JP6503309B2 - 改変された結核抗原 - Google Patents

Description

本発明は、改変されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｒｖ３６１６ｃタンパク質、関連するポリヌクレオチド、ならびに結核の治療または予防におけるそのようなタンパク質およびポリヌクレオチドの使用、特に、潜伏結核の治療または予防および結核の再活性化の予防または遅延における使用に関する。

結核（ＴＢ）は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよび他のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の感染によって引き起こされる慢性感染症である。結核は、開発途上国において主要な疾患であり、世界の先進地域においてもますます問題となっている。２０億を越える人々が、ＴＢ菌に感染していると考えられており、毎年、約９２０万のＴＢ新規症例が発生し、１７０万人が死亡している。ＴＢ菌に感染している人の１０％が、活動性ＴＢを発症し、活動性ＴＢを発症した人は１年に１人あたり平均１０〜１５人に感染させている。年間発症率は、世界的にピークに達したが、死亡数および症例数は、人口増加が原因でなおも増え続けている（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｆａｃｔｓ ２００８）。

Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは、呼吸経路を介して個体に感染する。肺胞マクロファージは、この細菌を貪食するが、この細菌は、ファゴソームと酸性リソソームとの融合を阻害することによって、生存および増殖することができる。結果として、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞が関与する複雑な免疫応答が起き、最終的には、肉芽腫が形成される。病原体としてのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの成功の中心は、その細菌が、隔離されているが排除されずに長期間存続することがあり、後に個体が活動性ＴＢを発症しやすくなるという事実にある。

感染個体の５％未満が、感染後１年目に活動性ＴＢを発症する。肉芽腫は、数十年間存続することができ、生きたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを、酸素および栄養分が欠乏した休眠状態で含んでいると考えられている。しかしながら、最近、その休眠状態の細菌の大部分は、全身に広がった非マクロファージ細胞型に位置していると示唆された（Ｌｏｃｈｔ ｅｔ ａｌ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００７ ７（１１）：１６６５−１６７７）。例えば、免疫抑制事象の結果として、宿主の自然免疫と病原体とのバランスが変化したとき、活動性ＴＢが発症する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｐ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００７ １５（１）：７−１３；Ｅｈｌｅｒｓ Ｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２００９ ３７（２）：８７−９５）。

潜伏ＴＢと活動性ＴＢとのバランスを説明する動的仮説も提唱されている（Ｃａｒｄａｎａ Ｐ−Ｊ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ＆ Ａｌｌｅｒｇｙ−Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ２００６ ６：２７−３９；Ｃａｒｄａｎａ Ｐ−Ｊ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２００９ ３７（２）：８０−８６）。

感染は、かなりの期間にわたって無症候性の場合があるが、その活動性の疾患は、最も一般的には肺の急性炎症としてあらわれ、疲労、体重減少、発熱および持続性の咳が生じる。治療されない場合、典型的には重篤な合併症および死亡に至る。

結核は、一般に、長期の抗生物質治療を用いて制御することができるが、そのような治療は、この疾患の蔓延を防ぐには不十分である。活動性感染の個体は、大部分はしばらくの間、無症候性であるが、伝染性である場合がある。さらに、治療レジメンの順守が重要であるにもかかわらず、患者の行動を監視することは困難である。一部の患者は、治療過程を終えず、それにより、効果のない治療および薬剤耐性の発生がもたらされ得る。

多剤耐性ＴＢ（ＭＤＲ−ＴＢ）は、第一選択薬に反応しない１つの形態である。ＴＢの全症例の５％がＭＤＲ−ＴＢであり、毎年４９０，０００例のＭＤＲ−ＴＢ新規症例が生じていると推定されている。ＭＤＲ−ＴＢに加えて第二選択薬に対しても耐性になると、広範囲薬剤耐性ＴＢ（ＸＤＲ−ＴＢ）が生じる。毎年４０，０００例の実質的に治療不能なＸＤＲ−ＴＢの新規症例が生じていると推定されている（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｆａｃｔｓ ２００８）。

抗生物質治療の全過程が完了したとしても、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの感染は、感染個体から排除されないことがあり、再活性化することができる潜伏感染として残ることがある。

結核の蔓延を制御するために、効果的なワクチン接種計画およびこの疾患の正確な早期診断が、何よりも重要である。

現在、生菌ワクチン接種が、防御免疫を誘導するために最も広く使用されている方法である。この目的のために使用されている最も一般的なＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、６０年以上前に初めて開発されたＭ．ｂｏｖｉｓの非病原性株であるＢａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）である。しかしながら、ＢＣＧの安全性および有効性は、論争の源である（ＢＣＧは、小児における重篤疾患の顕在化を保護するが、潜伏ＴＢの確立または成人期における肺疾患の再活性化を予防しない）。そのうえ、米国などの一部の国は、一般市民に対してこの薬剤のワクチン接種を行っていない。

現在臨床開発中のほぼすべての新世代ＴＢワクチンが、曝露前ワクチンとして設計されている。これらには、事前のＢＣＧワクチン接種によって誘導された免疫を追加免疫する際に特に効果的であるサブユニットワクチン、ならびにＢＣＧをより有効および／またはより安全な株で置き換えることを目標とした進歩した生マイコバクテリアワクチンが含まれる。これらのワクチンは、感染に対する抵抗性を改善することを目標としているが、それらは、潜伏ＴＢ症例における曝露後ワクチンまたは治療用ワクチンとしてはあまり効果的でない可能性がある（Ｌｉｎ ＭＹ ｅｔ ａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ＆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ−Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ２００８ ８：１５−２９）。

米国特許出願公開第２００８０２６９１５１号明細書の実施例２には、残基１５０〜１６０が欠失したＲｖ３６１６ｃポリペプチドであるΔＴＭ−１（米国特許出願公開第２００８０２６９１５１号明細書の配列番号２２）；残基１０１〜２０３が欠失したＲｖ３６１６ｃポリペプチドであるΔＴＭ−２（米国特許出願公開第２００８０２６９１５１号明細書の配列番号２４）；およびＲｖ３６１６ｃの残基１５０〜１６０が抗原ＴｂＨ９によって置き換えられた配列（米国特許出願公開第２００８０２６９１５１号明細書の配列番号６０）を含む、ある特定の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質のクローニング、構築および発現が開示されている。

発明の簡単な要旨
本発明は、概して、マイコバクテリアの潜伏感染の分野における、改変されたＲｖ３６１６ｃポリペプチドまたはそれらをコードするポリヌクレオチドの使用に関する。さらに、本発明は、特定の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質に関する。本発明者らは、驚いたことに、Ｒｖ３６１６ｃ配列の特定の領域の疎水性を破壊することにより、免疫原性特性に対して有害な影響なしに発現を改善することができることを発見した。その改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、ＴＢ抗原、特に潜伏ＴＢ抗原として有用である。

その最も広範な態様において、本発明は、Ｈ３７Ｒｖ配列の残基１３４〜１８３に対応するアミノ酸残基の疎水性が破壊されている改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質、好適には、Ｈ３７Ｒｖ配列の残基１３５〜１５４に対応するアミノ酸残基の疎水性が破壊されている改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を提供する。

本発明の１つの態様では、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質が提供され、前記改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含んでなり、その第１ポリペプチドは、第２ポリペプチドに対して、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質のＣ末端側に位置し、ここで、
（ｉ）第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３３に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、かつ
（ｉｉ）第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１８４〜３９２に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、
ここで、その第１および第２ポリペプチドは、直接的または間接的に連結されている。

本発明の第２の態様では、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質が提供され、前記改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含んでなり、その第１ポリペプチドは、第２ポリペプチドに対して、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質のＣ末端側に位置し、ここで、
（ｉ）第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３３の中の少なくとも１００アミノ酸の連続した配列であり、かつ
（ｉｉ）第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１８４〜３９２の中の少なくとも１５５アミノ酸の連続した配列であり、
ここで、その第１および第２ポリペプチドは、直接的または間接的に連結されている。

本発明の第３の態様では、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質が提供され、前記タンパク質は、配列番号１における残基１３４〜１８３に対応する領域から少なくとも１つのアミノ酸（例えば、少なくとも２つ）が欠失しているＲｖ３６１６ｃ配列を含んでなるか、あるいは、その配列から本質的になるか、またはその配列からなる。

本発明の第４の態様は、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を提供し、前記タンパク質は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含んでなり、その第１ポリペプチドは、第２ポリペプチドに対してＮ末端側に位置しており、ここで、
（ｉ）第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３３の中の少なくとも１００アミノ酸の連続した配列であり、かつ
（ｉｉ）第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１８４〜３９２の中の少なくとも１５５アミノ酸の連続した配列であり、
ここで、その第１および第２ポリペプチドは、直接連結されているか、または第３ポリペプチドを介して間接的に連結されており、前記第３ポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸（例えば、少なくとも２つ）が欠失している、配列番号１における残基１３４〜１８３に対応する。

本発明の第５の態様は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含んでなる改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を提供し、その第１ポリペプチドは、第２ポリペプチドに対してＮ末端側に位置しており、ここで、
（ｉ）第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３４の中の少なくとも１００アミノ酸の連続した配列であり、かつ
（ｉｉ）第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１５５〜３９２の中の少なくとも１７５アミノ酸の連続した配列であり、
ここで、その第１および第２ポリペプチドは、直接連結されているか、または第３ポリペプチドを介して間接的に連結されており、ここで、前記第３ポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸（例えば、少なくとも２つ）が欠失している、配列番号１における残基１３５〜１５４に対応する。

本発明の第６の態様は、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を提供し、前記タンパク質は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含んでなり、その第１ポリペプチドは、第２ポリペプチドに対してＮ末端側に位置しており、ここで、
（ｉ）第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３３に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、かつ
（ｉｉ）第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１８４〜３９２に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、
ここで、その第１および第２ポリペプチドは、直接連結されているか、または第３ポリペプチドを介して間接的に連結されており、前記第３ポリペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸（例えば、少なくとも４個）の連続した部分が欠失している、配列番号１における残基１３４〜１８３に対応する配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する。

本発明の第７の態様は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含んでなる改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を提供し、その第１ポリペプチドは、第２ポリペプチドに対してＮ末端側に位置しており、ここで、
（ｉ）第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３４に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、かつ
（ｉｉ）第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１５５〜３９２に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、
ここで、その第１および第２ポリペプチドは、直接連結されているか、または第３ポリペプチドを介して間接的に連結されており、前記第３ポリペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸（例えば、少なくとも４個）の連続した部分が欠失している、配列番号１における残基１３５〜１５４に対応する配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する。

本発明の第８の態様では、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質が提供され、前記タンパク質は、配列番号１における残基１３４〜１８３に対応する領域から少なくとも３個のアミノ酸（例えば、少なくとも４個）の連続した部分が親水性残基で置換されているＲｖ３６１６ｃ配列を含んでなる。

改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの任意の株由来の野生型Ｒｖ３６１６ｃタンパク質配列に基づき得る。例えば、前述の実施形態では、配列番号３〜７のいずれか１つ、特に、配列番号３〜６のいずれか１つで、配列番号１が置換されてもよい。

本発明に係る例示的な改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、配列番号１６１〜１６９、１７９および１８０に提供されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質（例えば、配列番号１６１〜１６９、１７９および１８０に提供されるアミノ酸配列からなるタンパク質）である。配列番号１６１、１６３〜１６９、１７９および１８０に提供されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質（例えば、配列番号１６１、１６３〜１６９、１７９および１８０に提供されるアミノ酸配列からなるタンパク質）が特に興味深い。

薬剤として使用するための、そのような改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質も提供される。

本発明のさらなる態様は、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を投与することを含んでなる、被験体における免疫応答を誘導するための方法に関する。

本発明のさらなる態様は、ＴＢの治療、改善または予防のための方法に関し、その方法は、有効量の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を、それを必要とする被験体に投与することを含んでなり、ここで、前記ポリペプチドは、免疫応答を誘導する。さらなる態様において、その方法は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する免疫応答を誘導することをさらに含んでなる。

ＴＢの治療、改善または予防のための薬剤の製造における改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質の使用は、本発明の別の態様に相当する。

本発明は、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質をコードする核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドを提供する。改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質をコードする核酸配列を含んでなる例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１７０〜１７８に提供されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド（例えば、配列番号１７０〜１７８に提供されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド）である。改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質をコードする核酸配列を含んでなる他の例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１６１〜１６９、１７９または１８０（例えば、配列番号１６１、１６３〜１６９、１７９または１８０）に提供されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなる（例えば、そのヌクレオチド配列からなる）ポリヌクレオチドである。

薬剤として使用するための、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質をコードする核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドも提供される。

本発明のさらなる態様は、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質をコードする核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドを投与することを含んでなる、被験体において免疫応答を誘導するための方法に関する。

本発明のさらなる態様は、結核の再活性化の治療、改善、遅延または予防のための方法に関し、その方法は、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質をコードする核酸配列を含んでなる有効量のポリヌクレオチドを、それを必要とする被験体に投与することを含んでなり、ここで、前記ポリペプチドは、免疫応答を誘導する。さらなる態様において、その方法は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する免疫応答を誘導することをさらに含んでなる。

ＴＢの治療、改善または予防のための薬剤の製造における、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を含んでなるポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドの使用は、本発明の別の態様に相当する。

また、
（ａ）改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質、または
（ｂ）改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質をコードする核酸配列を含んでなるポリヌクレオチド、および
（ｃ）薬学上許容される担体または賦形剤
を含んでなる医薬組成物が提供される。

さらに、
（ａ）改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質、または
（ｂ）改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質をコードする核酸配列を含んでなるポリヌクレオチド、および
（ｃ）非特異的な免疫応答増強剤
を含んでなる免疫原性組成物が提供される。

改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質をコードする核酸配列を含んでなる発現ベクターも提供される。

前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞は、本発明のさらなる態様を形成する。さらに、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を組換え的に発現する宿主細胞が提供される。

さらに、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を生成するための方法が提供され、
前記方法は、宿主細胞内で前記ポリペプチドを組換え的に発現させる工程を含んでなる。

（ａ）改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質、
（ｂ）前記改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質と、個体由来のサンプル（例えば、全血またはより好適にはＰＢＭＣ）とを接触させるのに足りる装置、および
（ｃ）そのサンプルのＴ細胞応答を定量する手段
を含んでなる診断キットも提供される。

本発明の別の態様は、
（ａ）改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質、および
（ｂ）前記改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質と患者の皮膚細胞とを接触させるのに足りる装置
を含んでなる診断キットに関する。

本発明のさらなる態様は、被験体におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を検出するための方法に関し、その方法は、
（ａ）前記被験体由来のサンプルと改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質とを接触させる工程、および
（ｂ）その生物学的サンプルにおいて、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質に結合する抗体の存在を検出する工程
を含んでなる。

本発明はまた、
（ａ）改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質（このタンパク質は、必要に応じて固体支持体上に固定化されている）、および
（ｂ）検出試薬
を含んでなる診断キットも提供する。

１つの実施形態において、本発明に係る改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質、ポリヌクレオチドまたは組成物を投与される被験体は、活動性結核（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによる活動性感染）を有し得る。第２の実施形態において、その被験体は、潜伏結核（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによる休眠感染）を有し得る。第３の実施形態において、その被験体は、結核を有しない（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによる感染を有しない）ことがある。

本発明に係る改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質、ポリヌクレオチドまたは組成物を投与される被験体は、以前に結核に対するワクチン接種（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの感染に対するワクチン接種）を受けたことがあってもよい（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）のワクチン接種を受けたことがあってもよい）。あるいは、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物を投与される被験体は、以前に結核に対するワクチン接種を受けたことがなくてもよい（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの感染に対するワクチン接種を受けたことがなくてもよい）（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）のワクチン接種を受けたことがなくてもよい）。

本発明に係る改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質、ポリヌクレオチドまたは組成物は、
−活動性結核を治療する、
−活動性結核を予防する（例えば、感染していない被験体、あるいは潜伏感染を有する被験体に投与することによって）、
−潜伏結核を治療する、
−潜伏結核を予防する、または
−結核の再活性化を予防するかもしくは遅延させる（例えば、数ヶ月間、数年間または無期限に、特にＴＢの再活性化を遅延させる）
という目的で提供され得る。

潜伏ＴＢを治療するための方法も提供され、その方法は、
（ｉ）ＴＢに潜伏感染していると被験体を識別する工程（例えば、ＰＰＤまたはＴ細胞ベースアッセイによって）、および
（ｉｉ）安全かつ有効な量の、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質または改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質をコードするポリヌクレオチドを（例えば、医薬組成物または免疫原性組成物の形態で）前記被験体に投与する工程
を含んでなる。

試験被験体におけるＴＢ（例えば、潜伏ＴＢ）を識別するための診断キットの製造における本発明のポリペプチドの使用も提供される。
本発明はまた、以下に関する。
[項目１]
Ｈ３７Ｒｖ配列の残基１３４〜１８３に対応するアミノ酸残基の疎水性が破壊されている、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目２]
薬剤として使用するための、項目１に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目３]
結核の再活性化を予防するための薬剤として使用するための、項目１または２のいずれかに記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目４]
結核の再活性化を遅延させるための薬剤として使用するための、項目１または２のいずれかに記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目５]
潜伏ＴＢを治療するための薬剤として使用するための、項目１または２のいずれかに記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目６]
潜伏ＴＢを予防するための薬剤として使用するための、項目１または２のいずれかに記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目７]
ＴＢを治療するための薬剤として使用するための、項目１または２のいずれかに記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目８]
ＴＢを予防するための薬剤として使用するための、項目１または２のいずれかに記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目９]
ＴＢを改善するための薬剤として使用するための、項目１または２のいずれかに記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目１０]
Ｈ３７Ｒｖ配列の残基１３５〜１５４に対応するアミノ酸残基の疎水性が破壊されている、項目１〜９のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目１１]
項目１〜１０のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質であって、該タンパク質は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含んでなり、該第１ポリペプチドは、該第２ポリペプチドに対してＮ末端側に位置しており、ここで、
（ｉ）該第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３４の中の少なくとも１００アミノ酸の連続した配列であり、かつ
（ｉｉ）該第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１５５〜３９２の中の少なくとも１７５アミノ酸の連続した配列であり、
ここで、該第１および第２ポリペプチドは、直接連結されているか、または第３ポリペプチドを介して間接的に連結されており、ここで、該第３ポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸が欠失している、配列番号１における残基１３５〜１５４に対応する、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目１２]
項目１〜１０のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質であって、該タンパク質は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含んでなり、該第１ポリペプチドは、該第２ポリペプチドに対してＮ末端側に位置しており、ここで、
（ｉ）該第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３４の中の少なくとも１００アミノ酸の連続した配列であり、かつ
（ｉｉ）該第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１５５〜３９２の中の少なくとも１７５アミノ酸の連続した配列であり、
ここで、該第１および第２ポリペプチドは、直接連結されているか、または第３ポリペプチドを介して間接的に連結されており、ここで、該第３ポリペプチドは、少なくとも３個の少なくとも連続した部分のアミノ酸が欠失している、配列番号１における残基１３５〜１５４に対応する、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目１３]
前記第１ポリペプチドが、配列番号１の残基１〜１３４の中の少なくとも１１０アミノ酸の連続した配列である、項目１１または１２のいずれかに記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目１４]
前記第２ポリペプチドが、配列番号１の残基１５５〜３９２の中の少なくとも２００アミノ酸の連続した配列である、項目１１〜１３のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目１５]
前記第２ポリペプチドが、配列番号１の残基１５５〜３９２の中の少なくとも２３５アミノ酸の連続した配列である、項目１４に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目１６]
ペプチド結合が直接的である、項目１１〜１５のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目１７]
ペプチド結合が間接的である、項目１１〜１５のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目１８]
前記第３ポリペプチドが、少なくとも４個のアミノ酸の少なくとも連続した部分が欠失している、配列番号１における残基１３５〜１５４に対応する、項目１７に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目１９]
項目１〜１０のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質であって、該タンパク質は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含んでなり、該第１ポリペプチドは、該第２ポリペプチドに対して該改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質のＣ末端側に位置し、ここで、
（ｉ）該第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３３に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、かつ
（ｉｉ）該第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１８４〜３９２に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、
ここで、該第１および第２ポリペプチドは、直接的または間接的に連結されている、
改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目２０]
前記第１ポリペプチドが、配列番号１の残基１〜１３３に対して少なくとも９５％の同一性を有する、項目１９に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目２１]
前記第１ポリペプチドが、配列番号１の残基１〜１３４に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項目１９に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目２２]
前記第１ポリペプチドが、配列番号１の残基１〜１３４に対して少なくとも９５％の同一性を有する、項目２１に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目２３]
前記第２ポリペプチドが、配列番号１の残基１８４〜３９２に対して少なくとも９５％の同一性を有する、項目１９〜２１のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目２４]
前記第２ポリペプチドが、配列番号１の残基１５５〜３９２に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項目１９〜２１のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目２５]
前記第２ポリペプチドが、配列番号１の残基１５５〜３９２に対して少なくとも９５％の同一性を有する、項目１９〜２１のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目２６]
前記第２ポリペプチドが、配列番号１の残基１５５〜３９２に対して少なくとも９９％の同一性を有する、項目１９〜２１のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目２７]
ペプチド結合が直接的である、項目１９〜２６のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目２８]
ペプチド結合が間接的である、項目１９〜２６のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目２９]
前記改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質が、完全長の配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含まない、項目１９〜２６のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目３０]
項目１〜１０のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質であって、該改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含んでなり、該第１ポリペプチドは、該第２ポリペプチドに対して該改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質のＣ末端側に位置し、ここで、
（ｉ）該第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３３の中の少なくとも１００アミノ酸の連続した配列であり、かつ
（ｉｉ）該第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１８４〜３９２の中の少なくとも１５５アミノ酸の連続した配列であり、
ここで、該第１および第２ポリペプチドは、直接的または間接的に連結されている、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目３１]
前記第１ポリペプチドが、配列番号１の残基１〜１３３の中の少なくとも１１０アミノ酸の連続した配列である、項目３０に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目３２]
前記第１ポリペプチドが、配列番号１の残基１〜１３４の中の少なくとも１００アミノ酸の連続した配列である、項目３０に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目３３]
前記第１ポリペプチドが、配列番号１の残基１〜１３４の中の少なくとも１１０アミノ酸の連続した配列である、項目３０に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目３４]
前記第２ポリペプチドが、配列番号１の残基１８４〜３９２の中の少なくとも１８０アミノ酸の連続した配列である、項目３０〜３３のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目３５]
前記第２ポリペプチドが、配列番号１の残基１５５〜３９２の中の少なくとも１７５アミノ酸の連続した配列である、項目３０〜３３のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目３６]
前記第２ポリペプチドが、配列番号１の残基１５５〜３９２の中の少なくとも２００アミノ酸の連続した配列である、項目３５に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目３７]
前記第２ポリペプチドが、配列番号１の残基１５５〜３９２の中の少なくとも２３５アミノ酸の連続した配列である、項目３６に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目３８]
ペプチド結合が直接的である、項目３０〜３７のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目３９]
ペプチド結合が間接的である、項目３０〜３７のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目４０]
前記改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質が、配列番号１の２５９アミノ酸を超える連続した配列を含まない、項目３０〜３９のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目４１]
前記タンパク質が、配列番号１における残基１３４〜１８３に対応する領域から少なくとも１つのアミノ酸が欠失しているＲｖ３６１６ｃ配列を含んでなる、項目１〜１０のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目４２]
前記タンパク質が、配列番号１における残基１３４〜１８３に対応する領域から少なくとも２個のアミノ酸が欠失しているＲｖ３６１６ｃ配列を含んでなる、項目４１に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目４３]
前記タンパク質が、配列番号１における残基１３５〜１５４に対応する領域から少なくとも１つのアミノ酸が欠失しているＲｖ３６１６ｃ配列を含んでなる、項目４１に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目４４]
前記タンパク質が、配列番号１における残基１３５〜１５４に対応する領域から少なくとも２個のアミノ酸が欠失しているＲｖ３６１６ｃ配列を含んでなる、項目４１に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目４５]
項目１〜１０のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質であって、該タンパク質は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含んでなり、該第１ポリペプチドは、該第２ポリペプチドに対してＮ末端側に位置しており、ここで、
（ｉｉｉ）該第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３３の中の少なくとも１００アミノ酸の連続した配列であり、かつ
（ｉｖ）該第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１８４〜３９２の中の少なくとも１５５アミノ酸の連続した配列であり、
ここで、該第１および第２ポリペプチドは、直接連結されているか、または第３ポリペプチドを介して間接的に連結されており、該第３ポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸が欠失している、配列番号１における残基１３４〜１８３に対応する、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目４６]
項目１〜１０のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質であって、該タンパク質は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含んでなり、該第１ポリペプチドは、該第２ポリペプチドに対してＮ末端側に位置しており、ここで、
（ｉ）該第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３３の中の少なくとも１００アミノ酸の連続した配列であり、かつ
（ｉｉ）該第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１８４〜３９２の中の少なくとも１５５アミノ酸の連続した配列であり、
ここで、該第１および第２ポリペプチドは、直接連結されているか、または第３ポリペプチドを介して間接的に連結されており、該第３ポリペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸の少なくとも連続した部分が欠失している、配列番号１における残基１３４〜１８３に対応する、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目４７]
前記第１ポリペプチドが、配列番号１の残基１〜１３３の中の少なくとも１１０アミノ酸の連続した配列である、項目４５または４６のいずれかに記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目４８]
前記第２ポリペプチドが、配列番号１の残基１８４〜３９２の中の少なくとも１８０アミノ酸の連続した配列である、項目４５〜４７のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目４９]
ペプチド結合が直接的である、項目４５〜４８のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目５０]
ペプチド結合が間接的である、項目４５〜４８のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目５１]
前記第３ポリペプチドが、少なくとも４個のアミノ酸の少なくとも連続した部分が欠失している、配列番号１における残基１３４〜１８３に対応する、項目５０に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目５２]
項目１〜１０のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質であって、該タンパク質は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含んでなり、該第１ポリペプチドは、該第２ポリペプチドに対してＮ末端側に位置しており、ここで、
（ｉｉｉ）該第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３４の中の少なくとも１００アミノ酸の連続した配列であり、かつ
（ｉｖ）該第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１５５〜３９２の中の少なくとも１７５アミノ酸の連続した配列であり、
ここで、該第１および第２ポリペプチドは、直接連結されているか、または第３ポリペプチドを介して間接的に連結されており、ここで、該第３ポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸が欠失している、配列番号１における残基１３５〜１５４に対応する、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目５３]
項目１〜１０のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質であって、該タンパク質は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含んでなり、該第１ポリペプチドは、該第２ポリペプチドに対してＮ末端側に位置しており、ここで、
（ｉｉｉ）該第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３４の中の少なくとも１００アミノ酸の連続した配列であり、かつ
（ｉｖ）該第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１５５〜３９２の中の少なくとも１７５アミノ酸の連続した配列であり、
ここで、該第１および第２ポリペプチドは、直接連結されているか、または第３ポリペプチドを介して間接的に連結されており、ここで、該第３ポリペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸の少なくとも連続した部分が欠失している、配列番号１における残基１３５〜１５４に対応する、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目５４]
前記第１ポリペプチドが、配列番号１の残基１〜１３４の中の少なくとも１１０アミノ酸の連続した配列である、項目５２または５３のいずれかに記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目５５]
前記第２ポリペプチドが、配列番号１の残基１５５〜３９２の中の少なくとも２００アミノ酸の連続した配列である、項目５２〜５４のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目５６]
前記第２ポリペプチドが、配列番号１の残基１５５〜３９２の中の少なくとも２３５アミノ酸の連続した配列である、項目５５に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目５７]
ペプチド結合が直接的である、項目５２〜５６のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目５８]
ペプチド結合が間接的である、項目５２〜５６のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目５９]
前記第３ポリペプチドが、少なくとも４個のアミノ酸の少なくとも連続した部分が欠失している、配列番号１における残基１３５〜１５４に対応する、項目５８に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目６０]
項目１〜１０のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質であって、該タンパク質は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含んでなり、該第１ポリペプチドは、該第２ポリペプチドに対してＮ末端側に位置しており、ここで、
（ｉ）該第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３３に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、かつ
（ｉｉ）該第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１８４〜３９２に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、
ここで、該第１および第２ポリペプチドは、直接連結されているか、または第３ポリペプチドを介して間接的に連結されており、該第３ポリペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸の連続した部分が欠失している、配列番号１における残基１３４〜１８３に対応する配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目６１]
前記第１ポリペプチドが、配列番号１の残基１〜１３３に対して少なくとも９５％の同一性を有する、項目６０に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目６２]
前記第１ポリペプチドが、配列番号１の残基１〜１３３に対して少なくとも９８％の同一性を有する、項目６１に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目６３]
前記第２ポリペプチドが、配列番号１の残基１８４〜３９２に対して少なくとも９５％の同一性を有する、項目６０〜６２のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目６４]
前記第２ポリペプチドが、配列番号１の残基１８４〜３９２に対して少なくとも９８％の同一性を有する、項目６３に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目６５]
ペプチド結合が直接的である、項目６０〜６４のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目６６]
ペプチド結合が間接的である、項目６０〜６４のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目６７]
前記第３ポリペプチドが、少なくとも３個のアミノ酸の連続した部分が欠失している、配列番号１における残基１３４〜１８３に対応する配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列である、項目６６に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目６８]
前記第３ポリペプチドが、少なくとも３個のアミノ酸の連続した部分が欠失している、配列番号１における残基１３４〜１８３に対応する配列に対して少なくとも９８％の同一性を有する配列である、項目６７または６８のいずれかに記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目６９]
配列番号１における１３４〜１８３に対応する残基から欠失される連続した部分が、少なくとも４個のアミノ酸である、項目６０〜６８のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目７０]
前記第３ポリペプチドが、４８アミノ酸長またはそれ以下である、項目６６〜６９のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目７１]
項目１〜１０のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質であって、該タンパク質は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含んでなり、該第１ポリペプチドは、該第２ポリペプチドに対してＮ末端側に位置しており、ここで、
（ｉ）該第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３４に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、かつ
（ｉｉ）該第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１５５〜３９２に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、
ここで、該第１および第２ポリペプチドは、直接連結されているか、または第３ポリペプチドを介して間接的に連結されており、該第３ポリペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸の連続した部分が欠失している、配列番号１における残基１３５〜１５４に対応する配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目７２]
前記第１ポリペプチドが、配列番号１の残基１〜１３４に対して少なくとも９５％の同一性を有する、項目７１に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目７３]
前記第１ポリペプチドが、配列番号１の残基１〜１３４に対して少なくとも９８％の同一性を有する、項目７２に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目７４]
前記第２ポリペプチドが、配列番号１の残基１５５〜３９２に対して少なくとも９５％の同一性を有する、項目７１〜７３のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目７５]
前記第２ポリペプチドが、配列番号１の残基１５５〜３９２に対して少なくとも９８％の同一性を有する、項目７４に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目７６]
前記第２ポリペプチドが、配列番号１の残基１５５〜３９２に対して少なくとも９９％の同一性を有する、項目７４に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目７７]
ペプチド結合が直接的である、項目７１〜７６のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目７８]
ペプチド結合が間接的である、項目７１〜７６のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目７９]
前記第３ポリペプチドが、少なくとも３個のアミノ酸の連続した部分が欠失している、配列番号１における残基１３５〜１５４に対応する配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列である、項目７８に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目８０]
前記第３ポリペプチドが、少なくとも３個のアミノ酸の連続した部分が欠失している、配列番号１における残基１３５〜１５４に対応する配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列である、項目７８または７９のいずれかに記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目８１]
配列番号１における１３４〜１８３に対応する残基から欠失される連続した部分が、少なくとも４個のアミノ酸である、項目７１〜８０のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目８２]
配列番号１における１３４〜１８３に対応する残基から欠失される連続した部分が、少なくとも５個のアミノ酸である、項目８１に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目８３]
前記第３ポリペプチドが、２０アミノ酸長またはそれ以下である、項目７８〜８２のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目８４]
前記タンパク質が、配列番号１における残基１３４〜１８３に対応する領域の少なくとも１つのアミノ酸が親水性残基で置換されているＲｖ３６１６ｃ配列を含んでなる、項目１〜１０のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目８５]
前記タンパク質が、配列番号１における残基１３４〜１８３に対応する領域の少なくとも３個のアミノ酸の連続した部分が親水性残基で置換されているＲｖ３６１６ｃ配列を含んでなる、項目８４に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目８６]
前記タンパク質が、配列番号１における残基１３５〜１５４に対応する領域の少なくとも１つのアミノ酸が親水性残基で置換されているＲｖ３６１６ｃ配列を含んでなる、項目１〜１０のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目８７]
前記タンパク質が、配列番号１における残基１３５〜１５４に対応する領域の少なくとも３個のアミノ酸の連続した部分が親水性残基で置換されているＲｖ３６１６ｃ配列を含んでなる、項目８６に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目８８]
前記タンパク質が、配列番号１における１３３〜１８４に対応する残基の間の位置に少なくとも１つの親水性アミノ酸残基が付加されているＲｖ３６１６ｃ配列を含んでなる、項目１〜１０のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目８９]
前記タンパク質が、配列番号１における１３４〜１８３に対応する残基の間の位置に少なくとも１つの親水性アミノ酸残基が付加されているＲｖ３６１６ｃ配列を含んでなる、項目８８に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目９０]
前記タンパク質が、配列番号１における１３４〜１５５に対応する残基の間の位置に少なくとも１つの親水性アミノ酸残基が付加されているＲｖ３６１６ｃ配列を含んでなる、項目８９に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目９１]
前記タンパク質が、配列番号１における１３５〜１５４に対応する残基の間の位置に少なくとも１つの親水性アミノ酸残基が付加されているＲｖ３６１６ｃ配列を含んでなる、項目９０に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目９２]
少なくとも２つの親水性アミノ酸残基が、明記された領域内に付加されている、項目８８〜９１のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目９３]
前記タンパク質が、５００アミノ酸残基長より短い、項目１〜９２のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目９４]
前記タンパク質が、４５０アミノ酸残基長より短い、項目９３に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目９５]
前記タンパク質が、４００アミノ酸残基長より短い、項目９４に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目９６]
配列番号１６１のアミノ酸配列を含んでなる、項目１〜９５のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目９７]
配列番号１６２のアミノ酸配列を含んでなる、項目１〜９５のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目９８]
配列番号１６３のアミノ酸配列を含んでなる、項目１〜９５のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目９９]
配列番号１６４のアミノ酸配列を含んでなる、項目１〜９５のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目１００]
配列番号１６５のアミノ酸配列を含んでなる、項目１〜９５のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目１０１]
配列番号１６６のアミノ酸配列を含んでなる、項目１〜９５のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目１０２]
配列番号１６７のアミノ酸配列を含んでなる、項目１〜９５のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目１０３]
配列番号１６８のアミノ酸配列を含んでなる、項目１〜９５のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目１０４]
配列番号１６９のアミノ酸配列を含んでなる、項目１〜９５のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目１０５]
配列番号１７９のアミノ酸配列を含んでなる、項目１〜９５のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目１０６]
配列番号１８０のアミノ酸配列を含んでなる、項目１〜９５のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目１０７]
前記結核が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染に関連する、項目１〜１０６のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目１０８]
前記改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質が、配列番号１６２の配列を含まない、項目１〜１０７のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質。
[項目１０９]
ＴＢの治療、改善または予防のための方法であって、有効量の項目１〜１０８のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を、それを必要とする被験体に投与することを含んでなり、ここで、前記ポリペプチドは、免疫応答を誘導する、方法。
[項目１１０]
ＴＢの治療、予防または改善のための薬剤の製造における項目１〜１０８のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質の使用。
[項目１１１]
項目１〜１０８のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質をコードする核酸配列を含んでなる、ポリヌクレオチド。
[項目１１２]
項目１〜１０８のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質をコードする核酸配列からなる、項目１１１に記載のポリヌクレオチド。
[項目１１３]
配列番号１６１〜１６９、１７９または１８０のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードする配列を含んでなる、項目１１１または１１２のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
[項目１１４]
配列番号１７０〜１７８のいずれか１つに記載の配列を含んでなる、項目１１３に記載のポリヌクレオチド。
[項目１１５]
薬剤として使用するための、項目１１１〜１１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[項目１１６]
ＴＢを治療するための薬剤として使用するための、項目１１１〜１１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[項目１１７]
ＴＢを予防するための薬剤として使用するための、項目１１１〜１１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[項目１１８]
ＴＢを改善するための薬剤として使用するための項目１１１〜１１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[項目１１９]
潜伏ＴＢを治療するための薬剤として使用するための、項目１１１〜１１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[項目１２０]
潜伏ＴＢを予防するための薬剤として使用するための、項目１１１〜１１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[項目１２１]
結核の再活性化を予防するための薬剤として使用するための、項目１１１〜１１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[項目１２２]
結核の再活性化を遅延させるための薬剤として使用するための、項目１１１〜１１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[項目１２３]
前記結核が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染に関連する、項目１１１〜１２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[項目１２４]
ＴＢの治療、改善または予防のための方法であって、有効量の項目１１１〜１１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを、それを必要とする被験体に投与することを含んでなり、ここで、前記ポリペプチドは、免疫応答を誘導する、方法。
[項目１２５]
ＴＢの治療、改善または予防のための薬剤の製造における項目１１１〜１１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの使用。
[項目１２６]
（ａ）項目１〜１０８のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質と、
（ｂ）薬学上許容される担体または賦形剤と
を含んでなる、医薬組成物。
[項目１２７]
（ａ）項目１１１〜１１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと、
（ｂ）薬学上許容される担体または賦形剤と
を含んでなる、医薬組成物。
[項目１２８]
（ａ）項目１〜１０８のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質と、
（ｂ）非特異的な免疫応答増強剤と
を含んでなる、免疫原性組成物。
[項目１２９]
（ａ）項目１１１〜１１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと、
（ｂ）非特異的な免疫応答増強剤と
を含んでなる、免疫原性組成物。
[項目１３０]
前記非特異的な免疫応答増強剤が、アジュバントである、項目１２８または１２９のいずれかに記載の免疫原性組成物。
[項目１３１]
項目１〜１０８のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質をコードする核酸配列を含んでなる、発現ベクター。
[項目１３２]
項目１３１の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
[項目１３３]
項目１〜１０８のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を組換え的に発現する宿主細胞。
[項目１３４]
項目１〜１０８のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を生成するための方法であって、宿主細胞内で前記ポリペプチドを組換え的に発現させることを含んでなる、方法。
[項目１３５]
前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、項目１３４に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を生成するための方法。
[項目１３６]
（ａ）項目１〜１０８のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質と、
（ｂ）該改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質と、個体由来のサンプル（例えば、全血またはより好適にはＰＢＭＣ）とを接触させるのに足りる装置と、
（ｃ）該サンプルのＴ細胞応答を定量する手段と
を含んでなる、診断キット。
[項目１３７]
（ａ）項目１〜１０８のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質と、
（ｂ）該改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質と患者の皮膚細胞とを接触させるのに足りる装置と
を含んでなる、診断キット。
[項目１３８]
被験体におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を検出するための方法であって、
（ａ）該被験体由来のサンプルと項目１〜１０８のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質とを接触させる工程と、
（ｂ）該生物学的サンプルにおいて、該改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質に結合する抗体の存在を検出する工程と
を含んでなる、方法。
[項目１３９]
前記改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質が、固体支持体上に固定化されている、項目１３８に記載の方法。
[項目１４０]
項目１〜１０８のいずれか一項に記載の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質と、追加の異種ポリペプチドとを含んでなる、融合タンパク質。
[項目１４１]
項目１４０に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[項目１４２]
ポリペプチドの形態である追加の異種抗原成分を含んでなる、項目１２６または１２７のいずれかに記載の医薬組成物。
[項目１４３]
ポリヌクレオチドの形態である追加の異種抗原成分を含んでなる、項目１２６または１２７のいずれかに記載の医薬組成物。
[項目１４４]
ポリペプチドの形態である追加の異種抗原成分を含んでなる、項目１２８または１２９のいずれかに記載の免疫原性組成物。
[項目１４５]
ポリヌクレオチドの形態である追加の異種抗原成分を含んでなる、項目１２８または１２９のいずれかに記載の医薬組成物。
[項目１４６]
化学療法剤と併用して使用するための、項目１〜１０８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項目１４７]
化学療法剤と併用して使用するための、項目１１１〜１２３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

完全長配列とのＲｖ３６１６ｃペプチドのアラインメント。 Ｒｖ３６１６ｃペプチドに対するＰＢＭＣの応答。 ２１日目（すなわち、２回目の免疫の７日後）にＩＦＮ−ガンマおよび／またはＩＬ−２および／またはＴＮＦ−アルファサイトカインを発現している、免疫されたＣＢ６Ｆ１マウス由来のＣＤ４およびＣＤ８細胞のパーセンテージ。 免疫されたＣＢ６Ｆ１マウスにおける抗原特異的ＣＤ４応答の２１日目（すなわち、２回目の免疫の７日後）のサイトカインプロファイル。 免疫されたＣＢ６Ｆ１マウスにおける抗原特異的ＣＤ８応答の２１日目（すなわち、２回目の免疫の７日後）のサイトカインプロファイル。 ３５日目（すなわち、３回目の免疫の７日後）にＩＦＮ−ガンマおよび／またはＩＬ−２および／またはＴＮＦ−アルファサイトカインを発現している、免疫されたＣＢ６Ｆ１マウス由来のＣＤ４およびＣＤ８細胞のパーセンテージ。 免疫されたＣＢ６Ｆ１マウスにおける抗原特異的ＣＤ４応答の３５日目（すなわち、３回目の免疫の７日後）のサイトカインプロファイル。 免疫されたＣＢ６Ｆ１マウスにおける抗原特異的ＣＤ８応答の３５日目（すなわち、３回目の免疫の７日後）のサイトカインプロファイル。 ２１日目（すなわち、２回目の免疫の７日後）にＩＦＮ−ガンマおよび／またはＩＬ−２および／またはＴＮＦ−アルファサイトカインを発現している、免疫されたＣ５７ＢＬ／６マウス由来のＣＤ４およびＣＤ８細胞のパーセンテージ。 免疫されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける抗原特異的ＣＤ４応答の２１日目（すなわち、２回目の免疫の７日後）のサイトカインプロファイル。 ３５日目（すなわち、３回目の免疫の７日後）にＩＦＮ−ガンマおよび／またはＩＬ−２および／またはＴＮＦ−アルファサイトカインを発現している、免疫されたＣ５７ＢＬ／６マウス由来のＣＤ４およびＣＤ８細胞のパーセンテージ。 免疫されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける抗原特異的ＣＤ４応答の３５日目（すなわち、３回目の免疫の７日後）のサイトカインプロファイル。 免疫されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける抗原特異的ＣＤ８応答の３５日目（すなわち、３回目の免疫の７日後）のサイトカインプロファイル。 ナイーブなヒトおよび潜伏感染したヒトにおける抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答。 野生型Ｒｖ３６１６ｃタンパク質配列のアラインメント。 例示的な改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質配列のアラインメント。 例示的な改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質配列のアラインメント。 最初の抗原発現実験のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果。 さらなる抗原発現実験のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果。 追加の抗原発現実験のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果。 Ｒｖ３６１６Δ１３８−１４５による２回目の免疫の７日後および３回目の免疫の７日後にＩＦＮ−ガンマおよび／またはＩＬ−２および／またはＴＮＦ−アルファサイトカインを発現している、免疫されたマウス由来のＣＤ４細胞のパーセンテージ。 Ｒｖ３６１６Δ１３８−１４５による２回目の免疫の７日後のＲｖ３６１６特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答のサイトカインプロファイル。 Ｒｖ３６１６Δ１３８−１４５による３回目の免疫の７日後のＲｖ３６１６特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答のサイトカインプロファイル 。 Ｒｖ３６１６Δ１３８−１４５による２回目の免疫の７日後および３回目の免疫の７日後にＩＦＮ−ガンマおよび／またはＩＬ−２および／またはＴＮＦ−アルファサイトカインを発現している、免疫されたマウス由来のＣＤ８細胞のパーセンテージ。 Ｒｖ３６１６Δ１３８−１４５による２回目の免疫の７日後のＲｖ３６１６特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答のサイトカインプロファイル。 Ｒｖ３６１６Δ１３８−１４５による３回目の免疫の７日後のＲｖ３６１６特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答のサイトカインプロファイル。

列挙される配列の説明
配列番号１：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ株由来のＲｖ３６１６ｃのポリペプチド配列。

配列番号２：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ株由来のＲｖ３６１６ｃのポリヌクレオチド配列。

配列番号３：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＣＤＣ１５５１株由来のＲｖ３６１６ｃのポリペプチド配列。

配列番号４：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｆ１１株由来のＲｖ３６１６ｃのポリペプチド配列。

配列番号５：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈａａｒｌｅｍ Ａ株由来のＲｖ３６１６ｃのポリペプチド配列。

配列番号６：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｃ株由来のＲｖ３６１６ｃのポリペプチド配列。

配列番号７：ＢＣＧ由来のＲｖ３６１６ｃのポリペプチド配列。

配列番号８：Ｍｔｂ８．４のポリペプチド配列。

配列番号９：Ｍｔｂ９．８のポリペプチド配列。

配列番号１０：Ｍｔｂ９．９のポリペプチド配列。

配列番号１１：Ｒａ１２のポリペプチド配列。

配列番号１２：Ｒａ３５のポリペプチド配列。

配列番号１３：ＴｂＨ９のポリペプチド配列。

配列番号１４：Ｍｔｂ４１のポリペプチド配列。

配列番号１５：ＥＳＡＴ−６のポリペプチド配列。

配列番号１６：Ａｇ８５Ａのポリペプチド配列。

配列番号１７：Ａｇ８５Ｂのポリペプチド配列。

配列番号１８：アルファ−クリスタリンのポリペプチド配列。

配列番号１９：ＭＰＴ６４のポリペプチド配列。

配列番号２０：Ｍｔｂ３２Ａのポリペプチド配列。

配列番号２１：Ｓｅｒ／Ａｌａ変異成熟Ｍｔｂ３２Ａのポリペプチド配列。

配列番号２２：ＴＢ１０．４のポリペプチド配列。

配列番号２３：Ｍｔｂ７２ｆのポリペプチド配列。

配列番号２４：Ｍ７２のポリペプチド配列。

配列番号２５：Ｍｔｂ７１ｆのポリペプチド配列。

配列番号２６：Ｍ９２融合物のポリペプチド配列。

配列番号２７：Ｍ１０３融合物のポリペプチド配列。

配列番号２８：Ｍ１１４融合物のポリペプチド配列。

配列番号２９：推定ヒトＣＤ４細胞エピトープ１。

配列番号３０：推定ヒトＣＤ４細胞エピトープ２。

配列番号３１：推定ヒトＣＤ４細胞エピトープ３。

配列番号３２：推定ヒトＣＤ４細胞エピトープ４。

配列番号３３：推定ヒトＣＤ４細胞エピトープ５。

配列番号３４：推定ヒトＣＤ４細胞エピトープ６。

配列番号３５：推定ヒトＣＤ４細胞エピトープ７。

配列番号３６：推定ヒトＣＤ４細胞エピトープ８。

配列番号３７：推定ヒトＣＤ４細胞エピトープ９。

配列番号３８：推定ヒトＣＤ４細胞エピトープ１０。

配列番号３９：推定ヒトＣＤ４細胞エピトープ１１。

配列番号４０：推定ヒトＣＤ４細胞エピトープ１２。

配列番号４１：推定ヒトＣＤ４細胞エピトープ１３。

配列番号４２：推定ヒトＣＤ４細胞エピトープ１４。

配列番号４３：推定ヒトＣＤ４細胞エピトープ１５。

配列番号４４：推定ヒトＣＤ４細胞エピトープ１６。

配列番号４５：推定ヒトＣＤ４細胞エピトープ１７。

配列番号４６：推定ヒトＣＤ４細胞エピトープ１８。

配列番号４７：推定ヒトＣＤ４細胞エピトープ１９。

配列番号４８：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ１。

配列番号４９：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ２。

配列番号５０：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ３。

配列番号５１：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ４。

配列番号５２：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ５。

配列番号５３：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ６。

配列番号５４：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ７。

配列番号５５：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ８。

配列番号５６：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ９。

配列番号５７：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ１０。

配列番号５８：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ１１。

配列番号５９：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ１２。

配列番号６０：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ１３。

配列番号６１：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ１４。

配列番号６２：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ１５。

配列番号６３：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ１６。

配列番号６４：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ１７。

配列番号６５：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ１８。

配列番号６６：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ１９。

配列番号６７：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ２０。

配列番号６８：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ２１。

配列番号６９：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ２２。

配列番号７０：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ２３。

配列番号７１：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ２４。

配列番号７２：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ２５。

配列番号７３：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ２６。

配列番号７４：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ２７。

配列番号７５：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ２８。

配列番号７６：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ２９。

配列番号７７：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ３０。

配列番号７８：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ３１。

配列番号７９：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ３２。

配列番号８０：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ３３。

配列番号８１：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ３４。

配列番号８２：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ３５。

配列番号８３：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ３６。

配列番号８４：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ３７。

配列番号８５：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ３８。

配列番号８６：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ３９。

配列番号８７：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ４０。

配列番号８８：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ４１。

配列番号８９：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ４２。

配列番号９０：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ４３。

配列番号９１：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ４４。

配列番号９２：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ４５。

配列番号９３：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ４６。

配列番号９４：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ４７。

配列番号９５：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ４８。

配列番号９６：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ４９。

配列番号９７：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ５０。

配列番号９８：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ５１。

配列番号９９：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ５２。

配列番号１００：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ５３。

配列番号１０１：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ５４。

配列番号１０２：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ５５。

配列番号１０３：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ５６。

配列番号１０４：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ５７。

配列番号１０５：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ５８。

配列番号１０６：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ５９。

配列番号１０７：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ６０。

配列番号１０８：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ６１。

配列番号１０９：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ６２。

配列番号１１０：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ６３。

配列番号１１１：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ６４。

配列番号１１２：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ６５。

配列番号１１３：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ６６。

配列番号１１４：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ６７。

配列番号１１５：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ６８。

配列番号１１６：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ６９。

配列番号１１７：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ７０。

配列番号１１８：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ７１。

配列番号１１９：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ７２。

配列番号１２０：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ７３。

配列番号１２１：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ７４。

配列番号１２２：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ７５。

配列番号１２３：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ７６。

配列番号１２４：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ７７。

配列番号１２５：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ７８。

配列番号１２６：推定ヒトＣＤ８細胞エピトープ７９。

配列番号１２７：ペプチド１。

配列番号１２８：ペプチド２。

配列番号１２９：ペプチド３。

配列番号１３０：ペプチド４。

配列番号１３１：ペプチド５。

配列番号１３２：ペプチド６。

配列番号１３３：ペプチド７。

配列番号１３４：ペプチド８。

配列番号１３５：ペプチド９。

配列番号１３６：ペプチド１０。

配列番号１３７：ペプチド１１。

配列番号１３８：ペプチド１２。

配列番号１３９：ペプチド１３。

配列番号１４０：ペプチド１４。

配列番号１４１：ペプチド１５。

配列番号１４２：ペプチド１６。

配列番号１４３：ペプチド１７。

配列番号１４４：ペプチド１８。

配列番号１４５：ペプチド１９。

配列番号１４６：ペプチド２０。

配列番号１４７：ペプチド２１。

配列番号１４８：ペプチド２２。

配列番号１４９：ペプチド２３。

配列番号１５０：ペプチド２４。

配列番号１５１：ペプチド２５。

配列番号１５２：ペプチド２６。

配列番号１５３：ペプチド２７。

配列番号１５４：ペプチド２８。

配列番号１５５：ペプチド２９。

配列番号１５６：ペプチド３０。

配列番号１５７：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ株由来のＲｖ１７５３ｃのポリペプチド配列。

配列番号１５８：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ株由来のＲｖ２３８６ｃのポリペプチド配列。

配列番号１５９：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ株由来のＲｖ２７０７ｃのポリペプチド配列。

配列番号１６０：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ株由来のＲｖ３６１６ｃに対する、Ｅ．ｃｏｌｉコドンに最適化されたポリヌクレオチド配列。

配列番号１６１：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ株由来のＲｖ３６１６ｃΔ１３６−１８３のポリペプチド配列。

配列番号１６２：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ株由来のＲｖ３６１６ｃΔ１５０−１６０のポリペプチド配列。

配列番号１６３：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ株由来のＲｖ３６１６ｃΔ１３６−１５４のポリペプチド配列。

配列番号１６４：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ株由来のＲｖ３６１６ｃΔ１６６−１８２のポリペプチド配列。

配列番号１６５：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ株由来のＲｖ３６１６ｃΔ１３５−１３９のポリペプチド配列。

配列番号１６６：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ株由来のＲｖ３６１６ｃΔ１４２−１４５のポリペプチド配列。

配列番号１６７：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ株由来のＲｖ３６１６ｃΔ１３８−１４５のポリペプチド配列。

配列番号１６８：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ株由来のＲｖ３６１６ｃΔ１４５−１５２のポリペプチド配列。

配列番号１６９：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ株由来のＲｖ３６１６ｃΔ１４９−１５４のポリペプチド配列。

配列番号１７０：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ株由来のＲｖ３６１６ｃΔ１３６−１８３をコードする、Ｅ．ｃｏｌｉコドンに最適化されたポリヌクレオチド配列。

配列番号１７１：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ株由来のＲｖ３６１６ｃΔ１５０−１６０をコードする、Ｅ．ｃｏｌｉコドンに最適化されたポリヌクレオチド配列。

配列番号１７２：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ株由来のＲｖ３６１６ｃΔ１３６−１５４をコードする、Ｅ．ｃｏｌｉコドンに最適化されたポリヌクレオチド配列。

配列番号１７３：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ株由来のＲｖ３６１６ｃΔ１６６−１８２をコードする、Ｅ．ｃｏｌｉコドンに最適化されたポリヌクレオチド配列。

配列番号１７４：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ株由来のＲｖ３６１６ｃΔ１３５−１３９をコードする、Ｅ．ｃｏｌｉコドンに最適化されたポリヌクレオチド配列。

配列番号１７５：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ株由来のＲｖ３６１６ｃΔ１４２−１４５をコードする、Ｅ．ｃｏｌｉコドンに最適化されたポリヌクレオチド配列。

配列番号１７６：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ株由来のＲｖ３６１６ｃΔ１３８−１４５をコードする、Ｅ．ｃｏｌｉコドンに最適化されたポリヌクレオチド配列。

配列番号１７７：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ株由来のＲｖ３６１６ｃΔ１４５−１５２をコードする、Ｅ．ｃｏｌｉコドンに最適化されたポリヌクレオチド配列。

配列番号１７８：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ株由来のＲｖ３６１６ｃΔ１４９−１５４をコードする、Ｅ．ｃｏｌｉコドンに最適化されたポリヌクレオチド配列。

配列番号１７９：Ｃｙｓ１３８の欠失を含む、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ株由来の残基１３７〜１３９付近での分断および再配列に基づく改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質のポリペプチド配列。

配列番号１８０：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ株由来の残基１５２〜１５３付近での分断および再配列に基づく改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質のポリペプチド配列。

詳細な説明
本発明は、概して、マイコバクテリアの潜伏感染の分野における、改変されたＲｖ３６１６ｃポリペプチドまたはそれらをコードするポリヌクレオチドの使用に関する。さらに、本発明は、特定の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質に関する。本発明者らは、驚いたことに、Ｒｖ３６１６ｃタンパク質配列の特定の領域の疎水性を破壊することにより、免疫原性特性に対して実質的な有害な影響なしに発現を改善することができることを発見した。その改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、ＴＢ抗原、特に潜伏ＴＢ抗原として有用である。

Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染の初期に強く発現されるタンパク質のいくつかは、動物ワクチン接種モデルにおいて、強い防御効果を提供すると示されている。しかしながら、感染の初期に高度に発現される抗原によるワクチン接種は、感染後期に対処するためには最適な免疫応答を提供しない可能性がある。潜伏感染中の適切な制御には、その時点において発現されている特定の抗原に特異的なＴ細胞が必要とされ得る。

休眠状態の持続性細菌を直接標的にする曝露後ワクチンは、ＴＢ再活性化の予防を助けることがあり、それにより、ＴＢの制御が増強されるか、または感染のクリアランスさえも可能になる。ゆえに、潜伏ＴＢを標的にするワクチンは、世界的なＴＢの感染率を有意かつ経済的に低下させることができるだろう。

後期抗原に基づくサブユニットワクチンもまた、多段階ワクチン（ｍｕｌｔｉｐｈａｓｅ ｖａｃｃｉｎｅ）を提供するために初期抗原と併用して利用することができるだろう。あるいは、後期抗原を使用することにより、ＢＣＧワクチン接種を補完および改善することができるだろう（ＢＣＧ応答をブーストすることによって、または進歩した組換えＢＣＧ株を開発することによって）。

マクロファージは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ免疫の主要な作動体として作用すると示されているが、Ｔ細胞は、そのような免疫の主な誘導物質である。結核からの防御におけるＴ細胞の本質的な役割は、ヒト免疫不全ウイルス感染個体における、それに関連するＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇が原因のＴＢ再活性化の速度の上昇によって説明される。さらに、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する一次免疫応答のピーク時に採取されたＣＤ４＋Ｔ細胞の養子移入により、Ｔ細胞欠損マウスにおいてＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓからの防御がもたらされると示された（Ｏｒｍｅ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８３ １５８：７４−８３）。

Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ反応性のＣＤ４＋Ｔ細胞は、γ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）の強力な産生者であると示されており、そしてそのＩＦＮ−γは、マウスにおいてマクロファージの抗マイコバクテリア作用の引き金を引くと示されている（Ｆｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９３ １７８：２２４９−２２５４）。ヒトでのＩＦＮ−γの役割はそれほど明らかではないが、研究によって、１，２５−ジヒドロキシ−ビタミンＤ３が、単独でまたはＩＦＮ−γもしくは腫瘍壊死因子−アルファとともに、ヒトマクロファージを活性化してＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を阻害することが示された。さらに、ＩＦＮ−γは、ヒトマクロファージを刺激して１，２５−ジヒドロキシ−ビタミンＤ３を生成すると知られている。同様に、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染に対する抵抗性の刺激に関わると示されている。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染の免疫学の概説については、Ｃｈａｎ ＆ Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ：Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｂｌｏｏｍ ｅｄ．，１９９４）、Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（２ｎｄ ｅｄ．，Ｒｏｍ ａｎｄ Ｇａｒａｙ，ｅｄｓ．，２００３）およびＨａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｃｈａｐｔｅｒ １５０，ｐｐ．９５３−９６６（１６ｔｈ ｅｄ．，Ｂｒａｕｎｗａｌｄ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，２００５）を参照のこと。

ＴＢの潜伏感染の診断は、通常、精製ツベルクリンタンパク質誘導体（ＰＰＤ）に対する皮内曝露を含むツベルクリン皮膚試験を用いて行われる。抗原特異的Ｔ細胞応答によって、注射の４８〜７２時間後までにその注射部位にマイコバクテリア抗原への曝露を示唆する測定可能な硬化がもたらされる。しかしながら、この試験では感度および特異性が問題であり、ＢＣＧワクチン接種された個体が、必ずしも容易に感染個体と識別することができるとは限らない（これは、ＢＣＧが潜伏感染を防御しないという事実に鑑みて特に重要である）。一般に、ＢＣＧを受けたことがあるがＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに感染していない個体は、１０ｍｍ未満の直径のＰＰＤ反応を示すのに対して、１０ｍｍを超える直径のＰＰＤ反応を有する個体は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに感染したことがあると考えられる。しかしながら、この法則は、１０ｍｍ未満の直径のＰＰＤ反応をもたらし得る、ＨＩＶ感染が原因で免疫抑制されている個体、または非結核マイコバクテリアに感染している個体が１０ｍｍを超える直径のＰＰＤ反応を示し得る蔓延国（ｅｎｄｅｍｉｃ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ）の個体には適用できない。

近年、インターフェロン−ガンマ放出に基づき、かつＰＰＤよりもＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対して特異的な抗原、すなわちＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０を使用する、インビトロＴ細胞ベースアッセイの開発に進歩が見られる。これらの特異性の高い試験は、ツベルクリン皮膚試験と少なくとも同程度の感度を有するとみられ、また、この試験では、ＢＣＧワクチン接種に起因する交差反応性がより低い。潜伏ＴＢの診断に関する最近の概説については、Ｐａｉ Ｍ ｅｔ ａｌ Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．２００６ ６（３）：４１３−４２２を参照のこと。しかしながら、ＥＳＡＴ−６／ＣＦＰ−１０は、初期抗原であるので、ＥＳＡＴ−６／ＣＦＰ−１０に基づくアッセイは、最近感染した個体にしか最適に行われない可能性がある。その結果として、潜伏結核と特異的に関連する抗原を同定すれば、長期間の潜伏感染を確実に検出できるであろうより高感度のアッセイの開発が促進され得る。

結核の治療および予防のため、特に、潜伏ＴＢの治療および予防のため、ならびにＴＢ再活性化の予防のために有効なストラテジーがなおも必要とされている。

最近、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓゲノムのホールゲノムのバイオインフォマティクス解析（Ｚｖｉ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２００８ １：１８）、ならびに活動性感染個体と潜伏感染個体とにおいて差次的に発現されるタンパク質の試験（Ｓｃｈｕｃｋ ＳＤ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２００９ ４（５）：ｅ５５９０）に基づいて、一連のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓワクチン候補が提案された。

Ｍｔｂ４０、ＨＴＣＣ１およびＥｓｐＡとしても知られるＲｖ３６１６ｃは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＥＳＸ−１の分泌系に関与する（Ｗｏｏｄｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２００８ ７６（９）：４１９９−４２０５）。Ｒｖ３６１６ｃは、以前に、結核に関連する免疫応答に関係づけられている（例えば、ＷＯ９８／５３０７５を参照のこと）。Ａｌ−Ａｔｔｉｙａｈ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４ １３８：１３９−１４４では、Ｒｖ３６１６ｃが、肺結核患者によって十分に認識されること（ＰＭＢＣの増殖およびＩＦＮ−ガンマの産生によって）が示されている。Ｍｕｓｔａｆａ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２００６ ７４（８）：４５６６−４５７２では、Ｍ．ｂｏｖｉｓに感染し、かつＢＣＧワクチン接種されたウシによるＲｖ３６１６ｃの認識が調べられた。

ＷＯ２０１０／０１０１７７として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５９５８０には、潜伏段階のＴＢ感染に関連する抗原としてのＲｖ３６１６ｃの同定が記載されている。

国際特許出願ＷＯ２０１０／１２１６１８は、ＥｓｐＡ（すなわち、Ｒｖ３６１６ｃ）を含むワクチンなどの免疫学的組成物のための、構成的に発現されるタンパク質およびそれらをコードする遺伝子の使用を提案している。

望ましくは、それらの野生型配列を有するワクチン抗原が生成される（それにより、そのワクチンによって誘発される免疫学的応答が、病原体による感染に対抗するために必要とされる免疫学的応答に厳密に対応することが確実になる）。それにもかかわらず、抗原の効率的な生成は、ワクチン製造に関連するコストを減少させる際の重要な要素である。その結果として、都合よく高レベルで発現されるが免疫原性に対する任意の有害な影響を回避する改変された抗原が、実質的な利益をもたらすことができるだろう。本発明は、この問題および他の問題に応える改変されたＲｖ３６１６ｃ抗原を提供しようとしている。

理論に限定されるものではないが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ株のＲｖ３６１６ｃのアミノ酸残基１３４〜１８３は、潜在的な膜貫通領域、低複雑領域およびコイルドコイルに対応すると考えられる。これらの構造エレメントのうちの１つ、２つまたは３つすべての破壊によって、その結果生じる改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質配列を、改善されたレベルで発現させることが可能になる。

その結果として、最も広範な態様において、本発明は、Ｈ３７Ｒｖ配列の残基１３４〜１８３に対応するアミノ酸残基の疎水性が破壊されている改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質、好適には、Ｈ３７Ｒｖ配列の残基１３５〜１５４に対応するアミノ酸残基の疎水性が破壊されている改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を提供する。

用語「疎水性を破壊する」とは、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質配列がより効率的に発現され得るように十分に低い疎水性をもたらす配列の改変のことを意味する。

望ましくは、野生型配列に対する改変の程度は、免疫原性に対する任意の決定的な（ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｎｔａｌ）影響の可能性を低下させるために、最小限に抑えられるべきである。

本明細書中で使用されるとき、「直接的なペプチド結合」は、２つのペプチドが介在性アミノ酸配列なしにペプチド結合を介して互いに直接連結されるペプチド結合である。「間接的なペプチド結合」は、２つのペプチドがペプチド結合を介して第３の介在性ペプチドに連結されるペプチド結合である。

本発明に照らして、疎水性を破壊するための主なアプローチは４つ存在する（すなわち、疎水性残基の分断、疎水性残基の削除、親水性残基による疎水性残基の置換、および親水性残基の付加）。当業者は、そのようなアプローチの組み合わせもまた利用され得ることを認識するだろう。しかしながら、先に述べたように、配列の改変の程度は、理想的には、免疫原性に対する不必要な有害な影響を回避するために最小にされるべきである。

疎水性残基の分断は、配列番号１の残基１３３〜１８４に対応するアミノ酸の位置でＲｖ３６１６ｃタンパク質配列をＮ末端フラグメントとＣ末端フラグメントとに分割した後、Ｎ末端フラグメントが改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質のＣ末端領域に位置し、かつＣ末端フラグメントが改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質のＮ末端領域に位置するように、それらの部分を再配列することによって、行われ得る。

本発明の１つの態様では、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質が提供され、前記改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含んでなり、その第１ポリペプチドは、第２ポリペプチドに対して、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質のＣ末端側に位置し、ここで、
（ｉ）第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３３に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、かつ
（ｉｉ）第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１８４〜３９２に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、
ここで、その第１および第２ポリペプチドは、直接的または間接的に連結されている。

いくつかの実施形態において、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドから本質的になるか、あるいはそれらからなり、その第１ポリペプチドは、第２ポリペプチドに対して、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質のＣ末端側に位置し、ここで、
（ｉ）第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３３に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、かつ
（ｉｉ）第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１８４〜３９２に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、
ここで、その第１および第２ポリペプチドは、直接的または間接的に連結されている。

第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３３に対して少なくとも９５％の同一性（例えば、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％もの同一性）を有する配列であり得る。

第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１８４〜３９２に対して少なくとも９５％の同一性（例えば、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性）を有する配列であり得る。

好適には、第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３４に対して少なくとも９０％の同一性、特に、少なくとも９５％の同一性（例えば、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％もの同一性）を有する配列であり得る。

好適には、第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１５５〜３９２に対して少なくとも９０％の同一性、特に、少なくとも９５％の同一性（例えば、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％もの同一性）を有する配列であり得る。

好適には、第１の態様の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、完全長の配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含まない。好適には、第１の態様の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、５００アミノ酸長未満（例えば、４５０アミノ酸長未満、特に、４００アミノ酸長未満）である。

ペプチド結合は、直接的であり得る。あるいは、ペプチド結合は、間接的であり得る。

本発明の第２の態様では、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質が提供され、前記改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含んでなり、その第１ポリペプチドは、第２ポリペプチドに対して、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質のＣ末端側に位置し、ここで、
（ｉｉｉ）第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３３の中の少なくとも１００アミノ酸の連続した配列であり、かつ
（ｉｖ）第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１８４〜３９２の中の少なくとも１５５アミノ酸の連続した配列であり、
ここで、その第１および第２ポリペプチドは、直接的または間接的に連結されている。

いくつかの実施形態において、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドから本質的になるか、あるいはそれらからなり、その第１ポリペプチドは、第２ポリペプチドに対して、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質のＣ末端側に位置し、ここで、
（ｉ）第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３３の中の少なくとも１００アミノ酸の連続した配列であり、かつ
（ｉｉ）第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１８４〜３９２の中の少なくとも１５５アミノ酸の連続した配列であり、
ここで、その第１および第２ポリペプチドは、直接的または間接的に連結されている。

第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３３の中の少なくとも１１０アミノ酸の連続した配列（例えば、少なくとも１２０アミノ酸または少なくとも１３０アミノ酸、例えば、残基１〜１３３）であり得る。

第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１８４〜３９２の中の少なくとも１８０アミノ酸の連続した配列（例えば、少なくとも１９０アミノ酸または少なくとも２００アミノ酸、例えば、残基１８４〜３９２）であり得る。

好適には、第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３４の中の少なくとも１００アミノ酸の連続した配列、特に、少なくとも１１０アミノ酸（例えば、少なくとも１２０アミノ酸または少なくとも１３０アミノ酸、例えば、残基１〜１３４）であり得る。

好適には、第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１５５〜３９２の中の少なくとも１７５アミノ酸の連続した配列、特に、少なくとも２００アミノ酸（例えば、少なくとも２１０アミノ酸または少なくとも２２０アミノ酸、例えば、残基１５５〜３９２）であり得る。第２ポリペプチドが配列番号１の残基１５５〜３９２の中の少なくとも２３５アミノ酸の連続した配列である実施形態もまた興味深い。

好適には、第２の態様の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、配列番号１の２５９アミノ酸超連続した配列を含まない。あるいは、第２の態様の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、２５７アミノ酸超連続した配列、２５５アミノ酸超連続した配列または２５３アミノ酸超連続した配列を含まない。好適には、第２の態様の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、５００アミノ酸長未満（例えば、４５０アミノ酸長未満、特に、４００アミノ酸長未満）である。

ペプチド結合は、直接的または間接的な結合であり得る。

第１および第２の態様の例としては、第１および第２ポリペプチドが、配列番号１における残基１３５〜１５４（例えば、残基１３８〜１３９または１５２〜１５３、例えば、残基１３８〜１３９または１５２〜１５３）に対応するアミノ酸の位置におけるＲｖ３６１６ｃ配列の分割から生じるＮ末端およびＣ末端フラグメントに対応し、ペプチド結合が直接的である、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質が挙げられる。好適には、その第１および第２ポリペプチドが再配列されるとき、開始メチオニンが、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質のＮ末端に残る。例えば、このタイプの再配列を例示している配列番号１７９および１８０を参照のこと。

疎水性残基の削除は、配列番号１の残基１３４〜１８３に対応する少なくとも１つのアミノ酸の除去によって行われ得る。削除される残基は、連続していないことがあり、かつ／または連続していることがある。

好適には、疎水性残基の削除は、配列番号１の残基１３４〜１８３に対応する少なくとも２つのアミノ酸の除去によって行われ得る。疎水性残基の削除は、配列番号１の残基１３４〜１８３に対応する少なくとも３つのアミノ酸の除去によっても行われ得る。

削除される残基は、連続していないことがあり、かつ／または連続していることがある。

野生型Ｒｖ３６１６ｃ配列は、１３８位にＣｙｓ残基を含むことを指摘しておいてもよいだろう。好適には、このＣｙｓ残基は、削除されるかまたは置換される（例えば、Ｃ１３８Ｑ）。

本発明の第３の態様では、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質が提供され、前記タンパク質は、配列番号１における残基１３４〜１８３に対応する領域から少なくとも１つのアミノ酸（例えば、少なくとも２つ）が欠失しているＲｖ３６１６ｃ配列を含んでなるか、あるいは、その配列から本質的になるかまたはその配列からなる。

改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、配列番号１における残基１３４〜１８３に対応する領域から少なくとも３個のアミノ酸（例えば、少なくとも４個）の連続した部分が欠失しているＲｖ３６１６ｃ配列を含んでなり得るか、あるいは、その配列から本質的になり得るかまたはその配列からなり得る。

配列番号１における残基１３５〜１５４に対応する領域から少なくとも１つのアミノ酸（例えば、少なくとも２つ）が欠失しているＲｖ３６１６ｃ配列を含んでなる改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質が特に興味深い。他の興味深い配列は、配列番号１における残基１３５〜１５４に対応する領域から少なくとも３個のアミノ酸（例えば、少なくとも４個）の連続した部分が欠失しているＲｖ３６１６ｃ配列を含んでなる改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質である。

削除される連続した部分は、少なくとも５アミノ酸（例えば、５〜３０、例えば、５〜２０または５〜１５）、特に、少なくとも６アミノ酸（例えば、６〜３０、例えば、６〜２０または６〜１５）、特に、少なくとも７アミノ酸（例えば、７〜３０、例えば、７〜２０または７〜１５）、例えば、少なくとも８アミノ酸（例えば、８〜３０、例えば、８〜２０または８〜１５）または少なくとも１０アミノ酸（例えば、１０〜３０、例えば、１０〜２０または１０〜１５）であり得る。

ある特定の実施形態において、削除される連続した部分は、
−４アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１４２〜１４５に対応するアミノ酸）、
−５アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１３５〜１３９に対応するアミノ酸）、
−６アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１４９〜１５４に対応するアミノ酸）、
−８アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１３８〜１４５または配列番号１における残基１４５〜１５２に対応するアミノ酸）、
−１１アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１５０〜１６０に対応するアミノ酸）、
−１７アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１６６〜１８２に対応するアミノ酸）、
−１９アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１３６〜１５４に対応するアミノ酸）、
−３１アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１３６〜１６６に対応するアミノ酸）、または
−４８アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１３６〜１８３に対応するアミノ酸）
であり得る。

他の実施形態において、削除される連続した部分は、３〜１０アミノ酸残基、例えば、４〜１０アミノ酸残基、例えば、４〜８アミノ酸残基であり得る。削除されるアミノ酸の特定の数は、３、４、５、６、７、８、９または１０、特に、４、５、６または８であり得る。

他の実施形態において、削除される部分は、配列番号１における残基１３５〜１３８、配列番号１における残基１３６〜１３８、配列番号１における残基１３７〜１３８、配列番号１における残基１３８〜１４０、配列番号１における残基１３８〜１４１、配列番号１における残基１５２〜１５４に対応する部分、または配列番号１における残基１４９〜１５１の欠失であり得る。

本発明の第４の態様は、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を提供し、前記タンパク質は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含んでなり、その第１ポリペプチドは、第２ポリペプチドに対してＮ末端側に位置しており、ここで、
（ｉｉｉ）第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３３の中の少なくとも１００アミノ酸の連続した配列であり、かつ
（ｉｖ）第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１８４〜３９２の中の少なくとも１５５アミノ酸の連続した配列であり、
ここで、その第１および第２ポリペプチドは、直接連結されているか、または第３ポリペプチドを介して間接的に連結されており、前記第３ポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸（例えば、少なくとも２つ）が欠失している、配列番号１における残基１３４〜１８３に対応する。

いくつかの実施形態において、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドから本質的になるか、あるいは、それらからなり、その第１ポリペプチドは、第２ポリペプチドに対してＮ末端側に位置しており、ここで、
（ｉ）第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３３の中の少なくとも１００アミノ酸の連続した配列であり、かつ
（ｉｉ）第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１８４〜３９２の中の少なくとも１５５アミノ酸の連続した配列であり、
ここで、その第１および第２ポリペプチドは、直接連結されているか、または第３ポリペプチドを介して間接的に連結されており、前記第３ポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸（例えば、少なくとも２つ）が欠失している、配列番号１における残基１３４〜１８３に対応する。

第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含んでなるか、あるいはそれらから本質的になるかまたはそれらからなるタンパク質が特に興味深く、その第１ポリペプチドは、第２ポリペプチドに対してＮ末端側に位置しており、ここで、
（ｉ）第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３３の中の少なくとも１００アミノ酸の連続した配列であり、かつ
（ｉｉ）第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１８４〜３９２の中の少なくとも１５５アミノ酸の連続した配列であり、
ここで、その第１および第２ポリペプチドは、直接連結されているか、または第３ポリペプチドを介して間接的に連結されており、前記第３ポリペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸（例えば、少なくとも４個）の少なくとも連続した部分が欠失している、配列番号１における残基１３４〜１８３に対応する。

第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３３の中の少なくとも１１０アミノ酸の連続した配列、例えば、少なくとも１２０アミノ酸または少なくとも１３０アミノ酸（例えば、残基１〜１３３）であり得る。

第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１８４〜３９２の中の少なくとも１８０アミノ酸の連続した配列、例えば、少なくとも１９０アミノ酸または少なくとも２００アミノ酸（例えば、残基１８４〜３９２）であり得る。

配列番号１における１３４〜１８３に対応する残基から削除される連続した部分は、少なくとも５アミノ酸（例えば、５〜３０、例えば、５〜２０または５〜１５）、特に、少なくとも６アミノ酸（例えば、６〜３０、例えば、６〜２０または６〜１５）、特に、少なくとも７アミノ酸（例えば、７〜３０、例えば、７〜２０または７〜１５）、例えば、少なくとも８アミノ酸（例えば、８〜３０、例えば、８〜２０または８〜１５）または少なくとも１０アミノ酸（例えば、１０〜３０、例えば、１０〜２０または１０〜１５）であり得る。

ある特定の実施形態において、配列番号１における１３４〜１８３に対応する残基から削除される連続した部分は、
−４アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１４２〜１４５に対応するアミノ酸）、
−５アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１３５〜１３９に対応するアミノ酸）、
−６アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１４９〜１５４に対応するアミノ酸）、
−８アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１３８〜１４５または配列番号１における残基１４５〜１５２に対応するアミノ酸）、
−１１アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１５０〜１６０に対応するアミノ酸）、
−１７アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１６６〜１８２に対応するアミノ酸）、
−１９アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１３６〜１５４に対応するアミノ酸）、
−３１アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１３６〜１６６に対応するアミノ酸）、または
−４８アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１３６〜１８３に対応するアミノ酸）
であり得る。

他の実施形態において、配列番号１における１３４〜１８３に対応する残基から削除される連続した部分は、３〜１０アミノ酸残基、例えば、４〜１０、例えば、４〜８アミノ酸残基であり得るあり得る。削除されるアミノ酸の特定の数は、３、４、５、６、７、８、９または１０、特に、４、５、６または８であり得る。

他の実施形態において、配列番号１における１３４〜１８３に対応する残基から削除される連続した部分は、配列番号１における残基１３５〜１３８、配列番号１における残基１３６〜１３８、配列番号１における残基１３７〜１３８、配列番号１における残基１３８〜１４０、配列番号１における残基１３８〜１４１、配列番号１における残基１５２〜１５４に対応する残基、または配列番号１における残基１４９〜１５１の欠失であり得る。

第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドは、いくつかの実施形態において、直接連結され得る。他の実施形態において、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドは、第３ポリペプチドを介して間接的に連結され得る。第３ポリペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸（例えば、少なくとも４個）の連続した単一部分に欠失が生じている、配列番号１における残基１３４〜１８３に対応することがある。さらに、第３ポリペプチドは、複数の異なる位置（例えば、１〜１０個、例えば、１〜５個、特に、１または２個の位置）に欠失が生じている、配列番号１における残基１３４〜１８３に対応することがある。各欠失は、１〜１０アミノ酸残基、例えば、１〜５アミノ酸残基である。

好適には、第３ポリペプチドは、４８アミノ酸またはそれ以下（例えば、１０〜４８、例えば、２０〜４８または３０〜４８残基）、例えば、４６アミノ酸またはそれ以下（例えば、１０〜４６、例えば、２０〜４６または３０〜４６残基）、４４アミノ酸またはそれ以下（例えば、１０〜４４、例えば、２０〜４４または３０〜４４残基）または４２アミノ酸またはそれ以下（例えば、１０〜４２、例えば、２０〜４２または３０〜４２残基）である。

本発明の第５の態様は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含んでなる改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を提供し、その第１ポリペプチドは、第２ポリペプチドに対してＮ末端側に位置しており、ここで、
（ｉｉｉ）第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３４の中の少なくとも１００アミノ酸の連続した配列であり、かつ
（ｉｖ）第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１５５〜３９２の中の少なくとも１７５アミノ酸の連続した配列であり、
ここで、その第１および第２ポリペプチドは、直接連結されているか、または第３ポリペプチドを介して間接的に連結されており、ここで、前記第３ポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸（例えば、少なくとも２つ）が欠失している、配列番号１における残基１３５〜１５４に対応する。

いくつかの実施形態において、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドから本質的になるか、あるいはそれらからなり、その第１ポリペプチドは、第２ポリペプチドに対してＮ末端側に位置しており、ここで、
（ｉ）第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３４の中の少なくとも１００アミノ酸の連続した配列であり、かつ
（ｉｉ）第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１５５〜３９２の中の少なくとも１７５アミノ酸の連続した配列であり、
ここで、その第１および第２ポリペプチドは、直接連結されているか、または第３ポリペプチドを介して間接的に連結されており、ここで、前記第３ポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸（例えば、少なくとも２つ）が欠失している、配列番号１における残基１３５〜１５４に対応する。

第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含んでなるか、あるいはそれらから本質的になるかまたはそれらからなるタンパク質が特に興味深く、その第１ポリペプチドは、第２ポリペプチドに対してＮ末端側に位置しており、ここで、
（ｉ）第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３４の中の少なくとも１００アミノ酸の連続した配列であり、かつ
（ｉｉ）第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１５５〜３９２の中の少なくとも１７５アミノ酸の連続した配列であり、
ここで、その第１および第２ポリペプチドは、直接連結されているか、または第３ポリペプチドを介して間接的に連結されており、ここで、前記第３ポリペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸（例えば、少なくとも４個）の少なくとも連続した部分が欠失している、配列番号１における残基１３５〜１５４に対応する。

第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３４の中の少なくとも１１０アミノ酸の連続した配列、例えば、少なくとも１２０アミノ酸または少なくとも１３０アミノ酸、例えば、残基１〜１３４でもあり得る。

第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１５５〜３９２の中の少なくとも２００アミノ酸の連続した配列、例えば、少なくとも２１０アミノ酸または少なくとも２２０アミノ酸、例えば、残基１５５〜３９２でもあり得る。第２ポリペプチドが配列番号１の残基１５５〜３９２の中の少なくとも２３５アミノ酸の連続した配列である実施形態も興味深い。

配列番号１における１３５〜１５４に対応する残基から削除される連続した部分は、少なくとも５アミノ酸（例えば、５〜２０、例えば、５〜１５または５〜１０）、特に、少なくとも６アミノ酸（例えば、６〜２０、例えば、６〜１５または６〜１０）、特に、少なくとも７アミノ酸（例えば、７〜２０、例えば、７〜１５または７〜１０）、例えば、少なくとも８アミノ酸（例えば、８〜２０、例えば、８〜１５または８〜１０）または少なくとも１０アミノ酸（例えば、１０〜２０、例えば、１０〜１５）であり得る。

ある特定の実施形態において、配列番号１における１３５〜１５４に対応する残基から削除される連続した部分は、
−４アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１４２〜１４５に対応するアミノ酸）、
−６アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１４９〜１５４に対応するアミノ酸）、
−８アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１３８〜１４５または配列番号１における残基１４５〜１５２に対応するアミノ酸）
−１１アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１５０〜１６０に対応するアミノ酸）、または
−１９アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１３６〜１５４に対応するアミノ酸）
であり得る。

他の実施形態において、１３５〜１５４に対応する残基から削除される連続した部分は、３〜１０アミノ酸残基、例えば、４〜１０、例えば、４〜８アミノ酸残基であり得る。削除されるアミノ酸の特定の数は、３、４、５、６、７、８、９または１０、特に、４、５、６または８であり得る。

他の実施形態において、配列番号１における１３５〜１５４に対応する残基から削除される連続した部分は、配列番号１における残基１３５〜１３８、配列番号１における残基１３６〜１３８、配列番号１における残基１３７〜１３８、配列番号１における残基１３８〜１４０、配列番号１における残基１３８〜１４１、配列番号１における残基１５２〜１５４に対応する部分、または配列番号１における残基１４９〜１５１の欠失であり得る。

第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドは、いくつかの実施形態において、直接連結され得る。他の実施形態において、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドは、第３ポリペプチドを介して間接的に連結され得る。第３ポリペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸（例えば、少なくとも４個）の連続した単一部分に欠失が生じている、配列番号１における残基１３５〜１５４に対応することがある。さらに、第３ポリペプチドは、複数の異なる位置（例えば、１〜１０個、例えば、１〜５個、特に、１または２個の位置）に欠失が生じている、配列番号１における残基１３５〜１５４に対応することがあり、各欠失は、１〜１０アミノ酸残基、例えば、１〜５アミノ酸残基である。

好適には、第３ポリペプチドは、２０アミノ酸またはそれ以下（例えば、５〜２０、例えば、１０〜２０残基）、例えば、１８アミノ酸またはそれ以下（例えば、５〜１８、例えば、１０〜１８残基）、１６アミノ酸またはそれ以下（例えば、５〜１６、例えば、１０〜１６残基）または１４アミノ酸またはそれ以下（例えば、５〜１４、例えば、１０〜１４残基）である。

本発明の第６の態様は、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を提供し、前記タンパク質は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含んでなり、その第１ポリペプチドは、第２ポリペプチドに対してＮ末端側に位置しており、ここで、
（ｉｉｉ）第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３３に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、かつ
（ｉｖ）第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１８４〜３９２に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、
ここで、その第１および第２ポリペプチドは、直接連結されているか、または第３ポリペプチドを介して間接的に連結されており、前記第３ポリペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸（例えば、少なくとも４個）の連続した部分が欠失している、配列番号１における残基１３４〜１８３に対応する配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する。

いくつかの実施形態において、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドから本質的になるか、あるいはそれらからなり、その第１ポリペプチドは、第２ポリペプチドに対してＮ末端側に位置しており、ここで、
（ｉ）第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３３に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、かつ
（ｉｉ）第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１８４〜３９２に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、
ここで、その第１および第２ポリペプチドは、直接連結されているか、または第３ポリペプチドを介して間接的に連結されており、前記第３ポリペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸（例えば、少なくとも４個）の連続した部分が欠失している、配列番号１における残基１３４〜１８３に対応する配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する。

第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３３に対して少なくとも９５％の同一性（例えば、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％もの同一性）を有する配列であり得る。

第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１８４〜３９２に対して少なくとも９５％の同一性（例えば、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％もの同一性）を有する配列であり得る。

第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドは、いくつかの実施形態において、直接連結され得る。他の実施形態において、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドは、第３ポリペプチドを介して間接的に連結され得る。第３ポリペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸（例えば、少なくとも４個）の連続した部分が欠失している、配列番号１における残基１３４〜１８３に対応する配列に対して少なくとも９５％の同一性（例えば、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％もの同一性）を有する配列であり得る。

配列番号１における１３４〜１８３に対応する残基から削除される連続した部分は、少なくとも５アミノ酸（例えば、５〜３０、例えば、５〜２０または５〜１５）、特に、少なくとも６アミノ酸（例えば、６〜３０、例えば、６〜２０または６〜１５）、特に、少なくとも７アミノ酸（例えば、７〜３０、例えば、７〜２０または７〜１５）、例えば、少なくとも８アミノ酸（例えば、８〜３０、例えば、８〜２０または８〜１５）または少なくとも１０アミノ酸（例えば、１０〜３０、例えば、１０〜２０または１０〜１５）であり得る。

ある特定の実施形態において、配列番号１における１３４〜１８３に対応する残基から削除される連続した部分は、
−４アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１４２〜１４５に対応するアミノ酸）、
−５アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１３５〜１３９に対応するアミノ酸）、
−６アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１４９〜１５４に対応するアミノ酸）、
−８アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１３８〜１４５または配列番号１における残基１４５〜１５２に対応するアミノ酸）、
−１１アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１５０〜１６０に対応するアミノ酸）、
−１７アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１６６〜１８２に対応するアミノ酸）、
−１９アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１３６〜１５４に対応するアミノ酸）、
−３１アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１３６〜１６６に対応するアミノ酸）、または
−４８アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１３６〜１８３に対応するアミノ酸）
であり得る。

他の実施形態において、削除される連続した部分は、３〜１０アミノ酸残基、例えば、４〜１０、例えば、４〜８アミノ酸残基であり得る。削除されるアミノ酸の特定の数は、３、４、５、６、７、８、９または１０、特に、４、５、６または８であり得る。

他の実施形態において、配列番号１における１３４〜１８３に対応する残基から削除される連続した部分は、配列番号１における残基１３５〜１３８、配列番号１における残基１３６〜１３８、配列番号１における残基１３７〜１３８、配列番号１における残基１３８〜１４０、配列番号１における残基１３８〜１４１、配列番号１における残基１５２〜１５４の残基に対応する部分、または配列番号１における残基１４９〜１５１の欠失であり得る。

好適には、第３ポリペプチドは、４８アミノ酸またはそれ以下（例えば、１０〜４８、例えば、２０〜４８または３０〜４８残基）、例えば、４６アミノ酸またはそれ以下（例えば、１０〜４６、例えば、２０〜４６または３０〜４６残基）、４４アミノ酸またはそれ以下（例えば、１０〜４４、例えば、２０〜４４または３０〜４４残基）または４２アミノ酸またはそれ以下（例えば、１０〜４２、例えば、２０〜４２または３０〜４２残基）である。

本発明の第７の態様は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含んでなる改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を提供し、その第１ポリペプチドは、第２ポリペプチドに対してＮ末端側に位置しており、ここで、
（ｉ）第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３４に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、かつ
（ｉｉ）第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１５５〜３９２に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、
ここで、その第１および第２ポリペプチドは、直接連結されているか、または第３ポリペプチドを介して間接的に連結されており、前記第３ポリペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸（例えば、少なくとも４個）の連続した部分が欠失している、配列番号１における残基１３５〜１５４に対応する配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する。

いくつかの実施形態において、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドから本質的になるか、あるいはそれらからなり、その第１ポリペプチドは、第２ポリペプチドに対してＮ末端側に位置しており、ここで、
（ｉ）第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３４に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、かつ
（ｉｉ）第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１５５〜３９２に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、
ここで、その第１および第２ポリペプチドは、直接連結されているか、または第３ポリペプチドを介して間接的に連結されており、前記第３ポリペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸（例えば、少なくとも４個）の連続した部分が欠失している、配列番号１における残基１３５〜１５４に対応する配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する。

第１ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１３４に対して少なくとも９５％の同一性（例えば、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％もの同一性）を有する配列であり得る。

第２ポリペプチドは、配列番号１の残基１５５〜３９２に対して少なくとも９５％の同一性（例えば、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％もの同一性）を有する配列であり得る。

第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドは、いくつかの実施形態において、直接連結され得る。他の実施形態において、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドは、第３ポリペプチドを介して間接的に連結され得る。第３ポリペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸（例えば、少なくとも４個）の連続した部分が欠失している、配列番号１における残基１３５〜１５４に対応する配列に対して少なくとも９０％の同一性（例えば、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％もの同一性）を有する配列であり得る。

配列番号１における１３５〜１５４に対応する残基から削除される連続した部分は、少なくとも５アミノ酸（例えば、５〜２０、例えば、５〜１５または５〜１０）、特に、少なくとも６アミノ酸（例えば、６〜２０、例えば、６〜１５または６〜１０）、特に、少なくとも７アミノ酸（例えば、７〜２０、例えば、７〜１５または７〜１０）、例えば、少なくとも８アミノ酸（例えば、８〜２０、例えば、８〜１５または８〜１０）または少なくとも１０アミノ酸（例えば、１０〜２０、例えば、１０〜１５）であり得る。

ある特定の実施形態において、配列番号１における１３５〜１５４に対応する残基から削除される連続した部分連続した部分は、
−４アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１４２〜１４５に対応するアミノ酸）、
−６アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１４９〜１５４に対応するアミノ酸）、
−８アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１３８〜１４５または配列番号１における残基１４５〜１５２に対応するアミノ酸）、
−１１アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１５０〜１６０に対応するアミノ酸）、または
−１９アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１３６〜１５４に対応するアミノ酸）
であり得る。

他の実施形態において、削除される連続した部分は、３〜１０アミノ酸残基、例えば、４〜１０、例えば、４〜８アミノ酸残基であり得る。削除されるアミノ酸の特定の数は、３、４、５、６、７、８、９または１０、特に、４、５、６または８であり得る。

他の実施形態において、配列番号１における１３５〜１５４に対応する残基から削除される連続した部分連続した部分は、配列番号１における残基１３５〜１３８、配列番号１における残基１３６〜１３８、配列番号１における残基１３７〜１３８、配列番号１における残基１３８〜１４０、配列番号１における残基１３８〜１４１、配列番号１における残基１５２〜１５４に対応する残基、または配列番号１における残基１４９〜１５１の欠失であり得る。

好適には、第３ポリペプチドは、２０アミノ酸またはそれ以下（例えば、５〜２０、例えば、１０〜２０残基）、例えば、１８アミノ酸またはそれ以下（例えば、５〜１８、例えば、１０〜１８残基）、１６アミノ酸またはそれ以下（例えば、５〜１６、例えば、１０〜１６残基）または１４アミノ酸またはそれ以下（例えば、５〜１４、例えば、１０〜１４残基）である。

疎水性残基の置換は、配列番号１の残基１３４〜１８３に対応する少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ）のアミノ酸の、親水性残基による置換によって行われ得る。この点において、好適な親水性残基は、典型的には、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｓｅｒ（Ｓ）またはＴｈｒ（Ｔ）であり得る。

配列番号１の残基１３５〜１５４に対応する少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ）のアミノ酸の、親水性残基による置換が、特に興味深い。この点において、好適な親水性残基は、典型的には、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｓｅｒ（Ｓ）またはＴｈｒ（Ｔ）であり得る。

置換される残基は、連続していなくてもよいが、好適には連続している。

本発明の第８の態様では、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質が提供され、前記タンパク質は、配列番号１における残基１３４〜１８３に対応する領域の少なくとも３個のアミノ酸（例えば、少なくとも４個）の連続した部分が親水性残基で置換されているＲｖ３６１６ｃ配列を含んでなる。

いくつかの実施形態において、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、配列番号１における残基１３４〜１８３に対応する領域の少なくとも３個のアミノ酸（例えば、少なくとも４個）の連続した部分が親水性残基で置換されているＲｖ３６１６ｃ配列から本質的になるか、あるいはその配列からなる。

配列番号１における残基１３５〜１５４に対応する領域の少なくとも３個のアミノ酸（例えば、少なくとも４個）の連続した部分が親水性残基で置換されているＲｖ３６１６ｃ配列を含んでなる改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質が特に興味深い。

置換される連続した部分は、少なくとも５アミノ酸（例えば、５〜３０、例えば、５〜２０または５〜１５）、特に、少なくとも６アミノ酸（例えば、６〜３０、例えば、６〜２０または６〜１５）、特に、少なくとも７アミノ酸（例えば、７〜３０、例えば、７〜２０または７〜１５）、例えば、少なくとも８アミノ酸（例えば、８〜３０、例えば、８〜２０または８〜１５）または少なくとも１０アミノ酸（例えば、１０〜３０、例えば、１０〜２０または１０〜１５）であり得る。

ある特定の実施形態において、置換される連続した部分は、
−４アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１４２〜１４５に対応するアミノ酸）、
−５アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１３５〜１３９に対応するアミノ酸）、
−６アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１４９〜１５４に対応するアミノ酸）、
−８アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１３８〜１４５または配列番号１における残基１４５〜１５２に対応するアミノ酸）、
−１１アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１５０〜１６０に対応するアミノ酸）、
−１７アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１６６〜１８２に対応するアミノ酸）、
−１９アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１３６〜１５４に対応するアミノ酸）、
−３１アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１３６〜１６６に対応するアミノ酸）、または
−４８アミノ酸（例えば、配列番号１における残基１３６〜１８３に対応するアミノ酸）
であり得る。

他の実施形態において、置換される連続した部分は、３〜１０アミノ酸残基、例えば、４〜１０、例えば、４〜８アミノ酸残基であり得る。置換されるアミノ酸の特定の数は、３、４、５、６、７、８、９または１０、特に、４、５、６または８であり得る。

他の実施形態において、置換される部分は、配列番号１における残基１３５〜１３８、配列番号１における残基１３６〜１３８、配列番号１における残基１３７〜１３８、配列番号１における残基１３８〜１４０、配列番号１における残基１３８〜１４１、配列番号１における残基１５２〜１５４に対応する部分、または配列番号１における残基１４９〜１５１の欠失であり得る。

疎水性の破壊は、親水性残基の付加、例えば、配列番号１の残基１３３〜１８４に対応する残基の位置における少なくとも１つの親水性アミノ酸残基（例えば、少なくとも２つ、例えば、２〜１０個）の付加によっても行われ得る。好適には、少なくとも３つの親水性残基（例えば、３〜２０、例えば、３〜１５、特に、３〜１０）、例えば、少なくとも４残基（例えば、４〜２０、例えば、４〜１５、特に、４〜１０）、特に、少なくとも５残基（例えば、５〜２０、例えば、５〜１５、特に、５〜１０）、必要に応じて少なくとも６残基（例えば、６〜２０、例えば、６〜１５、特に、６〜１０）が付加され得る。この点において、好適な親水性残基は、典型的には、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｓｅｒ（Ｓ）またはＴｈｒ（Ｔ）であり得る。

追加の親水性残基は、典型的には、配列番号１の残基１３３〜１８４に対応する残基、特に、配列番号１の残基１３４〜１５５に対応する残基（例えば、配列番号１の残基１３５〜１５４に対応する残基）に配置され得る。

追加の親水性残基は、配列番号１の残基１３３〜１８４に対応する残基の種々の位置に分配され得（例えば、１〜１０個の位置、例えば、１〜５個、特に、１または２個の位置）、各位置は、追加の１〜１０個の親水性残基、例えば、追加の１〜５個の残基を有する。追加の親水性残基は、好適には、連続した一群として配置され得る。

上記の様々な態様において記載される改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質の特定の実施形態において、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、配列番号１６２（Ｒｖ３６１６ｃΔ１５０−１６０）ではない。他の実施形態において、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、配列番号１６２（Ｒｖ３６１６ｃΔ１５０−１６０）を含まない。

改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの任意の株の野生型Ｒｖ３６１６ｃタンパク質配列に基づき得る。例えば、配列番号３〜７のうちのいずれか１つ、特に、配列番号３〜６のうちのいずれか１つによって、前述の実施形態において、配列番号１が置換されてもよい。

上で論じられた様々な態様のタンパク質は、本明細書中では、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質と集合的に呼ばれる。ＴＢの治療または予防のための薬剤などの薬剤として使用するためのそのような改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質も提供される。

本発明のさらなる態様は、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を投与することを含んでなる、被験体において免疫応答を誘導するための方法に関する。

本発明のさらなる態様は、ＴＢの治療、改善または予防のための方法に関し、その方法は、安全かつ有効な量の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を、それを必要とする被験体に投与することを含んでなり、ここで、前記ポリペプチドは、免疫応答を誘導する。さらなる態様において、その方法は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する免疫応答を誘導することをさらに含んでなる。

本発明のさらなる態様は、結核の再活性化の治療、改善、遅延または予防のための方法に関し、その方法は、有効量の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を、それを必要とする被験体に投与することを含んでなり、ここで、前記ポリペプチドは、免疫応答を誘導する。さらなる態様において、その方法は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する免疫応答を誘導することをさらに含んでなる。

ＴＢの治療、改善または予防のための薬剤の製造における改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質の使用は、本発明の別の態様に相当する。

本発明は、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質をコードする核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドを提供する。ＴＢの治療、改善または予防のための薬剤などの薬剤として使用するための、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質をコードする核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドも提供される。

本発明のさらなる態様は、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質をコードする核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドを投与することを含んでなる、被験体において免疫応答を誘導するための方法に関する。

本発明のさらなる態様は、ＴＢの治療、改善または予防のための方法に関し、その方法は、安全かつ有効な量の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質をコードする核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドを、それを必要とする被験体に投与することを含んでなり、ここで、前記ポリヌクレオチドは、免疫応答を誘導する。さらなる態様において、本発明は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する免疫応答を誘導するための方法を提供する。

本発明のさらなる態様は、結核の再活性化の治療、改善、遅延または予防のための方法に関し、その方法は、有効量の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質をコードする核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドを、それを必要とする被験体に投与することを含んでなり、ここで、前記ポリペプチドは、免疫応答を誘導する。さらなる態様において、その方法は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する免疫応答を誘導することをさらに含んでなる。

ＴＢの治療、改善または予防のための薬剤の製造における、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を含んでなるポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドの使用は、本発明の別の態様に相当する。

また、
（ａ）改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質、または
（ｂ）改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質をコードする核酸配列を含んでなるポリヌクレオチド、および
（ｃ）薬学上許容される担体または賦形剤
を含んでなる医薬組成物が提供される。

さらに、
（ａ）改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質、または
（ｂ）改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質をコードする核酸配列を含んでなるポリヌクレオチド、および
（ｃ）非特異的な免疫応答増強剤
を含んでなる免疫原性組成物が提供される。

改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質をコードする核酸配列を含んでなる発現ベクターも提供される。

前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞は、本発明のさらなる態様を形成する。さらに、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を組換え的に発現する宿主細胞が提供される。

さらに、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を生成するための方法が提供され、
前記方法は、宿主細胞内で前記ポリペプチドを組換え的に発現させる工程を含んでなる。

（ａ）改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質、
（ｂ）前記改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質と、個体由来のサンプル（例えば、全血またはより好適にはＰＢＭＣ）とを接触させるのに足りる装置、および
（ｃ）そのサンプルのＴ細胞応答を定量する手段
を含んでなる診断キットも提供される。

本発明の別の態様は、
（ａ）改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質、および
（ｂ）前記改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質と患者の皮膚細胞とを接触させるのに足りる装置
を含んでなる診断キットに関する。

本発明のさらなる態様は、被験体におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を検出するための方法に関し、その方法は、
（ａ）前記被験体由来のサンプルと、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質とを接触させる工程、および
（ｂ）その生物学的サンプルにおいて、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質に結合する抗体の存在を検出する工程
を含んでなる。

本発明は、
（ａ）改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質（このタンパク質は、必要に応じて、固体支持体上に固定化されている）、および
（ｂ）検出試薬
を含んでなる診断キットも提供する。

１つの実施形態において、本発明に係る改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質、ポリヌクレオチドまたは組成物を投与される被験体は、活動性結核（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによる活動性感染）を有し得る。第２の実施形態において、その被験体は、潜伏結核（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによる休眠感染）を有し得る。第３の実施形態において、その被験体は、結核を有しない（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによる感染を有しない）ことがある。

本発明に係る改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質、ポリヌクレオチドまたは組成物を投与される被験体は、以前に結核のワクチン接種（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの感染に対するワクチン接種）を受けたことがあってもよい（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）のワクチン接種を受けたことがあってもよい）。あるいは、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物を投与される被験体は、以前に結核のワクチン接種を受けたことがなくてもよい（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの感染に対するワクチン接種を受けたことがなくてもよい）（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）のワクチン接種を受けたことがなくてもよい）。

本発明に係る改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質、ポリヌクレオチドまたは組成物は、
−活動性結核を治療する、
−活動性結核を予防する（例えば、感染していない被験体、あるいは潜伏感染を有する被験体に投与することによって）、
−潜伏結核を治療する、
−潜伏結核を予防する、または
−結核の再活性化を予防するかもしくは遅延させる（特に、ＴＢの再活性化を、例えば、数ヶ月間、数年間または無期限に遅延させる）
という目的で提供され得る。

潜伏ＴＢを治療するための方法も提供され、その方法は、
（ｉ）ＴＢの潜伏感染を有すると被験体を識別する工程（例えば、ＰＰＤまたはＴ細胞ベースアッセイによって）、および
（ｉｉ）安全かつ有効な量の、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質または改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質をコードするポリヌクレオチドを（例えば、医薬組成物または免疫原性組成物の形態で）前記被験体に投与する工程
を含んでなる。

試験被験体におけるＴＢ（例えば、潜伏ＴＢ）を識別するための診断キットの製造における本発明のポリペプチドの使用も提供される。

用語「結核菌群のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種」には、結核疾患を引き起こすと従来より考えられている種、ならびにＡＩＤＳを有する患者などの免疫力が低下した患者において結核および肺疾患を引き起こすＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの環境種および日和見種、例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓまたはＭ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、ＢＣＧ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｃｅｌａｔｕｍ、Ｍ．ｇｅｎａｖｅｎｓｅ、Ｍ．ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｓｉｍｉａｅ、Ｍ．ｖａｃｃａｅ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍおよびＭ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍが含まれる（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｃｈａｐｔｅｒ １５０，ｐｐ．９５３−９６６（１６ｔｈ ｅｄ．，Ｂｒａｕｎｗａｌｄ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，２００５を参照のこと）。本発明は、特に、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによる感染に関する。

用語「活動性感染」とは、疾患症状および／または病変があらわれている（好適には、疾患症状があらわれている）感染（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによる感染）のことを指す。

用語「非活動性感染」、「休眠感染」または「潜伏感染」とは、疾患症状および／または病変があらわれていない（好適には、疾患症状があらわれていない）感染（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによる感染）のことを指す。潜伏感染を有する被験体は、好適には、感染に対して陽性を示す（例えば、ＰＰＤまたはＴ細胞ベースアッセイによって）が、活動性感染に関連する疾患症状および／または病変を示していない、被験体であり得る。

用語「一次結核」とは、感染（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによる感染）の直後の臨床的疾病（例えば、疾患症状の出現）のことを指す。Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｃｈａｐｔｅｒ １５０，ｐｐ．９５３−９６６（１６ｔｈ ｅｄ．，Ｂｒａｕｎｗａｌｄ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，２００５）を参照のこと。

用語「二次性結核」または「初感染後結核」とは、休眠感染、非活動性感染または潜伏感染（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによる感染）の再活性化のことを指す。Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｃｈａｐｔｅｒ １５０，ｐｐ．９５３−９６６（１６ｔｈ ｅｄ．，Ｂｒａｕｎｗａｌｄ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，２００５）を参照のこと。

用語「結核の再活性化」とは、感染に対して陽性を示す（例えば、ツベルクリン皮膚試験、好適には、インビトロＴ細胞ベースアッセイにおいて）が、明らかな疾患症状を有しない個体において、後に疾患症状が出現することを指す。好適には、その個体は、感染に再度曝露されていない。診断テストの陽性は、その個体が感染しているが、しかしながら、その個体が、その結核を非活動性状態または潜伏状態にするのに十分治療された活動性の疾患症状を以前にあらわしたことがあるかもしれないし、ないかもしれないことを示唆する。結核の再活性化の予防、遅延または治療のための方法は、活動性の疾患症状をあらわしている個体において開始され得ることが認識されるだろう。

用語「薬剤耐性」結核とは、感染株が結核の治療に有効な１つ以上のいわゆる「第一線」化学療法剤（例えば、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、ストレプトマイシンおよびピラジナミド）によって静止状態で保持されないかまたは殺滅されない（すなわち、それらに耐性である）感染（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによる感染）のことを指す。

用語「多剤耐性」結核とは、感染株が結核の治療に有効な「第一線」化学療法剤のうちの２つ以上に対して耐性である感染（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによる感染）のことを指す。

「化学療法剤」とは、結核（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによる感染）を治療すると知られており、その治療のために当該分野において使用される薬理学的物質のことを指す。結核を治療するために使用される例示される薬理学的物質としては、アミカシン、アミノサリチル酸、カプレオマイシン、サイクロセリン、エタンブトール、エチオナミド、イソニアジド、カナマイシン、ピラジナミド、リファマイシン（すなわち、リファンピン、リファペンチンおよびリファブチン）、ストレプトマイシン、オフロキサシン、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシンおよびフルオロキノロンが挙げられるが、これらに限定されない。薬剤耐性でない結核を治療するために使用される「第一選択」または「第一線」化学療法剤としては、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、ストレプトマイシンおよびピラジナミドが挙げられる。１つ以上の「第一選択」薬に対して薬剤耐性を示している結核を治療するために使用される「第二選択」化学療法剤としては、オフロキサシン、シプロフロキサシン、エチオナミド、アミノサリチル酸、サイクロセリン、アミカシン、カナマイシンおよびカプレオマイシンが挙げられる。そのような薬理学的物質は、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｈａｒｄｍａｎ ａｎｄ Ｌｉｍｂｉｒｄ ｅｄｓ．，２００１のＣｈａｐｔｅｒ ４８に概説されている。

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーのことを指すために本明細書中で交換可能に使用される。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、ならびに後で修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリンである。好適には、本発明に係るポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸残基、特に、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸だけからなり得る。

「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および一本鎖または二本鎖の形態のそれらのポリマーのことを指す。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと交換可能に使用される。

アミノ酸は、一般に知られている３文字のシンボル、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨する１文字のシンボルのいずれかによって、本明細書中で言及され得る。同様に、ヌクレオチドも、一般に認められている一文字コードによって言及され得る。

用語「Ｒｖ３６１６ｃタンパク質配列」とは、本明細書中で使用されるとき、結核菌群のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓもしくはＭ．ａｆｒｉｃａｎｕｍなどの種、または免疫力が低下した宿主（例えば、ＡＩＤＳを有する患者）において肺感染症などの日和見感染を引き起こす環境性もしくは日和見性のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、例えば、ＢＣＧ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｃｅｌａｔｕｍ、Ｍ．ｇｅｎａｖｅｎｓｅ、Ｍ．ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｓｉｍｉａｅ、Ｍ．ｖａｃｃａｅ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍおよびＭ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ由来の、配列番号１に提供されるＲｖ３６１６ｃポリペプチド配列またはそのホモログのことを意味する（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｃｈａｐｔｅｒ １５０，ｐｐ．９５３−９６６，１６ｔｈ ｅｄ．，Ｂｒａｕｎｗａｌｄ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，２００５を参照のこと）。

ワクチン接種された宿主間で高い有効率を確実にするために、ワクチンの成分は、臨床的に重要な株の間で十分に保存されているべきである。好適には、Ｒｖ３６１６ｃタンパク質は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ（すなわち、配列番号１に提供されるポリペプチド配列）、または別のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株（例えば、ＣＤＣ１５５１、Ｆ１１、Ｈａａｒｌｅｍ ＡおよびＣ株）由来のそのホモログに由来する。薬剤耐性（例えば、ＭＤＲまたは特にＸＤＲ）に関連するＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの株は、野生型Ｒｖ３６１６ｃタンパク質配列に対して特に価値のある基盤である。興味深い株としては、以下が挙げられる：
ＣＤＣ１５５１−伝染性かつ病原性の株
Ｈａａｒｌｅｍファミリー（例えば、Ｈａａｒｌｅｍ Ａ）−過密なヒト集団に見出される薬剤耐性株。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株のＨａａｒｌｅｍファミリーのメンバーは、世界の多くの地域において見出されている。このファミリーの最初の代表は、Ｈａａｒｌｅｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓにおいて発見された。

ＫＺＮ４２０７−ＫｗａＺｕｌｕ−Ｎａｔａｌ，Ｓｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａにおける患者由来の薬剤感受性分離菌。

ＫＺＮ１４３５−ＫｗａＺｕｌｕ−Ｎａｔａｌ，Ｓｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａにおける患者由来の多剤耐性（ＭＤＲ）分離菌。

ＫＺＮ６０５−ＫｗａＺｕｌｕ−Ｎａｔａｌ，Ｓｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａにおける患者由来の広範囲薬剤耐性（ＸＤＲ）分離菌。

Ｃ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙにおいて大いに伝染したもの。１つの研究では、この株は、注射薬物使用者でより多く見出され、反応性窒素中間体に耐性であると見出された（Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９９７ １７６（２）：４７８−８４）
９４＿Ｍ４２４１Ａ−中国で生まれた患者から１９９４年にＳａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏで単離された。この株は、以前にゲノム欠失解析によって解析された（Ｇａｇｎｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２００６ １０３（８）：２８６９−２８７３）。

０２＿１９８７−韓国で生まれた患者から２００２年にＳａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏで単離された。この株は、以前にゲノム欠失解析によって解析された（Ｇａｇｎｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２００６ １０３（８）：２８６９−２８７３）。

Ｔ９２−フィリピンで生まれた患者から１９９９年にＳａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏで単離された。この株は、Ｈｉｒｓｈ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２００４ １０１：４８７１−４８７６）で公開された。

Ｔ８５−中国で生まれた患者から１９９８年にＳａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏで単離された。この株は、Ｈｉｒｓｈ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２００４ １０１：４８７１−４８７６）で公開された。

ＥＡＳ０５４−インドで生まれた患者から１９９３年にＳａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏで単離された。この株は、以前にゲノム欠失解析によって解析された（Ｇａｇｎｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２００６ １０３（８）：２８６９−２８７３）。

Ｇａｇｎｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２００６ １０３（８）：２８６９−２８７３およびＨｅｒｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２００７ ７５（１２）：５７９８−５８０５では、存在すると知られているＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株の範囲に対する価値ある背景が提供されている。

最も好適には、Ｒｖ３６１６ｃタンパク質は、配列番号１および３〜７、特に、配列番号１および３〜６、例えば、配列番号１に提供されるポリペプチド配列から選択される。配列番号１および３〜７のアラインメントは、図１５に提供されている。

特に興味深い改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、配列番号１６１〜１６９を含んでなる（例えば、それらからなる）タンパク質である。

特に興味深いポリヌクレオチドは、上で論じられたＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株に対応する野生型配列に由来するポリヌクレオチド（例えば、配列番号２またはその関係するＥ．ｃｏｌｉコドンに最適化された配列番号１６０に由来するポリヌクレオチド）である。

組み合わせ
本発明の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質（または関連するポリヌクレオチド）を含んでなる配列は、免疫原性を増強するようにまたは他の点においてこれらの抗原を改善するように設計された他の成分をさらに含んでなり得る。例えば、そのポリペプチド抗原の改善された単離は、その抗原の片端に一続きのヒスチジン残基（一般にｈｉｓ−タグとして知られる）を付加することによって容易になることがある。

用語「ｈｉｓ−タグ」とは、参照配列内に挿入されるヒスチジン残基の鎖、典型的には、６残基のことを指す。参照配列に関連する活性の破壊を最小にするために、ｈｉｓ−タグは、典型的には、通常、開始メチオニン残基の直後のＮ末端に挿入されるか、またはＣ末端に挿入される。それらは、通常、天然配列に対して異種であるが、固定化された金属アフィニティークロマトグラフィ樹脂（ＩＭＡＣ）へのそのタンパク質の結合を改善することによって単離を容易にするので、組み込まれる。一般的に言えば、ｈｉｓ−タグの有無は、参照タンパク質に対する望ましい免疫応答の誘発の観点からすると重要ではない。しかしながら、そのｈｉｓ−タグ自体に対する有害反応のリスクを回避するために、ｈｉｓ−タグの長さを最も短くすること、例えば、４残基もしくはそれ以下、特に、２残基にすること、または完全にｈｉｓ−タグの使用を排除することが最もよく考慮される。

誘発される免疫応答組成物の大きさおよび／または幅を改善するために、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（特に、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来の複数の改変されたＲｖ３６１６ｃ配列および／または追加の異種ポリペプチドもしくはそれらをコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリペプチド（およびそれらをコードする核酸）が調製され得る。

当業者は、いくつかの成分が組み合わされて利用されるとき、その厳密な提供が多様になり得ることを認識するだろう。例えば、改変されたＲｖ３６１６ｃ配列成分、およびその抗原の追加のコピーまたは追加の異種抗原成分が、
（１）２つの個別のポリペプチド成分として、
（２）両方のポリペプチド成分を含んでなる融合タンパク質として、
（３）１つのポリペプチドおよび１つのポリヌクレオチド成分として、
（４）２つの個別のポリヌクレオチド成分として、
（５）２つの個別のポリペプチド成分をコードする単一のポリヌクレオチドとして、または
（６）両方のポリペプチド成分を含んでなる融合タンパク質をコードする単一のポリヌクレオチドとして
提供され得る。

この適応性は、３つ以上の成分が組み合わされて使用される状況に等しく適用される。しかしながら、便宜上、いくつかの成分が存在するとき、それらが単一の融合タンパク質内、または単一の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド内に含められることが望ましいことが多い。本発明の１つの実施形態において、すべての抗原成分が、ポリペプチドとして（例えば、単一の融合タンパク質内に）提供される。本発明の代替の実施形態では、すべての抗原成分は、ポリヌクレオチド（例えば、単一のポリヌクレオチド、例えば、単一の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）として提供される。

核酸の一部に関して使用されるときの用語「異種」は、その核酸が、天然では互いに対してその関係性で見られない２つ以上の部分配列を含んでなることを示す。例えば、その核酸は、新しい機能的核酸をもたらすように配置された無関係の遺伝子由来の２つ以上の配列（例えば、１つの起源由来のプロモーターおよび別の起源由来のコード領域）を有する状態で、典型的には組換え的に生成される。同様に、異種タンパク質は、そのタンパク質が、天然では互いに対してその関係性で見られない２つ以上の部分配列を含んでなること（例えば、融合タンパク質）を示す。

「融合ポリペプチド」または「融合タンパク質」とは、直接またはアミノ酸リンカーを介して共有結合的に連結された少なくとも２つの異種ポリペプチド（例えば、少なくとも２つのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ポリペプチド）を有するタンパク質のことを指す。融合タンパク質を形成するポリペプチドは、典型的には、Ｃ末端側とＮ末端側とが連結されるが、それらは、Ｃ末端側とＣ末端側、Ｎ末端側とＮ末端側、またはＮ末端側とＣ末端側とも連結され得る。融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順序であり得る。この用語は、融合タンパク質を構成する抗原の、保存的に改変されたバリアント、多型バリアント、対立遺伝子、変異体、免疫原性フラグメントおよび種間ホモログのことも指す。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓゲノムの全体を開示しているＣｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９３：５３７（１９９８）に記載されている。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原に対応する他のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種由来の抗原は、例えば、本明細書中に記載されるような配列比較アルゴリズム、または当業者に公知の他の方法、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイおよび抗体結合アッセイを用いて、同定され得る。

用語「融合された」とは、融合タンパク質における２つのポリペプチド間の共有結合のことを指す。それらのポリペプチドは、典型的には、互いに直接、またはアミノ酸リンカーを介して、ペプチド結合によって連結される。必要に応じて、それらのペプチドは、当業者に公知の非ペプチド共有結合を介して連結され得る。

改変されたＲｖ３６１６ｃ配列と併用され得る例示的なＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原は、以下のうちの１つ以上（例えば、１〜５つ、例えば、１〜３つ、特に、１つ）が挙げられる：
（ｉ）Ｍｔｂ８．４（ＤＰＶおよびＲｖ１１７４ｃとしても知られる）（このポリペプチド配列は、ＷＯ９７／０９４２８の配列番号１０２（配列番号１０１にはｃＤＮＡ）およびＣｏｌｅｒ ｅｔ ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９８ １６１：２３５６−２３６４に記載されている）。リーディングシグナルペプチド（すなわち、ＷＯ９７／０９４２８の配列番号１０２のアミノ酸残基１５〜９６）が存在しない成熟Ｍｔｂ８．４配列が、特に興味深い。Ｍｔｂ８．４の完全長ポリペプチド配列は、配列番号８に示されている；
（ｉｉ）Ｍｔｂ９．８（ＭＳＬおよびＲｖ０２８７としても知られる）（このポリペプチド配列は、ＷＯ９８／５３０７５の配列番号１０９（ＭＳＬのフラグメントは、ＷＯ９８／５３０７５の配列番号１１０〜１２４に開示されており、配列番号１１９および１２０が特に興味深い）、また、Ｃｏｌｅｒ ｅｔ ａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ ２００９ ２７：２２３−２３３（特に、この中の図２に示されている反応性フラグメント）に記載されている）。Ｍｔｂ９．８に対する完全長ポリペプチド配列は、配列番号９に示されている；
（ｉｉｉ）Ｍｔｂ９．９（Ｍｔｂ９．９Ａ、ＭＴＩ、ＭＴＩ−ＡおよびＲｖ１７９３としても知られる）（このポリペプチド配列は、ＷＯ９８／５３０７５の配列番号１９およびＡｌｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０００ ７：５５１−５５９に記載されている（ＭＴＩのフラグメントは、ＷＯ９８／５３０７５の配列番号１７および５１〜６６に開示されており、配列番号１７、５１、５２、５３、５６および６２〜６５が特に興味深い））。ＭＴＩのいくつかのポリペプチドバリアントは、ＷＯ９８／５３０７５の配列番号２１、２３、２５、２７、２９および３１ならびにＡｌｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０００ ７：５５１−５５９に記載されている。Ｍｔｂ９．９に対する完全長ポリペプチド配列は、配列番号１０に示されている；
（ｉｖ）Ｒａ１２（Ｍｔｂ３２Ａ Ｃ末端抗原としても知られる）（このポリペプチド配列は、ＷＯ０１／９８４６０の配列番号１０およびＳｋｅｉｋｙ ｅｔ ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００４ １７２：７６１８−７６８２に記載されている）。Ｒａ１２に対する完全長ポリペプチド配列は、配列番号１１に示されている；
（ｖ）Ｒａ３５（Ｍｔｂ３２Ａ Ｎ末端抗原としても知られる）（このポリペプチド配列は、ＷＯ０１／９８４６０の配列番号８およびＳｋｅｉｋｙ ｅｔ ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００４ １７２：７６１８−７６８２に記載されている）。Ｒａ３５に対する完全長ポリペプチド配列は、配列番号１２に示されている；
（ｖｉ）ＴｂＨ９（Ｍｔｂ３９、Ｍｔｂ３９Ａ、ＴｂＨ９ＦＬおよびＲｖ１１９６としても知られる）（このポリペプチド配列は、ＷＯ９７／０９４２８の配列番号１０７、ならびにまた、Ｄｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９９９ ６７（６）：２９４１−２９５０およびＳｋｅｉｋｙ ｅｔ ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００４ １７２：７６１８−７６８２に記載されている）。ＴｂＨ９に対する完全長ポリペプチド配列は、配列番号１３に示されている；
（ｖｉｉ）Ｍｔｂ４１（ＭＴＣＣ２およびＲｖ０９１５ｃとしても知られる）（このポリペプチド配列は、ＷＯ９８／５３０７５の配列番号１４２（配列番号１４０にはｃＤＮＡ）およびＳｋｅｉｋｙ ｅｔ ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０００ １６５：７１４０−７１４９に記載されている）。Ｍｔｂ４１に対する完全長ポリペプチド配列は、配列番号１４に示されている；
（ｖｉｉｉ）ＥＳＡＴ−６（ｅｓｘＡおよびＲｖ３８７５としても知られる）（このポリペプチド配列は、ＷＯ９７／０９４２８の配列番号１０３（配列番号１０４にはｃＤＮＡ）およびＳｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９９５ ６３（５）：１７１０−１７１７に記載されている）。ＥＳＡＴ−６に対する完全長ポリペプチド配列は、配列番号１５に示されている；
（ｉｘ）Ａｇ８５複合抗原（例えば、ｆｂｐＡおよびＲｖ３８０４ｃとしても知られるＡｇ８５Ａ；またはｆｂｐＢおよびＲｖ１８８６ｃとしても知られるＡｇ８５Ｂ）（これは、例えば、Ｃｏｎｔｅｎｔ ｅｔ ａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９９１ ５９：３２０５−３２１２およびＨｕｙｇｅｎ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９６ ２（８）：８９３−８９８において述べられている）。Ａｇ８５Ａに対する完全長ポリペプチド配列は、配列番号１６に示されている（残基４３〜３３８の成熟タンパク質、すなわち、シグナルペプチドを欠くタンパク質が、特に興味深い）。Ａｇ８５Ｂに対する完全長ポリペプチド配列は、配列番号１７に示されている（残基４１〜３２５の成熟タンパク質、すなわち、シグナルペプチドを欠くタンパク質が、特に興味深い）；
（ｘ）アルファ−クリスタリン（ｈｓｐＸおよびＲｖ２０３１ｃとしても知られる）（これは、Ｖｅｒｂｏｎ ｅｔ ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １９９２ １７４：１３５２−１３５９およびＦｒｉｓｃｉａ ｅｔ ａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９５ １０２：５３−５７に記載されている（残基７１〜９１、２１〜４０、９１〜１１０および１１１〜１３０に対応するフラグメントが特に興味深い））。アルファ−クリスタリンに対する完全長ポリペプチド配列は、配列番号１８に示されている；
（ｘｉ）Ｍｐｔ６４（Ｒｖ１９８０ｃとしても知られる）（これは、Ｒｏｃｈｅ ｅｔ ａｌ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９６ ４３：６６２−６７０に記載されている）。ＭＰＴ６４に対する完全長ポリペプチド配列は、配列番号１９に示されている（残基２４〜２２８の成熟タンパク質、すなわち、シグナルペプチドを欠くタンパク質が、特に興味深い）：
（ｘｉｉ）Ｍｔｂ３２Ａ（このポリペプチド配列は、ＷＯ０１／９８４６０の配列番号２（完全長）および配列番号４の残基８〜３３０（成熟）に記載されており、特に、少なくとも１つの変異した触媒三残基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒｉａｄ ｍｕｔａｔｅｄ）（例えばアラニンに変異され得る、例えば触媒セリン残基）を有するバリアントである）。Ｍｔｂ３２Ａに対する完全長ポリペプチド配列は、配列番号２０に示されている。Ｓｅｒ／Ａｌａ変異を有するＭｔｂ３２Ａの成熟型は配列番号２１に示されている；
（ｘｉｉｉ）ＴＢ１０．４（ＴＢ１０．４に対する完全長ポリペプチド配列は、配列番号２２に示されている）；
（ｘｉｖ）Ｒｖ１７５３ｃ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ由来のＲｖ１７５３ｃに対する完全長ポリペプチド配列は、配列番号１５７に示されている）；
（ｘｖ）Ｒｖ２３８６ｃ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ由来のＲｖ２３８６ｃに対する完全長ポリペプチド配列は、配列番号１５８に示されている）；および／もしくは
（ｘｖｉ）Ｒｖ２７０７ｃ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ由来のＲｖ２７０７ｃに対する完全長ポリペプチド配列は、配列番号１５９に示されている）
またはそれらの組み合わせ、例えば：
（ａ）Ｒａ１２、ＴｂＨ９およびＲａ３５成分の組み合わせ（例えば、Ｍｔｂ７２ｆなどの融合タンパク質の形態）。Ｍｔｂ７２ｆのポリペプチド配列は、ＷＯ２００６／１１７２４０の配列番号６（配列番号５にはｃＤＮＡ）およびＳｋｅｉｋｙ ｅｔ ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００４ １７２：７６１８−７６８２に記載されている（ここで、Ｍｔｂ７２ｆは、精製を助ける随意のＨｉｓ−タグを組み込んでいるが、本発明において利用されるときは、好適には、随意のヒスチジン残基を有しない）。Ｍｔｂ７２ｆに対するポリペプチド配列は、配列番号２３に示されている；
（ｂ）Ｒａ１２、ＴｂＨ９およびＳｅｒ／Ａｌａ変異Ｒａ３５（すなわち、その触媒セリン残基はアラニンで置換されている）成分の組み合わせ（例えば、Ｍ７２などの融合タンパク質の形態）。Ｍ７２のポリペプチド配列は、ＷＯ２００６／１１７２４０の配列番号４（配列番号３にはｃＤＮＡ）に記載されている（ここで、Ｍ７２は、製造を助ける随意の２つ続きのヒスチジンを組み込んでおり、本発明において利用されるときも２つ続きのヒスチジンを組み込んでもよいが、好適には、Ｍ７２は、随意の２つ続きのヒスチジンを有しない）（すなわち、ＷＯ２００６／１１７２４０の配列番号４の残基４〜７２５が特に興味深い）。Ｍ７２に対するポリペプチド配列は、配列番号２４に示されている；
（ｃ）Ｍｔｂ８．４、Ｍｔｂ９．８、Ｍｔｂ９．９およびＭｔｂ４１成分の組み合わせ（例えば、Ｍｔｂ７１ｆなどの融合タンパク質の形態）。Ｍｔｂ７１ｆのポリペプチド配列は、ＷＯ９９／０５１７４８の配列番号１６（配列番号１５にはｃＤＮＡ）に記載されている（ここで、Ｍｔｂ７１ｆは、精製を助ける随意のＨｉｓ−タグを組み込んでおり、Ｍｔｂ７１ｆは、本発明において利用されるとき、好適には、ＷＯ９９／０５１７４８の配列番号１６のアミノ酸残基９〜７１０に対応する）。Ｍｔｂ７１ｆに対するポリペプチド配列は、配列番号２５に示されている；
（ｄ）Ｍｔｂ９．８およびＭｔｂ９．９とＭｔｂ７２ｆまたはＭ７２（好適には、発現を助ける随意のヒスチジン残基を含まない）との組み合わせ（例えば、融合タンパク質として）。Ｍ７２−Ｍｔｂ９．９−Ｍｔｂ９．８融合物に対するポリペプチド配列は、配列番号２６に示されており（Ｍ９２融合物）、Ｍ７２−Ｍｔｂ９．９−Ｍｔｂ９．８融合物は、本発明において使用されるとき、製造を助けるために、必要に応じて開始メチオニン残基の後に２つ続きのヒスチジンを組み込んでもよい；
（ｅ）Ａｇ８５ＢとＭｔｂ７２ｆまたはＭ７２（好適には、発現を助ける随意のヒスチジン残基を含まない）との組み合わせ（例えば、Ｍｔｂ１０３ｆなどの融合タンパク質として）。Ｍｔｂ１０３ｆのポリペプチド配列は、ＷＯ０３／０７０１８７の配列番号１８（配列番号１０にはｃＤＮＡ）に記載されている（ここで、Ｍｔｂ１０３ｆは、精製を助ける随意のＨｉｓ−タグを組み込んでおり、Ｍｔｂ１０３ｆは、本発明において利用されるとき、好適には、ＷＯ０３／０７０１８７の配列番号１８のアミノ酸残基８〜１０１６に対応する）。Ｍ１０３、すなわち、Ｒａ３５成分中にＳｅｒ／Ａｌａ変異を組み込んでいるＭｔｂ１０３ｆも特に興味深い（Ｍ１０３は、本発明において利用されるとき、好適には、ＷＯ０３／０７０１８７の配列番号１８のアミノ酸残基８〜１０１６に対応し、ここで、７１０位のＳｅｒ残基は、Ａｌａで置換されている）。Ｍ１０３に対するポリペプチド配列は、配列番号２７に示されている（Ｍ７２−Ｍｔｂ９．９−Ｍｔｂ９．８融合物は、本発明において使用されるとき、製造を助けるために、必要に応じて開始メチオニン残基の後に２つ続きのヒスチジンを組み込んでもよい）；
（ｆ）Ｍｔｂ４１とＭｔｂ７２ｆまたはＭ７２（好適には、発現を助ける随意のヒスチジン残基を含まない）との組み合わせ（例えば、Ｍｔｂ１１４ｆなどの融合タンパク質として）。Ｍｔｂ１１４ｆのポリペプチド配列は、ＷＯ０３／０７０１８７の配列番号１６（配列番号９にはｃＤＮＡ）に記載されている（ここで、Ｍｔｂ１１４ｆは、精製を助ける随意のＨｉｓ−タグを組み込んでおり、Ｍｔｂ１１４ｆは、本発明において利用されるとき、好適には、ＷＯ０３／０７０１８７の配列番号１６のアミノ酸残基８〜１１５４に対応する）。Ｍ１１４、すなわち、Ｒａ３５成分中にＳｅｒ／Ａｌａ変異を組み込んでいるＭｔｂ１１４ｆも特に興味深い（Ｍ１１４は、本発明において利用されるとき、好適には、ＷＯ０３／０７０１８７の配列番号１６のアミノ酸残基８〜１１５４に対応し、ここで、７１０位のＳｅｒ残基は、Ａｌａで置換されている）。Ｍ１１４に対するポリペプチド配列は、配列番号２８に示されている（Ｍ７２−Ｍｔｂ９．９−Ｍｔｂ９．８融合物は、本発明において使用されるとき、製造を助けるために、必要に応じて、開始メチオニン残基の後に２つ続きのヒスチジンを組み込んでもよい）；
（ｇ）Ａｇ８５ＢおよびＥＳＡＴ−６成分の組み合わせ（例えば、Ｄｏｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２００４ １９０：２１４６−２１５３に記載されている融合物として）；および／または
（ｈ）Ａｇ８５ＢおよびＴＢ１０．４成分の組み合わせ（例えば、Ｄｉｅｔｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００５ １７４（１０）：６３３２−６３３９ １９０：２１４６−２１５３に記載されている融合物として）。

改変されたＲｖ３６１６ｃ配列成分とＲｖ１７５３ｃ成分との組み合わせが、特に興味深い。言うまでもなく、そのような組み合わせは、必要に応じて、他の追加の抗原成分（例えば、Ｍ７２成分）を含んでもよい。

興味深い別の組み合わせは、改変されたＲｖ３６１６ｃ配列成分およびＭ７２成分を含んでなる。

興味深いさらなる組み合わせは、改変されたＲｖ３６１６ｃ配列成分およびＲｖ２３８６ｃ成分を含んでなる。

興味深い他の組み合わせには、改変されたＲｖ３６１６ｃ配列成分およびＲｖ２７０７ｃ成分を含んでなる組み合わせが含まれる。

興味深い追加の組み合わせは、改変されたＲｖ３６１６ｃ配列成分およびアルファ−クリスタリン成分を含んでなる。

当業者は、組み合わせが、（ｉ）〜（ｘｖｉ）および（ａ）〜（ｈ）として上に記載された特定の配列に依存する必要がないこと、および記載された配列の保存的に改変されたバリアント（例えば、少なくとも７０％の同一性（例えば、少なくとも８０％の同一性、特に、少なくとも９０％の同一性、特に、少なくとも９５％の同一性）を有する）または免疫原性フラグメント（例えば、完全長抗原の少なくとも２０％（例えば、抗原の少なくとも５０％、特に、少なくとも７０％、特に、少なくとも８０％））を使用することにより、同じ実際的な効果を達成することができることを認識するだろう。

上記の個別の抗原配列の各々は、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ １９９８ ３９３：５３７−５４４およびＣａｍｕｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００２ １４８：２９６７−２９７３にも開示されている。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖのゲノムは、例えば、Ｗｅｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイト（ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｍ＿ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ／）などで公的に入手可能である。

上記抗原の多くは、米国特許出願番号０８／５２３，４３５、０８／５２３，４３６、０８／６５８，８００、０８／６５９，６８３、０８／８１８，１１１、０８／８１８，１１２、０８／９４２，３４１、０８／９４２，５７８、０８／８５８，９９８、０８／８５９，３８１、０９／０５６，５５６、０９／０７２，５９６、０９／０７２，９６７、０９／０７３，００９、０９／０７３，０１０、０９／２２３，０４０、０９／２８７，８４９ならびにＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１０４０７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１０５１４、ＰＣＴ／ＵＳ９９／０３２６５、ＰＣＴ／ＵＳ９９／０３２６８、ＰＣＴ／ＵＳ９９／０７７１７、ＷＯ９７／０９４２８およびＷＯ９７／０９４２９、ＷＯ９８／１６６４５、ＷＯ９８／１６６４６（これらの各々は、本明細書で参考として援用される）にも開示されている。

本発明の組成物、ポリペプチドおよび核酸は、他の起源由来の追加のポリペプチドも含んでもよい。例えば、本発明の組成物および融合タンパク質は、ポリペプチド、またはポリペプチドをコードする核酸を含んでよく、ここで、そのポリペプチドは、抗原、例えば、インフルエンザウイルスタンパク質であるＮＳ１の発現を増大させる（例えば、ＷＯ９９／４０１８８およびＷＯ９３／０４１７５を参照のこと）。

本発明の核酸は、最適な種、例えば、ヒト（インビボ発現の場合）または特定の細菌（ポリペプチド生成の場合）におけるコドン選択性に基づいて操作することができる。例えば、配列番号１６０は、Ｈ３７Ｒｖ由来のＲｖ３６１６ｃをＥ．ｃｏｌｉにおいて発現するためにコドンが最適化されたポリヌクレオチドを提供する。

改変されたＲｖ３６１６ｃ配列成分は、結核（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染）に対して有効な１つ以上の化学療法剤とともに投与されてもよい。そのような化学療法剤の例としては、アミカシン、アミノサリチル酸、カプレオマイシン、サイクロセリン、エタンブトール、エチオナミド、イソニアジド、カナマイシン、ピラジナミド、リファマイシン（すなわち、リファンピン、リファペンチンおよびリファブチン）、ストレプトマイシン、オフロキサシン、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシンおよびフルオロキノロンが挙げられるが、これらに限定されない。そのような化学療法は、好ましい薬剤の組み合わせを用いる治療医の判断によって決定される。薬剤耐性でない結核（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染）を治療するために使用される「第一選択」化学療法剤としては、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、ストレプトマイシンおよびピラジナミドが挙げられる。１つ以上の「第一選択」薬に対して薬剤耐性を示している結核（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染）を治療するために使用される「第二選択」化学療法剤としては、オフロキサシン、シプロフロキサシン、エチオナミド、アミノサリチル酸、サイクロセリン、アミカシン、カナマイシンおよびカプレオマイシンが挙げられる。

従来の化学療法剤は、一般に、比較的長期間（およそ９ヶ月間）にわたって投与される。従来の化学療法剤と、本発明に係る改変されたＲｖ３６１６ｃ配列成分の投与との組み合わせによって、効力を低下させることなく化学療法の治療期間を短くする（例えば、８ヶ月、７ヶ月、６ヶ月、５ヶ月、４ヶ月、３ヶ月またはそれ以下に）ことができる可能性がある。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）と組み合わせた、改変されたＲｖ３６１６ｃ配列成分の使用が、特に興味深い。例えば、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を組換え的に発現する改変されたＢＣＧの形態において。あるいは、改変されたＲｖ３６１６ｃ配列成分を使用することにより、同時投与によって、または以前のＢＣＧワクチン接種を追加免疫することによって、ＢＣＧワクチン接種に対する被験体の応答が増強されることがある。改変されたＲｖ３６１６ｃ配列成分は、ＢＣＧワクチン接種に対する被験体の応答を増強するために使用されるとき、言うまでもなく、ポリペプチドの形態で提供されてもよいし、ポリヌクレオチドの形態で提供されてもよい（必要に応じて、上に記載されたような追加の抗原性成分とともに）。

当業者は、成分の組み合わせが、一緒に投与される必要がなく、かつ：別個にまたは組み合わせて；同時に、連続的に、または短期間内に；同じ経路で、または異なる経路で、適用され得ることを認識するだろう。それにもかかわらず、便宜上、一般には、成分の組み合わせを単一組成物として投与することが望ましい（投与レジメンが適合性である場合）。

本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび組成物は、通常、ヒトに投与されるが、他の哺乳動物（飼いならされた哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、チンチラ）および農業用の哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）を含む）においても有効であると予想され得る。

（バリアント）
Ｔ細胞エピトープは、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞）によって認識される、アミノ酸の短い連続した一続きである。Ｔ細胞エピトープの同定は、当業者に周知のエピトープマッピング実験によって行われ得る（例えば、Ｐａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，２４３−２４７（１９９３）；Ｂｅｉｓｓｂａｒｔｈ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００５ ２１（Ｓｕｐｐｌ．１）：ｉ２９−ｉ３７を参照のこと）。あるいは、エピトープは、実施例において論じられるアプローチを用いて予測またはマッピングされてもよい。

多様な非近交系集団（例えば、ヒト）において、異なるＨＬＡタイプは、特定のエピトープが、その集団のすべてのメンバーによって認識されないかもしれないことを意味する。Ｔ細胞応答が結核において決定的に関与する結果として、最適な改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、認識のレベルおよび免疫応答のスケールを最大にするために、大部分の（または好適にはすべての）インタクトなＴ細胞エピトープを含むタンパク質である。

「バリアント」または「保存的に改変されたバリアント」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変されたバリアントとは、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸のことを指すか、またはその核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は本質的に同一の配列のことを指す。

遺伝暗号の縮重に起因して、多数の機能的に同一の核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸のアラニンをコードする。したがって、あるコドンによってアラニンが指定されるすべての位置において、そのコドンは、コードされるポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸のバリエーションによって、保存的に改変されたバリエーションの１種である「サイレント」または「縮重」バリアントがもたらされる。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列は、その核酸の可能性のあるすべてのサイレントバリエーションも記載する。当業者は、核酸における各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変することにより、機能的に同一の分子を得ることができることを認識するだろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションは、記載される各配列の中に暗に含まれる。

非サイレントバリエーションは、コードされるアミノ酸配列を変更する（アミノ酸残基の置換、欠失または付加のいずれかによって）バリエーションである。当業者は、特定のポリヌクレオチド配列が、サイレントバリエーションと保存的な非サイレントバリエーションの両方を含み得ることを認識するだろう。

タンパク質配列のバリアントに関しては、当業者は、ポリペプチドに対する個別の置換、欠失または付加（単一のアミノ酸または低パーセンテージのアミノ酸を変更させるか、付加するかまたは削除するものである）が、その変更によって、機能的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換、またはバリアントの生物学的機能に実質的に影響しない残基の置換／欠失／付加をもたらす「保存的に改変されたバリアント」であることを認識するだろう。

機能的に類似のアミノ酸を提供している保存的置換の表は、当該分野で周知である。そのような保存的に改変されたバリアントは、本発明の多型バリアント、種間ホモログおよび対立遺伝子に加えられ、それらを排除しない。

一般に、そのような保存的置換は、下記に明記されるアミノ酸分類のうちの１つに含まれるが、いくつかの状況では、抗原の免疫原性特性に実質的に影響せずに他の置換が可能であり得る。以下の８つの群の各々は、互いにとって典型的に保存的置換であるアミノ酸を含んでなる：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １９８４を参照のこと）。

好適には、そのような置換は、エピトープの領域には存在せず、ゆえに、その抗原の免疫原性特性に対して有意な影響を有しない。

タンパク質バリアントには、参照配列と比べて追加のアミノ酸が挿入されたバリアントも含まれることがある。好適には、そのような挿入は、エピトープの領域には存在せず、ゆえに、その抗原の免疫原性特性に対して有意な影響を有しない。挿入の一例としては、対象の抗原の発現および／または精製を助ける短い一続きのヒスチジン残基（例えば、２〜６残基）が挙げられる。

タンパク質バリアントには、参照配列と比べてアミノ酸が削除されているバリアントが含まれる。好適には、そのような欠失は、エピトープの領域には存在せず、ゆえに、その抗原の免疫原性特性に対して有意な影響を有しない。

当業者は、特定のタンパク質バリアントが、置換、欠失および付加（またはそれらの任意の組み合わせ）を含み得ることを認識するだろう。

２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における用語「同一」またはパーセント「同一性」とは、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いてまたは手作業でのアラインメントおよび目視検査によって測定される、比較範囲または指定領域にわたって比較され、対応が最大となるようにアラインメントされたときに、全く同じであるか、または指定のパーセンテージの全く同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチド（すなわち、指定領域にわたって、７０％の同一性、必要に応じて、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性）を有する、２つ以上の配列または部分配列のことを指す。そのような配列は、「実質的に同一」と言われる。この定義は、試験配列の相補鎖（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）にも当てはまる。必要に応じて、少なくとも約２５〜約５０アミノ酸長もしくはヌクレオチド長の領域にわたって、または必要に応じて、７５〜１００アミノ酸長もしくはヌクレオチド長の領域にわたって、同一性が存在する。好適には、参照配列の全体の長さに対応する範囲にわたって比較が行われる（バリアント配列とは対照的に）。

配列比較の場合、典型的には、１つの配列が、試験配列と比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列および参照配列が、コンピュータに入力され、必要であれば部分配列座標が指定され、そして配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトのプログラムパラメータを使用することもできるし、代替のパラメータを指定することもできる。次いで、その配列比較アルゴリズムが、そのプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。

本明細書中で使用される「比較範囲」は、ある配列と参照配列とが最適にアラインメントされた後にそのある配列が同じ数の連続した位置からなる参照配列と比較され得る、セグメントのことを指す。比較するための配列のアラインメント方法は、当該分野で周知である。比較するための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のローカルホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のホモロジーアラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または手作業によるアラインメントおよび目視検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照のこと）によって、行うことができる。

有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、関係性およびパーセント配列同一性を示すプログレッシブペアワイズアラインメントを用いて関係する配列の一群から複数の配列アラインメントを作成する。ＰＩＬＥＵＰはまた、そのアラインメントを作成するために使用されたクラスタリング関係を示すツリーまたはデンドログラム（ｄｅｎｄｏｇｒａｍ）で表す。ＰＩＬＥＵＰは、単純化されたＦｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０（１９８７）のプログレッシブアラインメント法を使用する。使用される方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３（１９８９）によって記載された方法に類似している。このプログラムは、最大３００個の配列（各々、５，０００ヌクレオチドまたはアミノ酸という最大長）をアラインメントすることができる。多重アラインメントの手順は、最も類似する２つの配列のペアワイズアラインメントから始まり、アラインメントされた２つの配列のクラスターが生成される。次いで、このクラスターが、次に最も関係する配列またはアラインメントされた配列のクラスターとアラインメントされる。２つの個別の配列のペアワイズアラインメントの単純な拡張によって、配列の２つのクラスターがアラインメントされる。最終的なアラインメントは、一連のプログレッシブペアワイズアラインメントによって行われる。このプログラムは、配列比較の領域に対する特定の配列およびそれらのアミノ酸またはヌクレオチドの座標を指定することによって、ならびにプログラムパラメータを指定することによって、実行される。ＰＩＬＥＵＰを用いるとき、以下のパラメータ：デフォルトのギャップウェイト（３．００）、デフォルトのギャップ長ウェイト（０．１０）および重み付けエンドギャップ（ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｅｎｄ ｇａｐｓ）を使用して、参照配列が他の試験配列と比較されて、パーセント配列同一性の関係が決定される。ＰＩＬＥＵＰは、ＧＣＧ配列解析ソフトウェアパッケージ、例えば、バージョン７．０（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５（１９８４）から入手することができる。

パーセント配列同一性および配列類似性の測定に適したアルゴリズムの別の例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９７７）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／のウェブサイト）を介して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列内の同じ長さのワードとアラインメントされるとき、マッチするかまたは何らかの正の数の閾値スコアＴを満たす、クエリー配列内の長さＷの短いワードを同定することによって高スコア配列対（ｈｉｇｈ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐａｉｒｓ）（ＨＳＰｓ）を同定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，前出）。これらの最初の近傍ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを発見する検索を開始するためのシードとして機能する。このワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（一対のマッチ残基に対するリワードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を用いて算出される。アミノ酸配列については、累積スコアはスコア行列を用いて算出される。累積アラインメントスコアが最高到達値から数量Ｘだけ低下したとき；負のスコアを有する１つ以上の残基アラインメントの累積に起因して累積スコアが０以下になったとき；またはいずれかの配列の末端に達したときは、各方向におけるワードヒットの伸長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータのＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）または１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、ワード長３および期待値（Ｅ）１０をデフォルトとして用い、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照のこと）は、アライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較をデフォルトとして用いる。

ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似度の統計解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似度の１つの尺度は、最小合計確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間でのマッチが偶然起き得る確率の指標を提供する。例えば、試験核酸と参照核酸との比較において最小合計確率が、約０．２未満、より好ましくは、約０．０１未満、最も好ましくは、約０．００１未満である場合、核酸は、参照配列に類似していると考えられる。

いずれにしても、ポリペプチド配列のバリアントは、参照配列と本質的に同じ活性を有する（ポリヌクレオチドの場合は、バリアントポリヌクレオチド配列は、参照配列と本質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードする）。本質的に同じ活性とは、リンパ球増殖による細胞の活性化、培養上清中のサイトカインの産生（ＥＬＩＳＡ、ＣＢＡなどによって測定される）、または細胞内染色および細胞外染色（例えば、免疫マーカー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＬ２、ＴＮＦａ、ＩＦＮｇ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ６９など）に特異的な抗体を使用した染色）の後のフローサイトメーターを用いた解析によるＴおよびＢ細胞応答の特徴づけを測定する、特異的抗原を用いたＰＢＭＣまたは全血のインビトロ再刺激アッセイ（例えば、数時間〜２週間（例えば、最大１日間、１日〜１週間または１〜２週間）の期間にわたる再刺激）における、参照配列の少なくとも５０％、好適には、少なくとも７５％、特に、少なくとも９０％の活性のことを意味する。好適には、本質的に同じ活性とは、Ｔ細胞増殖アッセイおよび／またはＩＦＮ−ガンマ産生アッセイにおける参照配列の少なくとも５０％、好適には、少なくとも７５％、特に、少なくとも９０％の活性のことを意味する。

当業者が理解するように、本発明において有用なポリヌクレオチドには、ゲノム配列、ゲノム外の配列およびプラスミドによってコードされる配列、ならびにタンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現するかまたは発現するように適合され得るより小さい操作された遺伝子セグメントが含まれ得る。そのようなセグメントは、もともと単離されているかもしれないし、人間の手によって合成的に改変されているかもしれない。

当業者が認識するように、ポリヌクレオチドは、一本鎖（コーディングまたはアンチセンス）または二本鎖であり得、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）またはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子には、ＨｎＲＮＡ分子（イントロンを含み、かつ１対１の様式でＤＮＡ分子に対応する）およびｍＲＮＡ分子（イントロンを含まない）が含まれる。追加のコード配列または非コード配列が、本発明のポリヌクレオチドの中に存在してもよいが、そのように存在しなくてもよく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材料に連結されていてもよいが、そのように連結されていなくてもよい。

ポリヌクレオチドは、天然配列（すなわち、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ抗原またはその一部をコードする内在性配列）を含んでもよいし、そのような配列のバリアントまたは生物学的等価物もしくは機能的等価物を含んでもよい。ポリヌクレオチドバリアントは、コードされるポリペプチドの免疫原性が、参照タンパク質と比べて低下しないように、１つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含んでもよい。

ポリヌクレオチドの同定および特徴づけ
ポリヌクレオチドは、種々の十分に確立された手法のいずれかを用いて、同定され得、調製され得、そして／または操作され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、下記でより詳細に記載されるように、ｃＤＮＡのマイクロアレイをスクリーニングすることによって、同定され得る。そのようなスクリーニングは、例えば、Ｓｙｎｔｅｎｉマイクロアレイ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を製造者の指示書に従って（および本質的にはＳｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１０６１４−１０６１９（１９９６）およびＨｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：２１５０−２１５５（１９９７）に記載されているように）使用して、行われ得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ細胞などの本明細書中に記載されるタンパク質を発現する細胞から調製されたｃＤＮＡから増幅され得る。そのようなポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅されてもよい。このアプローチのために、配列特異的プライマーが、本明細書中に提供される配列に基づいて設計され得、そして購入され得るか、または合成され得る。

ポリヌクレオチドの増幅された部分は、周知の手法を用いて好適なライブラリー（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃＤＮＡライブラリー）から完全長遺伝子を単離するために使用され得る。そのような手法の中で、ライブラリー（ｃＤＮＡまたはゲノム）は、増幅に適した１つ以上のポリヌクレオチドプローブまたはプライマーを用いてスクリーニングされる。好ましくは、より大きな分子を含むライブラリーは、サイズ選択される。遺伝子の５’領域および上流領域を同定するためには、ランダムプライム（Ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｄ）ライブラリーが好ましい場合もある。イントロンを得るため、および５’配列を伸長するためには、ゲノムライブラリーが好ましい。

ハイブリダイゼーション法の場合、ある部分配列が、周知の手法を用いて標識され得る（例えば、ニックトランスレーションまたは^３２Ｐによる末端標識）。次いで、一般に、細菌またはバクテリオファージのライブラリーが、変性された細菌コロニー（またはファージプラークを含む菌叢）を含むフィルターを標識プローブとハイブリダイズすることによってスクリーニングされる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２０００）を参照のこと）。ハイブリダイズしたコロニーまたはプラークが、選択され、増殖され、そしてそのＤＮＡが、さらなる解析のために単離される。ｃＤＮＡクローンを解析することにより、例えば、その部分配列由来のプライマーおよびそのベクター由来のプライマーを使用するＰＣＲによって、追加の配列の量を測定することができる。１つ以上の重複クローンを同定するために、制限酵素地図および一部の配列が生成され得る。次いで、標準的な手法を用いて、完全配列が決定され得る（その手法は、一連の欠失クローンの生成を含み得る）。次いで、得られた重複配列が、単一の連続した配列に組み立てられ得る。完全長ｃＤＮＡ分子は、周知の手法を用いて好適なフラグメントをライゲートすることによって、生成され得る。

あるいは、部分ｃＤＮＡ配列から完全長のコード配列を得るための増幅法が数多く存在する。そのような手法の中で、増幅は一般にＰＣＲによって行われる。種々の商業的に入手可能なキットのいずれかを用いて、増幅工程が行われ得る。プライマーは、例えば、当該分野で周知のソフトウェアを用いて、設計され得る。プライマーは、好ましくは、２２〜３０ヌクレオチド長であり、少なくとも５０％のＧＣ含有量を有し、約６８℃〜７２℃の温度で標的配列にアニールする。増幅された領域は、上に記載されたように配列決定され得、重複配列は、連続した配列に組み立てられ得る。

そのような増幅法の１つが、インバースＰＣＲであり（Ｔｒｉｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：８１８６（１９８８）を参照のこと）、これは、制限酵素を使用して、遺伝子の既知領域においてフラグメントを生成するものである。次いで、そのフラグメントを、分子内ライゲーションによって環状化し、既知領域から得られる互いに異なるプライマーとともにＰＣＲの鋳型として使用する。代替アプローチでは、ある部分配列に隣接する配列は、リンカー配列に対するプライマーおよび既知領域に特異的なプライマーを用いる増幅によって回収され得る。その増幅された配列は、典型的には、同じリンカープライマーおよびその既知領域に特異的な第２のプライマーを用いた２回目の増幅に供される。この手順に対する変法（既知配列から逆方向で伸長を開始する２種のプライマーを使用する方法）は、ＷＯ９６／３８５９１に記載されている。別のそのような手法は、「ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ」またはＲＡＣＥとして知られる。この手法は、ポリＡ領域またはベクター配列にハイブリダイズして既知配列の５’および３’である配列を同定する、内部プライマーおよび外部プライマーの使用を含む。さらなる手法としては、キャプチャーＰＣＲ（ｃａｐｔｕｒｅ ＰＣＲ）（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ．１：１１１−１９（１９９１））およびウォーキングＰＣＲ（ｗａｌｋｉｎｇ ＰＣＲ）（Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９：３０５５−６０（１９９１））が挙げられる。増幅を使用する他の方法も、完全長ｃＤＮＡ配列を得るために用いてよい。

ある特定の場合では、ＧｅｎＢａｎｋから利用可能な配列などの発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースに提供されている配列の解析によって完全長ｃＤＮＡ配列を得ることが可能である。重複ＥＳＴの検索は、一般に、周知のプログラム（例えば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ検索）を用いて行われ得、そのようなＥＳＴを用いることにより、連続した完全長配列が生成され得る。完全長ＤＮＡ配列は、ゲノムフラグメントの解析によっても得られる場合がある。

宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現
ポリペプチドまたはその融合タンパク質もしくは機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントを組換えＤＮＡ分子として使用することにより、適切な宿主細胞においてポリペプチドの発現が指示され得る。遺伝暗号固有の縮重に起因して、実質的に同じまたは機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が、生成されることがあり、これらの配列を、所与のポリペプチドをクローニングするためおよび発現させるために使用してもよい。

当業者が理解するように、場合によっては、天然に存在しないコドンを有する、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を生成することが、有益であることがある。例えば、特定の原核生物または真核生物の宿主によって好まれるコドンが選択されることにより、タンパク質の発現率を高めることができるか、または望ましい特性（例えば、天然に存在する配列から産生される転写物の半減期よりも長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写物を生成することができる。

さらに、種々の理由（クローニング、プロセシングおよび／または遺伝子産物の発現を改変する変更が挙げられるがこれらに限定されない）のためにポリペプチドのコード配列を変更するために、ポリヌクレオチド配列は、当該分野で一般に知られている方法を用いて操作され得る。例えば、ランダムな断片化によるＤＮＡシャフリング、ならびに遺伝子フラグメントおよび合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再集合（ＰＣＲ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ）が、ヌクレオチド配列を操作するために使用され得る。さらに、部位特異的突然変異誘発が、新しい制限酵素認識部位を挿入するため、グリコシル化パターンを変更するため、コドン選択性を変更するため、スプライスバリアントを生成するため、または変異を導入するためなどのために、使用され得る。

天然の、改変された、または組換えの核酸配列は、融合タンパク質をコードするために、異種配列にライゲートされることがある。例えば、ポリペプチド活性の阻害剤についてペプチドライブラリーをスクリーニングするために、商業的に入手可能な抗体が認識することができるキメラタンパク質をコードすることが有用である場合がある。融合タンパク質もまた、ポリペプチドのコード配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含めるために操作されることがあり、その結果、そのポリペプチドは、切断されて、異種部分から精製され得る。

所望のポリペプチドをコードする配列は、当該分野で周知の化学的方法を用いて全体的にまたは部分的に、合成され得る（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．ｐｐ．２１５−２２３（１９８０）、Ｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．ｐｐ．２２５−２３２（１９８０）を参照のこと）。あるいは、ポリペプチドのアミノ酸配列またはその一部を合成する化学的方法を用いてそのタンパク質自体が生成され得る。例えば、様々な固相法を用いてペプチド合成を行うことができ（Ｒｏｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２−２０４（１９９５））、自動化された合成は、例えば、ＡＢＩ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて行われ得る。

新しく合成されたペプチドは、分取高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（１９８３））または当該分野において利用可能な他の同等の手法によって、実質的に精製され得る。合成ペプチドの組成は、アミノ酸解析または配列決定（例えば、エドマン分解法）によって確かめられ得る。さらに、ポリペプチドのアミノ酸配列またはその任意の部分が、直接的な合成の間に変更されることにより、および／または化学的方法を用いて他のタンパク質由来の配列もしくはその任意の一部と組み合わされることにより、バリアントポリペプチドが生成され得る。

所望のポリペプチドを発現させるために、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはその機能的等価物は、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されるコード配列の転写および翻訳にとって必要なエレメントを含むベクターに挿入され得る。当業者に周知の方法を用いることにより、目的のポリペプチドをコードする配列ならびに適切な転写調節領域および翻訳調節領域を含む発現ベクターが構築され得る。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ法、合成法、およびインビボ遺伝的組換えが挙げられる。そのような手法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２０００）およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（毎年更新される）に記載されている。

ポリヌクレオチド配列を含めるためおよび発現させるために、種々の発現ベクター／宿主系を利用してよい。これらとしては、微生物（例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌）；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス，ＣａＭＶ；タバコモデルウイルス，ＴＭＶ）もしくは細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系；または動物細胞系が挙げられるが、これらに限定されない。

発現ベクターに存在する「調節領域」または「制御配列」は、宿主の細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を行う、ベクターの非翻訳領域（エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域）である。そのようなエレメントは、その強度および特異性が異なり得る。利用されるベクター系および宿主に応じて、任意の数の好適な転写エレメントおよび翻訳エレメント（構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む）が使用され得る。例えば、細菌系におけるクローニングのときは、誘導性プロモーター（例えば、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）のハイブリッドｌａｃＺプロモーターなど）が使用され得る。哺乳動物細胞系では、哺乳動物の遺伝子由来または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが、一般に好ましい。あるポリペプチドをコードする多コピーの配列を含む細胞株を作製する必要がある場合、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターが、適切な選択マーカーとともに都合よく使用され得る。

細菌系では、発現されるポリペプチドに対して意図された使用法に応じて、いくつかの発現ベクターが選択され得る。例えば、大量が必要とされるとき（例えば、抗体の誘導のために）、容易に精製される融合タンパク質の高レベル発現を指示するベクターが使用され得る。そのようなベクターとしては、多機能性のＥ．ｃｏｌｉクローニングベクターおよび発現ベクター（例えば、目的のポリペプチドをコードする配列が、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端のＭｅｔおよびその後の７残基に対する配列とインフレームでそのベクターにライゲートされ得、その結果、ハイブリッドタンパク質が生成される、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９（１９８９））；などが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）もまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着に続く、遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解された細胞から容易に精製され得る。そのような系において生成されるタンパク質は、ヘパリン、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され得、クローニングされた目的のポリペプチドを、自在にＧＳＴ部分から放出させることができる。

酵母であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、アルファ因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨ）を含むいくつかのベクターが使用され得る。構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含む他のベクターとしては、ＧＡＰ、ＰＧＫ、ＧＡＬおよびＡＤＨが挙げられる。概説として、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（前出）およびＧｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４（１９８７）およびＲｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．Ｙｅａｓｔ ８ ４２３−８８（１９９２）を参照のこと。

植物発現ベクターを使用する場合、ポリペプチドをコードする配列の発現は、任意のいくつかのプロモーターによって駆動され得る。例えば、ウイルスプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーター）が、単独で、またはＴＭＶ由来のオメガリーダー配列（Ｔａｋａｍａｔｓｕ，ＥＭＢＯ Ｊ．６：３０７−３１１（１９８７））と組み合わせて、使用され得る。あるいは、植物プロモーター（例えば、ＲＵＢＩＳＣＯプロモーターまたは熱ショックプロモーターの小サブユニット）を使用してもよい（Ｃｏｒｕｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．３：１６７１−１６８０（１９８４）；Ｂｒｏｇｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８−８４３（１９８４）；およびＷｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．１７：８５−１０５（１９９１））。これらの構築物は、直接的なＤＮＡ形質転換または病原体によって媒介されるトランスフェクションによって植物細胞に導入され得る。そのような手法は、いくつかの一般に入手可能な総説に記載されている（例えば、Ｈｏｂｂｓ ｉｎ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｐｐ．１９１−１９６（１９９２）を参照のこと）。

昆虫系もまた、目的のポリペプチドを発現させるために使用され得る。例えば、そのような１つの系において、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｌａｒｖａｅにおいて外来遺伝子を発現するベクターとして使用される。ポリペプチドをコードする配列は、そのウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）にクローニングされ得、ポリヘドリンプロモーターの支配下に置かれ得る。ポリペプチドをコードする配列の挿入が成功すると、ポリヘドリン遺伝子が非活性になり、コートタンパク質を欠く組換えウイルスが生成される。次いで、その組換えウイルスは、例えば、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｌａｒｖａｅを感染させるために使用され得、それらの細胞において目的のポリペプチドが発現され得る（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：３２２４−３２２７（１９９４））。

哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルスベースの発現系が一般に利用可能である。例えば、アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、目的のポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターおよびトリパータイト（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体にライゲートされ得る。そのウイルスゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域における挿入を用いることにより、感染した宿主細胞においてそのポリペプチドを発現することができる生存可能なウイルスが得られることがある（Ｌｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：３６５５−３６５９（１９８４））。さらに、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いることにより、哺乳動物宿主細胞において発現が増加し得る。アデノウイルスベクターを扱う方法およびプロトコルは、Ｗｏｌｄ，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１９９８に概説されている。アデノウイルスベクターの使用に関する追加の参考文献は、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：Ａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，Ｂｉｂｌｉｏｇｒａｐｈｙ，ａｎｄ Ａｎｎｏｔａｔｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｉｎｔｅｒｎｅｔ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ，２００４に見ることができる。

また、特定の開始シグナルも、目的のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を行うために使用され得る。そのようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。ポリペプチドをコードする配列、その開始コドンおよび上流配列が適切な発現ベクターに挿入される場合、追加の転写調節シグナルまたは翻訳調節シグナルは必要とされないことがある。しかしながら、コード配列またはその一部だけが挿入される場合は、ＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが提供されるべきである。さらに、その開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、正しい読み枠で存在するべきである。外来性の翻訳エレメントおよび開始コドンは、天然と合成の両方の様々な起源であってよい。発現効率は、使用される特定の細胞系にとって適切なエンハンサー（例えば、文献（Ｓｃｈａｒｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５−１６２（１９９４））に記載されているエンハンサー）を含めることによって高められ得る。

さらに、宿主細胞株は、挿入される配列の発現を調節する能力または発現されたタンパク質を所望の形式でプロセシングする能力について選択され得る。ポリペプチドのそのような修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が挙げられるが、これらに限定されない。正しい挿入、フォールディングおよび／または機能を促進するために、タンパク質の「プレプロ」型を切断する翻訳後プロセシングも使用してよい。そのような翻訳後の活性に対して特定の細胞機構および特徴的な機序を有する種々の宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷＩ３８）が、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするために選択され得る。

組換えタンパク質を長期間にわたって高収量で生成するために、安定した発現が一般に好ましい。例えば、目的のポリヌクレオチドを安定的に発現する細胞株が、ウイルス複製開始点および／または内在性の発現エレメントならびに選択マーカー遺伝子を同じベクターまたは別個のベクター上に含み得る発現ベクターを用いて形質転換され得る。そのベクターを導入した後、細胞は、強化培地中で１〜２日間生育された後、選択培地に切り替えられ得る。選択マーカーの目的は、選択に対する抵抗性を付与することであり、それが存在することによって、導入された配列を首尾よく発現する細胞の成長および回収が可能になる。安定的に形質転換された細胞の抵抗性のクローンは、その細胞型に適切な組織培養法を用いて増殖され得る。

任意の数の選択系が、形質転換された細胞株を回収するために使用され得る。これらとしては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１：２２３−３２（１９７７））およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２２：８１７−２３（１９９０））遺伝子（これらは、それぞれｔｋ．ｓｕｐ．−またはａｐｒｔ．ｓｕｐ．−細胞において使用され得る）が挙げられるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗物質、抗生物質または除草剤に対する抵抗性を、選択に対する原理として使用することができる；例えば、メトトレキサートに対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７７：３５６７−７０（１９８０））；アミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する抵抗性を付与するｎｐｔ（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４（１９８１））；ならびにそれぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する抵抗性を付与するａｌｓまたはｐａｔ（Ｍｕｒｒｙ，前出）。さらなる選択遺伝子、例えば、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするｔｒｐＢ、または細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用できるようにするｈｉｓＤが報告されている（Ｈａｒｔｍａｎ ＆ Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８０４７−５１（１９８８））。最近、可視マーカーの使用が好評を博しており、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質のＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質のルシフェリンのようなマーカーは、形質転換体を識別するためだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性のまたは安定したタンパク質発現の量を定量するためにも広く使用されている（Ｒｈｏｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：１２１−１３１（１９９５））。

マーカー遺伝子発現の存在／非存在によって、目的の遺伝子も存在することが示唆されるが、その存在および発現は、確かめられる必要がある場合がある。例えば、ポリペプチドをコードする配列が、マーカー遺伝子配列内に挿入されている場合、配列を含む組換え細胞は、そのマーカー遺伝子の機能が無くなることによって識別され得る。あるいは、マーカー遺伝子は、ポリペプチドをコードする配列と、単一のプロモーターの支配下にタンデムに配置され得る。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は、通常、タンデム型の遺伝子の発現も同様に示唆する。

あるいは、所望のポリヌクレオチド配列を含み、かつ発現する宿主細胞は、当業者に公知の種々の手順によって識別され得る。これらの手順としては、核酸またはタンパク質の検出および／または定量のための、膜、溶液またはチップに基づく技術を含む、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびタンパク質バイオアッセイ法またはイムノアッセイ法が挙げられるが、これらに限定されない。

ポリヌクレオチドによってコードされる産物に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いてその産物の発現を検出するためおよび測定するための種々のプロトコルが当該分野で公知である。例としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）が挙げられる。所与のポリペプチド上の２つの非干渉エピトープに反応性であるモノクローナル抗体を利用する２部位モノクローナルベースイムノアッセイが、一部の用途にとって好ましい場合があるが、競合結合アッセイも使用され得る。これらおよび他のアッセイは、特に、Ｈａｍｐｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）およびＭａｄｄｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１−１２１６（１９８３）に記載されている。

多種多様の標識および結合体化の手法が、当業者に公知であり、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにおいて使用され得る。ポリヌクレオチドに関係する配列の検出用の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプローブを生成するための手段としては、オリゴ標識（ｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｉｎｇ）、ニックトランスレーション、末端標識、または標識されたヌクレオチドを使用したＰＣＲ増幅が挙げられる。あるいは、それらの配列またはその任意の一部は、ｍＲＮＡプローブを生成するために、ベクターにクローニングされ得る。そのようなベクターは、当該分野で公知であり、商業的に入手可能であり、そのベクターを使用し、適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６）および標識されたヌクレオチドを加えることによって、ＲＮＡプローブがインビトロで合成され得る。これらの手順は、種々の商業的に入手可能なキットを用いて行われ得る。使用され得る好適なレポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、蛍光物質、化学発光物質または色素生産性物質、ならびに基質、補因子、阻害剤、磁気粒子などが挙げられる。

目的のポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、そのタンパク質の発現および細胞培養物からの回収に適した条件下で培養され得る。組換え細胞によって産生されたタンパク質は、使用される配列および／またはベクターに応じて、分泌され得るか、または細胞内に含まれ得る。当業者が理解するように、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、コードされるポリペプチドの原核細胞膜または真核細胞膜を通過した分泌を指示するシグナル配列を含むように設計され得る。目的のポリペプチドをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促進し得るポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に連結するために、使用してもよい。そのような精製促進ドメインとしては、金属キレートペプチド（例えば、固定化された金属における精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール）、固定化された免疫グロブリンにおける精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／親和性精製系において利用されるドメイン（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）が挙げられるが、これらに限定されない。切断可能なリンカー配列（例えば、ＸＡ因子またはエンテロキナーゼに特異的なリンカー配列（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．））を精製ドメインとコードされるポリペプチドとの間に含めることにより、精製が促進される場合がある。そのような発現ベクターの１つは、目的のポリペプチドと、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位に先行する６ヒスチジン残基をコードする核酸とを含む融合タンパク質の発現を提供する。そのヒスチジン残基は、Ｐｏｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３−２８１（１９９２）に記載されているようなＩＭＩＡＣ（固定化された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）における精製を促進し、一方、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質から所望のポリペプチドを精製するための手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターに関する討論は、Ｋｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：４４１−４５３（１９９３））に提供されている。

インビボにおけるポリヌクレオチド送達法
さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドの１つ以上を含む遺伝的構築物は、インビボで細胞に導入される。これは、種々のまたは周知の任意のアプローチを用いて行われ得、そのアプローチのいくつかは、例示目的で下記に概説される。

１．アデノウイルス
１つ以上の核酸配列のインビボ送達のための好ましい方法の１つとしては、アデノウイルス発現ベクターの使用が挙げられる。「アデノウイルス発現ベクター」は、（ａ）構築物のパッケージングを支持するために十分、および（ｂ）センス方向またはアンチセンス方向でその中にクローニングされたポリヌクレオチドを発現させるために十分なアデノウイルス配列を含む構築物を包含すると意味される。当然のことながら、アンチセンス構築物の文脈において、発現は、遺伝子産物が合成されることを必要としない。

この発現ベクターは、アデノウイルスの遺伝的に操作された形態を含む。３６ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスの遺伝子構成に関する知識により、アデノウイルスＤＮＡの大きな断片を最大７ｋｂの外来配列で置換することが可能である（Ｇｒｕｎｈａｕｓ ＆ Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９２）。レトロウイルスとは対照的に、アデノウイルスＤＮＡは、潜在的な遺伝毒性なしにエピソーム様式で複製することができるので、宿主細胞がアデノウイルスに感染しても染色体への組み込みは生じない。また、アデノウイルスは、構造的に安定であり、大規模に増幅した後もゲノム再配列が検出されていない。アデノウイルスは、実質的にすべての上皮細胞にその細胞周期の段階に関係なく感染することができる。これまで、アデノウイルス感染は、ヒトにおける急性呼吸器疾患などの軽度の疾患にしか関連づけられないとみられている。

アデノウイルスは、その中程度のサイズのゲノム、操作のしやすさ、高力価、広い標的細胞の範囲および高感染性を理由に、遺伝子トランスファーベクターとしての使用に特に適している。このウイルスゲノムの両端は、ウイルスＤＮＡの複製およびパッケージングに必要なｃｉｓエレメントである１００〜２００塩基対の逆方向反復（ＩＴＲ）を含む。このゲノムの初期（Ｅ）および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって分けられる異なる転写単位を含む。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよびいくつかの細胞遺伝子の転写の制御に関与するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現によって、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質が合成される。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現および宿主細胞シャットオフに関わる（Ｒｅｎａｎ，１９９０）。後期遺伝子の産物（ウイルスキャプシドタンパク質の大部分を含む）は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によって生じる単一の主要な転写物の重大なプロセシングの後にだけ発現される。ＭＬＰ，（１６．８ｍ．ｕ．に位置する）は、感染の後期において特に効率的であり、このプロモーターから生じたｍＲＮＡのすべてが、それらを翻訳にとって好ましいｍＲＮＡにする５’−トリパータイトリーダー（ＴＰＬ）配列を有する。

現在の系では、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの相同組換えから組換えアデノウイルスが作製される。２つのプロウイルスベクター間で組換えが生じる可能性に起因して、このプロセスから野生型アデノウイルスが作製されることがある。ゆえに、個別のプラークからウイルスの単一クローンを単離することおよびそのゲノム構造を調べることが不可欠である。

複製欠損である現在のアデノウイルスベクターの作製および増殖は、Ａｄ５ ＤＮＡフラグメントによってヒト胎児腎細胞から形質転換され、Ｅ１タンパク質を構成的に発現する、２９３と称される独特のヘルパー細胞株に依存する（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７７）。アデノウイルスゲノムのＥ３領域は必要ないので（Ｊｏｎｅｓ ＆ Ｓｈｅｎｋ，１９７８）、２９３細胞の助けを借りる現在のアデノウイルスベクターは、Ｅ１、Ｄ３またはその両方の領域に外来ＤＮＡを有する（Ｇｒａｈａｍ ＆ Ｐｒｅｖｅｃ，１９９１）。天然では、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約１０５％をパッケージングすることができる（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９８７）ことから、約２ｋＢ追加のＤＮＡを収容する能力を提供する。Ｅ１およびＥ３領域において置換可能な約５．５ｋＢのＤＮＡと組み合わせると、現在のアデノウイルスベクターの最大収容能力は、７．５ｋＢ未満、すなわちこのベクターの全長の約１５％未満である。アデノウイルスのウイルスゲノムの８０％超が、このベクター骨格に残っており、ベクターに由来する細胞傷害性の源である。また、Ｅ１が削除されたウイルスの複製欠損は、不完全である。例えば、現在利用可能なベクターを高い感染効率（ＭＯＩ）で用いたとき、ウイルス遺伝子発現の漏出が観察されている（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３）。

ヘルパー細胞株は、ヒト細胞（例えば、ヒト胎児腎細胞、筋細胞、造血細胞または他のヒト胚性間葉系細胞もしくは上皮細胞）に由来し得る。あるいは、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスに許容される他の哺乳動物種の細胞に由来してもよい。そのような細胞としては、例えば、Ｖｅｒｏ細胞または他のサル胚性間葉系細胞もしくは上皮細胞が挙げられる。上で述べたように、現在好ましいヘルパー細胞株は、２９３である。

Ｒａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）は、２９３細胞を培養するためおよびアデノウイルスを増殖するための改良方法を開示した。１つの形式では、１００〜２００ｍｌの培地を含む１リットルのシリコン処理されたスピナーフラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）に個別の細胞を接種することによって、天然の細胞集合体が生育される。４０ｒｐｍで撹拌した後、細胞生存率を、トリパンブルーを用いて推定する。別の形式では、Ｆｉｂｒａ−Ｃｅｌマイクロキャリア（Ｂｉｂｂｙ Ｓｔｅｒｌｉｎ，Ｓｔｏｎｅ，ＵＫ）（５ｇ／ｌ）を以下のとおり使用する。５ｍｌの培地に再懸濁された細胞接種材料を、２５０ｍｌ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ内のそのキャリア（５０ｍｌ）に加え、時々撹拌しながら１〜４時間静置する。次いで、培地を５０ｍｌの新鮮培地と交換し、振盪を開始する。ウイルスを産生させるために、細胞を約８０％コンフルエンスまで生育させた後、培地を交換し（最終体積の２５％に）、０．０５ＭＯＩでアデノウイルスを加える。培養物を一晩静置し、その後、体積を１００％に増加させ、さらに７２時間振盪を開始する。

アデノウイルスベクターが、複製欠損または少なくとも条件的に欠損でなければならないという要件以外に、アデノウイルスベクターの性質は、本発明の実施の成功にとって重大ではないと考えられる。アデノウイルスは、４２種の異なる既知の血清型または亜群Ａ〜Ｆのいずれであってもよい。５型アデノウイルスは、それについての生化学的情報および遺伝情報が多く知られていて、アデノウイルスをベクターとして使用しているほとんどの構築物に対して歴史的に使用されているヒトアデノウイルスであるので、本発明において使用するための条件的複製欠損アデノウイルスベクターを得るために、亜群Ｃの５型アデノウイルスが好ましい出発物質である。

上で述べたように、本発明に係る典型的なベクターは、複製欠損であり、アデノウイルスＥ１領域を有しない。したがって、Ｅ１コード配列が除去された位置に、目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入することが最も都合がよい。しかしながら、アデノウイルス配列内の構築物の挿入の位置は、本発明にとって重大でない。目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）によって報告されたようなＥ３置換ベクターにおいて、削除されたＥ３領域の代わりに挿入されてもよいし、ヘルパー細胞株またはヘルパーウイルスがＥ４欠損を補完する場合はＥ４領域の代わりに挿入されてもよい。

アデノウイルスは、生育しやすくかつ操作しやすく、インビトロおよびインビボにおいて広い宿主範囲を示す。この群のウイルスは、高力価、例えば、１０^９〜１０^１１プラーク形成単位／ｍｌで得ることができ、それらは高度に感染性である。アデノウイルスの生活環は、宿主細胞ゲノムへの組み込みを必要としない。アデノウイルスベクターによって送達される外来遺伝子は、エピソーム性であり、ゆえに、宿主細胞に対して低い遺伝毒性しか有しない。野生型アデノウイルスを用いたワクチン接種の研究において副作用は報告されていない（Ｃｏｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９６３；Ｔｏｐ ｅｔ ａｌ．，１９７１）ことから、インビボ遺伝子トランスファーベクターとしてのそれらの安全性および治療上の潜在能力が示されている。

アデノウイルスベクターは、真核生物の遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ ｅｔ ａｌ．，１９９２）およびワクチン開発（Ｇｒｕｎｈａｕｓ ＆ Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９２；Ｇｒａｈａｍ ＆ Ｐｒｅｖｅｃ，１９９２）において使用されている。最近、動物試験により、組換えアデノウイルスが遺伝子治療に使用することできると示唆された（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ ＆ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，１９９１；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。種々の組織に組換えアデノウイルスを投与する研究には、気管点滴注入（ｔｒａｃｈｅａ ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ）（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、末梢静脈内注射（Ｈｅｒｚ ＆ Ｇｅｒａｒｄ，１９９３）および脳への定位接種（ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）（Ｌｅ Ｇａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３）が含まれる。

アデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス起源であり得る。あるいは、それらは、他の種、例えば、チンパンジーのアデノウイルス起源であってもよく、そのアデノウイルスは、そのウイルスベクターが多くのヒト被験体内に循環しているヒトアデノウイルスに対する抗体によって中和されないという利点を有し得る（例えば：Ｔａｔｓｉｓ Ｎ ｅｔ ａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００６ １３：４２１−４２９を参照のこと）。

比較的珍しく、ゆえにそのベクター自体に対する既存の免疫が低レベルである３５型アデノウイルスは、開発中のある特定の結核ワクチンにおいて送達系として使用されている（例えば、Ｒａｄｏｓｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２００７ ７５（８）：４１０５−４１１５を参照のこと）。３５型アデノウイルスは、本発明においても送達ベクターとして特に価値があり得る。

２．レトロウイルス
レトロウイルスは、そのＲＮＡを逆転写のプロセスによって感染細胞内で二本鎖ＤＮＡに変換する能力を特徴とする一本鎖ＲＮＡウイルスの一群である（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。次いで、得られたＤＮＡは、プロウイルスとして細胞の染色体に安定に組み込まれ、ウイルスタンパク質の合成を指示する。その組み込みによって、レシピエント細胞およびその子孫においてそのウイルス遺伝子配列が保持される。レトロウイルスゲノムは、３つの遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含み、これらはそれぞれ、キャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素およびエンベロープ成分をコードする。ｇａｇ遺伝子の上流に見られる配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルを含む。２つの末端反復（ＬＴＲ）配列が、このウイルスゲノムの５’および３’末端に存在する。これらは、強力なプロモーターおよびエンハンサー配列を含み、宿主細胞ゲノムにおける組み込みにも必要とされる（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。

レトロウイルスベクターを構築するために、目的の１つ以上のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列をコードする核酸が、そのウイルスゲノム内のある特定のウイルス配列の位置に挿入されることにより、複製欠損であるウイルスが作製される。ビリオンを産生するために、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含むがＬＴＲおよびパッケージング成分を有しないパッケージング細胞株が構築される（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３）。レトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列とともにｃＤＮＡを含む組換えプラスミドがこの細胞株に導入されるとき（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、そのパッケージング配列によって、組換えプラスミドのＲＮＡ転写物をウイルス粒子にパッケージングすることが可能になり、次いでそのウイルス粒子は培養液中に分泌される（Ｎｉｃｏｌａｓ ＆ Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，１９８６；Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３）。次いで、組換えレトロウイルスを含む培地が回収され、必要に応じて濃縮され、遺伝子導入のために使用される。レトロウイルスベクターは、幅広い種類の細胞型に感染することができる。しかしながら、組み込みおよび安定した発現には、宿主細胞の分裂が必要である（Ｐａｓｋｉｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９７５）。

ウイルスエンベロープへのラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学修飾に基づく、レトロウイルスベクターの特異的な標的化を可能にするように設計された新規アプローチが、最近開発された。この修飾によって、シアロ糖タンパク質受容体を介した肝細胞への特異的な感染が可能になり得る。

レトロウイルスエンベロープタンパク質および特定の細胞受容体に対するビオチン化抗体を使用する、組換えレトロウイルスを標的化するための異なるアプローチが設計された。それらの抗体は、ストレプトアビジンを使用することにより、ビオチン成分を介して連結された（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。主要組織適合遺伝子複合体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体を用いるとき、インビトロにおいて、それらの表面抗原を有する種々のヒト細胞へのエコトロピックウイルスの感染が示された（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。

３．アデノ随伴ウイルス
ＡＡＶ（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｓｋａ，１９８４）は、アデノウイルスストックの汚染物質として発見されたパルボウイルス（ｐａｒｏｖｉｒｕｓ）である。これは、いかなる疾患にも関連づけられていない遍在ウイルスである（米国のヒト集団の８５％に抗体が存在する）。これは、その複製がアデノウイルスなどのヘルパーウイルスの存在に依存しているので、デペンドウイルスとしても分類される。５つの血清型が単離されており、そのうちＡＡＶ−２が最もよく特徴付けられている。ＡＡＶは、直径２０〜２４ｎｍの正二十面体ビリオンを形成するキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３内に包まれた一本鎖線状ＤＮＡを有する（Ｍｕｚｙｃｚｋａ ＆ ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，１９８８）。

ＡＡＶ ＤＮＡは、約４．７キロベース長である。それは、２つのオープンリーディングフレームを含み、２つのＩＴＲに隣接している。ＡＡＶゲノムには２つの主要な遺伝子：ｒｅｐおよびｃａｐが存在する。ｒｅｐ遺伝子は、ウイルスの複製に関与するタンパク質をコードするのに対し、ｃａｐは、キャプシドタンパク質ＶＰ１〜３をコードする。各ＩＴＲは、Ｔ型のヘアピン構造を形成する。これらの末端反復は、染色体組み込みにとって必須のＡＡＶ唯一のｃｉｓ成分である。ゆえに、ＡＡＶは、すべてのウイルスコード配列が除去され、かつ送達用の遺伝子のカセットで置換された、ベクターとして使用することができる。３つのウイルスプロモーターが同定されており、それらは、そのマップ位置に従ってｐ５、ｐ１９およびｐ４０と命名された。ｐ５およびｐ１９からの転写によって、ｒｅｐタンパク質が生成され、ｐ４０からの転写によって、キャプシドタンパク質が生成される（Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９８４）。

研究者にｒＡＡＶを発現ベクターとして使用する可能性を研究するように促した要因がいくつかある。１つは、驚いたことに、宿主染色体に組み込むための遺伝子送達に対する要件がほとんどないことである。ＡＡＶゲノムのたった６％である１４５ｂｐのＩＴＲを有することが必要である。これは、ベクター内に４．５ｋｂのＤＮＡ挿入物を組み立てる余地を残す。この収容能力のせいで、ＡＡＶが大きな遺伝子を送達するのが妨げられる可能性があるが、アンチセンス構築物を送達するには十分に適している。

ＡＡＶはまた、その安全性を理由に、送達ビヒクルの良好な選択肢である。比較的複雑なレスキュー機序が存在する：ｒＡＡＶを起動させるためには、野生型アデノウイルスだけでなくＡＡＶ遺伝子も必要とされる。同様に、ＡＡＶは、病原性でなく、いかなる疾患にも関連していない。ウイルスコード配列の除去によって、ウイルス遺伝子発現に対する免疫反応が最小になり、ゆえに、ｒＡＡＶは炎症反応を誘発しない。

４．発現構築物としての他のウイルスベクター
オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を宿主細胞に送達するために、他のウイルスベクターを本発明において発現構築物として使用してもよい。ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｃｏｕｐａｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、レンチウイルス、ポリオウイルスおよびヘルペスウイルス）由来のベクターが使用され得る。他のポックスウイルス由来ベクター（例えば、鶏痘由来ベクター）もまた、有用であると予想され得る。それらは、様々な哺乳動物細胞に対していくつかの魅力的な特徴を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｃｏｕｐａｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。

欠損Ｂ型肝炎ウイルスの最近の認識で、種々のウイルス配列の構造と機能との関係性に新しい見識が得られた。インビトロ研究から、そのウイルスが、そのゲノムの最大８０％の欠失にもかかわらずヘルパー依存的パッケージングおよび逆転写に対する能力を保持することができることが示された（Ｈｏｒｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。これは、そのゲノムの大部分が外来遺伝物質で置き換えられ得ることを示唆した。向肝性（ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｓｍ）および残存性（組み込み）が、肝臓に特異的な遺伝子導入にとって特に魅力的な特性だった。Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９１）は、ポリメラーゼ、表面および前表面（ｐｒｅ−ｓｕｒｆａｃｅ）コード配列の代わりにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子をアヒルＢ型肝炎ウイルスゲノムに導入した。それは、野生型ウイルスとともにトリヘパトーマ細胞株に同時トランスフェクトされた。高力価の組換えウイルスを含む培養液を使用して、初代子ガモ肝細胞に感染させた。トランスフェクション後の少なくとも２４日間にわたって安定的なＣＡＴ遺伝子発現が検出された（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。

追加の「ウイルス」ベクターとしては、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）およびファージが挙げられる。

５．非ウイルスベクター
本発明のオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列の発現をもたらすために、発現構築物が、細胞内に送達されなければならない。この送達は、細胞株を形質転換するための実験室手順におけるようにインビトロで、またはある特定の疾患状態の治療におけるようにインビボもしくはエキソビボで、行われ得る。上に記載されたように、１つの好ましい送達機序は、発現構築物が感染性のウイルス粒子に被包されたウイルス感染を介するものである。

いったんその発現構築物が、細胞内に送達されると、所望のオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列をコードする核酸は、種々の部位に配置され、発現され得る。ある特定の実施形態において、その構築物をコードする核酸は、細胞のゲノム内に安定して組み込まれ得る。この組み込みは、相同組換えを介した特異的な位置および配向におけるものであり得るか（遺伝子置換）、またはランダムな非特異的な位置において組み込まれ得る（遺伝子増大）。なおもさらなる実施形態では、その核酸は、ＤＮＡの別個のエピソームセグメントとして細胞内に安定して維持され得る。そのような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主の細胞周期とは無関係のまたはそれと同期した維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。どのようにしてその発現構築物が細胞に送達されるか、およびその核酸が細胞内のどこにとどまるかは、使用される発現構築物のタイプに依存する。

本発明のある特定の実施形態において、１つ以上のオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列を含む発現構築物は、単純に、裸の組換えＤＮＡまたはプラスミドからなり得る。その構築物の移入は、例えば、細胞膜を物理的または化学的に透過性にする任意の方法によって、行われ得る。これは、インビトロでの移入に対して特に適用可能であるが、インビボでの使用にも同様に適用され得る。Ｄｕｂｅｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９８４）は、リン酸カルシウム沈殿物の形態でポリオーマウイルスＤＮＡを成体マウスおよび新生仔マウスの肝臓および脾臓に注射し、活性なウイルス複製および急性感染を示すことに成功した。Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ ＆ Ｒｅｓｈｅｆ（１９８６）もまた、リン酸カルシウム沈殿プラスミドの直接的な腹腔内注射によって、トランスフェクトされた遺伝子を発現させることを示した。目的の遺伝子をコードするＤＮＡが、インビボにおいて同様の様式で移入され、その遺伝子産物を発現し得ることが想定される。

裸のＤＮＡ発現構築物を細胞に移入するための本発明の別の実施形態は、粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）が関与し得る。この方法は、ＤＮＡでコーティングされた微粒子を、それらが細胞膜を貫通して細胞を死滅させることなく細胞に進入するのを可能にさせる高速にまで加速させる能力に依存する（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。小粒子を加速させるためのデバイスがいくつか開発されている。そのようなデバイスの１つは、電流を発生させて、その電流によって推進力を提供する高電圧の放電に依存する（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。使用される微粒子は、生物学的に不活性な物質（例えば、タングステンまたは金ビーズ）からなる。

ラットおよびマウスの肝臓、皮膚および筋組織を含む選択された臓器が、インビボにおいて撃ち込まれた（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｚｅｌｅｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。これには、銃と標的臓器との間の任意の介在組織を排除するために組織または細胞を外科的に露出させること、すなわち、エキソビボ治療が必要であり得る。また、特定の遺伝子をコードするＤＮＡは、この方法を介して送達され得、さらに組み込まれ得る。

細菌もまた、送達方法（例えば、リステリア、ＷＯ２００４／１１０４８を参照のこと）として、特にＢＣＧにおいて利用され得る。

ポリペプチド組成物
ポリペプチドは、種々の任意の周知の手法を用いて調製され得る。上に記載されたようなＤＮＡ配列によってコードされる組換えポリペプチドは、当業者に公知の種々の任意の発現ベクターを用いてそのＤＮＡ配列から容易に調製され得る。発現は、組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた任意の適切な宿主細胞において行われ得る。好適な宿主細胞としては、原核細胞、酵母細胞および高等真核細胞（例えば、哺乳動物細胞および植物細胞）が挙げられる。好ましくは、使用される宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母または哺乳動物細胞株（例えば、ＣＯＳまたはＣＨＯ）である。組換えタンパク質またはポリペプチドを培養液中に分泌する好適な宿主／ベクター系の上清が、まず、商業的に入手可能なフィルターを用いて濃縮され得る。濃縮後、その濃縮物が好適な精製マトリックス（例えば、親和性マトリックスまたはイオン交換樹脂）に適用され得る。最後に、組換えポリペプチドをさらに精製するために１回以上の逆相ＨＰＬＣ工程が用いられ得る。

より短いポリペプチドは、当業者に周知の手法を用いて、合成手段によって作製されてもよい。例えば、そのようなポリペプチドは、成長中のアミノ酸鎖にアミノ酸が順次付加される商業的に利用可能な任意の固相法（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法）を用いて合成され得る。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１４６（１９６３）を参照のこと。ポリペプチドの自動合成のための装置は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）などの供給業者から商業的に入手可能であり、製造者の指示書に従って操作され得る。

ある特定の独特の実施形態において、ポリペプチドは、本明細書中に記載されるような複数の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を含む融合タンパク質、または本明細書中に記載されるような少なくとも１つの改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質および無関係の配列を含む融合タンパク質であり得る（例えば、上記の（ｉ）〜（ｘｖｉ）および（ａ）〜（ｇ）に記載された配列）。

融合パートナーは、例えば、Ｔヘルパーエピトープ（免疫学的融合パートナー）、好ましくは、ヒトによって認識されるＴヘルパーエピトープの提供を助け得るか、または未処理の（ｎａｔｉｖｅ）組換えタンパク質よりも高収率でのタンパク質発現を助け得る（発現エンハンサー）。ある特定の好ましい融合パートナーは、免疫学的な融合パートナーであり、かつ発現を増強する融合パートナーである。他の融合パートナーは、タンパク質の溶解性を高めるように、または所望の細胞内コンパートメントに対してそのタンパク質が標的化され得るように、選択されてもよい。なおもさらなる融合パートナーとしては、そのタンパク質の精製を容易にする親和性タグが挙げられる。

融合タンパク質は、一般に、化学的な結合体化を含む標準的な手法を用いて調製され得る。好ましくは、融合タンパク質は、ある発現系において非融合タンパク質よりも高いレベルの生成が可能である組換えタンパク質として発現される。簡潔には、ポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列が、別個に組み立てられ、適切な発現ベクターにライゲートされ得る。一方のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端が、ペプチドリンカーありまたはなしで第２のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端に、それらの配列の読み枠がインフェーズ（ｉｎ ｐｈａｓｅ）になるようにライゲートされる。これにより、両方の成分のポリペプチドの生物学的活性を保持した単一の融合タンパク質への翻訳が可能になる。

ペプチドリンカー配列は、各ポリペプチドが確実にその二次構造および三次構造に折り畳まれるのに十分な距離だけ融合パートナーを引き離すために使用され得る。そのようなペプチドリンカー配列は、当該分野で周知の標準的な手法を用いて融合タンパク質に組み込まれる。好適なペプチドリンカー配列は、以下の因子に基づいて選択され得る：（１）伸長された可撓性のコンフォメーションを取ることができること；（２）第１および第２ポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用できない二次構造を取ること；および（３）ポリペプチド機能的エピトープと反応する可能性のある疎水性残基または荷電残基を欠くこと。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含む。他の中性付近のアミノ酸（例えば、ＴｈｒおよびＡｌａ）もまた、そのリンカー配列に使用してもよい。リンカーとして有用に使用され得るアミノ酸配列としては、Ｍａｒａｔｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ４０：３９−４６（１９８５）；Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８２５８−８２６２（１９８６）；米国特許第４，９３５，２３３号明細書および米国特許第４，７５１，１８０号明細書に開示されているアミノ酸配列が挙げられる。リンカー配列は、一般に、１〜約５０アミノ酸長であり得る。第１および第２ポリペプチドが、機能的ドメインを引き離すためおよび立体的干渉を妨げるために使用することができる非必須のＮ末端アミノ酸領域を有するとき、リンカー配列は必要とされない。

好ましい実施形態において、免疫学的融合パートナーは、グラム陰性菌Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂの表面タンパク質であるプロテインＤに由来する（ＷＯ９１／１８９２６）。好ましくは、プロテインＤ誘導体は、そのタンパク質の約３分の１（例えば、最初のＮ末端の１００〜１１０アミノ酸）を含み、プロテインＤ誘導体は、脂質付加され得る。ある特定の好ましい実施形態の中で、リポプロテインＤ融合パートナーの最初の１０９残基が、Ｎ末端上に含められることにより、そのポリペプチドに追加の外来性Ｔ細胞エピトープが提供され、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現レベルが増加する（したがって、発現エンハンサーとして機能する）。脂質テイルのおかげで、抗原提示細胞に対するその抗原の最適な提示が確実になる。他の融合パートナーとしては、インフルエンザウイルスＮＳ１由来の非構造タンパク質（赤血球凝集素（ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ））が挙げられる。典型的には、Ｎ末端の８１アミノ酸が使用されるが、Ｔ−ヘルパーエピトープを含む異なるフラグメントを使用してもよい。

別の実施形態において、免疫学的融合パートナーは、ＬＹＴＡとして知られるタンパク質またはその一部（好ましくは、Ｃ末端部分）である。ＬＹＴＡは、アミダーゼＬＹＴＡ（ＬｙｔＡ遺伝子によってコードされる；Ｇｅｎｅ ４３：２６５−２９２（１９８６））として知られるＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼを合成するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン骨格におけるある特定の結合を特異的に分解する自己溶解素である。ＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリンまたはいくつかのコリンアナログ（例えば、ＤＥＡＥ）に対する親和性に関与する。この特性は、融合タンパク質の発現に有用なプラスミドを発現するＥ．ｃｏｌｉ Ｃ−ＬＹＴＡの開発に活用されている。アミノ末端にＣ−ＬＹＴＡフラグメントを含むハイブリッドタンパク質の精製は、報告されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７９５−７９８（１９９２）を参照のこと）。好ましい実施形態において、ＬＹＴＡの反復部分が、融合タンパク質に組み込まれ得る。反復部分は、残基１７８から始まるＣ末端領域に見られる。特に好ましい反復部分は、残基１８８〜３０５を組み込んでいる。

医薬組成物
追加の実施形態では、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド組成物またはポリペプチド組成物は、単独でまたは他の１つ以上の治療様式と併用して細胞または動物に投与するための薬学上許容されるまたは生理的に許容される溶液として製剤化され得る。組成物は、使用の直前に再構成するための粉末の形態（例えば、フリーズドライされた形態）で提供され得、保管中、一般にそのような乾燥組成物のほうが安定である。

医薬組成物は、融合タンパク質、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、薬学上許容される担体または賦形剤とともに含み得る。

所望であれば、本明細書中に開示されるようなポリペプチドを発現する核酸セグメント（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）が、同様に他の薬剤、例えば、他のタンパク質もしくはポリペプチドまたは様々な薬学上活性な薬剤（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染に対して有効な化学療法剤を含む）と組み合わせて投与されてもよいことも理解されるだろう。実際のところ、その追加の薬剤が、標的細胞または標的宿主組織と接触した際、有意な有害作用を引き起こさなければ、含めてもよい他の成分に対する制限は実質的に存在しない。したがって、本組成物は、特定の場合において必要とされる様々な他の薬剤とともに送達され得る。そのような組成物は、宿主細胞または他の生物学的起源から精製されてもよいし、あるいは、本明細書中に記載されるように化学的に合成されてもよい。同様に、そのような組成物は、置換されたまたは誘導体化されたＲＮＡまたはＤＮＡ組成物をさらに含んでもよい。

種々の治療レジメン（例えば、経口、非経口、静脈内、鼻腔内および筋肉内への投与および製剤を含む）において本明細書中に記載される特定の組成物を使用するための好適な投与レジメンおよび治療レジメンの開発と同様に、薬学上許容される賦形剤および担体溶液の製剤化は、当業者に周知である。他の投与経路としては、粘膜表面を介する経路が挙げられる。

典型的には、治療有効量を含む製剤は、投与１回あたり約０．０１μｇ〜約１０００μｇの改変されたＲｖ３６１６ｃポリペプチド、より典型的には、投与１回あたり約０．１μｇ〜約１００μｇのポリペプチド（例えば、０．５〜５０μｇ）を送達する。ポリヌクレオチド組成物に関しては、これらは、典型的には、投与１回あたり約１０μｇ〜約２０ｍｇの本発明のポリヌクレオチド、より典型的には、投与１回あたり約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇの本発明のポリヌクレオチドを送達する。

当然、治療上有用な各組成物中の活性な化合物の量は、好適な投薬量がその化合物の任意の所与の単位用量として得られるような方法で調製され得る。溶解性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品の有効期間、ならびに他の薬理学的に考慮すべき点などの因子が、そのような医薬製剤を調製する当業者によって企図されるだろうから、種々の投薬量および治療レジメンが望ましい場合がある。

１．経口送達
ある特定の適用において、本明細書中に開示される医薬組成物は、動物に経口投与によって送達され得る。そのようなものとして、これらの組成物は、不活性な希釈剤または同化可能な可食担体を用いて製剤化されてもよいし、硬または軟ゼラチンカプセル内に封入されてもよいし、錠剤に圧縮されてもよいし、食餌の食物に直接組み込まれてもよい。

それらの活性な化合物は、賦形剤とともに組み込まれてもよく、摂取可能な錠剤、頬側錠剤（ｂｕｃｃａｌ ｔａｂｌｅｓ）、トローチ剤、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ剤、オブラート剤などの形態で使用されてもよい（Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８；米国特許第５，６４１，５１５号明細書；米国特許第５，５８０，５７９号明細書および米国特許第５，７９２，４５１号明細書（これらの各々の全体が本明細書中で明確に参考として援用される））。錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセルなどは、以下のものも含むことがある：トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンのような結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；崩壊剤（例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸など）；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；および甘味剤（例えば、スクロース、ラクトースまたはサッカリン）が付加され得るかまたは香味料（例えば、ペパーミント、ウインターグリーン油またはチェリー香料）。投薬単位形態（ｄｏｓａｇｅ ｕｎｉｔ ｆｏｒｍ）がカプセルであるとき、それは、上記のタイプの材料に加えて、液体の担体を含み得る。様々な他の材料が、コーティングとして、またはその投薬単位の物理的形状を別途改変するために、存在することがある。例えば、錠剤、丸剤またはカプセルは、シェラック、糖またはその両方でコーティングされることがある。エリキシル剤のシロップ剤は、活性成分、甘味剤としてスクロース、保存剤としてメチルパラベンおよびプロピルパラベン、色素ならびに香料（例えば、チェリーまたはオレンジフレーバー）を含むことがある。当然のことながら、任意の投薬単位形態の調製において使用されるいずれの材料も、薬学的に純粋であるべきであり、かつ使用される量において実質的に無毒性であるべきである。さらに、その活性成分は、徐放調製物および徐放製剤に組み込まれてもよい。

あるいは、経口投与の場合、本発明の組成物は、１つ以上の賦形剤とともに、うがい液、歯磨剤、頬側錠剤、経口スプレーまたは経口的に投与される舌下製剤の形態で組み込まれてもよい。例えば、適切な溶媒（例えば、ホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル液））中に必要量で活性成分を組み込んだうがい液が調製され得る。あるいは、その活性成分は、経口溶液（例えば、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび重炭酸カリウムを含む溶液）に組み込まれてもよいし、歯磨剤に分散されてもよいし、水、結合剤、研磨材、香味剤、発泡剤および吸湿剤を含み得る組成物に治療有効量で添加されてもよい。あるいは、その組成物は、舌の下に置かれるかまたは別途口内で溶解される錠剤または溶液の形態にされてもよい。

２．注射送達
米国特許第５，５４３，１５８号明細書；米国特許第５，６４１，５１５号明細書および米国特許第５，３９９，３６３号明細書（これらの各々の全体が本明細書中で明確に参考として援用される）に記載されているように、概して、本明細書中に開示される医薬組成物を非経口的に、静脈内に、筋肉内に、皮内にまたは腹腔内に送達することが望ましい場合がある。遊離塩基または薬理学上許容される塩としての活性な化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性物質と適切に混合された水において調製され得る。グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物ならびに油において、分散液を調製してもよい。通常の保管条件下および使用条件下において、これらの調製物は、微生物の成長を防止するために保存剤を含む。

注射可能な使用に適した薬学上の形態には、滅菌された水溶液または分散液、および滅菌された注射可能な溶液または分散液の即時調製用の滅菌された粉末が含まれる（米国特許第５，４６６，４６８号明細書（この全体が本明細書中で明確に参考として援用される））。すべての場合において、その形態は、滅菌されていなければならず、かつ、容易に注射可能である程度に流動性でなければならない。その形態は、製造条件下および保管条件下において安定でなければならず、かつ、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護されていなければならない。その担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物および／または植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤を使用することによって、分散液の場合は必要とされる粒径を維持することによって、および界面活性物質を使用することによって、維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって高められ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい場合がある。注射可能組成物の吸収の延長は、その組成物において、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによってもたらすことができる。

水溶液で非経口投与される場合、例えば、その溶液は、必要であれば適切に緩衝されるべきであり、液体の希釈剤がまず、十分な食塩水またはグルコースによって等張性にされるべきである。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内への投与に適している。これに関しては、使用され得る滅菌された水性媒質は、本開示に鑑みて当業者に公知であろう。例えば、１回量が、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され、１０００ｍｌの皮下注入液（ｈｙｐｏｄｅｒｍｏｃｌｙｓｉｓ ｆｌｕｉｄ）に加えられ得るか、または提案された注入部位に注射され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．１０３５−１０３８および１５７０−１５８０を参照のこと）。治療される被験体の状態に応じて、投薬量にいくらかのばらつきが必然的に生じ得る。いずれにしても、投与に対して責任がある者が、個別の被験体にとって適切な用量を決定する。さらに、ヒトに投与する場合、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓの基準によって求められているような無菌性、発熱性、ならびに全般的な安全性および純度の基準を満たすべきである。

注射可能な滅菌溶液は、上に列挙された様々な他の成分とともに活性な化合物を必要量で適切な溶媒に組み込むことによって調製され、必要であればその後、濾過滅菌される。一般に、分散液は、滅菌された様々な活性成分を、基本的な分散媒および上に列挙された成分のうち必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。注射可能な滅菌溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め濾過滅菌されたその溶液から、活性成分＋任意の追加の所望の成分の粉末を得る、真空乾燥および凍結乾燥法である。

本明細書中に開示される組成物は、中性または塩の形態で製剤化され得る。薬学上許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される塩）および無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）を用いて形成される塩が挙げられる。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩は、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄）および有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）からも得ることができる。製剤化の際、溶液は、投薬製剤に適合した様式かつ治療的に有効であるような量で、投与され得る。その製剤は、種々の剤形（例えば、注射可能な溶液、薬物放出カプセルなど）で容易に投与される。

本明細書中で使用されるとき、「担体」には、任意およびすべての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが含まれる。薬学上活性な物質のためにそのような媒質および薬剤を使用することは、当該分野で周知である。任意の従来の媒質または薬剤が活性成分と不適合性である場合を除いては、治療用組成物におけるその使用が企図される。追加の活性成分もその組成物に組み込まれ得る。

句「薬学上許容される」とは、ヒトに投与されたときにアレルギー性または同様の有害反応をもたらさない分子実体および組成物のことを指す。活性成分としてタンパク質を含む水性組成物の調製は、当該分野において十分理解されている。典型的には、そのような組成物は、液体の溶液または懸濁液のいずれかの注射可能物として調製され；注射前に液体に溶解または懸濁するのに適した固体の形態も調製され得る。その調製物はまた、乳化され得る。

３．経鼻送達および頬側送達
ある特定の実施形態において、医薬組成物は、鼻腔内スプレー、頬側スプレー、吸入および／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達され得る。例えば、経鼻および頬側エアロゾルスプレーを介して、遺伝子、核酸およびペプチド組成物を肺に直接送達するための方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号明細書および米国特許第５，８０４，２１２号明細書（これらの各々の全体が本明細書中で明確に参考として援用される）に記載されている。同様に、鼻腔内用微小粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号明細書（この全体が本明細書中で明確に参考として援用される））を用いた薬物の送達も、薬学分野において周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｅｙｌｅｎｅ）支持マトリックスの形態での経粘膜的な薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号明細書（この全体が本明細書中で明確に参考として援用される）に記載されている。

４．リポソーム、ナノカプセルおよび微小粒子によって媒介される送達
ある特定の実施形態において、本発明者らは、好適な宿主細胞に本発明の組成物を導入するために、リポソーム、ナノカプセル、微小粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、ベシクルなどを使用することを企図する。特に、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、ベシクル、ナノスフェアまたはナノ粒子などに被包された状態での送達用に製剤化され得る。

そのような製剤は、本明細書中に開示される核酸または構築物の薬学上許容される製剤の導入にとって好ましい場合がある。リポソームの形成および使用は、一般に当業者に公知である（例えば、Ｃｏｕｖｒｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９７７；Ｃｏｕｖｒｅｕｒ，１９８８；Ｌａｓｉｃ，１９９８を参照のこと；この文献は、細胞内の細菌感染症および疾患に対して標的化された抗生物質による治療におけるリポソームおよびナノカプセルの使用が記載されている）。最近、血清安定性および循環半減時間が改善されたリポソームが開発された（Ｇａｂｉｚｏｎ ＆ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，１９８８；Ａｌｌｅｎ ａｎｄ Ｃｈｏｕｎ，１９８７；米国特許第５，７４１，５１６号明細書（これらの全体が本明細書中で明確に参考として援用される））。さらに、潜在的な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様の調製物に関する様々な方法が、概説されている（Ｔａｋａｋｕｒａ，１９９８；Ｃｈａｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｍａｒｇａｌｉｔ，１９９５；米国特許第５，５６７，４３４号明細書；米国特許第５，５５２，１５７号明細書；米国特許第５，５６５，２１３号明細書；米国特許第５，７３８，８６８号明細書および米国特許第５，７９５，５８７号明細書（これらの各々の全体が本明細書中で明確に参考として援用される）。

リポソームは、他の手順によるトランスフェクションに通常抵抗性であるいくつかの細胞型（Ｔ細胞懸濁液、初代培養肝細胞およびＰＣ１２細胞を含む）において首尾よく使用されている（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。さらに、リポソームは、ウイルスベースの送達系に特有のＤＮＡの長さに制約がない。リポソームは、遺伝子、薬物（Ｈｅａｔｈ ＆ Ｍａｒｔｉｎ，１９８６；Ｈｅａｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｂａｌａｚｓｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｆｒｅｓｔａ ＆ Ｐｕｇｌｉｓｉ，１９９６）、放射線治療薬（Ｐｉｋｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７）、酵素（Ｉｍａｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０ａ；Ｉｍａｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０ｂ）、ウイルス（Ｆａｌｌｅｒ ＆ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８４）、転写因子およびアロステリックエフェクター（Ｎｉｃｏｌａｕ ＆ Ｇｅｒｓｏｎｄｅ，１９７９）を種々の培養細胞株および動物に導入するために効果的に使用されている。さらに、リポソームによって媒介される薬物送達の有効性を調べるいくつかの臨床試験（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒａｉｌｓ）が成功に終わっている（Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５ａ；１９８５ｂ；Ｃｏｕｎｅ，１９８８；Ｓｃｕｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。さらに、いくつかの研究から、リポソームの使用が、全身送達後の自己免疫性応答、毒性または生殖腺局在化を伴わないことが示唆されている（Ｍｏｒｉ ＆ Ｆｕｋａｔｓｕ，１９９２）。

リポソームは、水性媒質に分散され、多重膜で同心円状の二重層ベシクル（多層ベシクル（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自発的に形成する、リン脂質から形成される。ＭＬＶは、通常、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理によって、中心に水溶液を含む、２００〜５００Åの範囲の直径を有する小型単層ベシクル（ＳＵＶ）が形成される。

リポソームは、細胞膜と類似点を有し、本発明に関してはペプチド組成物用の担体としての使用が企図される。リポソームは、水溶性物質と脂溶性物質の両方を封入することができる（すなわち、それぞれ、水性の空間と二重層自体の中に封入することができる）ので、広く好適である。薬物を有するリポソームは、そのリポソーム製剤を選択的に修飾することによって、活性薬剤の部位特異的送達のためにも使用され得る可能性がある。

Ｃｏｕｖｒｅｕｒ ｅｔ ａｌ．（１９７７；１９８８）の教示に加えて、以下の情報が、リポソーム製剤を生成する際に利用されることがある。リン脂質は、水に分散されると、脂質と水とのモル比に応じてリポソーム以外の種々の構造を形成し得る。低比率では、リポソームが好ましい構造である。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度および二価カチオンの存在に依存する。リポソームは、イオン性物質および極性物質に対して低い透過性を示し得るが、高温では、その透過性を著しく変化させる相転移を起こし得る。相転移は、ゲル状態として知られる密に詰まった規則正しい構造から、流体状態として知られる疎に詰まった規則正しさが低い構造への変化を伴う。これは、独特の相転移温度において生じ、イオン、糖および薬物に対する透過性を増大させる。

温度に加えて、タンパク質への曝露によっても、リポソームの透過性を変化させることができる。ある特定の可溶性タンパク質（例えば、シトクロムｃ）が、その二重層に結合し、変形し、透過することによって、透過性が変化する。コレステロールは、明らかにリン脂質をより密接に詰めることによって、タンパク質の透過を阻害する。抗生物質および阻害剤の送達にとって最も有用なリポソームの形成は、コレステロールを含み得ることが企図される。

溶質を捕捉する能力は、種々のタイプのリポソーム間で異なる。例えば、ＭＬＶは、溶質の捕捉において中程度に効率的であるが、ＳＵＶは、極端に非効率的である。ＳＵＶは、サイズ分布の均一性および再現性に関して有利であるが、しかしながら、サイズと捕捉効率の両方を兼ね備えているのは、大型単層ベシクル（ＬＵＶ）である。これらは、エーテル蒸発によって調製され、ＭＬＶよりも溶質の封入が３〜４倍効率的である。

リポソームの特徴に加えて、化合物の封入において重要な決定因子は、その化合物自体の物理化学的特性である。極性化合物は、水性の空間に捕捉され、非極性化合物は、ベシクルの脂質二重層に結合する。極性化合物は、浸透によって放出されるかまたは二重層が壊されると放出されるが、非極性化合物は、温度またはリポタンパク質への曝露によって破壊されない限り、二重層と結びついたままである。両方のタイプが、相転移温度において最大流出速度を示す。

リポソームは、４つの異なる機序：マクロファージおよび好中球などの細網内皮系の食細胞によるエンドサイトーシス；非特異的な弱い疎水性力もしくは静電力、または細胞表面成分との特異的な相互作用による、細胞表面への吸着；原形質膜へのリポソームの脂質二重層の挿入による、細胞原形質膜との融合（同時に、リポソームの内容物が細胞質に放出される）；および細胞膜またはオルガネラ膜（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）へのリポソームの脂質の移動（またはその逆）（リポソームの内容物のいかなる会合を伴わない）によって細胞と相互作用する。どの機序が働いているかを判断することは困難であることが多く、２つ以上が同時に機能していることがある。

静脈内注射されたリポソームの運命および処分は、その物理的特性（例えば、サイズ、流動性および表面電荷）に依存する。それらは、その組成に応じて数時間または数日間、組織内に存続し得、血中半減期は、数分から数時間にわたる。より大きなリポソーム（例えば、ＭＬＶおよびＬＵＶ）は、細網内皮系の食細胞によって速やかに取り込まれるが、循環器系の生理機能は、ほとんどの部位においてそのような大きな種の退去を制限する。それらは、大きな開口部または孔が毛細血管内皮（例えば、肝臓または脾臓の洞様毛細血管）に存在する位置でしか退去できない。したがって、これらの臓器が、主要な取り込み部位である。他方、ＳＵＶは、より広い組織分布を示すが、なおも高度に肝臓および脾臓に隔離される。一般に、このインビボでの挙動のせいで、大きなサイズのリポソームが接近可能な臓器および組織にしかそのリポソームを標的化できなくなる。これらとしては、血液、肝臓、脾臓、骨髄およびリンパ系の臓器が挙げられる。

標的化は、通常、本発明に関して限定するものではない。しかしながら、特異的な標的化が望まれる場合、これを達成する方法が利用可能である。抗体を用いることにより、リポソーム表面に結合され得、そしてその抗体およびその薬物内容物が、特定の細胞型の表面に位置する特定の抗原受容体に方向づけられ得る。炭水化物決定基（細胞間の認識、相互作用および接着に関与する、糖タンパク質または糖脂質の細胞表面成分）は、リポソームを特定の細胞型に方向づける潜在能力を有するので、それらもまた認識部位として使用してもよい。主に、リポソーム調製物の静脈内注射が使用され得ると企図されるが、他の投与経路も考えられる。

あるいは、本発明は、本発明の組成物の薬学上許容されるナノカプセル製剤を提供する。ナノカプセルは、一般に、安定かつ再現性のある方法で化合物を封入することができる（Ｈｅｎｒｙ−Ｍｉｃｈｅｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｄｏｕｇｌａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。細胞内へのポリマーの過負荷に起因する副作用を回避するために、そのような超微細粒子（およそ０．１μｍのサイズ）は、インビボにおいて分解され得るポリマーを用いて設計されるべきである。これらの要件を満たす生分解性のポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が本発明における使用のために企図される。そのような粒子は、記載されているように容易に生成され得る（Ｃｏｕｖｒｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０；１９８８；ｚｕｒ Ｍｕｈｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｚａｍｂａｕｘ ｅｔ ａｌ．１９９８；Ｐｉｎｔｏ−Ａｌｐｈａｎｄｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５および米国特許第５，１４５，６８４号明細書（これらの全体が本明細書中で明確に参考として援用される））。

皮膚パッチもまた、経皮送達に利用され得る。

免疫原性組成物
本発明のある特定の実施形態では、免疫原性組成物が提供される。その免疫原性組成物は、免疫賦活薬と組み合わせて、上で論じられたような１つ以上の改変されたＲｖ３６１６ｃ配列（ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を含み得る。

免疫原性組成物は、薬学上許容される担体または賦形剤と組み合わせて、融合タンパク質または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドも含み得る。

免疫賦活薬は、外来性抗原に対する免疫応答（抗体および／または細胞によって媒介される免疫応答）を増強するかまたは強化する任意の物質であり得る。免疫賦活薬の例としては、アジュバントが挙げられる。

免疫原性組成物の調製は、一般に、例えば、Ｐｏｗｅｌｌ ＆ Ｎｅｗｍａｎ，ｅｄｓ．，Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ（ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ）（１９９５）に記載されている。本発明の範囲内の医薬組成物および免疫原性組成物は、生物学的に活性かまたは不活性であり得る他の化合物も含み得る。例えば、他のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原の１つ以上の免疫原性部分が、融合ポリペプチドに組み込まれた状態で、または別個の成分として、医薬組成物または免疫原性組成物内に存在してもよい。

例示的な免疫原性組成物は、上に記載されたようなポリペプチドがインサイチュで生成される（それによって、免疫応答が誘発される）ような、そのポリペプチドの１つ以上をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を含み得る。上で述べられたように、当業者に公知の種々の送達系のいずれか（核酸発現系、細菌およびウイルス発現系を含む）の中にそのＤＮＡが存在し得る。数多くの遺伝子送達法が当該分野で周知である（例えば、Ｒｏｌｌａｎｄ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １５：１４３−１９８（１９９８）およびその中で引用されている参考文献に記載されているようなもの）。適切な核酸発現系は、患者における発現に必要なＤＮＡ配列（例えば、好適なプロモーターおよび終結シグナル）を含む。細菌送達系は、ポリペプチドを発現する（例えば、ポリペプチドをその細胞表面上で発現するかまたは分泌する）細菌宿主細胞（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＢａｃｉｌｌｕｓまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−ＧｕｅｒｒｉｎまたはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓを含む））の投与を含む（例えば、Ｆｅｒｒｅｉｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎ Ａｃａｄ Ｂｒａｓ Ｃｉｅｎｃ（２００５）７７：１１３−１２４；およびＲａｈａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００５）ＰｕｂＭｅｄＩＤ １５６３５４５９を参照のこと）。好ましい実施形態において、そのＤＮＡは、複製可能な非病原性（欠陥）ウイルスの使用を含み得るウイルス発現系（例えば、ワクシニアもしくは他のポックスウイルス、レトロウイルスまたはアデノウイルス）を用いて導入され得る。好適な系は、例えば、Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３１７−３２１（１９８９）；Ｆｌｅｘｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６−１０３（１９８９）；Ｆｌｅｘｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ８：１７−２１（１９９０）；米国特許第４，６０３，１１２号明細書、同第４，７６９，３３０号明細書および同第５，０１７，４８７号明細書；ＷＯ８９／０１９７３；米国特許第４，７７７，１２７号明細書；ＧＢ２，２００，６５１；ＥＰ０，３４５，２４２；ＷＯ９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６−６２７（１９８８）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９９１）；Ｋｏｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２１５−２１９（１９９４）；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１４９８−１１５０２（１９９３）；Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８８：２８３８−２８４８（１９９３）；ならびにＧｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３：１２０２−１２０７（１９９３）に開示されている。そのような発現系にＤＮＡを組み込むための手法は、当業者に周知である。そのＤＮＡは、例えば、Ｕｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４９（１９９３）に記載されているような、およびＣｏｈｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１６９１−１６９２（１９９３）によって概説されているような、「裸」でもあってもよい。裸のＤＮＡの取り込みは、細胞に効率的に輸送される生分解性ビーズ上にそのＤＮＡをコーティングすることによって増大されることがある。免疫原性組成物が、ポリヌクレオチドとポリペプチドの両方の成分を含むことがあることは明らかであろう。そのような免疫原性組成物は、増強された免疫応答をもたらすことがある。

免疫原性組成物が、本明細書中に提供されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学上許容される塩を含み得ることは明らかであろう。そのような塩は、薬学上許容される無毒性の塩基（有機塩基（例えば、第一級、第二級および第三級アミンならびに塩基性アミノ酸の塩）および無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウムおよびマグネシウムの塩）を含む）から調製され得る。

当業者に公知の任意の好適な担体を、本発明の免疫原性組成物において使用してよいが、その担体のタイプは、投与様式に応じて変化し得る。本発明の組成物は、任意の適切な投与様式（例えば、局所的、経口的、経鼻的、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下または筋肉内の投与が挙げられる）用に製剤化され得る。皮下注射などの非経口投与の場合、担体は、好ましくは、水、食塩水、アルコール、脂肪、ろうまたは緩衝液を含む。経口投与の場合、上記担体または固体の担体のいずれか（例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロースおよび炭酸マグネシウム）が使用され得る。生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリラクテートポリグリコレート）もまた、本発明の医薬組成物用の担体として使用され得る。好適な生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号明細書；同第５，０７５，１０９号明細書；同第５，９２８，６４７号明細書；同第５，８１１，１２８号明細書；同第５，８２０，８８３号明細書；同第５，８５３，７６３号明細書；同第５，８１４，３４４号明細書および同第５，９４２，２５２号明細書に開示されている。米国特許第５，９２８，６４７号明細書に記載されている粒子−タンパク質複合体（宿主においてクラスＩ拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導することができる）を含む担体も使用され得る。

そのような組成物は、緩衝液（例えば、中性緩衝食塩水またはリン酸緩衝食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドもしくはアミノ酸（例えば、グリシン）、酸化防止剤、静菌剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、レシピエントの血液と製剤を等張性、低張性もしくは弱高張性にする溶質、懸濁剤、増粘剤および／または保存剤も含み得る。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として製剤化されてもよい。化合物はまた、周知の技術を用いてリポソーム内に被包されてもよい。

種々の免疫賦活薬のいずれかが、本発明の免疫原性組成物において使用され得る。例えば、アジュバントが含められ得る。アジュバントとは、抗原に対する特異的な免疫応答を増加させる、ワクチンまたは治療用組成物における成分のことを指す（例えば、Ｅｄｅｌｍａｎ，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ８：１４０９−１４１１（１９９２）を参照のこと）。アジュバントは、Ｔｈ１型およびＴｈ−２型の応答の免疫応答を誘導する。Ｔｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与された抗原に対する細胞媒介性免疫応答の誘導を助ける傾向がある一方で、Ｔｈ−２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、Ｉｌ−６、ＩＬ−１０）は、体液性免疫応答の誘導を助ける傾向がある。

本明細書中に提供される免疫原性組成物の中でも、アジュバント組成物は、好ましくは、主にＴｈ１型の免疫応答を誘導するように設計される。

好適なアジュバント組成物としては、水中油型エマルジョンが挙げられる。特に、ヒトの１用量あたり０．５〜１０ｍｇの代謝可能な油（例えば、スクアレン）、０．５〜１１ｍｇのトコール（例えば、アルファ−トコフェロール）および０．１〜４ｍｇの乳化剤（例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）を含む水中油型エマルジョン。例えば、ＷＯ２００８／０４３７７４（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。

代替アジュバントは、リポソームおよびリポ多糖（例えば、３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ）の形態で提供される、Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの樹皮から得られる免疫学的に活性なサポニン画分（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号明細書に記載されているような、ＱＳ２１として公知のＨＰＬＣ精製画分）を含む。これらの組成物は、ステロール（例えば、コレステロール）をさらに含むことがあり、例えば、サポニン：ステロールの比は、１：１〜１：１００ｗ／ｗである（例えば、サポニン：ステロールの比は、１：１〜１：１０ｗ／ｗである）。前記ＱＳ２１および前記３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡが１：１ｗ／ｗというＱＳ２１：３Ｄ−ＭＰＬの比で存在し、その両方が３０μｇ未満のレベルのヒト用の用量で存在するアジュバント（ａｄｊｕｔａｎｔｓ）が特に好適である。そのようなアジュバント組成物は、例えば、ＷＯ２００７／０６８９０７および米国特許出願公開第２００８２７９９２６号明細書（本明細書によって参考として援用される）に記載されている。

他の目的のアジュバント系としては、リポ多糖３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと組み合わされる、アルミニウム塩に基づくアジュバント系が挙げられる。抗原と３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡとは、同じ金属塩粒子に同時に吸着されてもよいし、異なる金属塩粒子に吸着されてもよい。例えば、ＷＯ００／２３１０５、米国特許第７３５７９３６号明細書および米国特許出願公開第２００８０２２６６７２Ａ１号明細書（これらは、本明細書によって参考として援用され、第１の金属塩粒子（特に、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）に結合した抗原、および第２の金属塩粒子（特に、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）に結合した３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡを含む免疫原性組成物を記載している）を参照のこと。

本明細書中に提供されるいずれの免疫原性組成物も、抗原、免疫応答増強剤および好適な担体または賦形剤（必要であれば）の組み合わせをもたらす周知の方法を用いて調製され得る。

任意の種々の送達ビヒクルが、抗原特異的免疫応答が生じるのを促進するために医薬組成物および免疫原性組成物の中で使用され得る。

送達ビヒクルとしては、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球、および有効なＡＰＣとなるように操作され得る他の細胞が挙げられる。そのような細胞は、抗原を提示する能力を増加させるように、Ｔ細胞応答の活性化および／もしくは維持を改善するように、ならびに／または受取者と免疫学的に適合性であるように（すなわち、ＨＬＡハプロタイプがマッチするように）、遺伝的に改変されることがあるが、そのように改変されなくてもよい。ＡＰＣは、一般に、任意の種々の生体液および臓器から単離され得、自己細胞、同種細胞、同系細胞または異種細胞であり得る。

本発明のある特定の実施形態は、抗原提示細胞として樹状細胞またはその前駆細胞を使用する。樹状細胞は、高度に強力なＡＰＣであり（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ ＆ Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５−２５１（１９９８））、予防的または治療的な免疫を誘発するための生理学的アジュバントとして有効であると示されている（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ ＆ Ｌｅｖｙ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５０：５０７−５２９（１９９９）を参照のこと）。通常、樹状細胞は、その典型的な形状（インサイチュでは星形であり、インビトロでは著しい細胞質突起（樹状突起）が可視である）、高効率で抗原を取り込む能力、抗原をプロセシングする能力および抗原を提示する能力、ならびにナイーブＴ細胞応答を活性化する能力に基づいて同定され得る。樹状細胞は、当然のことながら、インビボまたはエキソビボでは樹状細胞上に通常見られない特定の細胞表面受容体またはリガンドを発現するように操作されることがあり、そのような改変された樹状細胞は、本発明によって企図される。樹状細胞に対する代替物として、抗原を負荷された樹状細胞から分泌されるベシクル（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）（エキソソームと呼ばれる）が、免疫原性組成物の中で使用され得る（Ｚｉｔｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．４：５９４−６００（１９９８）を参照のこと）。

樹状細胞および前駆細胞は、末梢血、骨髄、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血、または他の任意の好適な組織もしくは体液から得ることができる。例えば、樹状細胞は、末梢血から回収された単球の培養物にサイトカインの組み合わせ（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦα）を加えることによって、エキソビボで分化され得る。あるいは、末梢血、臍帯血または骨髄から回収されたＣＤ３４陽性細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンド、ならびに／または樹状細胞の分化、成熟および増殖を誘導する他の化合物の組み合わせを培養液に加えることによって樹状細胞に分化され得る。

樹状細胞は、「未熟」細胞および「成熟」細胞として便利に分類され、このおかげで、簡便な方法によって、十分に特徴付けられた２つの表現型を識別することが可能になる。しかしながら、この命名法は、分化のすべてのあり得る中間段階を排除すると解釈されるべきでない。未熟樹状細胞は、Ｆｃγ受容体およびマンノース受容体の高発現と相関する、抗原の取り込みおよびプロセシングについて高い能力を有するＡＰＣと特徴付けられる。成熟表現型は、典型的には、これらのマーカーのより低い発現、ならびにＴ細胞活性化に関与する細胞表面分子（例えば、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ）、接着分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）および共刺激分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４−１ＢＢ）の高発現を特徴とする。

ＡＰＣは、通常、タンパク質（またはその一部もしくは他のバリアント）をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る（その結果、そのポリペプチドは、細胞表面上に発現される）。そのようなトランスフェクションは、エキソビボで実施され得、次いで、そのようなトランスフェクトされた細胞を含む医薬組成物または免疫原性組成物が、本明細書中に記載されるように使用され得る。あるいは、樹状細胞または他の抗原提示細胞を標的とする遺伝子送達ビヒクルが、患者に投与され、インビボで起きるトランスフェクションがもたらされてもよい。樹状細胞のインビボおよびエキソビボトランスフェクションは、例えば、一般に、当該分野で公知の任意の方法（例えば、ＷＯ９７／２４４４７に記載されている方法、またはＭａｈｖｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７５：４５６−４６０（１９９７）に記載されている遺伝子銃アプローチ）を用いて行われ得る。樹状細胞の抗原負荷は、樹状細胞または前駆細胞を、ポリペプチド、ＤＮＡ（裸のものまたはプラスミドベクター内のもの）もしくはＲＮＡ；または抗原を発現する組換え細菌もしくはウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、アデノウイルスまたはレンチウイルスベクター）とともにインキュベートすることによって、行われ得る。そのポリペプチドは、負荷の前に、Ｔ細胞の助けをもたらす免疫学的パートナー（例えば、担体分子）に共有結合的に結合体化されてもよい。あるいは、樹状細胞は、結合体化されていない免疫学的パートナーで別々にまたはそのポリペプチドの存在下でパルスされてもよい。

免疫原性組成物および医薬組成物は、単位用量容器または複数回用量容器（例えば、密封されたアンプルまたはバイアル）に入った状態で提供され得る。そのような容器は、好ましくは、使用するまでその製剤の無菌性が保たれるように密閉して密封される。一般に、製剤は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンとして保管され得る。あるいは、免疫原性組成物または医薬組成物は、使用の直前に滅菌液体担体を加えることだけが必要なフリーズドライ状態で保管され得る。

いくつかの実施形態において、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質（融合タンパク質を含む）または前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの「初回抗原刺激」または１回目の投与に続いて、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質（融合タンパク質を含む）または前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの１回以上の「追加免疫」またはその後の投与が行われる（「プライムブースト」法）。例えば、改変されたＲｖ３６１６ｃポリペプチド（融合タンパク質を含む）または前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの１回目の投与に続いて、改変されたＲｖ３６１６ｃポリペプチド（融合タンパク質を含む）または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの１回以上のその後の投与が行われる。

１つの実施形態において、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質またはポリヌクレオチドの１回目の投与に続いて、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質の１回以上のその後の投与が行われる。１つの実施形態において、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質またはポリヌクレオチドの１回目の投与に続いて、改変されたＲｖ３６１６ｃポリヌクレオチドの１回以上のその後の投与が行われる。通常、１回目の投与または「初回抗原刺激」投与および２回目の投与または「追加免疫」投与は、約２〜１２週間空けて、または最大４〜６ヶ月空けて行われる。その後の「ブースター」投与は、約６ヶ月空けて、または１、２、３、４もしくは５年も空けて行われる。従来のブースター治療（例えば、タンパク質の初回抗原刺激投与の後のタンパク質の追加免疫投与）もまた、結核の予防または治療（例えば、潜伏結核の予防または治療、特に、結核の再活性化の予防または遅延）において有用であり得る。

診断法
別の態様において、本発明は、上に記載された改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質の１つ以上を使用して潜伏結核などの結核を診断するための方法（例えば、従来の形式のＴ細胞応答ベースアッセイまたは抗体ベースアッセイを使用して）を提供する。

例えば、個体における潜伏Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を判定するための方法が提供され、その方法は、
（ａ）その個体からサンプルを得る工程、
（ｂ）前記サンプルを改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質と接触させる工程、
（ｃ）そのサンプルの応答を定量する工程
を含んでなる。

そのサンプルは、例えば、全血または精製された細胞であり得る。好適には、そのサンプルは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み得る。本発明の１つの実施形態において、個体は、血清陽性であり得る。本発明の第２の実施形態において、個体は、血清陰性であり得る。

好適には、個体は以前にＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染に対するワクチン接種を受けたことがない（例えば、好適には、個体は以前にＢＣＧワクチン接種を受けたことがない）。

上記サンプルの応答は、リンパ球の増殖または特定のサイトカインもしくは抗体の産生をモニターすることを含む、当業者に公知の一連の手段によって定量され得る。例えば、Ｔ細胞ＥＬＩＳＰＯＴを用いることにより、サイトカイン（例えば、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、インターロイキン２（ＩＬ２）およびインターロイキン５（ＩＬ５））がモニターされ得る。Ｂ細胞ＥＬＬＩＳＰＯＴを用いることにより、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ特異的抗原の刺激がモニターされ得る。その細胞応答は、細胞内染色および細胞外染色の使用ならびにフローサイトメーターによる解析によっても特徴付けられ得る。

サンプルの増殖応答を定量する方法は、
（ｉ）培養された細胞に放射標識（例えば、トリチウムチミジン）をパルスし、トリチウムの取り込みをモニターする工程（例えば、ガスシンチレーション）、
（ｉｉ）カルボキシフルオレセイン（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｓｅｃｅｉｎ）ジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、フローサイトメトリーを用いて細胞分裂を蛍光的にモニターする工程
を含んでなる。

サンプルのサイトカイン応答の定量は、特に、インターフェロンガンマ産生のモニターを含む。

そのような定量方法を用いるとき、抗原に対する陽性の応答は、少なくとも２：１（例えば、少なくとも３：１または少なくとも５：１）のシグナル・ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）によって定義され得る。

本発明のさらなる態様では、皮膚試験を用いて潜伏Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を診断する方法が提供される。本明細書中で使用されるとき、「皮膚試験」は、患者に対して直接行われる任意のアッセイであり、この試験では、上に記載されたような改変されたＲｖ１５３ｃタンパク質の皮内注射後に遅延型過敏（ＤＴＨ）反応（例えば、腫脹、発赤または皮膚炎）が測定される。そのような注射は、抗原の組み合わせを患者の皮膚細胞と接触させるのに足りる任意の好適なデバイス（例えば、ツベルクリン注射器または１ｍＬ注射器）を用いて行われ得る。ある時間が経過した後に、例えば、注射の少なくとも４８時間後、特に、４８〜７２時間後に、その反応が測定される。

ＤＴＨ反応は、細胞媒介性の免疫応答であり、その応答は、以前にその試験抗原に曝露されたことのある患者ではより大きい。その応答は、定規を用いて視覚的に測定され得る。一般に、直径が約０．５ｃｍより大きい応答、特に、直径が約１．０ｃｍより大きい応答は、以前のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染（活動性の疾患としてあらわれているかもしれないし、顕れていないかもしれない）を示唆する陽性反応である。

皮膚試験において使用する場合、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質成分は、好適には、生理的に許容される担体を含む医薬組成物として製剤化される。そのような医薬組成物において使用される担体は、好適には、適切な保存剤（例えば、フェノールおよび／またはＴｗｅｅｎ８０^ＴＭ）を含む食塩水溶液である。

本発明はさらに、上記の診断方法のいずれかの中で使用するためのキットを提供する。そのようなキットは、典型的には、診断アッセイを行うために必要な２つ以上の構成要素を含んでなる。構成要素は、化合物、試薬、容器および／または装置であり得る。例えば、キット内の１つの容器が、改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質を含み得る。そのようなタンパク質は、支持材料に付着された状態で提供され得る。そのようなキットはまた、抗体結合の直接的または間接的な検出に適したレポーター基を含む検出試薬も備え得る。

他の診断キットは、細胞媒介性応答を検出するために設計されたキット（例えば、本発明の診断方法において有用であり得るキット）を含む。そのようなキットは、典型的には、
（ｉ）適切な細胞サンプルを被験体から得るための装置、
（ｉｉ）前記細胞サンプルをＲｖ３６１６ｃポリペプチド（またはそのバリアント、その免疫原性フラグメントもしくはそのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ）で刺激するための手段、
（ｉｉｉ）刺激に対する細胞応答を検出するためまたは定量するための手段
を備え得る。

細胞応答の定量に適した手段には、当業者に公知である、Ｂ細胞ＥＬＩＳＰＯＴキット、あるいはＴ細胞ＥＬＩＳＰＯＴキットが含まれる。

１つのあり得るキットは、
（ａ）本発明のポリペプチド、および
（ｂ）抗体結合の直接的または間接的な検出に適した検出試薬
を含んでなる。

Ｔ細胞応答の定量に合わせて作製された診断キット、
（ａ）本発明のポリペプチド、および
（ｂ）前記ポリペプチドを個体の皮膚細胞と接触させるのに足りる装置
を含んでなる診断キット、
（ａ）本発明のポリペプチド、
（ｂ）前記ポリペプチドを個体由来のサンプル（例えば、全血またはより好適にはＰＢＭＣ）と接触させるのに足りる装置、および
（ｃ）Ｔ細胞応答（例えば、増殖またはＩＦＮ−ガンマ産生）を定量する手段
を含んでなる診断キット
が、特に興味深い。

以下の実施例は、単に例示の目的で提供されるものであって、限定の目的で提供されるものではない。当業者は、本質的に類似の結果を得るために変更され得るかまたは改変され得る種々の重要でないパラメータを容易に認識するだろう。

実施例１−潜伏ＴＢワクチン標的としてのＲｖ３６１６ｃの同定
遺伝子Ｒｖ３６１６ｃは、保存された仮定のアラニンおよびグリシンリッチタンパク質をコードする。

Ｍｕｒｐｈｙ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ ＢＭＣ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２００７ ７：８４−９９におけるような休眠段階の維持および感染性に関連するＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ遺伝子のゲノムワイド解析に基づいて、Ｒｖ３６１６ｃを選択した。擬似休眠条件下における、細菌遺伝子発現の公開されているゲノムワイドＤＮＡマイクロアレイデータセットのバイオインフォマティクスメタアナリシスによって、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにおける潜在的な休眠段階遺伝子標的に優先順位をつけた。続いて、遺伝子によってコードされるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓタンパク質の細胞内局在化をゲノム全体に対して行うことにより、ワクチン標的を同定した。

簡潔には、上記休眠モデルにおける実験条件は、かなり多様だったので、０から５のスコアリングシステムを開発して、これらのデータを２つの基準：１）実験条件と休眠状態との関連性、および２）発現の順位に基づいて正規化した。特定の実験データセットに対する最大スコアを、休眠段階のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染の臨床上の発生率に対する潜在的な関連性に基づいて調整した。表１は、工程１のために収集されたデータセットを、各データセットに対する調整された最大スコアとともに示している。成長のための遺伝子不可欠性に対する追加のデータセットを、トランスポゾンベースのノックアウト実験（ＴｒａＳＨ）を用いた公開されている研究から得た。成長に影響がなかった遺伝子には、０のスコアを与えた。

表１−Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＤＮＡマイクロアレイ遺伝子発現およびゲノムワイド遺伝子ノックアウト（成長段階に対する不可欠性）に対する起源、実験モデルおよびスコアリング基準。

^ａ休眠モデルとしての関連性に基づく最大スコア；ｈ＝時間；ｄ＝日。

^ｂＢａｌｂ／ｃ肺由来のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓと２８日間の通気培養物中のＭＴＢとの比
＃Ｗａｙｎｅ ＬＧ ａｎｄ Ｈａｙｅｓ ＬＧ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９９６ ６４：２０６２−２０６９
工程２−第２の判定基準である遺伝子発現の順位を適用する際に、各データセットからの遺伝子のスコアを発現率（対数期の液体培養物中の細胞に対する実験条件における発現倍率）に基づいて最高から最低に順位付けた。最高スコアの遺伝子には、その特定のデータセットに対して最大のスコアが与えられた（表１のカラム３に列挙される（例えば、５、４・・・、１点））。そのスコアは、０までまたはデータセットの終わりに達するまで各遺伝子に対して０．００５点ずつ順々に減少した。したがって、最大スコアが４点であるとき、１００番目にランクされた遺伝子は、３．５００のスコアを与えられる。５点が最大スコアである場合、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓゲノムの１０００個の遺伝子または２５％がスコアを与えられる。複数の時点からデータが収集された実験の場合は、すべての時点の中の最大スコアを、最終的なスコアとして使用した。

工程３では、各実験条件における各遺伝子に対するスコアをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ａｃｃｅｓｓデータベースに収集した。優先順位付けを容易にするために、参照フィールド（例えば、Ｒｅｆｓｅｑ ＩＤ、Ｇｅｎｂａｎｋ ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｇｅｎｂａｎｋ ｎｏｔｅ、Ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｓｔ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎおよびＫＥＧＧ ａｎｄ Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ ｌｉｎｋｓ）を加えた。種々の研究および起源からのデータを組み合わせることによって、休眠状態における生存にとって最も重要な特定の遺伝子および経路について一致した見解に達した。

工程４では、生化学的経路、酵素学、薬物としての取り扱いやすさ（ｄｒｕｇ ｔｒａｃｔａｂｉｌｉｔｙ）、ヒト遺伝子に対する相同性および他の事前の知識の専門のコンピュータによる解析および手作業による解析によって追加された上位４００個のスコアがつけられた遺伝子（ゲノムの約１０％）を利用して、治療用標的の優先順位リストを得た。高いスコアがつけられた遺伝子の大部分は、２つまたは３つの群が交差しているサブセットに由来する。

工程５では、遺伝子によってコードされるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓタンパク質の細胞内局在の特定をゲノム全体に対して行った。膜タンパク質予測に用いられる発見的方法（ｈｅｕｒｉｓｔｉｃ）は、Ｃｈａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００１ １８３：１２５９−１２６８に記載されている。台形ウインドウを使用して重み付けられたＧＥＳハイドロパシー値（Ｅｎｇｅｌｍａｎ ＤＭ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１９８６ １５：３２１−３５３）を用いて平均ハイドロパシープロファイル（Ｈ）（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ Ｇ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９２ ２２５：４８７−４９４）を生成した。ＴｏｐＰｒｅｄ ＩＩアルゴリズム（Ｃｌａｒｏｓ ＭＧ ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１９９４ １０：６８５−６８６）の最初の工程に類似したプロセスを用いて、最高Ｈ値（ＭａｘＨ）に集中している１９アミノ酸を選択し、これらをさらなる考慮からマスクし、そしてＨに＞０．５のピークが残らなくなるまでそのプロセスを繰り返すことによって、各ペプチド配列についてらせん状膜貫通セグメント（ＴＭＳ）を予測した。ピークＭａｘＨ値、Ｈが＞１．０のセグメントの数、ならびに推定ＴＭＳの分布およびピークＨ値に基づいて、細胞内位置を割り当てた。膜貫通タンパク質および細胞質タンパク質をそれぞれ含む２つのＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎリリース３４試験データセット間の区別を最大にするために、１．１５のＭａｘＨカットオフを選択した（Ｂｏｙｄ Ｄ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１９９８ ７：２０１−２０５）。ＭａｘＨが＜１．１５のタンパク質を、細胞質タンパク質と分類し、ＭａｘＨが＞１．１５でありかつ可能性のあるＴＭＳを少なくとも３つ有するタンパク質を膜タンパク質として分類した。アンカータンパク質は、厳密に２つのＴＭＳ（一方は、アミノ酸（ａａ）３５の前から開始し、かつ＞１．１５のＨを有し、他方は、０．５以上のＨを有する）を有すると定義された。グラム陽性設定でのＳｉｇｎａｌＰをＭ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍに対して特異的に使用することにより、発見的解析（Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｈ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９９７ １０：１−６）において細胞質または「不明」と分類されたものの中から分泌タンパク質を同定した。

Ｒｖ３６１６ｃは、いくつかの基準に従ってワクチン抗原として非常に高くランクされた：
（ｉ）Ｒｖ３６１６ｃは、すべての休眠モデルにおいて一貫してアップレギュレートされる。メタアナリシスにおいてスコア付けされた３９９９個の遺伝子一式全体のうち、Ｒｖ３６１６ｃは、すべての休眠モデルにおいて過剰発現遺伝子の最上位の四分位にランクされた。Ｒｖ３６１６ｃに対するアップレギュレートされたスコアは、６．５２であり、これは、２２．２８という最上位の遺伝子スコアと比べて遜色ない。

（ｉｉ）Ｒｖ３６１６ｃは、マウス脾臓感染モデルにおける生存にとって高度に不可欠であるとランクされた（スコア付け可能な５というスコアのうち４．９４５というスコアが付けられた）。

（ｉｉｉ）細胞内局在化によって、Ｒｖ３６１６ｃタンパク質が膜結合型タンパク質であり、ゆえにかなり細胞外に露出されると予測されたことから、ワクチン標的としての適合性が示唆される。

（ｉｖ）Ｒｖ３６１６ｃは、最初の結核攻撃に対する防御反応を誘発することができる。

（ｖ）Ｒｖ３６１６ｃは、抗原として広く認識される。

実施例２−Ｒｖ３６１６ｃエピトープの予測
方法
Ｔ細胞エピトープの予測は、以下のアプローチに基づいた：

結果
表２−推定Ｒｖ３６１６ｃヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ

表３−推定Ｒｖ３６１６ｃヒトＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ

表２および３から分かるように、Ｒｖ３６１６ｃは、予測されるいくつかのＣＤ４＋およびＣＤ８ Ｔ細胞エピトープを含む。さらにこの情報から、このタンパク質が、世界中に存在するＨＬＡ（すなわち、コーカサス人、アフリカ人、アジア人またはラテンアメリカ人の個体由来のＨＬＡ−ｗｗｗ．ａｌｌｅｌｅｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ．ｎｅｔのウェブサイトを参照のこと）によって認識され得るエピトープを有することが示唆される。

実施例３−Ｒｖ３６１６ｃエピトープの同定
Ｒｖ３６１６ｃの完全長を網羅する一連の３０個の重複ペプチドを調製し（詳細については図１および配列番号１２７〜１５６を参照のこと）、それらが４人のＰＰＤ＋ドナー由来のＰＢＭＣを刺激する能力について試験した。

図２に示されるデータは、ペプチド１〜７および１７〜３０が、これらの個体に対して免疫原性だったことを明らかにしている。これらのペプチドは、本発明の改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質の配列内に適切に存在する。

ペプチド８〜１６（アミノ酸残基９２〜２１５）は、ＨＬＡ型が異なる他の個体では免疫原性であり得ることに注意すべきである。

実施例４−Ｒｖ３６１６ｃ Ｈ３７Ｒｖホモログ
いくつかのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株およびＢＣＧ由来のＲｖ３６１６ｃ配列を、ＧｅｎＢａｎｋのＢＬＡＳＴＰ検索を用いて同定した（Ｈ３７Ｒｖ参照配列アクセッション番号ＮＰ＿２１８１３３．１）：

ホモログ配列のアラインメントから、高レベルの同一性が示唆される。

生物学的アッセイ
Ｒｖ３６１６ｃに対するＴ細胞応答の定量
感染個体（例えば、潜伏感染個体）由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）または全血調製物においてＴ細胞（増殖の誘導および／またはサイトカインの産生）を活性化させる能力についてポリペプチドがスクリーニングされ得る。

潜伏感染個体は、通常、皮膚試験で１０ｍｍを超える直径を有するが症状を有さず、Ｍｔｂ陽性培養物がなく、陰性痰陰性であり、病変（胸部Ｘ線によって検出される）がないことによって識別される。

ＰＢＭＣサンプルまたは全血に基づく一連のインビトロアッセイを使用することができる：抗原（または適切であればそのバリアント／免疫原性フラグメント）の存在下での再刺激の後、それらの細胞の増殖が測定され得る（ＣＦＳＥ／フローサイトメトリーによって測定される）か、またはサイトカインの産生が定量され得る（培養細胞の上清中の存在がＥＬＩＳＡによって測定されるか、またはＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の細胞内染色後のフローサイトメトリーによる解析によって測定される）。

例えば、ＰＢＭＣサンプルは、標準的な手順後のＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によってヘパリン添加全血から得ることができる。次いで、それらの細胞は、洗浄され、試験するまで液体窒素中で冷凍保存され得る（さらなる詳細については、Ｌａｌｖａｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９９９ １８０：１６５６−１６６４を参照のこと）。

Ｔ細胞増殖
特異的な免疫応答は、トリチウムチミジンを用いたリンパ球増殖解析を行うことによって特徴付けられ得る。この手法は、抗原に対するインビトロ刺激時の細胞の増大を評価する。実際には、細胞の増殖は、細胞数の基本的な変化と密接に関係するプロセスであるＤＮＡへのトリチウムチミジンの取り込みを推定することによって測定される。

より好適には、リンパ球増殖は、カルボキシフルオレセインジアセテートのスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）を用いて行われ得る。ＣＦＳＥは、リジン側鎖および他の利用可能なアミン基との反応によって、細胞内タンパク質と細胞表面タンパク質の両方に自発的かつ不可逆的に連結する。ＣＦＳＥ標識は、リンパ球細胞が分裂するときに、娘細胞に等しく分配されるので、その娘細胞は、親の半分の蛍光性である。結果として、細胞の蛍光強度の半減によって、増殖中の細胞の集団内において各次世代がマークされ、その半減は、フローサイトメトリーによって容易に追跡される（さらなる詳細については、Ｈｏｄｇｋｉｎｓ，ＰＤ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９６ １８４：２７７−２８１を参照のこと）。

実際のところは、ＰＭＢＣは、解凍後、洗浄され、ＣＦＳＥで染色された後、培養液（グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸塩および熱失活ヒトＡＢ血清が補充されたＲＰＭＩ−１６４０）中で１０μｇ／ｍｌの抗原とともに７２時間培養され得る（２×１０^５細胞）。次いで次いで、細胞が回収され、記憶ＣＤ８およびＣＤ４＋Ｔ細胞を識別する表面染色によって、それらの細胞の表現型が特徴付けられ得る。続いて、フローサイトメトリー解析を用いることにより、各抗原に応答したリンパ球増殖の程度（インビトロ刺激時のＣＦＳＥ強度が低下した細胞の割合）を示すことができる。

サイトカイン産生
ＩＦＮ−γ産生（または他のサイトカイン（例えば、ＩＬ２、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ５、ＩＬ１２など）の産生）が、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定され得る。ＥＬＩＳＡプレートが、ＰＢＳ中のヒトＩＦＮ−γに対するマウスモノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で室温において４時間コーティングされ得る。次いで、ウェルを、５％（Ｗ／Ｖ）脱脂粉乳を含むＰＢＳで室温にて１時間ブロッキングする。次いで、そのプレートを、例えば、ＰＢＳ／０．２％ＴＷＥＥＮ−２０で６回洗浄し、培養液で１：２希釈されたそのＥＬＩＳＡプレート内のサンプルを、室温で一晩インキュベートする。そのプレートを再度洗浄し、ポリクローナルウサギ抗ヒトＩＦＮ−γ血清（例えば、ＰＢＳ／１０％正常ヤギ血清で１：３０００希釈されたもの）が、各ウェルに加えられ得る。次いで、そのプレートを室温で２時間インキュベートし、洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼに連結された抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）が、例えば、ＰＢＳ／５％脱脂粉乳による１：２０００希釈で加えられ得る。室温でさらに２時間インキュベートした後、そのプレートを洗浄し、ＴＭＢ基質を加える。２０分後に、１Ｎ硫酸で反応が停止され得る。次いで、光学濃度が、４５０ｎｍで測定され得る（参照波長として５７０ｎｍを用いる）。典型的には、両方の複製物が培地のみで培養された細胞の平均ＯＤよりも２倍高いＯＤをもたらす画分が陽性と考えられ得る。

実施例５−ＣＢ６Ｆ１マウスでのＲｖ３６１６ｃの免疫原性
この抗原の免疫原性を、ＣＢ６Ｆ１マウス（ＢＡＬＢ／ｃマウスとＣ５７ＢＬ／６マウスとの交雑第一世代）において評価した。

ＣＢ６Ｆ１マウスの筋肉内に０．５μｇのタンパク質抗原を、Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ ＡＳ０１Ｅ（３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１を含むリポソームアジュバント製剤）と一緒に３回（０日目、１４日目および２８日目に）免疫した。

実験計画は、以下のとおりだった：

合計２４匹のマウスをこのプロトコル群において使用した。

末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を回収し、２１日目（すなわち、２回目の免疫の７日後）および３５日目（すなわち、３回目の免疫の７日後）にプールし、抗原特異的ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞応答（ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−ガンマおよび／またはＴＮＦ−アルファを産生しているＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞によって測定される）を、目的の配列を網羅する１５ｍｅｒペプチドのプールでインビトロにて一晩再刺激した後に、フローサイトメトリーによって測定した。抗原によって駆動されるサイトカイン発現の短時間のインビトロ増幅を用いることによって、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−ガンマおよび／またはＴＮＦ−アルファを発現しているマウスＴ細胞の検出を行った。

簡潔には、赤血球を溶解させるために、ＰｈａｒｍＬｙｓｅ溶液（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をヘパリン添加マウス末梢血に加えた。得られたＰＢＬ（末梢血リンパ球）を洗浄し、次いで、目的の抗原の配列を網羅する１５ｍｅｒペプチド（１１アミノ酸重複している）のプール、ならびにＣＤ２８およびＣＤ４９ｄに対する１μｇ／ｍｌの抗体（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下においてインキュベートした。各１５ｍｅｒペプチドは、１μｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。培地コントロールも、ＣＤ２８およびＣＤ４９ｄに対する抗体で刺激した。

３７℃、５％ＣＯ_２で培養を開始した２時間後に、サイトカイン分泌阻止化合物であるブレフェルジン−Ａ（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を加え、その細胞をさらに４時間、３７℃、５％ＣＯ_２で維持した後、＋４℃で一晩インキュベートした。

次いで、細胞を回収し、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅに連結された抗ＣＤ４（ＢＤ−クローンＲＭ４−５，ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびペリジニンクロロフィルＡタンパク質（ＰｅｒＣｐ）シアニン５．５（Ｃｙ５．５）に連結された抗ＣＤ８アルファ（クローン５３−６．７，ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）抗体で染色した。

次いで、細胞を洗浄し、固定し、透過処理し（Ｃｙｔｏｆｉｘ−ｃｙｔｏｐｅｒｍキット，ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、アロフィコシアニンに連結された抗ＩＦＮ−ｇ抗体（クローンＸＭＧ１．２，ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に連結された抗ＩＬ−２抗体（クローンＪＥＳ ６−５Ｈ４，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）およびフィコエリトリン（ＰＥ）に連結された抗ＴＮＦアルファ抗体（クローンＭＰ６−ＸＴ２２，ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した。最後の洗浄の後、染色された細胞を、ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）において解析した。ＣＤ８＋サブセットの１０，０００個という最小数の細胞を取得した。

さらなる背景については、Ｗａｌｚｅｒ Ｔ ｅｔ ａｌ Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ ２０６（１）：１６−２５およびＭａｅｃｋｅｒ ＨＴ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００１ ２５５（１−２）：２７−４０を参照のこと。

ネガティブコントロールとして、いくつかの細胞も、培養液（非刺激）中でインビトロにて一晩培養した。非刺激細胞によって産生された平均サイトカイン応答を、ペプチドで刺激された細胞によって産生された平均サイトカイン応答から減算することによって、抗原特異的応答を算出した。

各群について各時点において、各６匹のマウスの４プールからデータを収集した。下記のデータは、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−ガンマおよび／またはＴＮＦ−アルファを産生しているＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞の％として提示される。マウスの各個別のプール（三角）ならびにその群の平均値（バー）をプロットする。

図３は、２１日目（すなわち、２回目の免疫の７日後）に、０．５μｇのＲｖ３６１６ｃ／ＡＳ０１Ｅで免疫されたマウスにおいてＲｖ３６１６ｃ特異的ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞応答が検出されることを示している。

図４は、２１日目（すなわち、２回目の免疫の７日後）における、Ｒｖ３６１６ｃペプチドプールで刺激されたＰＢＬ（培地が除去されていない）からのＣＤ４ Ｔ細胞応答のサイトカインプロファイルを示している。

図５は、２１日目（すなわち、２回目の免疫の７日後）における、Ｒｖ３６１６ｃペプチドプールで刺激されたＰＢＬ（培地が除去されていない）からのＣＤ８ Ｔ細胞応答のサイトカインプロファイルを示している。

図６は、３５日目（すなわち、３回目の免疫の７日後）に、０．５μｇのＲｖ３６１６ｃ／ＡＳ０１Ｅで免疫されたマウスにおいてＲｖ３６１６ｃ特異的ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞応答が検出されることを示している。３回目の投与は、ＣＤ４ Ｔ細胞応答を増加させるが、ＣＤ８ Ｔ細胞応答を増加させない。技術的な問題が原因で、データは、単一プールについてしか入手可能でなかった。

図７は、３５日目（すなわち、３回目の免疫の７日後）における、Ｒｖ３６１６ｃペプチドプールで刺激されたＰＢＬ（培地が除去されていない）からのＣＤ４ Ｔ細胞応答のサイトカインプロファイルを示している。技術的な問題が原因で、データは、単一プールについてしか入手可能でなかった。

図８は、３５日目（すなわち、３回目の免疫の７日後）における、Ｒｖ３６１６ｃペプチドプールで刺激されたＰＢＬ（培地が除去されていない）からのＣＤ８ Ｔ細胞応答のサイトカインプロファイルを示している。技術的な問題が原因で、データは、単一プールについてしか入手可能でなかった。

実施例６−Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＲｖ３６１６ｃの免疫原性
この抗原の免疫原性を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいても評価した。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスの筋肉内に１μｇのタンパク質抗原を、Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ ＡＳ０１Ｅ（３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１を含むリポソームアジュバント製剤）と一緒に３回（０日目、１４日目および２８日目に）免疫した。

実験計画は、以下だった：

末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を回収し、２１日目（すなわち、２回目の免疫の７日後）および３５日目（すなわち、３回目の免疫の７日後）にプールし、抗原特異的ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞応答（ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−ガンマおよび／またはＴＮＦ−アルファを産生しているＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞によって測定される）を、目的の配列を網羅する１５ｍｅｒペプチドのプールでインビトロにて一晩再刺激した後に、フローサイトメトリーによって測定した。従った手順は、先に記載されたとおりだった。

ネガティブコントロールとして、いくつかの細胞も、培養液（非刺激）中でインビトロにて一晩培養した。非刺激細胞によって産生された平均サイトカイン応答を、ペプチドで刺激された細胞によって産生された平均サイトカイン応答から減算することによって、抗原特異的応答を算出した。

各群について各時点において、各６匹のマウスの４プールからデータを収集した。下記のデータは、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−ガンマおよび／またはＴＮＦ−アルファを産生しているＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞の％として提示される。マウスの各個別のプール（三角）ならびにその群の平均値（バー）をプロットする。

図９は、２１日目（すなわち、２回目の免疫の７日後）に、１μｇのＲｖ３６１６ｃ／ＡＳ０１Ｅで免疫されたマウスにおいてＲｖ３６１６ｃ特異的ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞応答が検出されるが、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答が非常に低いこと（ゆえに、サイトカインプロファイルデータが示されていない）を示している。

図１０は、２１日目（すなわち、２回目の免疫の７日後）における、Ｒｖ３６１６ｃペプチドプールで刺激されたＰＢＬ（培地が除去されていない）のＣＤ４ Ｔ細胞応答のサイトカインプロファイルを示している。

図１１は、３５日目（すなわち、３回目の免疫の７日後）に、１μｇのＲｖ３６１６ｃ／ＡＳ０１Ｅで免疫されたマウスにおいてＲｖ３６１６ｃ特異的ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞応答が検出されることを示している。３回目の免疫は、ＣＤ４ Ｔ細胞応答を増加させるが、ＣＤ８ Ｔ細胞応答をわずかしか増加させない。

図１２は、３５日目（すなわち、３回目の免疫の７日後）における、Ｒｖ３６１６ｃペプチドプールで刺激されたＰＢＬ（培地が除去されていない）のＣＤ４ Ｔ細胞応答のサイトカインプロファイルを示している。

図１３は、３５日目（すなわち、３回目の免疫の７日後）における、Ｒｖ３６１６ｃペプチドプールで刺激されたＰＢＬ（培地が除去されていない）のＣＤ８ Ｔ細胞応答のサイトカインプロファイルを示している。

実施例７−潜伏ＴＢを有するヒト由来のＰＢＭＣによるＲｖ３６１６ｃのインビトロ認識
南アフリカの４人のＴＢナイーブ健常成人（ＰＰＤ皮膚試験＝０ｍｍ）および８人のＴＢ潜伏感染健常成人（ＰＰＤ皮膚試験＝１５ｍｍ以上）において本発明の抗原に特異的な末梢Ｔ細胞応答を評価するために、実験を行った。

サイトカイン細胞内染色（ＩＣＳ）アッセイによって、単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）においてサイトカインを測定することによって細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答を評価した。

行われたＩＣＳは、以前に報告された方法（Ｖｏｎ Ｅｓｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ．Ｖａｃｃｉｎ．２００９ ５（７）を参照のこと）の変法だった。目的の抗原の配列全体を網羅する１５ｍｅｒペプチド（１１アミノ酸重複する）の１プールによってＰＢＭＣをインビトロで刺激した。細胞をペプチドで２時間刺激し、ブレフェルジンＡの存在下でさらに一晩培養し、ＩＣＳのために処理し、フローサイトメトリーを用いて解析した。ＩＦＮ−ガンマおよび／またはＴＮＦ−アルファおよび／またはＩＬ−１７を発現している抗原特異的ＣＤ３＋ＣＤ４＋またはＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の発生頻度を測定した。ペプチドプールで刺激された細胞において得られた応答から、培地で刺激された細胞応答を減算した。

ＩＣＳ：抗体
抗ＣＤ３ ＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−ｃａｔ ＣＤ０３３０）
抗ＣＤ４ ＰＢ（ＢＤ−ｃａｔ ５５８１１６）
抗ＣＤ８ ＡＰＣ−Ｈ７（ＢＤ−ｃａｔ ６４１４００）
抗ＩＦＮｇ ＡＦ７００（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ−ｃａｔ ５５７９９５）
抗ＴＮＦ ＰＥ−Ｃｙ７（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ−ｃａｔ ５５７６４７）
抗ＩＬ１７ ＡＦ６４７（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ−ｃａｔ ５１−７１７８−７１）
ＴＮＦ−アルファおよびＩＦＮ−ガンマを発現している抗原特異的ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の主な集団に相当するので、結果は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞１００万個あたりのＴＮＦ−アルファおよびＩＦＮ−ガンマを発現している抗原特異的ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数として提示される（培地に起因するバックグラウンド応答レベルは除去される）。抗原特異的ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は検出されなかった。図１４は、抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答が、ナイーブ個体において測定された非特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答と比べて、８人中６人の潜伏感染個体において測定された（７番および７４番の個体では測定されなかった）ことを示している。

実施例８−改変されたＲｖ３６１６ｃ配列の生成
（ｉ）クローニング
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ Ｒｖ３６１６ヌクレオチド配列を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン最適化し、遺伝子合成した。サブクローニング後に得られたインサートを、Ｎ末端のＮｄｅＩ制限酵素認識部位およびＣ末端のＸｈｏＩ制限酵素認識部位を用いてｐＥＴ２１ｂ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。改変されたＲｖ３６１６ｃ構築物を生成するために、Ｒｖ３６１６ｃ内の特定のヌクレオチド残基を削除するために種々のプライマーを用いた一連のＰＣＲ増幅を行った。次いで、改変されたインサートをｐＥＴ２６ｂ＋および／またはｐＥＴ１９ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。

（ｉｉ）組換えタンパク質の発現
宿主株：Ｔ７ ＥｘｐｒｅｓｓコンピテントＥ．ｃｏｌｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）：増強ＢＬ２１誘導体。

プラスミドＤＮＡによるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓの形質転換を、ＣａＣｌ_２処理された細胞を用いて標準的な方法によって行った（Ｈａｎａｈａｎ Ｄ．≪Ｐｌａｓｍｉｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ Ｓｉｍａｎｉｓ．≫Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（Ｅｄ），ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｏｎｄｏｎ．（１９８５）：ｐ．１０９−１３５）。

Ａ：ＮＥＢ（カタログ番号：Ｃ２５６６Ｈ）
Ｂ：Ｔｅｋｎｏｖａ，ＣＡ，ＵＳＡ（カタログ番号Ｌ１０９２）
Ｃ：Ｔｅｋｎｏｖａ，ＣＡ，ＵＳＡ（カタログ番号Ｌ１０９６）
形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ＋プラスミドを接種されたコンフルエントな寒天プレートを用いて、８００ｍｌのＬＢブロスＡＰＳ＋５０μｇ／ｍｌの抗生物質に接種して、０．０５〜０．１のＯ．Ｄ．_{６００ｎｍ}を得た。Ｏ．Ｄ．_{６００ｎｍ}がおよそ０．８になるまで培養物を３７℃、２５０ＲＰＭでインキュベートした。

最終１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ）を生育培養液に加えることによって、組換えタンパク質の発現を誘導した。３７℃において３時間（または１６℃において一晩）誘導を維持した。

（ｉｉｉ）精製
細菌培養物を４℃、８０００ｇで１５分間遠心した。細菌培養物のペレットを溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）およびプロテアーゼ阻害剤カクテルの混合物（完全にＥＤＴＡを含まない）に再懸濁した。Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｃｅｌｌ破砕システム（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて細菌を溶解した。可溶性成分（上清）および不溶性成分（ペレット）を、４℃、２００００ｇにおける２０分間の遠心分離によって分離した。

その不溶性成分（ペレット）を、６ＭグアニジンＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾールｐＨ８．０を含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液に再可溶化した。次いで、上清を５ｍｌ ＩＭＡＣカラム（ＢｉｏＲａｄ）に充填した。洗浄後、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌおよび２５０ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて溶出を行った。

２回の透析工程を、膜１２−１４０００ＭＷＣＯ（ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ）において行った：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．０を含む８Ｍ尿素緩衝液における１回目に続く、ＰＢＳ、４Ｍ尿素 ｐＨ７．４における２回目の透析。

（ｉｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
発現プロファイルを測定するために非誘導培養物および誘導培養物からサンプルを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。

簡潔には、サンプルを、ＮＵＰＡＧＥ ４Ｘ ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理し、０．０５Ｍ ＤＴＴを用いて還元し、７０℃において１０分間加熱した。次いで、サンプルを最高速度で２分間遠心し、ＮＵＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に充填した。１Ｘ ＮＵＰＡＧＥ ＭＥＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、２００Ｖにおいて３５分間泳動を行い、分離されたタンパク質を可視化できるようにそのゲルを染色した（その結果を図１７および１８に示す）。

Ｈ３７Ｒｖ野生型発現と比べて、構築物Ｒｖ３６１６Δ１３８−１４５、Ｒｖ３６１６Δ１３６−１５４、Ｒｖ３６１６Δ１５０−１６０、Ｒｖ３６１６Δ１６６−１８２、Ｒｖ３６１６Δ１４９−１５４およびＲｖ３６１６Δ１３５−１３９は、著しく改善された。

構築物Ｒｖ３６１６Δ１３６−１８３は、その配列内に誤った終止コドンを含んでおり、その結果として、その配列の発現は、意図されたとおり進まなかった。

実施例９−改変されたＲｖ３６１６ｃ配列のさらなる生成
実施例８に記載された方法と類似の方法（Ｔ７Ｅｘｐｒｅｓｓの代わりにＢＬ２１（ＤＥ３）株が使用され、抗生物質を含む２５ｍｌのＬＢブロスＡＰＳに接種するためにコンフルエントな寒天プレートが使用された）を用いて、一連の改変されたＲｖ３６１６ｃ構築物について３回の発現実験を行った（同じ形質転換プレートから開始して）。

その発現実験の生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析し、その発現実験のうちの１つからの代表的なゲルを図１９に提供する。Ｒｖ３６１６Δ１３８−１４５が、最も良好なタンパク質発現をもたらすと見出され、それにＲｖ３６１６Δ１４９−１５４およびＲｖ３６１６Δ１３６−１５４がすぐ続き、Ｒｖ３６１６Δ１３５−１３９も良好な発現を示した。

標的タンパク質に対応するバンドの定量をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬソフトウェアを用いて行った。簡潔には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ染色（Ｎｏｖｅｘｉｎ）を用いて染色し、ＵＶＰ ＢｉｏＩｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いてＴＩＦＦファイル形式でスキャンした。次いで、それらのバンドを、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＬ ７．０ソフトウェアを用いて解析した。抗ｈｉｓタグＡｂとの反応性が観察されなかったので、非誘導Ｒｖ３６１６タンパク質をネガティブ発現に対するコントロールとして使用した。

バンドパーセンテージにおいて、Ｒｖ３６１６Δ１４９−１５４、Ｒｖ３６１６Δ１３８−１４５およびＲｖ３６１６Δ１３６−１５４タンパク質はすべて、天然配列または既知のＲｖ３６１６Δ１５０−１６０構築物と比べて、著しく高いレベルで発現されている。Ｒｖ３６１６Δ１３５−１３９もまた、高レベルで発現された。

実施例１０−ＣＢ６Ｆ１マウスにおけるＲｖ３６１６Δ１３８−１４５の免疫原性
Ｒｖ３６１６Δ１３８−１４５の免疫原性をＣＢ６Ｆ１マウスにおいて評価した。

ＣＢ６Ｆ１マウスの筋肉内に、ある用量範囲（８μｇ、２μｇおよび０．５μｇ）のＲｖ３６１６Δ１３８−１４５を含む５０μｌの試験ワクチンを、Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ ＡＳ０１Ｅ（３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１を含むリポソームアジュバント製剤）と一緒に３回（０日目、１４日目および２８日目に）免疫した。これらの製剤は、尿素（４Ｍ）およびアルギニン（５００ｍＭ）も含んでいた。

実験計画は、以下だった：

合計２０匹のマウスを各免疫群において使用した。ネガティブコントロール群として１０匹のマウスに食塩水を投与した（データ示さず）。

末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、２１日目（すなわち、２回目の免疫の７日後）および３５日目（すなわち、３回目の免疫の７日後）に回収してプールし、抗原特異的ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞応答（ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−ガンマおよび／またはＴＮＦ−アルファを産生しているＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞によって測定される）を、完全Ｒｖ３６１６ｃ抗原配列を網羅する１５ｍｅｒペプチドのプールでインビトロにて再刺激した６時間後に、フローサイトメトリーによって測定した。抗原によって駆動されるサイトカイン発現の短時間のインビトロ増幅を用いることによって、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−ガンマおよび／またはＴＮＦ−アルファを発現しているマウスＴ細胞の検出を行った。

簡潔には、赤血球を溶解させるために、ＰｈａｒｍＬｙｓｅ溶液（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をヘパリン添加マウス末梢血に加えた。得られたＰＢＬ（末梢血リンパ球）を洗浄し、次いで、目的の抗原の配列を網羅する１５ｍｅｒペプチド（１１アミノ酸重複している）のプール、ならびにＣＤ２８およびＣＤ４９ｄに対する１μｇ／ｍｌの抗体（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下においてインキュベートした。各１５ｍｅｒペプチドは、１μｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。培地コントロールウェルも、ＣＤ２８およびＣＤ４９ｄに対する抗体で刺激した。

３７℃、５％ＣＯ_２で培養を開始した２時間後に、サイトカイン分泌阻止化合物であるブレフェルジン−Ａ（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を加え、その細胞をさらに４時間、３７℃、５％ＣＯ_２で維持した後、＋４℃で一晩保管した。

次いで、細胞を回収し、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅに連結された抗ＣＤ４（クローンＲＭ４−５，ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびペリジニンクロロフィルＡタンパク質（ＰｅｒＣｐ）シアニン５．５（Ｃｙ５．５）に連結された抗ＣＤ８アルファ（クローン５３−６．７，ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）抗体で染色した。

次いで、細胞を洗浄し、固定し、透過処理し（Ｃｙｔｏｆｉｘ−ｃｙｔｏｐｅｒｍキット，ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、アロフィコシアニンに連結された抗ＩＦＮ−ガンマ抗体（クローンＸＭＧ１．２，ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に連結された抗ＩＬ−２抗体（クローンＪＥＳ ６−５Ｈ４，ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびフィコエリトリン（ＰＥ）に連結された抗ＴＮＦアルファ抗体（クローンＭＰ６−ＸＴ２２，ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した。最後の洗浄の後、染色された細胞を、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）において解析した。ＣＤ８＋サブセットの１０，０００個という最小数の細胞を取得した。

ネガティブコントロールとして、いくつかの細胞も、培養液（非刺激）中でインビトロにて６時間培養した。非刺激細胞によって産生された平均サイトカイン応答を、ペプチドで刺激された細胞によって産生された平均サイトカイン応答から減算することによって、抗原特異的応答を算出した。

各群について各時点において、各５匹のマウスの４プールからデータを収集し、データを、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−ガンマおよび／またはＴＮＦ−アルファを産生しているＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞の％として提示する。マウスの各個別のプール（黒菱形）ならびにその群の中央値（バー）をプロットする。

結果を図２０〜２５に示す。

図２０は、両方の時点（７ｄＰＩＩおよび７ｄＰＩＩＩ）において、Ｒｖ３６１６ｃ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答が、どの用量のＲｖ３６１６Δ１３８−１４５／ＡＳ０１Ｅで免疫されたマウスにおいても検出されることを示している。Ｒｖ３６１６ｃ特異的Ｔ細胞応答のレベルは、７ｄＰＩＩ時点と比べて７ｄＰＩＩＩ時点のほうが高い。Ｒｖ３６１６ｃペプチドプールで刺激されたＰＢＬ（培地は除去されている）のＣＤ４ Ｔ細胞応答のサイトカイン（Ｃｙｏｔｏｋｉｎｅ）プロファイルを図２１（７ｄＰＩＩ）および２２（７ｄＰＩＩＩ）に示す。

図２３は、両方の時点（７ｄＰＩＩおよび７ｄＰＩＩＩ）において、Ｒｖ３６１６ｃ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答が、どの用量のＲｖ３６１６Δ１３８−１４５／ＡＳ０１Ｅで免疫されたマウスにおいても検出されることを示している。Ｒｖ３６１６ｃ特異的Ｔ細胞応答のレベルは、７ｄＰＩＩＩ時点と比べて７ｄＰＩＩ時点のほうが高い。Ｒｖ３６１６ｃペプチドプールで刺激されたＰＢＬ（培地は除去されている）のＣＤ８ Ｔ細胞応答のサイトカインプロファイルを図２４（７ｄＰＩＩ）および２５（７ｄＰＩＩＩ）に示す。

結論として、Ｒｖ３６１６ｃ抗原が、ＣＢ６Ｆ１マウスとＣ５７ＢＬ／６マウスの両方において免疫応答を誘発することができることに注目することができる。さらに、サイトカイン産生のプロファイルから、抗原特異的Ｔ細胞の大部分が複数のＴｈ１関連サイトカインを発現する（すなわち、多機能性Ｔ細胞応答が誘発される）ことが示唆される。重要なことには、ＣＤ４抗原特異的Ｔ細胞とＣＤ８抗原特異的Ｔ細胞の両方が免疫後に存在し、潜伏ＴＢのシナリオではＣＤ８細胞が特に重要であり得る。南アフリカの潜伏感染個体において高レベルに認識されることおよびナイーブ被験体では応答がないことによって、Ｒｖ３６１６ｃとヒト感染との関係性が確かめられる。ゆえに、Ｒｖ３６１６ｃは、結核感染（特に、潜伏結核感染）の予防、治療および診断において実質的に価値があると予想され得る。

対応するＨ３７Ｒｖ野生型配列または従来技術のＲｖ３６１６Δ１５０−１６０配列と等しいかまたはそれらよりも良好な発現を明らかに示すいくつかの改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質が調製された。Ｒｖ３６１６Δ１３８−１４５／ＡＳ０１Ｅの免疫原性が、ＣＢ６Ｆ１マウスにおいて確かめられた。

野生型配列の免疫原性を維持しつつ良好な発現特性を示す構築物が、商業的に実行可能なワクチン製品の生産への鍵である。この新しい改変されたＲｖ３６１６ｃタンパク質は、ワクチンなどのＲｖ３６１６ｃ組成物の商業生産において非常に価値があり得る。

前述の本発明は、理解を明らかにする目的で説明および例としていくらか詳細に記載されてきたが、本発明の教示に鑑みて、添付の請求項の精神または範囲から逸脱することなく、ある特定の変更および改変が本発明に対して行われ得ることが当業者には容易に明らかになるだろう。

本願において言及されたすべての参考文献（特許および特許出願を含む）は、各個別の刊行物または特許出願が明確かつ個別に参考として援用されると示されたかのように可能な最大の程度に本明細書に参考として援用される。

明細書およびこの後に続く請求項の全体を通して、文脈が別段求めない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびその変形（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」）は、述べられる整数、工程、整数の群または工程の群を含むが、他の任意の整数、工程、整数の群または工程の群を排除しないことを含意すると理解される。

Claims (27)

1. 改変されたRv3616cタンパク質であって、該タンパク質は、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドを含んでなり、該第１ポリペプチドは、該第２ポリペプチドに対してN末端側に位置しており、ここで、
   (i) 該第１ポリペプチドは、配列番号１の残基1〜134に対して少なくとも98％の同一性を有する配列であり、且つ
   (ii) 該第２ポリペプチドは、配列番号１の残基155〜392に対して少なくとも98％の同一性を有する配列であり、
   ここで、該第１及び第２ポリペプチドは、直接連結されているか、又は第３ポリペプチドを介して間接的に連結されており、該第３ポリペプチドは、少なくとも4個のアミノ酸の連続した部分が欠失している、配列番号１における残基135〜154に対応する配列に対して少なくとも90％の同一性を有する、前記改変されたRv3616cタンパク質。
2. 前記第１ポリペプチドが、配列番号１の残基1〜134に対して少なくとも99％の同一性を有する、請求項１記載の改変されたRv3616cタンパク質。
3. 前記第１ポリペプチドが、配列番号１の残基1〜134に対して100％の同一性を有する、請求項２記載の改変されたRv3616cタンパク質。
4. 前記第２ポリペプチドが、配列番号１の残基155〜392に対して少なくとも99％の同一性を有する、請求項１〜３のいずれか１項記載の改変されたRv3616cタンパク質。
5. 前記第２ポリペプチドが、配列番号１の残基155〜392に対して100％の同一性を有する、請求項４記載の改変されたRv3616cタンパク質。
6. ペプチド結合が直接的である、請求項１〜５のいずれか１項記載の改変されたRv3616cタンパク質。
7. ペプチド結合が間接的である、請求項１〜５のいずれか１項記載の改変されたRv3616cタンパク質。
8. 前記第３ポリペプチドが、少なくとも4個のアミノ酸の連続した部分が欠失している、配列番号１における残基135〜154に対応する配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列である、請求項７記載の改変されたRv3616cタンパク質。
9. 配列番号１における135〜154に対応する残基から欠失される連続した部分が、少なくとも5個のアミノ酸である、請求項１〜８のいずれか１項記載の改変されたRv3616cタンパク質。
10. 前記第３ポリペプチドが、20アミノ酸長又はそれ以下である、請求項７〜９のいずれか１項記載の改変されたRv3616cタンパク質。
11. 前記タンパク質が、500アミノ酸残基長より短い、請求項１〜１０のいずれか１項記載の改変されたRv3616cタンパク質。
12. 前記タンパク質が、400アミノ酸残基長より短い、請求項１１記載の改変されたRv3616cタンパク質。
13. 配列番号１６６のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１、１１及び１２のいずれか１項記載の改変されたRv3616cタンパク質。
14. 配列番号１６８のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１、１１及び１２のいずれか１項記載の改変されたRv3616cタンパク質。
15. 請求項１〜１４のいずれか１項記載の改変されたRv3616cタンパク質であって、該タンパク質は、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドから成り、該第１ポリペプチドは、該第２ポリペプチドに対してN末端側に位置しており、ここで、
    (i) 該第１ポリペプチドは、配列番号１の残基1〜134に対して少なくとも98％の同一性を有する配列であり、且つ
    (ii) 該第２ポリペプチドは、配列番号１の残基155〜392に対して少なくとも98％の同一性を有する配列であり、
    ここで、該第１及び第２ポリペプチドは、直接連結されているか、又は第３ポリペプチドを介して間接的に連結されており、該第３ポリペプチドは、少なくとも4個のアミノ酸の連続した部分が欠失している、配列番号１における残基135〜154に対応する配列に対して少なくとも90％の同一性を有する、前記改変されたRv3616cタンパク質。
16. 請求項１〜１５のいずれか１項記載の改変されたRv3616cタンパク質をコードする核酸配列を含んでなる、ポリヌクレオチド。
17. 請求項１〜１５のいずれか１項記載の改変されたRv3616cタンパク質をコードする核酸配列から成る、請求項１６記載のポリヌクレオチド。
18. 配列番号１６６又は１６８記載のポリペプチドをコードする配列を含んでなる、請求項１６又は１７記載のポリヌクレオチド。
19. (a) 請求項１〜１５のいずれか１項記載の改変されたRv3616cタンパク質と、
    (b) 非特異的な免疫応答増強剤と
    を含んでなる、免疫原性組成物。
20. (a) 請求項１６〜１８のいずれか１項記載のポリヌクレオチドと、
    (b) 非特異的な免疫応答増強剤と
    を含んでなる、免疫原性組成物。
21. 請求項１〜１５のいずれか１項記載の改変されたRv3616cタンパク質をコードする核酸配列を含んでなる、発現ベクター。
22. 請求項２１記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
23. 請求項１〜１５のいずれか１項記載の改変されたRv3616cタンパク質を組換え的に発現する宿主細胞。
24. 請求項１〜１５のいずれか１項記載の改変されたRv3616cタンパク質を生成するための方法であって、宿主細胞内で前記ポリペプチドをインビトロで組換え的に発現させることを含んでなる、前記方法。
25. 前記宿主細胞が、E. coliである、請求項２４記載の改変されたRv3616cタンパク質を生成するための方法。
26. 請求項１〜１５のいずれか１項記載の改変されたRv3616cタンパク質と、追加の異種ポリペプチドとを含んでなる、融合タンパク質。
27. 請求項２６記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
    

Images