АЬа АЬа АЬа АЬа АЬа Рго Туг
1 5
<210> <2Ы> <2Ь2> <213> 75 9 ПРТ МусоЪасЕег!иш СиЬегсиЬоэЬэ
<400> 75
АЬа АЬа АЬа АЬа АЬа Рго Туг АЬа АЬа
1 5
<210> <211> <212> <213> 76 9 ПРТ МусоЬасбегЬшп биЬегсиЬоаЬз
<400> 76
АЬа АЬа АЬа Рго Туг АЬа АЬа Тгр Ьеи
1 5
<2Ь0> <21Ь> <212> 77 9 ПРТ
<213> МусоЬааег1 ит ^иЬесси1оз!з <400> 77
АЬа АЬа Рго Туг АЬа АЬа Тгр Ьеи АЬа
- 107 022203
5
<210> <211> <212> <213> 78 9 ПРТ МусоЬасСег1ит СиЬегсиЗозЗз
<400> 78
АЬа Рго Туг АЬа АЬа Тгр Ъеи АЬа АЬа
1 5
<210> <211> <212> <213> 79 9 ПРТ МусоЬасЬегЬиш СиЬегсиЬозЬз
<400> 79
Туг АЬа АЬа Тгр Ьеи АЬа АЬа АЬа АЬа
Ь 5
<210> <211> <212> <213> 80 9 ПРТ МусоЬасСег1шп биЬегсиЬоаЬз
<400> 80
АЬа АЬа Тгр Ьеи АЬа АЬа АЬа АЬа УаЬ
1 3
<210> <211> <212 > <213> 81 9 ПРТ Мус&ЬасбегЬит биЬегсиЬозЬз
<400> 81
Тгр Ьеи АЬа АЬа АЬа АЬа УаЬ СЬп АЬа
1 5
<210> <2Ы> <212> <213> 82 9 ПРТ МусоЬасбегЬип ЬиЬегсиЬоаЬа
<400> 82
СЬп АЬа СЬи СЬп ТЬг АЬа АЬа СЬп АЬа 1 5
<210> <211> <212> <213> 83 9 ПРТ МусоЬасбегЬига СиЬегси1оз1з
<400> 83
АЬа С1и СЬп ТЬг АЬа АЬа СЬп АЬа АЬа 1 5
- 108 022203 <210> 84 <2Ы> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСепига СиЬегсиЬозиз <400> 84
ТЬг АЬа АЬа СЬп АЬа АЬа АЬа МеГ ЬЬе 1 5 <210> 85 <211> 9 <212? ПРТ <213> МусоЬасСегаит СаЬегси1оз1з <400> 85
АЬа АЬа Мег Ые АЬа СЬи РЬе СЬи АЬа
5 <210> 86 <211> 9 <212> ПРТ <213? МусоЬасСег1и1п £иЬегси1о515 <400> 86
АЬа МеГ Ие АЬа СЬи РЬе СЬи АЬа УаЬ 1 5 <210> 87 <2И> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасТег1ит СиЬегси1оз1з <400> 87
АЬа СЬи РЬе СЬи АЬа УаЬ Ьуз ТНг АЬа 1 5 <210> 88 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСегЬшп ГиЬегсиЬозиз <400> 88
РЬе СЬи АЬа УаЬ Ьуз ТЬг АЬа УаЬ УаЬ 1 5 <210> 89 <211> 9 <2Ь2> ПРТ <213> МусоЬасСеглим ЬиЬегсиЬозьз <400 89
СЬи АЬа УаЬ Ьуз ТЬг АЬа УаЬ УаЬ СЬп 1 5
- 109 022203 <210> 90 <211> 9 <212> ΠΡΤ <213> МусоЬасСегхшп СиЬегси1оз)з <400> 90
Ъуз ТЬг АЪа УаЪ УаЪ СЪп Рго Меб Ъеи 1 5 <210> 91 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬа о С ег! ил? биЬегсиЪозЪз <400> 91
СЪп Рго Меб Ъеи Уа1 АЪа АЪа Азп Агд 1 5 <210> 92 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасбегЪит СиЬегсиЪозЪз <400 92
Рго Меб Ъеи УаЪ АЪа АЪа Азп Агд АЪа 1 5 <210> 93 <211> 9 <212> ПРТ <213> Мус&ЬасбегЪшг! СиЬегси1оз1з <400> 93
Ъеи УаЪ АЪа АЪа Азп Агд АЪа Азр Ъеи 1 5 <210 94 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасбегЪит биЬегсиЪозЪз <400 94
АЪа Азп Агд АЪа Азр Ъеи УаЪ Зег Ъеи 1 5 <210> 95 <211> 9 <212> ПРТ <213> АГусоЬасбегЪил! биЬегсиЪозЪз <400> 95
Агд АЪа Азр Ъеи УаЪ Зег Ъеи УаЪ Меб 1 5
- 110 022203
- 111 022203 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасЕег1 ил! СиЪегси1оз1з <400> 102
А1а МеС Зег А1а Туг Шз А1а С1у А1а 1 5 <210> 103 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСеггит СиЬегаи1оз1з <400> 103
Зег А1а Туг Н1з А1а С1у А1а Зег А1а 1 5 <210> 104 <211> 9 <212> ПРТ <213> МуссФасеег! ют СиЬегси1оя1з <400> 104
А1а Туг Н1з А1а 61у А1а Зех А1а 11е 1 5 <210> 105 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬас£ег1ит £иЪегси1оз1з <400> 105
С1у А1а Зег А1а 11е А1а Зег А1а Ьеи 1 5 <210> 106 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСег 1Шп СиЬегсиТозхз <400> 106
А1а 11е А1а Зег А1а Ьеи Зег Рго РЬе 1 5 <210> 107 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасЕеххиш СиЬехои1оз1з <400> 107
А1а Ьеи Зег Рго РЬе Зег Ьуз Рго Ьеи 1 5 <210> 10Θ <211> 9
- 112 022203 <212> ПРТ <213> Мусо&асСег!ит СиЬегси1оз1а <400> 108
Рго РЬе Зег Ьуз Рго Ьеи С1п Азп Ьеи
1 5
<210> <211> <212> <213> 109 9 ПРТ МусоЬасбеггия си£>егси1о®23
<400> 109
Ьуз Рго Ьеи С1п Азп Ьеи А1а С1у Ьеи 1 5
<210> < 211> <212> <213> 110 9 ПРТ МуооЬасСеггия £иЬегси1о$1а
<400> 110
Азп Ьеи А1а С1у Ьеи Рго А1а Тгр Ьеи
1 5
<210> <211> <212> <213> 111 9 ПРТ Мусо&аскег1шл сиЪегси1оз1$
<400> 111
Ьеи А1а С1у Ьеи Рго А1а Тгр Ьеи А1а
1 5
<210> <211> <212> <213> 112 9 ПРТ ЛГуооЬасСегЬигп биЬегси1оз1з
<400> 112
Ьеи Рго А1а Тгр Ьеи А1а Зег С1у А1а
1 5
<210> <211> <212> <213> 113 9 ПРТ МусоЪасЕег1ит СиЬегси1оз13
<400> 113
Тгр Ьеи А1а Зег С1у А1а Рго А1а А1а
1 5
<210> <211> <212> 114 9 ПРТ
- 113 022203 <213> МусойасНегЬига НийегсиЬозЬз <400> 114
СЬу АЬа Рго АЬа АЬа АЬа МеН ТЬг АЬа 1 5 <210> 115 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЪасСег!шл Сийегси1оз1з <400> 115
А1а Рго АЬа АЬа АЬа МеН ТНг АЬа АЬа Ь 5 <210> 116 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСеггит СиЬегси1оз1з <400> 116
А1а АЬа МеН ТНг А1а А1а А1а С1у 11е 1 5 <210> 117 <211> 9 <212> ПРТ <213> МуссиЬасСегншп СиЬегсиЬоз!® <400> 117
ТНг А1а А1а А1а С1у 11е Рго А1а Ьеи 1 5 <210> 110 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусойасНегйит £иЪегси1оз1з <400> 118
А1а А1а А1а С1у 11е Рго А1а Ьеи А1а 1 5 <210> 119 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСег!ига НиЬегсиЬозиз <400> 119
А1а Ьеи А1а С1у С1у Рго ТНг А1а 11е 1 5 <210 120 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬаснег!ига еиЬегси1оз1г
- 114 022203 <400> 120
А1а С1у С1у Рго ТНг А1а 11е Азп Ьеи 1 5
<210> <211> <212> <213> 121 9 ПРТ МусоЬасЕеьЗат ЕиЬегси1оз13
<400> 121
С1у Рго ТЬг А1а 11е Азп Ьеи 51у 11е
1 5
<210> <211> <212> <213> 122 9 ПРТ МусоЬаСЕепит ЕиЬегсиЗозхз
<400> 122
А1а 11е Азп Ьеи С1у 11е АЬа Азп Уа1
1 5
<210> <211> <212> <213> 123 9 ПРТ МусоЬасЕег1ит ЕиЬегси1о$13
<400> 123
Азп А1а Азп Ьеи С1у Азп Туг Азп РНе
1 5
<210> <211> <212> <213> 124 9 ПРТ МусоЬасЕег1ит ЕиЬегси1оз1з
<400> 124
Азп Туг Азп РНе С1у Зег б1у Азп РНе 1 5
<210> <211> <212> <213> 125 9 ПРТ МусойасСегЬим ГиЬегсиЬозХз
<400> 125
Азп Ьеи С1у Зег Азп Азп Уа1 С1у Уа1
1 5
<210> <211> <212> 126 9 ПРТ
<213> МусоЬасГегишл Сийегси2оз1з
- 115 022203 <400> 126
8ег Ьеи Азп ТЫ С1у Зег Туг Азп Ме!
1 5
<210> <211> <212> <213> 127 9 ПРТ МусоЬасЕег!чт сиЬегсиЬозЬз
<400> 127
Азп АЬа Азп ТЫ СЬу РЬе Ьеи Азп АЬа
1 5
<210> <211> <212> <213> 128 9 ПРТ МусеФасСыгит ЪиЬёгсъ1о$1з
<400> 126
РЬе Ьеи Азп АЬа СЬу Азп 11е Азп ТЬг
1 5
<210> <211> <212> <213> 129 9 ПРТ МусоЬасЕегЬил] СиЬегсиЬозЬз
<400> 129
Азп 11е Азп ТЬг СЬу 7а1 РЬе Азп 11е
1 5
<210> <211> <212> <213> 130 9 ПРТ МусоЬааег1ий1 £иЬегси1оз1з
<400> 130
С1у \7а1 С1у С1п СЬу 5ег Ьеи СЬп РЬе 1 5
<210> <211> <212> <213> 131 9 ПРТ МусоЬасСегЬид СиЬегсиЬозЬа
<400> 131
Зег 11е ТЬг ТЬг Рго Азр Ьеи ТЬг Ьеи
1 5
<210> <211> <212> <213> 132 9 ПРТ МусоЬасСеПит СиЬегси1оз1з
<400> 132
- 116 022203
ТНг Рго Азр Ьеи ТНг Ьеи Рго Рго Ьеи
5 <210> 133 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасС&ггит СиЬегси1оз13 <400> 133
Азр Ьеи ТЬг Ьеи Рго Рго Ьеи С1п 11е 1 5 <210 134 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасХег!ига СиЬегси1оз1з <400 134
Рго Ьеи С1п 11е Рго С1у 11е Зег УаЬ 1 5 <210> 135 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасХегЕшп СиЬегси1оз1з <400 135
11е Рго С1у Х1е Зег УаЬ Рго А1а РЬе 1 5 <210> 136 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬзсеег1и!п СиЬегси1о$1з <40О> 136
С1у 11е Зег Уа1 Рго А1а РЬе Зег Ьеи
5 <210> 137 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСегЬют СиЬегси1ой1з <400 137
Уа1 Рго А1а РЬе Зег Ьеи Рго А1а 11е 1 5 <210 138 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЪасСег1ит £иЬегси1ог1з <400 133
А1а РЬе Зег Ьеи Рго АЬа 11е ТНг Ьеи
- 117 022203 <210> 139 <2Ы> 9 <212> ПРТ <213> МусоЪасСегίит ЬиЬегси1оз1з <400> 139
Ьеи Рго АЬа 11е ТЬг Ьеи Рго Зег Ьеи 1 5 <210> 140 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусеЬасСег1ит 1:и1>егси1оз2.$ <400> 140
АЬа 11е ТНг Ьеи Рго Зег Ьеи Азп 11е 1 5 <210> 141 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЪаССеггил! СиЬегси1оз1$ <400> 141
ТЬг Ьеи Рго Зег Ьеи Аэп 11е Рго А1а 1 6 <210> 142 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСеггит ЕиЪегси2оз1а <400> 142
Ьеи Рго Зег Ьеи Азп 11е Рго А1а А1а 1 5 <210> 143 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬаскег1ит ЕиЬегсиХозЬз <400> 143
АЬа ТЬг ТЬг Рго АЬа Азп Не ТЬг УаЬ 1 5 <210> 144 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасЕег!ит сиЪегси1о$1з <400> 144
ТЬг Рго А1а Азп 11е ТЬг УаЬ СЬу АЬа ι г
- 118 022203 <210> 145 <2Ы> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасбегЬит ЬиЬегсиЬозЬз <400> 145
Азп Не ТНг Уа1 СЬу АЬа РНе Зег Ьеи 1 5 <210> 146 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСег!ит £иЬегси1оз1е <400> 146
АЬа РНе Зег Ьеи Рго СЬу Ьеи ТНг Ьеи 1 5 <210> 147 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасбегЬип> ЕиЬегсиЬозЬа <400> 147
Ьеи Рго СЬу Ьеи ТНг Ьеи Рго Зег Ьеи 1 5 <210> 14в <211> Э <212> ПРТ <213> МусоЬасСег!ит СиЬегсиЬозЬа <400> 148
ТЫ Ьеи Рго Зег Ьеи Азп Не Рго АЬа 1 5 <210> 149 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасЕег!ит СиЬегси1оз1з <400> 149
АЬа ТНг ТЬг Рго АЬа Азп Ые ТНг 7а1 1 5 <210> 150 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасбегЬшп биЬегсиЬозгз <400> 150
Азп Ые ТНг ’/аЬ СЬу АЬа РНе Зег Ьеи 1 5
- 119 022203
- 120 022203 <210> 157 <2Ы> 9 <212> ПРТ <213> МусойасСегЬит СиЬегси1оз1з <400> 157
Ъеи Рго СЬу Ъеи ТЬг Ъеи Рго Йег Ъеи Ь 5 <210> 158 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасЕегЬит СиЬегсиЬозЬз <400> 158
ТЬг Ьеи Рго Зег Ьеи Азп Ые Рго АЬа 1 5 <210> 159 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСегЬига СиЬегси1оз13 <400> 159
АЬа ТЬг ТНг Рго АЬа Азп Ые ТЬг УаЬ 1 5 <210> 160 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬаскеглит СиЬегси1озаз <400> 160
Азп Ые ТЬг УаЬ СЬу АЬа РЬе Зег Ьеи 1 5 <210> 161 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬас1:ег1и1п 1:иЬегси1оз1з <400> 161
АЬа РЬе Зег Ьеи Рго СЬу Ьеи ТЬг Ьеи 1 5 <210> 162 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСегЬит ЕиЬегсиЬозЬз <400> 162
Ьеи Рго СЬу Ьеи ТЬг Ьеи Рго Зег Ьеи 1 5 <210> 163
- 121 022203 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСегйит СиЬегсиЬозгз <400> 163
ТЬг Ьеи Рго Зег Ьеи Азп Не Рго А1а 1 5 <210> 164 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСеггит 1иЬегси1оз1з <400> 164
А1а ТЬг ТЬг Рго АХа Азп 11е ТЬг Уа1 1 5 <210> 165 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСег^ит СиРегси1оз1$ <400> 165
Азп 11е ТЬг Уа1 С1у А1а РЬе Зег Ьеи 1 5 <210> 166 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоРасСег1ит СиЪегси1оз13 <400> 166
Ьеи Рго С1у Ьеи ТЬг Ьеи Рго Зег Ьеи 1 5 <210> 167 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусорасСегэит ЬиЬегси1оз1з <400> 167
А1а ТЬг ТЬг Рго А1а Азп 11е ТЬг Ь’а! 1 5 <210> 168 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬас£ег1ит СиЬегси1озэз <400> 168
Рго А1а Азп 11е ТЬг Уа1 Зег Е1у РЬе 1 5 <210> 169 <211> 9
- 122 022203 <212> ПРТ <213> МуеоЬас!ег1ип< сиЬегси1оз15 <400> 169
Аэп Не ТЬг Уа1 Зег С1у РНе С1п Ьеи 1 5 <210> 170 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасЕесгит СиЬегси1оз!з <400> 170
Ьеи Рго Рго Ьеи Зег Не Рго Зег '/а! 1 5 <210> 171 <211> 9 <212> ПРТ <213> МуссЬааег1 игп ЕиЬегсиПНз <400 171
Рго Рго Ьеи Зег 11е Рго Зег Уа1 А1а 1 5 <210 172 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСеггшп СиЬегсиЗозгз <400 172
11е Рго Зег Уа1 А1а Не Рго Рго Уа1 1 6 <210 173 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСеггит сиЬегсиЗовН <400> 173
Х1е Рго Рго Уа1 ТНг 1/а1 Рго Рго Не 1 5 <210> 174 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСеггит СиЬегси1ов1$ <400> 174
Уа1 Рго Рго 11е ТЬг Уа1 31у А1а РЬе 1 5 <210> 175 <211> 9 <212> ПРТ
- 123 022203 <213? МусоЬасСеггит сиЬегсиЬозгз <400? 175
Рго Ьеи СЬп Ие Рго СЬи УаЬ ТЬг Ие 1 5 <210? 176 <211> 9 <212? ПРТ <213? МусоЬасСепит СиЬегси1озлз <400? 176
Не Рго СЬи УаЬ ТЬг Ие Рго СЬп Ьеи 1 5 <210? 177 <211? 9 <212? ПРТ <213? МусоЬасСеггит СиЬегсиЬозгз <400? 177
ТЬг Ые Рго СЬп Ьеи ТЬг Ые Рго АЬа I 5 <210? 178 <211? 9 <212? ПРТ <213? МусоЬас Се глит СиЬегси1озлз <400? 178
Ьеи ТЬг Ие Рго АЬа СЬу Ые ТЬг Ые 1 5 <210? 179 <211? 9 <212? ПРТ <213? МусоЬас Сеглит СиЬегси1озлз <400? 179
СЬу Ые ТЬг Ые СЬу СЬу РЬе Зег Ьеи 1 5 <210? 180 <2Ы> 9 <212? ПРТ <213? МусоЬасСепит СиЬегси1озлз <400? 180
Ьеи Рго АЬа Ие Нгз ТЬг СЬп Рго Ие 1 5 <210? 181 <211? 9 <212? ПРТ <213? МусоЬасСепит СиЬегси1озлз
- 124 022203 <400> 181
АЬа 11е НЬз ТЬг СЬп Рго Ые ТЬг УаЬ 1 5
<210> <211> <212> <213> 182 9 ПРТ МуооЬасбегЬии ЬиЬегсиЬозЬз
<400> 182
Рго 11е ТЬг УаЬ СЬу СЬп Ые СЬу УаЬ
1 5
<210 <211> <212> <213> 183 9 ПРТ МусодасбегЬшп СиЬеггиЬозЬз
<400> 183
СЬп Ые СЬу УаЬ СЬу СЬп РЬе СЬу Ьеи
1 5
<210> <211> <212> <213> 184 9 ПРТ МусоЬзсСеглит Си£егси1оз1з
<400> 184
СЬу Ьеи Рго Зег Ые СЬу Тгр Азр УаЬ 1 5
<210> <211> <212> <213> 1Э5 9 ПРТ МусоЬасСес!илг СиЬегсиЬозЬз
<400> 185
Ьеи Рго Зег Ые СЬу Тгр Азр УаЬ РЬе
1 5
<210> <211> <212> <213> 186 9 ПРТ МусоЬасСегЗиа £иЪегси1оз13
<400> 186
Азр УаЬ РЬе Ьеи Зег ТЬг Рго Агд Ые
1 5
<210> <211> <212> <213> 187 9 ПРТ МусоЬассег!шп 6иЬегси1оз1з
- 125 022203 <400> 187
РЬе Ъеи Зег ТЬг Рго Агд 11е ТЬг Уа1 1 5 <210 183 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСегЪит биЬегсиЪозЪз <400> 188
ТЬг Рго Агд 11е ТЬг УаЪ Рго А1а РЬе 1 5 <210> 189 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоРас^егхит ГиЬегсиЪозЪз <400> 189
РЬе СЪу Пе Рго РЬе ТЬг Ъеи СЪп РЬе 1 5 <210> 190 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасбег1ил ЬиЬегси1оз1з <400> 190
РЬе ТЬг Ъеи СЪп РЬе С1ь ТЬг Азп УаЪ 1 5 <210> 191 <211> 9 <212? ПРТ <213> МусоЬасСег!ит СиЪегси1оз1з <400? 191
С1п РЬе СЪп ТЬг Азп УаЪ Рго А1а Ъеи 1 5 <210? 192 <211? 9 <212> ПРТ <213> МусоЬаоСегЪит СиЪегсиЪозЪз <400> 192
А1а Ъеи С1п Рго Рго СЪу СЪу СЪу Ъеи
1 5
<210> 193
<211> 9
<2Ъ2> ПРТ
<213> МусоЬас1:ег1ип) 1:иЬегси1о515
<400> 193
- 126 022203
Ьеи Зег ТЬг РЬе ТЬг Азп С1у А1а Ьеи 1 5 <210> 194 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬассегдил? сидегси^озхз <400> 194
Зег ТЬг РЬе ТЬг Азп С1у А1а Ьеи Не 1 5 <210> 195 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСегйит сиЬегсиТозхз <400> 195
ТЬг РЬе ТЬг Азп С31у А1а Ьеи 11е РЬе 1 5 <210> 196 <211> 9 <212> ПРТ <213> ЛТусо2з-зс&ег2и/п СиЬегси1оз1з <400> 196
А1а Ьеи 11е РЬе С1у С1и РЬе Азр Ьеи 1 5 <210> 197 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусорасСег^ил! СиЪегси2оз1^ <400 197
С1у С1ц РЬе Азр Ьеи Рго С?1п Ьеи Уа1 1 5 <210> 198 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСегхил СиЬегсиТозх·?
<400> 198
Ьеи Рго С1п Ьеи Уа1 \Га1 Нхз Рхо Тух 1 5 <210> 199 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЪ&с£ег1ит СиЬегси1о$15 <400> 199
С1п Ьеи Уа1 Уа1 НБз Рго Тух ТЬх Ьеи
- 127 022203 <210> 200 <211> 9 <212> ПРТ <213> МуооЬасС.ег1ию СиЬегси1оз1в <400> 200
НЬз Рго Туг ТЬг Ьеи ТЬг С1у Рго Не 1 5 <210> 201 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЪас£ег1ит £иЪегси1оз1з <400> 201
Туг ТЬг Ьеи ТЬг С1у Рго 11е Уа1 11е 1 5 <210> 202 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬас£ег1иго ГиЬегси1оз1з <400> 202
С1у Рго Не Уа1 11е С1у Зег РЬе РЬе 1 5 <210> 203 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасЪег!шп сийегсиТозл® <400> 203
Рго 11е Уа1 11е С1у Зег РЬе РЬе Ьеи 1 5 <210> 204 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСег!йот СиЬесси1оз1з <400> 204
Зег РЬе РЬе Ьеи Рго А1а РЬе Азп Не 1 5 <210> 205 <211> 9 <212> ПРТ <213> Мусо1эасСег1ит СиЬегси1оз1е <400> 205
Ьеи Рго А1а РЬе Азп Не Рго 61у Не 1 5
- 128 022203
- 129 022203 <210> 212 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСег1ит СиЬегси1оз1з <400 212
ТЬг Рго А1а Ые ТНг ТНг Рго С1и РНе
5 <210> 213 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЪас1:ег1и1п £иЬегси1оз13 <400> 213
АЬа Ые ТЬг ТНг Рго СЬи РНе АЬа 11е 1 5 <210> 214 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬассееаит СиЪегси1оз1з <400> 214
ТНг Рго СЬи РНе АЬа Ые Рго Рго 11е 1 5 <210> 215 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасЁег!иго ЬиЬегси2оз1з <400> 215
Ые Рго Рго Ые СЬу УаЬ СЬу СЬу РНе 1 5 <210> 216 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬас ГегЬит СиЬегси/озлз <400 216
Рго Ые СЬу УаЬ СЬу СЬу РНе ТНг Ьеи 1 5 <210> 217 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасЬеггиш СиЬегсиЬовЬз <400> 217
Ьеи Рго СЬп Ые ТНг ТНг СЬп СЬи Ые 1 5
- 130 022203 <210? 218 <211? 9 <212? ПРТ <213? МусоЬас Неп шп ЪиЬегси1оз13 <400? 218
Рго С1П 11е ТЬг ТЬг С1п С1и 11е 11е 1 5 <210? 219 <211? 9 <212? ПРТ <213? МусоЬасίег1ит СиЬегси1оз13 <400? 219
С1и 11е Не ТЬг Рго 31и Ьеи ТЬг 11е 1 5 <210? 220 <211? 9 <212? ПРТ <213? МусоЪасНеНе® £иЬегси1о313 <400? 220
ТЬг Рго СЬи Ьеи ТЬг Не Азп Зег 11е 1 5 <210? 221 <211? 9 <212? ПРТ <213? МусоЬасСег!иа ίиЪегсиЬозН <400? 221
С1и Ьеи ТЬг Не Азп Зег Х1е С1у Ή1 1 5 <210? 222 <211? 9 <212? ПРТ <213? МусоЬасСегЬшп СиЬегси1оз1з <400? 222
Зег Не Й1у Уз. I С1у С1у РЬе ТЬг Ьеи 1 5 <210? 223 <211? 9 <212? ПРТ <213? МусоЬасСеПит СиЬегси1оз1з <400? 223
Ьеи Рго 61п Не ТЬг ТЬг Рго Рго Не 1 5 <210? 224
- 131 022203 <211> 9 <212> ПРТ <213> Мусооа сбег ί ит (:иЬагси1оз!3 <400> 224
ТНг Рго Рго Не ТЬг ТЬг Рго Рго Ьеи 1 5 <210 225 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСехАшп СиЬегси1оз1з <400 225
Рго 11е ТЬг ТЬг Рго Рго Ьеи ТЬг Не 1 5 <210 226 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСеглшп РиЬегси1оз13 <400 226
ТЬг Рго Рго Ьеи ТЬг Не Азр Рго 11е 1 5 <210> 227 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасЬеглит £иЬегси1оз1з <400 227
Рго Не Азп Ьеи ТЬг С1у РЬе ТЬг Ьеи 1 5 <210 229 <211> 9 <212> ПРТ <213> ЛГусоЬасЬеНил] £иЬегси1оз13 <400 226
ТЬг Рго Рго Ьеи ТЬг 11е СЬи Рго Не 1 5 <210> 229 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСеггит Си&егси1оз13 <400> 229
Рго Ьеи ТЬг Не С1и Рго Не С1у УаЬ 1 5 <210> 230 <211> 9
- 132 022203 <212? ПРТ <213> МусоЬасСепит СиЬегсиЬозлз <400? 230
Ие С1и Рго Ие <31у УаЬ С1у СЬу РНе <210? 231 <211> 9 <212> ПРТ <213? МусоЬасСег1ит СиЬелсиЬозлз <400> 231
Рго Рго Ьеи ТНг УаЬ Рго СЬу Ие НИ 1 5 <210> 232 <2Н> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСепит СиЬегси1опз <400> 232
Рго Ьеи ТЬг Уа1 Рго СЬу Ие НЬз Ьеи 1 5 <210> 233 <2И> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСепит СиЬегси1оз1з <400> 233
С1у Ие НЬз Ьеи Рго Зег ТНг ТЬг Ие 1 5 <210> 234 <211> 9 <212? ПРТ <213? МусоЬасСепит СиЬегси1о$лз <400> 234
НЬз Ьеи Рго Зег ТНг ТНг Ие С1у А1а 1 5 <210> 235 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСепит сиЬегси1о81$ <400> 235
Ьеи Рго Зег ТНг ТЬг Ие СЬу А1а РЬе <210>
<2И>
<212>
236
ПРТ
- 133 022203 <213> Мусора с Сепии СиЬегси1оз13 <400> 236
РНе А1а 11е Рго С1у СЬу Рго С1у Туг
1 5
<210> <211> <212> <213> 237 9 ПРТ МусоЬасСепит СиЬегсиЬозиз
<400> 237
Зег ТНг А1а Рго Зег Зег 61у РЬе РЬе
1 5
<210> <211> <-212> <213> 238 9 ПРТ ЛГусодасСепил! СиЬегеи1о313
<400> 238
Тгр РЬе Азп ТЬг Азп Рго АЬа СЬу Ьеи 1 5
<210> <211> <212> <213> 239 9 ПРТ МусоЬасХепшл ХиЬегсиЬозиз
<400> 239
Азп РЬе СЬу СЬу Ьеи Зег Зег СЬу РЬе
1 5
<210> <211> <212> <213> 240 9 ПРТ МусоЬасСепшп ЕиЬегси1оз13
<400> 240
СЬу Ьеи Зег Зег С1у РЬе Зег Азп Ьеи
1 5
<210> <211> <212> <213> 241 9 ПРТ МусоРасеепшп £иЬегси!о313
<400> 241
Азп Ьеи С1у Зег СЬу Уа1 Зег СЬу РЬе
1 5
<210> <211> <212> <213> 242 9 ПРТ МусоЬзсЗегιит ЬиЬегсиЬозиз
- 134 022203 <400> 242
РЬе АЬа Азп Агд СЬу ЬЬе Ьеи Рго РЬе 1 5 <2Ь0> 243 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСагэит СиЬегси1оз1з <400> 243
Азп Агд СЬу ЬЬе Ьеи Рго РЬе Зег УаЬ 1 5 <2Ь0> 244 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСес!игл СиЬесси1оз1е <400> 244
ЬЬе Ьеи Рго РЬе Зег УаЬ АЬа Зег УаЬ 1 5 <210> 245 <21Ь> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬас^еглит СиЬегси1оз!з <400> 245
Ьеи Рго РЬе Зег УаЬ АЬа Зег УаЬ УаЬ 1 5 <210 246 <211> 9 <212> ПРТ <2ЬЗ> МусоЬас^еггит виЬессиТозлз <400 246
Зег УаЬ АЬа Зег УаЬ УаЬ Зег СЬу РЬе 1 5 <210> 247 <211> 9 <212> ПРТ <213> МусоЬасСегэит СиЬегсиЬозЬз <400> 247
СЬу РЬе АЬа Азп Ые СЬу ТЬг Азп Ьеи 1 5 <210 248 <211> 450 <212> ПРТ <213> МусоЬасЕегаию !:иЬегси1оз1$
- 135 022203
<401 3> 243
МеС Зег СЬи Ьеи Зег УаЬ АЬа ТНг С1у АЬа УаЬ Зег ТНг АЬа Зег Зег
1 5 ЬО 15
Зег Не Рго МеС Рго АЬа СЬу УаЬ Азп Рго АЬа Азр Ьеи АЬа А1а СЬи
20 25 30
Ьеи АЬа АЬа УаЬ УаЬ ТНг СЬи Зег УаЬ Азр С1и Азр Туг Ьеи Ьеи Туг
35 40 45
С1и Суз Азр СЬу СЬп Тгр УаЬ Ьеи АЬа АЬа С1у Уа1 СЬп АЬа МеС Уа1
50 55 60
С1и Ьеи Азр Зег Азр СЬи Ьеи Агд УаЬ 11е Агд Азр СЬу УаЬ ТНг Агд
65 70 75 80
Агд С1п СЬп Тгр Зег СЬу Агд Рго СЬу АЬа АЬа Ьеи СЬу СЬи А1а Уа1
35 90 95
Азр Агд Ьеи Ьеи Ьеи СЬи ТНг Азр СЬп АЬа РНе 61 у Тгр УаЬ АЬа РНе
100 105 НО
СЬи РНе СЬу УаЬ Шз Агд Туг СЬу Ьеи СЬп С1п Агд Ьеи АЬа Рго НЬв
115 120 125
ТНг Рго Ьеи АЬа Агд УаЬ РНе Зег Рго Агд ТЬг Агд Не МеС Уа1 Зег
130 135 140
СЬи Ьуэ СЬи 11е Агд Ьеи РНе Аэр АЬа СЬу 11е Агд НЬз Агд СЬи АЬа
145 150 155 160
Не Азр Агд Ьеи Ьеи АЬа ТНг СЬу УаЬ Агд СЬи УаЬ Рго СЬп Зег Агд
165 170 175
Зег УаЬ Азр УаЬ Зег Азр Азр Рго Зег СЬу РЬе Агд Агд Агд УаЬ АЬа
130 185 190
УаЬ А1а УаЬ Аар СЬи 11е АЬа АЬа СЬу Агд Туг НЬз Ьуз Уа1 Не Ьеи
195 200 205
Зег Агд Суз УаЬ СЬи УаЬ Рго РЬе АЬа ТЬе Азр РЬе Рго Ьеи ТНг Туг
210 215 220
Агд Ьеи СЬу Агд Агд НЬз Азп ТНг Рго УаЬ Агд Зег РНе Ьеи Ьеи СЬп
225 230 235 240
Ьеи С1у СЬу Не Агд АЬа Ьеи СЬу Туг Зег Рго СЬи Ьеи УаЬ ТНг АЬа
245 250 255
Уа1 Агд АЬа Азр СЬу УаЬ УаЬ ТЬе ТЬг СЬи Рго Ьеи АЬа СЬу ТНг Агд
260 265 270
АЬа Ьеи СЬу Агд СЬу Рго АЬа 11е Азр Агд Ьеи АЬа Агд Аар Авр Ьеи
27 5 280 285
СЬи Зег Азп Зег Ьуз Е1и 11е УаЬ СЬи НЬз А1а Пе Зег УаЬ Агд Зег
290 295 300
Зег Ьеи СЬи СЬи 11е ТНг Азр Не АЬа С1и Рго С1у Зег АЬа АЬа Уа1
305 310 315 320
Не Азр РНе МеС ТНг УаЬ Агд СЬи Агд СЬу Зег УаЬ СЬп НЬз Ьеи СЬу
325 330 335
Зег ТНг Пе Агд АЬа Агд Ьеи Азр Рго Зег Зег Азр Агд МеС АЬа АЬа
340 345 350
Ьеи СЬи АЬа Ьеи РНе Рго АЬа УаЬ ТНг АЬа Зег СЬу Не Рго Ьуз АЬа
355 360 365
А1а СЬу Уа1 СЬи АЬа 11е РЬе Агд Ьеи Азр СЬи Суз Рго Агд СЬу Ьеи
370 375 380
Туг Зег СЬу АЬа УаЬ УаЬ МеС Ьеи Зег АЬа Азр СЬу СЬу Ьеи Азр АЬа
385 390 395 400
АЬа Ьеи ТНг Ьеи Агд АЬа АЬа Туг СЬп УаЬ С1у СЬу Агд ТНг Тгр Ьеи
405 410 415
Агд АЬа СЬу АЬа СЬу Не Пе СЬи С1и Зег СЬи Рго СЬи Агд СЬи РНе
420 425 430
С1и СЬи ТНг Суз СЬи Ьуз Ьеи Зег ТЬг Ьеи ТНг Рго Туг Ьеи УаЬ АЬа
435 440 445
Агд СЬп
450
136 022203 <210> 249 <211> 324 <212> ПРТ <213> ЛусоЬзсСегй шп <:иЪегси1о$13 <400> 249
МеГ Зег Азр от Уа1 Рго Ьуз Рго Нйз Агд Нйз Нйз Не Тгр Агд Пе
1 5 10 15
ТЬг Агд Агд ТЬг Ьеи Зег Ьуз Зег Тгр Азр Азр Зег Пе РЬе Зег Сйи
20 25 30
Зег Айа С1п Айа Ай а РЬе Тгр Зег Айа Ьеи Зег Ьеи Рго Рго Ьеи Ьеи
35 40 45
Ьеи Сйу МеГ Ьеи 01 у Зег Ьеи А1а Туг Уа1 Айа Рго Ьеи РЬе Сйу Рго
50 55 60
Азр ТЬг Ьеи Рго Ай а Не Сйи Ьу® Зег Айа Ьеи Зег ТЬг А1а Нйз Зег
65 70 75 80
РЬе РЬе Зег Рго Зег Уай Уа1 Азп Сйи Не Не Сйи Рго ТЬг Пе Сйу
85 90 95
Азр 11е ТЬг Азп Азп Айа Агд Сйу Сйи Уа1 Айа Зег Ьеи Сйу РЬе Ьеи
100 105 110
Пе Зег Ьеи Тгр Айа Сйу Зег зег А1а Не Зег А1а РЬе Уай Азр Айа
115 120 125
УаЬ Уа1 01 и А1а Нйз Азр 61п ТЬг Рго Ьеи Агд Нйз Рго Уа1 Агд С1п
130 135 140
Агд РЬе РЬе А1а Ьеи РЬе Ьеи Туг Уа1 Уа1 МеГ Ьеи УаЬ РЬе Ьеи Уа1
145 150 155 160
Айа ТЬг А1а Рго Уа1 МеГ Уа1 Уа1 Сйу Рго Агд Ьуз Уа1 Зег Сйи Нйз
165 170 175
11е Рго Сйи Зег Ьеи Айа Азп Ьеи Ьеи Агд Туг Сйу Туг Туг Рго Айа
180 185 190
Ьеи Ие Ьеи Сйу Ьеи ТЬг Уа1 Е1у Уа1 Не Ьеи Ьеи Туг Агд Уа1 Айа
195 200 205
Ьеи Рго Уа1 Рго Ьеи Рго ТЬг Нйз Агд Ьеи Уа1 Ьеи Сйу Айа Уай Ьеи
210 215 220
Айа Не Айа Уай РЬе Ьеи Не Айа ТЬг Ьеи 01 у Ьеи Агд Уа1 Туг Ьеи
225 230 235 240
Айа Тгр Не ТЬг Агд ТЬг С1у Туг ТЬг Туг С1 у А1а Ьеи Айа ТЬг Рго
245 250 255
Пе А1а РЬе Ьеи Ьеи РЬе Айа РЬе РЬе С1у С1у РЬе Айа Пе Мег Ьеи
260 265 270
Сйу А1а Сйи Ьеи Азп Айа А1а Уай С1п С1и Сйи Тгр Рго А1а Рго Айа
275 280 285
ТЬг Нйз А1а Нйз Агд Ьеи С1 у Азп Тгр Ьеи Ьуз Айа Агд Пе Сйу Уа1
290 295 300
61у ТЬг ТЬг ТЬг Туг Зег Зег ТЬг Айа С1п Нйз Зег Айа Уай Айа Айа
305 310 315 320
Сйи Рго Рго Зег
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (2)

1. Выделенный полипептидный антиген, содержащий:
(1) последовательность белка Ку1753с с 8Ε0 ΙΌ ΝΟ: 1 или 3-7;
(2) вариант последовательности белка Ку1753с, имеющий по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности 8Ε0 ГО ΝΟ: 1; или (3) иммуногенный фрагмент по меньшей мере из 10 аминокислотных остатков из последовательности белка Ку1753с с 8ΕΟ ГО ΝΟ: 1, для применения в качестве лекарственного средства в лечении или предупреждении туберкулеза.
2. Полипептид по п.1 для применения в лечении латентного туберкулеза.
3. Полипептид по п.1 для применения в предупреждении латентного туберкулеза.
4. Полипептид по п.1 для применения в предупреждении реактивации туберкулеза.
5. Полипептид по п.1 для применения в замедлении реактивации туберкулеза.
6. Выделенный полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептидный антиген, содержащий:
(1) последовательность белка Ку1753с с 8ΕΟ ГО ΝΟ: 1 или 3-7;
(2) вариант последовательности белка Ку1753с, имеющий по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности 8ΕΟ ГО ΝΟ: 1; или (3) иммуногенный фрагмент по меньшей мере из 10 аминокислотных остатков из последовательности белка Ку1753с с 8ΕΟ ГО ΝΟ: 1, для применения в качестве лекарственного средства в лечении или предупреждении туберкулеза.
7. Полинуклеотид по п.6 для применения в лечении латентного туберкулеза.
8. Полинуклеотид по п.6 для применения в предупреждении латентного туберкулеза.
9. Полинуклеотид по п.6 для применения в предупреждении реактивации туберкулеза.
- 137 022203
10. Полинуклеотид по п.6 для применения в замедлении реактивации туберкулеза.
11. Фармацевтическая композиция, содержащая:
(а) полипептидный антиген, содержащий:
(1) последовательность белка Ку1753с с 8ЕЦ ГО ЫО: 1 или 3-7;
(2) вариант последовательности белка Ку1753с, имеющий по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности §ЕЦ ГО ЫО: 1; или (3) иммуногенный фрагмент по меньшей мере из 10 аминокислотных остатков из последовательности белка Ку1753с с 8ЕЦ ГО ЫО: 1; или (б) полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид из (а); и (в) фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
12. Иммуногенная композиция, содержащая:
(а) полипептидный антиген, содержащий:
(1) последовательность белка Ку1753с с 8ЕЦ ГО ЫО: 1 или 3-7;
(2) вариант последовательности белка Ку1753с, имеющий по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности §ЕЦ ГО ЫО: 1; или (3) иммуногенный фрагмент по меньшей мере из 10 аминокислотных остатков из последовательности белка Ку1753с с 8ЕЦ ГО ЫО: 1; или (б) полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид из (а); и (в) неспецифический усилитель иммунного ответа.
13. Способ лечения или предупреждения туберкулеза, включающий введение безопасного и эффективного количества полипептидного антигена, содержащего:
(1) последовательность белка Ку1753с с 8ЕЦ ГО ЫО: 1 или 3-7;
(2) вариант последовательности белка Ку1753с, имеющий по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности §ЕЦ ГО ЫО: 1; или (3) иммуногенный фрагмент по меньшей мере из 10 аминокислотных остатков из последовательности белка Ку1753с с 8ЕЦ ГО ЫО: 1;
субъекту, нуждающемуся в этом, где указанный полипептид вызывает иммунный ответ.
14. Способ лечения или предупреждения туберкулеза, включающий введение безопасного и эффективного количества полинуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептидный антиген, содержащий:
(1) последовательность белка Ку1753с с 8ЕЦ ГО ЫО: 1 или 3-7;
(2) вариант последовательности белка Ку1753с, имеющий по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности §ЕЦ ГО ЫО: 1; или (3) иммуногенный фрагмент по меньшей мере из 10 аминокислотных остатков из последовательности белка Ку1753с с 8ЕЦ ГО ЫО: 1;
субъекту, нуждающемуся в этом, где указанный полинуклеотид вызывает иммунный ответ.
15. Способ по п.13 или 14, где субъект имеет активный туберкулез.
16. Способ по п.13 или 14, где субъект имеет латентный туберкулез.
17. Способ по п.13 или 14, где у субъекта нет туберкулеза.
18. Способ по любому из пп.13-17, который относится к лечению туберкулеза.
19. Способ по любому из пп.13-17, который относится к предупреждению туберкулеза.
20. Способ по любому из пп.13-17, который относится к лечению латентного туберкулеза.
21. Способ по любому из пп.13-17, который относится к предупреждению латентного туберкулеза.
22. Способ по любому из пп.13-17, который относится к предупреждению реактивации туберкулеза.
23. Способ по любому из пп.13-17, который относится к замедлению реактивации туберкулеза.
24. Применение полипептидного антигена, содержащего:
(1) последовательность белка К.у1753с с 8ЕЦ ГО ЫО: 1 или 3-7;
(2) вариант последовательности белка Ку1753с, имеющий по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности §ЕЦ ГО ЫО: 1; или (3) иммуногенный фрагмент по меньшей мере из 10 аминокислотных остатков из последовательности белка Ку1753с с 8ЕЦ ГО ЫО: 1;
в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения туберкулеза.
25. Применение полинуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептидный антиген, содержащий:
(1) последовательность белка К.у1753с с 8ЕЦ ГО ЫО: 1 или 3-7;
(2) вариант последовательности белка Ку1753с, имеющий по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности §ЕЦ ГО ЫО: 1; или (3) иммуногенный фрагмент по меньшей мере из 10 аминокислотных остатков из последовательности белка Ку1753с с 8ЕЦ ГО ЫО: 1;
в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения туберкулеза.
- 138 022203
Фиг. 1
Фиг. 2 % С08+ Т-клеток
Цитокиновый профиль Ку1753-специфического СО8 Т-клеточного ответа
Фиг. 3
Ξ)ΡΝ9+ΙΙ_2+ΤΝΡβ +
□ ΙΡΝ9-Η.2+ΤΝΡ8+ □ ΙΡΝρ+Η_2-ΤΝΡβ+ 1РМд+1|_2+ТМРаВ 1РМд-|1_2-ТЫРа+
О ΙΡΝ9+Ιί2-ΤΝΡβ0 ΙΡΝ9<2+ΤΝΡ3-
Фиг. 4
139
Цитокиновый профиль Ру1753с-специфического СО4 Т-клеточного ответе
ΘΟΟ4№Να+Ι12+ΤΝΡ+ □ СО4ЛР14д-Н_2+Т№+ □ СО4ЛРМд+И_2.Т1ЧР+ СО4ЛРМд+Н.2+ТМРВ СО4ЛРМд-Н-2.Т№+
1ШСО4ЛРМд+П.2-ТМРВСО4ЛРМд-1Ь2+ТМГ-
EA201100071A 2008-07-25 2009-07-24 Способы и композиции для лечения или предупреждения туберкулёза EA022203B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8369208P 2008-07-25 2008-07-25
PCT/EP2009/059586 WO2010010180A1 (en) 2008-07-25 2009-07-24 Novel compositions and methods

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201100071A1 EA201100071A1 (ru) 2011-10-31
EA022203B1 true EA022203B1 (ru) 2015-11-30

Family

ID=41172233

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201100071A EA022203B1 (ru) 2008-07-25 2009-07-24 Способы и композиции для лечения или предупреждения туберкулёза

Country Status (24)

Country Link
US (2) US9315556B2 (ru)
EP (1) EP2315597B1 (ru)
JP (1) JP5824360B2 (ru)
KR (2) KR20110060891A (ru)
CN (2) CN108059660A (ru)
AU (1) AU2009273133B2 (ru)
BR (1) BRPI0916705A2 (ru)
CA (1) CA2731549C (ru)
CO (1) CO6400198A2 (ru)
CY (1) CY1119737T1 (ru)
EA (1) EA022203B1 (ru)
ES (1) ES2647321T3 (ru)
HR (1) HRP20171694T1 (ru)
HU (1) HUE037121T2 (ru)
IL (1) IL210588A0 (ru)
LT (1) LT2315597T (ru)
MX (1) MX2011000981A (ru)
NO (1) NO2315597T3 (ru)
PL (1) PL2315597T3 (ru)
PT (1) PT2315597T (ru)
SG (1) SG10201505149WA (ru)
SI (1) SI2315597T1 (ru)
UA (1) UA107180C2 (ru)
WO (1) WO2010010180A1 (ru)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUE039159T2 (hu) 2008-07-25 2018-12-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Tuberkulózis Rv2386c protein, ezt tartalmazó készítmények és ezek alkalmazása
GB201116248D0 (en) 2011-09-20 2011-11-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Liposome production using isopropanol
US20140349320A1 (en) * 2011-12-15 2014-11-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Using Adaptive Immunity to Detect Drug Resistance
CN103467582A (zh) * 2012-06-08 2013-12-25 同济大学 结核杆菌重要抗原的高通量筛选及其在结核病诊断中的应用
GB201405921D0 (en) * 2014-04-02 2014-05-14 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel methods for inducing an immune response
US10695424B2 (en) 2016-12-07 2020-06-30 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Method of making a liposome composition
GB201621686D0 (en) 2016-12-20 2017-02-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods for inducing an immune response
GB201707700D0 (en) 2017-05-12 2017-06-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Dried composition
EP3630176A1 (en) 2017-05-30 2020-04-08 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Methods for manufacturing an adjuvant
JP2021504424A (ja) 2017-12-01 2021-02-15 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム サポニン精製
US20220218811A1 (en) * 2019-04-17 2022-07-14 Codiak Biosciences, Inc. Methods of treating tuberculosis
EP3980044A1 (en) 2019-06-05 2022-04-13 GlaxoSmithKline Biologicals SA Saponin purification

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030236393A1 (en) * 2002-03-22 2003-12-25 United States Of America Dept Of Vetrans Affairs Virulence genes of M. marinum and M. tuberculosis
WO2005076010A2 (en) * 2004-02-06 2005-08-18 Council Of Scientific And Industrial Research Computational method for identifying adhesin and adhesin-like proteins of therapeutic potential
WO2008107370A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Novel method and compositions

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4016146A (en) * 1974-12-10 1977-04-05 Biological Developments, Inc. Phenethylamine antigenic conjugates, their preparation, antibodies, and use
EP0761231B1 (en) 1992-06-25 2000-01-12 SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. Vaccine composition containing adjuvants
US6592877B1 (en) 1995-09-01 2003-07-15 Corixa Corporation Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis
US6458366B1 (en) 1995-09-01 2002-10-01 Corixa Corporation Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis
US6613881B1 (en) 1997-05-20 2003-09-02 Corixa Corporation Compounds for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis and methods of their use
US7087713B2 (en) * 2000-02-25 2006-08-08 Corixa Corporation Compounds and methods for diagnosis and immunotherapy of tuberculosis
CA2326598C (en) 1998-04-07 2014-06-10 Corixa Corporation Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses
US6291013B1 (en) * 1999-05-03 2001-09-18 Southern Biosystems, Inc. Emulsion-based processes for making microparticles
WO2001019993A2 (en) 1999-09-17 2001-03-22 University Of Maryland, Baltimore Virulence genes of m. marinum and m. tuberculosis
CA2386841A1 (en) 1999-10-07 2001-04-12 Corixa Corporation Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis
DK1542732T3 (da) 2000-06-20 2009-12-14 Corixa Corp Fusionsproteiner af Mycobacterium tuberculosis
CA2438279A1 (en) 2001-02-22 2002-09-26 Institut Pasteur Comparative mycobacterial geneomics as a tool for identifying targets for the diagnosis, prophylaxis or treatment of mycobacterioses
AU2003213118A1 (en) 2002-02-15 2003-09-09 Corixa Corporation Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis
CA2607715C (en) 2005-04-29 2015-11-24 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Novel method for preventing or treating m tuberculosis infection
WO2008007942A1 (en) 2006-07-10 2008-01-17 Het Nederlands Kanker Instituut Means and methods for manipulating sequential phagolysomal-cytosolic translocation of mycobacteria, and uses thereof
CN102164952B (zh) * 2008-07-25 2016-05-25 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 新型组合物和方法
HUE039159T2 (hu) 2008-07-25 2018-12-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Tuberkulózis Rv2386c protein, ezt tartalmazó készítmények és ezek alkalmazása
WO2010010178A1 (en) 2008-07-25 2010-01-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A The tuberculosis rv2707c protein, compositions and uses thereof
AU2010238943B9 (en) 2009-04-24 2015-10-15 Statens Serum Institut A tuberculosis TB vaccine to prevent reactivation
US8367055B2 (en) 2009-05-14 2013-02-05 Wisconsin Alumni Research Foundation Immunogenic compositions against tuberculosis
HUE031184T2 (en) 2010-01-27 2017-06-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Modified tuberculosis antigens

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030236393A1 (en) * 2002-03-22 2003-12-25 United States Of America Dept Of Vetrans Affairs Virulence genes of M. marinum and M. tuberculosis
WO2005076010A2 (en) * 2004-02-06 2005-08-18 Council Of Scientific And Industrial Research Computational method for identifying adhesin and adhesin-like proteins of therapeutic potential
WO2008107370A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Novel method and compositions

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHAITRA M. G. ET AL.: "Defining putative T cellepitopes from PE and PPE families of proteins of Mycobacterium tuberculosis with vaccine potential", VACCINE, vol. 23, no. 10, 26 January 2005 (2005-01-26), pages 1265-1272, XP004714023, ISSN: 0264-410X, the whole document *
CHAITRA M.G. ET AL.: "HLA-A*0201-restricted cytotoxic T-cellepitopes in three PE/PPE family proteins of Mycobacterium tuberculosis", SCANDINAVIAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol . 67, no. 4, April 2008 (2008-04), pages 411-417, XP002552248, ISSN: 0300-9475, the whole document *
DATABASE UniProt [Online], 1 December 2001 (2001-12-01), "SubName: Full=PPE Rvl753c; Flags: Fragment"; XP002552251, retrieved from EBI accession no. NIPROT:Q93M49, Database accession no. Q93M49, abstract *
DATABASE UniProt [Online], 10 July 2007 (2007-07-10), "SubNamtheta: Full=PPE family protein"; XP002552250, retrieved from. EBI accession no. UNIPROT:A5U3B3, Database accession no. A5U3B3, abstract *
DATABASE UniProt [Online], 20 March 2007 (2007-03-20), "SubName: Full=PPE family protein"; XP002552252, retrieved from EBI accession. no. UNIPROT:A2VIN4, Database accession no. A2VIN4, abstract *
DATABASE UniProt [Online], 6 February 2007 (2007-02-06), "SubName: Full=PPE family protein"; XP002552262, retrieved from EBI, accession no. UNIPROT:A1KJHO, Database accession no. AIKJHO, abstract *
GEY VAN PITTIUS NICOLAAS C. ET AL.: "Evolution and expansion of the Mycobacterium tuberculosis PE and PPE multigene families and their association with the duplication of the ESAT-6 (esx) genecluster regions", BMC EVOLUTIONARY BIOLOGY, BIOMED CENTRAL LTD., LONDON, GB,vol. 6, no. 1, 15 November 2006 (2006-11-15), page 95, XP021022074, ISSN: 1471-2148, figure 10; table 5 *
ROMANO M. ET AL.: "Immunogenicity and protective efficacy of tuberculosis subunit vaccines expressing PPE44 (Rv2770c)", VACCINE, BUTTERWORTH SCIENTIFIC. GUILDFORD, GB, vol. 26, no. 48, 11 November 2008 (2008-11-11), pages 6053-6063, XP026034575, ISSN: 0264-410X [retrieved on 2008-09-24], abstract *
SKUCE ROBIN A. ET AL.: "Discrimination of Mycobacterium tuberculosis complex bacteria using novel VNTR-PCR targets." MICROBIOLOGY (READING, ENGLAND), FEB. 2002, vol. 148, no. Pt 2, February 2002 (2002-02), pages 519-528, XP002552249, ISSN: 1350-0872, abstract; table 2 *

Also Published As

Publication number Publication date
HUE037121T2 (hu) 2018-08-28
MX2011000981A (es) 2011-03-02
CY1119737T1 (el) 2018-06-27
IL210588A0 (en) 2011-03-31
LT2315597T (lt) 2018-02-12
SI2315597T1 (sl) 2017-12-29
US20110223200A1 (en) 2011-09-15
US9315556B2 (en) 2016-04-19
CO6400198A2 (es) 2012-03-15
US20160184420A1 (en) 2016-06-30
JP2011528897A (ja) 2011-12-01
EP2315597A1 (en) 2011-05-04
WO2010010180A1 (en) 2010-01-28
CA2731549A1 (en) 2010-01-28
SG10201505149WA (en) 2015-07-30
UA107180C2 (ru) 2014-12-10
EP2315597B1 (en) 2017-08-23
US9750794B2 (en) 2017-09-05
BRPI0916705A2 (pt) 2015-11-10
AU2009273133A1 (en) 2010-01-28
CN108059660A (zh) 2018-05-22
PT2315597T (pt) 2017-11-20
EA201100071A1 (ru) 2011-10-31
NO2315597T3 (ru) 2018-01-20
ES2647321T3 (es) 2017-12-20
AU2009273133B2 (en) 2014-06-05
HRP20171694T1 (hr) 2017-12-15
CA2731549C (en) 2018-07-17
CN102164612B (zh) 2018-01-16
CN102164612A (zh) 2011-08-24
PL2315597T3 (pl) 2018-01-31
JP5824360B2 (ja) 2015-11-25
KR20160013262A (ko) 2016-02-03
KR20110060891A (ko) 2011-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA022203B1 (ru) Способы и композиции для лечения или предупреждения туберкулёза
EA024826B1 (ru) Способ лечения латентного туберкулеза
US10286053B2 (en) Compositions and methods
JP6503309B2 (ja) 改変された結核抗原
EA012576B1 (ru) Новый способ предупреждения или лечения инфекции, вызываемой m.tuberculosis
EA014527B1 (ru) Вакцины против хламидиоза
HUE028452T2 (en) Mycobacterium antigenic preparations
Kilgore et al. Combinatorial viral vector-based and live attenuated vaccines without an adjuvant to generate broader immune responses to effectively combat pneumonic plague
CN103118702A (zh) 活动性结核病的治疗性接种
US11911459B2 (en) Nant COVID vaccine cross reactivity

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU