ES2614266T3

ES2614266T3 - Antígenos de tuberculosis modificados

Info

Publication number: ES2614266T3
Application number: ES11700859.9T
Authority: ES
Inventors: Normand Blais; James Brown; Anne-Marie Gelinas; Pascal Mettens; Dennis Murphy
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA; Glaxo Group Ltd
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA; Glaxo Group Ltd
Priority date: 2010-01-27
Filing date: 2011-01-27
Publication date: 2017-05-30
Anticipated expiration: 2031-01-27
Also published as: JP2013517783A; CY1119518T1; CA2786969C; EP2528621A1; KR20120129927A; AU2011209399A1; MX2012008790A; EA201290590A1; SG182573A1; US9200044B2; US20150093414A1; US20120294882A1; JP2016166193A; CA2786969A1; CN102869372A; CN102869372B; PL2528621T3; MY156697A; WO2011092253A1; DK2528621T3

Abstract

Una proteína Rv3616c modificada, en la que se ha alterado la hidrofobicidad de los residuos de aminoácidos correspondientes a los residuos 134-183 de la secuencia de H37Rv, comprendiendo dicha proteína Rv3616c modificada un primer polipéptido y un segundo polipéptido, estándo el primer polipéptido localizado hacia el extremo N con respecto al segundo polipéptido, y en la que: (i) el primer polipéptido es una secuencia que tiene al menos una identidad del 98 % con los residuos 1-134 de la SEQ ID NO: 1; y (ii) el segundo polipéptido es una secuencia que tiene al menos una identidad del 98 % con los residuos 155- 392 de la SEQ ID NO: 1; en la que los primero y segundo polipéptidos están directamente unidos o indirectamente unidos por medio de un tercer polipéptido, teniendo dicho tercer polipéptido al menos una identidad del 80 % con una secuencia que corresponde a los residuos 135-154 de la SEQ ID NO: 1, en la que se ha suprimido una porción contigua de al menos 3 aminoácidos.

Description

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DESCRIPCIÓN

Antígenos de tuberculosis modificados

Campo de la invención

La presente invención se refiere a proteínas Rv3616c de Mycobacterium tuberculosis modificadas, a los

5 polinucleótidos asociados y al uso de tales proteínas y polinucleótidos en el tratamiento o en la prevención de la tuberculosis, en particular al uso en el tratamiento o en la prevención de tuberculosis latente y en la prevención o el retraso de la reactivación de la tuberculosis.

Antecedentes de la invención

La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa crónica causada por una infección con Mycobacterium

10 tuberculosis y con otras especies de Mycobacterium. Es una enfermedad importante en los países en desarrollo, así como un problema creciente en las áreas desarrolladas del mundo. Se cree que más de 2 mil millones de personas están infectadas con bacilos de tuberculosis (TB), con aproximadamente 9,2 millones de nuevos casos de tuberculosis (TB) y 1,7 millones de muertes cada año. El 10 % de aquéllos infectados con bacilos de tuberculosis (TB) desarrollarán la tuberculosis (TB) activa, en donde cada persona con la tuberculosis (TB) activa infectará a un

15 promedio de otras 10 a 15 personas al año. Aunque los índices de incidencia anuales han llegado a su pico globalmente, el número de muertes y casos todavía se está elevando debido al crecimiento de la población (World Health Organisation [Organización Mundial de la Salud] Tuberculosis Facts, 2008).

Mycobacterium tuberculosis infecta a los individuos a través de las vías respiratorias. Los macrófagos alveolares rodean completamente a la bacteria, pero ésta puede sobrevivir y proliferar mediante la inhibición de la fusión del

20 fagosoma con los lisosomas ácidos. Sigue una respuesta inmunitaria compleja que involucra a las células T CD4+ y CD8+, dando como resultado por último la formación de un granuloma. Central para el éxito de la Mycobacterium tuberculosis como un patógeno, es el hecho de que la bacteria aislada, pero no erradicada, puede persistir durante largos períodos, dejando a un individuo vulnerable al desarrollo posterior de la tuberculosis (TB) activa.

Menos del 5 % de los individuos infectados desarrollan la tuberculosis (TB) activa en los primeros años después de

25 la infección. El granuloma puede persistir durante décadas, y se cree que contiene la Mycobacterium tuberculosis viva en un estado de latencia, privada de oxígeno y nutrientes. Sin embargo, recientemente se ha sugerido que la mayoría de las bacterias en el estado latente se localizan en los tipos de células que no son macrófagos, extendidas a través de todo el cuerpo (Locht y col., Expert Opin. Biol. Ther. 2007 7(11) : 1665-1677). El desarrollo de la tuberculosis (TB) activa se presenta cuando cambia el equilibrio entre la inmunidad natural del huésped y el

30 patógeno, por ejemplo, como un resultado de un evento inmunosupresor (Anderson P, Trends in Microbiology, 2007 15(1) : 7-13; Ehlers S Infection 2009 37(2) : 87-95).

También se ha propuesto una hipótesis dinámica que describe el equilibrio entre la tuberculosis (TB) latente y la tuberculosis (TB) activa (Cardana P-J, Inflammation & Allergy – Drug Targets, 2006, 6: 27-39; Cardana P-J, Infection, 2009 37(2) : 80-86).

35 Aunque una infección puede ser asintomática durante un período de tiempo considerable, la enfermedad activa se manifiesta más comúnmente como una inflamación aguda de los pulmones, que da como resultado cansancio, pérdida de peso, fiebre, y una tos persistente. Si no se trata, resultan complicaciones serias no tratadas, y típicamente la muerte.

En términos generales, la tuberculosis se puede controlar utilizando una terapia prolongada con antibióticos, aunque

40 este tratamiento no es suficiente para prevenir la extensión de la enfermedad. Los individuos activamente infectados pueden ser en gran parte asintomáticos, pero contagiosos, durante algún tiempo. En adición, aunque es crítico el cumplimiento con el régimen de tratamiento, es difícil monitorear el comportamiento del paciente. Algunos pacientes no completan el curso del tratamiento, lo cual puede conducir a un tratamiento inefectivo y al desarrollo de resistencia al fármaco.

45 La tuberculosis (TB) resistente a múltiples fármacos (MDR-TB) es una forma que fracasa para responder a los medicamentos de primera línea. El 5 % de todos los casos de tuberculosis (TB) son de tuberculosis (TB) resistente a múltiples fármacos (MDR-TB), presentándose una estimación de 490,000 nuevos casos de tuberculosis (TB) resistente a múltiples fármacos (MDR-TB) cada año. La tuberculosis (TB) extensamente resistente a fármacos (XDR-TB) se presenta cuando se desarrolla resistencia a los medicamentos de segunda línea, en la parte superior de la

50 tuberculosis (TB) resistente a múltiples fármacos (MDR-TB). Se estima que se presentan 40,000 nuevos casos de la tuberculosis (TB) extensamente resistente a fármacos (XDR-TB) virtualmente no tratable anualmente (World Health Organisation [Organización Mundial de la Salud], Tuberculosis Facts, 2008).

Incluso cuando se complete un curso completo de tratamiento con antibióticos, puede no erradicarse la infección con

M. tuberculosis del individuo infectado, y puede permanecer como una infección latente que se puede reactivar.

55 Con el objeto de controlar la extensión de la tuberculosis, es de suma importancia un programa de vacunación efectivo y un diagnóstico oportuno preciso de la enfermedad.

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Actualmente, la vacunación con las bacterias vivas es el método más ampliamente empleado para inducir la inmunidad protectora. La Mycobacterium más habitual empleada para este propósito es el bacilo de Calmette-Guerin (BCG), una cepa avirulenta de M. bovis que fue primeramente desarrollada hace más de 60 años. Sin embargo, la

5 seguridad y eficacia de el BCG es una fuente de controversia -aunque protege contra la manifestación grave de la enfermedad en los niños, el BCG no previene el establecimiento de la tuberculosis (TB) latente o la reactivación de la enfermedad pulmonar en la vida adulta. Adicionalmente, algunos países, tales como los Estados Unidos, no vacunan al público en general con este agente.

Casi todas las vacunas para tuberculosis (TB) de nueva generación que están actualmente en desarrollo clínico, se

10 han diseñado como vacunas previas a la exposición. Éstas incluyen vacunas subunitarias, las cuales han sido particularmente efectivas para reforzar la inmunidad inducida por la vacunación previa con BCG, y las vacunas micobacterianas vivas avanzadas que tienen como objetivo reemplazar a el BCG con cepas más eficientes y/o más seguras. Aunque estas vacunas tienen como objetivo mejorar la resistencia a la infección, tienen probabilidades de ser menos efectivas como vacunas posteriores a la exposición o como vacunas terapéuticas en los casos de

15 tuberculosis (TB) latente (Lin MY y col., Endocrine, Metabolic & Immune Disorders – Drug Targets, 2008, 8: 15-29).

El Ejemplo 2 del documento US20080269151 da a conocer la clonación, construcción y expresión de ciertas proteínas Rv3616c modificadas, incluyendo: ΔTM-1, un polipéptido de Rv3616c, en donde se han suprimido los residuos 150 a 160 (SEQ ID No: 22 de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US20080269151) ; ΔTM-2, un polipéptido de Rv3616c, en donde se han suprimido los residuos 101 a 203 (SEQ ID No: 24 del

20 documento US20080269151) ; y una secuencia en donde los residuos 150 a 160 de Rv3616c han sido reemplazados por el antígeno TbH9 (SEQ ID No: 60 del documento US20080269151).

Breve sumario de la invención

La presente invención se refiere, en términos generales, al uso de polipéptidos de Rv3616c modificados, o de los polinucleótidos que los codifican, en el campo de las infecciones micobacterianas latentes. Adicionalmente, la

25 presente invención se refiere a proteínas Rv3616c modificadas particulares. Los inventores han descubierto, de una manera sorprendente, que la alteración de la hidrofobicidad de una región particular de una secuencia de Rv3616c puede conducir a una mejor expresión sin un impacto perjudicial a las propiedades inmunogénicas. Las proteínas Rv3616c modificadas son útiles como antígenos de tuberculosis (TB), en particular como antígenos de tuberculosis (TB) latente.

30 En su aspecto más amplio, la presente invención proporciona una proteína Rv3616c modificada, en donde se ha alterado la hidrofobicidad de los residuos de aminoácidos correspondientes a los residuos 134-183 de la secuencia de H37Rv, de una manera adecuada una proteína Rv3616c modificada, en donde se ha alterado la hidrofobicidad de los residuos de aminoácidos correspondientes a los residuos 135-154 de la secuencia de H37Rv.

En un aspecto de la invención, se proporciona una proteína Rv3616c modificada, comprendiendo dicha proteína

35 Rv3616c modificada, un primer polipéptido y un segundo polipéptido, localizándose el primer polipéptido hacia el extremo C de la proteína Rv3616c modificada en relación con el segundo polipéptido, y en la que:

(i) el primer polipéptido es una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con los residuos 1-133 de la SEQ ID NO: 1; y

(ii) el segundo polipéptido es una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con los residuos 184-392 40 de la SEQ ID NO: 1;

en la que los primero y segundo polipéptidos están unidos directa o indirectamente.

En un segundo aspecto de la invención, se proporciona una proteína Rv3616c modificada, comprendiendo esta proteína Rv3616c modificada, un primer polipéptido y un segundo polipéptido, localizándose el primer polipéptido hacia el extremo C de la proteína Rv3616c modificada en relación con el segundo polipéptido, y en la que:

45 (i) el primer polipéptido es una secuencia contigua de al menos 100 aminoácidos dentro de los residuos 1-133 de la SEQ ID NO: 1; y

(ii) el segundo polipéptido es una secuencia contigua de al menos 155 aminoácidos dentro de los residuos 184-392 de la SEQ ID NO: 1;

50 En un tercer aspecto de la invención, se proporciona una proteína Rv3616c modificada, comprendiendo esta proteína o, de una manera alternativa, consistiendo esencialmente o consistiendo en, una secuencia de Rv3616c, en donde al menos un aminoácido (por ejemplo, al menos 2) ha sido suprimido de la región correspondiente a los residuos 134-183 de la SEQ ID NO: 1.

Un cuarto aspecto de la invención proporciona una proteína Rv3616c modificada, comprendiendo esta proteína un primer polipéptido y un segundo polipéptido, localizándose el primer polipéptido hacia el extremo N en relación con el segundo polipéptido, y en la que

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(i) el primer polipéptido es una secuencia contigua de al menos 100 aminoácidos dentro de los residuos 1-133 de la SEQ ID NO: 1; y

5 (ii) el segundo polipéptido es una secuencia contigua de al menos 155 aminoácidos dentro de los residuos 184-392 de la SEQ ID NO: 1;

en la que los primero y segundo polipéptidos están unidos directa o indirectamente por medio de un tercer polipéptido, correspondiendo dicho tercer polipéptido a los residuos 134-183 de la SEQ ID NO: 1, en la que se ha suprimido al menos 1 aminoácido (por ejemplo, al menos 2).

10 Un quinto aspecto de la invención proporciona proteínas Rv3616c modificadas, las cuales comprenden un primer polipéptido y un segundo polipéptido, localizándose el primer polipéptido hacia el extremo N en relación con el segundo polipéptido, y en en la que:

(i) el primer polipéptido es una secuencia contigua de al menos 100 aminoácidos dentro de los residuos 1-134 de la SEQ ID NO: 1; y

15 (ii) el segundo polipéptido es una secuencia contigua de al menos 175 aminoácidos dentro de los residuos 155-392 de la SEQ ID NO: 1;

en la que los primero y segundo polipéptidos están ya sea directamente unidos o bien indirectamente unidos por medio de un tercer polipéptido, en donde este tercer polipéptido corresponde a los residuos 135-154 de la SEQ ID NO: 1, en en la que se ha suprimido al menos 1 aminoácido (por ejemplo, al menos 2).

20 Un sexto aspecto de la invención proporciona una proteína Rv3616c modificada, comprendiendo dicha proteína un primer polipéptido y un segundo polipéptido, localizándose el primer polipéptido hacia el extremo N en relación con el segundo polipéptido, y en la que:

(i) el primer polipéptido es una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad con los residuos 1-133 de la SEQ ID NO: 1; y

25 (ii) el segundo polipéptido es una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad con los residuos 184-392 de la SEQ ID NO: 1;

en la que los primero y segundo polipéptidos están directamente unidos o indirectamente unidos por medio de un tercer polipéptido, teniendo este tercer polipéptido al menos el 90 % de identidad con una secuencia correspondiente a los residuos 134-183 de la SEQ ID NO: 1, en donde se ha suprimido una porción contigua de al menos 3

30 aminoácidos (por ejemplo, de al menos 4).

Un séptimo aspecto de la invención proporciona proteínas Rv3616c modificadas, que comprenden un primer polipéptido y un segundo polipéptido, localizándose el primer polipéptido hacia el extremo N en relación con el segundo polipéptido, y en la que:

(i) el primer polipéptido es una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad con los residuos 1-134 de la 35 SEQ ID NO: 1; y

(ii) el segundo polipéptido es una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad con los residuos 155-392 de la SEQ ID NO: 1;

en la que los primero y segundo polipéptidos están ya sea directamente unidos o bien indirectamente unidos por medio de un tercer polipéptido, teniendo este tercer polipéptido al menos el 80 % de identidad con una secuencia

40 correspondiente a los residuos 135-154 de la SEQ ID NO: 1, en donde se ha suprimido una porción contigua de al menos 3 aminoácidos (por ejemplo, de al menos 4).

En un octavo aspecto de la invención, se proporciona una proteína Rv3616c modificada, comprendiendo dicha proteína una secuencia de Rv3616c, en donde una porción contigua de al menos 3 aminoácidos (por ejemplo, de al menos 4) a partir de la región correspondiente a los residuos 134-183 de la SEQ ID NO: 1 ha sido sustituida con

45 residuos hidrofílicos.

Las proteínas Rv3616c modificadas se pueden basar en una secuencia de proteína Rv3616c de tipo silvestre a partir de cualquier cepa de M. tuberculosis. Por ejemplo, una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-7, en particular una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-6, puede sustituir a la SEQ ID NO: 1 en las realizaciones anteriores.

Las proteínas Rv3616c modificadas de ejemplo de acuerdo con la presente invención, son aquéllas que comprenden

50 las secuencias de aminoácidos proporcionadas en las SEQ ID NOs: 161-169, 179 y 180 (tales como aquéllas que consisten en las secuencias de aminoácidos proporcionadas en las SEQ ID NOs: 161-169, 179 y 180). Son de un interés particular aquéllas que comprenden las secuencias de aminoácidos proporcionadas en las SEQ ID NOs: 161, 163-169, 179 y 180 (tales como aquéllas que consisten en las secuencias de aminoácidos proporcionadas en las SEQ ID NOs: 161, 163-169, 179 y 180).

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También se proporcionan estas proteínas Rv3616c modificadas para su uso como medicamentos.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende la administración de una proteína Rv3616c modificada.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para el tratamiento, la mejora, o la prevención de

5 tuberculosis (TB), que comprende la administración de una cantidad efectiva de una proteína Rv3616c modificada a un sujeto que lo necesite, en donde este polipéptido induce una respuesta inmunitaria. En un aspecto adicional, el método comprende además inducir una respuesta inmunitaria contra Mycobacterium tuberculosis.

El uso de una proteína Rv3616c modificada en la elaboración de un medicamento para el tratamiento, la mejora, o la prevención de tuberculosis (TB), representa otro aspecto de la invención.

10 La presente invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína Rv3616c modificada. Los polinucleótidos de ejemplo que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica proteínas Rv3616c modificadas, son aquéllos que comprenden las secuencias de nucleótidos proporcionadas en las SEQ ID NOs: 170-178, tales como aquéllos que consisten en las secuencias de nucleótidos proporcionadas en las SEQ ID NOs: 170-178. Otros polinucleótidos de ejemplo que comprenden una secuencia de

15 ácido nucleico que codifica proteínas Rv3616c modificadas, son aquéllos que comprenden (por ejemplo, que consisten en) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos proporcionada en las SEQ ID NOs: 161-169, 179 o 180, tal como en las SEQ ID NOs: 161, 163-169, 179 o 180.

También se proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína Rv3616c modificada para utilizarse como un medicamento.

20 Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende la administración de un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína Rv3616c modificada.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para el tratamiento, la mejora, el retardo, o la prevención de la reactivación de tuberculosis, que comprende la administración de una cantidad efectiva de un polinucleótido

25 que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína Rv3616c modificada a un sujeto que lo necesite, en donde este polipéptido induce una respuesta inmunitaria. En un aspecto adicional, el método comprende además inducir una respuesta inmunitaria contra Mycobacterium tuberculosis.

El uso de un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una proteína Rv3616c modificada en la elaboración de un medicamento para el tratamiento, la mejora, o

30 la prevención de tuberculosis (TB), representa otro aspecto de la invención.

Adicionalmente, se proporciona una composición farmacéutica, que comprende:

(a): una proteína Rv3616c modificada; o

(b): un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína Rv3616c

modificada; 35 y

(c) un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Además, se proporciona una composición inmunogénica, que comprende:

(a): una proteína Rv3616c modificada; o

40 modificada; y

(c) un potenciador no específico de la respuesta inmunitaria.

También se proporciona un vector de expresión, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína Rv3616c modificada.

45 Las células huésped, transformadas con este vector de expresión, forman un aspecto adicional de la invención. Adicionalmente, se proporciona una célula huésped que expresa de una manera recombinante una proteína Rv3616c modificada.

Además, se proporciona un método para la producción de una proteína Rv3616c modificada; comprendiendo este método la etapa de expresar de una manera recombinante el polipéptido dentro de una célula huésped.

50 También se proporcionan kits de diagnóstico, que comprenden:

(a): una proteína Rv3616c modificada;

(b): un aparato suficiente para poner en contacto la proteína Rv3616c modificada con una muestra (por ejemplo,

sangre entera, o de una manera más adecuada, células mononucleares de sangre periférica (PBMC)) a partir de un individuo; y

(c): medios para cuantificar la respuesta de células T de la muestra.

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Otro aspecto de la invención se refiere a un kit de diagnóstico, que comprende:

5 (a) una proteína Rv3616c modificada; y

(b) un aparato suficiente para poner en contacto la proteína Rv3616c modificada con las células dérmicas de un paciente.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para detectar la infección por Mycobacterium tuberculosis en un sujeto, que comprende:

10 (a) poner en contacto una muestra a partir del sujeto mencionado, con una proteína Rv3616c modificada; y

(b) detectar, en la muestra biológica, la presencia de anticuerpos que se enlacen a la proteína Rv3616c modificada.

La invención también proporciona un kit de diagnóstico, que comprende:

(a) una proteína Rv3616c modificada, cuya proteína se inmoviliza opcionalmente sobre un soporte sólido; y 15 (b) un reactivo de detección.

En una realización, el sujeto que recibe una proteína Rv3616c modificada, un polinucleótido o una composición de acuerdo con la invención, puede tener tuberculosis activa (por ejemplo, la infección activa por M. tuberculosis). En una segunda realización, el sujeto puede tener tuberculosis latente (por ejemplo, la infección latente por M. tuberculosis). En una tercera realización, el sujeto puede estar libre de tuberculosis (por ejemplo, libre de la infección

20 por M. tuberculosis).

Un sujeto que recibe una proteína Rv3616c modificada, un polinucleótido o una composición de acuerdo con la invención, puede haber sido vacunado previamente para tuberculosis (por ejemplo, puede haber sido vacunado contra la infección por M. tuberculosis), tal como puede haber sido vacunado con un Bacillus Calmette-Guerin (BCG). De una manera alternativa, un sujeto que recibe un polipéptido, polinucleótido o una composición de la

25 invención, puede no haber sido vacunado previamente para tuberculosis (por ejemplo, puede no haber sido vacunado contra la infección por M. tuberculosis), tal como puede no haber sido vacunado con un Bacillus Calmette-Guerin (BCG).

Una proteína Rv3616c modificada, un polinucleótido o una composición de acuerdo con la invención, se puede proporcionar para el propósito de:

30 -tratar la tuberculosis activa; -prevenir la tuberculosis activa (tal como mediante su administración a un sujeto que no esté infectado, o de una

manera alternativa, a un sujeto que tenga una infección latente) ; -tratar la tuberculosis latente; -prevenir la tuberculosis latente; o

35 -prevenir o retardar la reactivación de tuberculosis (en especial la demora de la reactivación de tuberculosis (TB), por ejemplo, por un período de meses, años, o incluso indefinidamente).

También se proporciona un método para el tratamiento de tuberculosis (TB) latente, que comprende las etapas de:

(i) identificar en un sujeto que tiene una infección por tuberculosis (TB) latente (por ejemplo, mediante ensayos basados en PPD o en células T) ; y

40 (ii) administrar a este sujeto, una cantidad segura y efectiva de una proteína Rv3616c modificada, o de un polinucleótido que codifique una proteína Rv3616c modificada (tal como en la forma de una composición farmacéutica o de una composición inmunogénica).

También se proporciona el uso de un polipéptido de la presente invención, en la elaboración de un kit de diagnóstico para la identificación de tuberculosis (TB) (por ejemplo, tuberculosis (TB) latente) en un sujeto de prueba.

45 Description de las figuras

Figura 1: Alineación del péptido de Rv3616c con la secuencia de longitud completa. Figura 2: Respuestas de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a los péptidos de Rv3616c. Figura 3: Porcentaje de células CD4 y CD8 a partir de ratones CB6F1 inmunizados que expresan 50 citocinas IFN-gamma y/o IL-2 y/o TNF-alfa en el día 21 (es decir, 7 días después de la segunda inmunización). Figura 4: Perfil de citocinas en el día 21 (es decir, 7 días después de la segunda inmunización) de la respuesta de CD4 específica del antígeno en los ratones CB6F1 inmunizados. Figura 5: Perfil de citocinas en el día 21 (es decir, 7 días después de la segunda inmunización) de la

5

15

25

35

45

55

respuesta de CD8 específica del antígeno en los ratones CB6F1 inmunizados.

Figura 6: Porcentaje de células CD4 y CD8 a partir de ratones CB6F1 inmunizados que expresan citocinas IFN-gamma y/o IL-2 y/o TNF-alfa en el día 35 (es decir, 7 días después de la tercera inmunización).

Figura 7: Perfil de citocinas en el día 35 (es decir, 7 días después de la tercera inmunización) de la respuesta de CD4 específica del antígeno en los ratones CB6F1 inmunizados. Figura 8: Perfil de citocinas en el día 35 (es decir, 7 días después de la tercera inmunización) de la respuesta de CD8 específica del antígeno en los ratones CB6F1 inmunizados.

Figura 9: Porcentaje de células CD4 y CD8 a partir de los ratones C57BL/6 inmunizados que expresan citocinas IFN-gamma y/o IL-2 y/o TNF-alfa en el día 21 (es decir, 7 días después de la segunda inmunización).

Figura 10: Perfil de citocinas en el día 21 (es decir, 7 días después de la segunda inmunización) de la respuesta de CD4 específica del antígeno en los ratones C57BL/6 inmunizados.

Figura 11: Porcentaje de células CD4 y CD8 a partir de los ratones C57BL/6 inmunizados que expresan citocinas IFN-gamma y/o IL-2 y/o TNF-alfa en el día 35 (es decir, 7 días después de la tercera inmunización).

Figura 12: Perfil de citocinas en el día 35 (es decir, 7 días después de la tercera inmunización) de la respuesta de CD4 específica del antígeno en los ratones C57BL/6 inmunizados. Figura 13: Perfil de citocinas en el día 35 (es decir, 7 días después de la tercera inmunización) de la respuesta de CD8 específica del antígeno en los ratones C57BL/6 inmunizados. Figura 14: Respuestas de células T CD4 específicas del antígeno en seres humanos limpios y

latentemente infectados. Figura 15: Alineación de secuencias de proteína Rv3616c de tipo silvestre. Figuras 16A y 16B: Alineación de secuencias de proteína Rv3616c modificada de ejemplo. Figura 17: Resultados de SDS-PAGE de los experimentos de expresión inicial del antígeno. Figura 18: Resultados de SDS-PAGE de los experimentos de otra expresión del antígeno. Figura 19: Resultados de SDS-PAGE de los experimentos de expresión adicional del antígeno. Figura 20: Porcentaje de células CD4 a partir de los ratones inmunizados que expresan citocinas IFN

gamma y/o IL-2 y/o TNF-alfa a los 7 días después de la segunda, y a los 7 días después de la tercera inmunización con Rv3616Δ138-145. Figura 21: Perfil de citocinas de la respuesta de células T CD4 específica de Rv3616 a los 7 días después de la segunda inmunización con Rv3616Δ138-145. Figura 22: Perfil de citocinas de la respuesta de células T CD4 específica de Rv3616 a los 7 días después de la tercera inmunización con Rv3616Δ138-145.

Figura 23: Porcentaje de células CD8 a partir de los ratones inmunizados que expresan citocinas IFNgamma y/o IL-2 y/o TNF-alfa a los 7 días después de la segunda, y a los 7 días después de la tercera inmunización con Rv3616Δ138-145.

Figura 24: Perfil de citocinas de la respuesta de células T CD8 específica de Rv3616 a los 7 días después de la segunda inmunización con Rv3616Δ138-145. Figura 25: Perfil de citocinas de la respuesta de células T CD8 específica de Rv3616 a los 7 días después de la tercera inmunización con Rv3616Δ138-145.

Descripción de las secuencias del listado

SEQ ID No: 1: secuencia de polipéptido de Rv3616c a partir de M. tuberculosis cepa H37Rv. SEQ ID No: 2: secuencia de polinucleótido de Rv3616c a partir de M. tuberculosis cepa H37Rv. SEQ ID No: 3: secuencia de polipéptido de Rv3616c a partir de M. tuberculosis cepa CDC1551. SEQ ID No: 4: secuencia de polipéptido de Rv3616c a partir de M. tuberculosis cepa F11. SEQ ID No: 5: secuencia de polipéptido de Rv3616c a partir de M. tuberculosis cepa Haarlem A. SEQ ID No: 6: secuencia de polipéptido de Rv3616c a partir de M. tuberculosis cepa C. SEQ ID No: 7: secuencia de polipéptido de Rv3616c a partir de BCG. SEQ ID No: 8: secuencia de polipéptido de Mtb8.4. SEQ ID No: 9: secuencia de polipéptido de Mtb9.8. SEQ ID No: 10: secuencia de polipéptido de Mtb9.9. SEQ ID No: 11: secuencia de polipéptido de Ra12. SEQ ID No: 12: secuencia de polipéptido de Ra35. SEQ ID No: 13: secuencia de polipéptido de TbH9. SEQ ID No: 14: secuencia de polipéptido de Mtb41. SEQ ID No: 15: secuencia de polipéptido de ESAT-6. SEQ ID No: 16: secuencia de polipéptido de Ag85A. SEQ ID No: 17: secuencia de polipéptido de Ag85B. SEQ ID No: 18: secuencia de polipéptido de alfa-cristalina. SEQ ID No: 19: secuencia de polipéptido de MPT64. SEQ ID No: 20: secuencia de polipéptido de Mtb32A. SEQ ID No: 21: secuencia de polipéptido de Mtb32A madura mutada en Ser/Ala. SEQ ID No: 22: secuencia de polipéptido de TB10.4.

SEQ ID No: 23: secuencia de polipéptido de Mtb72f. SEQ ID No: 24: secuencia de polipéptido de M72. SEQ ID No: 25: secuencia de polipéptido de Mtb71f. SEQ ID No: 26: secuencia de polipéptido de fusión M92. 5 SEQ ID No: 27: secuencia de polipéptido de fusión M103. SEQ ID No: 28: secuencia de polipéptido de fusión M114. SEQ ID No: 29: epítopo de células CD4 humano supuesto 1. SEQ ID No: 30: epítopo de células CD4 humano supuesto 2. SEQ ID No: 31: epítopo de células CD4 humano supuesto 3. SEQ ID No: 32: epítopo de células CD4 humano supuesto 4. SEQ ID No: 33: epítopo de células CD4 humano supuesto 5. SEQ ID No: 34: epítopo de células CD4 humano supuesto 6. SEQ ID No: 35: epítopo de células CD4 humano supuesto 7. SEQ ID No: 36: epítopo de células CD4 humano supuesto 8. 15 SEQ ID No: 37: epítopo de células CD4 humano supuesto 9. SEQ ID No: 38: epítopo de células CD4 humano supuesto 10. SEQ ID No: 39: epítopo de células CD4 humano supuesto 11. SEQ ID No: 40: epítopo de células CD4 humano supuesto 12. SEQ ID No: 41: epítopo de células CD4 humano supuesto 13. SEQ ID No: 42: epítopo de células CD4 humano supuesto 14. SEQ ID No: 43: epítopo de células CD4 humano supuesto 15. SEQ ID No: 44: epítopo de células CD4 humano supuesto 16. SEQ ID No: 45: epítopo de células CD4 humano supuesto 17. SEQ ID No: 46: epítopo de células CD4 humano supuesto 18. 25 SEQ ID No: 47: epítopo de células CD4 humano supuesto 19. SEQ ID No: 48: epítopo de células CD8 humano supuesto 1. SEQ ID No: 49: epítopo de células CD8 humano supuesto 2. SEQ ID No: 50: epítopo de células CD8 humano supuesto 3. SEQ ID No: 51: epítopo de células CD8 humano supuesto 4. SEQ ID No: 52: epítopo de células CD8 humano supuesto 5. SEQ ID No: 53: epítopo de células CD8 humano supuesto 6. SEQ ID No: 54: epítopo de células CD8 humano supuesto 7. SEQ ID No: 55: epítopo de células CD8 humano supuesto 8. SEQ ID No: 56: epítopo de células CD8 humano supuesto 9. 35 SEQ ID No: 57: epítopo de células CD8 humano supuesto 10. SEQ ID No: 58: epítopo de células CD8 humano supuesto 11. SEQ ID No: 59: epítopo de células CD8 humano supuesto 12. SEQ ID No: 60: epítopo de células CD8 humano supuesto 13. SEQ ID No: 61: epítopo de células CD8 humano supuesto 14. SEQ ID No: 62: epítopo de células CD8 humano supuesto 15. SEQ ID No: 63: epítopo de células CD8 humano supuesto 16. SEQ ID No: 64: epítopo de células CD8 humano supuesto 17. SEQ ID No: 65: epítopo de células CD8 humano supuesto 18. SEQ ID No: 66: epítopo de células CD8 humano supuesto 19. 45 SEQ ID No: 67: epítopo de células CD8 humano supuesto 20. SEQ ID No: 68: epítopo de células CD8 humano supuesto 21. SEQ ID No: 69: epítopo de células CD8 humano supuesto 22. SEQ ID No: 70: epítopo de células CD8 humano supuesto 23. SEQ ID No: 71: epítopo de células CD8 humano supuesto 24. SEQ ID No: 72: epítopo de células CD8 humano supuesto 25. SEQ ID No: 73: epítopo de células CD8 humano supuesto 26. SEQ ID No: 74: epítopo de células CD8 humano supuesto 27. SEQ ID No: 75: epítopo de células CD8 humano supuesto 28. SEQ ID No: 76: epítopo de células CD8 humano supuesto 29. 55 SEQ ID No: 77: epítopo de células CD8 humano supuesto 30. SEQ ID No: 78: epítopo de células CD8 humano supuesto 31. SEQ ID No: 79: epítopo de células CD8 humano supuesto 32. SEQ ID No: 80: epítopo de células CD8 humano supuesto 33. SEQ ID No: 81: epítopo de células CD8 humano supuesto 34. SEQ ID No: 82: epítopo de células CD8 humano supuesto 35. SEQ ID No: 83: epítopo de células CD8 humano supuesto 36. SEQ ID No: 84: epítopo de células CD8 humano supuesto 37. SEQ ID No: 85: epítopo de células CD8 humano supuesto 38. SEQ ID No: 86: epítopo de células CD8 humano supuesto 39. 65 SEQ ID No: 87: epítopo de células CD8 humano supuesto 40. SEQ ID No: 88: epítopo de células CD8 humano supuesto 41.

SEQ ID No: 89: epítopo de células CD8 humano supuesto 42. SEQ ID No: 90: epítopo de células CD8 humano supuesto 43. SEQ ID No: 91: epítopo de células CD8 humano supuesto 44. SEQ ID No: 92: epítopo de células CD8 humano supuesto 45. 5 SEQ ID No: 93: epítopo de células CD8 humano supuesto 46. SEQ ID No: 94: epítopo de células CD8 humano supuesto 47. SEQ ID No: 95: epítopo de células CD8 humano supuesto 48. SEQ ID No: 96: epítopo de células CD8 humano supuesto 49. SEQ ID No: 97: epítopo de células CD8 humano supuesto 50. SEQ ID No: 98: epítopo de células CD8 humano supuesto 51. SEQ ID No: 99: epítopo de células CD8 humano supuesto 52. SEQ ID No: 100: epítopo de células CD8 humano supuesto 53. SEQ ID No: 101: epítopo de células CD8 humano supuesto 54. SEQ ID No: 102: epítopo de células CD8 humano supuesto 55. 15 SEQ ID No: 103: epítopo de células CD8 humano supuesto 56. SEQ ID No: 104: epítopo de células CD8 humano supuesto 57. SEQ ID No: 105: epítopo de células CD8 humano supuesto 58. SEQ ID No: 106: epítopo de células CD8 humano supuesto 59. SEQ ID No: 107: epítopo de células CD8 humano supuesto 60. SEQ ID No: 108: epítopo de células CD8 humano supuesto 61. SEQ ID No: 109: epítopo de células CD8 humano supuesto 62. SEQ ID No: 110: epítopo de células CD8 humano supuesto 63. SEQ ID No: 111: epítopo de células CD8 humano supuesto 64. SEQ ID No: 112: epítopo de células CD8 humano supuesto 65. 25 SEQ ID No: 113: epítopo de células CD8 humano supuesto 66. SEQ ID No: 114: epítopo de células CD8 humano supuesto 67. SEQ ID No: 115: epítopo de células CD8 humano supuesto 68. SEQ ID No: 116: epítopo de células CD8 humano supuesto 69. SEQ ID No: 117: epítopo de células CD8 humano supuesto 70. SEQ ID No: 118: epítopo de células CD8 humano supuesto 71. SEQ ID No: 119: epítopo de células CD8 humano supuesto 72. SEQ ID No: 120: epítopo de células CD8 humano supuesto 73. SEQ ID No: 121: epítopo de células CD8 humano supuesto 74. SEQ ID No: 122: epítopo de células CD8 humano supuesto 75. 35 SEQ ID No: 123: epítopo de células CD8 humano supuesto 76. SEQ ID No: 124: epítopo de células CD8 humano supuesto 77. SEQ ID No: 125: epítopo de células CD8 humano supuesto 78. SEQ ID No: 126: epítopo de células CD8 humano supuesto 79. SEQ ID No: 127: péptido 1. SEQ ID No: 128: péptido 2. SEQ ID No: 129: péptido 3. SEQ ID No: 130: péptido 4. SEQ ID No: 131: péptido 5. SEQ ID No: 132: péptido 6. 45 SEQ ID No: 133: péptido 7. SEQ ID No: 134: péptido 8. SEQ ID No: 135: péptido 9. SEQ ID No: 136: péptido 10. SEQ ID No: 137: péptido 11. SEQ ID No: 138: péptido 12. SEQ ID No: 139: péptido 13. SEQ ID No: 140: péptido 14. SEQ ID No: 141: péptido 15. SEQ ID No: 142: péptido 16. 55 SEQ ID No: 143: péptido 17. SEQ ID No: 144: péptido 18. SEQ ID No: 145: péptido 19. SEQ ID No: 146: péptido 20. SEQ ID No: 147: péptido 21. SEQ ID No: 148: péptido 22. SEQ ID No: 149: péptido 23. SEQ ID No: 150: péptido 24. SEQ ID No: 151: péptido 25. SEQ ID No: 152: péptido 26. 65 SEQ ID No: 153: péptido 27. SEQ ID No: 154: péptido 28.

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SEQ ID No: 155: péptido 29. SEQ ID No: 156: péptido 30. SEQ ID No: 157: secuencia de polipéptido de Rv1753c a partir de M. tuberculosis cepa H37Rv. SEQ ID No: 158: secuencia de polipéptido de Rv2386c a partir de M. tuberculosis cepa H37Rv. SEQ ID No: 159: secuencia de polipéptido de Rv2707c a partir de M. tuberculosis cepa H37Rv. SEQ ID No: 160: secuencia de polinucleótido de codones optimizados de E. coli para Rv3616c a partir de M. tuberculosis cepa H37Rv. SEQ ID No: 161: secuencia de polipéptido de Rv3616cΔ136-183 derivada a partir de M. tuberculosis cepa H37Rv. SEQ ID No: 162: secuencia de polipéptido de Rv3616cΔ150-160 derivada a partir de M. tuberculosis cepa H37Rv. SEQ ID No: 163: secuencia de polipéptido de Rv3616cΔ136-154 derivada a partir de M. tuberculosis cepa H37Rv. SEQ ID No: 164: secuencia de polipéptido de Rv3616cΔ166-182 derivada a partir de M. tuberculosis cepa H37Rv. SEQ ID No: 165: secuencia de polipéptido de Rv3616cΔ135-139 derivada a partir de M. tuberculosis cepa H37Rv. SEQ ID No: 166: secuencia de polipéptido de Rv3616cΔ142-145 derivada a partir de M. tuberculosis cepa H37Rv. SEQ ID No: 167: secuencia de polipéptido de Rv3616cΔ138-145 derivada a partir de M. tuberculosis cepa H37Rv. SEQ ID No: 168: secuencia de polipéptido de Rv3616cΔ145-152 derivada a partir de M. tuberculosis cepa H37Rv. SEQ ID No: 169: secuencia de polipéptido de Rv3616cΔ149-154 derivada a partir de M. tuberculosis cepa H37Rv. SEQ ID No: 170: secuencia de polinucleótido de codones optimizados de E. coli que codifica Rv3616cΔ136-183 derivada a partir de M. tuberculosis cepa H37Rv. SEQ ID No: 171: secuencia de polinucleótido de codones optimizados de E. coli que codifica Rv3616cΔ150-160 derivada a partir de M. tuberculosis cepa H37Rv. SEQ ID No: 172: secuencia de polinucleótido de codones optimizados de E. coli que codifica Rv3616cΔ136-154 derivada a partir de M. tuberculosis cepa H37Rv. SEQ ID No: 173: secuencia de polinucleótido de codones optimizados de E. coli que codifica Rv3616cΔ166-182 derivada a partir de M. tuberculosis cepa H37Rv. SEQ ID No: 174: secuencia de polinucleótido de codones optimizados de E. coli que codifica Rv3616cΔ135-139 derivada a partir de M. tuberculosis cepa H37Rv. SEQ ID No: 175: secuencia de polinucleótido de codones optimizados de E. coli que codifica Rv3616cΔ142-145 derivada a partir de M. tuberculosis cepa H37Rv. SEQ ID No: 176: secuencia de polinucleótido de codones optimizados de E. coli que codifica Rv3616cΔ138-145 derivada a partir de M. tuberculosis cepa H37Rv. SEQ ID No: 177: secuencia de polinucleótido de codones optimizados de E. coli que codifica Rv3616cΔ145-152 derivada a partir de M. tuberculosis cepa H37Rv. SEQ ID No: 178: secuencia de polinucleótido de codones optimizados de E. coli que codifica Rv3616cΔ149-154 derivada a partir de M. tuberculosis cepa H37Rv. SEQ ID No: 179: secuencia de polipéptido de proteína Rv3616c modificada basada en la separación y reconfiguración alrededor de los residuos 137-139 a partir de M. tuberculosis cepa H37Rv, incluyendo la supresión de Cys138. SEQ ID No: 180: secuencia de polipéptido de proteína Rv3616c modificada basada en la separación y reconfiguración alrededor de los residuos 152-153 a partir de M. tuberculosis cepa H37Rv.

Descripción detallada

La presente invención se refiere en términos generales al uso de polipéptidos de Rv3616c modificados, o de los polinucleótidos que los codifican, en el campo de las infecciones micobacterianas latentes. Adicionalmente, la presente invención se refiere a proteínas Rv3616c modificadas particulares. Los inventores han descubierto, de una manera sorprendente, que la alteración de la hidrofobicidad de una región particular de una secuencia de proteína Rv3616c puede conducir a una mejor expresión sin un impacto perjudicial sustancial a las propiedades inmunogénicas. Las proteínas Rv3616c modificadas son útiles como antígenos de tuberculosis (TB), en particular como antígenos de tuberculosis (TB) latente.

Se ha demostrado que algunas de las proteínas que son fuertemente expresadas durante las primeras etapas de la infección por Mycobacterium proporcionan una fuerte eficacia protectora en los modelos animales de vacunación. Sin embargo, la vacunación con antígenos que son altamente expresados durante las primeras etapas de la infección puede no proporcionar una respuesta inmunitaria óptima para tratar con las etapas posteriores de la infección. El control adecuado durante la infección latente puede requerir de células T que sean específicas para los antígenos particulares que se expresen en ese momento.

Las vacunas posteriores a la exposición que se dirigen directamente hacia las bacterias latentes persistentes

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pueden ayudar a proteger contra la reactivación de la tuberculosis (TB), mejorando de esta manera el control de la tuberculosis (TB), o haciendo posible incluso la eliminación de la infección. Por consiguiente, una vacuna que se dirija hacia la tuberculosis (TB) latente podría reducir de una manera significativa y económica los índices globales de infección por tuberculosis (TB).

También se podrían utilizar vacunas subunitarias basadas en los antígenos de la etapa tardía en combinación con los antígenos de la etapa temprana para proporcionar una vacuna multifacética. De una manera alternativa, los antígenos de la etapa tardía se podrían utilizar para complementar y mejorar la vacunación con BCG (ya sea mediante el refuerzo de la respuesta a BCG o bien a través del desarrollo de cepas de BCG recombinantes avanzadas).

Aunque se ha demostrado que los macrófagos actúan como los efectores principales de la inmunidad a Mycobacterium, las células T son los inductores predominantes de esa inmunidad. La función esencial de las células T en la protección contra la tuberculosis es ilustrada por el aumento en los índices de reactivación de la tuberculosis (TB) en los individuos infectados por el virus de inmunodeficiencia humana, debido a la consunción asociada de las células T CD4+. Adicionalmente, se ha demostrado que la transferencia adoptiva de las células T CD4+ tomada a la altura de la respuesta inmunitaria primaria a M. tuberculosis, confiere protección contra M. tuberculosis en los ratones deficientes en células T (Orme y col., J. Exp. Med., 1983, 158: 74-83).

Se ha demostrado que las células T CD4+ que reaccionan con Mycobacterium son potentes productoras de γ-interferón (IFN-γ), el cual, a su vez, se ha demostrado que desencadena los efectos anti-micobacterianos de los macrófagos en los ratones (Flynn y col., J. Exp. Med., 1993, 178: 2249-2254). Aunque está menos clara la función del IFN-γ en los seres humanos, los estudios han demostrado que la 1,25-dihidroxi-vitamina D3, ya sea sola o bien en combinación con IFN-γ o con el factor de necrosis tumoral-alfa, activa los macrófagos humanos para inhibir la infección por M. tuberculosis. Adicionalmente, se sabe que el IFN-γ estimula los macrófagos humanos para elaborar la 1,25-dihidroxi-vitamina D3. De una manera similar, se ha demostrado que la interleucina-12 (IL-12) tiene una función en el estímulo de la resistencia a la infección por M. tuberculosis. Para una revisión de la inmunología de la infección por M. tuberculosis, véase Chan y Kaufmann, Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control (Bloom, Editor, 1994), Tuberculosis (2a Edición, Rom y Garay, Editores, 2003), y Harrison’s Principles of Internal Medicine, Capítulo 150, páginas 953-966 (16a Edición, Braunwald y col., Editores, 2005).

El diagnóstico de la infección por tuberculosis (TB) latente se lleva a cabo comúnmente utilizando la prueba de tuberculina de piel, la cual involucra la exposición intradérmica al derivado purificado de proteína tuberculina (PPD). Las respuestas de células T específicas del antígeno dan como resultado una induración mensurable en el sitio de la inyección por 48 a 72 horas después de la inyección, lo cual indica la exposición a los antígenos micobacterianos. Sin embargo, con esta prueba, la sensibilidad y la especificidad han sido un problema, y los individuos vacunados con BCG no siempre se pueden distinguir fácilmente de los individuos infectados (esto está en particular importante a la luz del hecho de que el BCG no protege contra la infección latente). En general, los individuos que han recibido BCG pero que no están infectados por M. tuberculosis, muestran una reacción a PPD por debajo de 10 milímetros de diámetro, mientras que se considera que las personas que tienen una reacción a PPD por encima de 10 milímetros de diámetro, han sido infectadas por M. tuberculosis. Sin embargo, esta regla no es aplicable a los individuos con inmunosupresión debida a la infección por VIH (la cual puede dar como resultado una reacción a PPD por debajo de 10 milímetros de diámetro) ; o en los países endémicos, en donde las personas infectadas por micobacterias que no son de tuberculosis, pueden mostrar una reacción a PPD por encima de 10 milímetros de diámetro.

El progreso durante los años recientes ha visto el desarrollo de ensayos basados en células T in vitro, basados en la liberación del interferón-gamma, y utilizan antígenos que son más específicos para M. tuberculosis que la PPD, es decir, ESAT-6 y CFP-10. Estas pruebas de alta especificidad parecen ser al menos tan sensibles como la prueba de tuberculina de piel, y también demuestran menos reactividad cruzada debida a la vacunación con BCG. Véase Pai M y col., Expert Rev. Mol. Diagn., 2006, 6(3) : 413-422, para ver una reseña reciente del diagnóstico de tuberculosis (TB) latente. Sin embargo, debido a que los ESAT-6/CFP-10 son los antígenos de la etapa temprana, los ensayos basados en ESAT-6/CFP-10 solamente pueden funcionar de una manera óptima en las personas recientemente infectadas. En consecuencia, la identificación de antígenos específicamente asociados con la tuberculosis latente puede ayudar al desarrollo de ensayos más sensibles que puedan asegurar la detección de infecciones latentes a más largo plazo.

Sigue existiendo una necesidad de estrategias efectivas para el tratamiento y la prevención de tuberculosis, en particular para el tratamiento y la prevención de tuberculosis (TB) latente, y para la prevención de la reactivación de tuberculosis (TB).

Recientemente, se han propuesto una gama de vacunas de M. tuberculosis candidatas, basándose en un análisis bioinformático del genoma entero de M. tuberculosis (Zvi y col., BMC Medical Genetics, 2008, 1: 18), y en la prueba de proteínas diferencialmente expresadas en los individuos activamente y latentemente infectados (Schuck SD y col., PLoS ONE, 2009, 4(5) : e5590).

La Rv3616c, también conocida como Mtb40, HTCC1 y EspA, está involucrada en el sistema de secreción ESX-1 de

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Mycobacterium tuberculosis (Woodsworth y col., Infection and Immunity, 2008, 76(9) : 4199-4205). La Rv3616c ha estado anteriormente implicada en las respuestas inmunitarias asociadas con tuberculosis (véase, por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO98/53075). Al-Attiyah y col., Clin. Exp. Immunol., 2004, 138: 139-144 han demostrado que la Rv3616c es bien reconocida (a través de la proliferación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y de la producción de IFN-gamma) por los pacientes con tuberculosis pulmonar. Mustafa y col., Infect. Immun. 2006, 74(8) : 4566-4572 han investigado el reconocimiento de la Rv3616c por ganado M. bovis infectado vacunado con BCG.

La solicitud internacional de patente número PCT/EP2009/ 059580, publicada como WO2010/010177, describe la identificación de la Rv3616c como un antígeno asociado con la etapa latente de la infección por tuberculosis (TB).

La solicitud internacional de patente número WO2010/121618 propone el uso de proteínas constitutivamente expresadas y de los genes que las codifican, para composiciones inmunológicas, tales como vacunas, incluyendo EspA (es decir, Rv3616c).

Deseablemente se producen antígenos de vacuna que tengan su secuencia de tipo silvestre, asegurando, por consiguiente, que las respuestas inmunológicas solicitadas por la vacuna, correspondan estrechamente con aquéllas requeridas para contrarrestar la infección por un patógeno. No obstante, la producción eficiente de antígenos es un factor importante para reducir los costos asociados con la elaboración de la vacuna. En consecuencia, los antígenos modificados que se expresen de una manera conveniente en altos niveles, pero que eliminen el impacto perjudicial sobre la inmunogenicidad, podrían proporcionar un beneficio sustancial. La presente invención busca proporcionar antígenos de Rv3616c modificados que resuelvan éste y otros problemas.

Sin limitarse por la teoría, se piensa que los residuos de aminoácidos 134-183 de Mycobacterium tuberculosis cepa H37Rv, Rv3616c, corresponden a una región transmembrana potencial, una región de baja complejidad, y una bobina enrollada. La alteración de uno, dos, o los tres de estos elementos estructurales hace posible que la secuencia de la proteína Rv3616c modificada resultante se exprese en mayores niveles.

En consecuencia, en su aspecto más amplio, la presente invención proporciona una proteína Rv3616c modificada, en donde se ha alterado la hidrofobicidad de los residuos de aminoácidos correspondientes a los residuos 134-183 de la secuencia de H37Rv, de una manera adecuada una proteína Rv3616c modificada, en donde se ha alterado la hidrofobicidad de los residuos de aminoácidos correspondientes a los residuos 135-154 de la secuencia de H37Rv.

El término ‘alteración de la hidrofobicidad’ significa una modificación de la secuencia que da como resultado una hidrofobicidad suficientemente reducida, de tal manera que se puede expresar más eficientemente la secuencia de la proteína Rv3616c modificada.

Deseablemente, el grado de modificaciones en relación con la secuencia de tipo silvestre se debe mantener hasta un mínimo, con el fin de reducir la probabilidad de cualquier impacto perjudicial sobre la inmunogenicidad.

Como se utiliza en la presente, un ‘enlace peptídico directo’ es un enlace peptídico en donde dos péptidos se enlazan por medio de enlaces de péptidos directamente uno con el otro, y sin una secuencia de aminoácidos que intervenga. Un ‘enlace peptídico indirecto’ es un enlace peptídico en donde dos péptidos se enlazan por medio de enlaces de péptidos con un tercer péptido que intervenga.

En el contexto de la presente invención, existen cuatro planteamientos principales para la alteración de la hidrofobicidad – es decir, la separación de los residuos hidrofóbicos, la supresión de los residuos hidrofóbicos, la sustitución de los residuos hidrofóbicos con residuos hidrofílicos, y la adición de residuos hidrofílicos. La persona experta reconocerá que también se puede utilizar una combinación de estos planteamientos. Sin embargo, como se menciona anteriormente, el grado de las modificaciones de la secuencia se debe minimizar idealmente para evitar un impacto perjudicial innecesario sobre la inmunogenicidad.

La separación de los residuos hidrofóbicos se puede lograr dividiendo una secuencia de proteína Rv3616c en una localización entre los aminoácidos correspondientes a los residuos 133 a 184 de la SEQ ID NO: 1 en un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal, seguida por la reconfiguración de esas porciones, de tal manera que el fragmento N-terminal se localiza en la región C-terminal de la proteína Rv3616c modificada, y el fragmento Cterminal se localiza en la región N-terminal de la proteína Rv3616c modificada.

En un aspecto de la invención, se proporciona una proteína Rv3616c modificada, comprendiendo esta proteína Rv3616c modificada, un primer polipéptido y un segundo polipéptido, localizándose el primer polipéptido hacia el extremo C de la proteína Rv3616c modificada en relación con el segundo polipéptido, y en donde:

(i): el primer polipéptido es una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad con los residuos 1-133 de la SEQ ID NO: 1; y

(ii): el segundo polipéptido es una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad con los residuos 184-392 de la SEQ ID NO: 1;

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En algunas realizaciones, la proteína Rv3616c modificada consiste esencialmente en, o de una manera alternativa consiste en, un primer polipéptido y un segundo polipéptido, localizándose el primer polipéptido hacia el extremo C de la proteína Rv3616c modificada en relación con el segundo polipéptido, y en donde:

El primer polipéptido puede ser una secuencia que tenga al menos el 95 % de identidad con los residuos 1-133 de la SEQ ID NO: 1, tal como al menos el 97 % de identidad, al menos el 98 % de identidad, al menos el 99 % de identidad, o incluso el 100 % idéntica.

El segundo polipéptido puede ser una secuencia que tenga al menos el 95 % de identidad con los residuos 184-392 de la SEQ ID NO: 1, tal como al menos el 97 % de identidad, al menos el 98 % de identidad, al menos el 99 % de identidad, o incluso el 100 % idéntica.

De una manera adecuada, el primer polipéptido puede ser una secuencia que tenga al menos el 90 % de identidad con los residuos 1-134 de la SEQ ID NO: 1, en particular al menos el 95 % de identidad, tal como al menos el 97 % de identidad, al menos el 98 % de identidad, al menos el 99 % de identidad, o incluso el 100 % idéntica.

De una manera adecuada, el segundo polipéptido puede ser una secuencia que tenga al menos el 90 % de identidad con los residuos 155-392 de la SEQ ID NO: 1, en particular al menos el 95 % de identidad, tal como al menos el 97 % de identidad, al menos el 98 % de identidad, al menos el 99 % de identidad, o incluso el 100 % idéntica.

De una manera adecuada, la proteína Rv3616c modificada del primer aspecto no comprende una secuencia que tenga al menos el 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 de longitud completa. De una manera adecuada, la proteína Rv3616c modificada del primer aspecto es de menos de 500 aminoácidos de largo, tal como de menos de 450 aminoácidos de largo, en particular de menos de 400 aminoácidos de largo.

El enlace peptídico puede ser directo. De una manera alternativa, el enlace peptídico puede ser indirecto.

En un segundo aspecto de la invención, se proporciona una proteína Rv3616c modificada, comprendiendo esta proteína Rv3616c modificada, un primer polipéptido y un segundo polipéptido, localizándose el primer polipéptido hacia el extremo C de la proteína Rv3616c modificada en relación con el segundo polipéptido, y en donde:

(iii) el primer polipéptido es una secuencia contigua de al menos 100 aminoácidos dentro de los residuos 1-133 de la SEQ ID NO: 1; y

(iv) el segundo polipéptido es una secuencia contigua de al menos 155 aminoácidos dentro de los residuos 184-392 de la SEQ ID NO: 1;

en donde los primero y segundo polipéptidos están unidos directa o indirectamente.

(i): el primer polipéptido es una secuencia contigua de al menos 100 aminoácidos dentro de los residuos 1-133 de la SEQ ID NO: 1; y

(ii): el segundo polipéptido es una secuencia contigua de al menos 155 aminoácidos dentro de los residuos 184-392 de la SEQ ID NO: 1;

El primer polipéptido puede ser una secuencia contigua de al menos 110 aminoácidos dentro de los residuos 1-133 de la SEQ ID NO: 1, tal como de al menos 120 aminoácidos o de al menos 130 aminoácidos, por ejemplo, los residuos 1-133.

El segundo polipéptido puede ser una secuencia contigua de al menos 180 aminoácidos dentro de los residuos 184392 de la SEQ ID NO: 1, tal como de al menos 190 aminoácidos o de al menos 200 aminoácidos, por ejemplo, los residuos 184-392.

De una manera adecuada, el primer polipéptido puede ser una secuencia contigua de al menos 100 aminoácidos dentro de los residuos 1-134 de la SEQ ID NO: 1, en particular de al menos 110 aminoácidos, tal como de al menos 120 aminoácidos o de al menos 130 aminoácidos, por ejemplo, los residuos 1-134.

imagen6

De una manera adecuada, el segundo polipéptido puede ser una secuencia contigua de al menos 175 aminoácidos dentro de los residuos 155-392 de la SEQ ID NO: 1, en particular de al menos 200 aminoácidos, tal como de al menos 210 aminoácidos o de al menos 220 aminoácidos, por ejemplo, los residuos 155-392. Las realizaciones en donde el segundo polipéptido es una secuencia contigua de al menos 235 aminoácidos dentro de los residuos 155

5 392 de la SEQ ID NO: 1 son también de interés.

De una manera adecuada, la proteína Rv3616c modificada del segundo aspecto no comprende una secuencia contigua de más de 259 aminoácidos a partir de la SEQ ID NO: 1. De una manera alternativa, la proteína Rv3616c modificada del segundo aspecto no comprende una secuencia contigua de más de 257 aminoácidos, una secuencia contigua de más de 255 aminoácidos, o una secuencia contigua de más de 253 aminoácidos. De una manera

10 adecuada, la proteína Rv3616c modificada del segundo aspecto es de menos de 500 aminoácidos de largo, tal como de menos de 450 aminoácidos de largo, en particular de menos de 400 aminoácidos de largo.

El enlace peptídico puede ser un enlace directo o indirecto.

Los ejemplos de los primero y segundo aspectos incluyen las proteínas Rv3616c modificadas, en donde los primero y segundo polipéptidos corresponden a los fragmentos N-terminal y C-terminal resultantes de la división de una

15 secuencia de Rv3616c en una localización entre los aminoácidos correspondientes a los residuos 135-154 de la SEQ ID NO: 1, por ejemplo, los residuos 138-139 o 152-153, por ejemplo, los residuos 138-139 o 152-153 en donde el enlace peptídico es directo. De una manera adecuada, cuando los primero y segundo polipéptidos se reconfiguran, la metionina inicial se deja en el extremo N de la proteína Rv3616c modificada. Véase, por ejemplo, las SEQ ID NOs: 179 y 180, las cuales ilustran este tipo de configuración.

20 La supresión de los residuos hidrofóbicos se puede lograr a través de la remoción de al menos un aminoácido correspondiente a los residuos 134 a 183 de la SEQ ID NO: 1. Los residuos suprimidos pueden ser no contiguos y/o contiguos.

De una manera adecuada, la supresión de los residuos hidrofóbicos se puede lograr a través de la remoción de al menos dos aminoácidos correspondientes a los residuos 134 a 183 de la SEQ ID NO: 1. La supresión de los

25 residuos hidrofóbicos también se puede lograr a través de la remoción de al menos tres aminoácidos correspondientes a los residuos 134 a 183 de la SEQ ID NO: 1.

Los residuos suprimidos pueden ser no contiguos y/o contiguos.

Se puede observar que las secuencias de Rv3616c de tipo silvestre contienen un residuo Cys en la localización 138. De una manera adecuada, este residuo Cys es suprimido o reemplazado (por ejemplo, C138Q).

30 En un tercer aspecto de la invención, se proporciona una proteína Rv3616c modificada, comprendiendo esta proteína o, de una manera alternativa, consistiendo esencialmente o consistiendo en, una secuencia de Rv3616c, en donde al menos un aminoácido (por ejemplo, al menos 2) ha sido suprimido de la región correspondiente a los residuos 134-183 de la SEQ ID NO: 1.

La proteína Rv3616c modificada puede comprender o, de una manera alternativa, puede consistir esencialmente o

35 consistir en, una secuencia de Rv3616c, en donde se ha suprimido una porción contigua de al menos 3 aminoácidos (por ejemplo, de al menos 4) de la región correspondiente a los residuos 134-183 de la SEQ ID NO: 1.

Son de interés las proteínas Rv3616c modificadas particulares que comprenden una secuencia de Rv3616c, en en la que se ha suprimido al menos 1 aminoácido (por ejemplo, al menos 2) de la región correspondiente a los residuos 135-154 de la SEQ ID NO: 1. Otras secuencias de interés son las proteínas Rv3616c modificadas, las cuales

40 comprenden una secuencia de Rv3616c, en donde se ha suprimido una porción contigua de al menos 3 aminoácidos (por ejemplo, de al menos 4) de la región correspondiente a los residuos 135-154 de la SEQ ID NO: 1.

La porción contigua suprimida puede ser de al menos 5 aminoácidos (por ejemplo, de 5 a 30, tal como de 5 a 20, o de 5 a 15), en especial de al menos 6 aminoácidos (por ejemplo, de 6 a 30, tal como de 6 a 20, o de 6 a 15), en particular de al menos 7 aminoácidos (por ejemplo, de 7 a 30, tal como de 7 a 20, o de 7 a 15), tal como de al menos

45 8 aminoácidos (por ejemplo, de 8 a 30, tal como de 8 a 20, o de 8 a 15), o de al menos 10 aminoácidos (por ejemplo, de 10 a 30, tal como de 10 a 20, o de 10 a 15).

En ciertas realizaciones, la porción contigua suprimida puede ser de:

-4 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 142-145 de la SEQ ID NO: 1; -5 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 135-139 de la SEQ ID NO: 1;

50 -6 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 149-154 de la SEQ ID NO: 1; -8 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 138-145 de la SEQ ID NO: 1, o a los residuos 145-152 de la SEQ ID NO: 1; -11 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 150-160 de la SEQ ID NO: 1; -17 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 166-182 de la SEQ ID NO: 1;

55 -19 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 136-154 de la SEQ ID NO: 1; -31 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 136-166 de la SEQ ID NO: 1; o

imagen7

-48 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 136-183 de la SEQ ID NO: 1.

En otras realizaciones, la porción contigua suprimida puede ser de 3 a 10 residuos de aminoácidos, tales como de 4 a 10, por ejemplo, de 4 a 8. El número particular de aminoácidos suprimidos puede ser de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, en 5 especial de 4, 5, 6 u 8.

En otras realizaciones, la porción suprimida puede ser aquélla correspondiente a los residuos 135-138 de la SEQ ID NO: 1, a los residuos 136-138 de la SEQ ID NO: 1, a los residuos 137-138 de la SEQ ID NO: 1, a los residuos 138140 de la SEQ ID NO: 1, a los residuos 138-141 de la SEQ ID NO: 1, a los residuos 152-154 de la SEQ ID NO: 1, o la supresión de los residuos 149-151 de la SEQ ID NO: 1.

10 Un cuarto aspecto de la invención proporciona una proteína Rv3616c modificada, comprendiendo esta proteína un primer polipéptido y un segundo polipéptido, localizándose el primer polipéptido hacia el extremo N en relación con el segundo polipéptido, y en donde:

15 (iv) el segundo polipéptido es una secuencia contigua de al menos 155 aminoácidos dentro de los residuos 184-392 de la SEQ ID NO: 1;

en donde los primero y segundo polipéptidos están unidos directa o indirectamente por medio de un tercer polipéptido, correspondiendo este tercer polipéptido a los residuos 134-183 de la SEQ ID NO: 1, en en la que se ha suprimido al menos 1 aminoácido (por ejemplo, al menos 2).

20 En algunas realizaciones, la proteína Rv3616c modificada consiste esencialmente en, o de una manera alternativa consiste en, un primer polipéptido y un segundo polipéptido, localizándose el primer polipéptido hacia el extremo N en relación con el segundo polipéptido, y en donde:

25 (ii) el segundo polipéptido es una secuencia contigua de al menos 155 aminoácidos dentro de los residuos 184-392 de la SEQ ID NO: 1;

30 Son de un interés particular las proteínas que comprenden, o de una manera alternativa que consisten esencialmente o que consisten en, un primer polipéptido y un segundo polipéptido, localizándose el primer polipéptido hacia el extremo N en relación con el segundo polipéptido, y en donde:

35 (ii) el segundo polipéptido es una secuencia contigua de al menos 155 aminoácidos dentro de los residuos 184-392 de la SEQ ID NO: 1;

en donde los primero y segundo polipéptidos están unidos directa o indirectamente por medio de un tercer polipéptido, correspondiendo este tercer polipéptido a los residuos 134-183 de la SEQ ID NO: 1, en donde al menos se ha suprimido una porción contigua de al menos 3 aminoácidos (por ejemplo, de al menos 4).

40 El primer polipéptido puede ser una secuencia contigua de al menos 110 aminoácidos dentro de los residuos 1-133 de la SEQ ID NO: 1, tal como de al menos 120 aminoácidos o de al menos 130 aminoácidos (por ejemplo, los residuos 1-133).

El segundo polipéptido puede ser una secuencia contigua de al menos 180 aminoácidos dentro de los residuos 184392 de la SEQ ID NO: 1, tal como de al menos 190 aminoácidos o de al menos 200 aminoácidos (por ejemplo, los

45 residuos 184-392).

La porción contigua suprimida a partir de los residuos correspondientes a los 134-183 de la SEQ ID NO: 1 puede ser de al menos 5 aminoácidos (por ejemplo, de 5 a 30, tal como de 5 a 20, o de 5 a 15), en especial de al menos 6 aminoácidos (por ejemplo, de 6 a 30, tal como de 6 a 20, o de 6 a 15), en particular de al menos 7 aminoácidos (por ejemplo, de 7 a 30, tal como de 7 a 20, o de 7 a 15), tal como de al menos 8 aminoácidos (por ejemplo, de 8 a 30, tal

50 como de 8 a 20, o de 8 a 15), o de al menos 10 aminoácidos (por ejemplo, de 10 a 30, tal como de 10 a 20, o de 10 a 15).

En ciertas realizaciones, la porción contigua suprimida a partir de los residuos correspondientes a los 134-183 de la SEQ ID NO: 1 puede ser de:

5

15

25

35

45

55

-4 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 142-145 de la SEQ ID NO: 1; -5 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 135-139 de la SEQ ID NO: 1; -6 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 149-154 de la SEQ ID NO: 1; -8 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 138-145 de la SEQ ID NO: 1, o a los

residuos 145-152 de la SEQ ID NO: 1; -11 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 150-160 de la SEQ ID NO: 1; -17 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 166-182 de la SEQ ID NO: 1; -19 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 136-154 de la SEQ ID NO: 1; -31 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 136-166 de la SEQ ID NO: 1; o -48 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 136-183 de la SEQ ID NO: 1.

En otras realizaciones, la porción contigua suprimida a partir de los residuos correspondientes a los 134-183 de la SEQ ID NO: 1 puede ser de 3 a 10 residuos de aminoácidos, tal como de 4 a 10, por ejemplo, de 4 a 8. El número particular de aminoácidos suprimidos puede ser de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, en especial de 4, 5, 6 u 8.

En otras realizaciones, la porción contigua suprimida a partir de los residuos correspondientes a los 134-183 de la SEQ ID NO: 1 puede ser aquélla correspondiente a los residuos 135-138 de la SEQ ID NO: 1, a los residuos 136138 de la SEQ ID NO: 1, a los residuos 137-138 de la SEQ ID NO: 1, a los residuos 138-140 de la SEQ ID NO: 1, a los residuos 138-141 de la SEQ ID NO: 1, a los residuos 152-154 de la SEQ ID NO: 1, o la supresión de los residuos 149-151 de la SEQ ID NO: 1.

El primer polipéptido y el segundo polipéptido, en algunas realizaciones, estarán directamente unidos. En otras realizaciones el primer polipéptido y el segundo polipéptido estarán indirectamente unidos por medio de un tercer polipéptido. El tercer polipéptido puede corresponder a los residuos 134-183 de la SEQ ID NO: 1, en donde la supresión se ha presentado en una sola porción contigua de al menos 3 aminoácidos (por ejemplo, de al menos 4). Adicionalmente, el tercer polipéptido puede corresponder a los residuos 134-183 de la SEQ ID NO: 1, en donde las supresiones se han presentado en una pluralidad de distintas localizaciones (por ejemplo, de 1 a 10, tal como de 1 a 5, en particular 1 o 2 localizaciones), siendo cada supresión de 1 a 10, tal como de 1 a 5 residuos de aminoácidos.

De una manera adecuada, el tercer polipéptido es de 48 aminoácidos o menos (por ejemplo, de 10 a 48, tal como de 20 a 48, o de 30 a 48 residuos), tal como de 46 aminoácidos o menos (por ejemplo, de 10 a 46, tal como de 20 a 46,

o de 30 a 46 residuos), de 44 aminoácidos o menos (por ejemplo, de 10 a 44, tal como de 20 a 44, o de 30 a 44 residuos), o de 42 aminoácidos o menos (por ejemplo, de 10 a 42, tal como de 20 a 42, o de 30 a 42 residuos).

Un quinto aspecto de la invención proporciona proteínas Rv3616c modificadas, las cuales comprenden un primer polipéptido y un segundo polipéptido, localizándose el primer polipéptido hacia el extremo N en relación con el segundo polipéptido, y en donde:

(iii) el primer polipéptido es una secuencia contigua de al menos 100 aminoácidos dentro de los residuos 1-134 de la SEQ ID NO: 1; y

(iv) el segundo polipéptido es una secuencia contigua de al menos 175 aminoácidos dentro de los residuos 155-392 de la SEQ ID NO: 1;

en donde los primero y segundo polipéptidos están ya sea directamente unidos o bien indirectamente unidos por medio de un tercer polipéptido, en donde este tercer polipéptido corresponde a los residuos 135-154 de la SEQ ID NO: 1, en en la que se ha suprimido al menos 1 aminoácido (por ejemplo, al menos 2).

En algunas realizaciones, la proteína Rv3616c modificada consiste esencialmente en, o de una manera alternativa consiste en, un primer polipéptido y un segundo polipéptido, localizándose el primer polipéptido hacia el extremo N en relación con el segundo polipéptido, y en donde:

(i): el primer polipéptido es una secuencia contigua de al menos 100 aminoácidos dentro de los residuos 1-134 de la SEQ ID NO: 1; y

(ii): el segundo polipéptido es una secuencia contigua de al menos 175 aminoácidos dentro de los residuos 155-392 de la SEQ ID NO: 1;

Son de un interés particular las proteínas que comprenden, o de una manera alternativa que consisten esencialmente o que consisten en, un primer polipéptido y un segundo polipéptido, localizándose el primer polipéptido hacia el extremo N en relación con el segundo polipéptido, y en donde:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

en donde los primero y segundo polipéptidos están ya sea directamente unidos o bien indirectamente unidos por medio de un tercer polipéptido, en donde este tercer polipéptido corresponde a los residuos 135-154 de la SEQ ID NO: 1, en donde al menos se ha suprimido una porción contigua de al menos 3 aminoácidos (por ejemplo, de al menos 4).

El primer polipéptido también puede ser una secuencia contigua de al menos 110 aminoácidos dentro de los residuos 1-134 de la SEQ ID NO: 1, tal como de al menos 120 aminoácidos o de al menos 130 aminoácidos, por ejemplo, los residuos 1-134.

El segundo polipéptido también puede ser una secuencia contigua de al menos 200 aminoácidos dentro de los residuos 155-392 de la SEQ ID NO: 1, tal como de al menos 210 aminoácidos o de al menos 220 aminoácidos, por ejemplo, los residuos 155-392. Las realizaciones en donde el segundo polipéptido es una secuencia contigua de al menos 235 aminoácidos dentro de los residuos 155-392 de la SEQ ID NO: 1 son también de interés.

La porción contigua suprimida a partir de los residuos correspondientes a los 135-154 de la SEQ ID NO: 1 puede ser de al menos 5 aminoácidos (por ejemplo, de 5 a 20, tal como de 5 a 15 o de 5 a 10), en especial de al menos 6 aminoácidos (por ejemplo, de 6 a 20, tal como de 6 a 15, o de 6 a 10), en particular de al menos 7 aminoácidos (por ejemplo, de 7 a 20, tal como de 7 a 15, o de 7 a 10), tal como de al menos 8 aminoácidos (por ejemplo, de 8 a 20, tal como de 8 a 15, o de 8 a 10), o de al menos 10 aminoácidos (por ejemplo, de 10 a 20, tal como de 10 a 15).

En ciertas realizaciones, la porción contigua suprimida a partir de los residuos correspondientes a los 135-154 de la SEQ ID NO: 1 puede ser de:

-4 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 142-145 de la SEQ ID NO: 1; -6 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 149-154 de la SEQ ID NO: 1; -8 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 138-145 de la SEQ ID NO: 1, o a los

residuos 145-152 de la SEQ ID NO: 1; -11 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 150-160 de la SEQ ID NO: 1; o -19 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 136-154 de la SEQ ID NO: 1.

En otras realizaciones, la porción contigua suprimida a partir de los residuos correspondientes a los 135-154 puede ser de 3 a 10 residuos de aminoácidos, tal como de 4 a 10, por ejemplo, de 4 a 8. El número particular de aminoácidos suprimidos puede ser de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, en especial de 4, 5, 6 u 8.

En otras realizaciones, la porción contigua suprimida a partir de los residuos correspondientes a los 135-154 de la SEQ ID NO: 1 puede ser aquélla correspondiente a los residuos 135-138 de la SEQ ID NO: 1, a los residuos 136138 de la SEQ ID NO: 1, a los residuos 137-138 de la SEQ ID NO: 1, a los residuos 138-140 de la SEQ ID NO: 1, a los residuos 138-141 de la SEQ ID NO: 1, a los residuos 152-154 de la SEQ ID NO: 1, o la supresión de los residuos 149-151 de la SEQ ID NO: 1.

El primer polipéptido y el segundo polipéptido, en algunas realizaciones, pueden estar directamente unidos. En otras realizaciones, el primer polipéptido y el segundo polipéptido pueden estar indirectamente unidos por medio de un tercer polipéptido. El tercer polipéptido puede corresponder a los residuos 135-154 de la SEQ ID NO: 1, en donde la supresión se ha presentado en una sola porción contigua de al menos 3 aminoácidos (por ejemplo, de al menos 4). Adicionalmente, el tercer polipéptido puede corresponder a los residuos 135-154 de la SEQ ID NO: 1, en donde las supresiones se han presentado en una pluralidad de distintas localizaciones (por ejemplo, de 1 a 10, tal como de 1 a 5, en particular 1 o 2 localizaciones), siendo cada supresión de 1 a 10, tal como de 1 a 5 residuos de aminoácidos.

De una manera adecuada, el tercer polipéptido es de 20 aminoácidos o menos (por ejemplo, de 5 a 20, tal como de 10 a 20 residuos), tal como de 18 aminoácidos o menos (por ejemplo, de 5 a 18, tal como de 10 a 18 residuos), de 16 aminoácidos o menos (por ejemplo, de 5 a 16, tal como de 10 a 16 residuos), o de 14 aminoácidos o menos (por ejemplo, de 5 a 14, tal como de 10 a 14 residuos).

Un sexto aspecto de la invención proporciona una proteína Rv3616c modificada, comprendiendo esta proteína un primer polipéptido y un segundo polipéptido, localizándose el primer polipéptido hacia el extremo N en relación con el segundo polipéptido, y en donde:

(iii) el primer polipéptido es una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad con los residuos 1-133 de la SEQ ID NO: 1; y

(iv) el segundo polipéptido es una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad con los residuos 184-392 de la SEQ ID NO: 1;

en donde los primero y segundo polipéptidos están directamente unidos o indirectamente unidos por medio de un tercer polipéptido, teniendo este tercer polipéptido al menos el 90 % de identidad con una secuencia correspondiente a los residuos 134-183 de la SEQ ID NO: 1, en donde se ha suprimido una porción contigua de al menos 3 aminoácidos (por ejemplo, de al menos 4).

imagen8

5 (ii) el segundo polipéptido es una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad con los residuos 184-392 de la SEQ ID NO: 1;

en donde los primero y segundo polipéptidos están directamente unidos o indirectamente unidos por medio de un tercer polipéptido, teniendo este tercer polipéptido al menos el 90 % de identidad con una secuencia correspondiente a los residuos 134-183 de la SEQ ID NO: 1, en donde se ha suprimido una porción contigua de al menos 3

10 aminoácidos (por ejemplo, de al menos 4).

El segundo polipéptido puede ser una secuencia que tenga al menos el 95 % de identidad con los residuos 184-392 15 de la SEQ ID NO: 1, tal como al menos el 97 % de identidad, al menos el 98 % de identidad, al menos el 99 % de identidad, o incluso el 100 % idéntica.

El primer polipéptido y el segundo polipéptido, en algunas realizaciones, pueden estar directamente unidos. En otras realizaciones, el primer polipéptido y el segundo polipéptido estarán indirectamente unidos por medio de un tercer polipéptido. El tercer polipéptido puede ser una secuencia que tenga al menos el 95 % de identidad con una

20 secuencia correspondiente a los residuos 134-183 de la SEQ ID NO: 1, en donde se ha suprimido una porción contigua de al menos 3 aminoácidos (por ejemplo, de al menos 4), tal como al menos el 97 % de identidad, al menos el 98 % de identidad, al menos el 99 % de identidad, o incluso el 100 % idéntica.

La porción contigua suprimida a partir de los residuos correspondientes a los 134-183 de la SEQ ID NO: 1 puede ser de al menos 5 aminoácidos (por ejemplo, de 5 a 30, tal como de 5 a 20, o de 5 a 15), en especial de al menos 6

25 aminoácidos (por ejemplo, de 6 a 30, tal como de 6 a 20, o de 6 a 15), en particular de al menos 7 aminoácidos (por ejemplo, de 7 a 30, tal como de 7 a 20, o de 7 a 15), tal como de al menos 8 aminoácidos (por ejemplo, de 8 a 30, tal como de 8 a 20, o de 8 a 15), o de al menos 10 aminoácidos (por ejemplo, de 10 a 30, tal como de 10 a 20, o de 10 a 15).

En ciertas realizaciones, la porción contigua suprimida a partir de los residuos correspondientes a los 134-183 de la 30 SEQ ID NO: 1 puede ser de:

35 residuos 145-152 de la SEQ ID NO: 1; -11 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 150-160 de la SEQ ID NO: 1; -17 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 166-182 de la SEQ ID NO: 1; -19 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 136-154 de la SEQ ID NO: 1; -31 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 136-166 de la SEQ ID NO: 1; o

40 -48 aminoácidos, tales como aquéllos correspondientes a los residuos 136-183 de la SEQ ID NO: 1.

En otras realizaciones, la porción contigua suprimida puede ser de 3 a 10 residuos de aminoácidos, tal como de 4 a 10, por ejemplo, de 4 a 8. El número particular de aminoácidos suprimidos puede ser de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, en especial de 4, 5, 6 u 8.

En otras realizaciones, la porción contigua suprimida a partir de los residuos correspondientes a los 134-183 de la

45 SEQ ID NO: 1 puede ser aquélla correspondiente a los residuos 135-138 de la SEQ ID NO: 1, a los residuos 136138 de la SEQ ID NO: 1, a los residuos 137-138 de la SEQ ID NO: 1, a los residuos 138-140 de la SEQ ID NO: 1, a los residuos 138-141 de la SEQ ID NO: 1, a los residuos 152-154 de la SEQ ID NO: 1, o la supresión de los residuos 149-151 de la SEQ ID NO: 1.

De una manera adecuada, el tercer polipéptido es de 48 aminoácidos o menos (por ejemplo, de 10 a 48, tal como de 50 20 a 48, o de 30 a 48 residuos), tal como de 46 aminoácidos o menos (por ejemplo, de 10 a 46, tal como de 20 a 46,

Un séptimo aspecto de la invención proporciona proteínas Rv3616c modificadas, las cuales comprenden un primer polipéptido y un segundo polipéptido, localizándose el primer polipéptido hacia el extremo N en relación con el 55 segundo polipéptido, y en donde:

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(i): el primer polipéptido es una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad con los residuos 1-134 de la SEQ ID NO: 1; y

(ii): el segundo polipéptido es una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad con los residuos 155-392 de la SEQ ID NO: 1;

en donde los primero y segundo polipéptidos están ya sea directamente unidos o bien indirectamente unidos por medio de un tercer polipéptido, teniendo este tercer polipéptido al menos el 80 % de identidad con una secuencia correspondiente a los residuos 135-154 de la SEQ ID NO: 1, en donde se ha suprimido una porción contigua de al menos 3 aminoácidos (por ejemplo, de al menos 4).

El primer polipéptido puede ser una secuencia que tenga al menos el 95 % de identidad con los residuos 1-134 de la SEQ ID NO: 1, tal como al menos el 97 % de identidad, al menos el 98 % de identidad, al menos el 99 % de identidad, o incluso el 100 % idéntica.

El segundo polipéptido puede ser una secuencia que tenga al menos el 95 % de identidad con los residuos 155-392 de la SEQ ID NO: 1, tal como al menos el 97 % de identidad, al menos el 98 % de identidad, al menos el 99 % de identidad, o incluso el 100 % idéntica.

El primer polipéptido y el segundo polipéptido, en algunas realizaciones, estarán directamente unidos. En otras realizaciones, el primer polipéptido y el segundo polipéptido estarán indirectamente unidos por medio de un tercer polipéptido. El tercer polipéptido puede ser una secuencia que tenga al menos el 90 % de identidad con una secuencia correspondiente a los residuos 135-154 de la SEQ ID NO: 1, en donde se ha suprimido una porción contigua de al menos 3 aminoácidos (por ejemplo, de al menos 4), tal como al menos el 95 % de identidad, al menos el 98 % de identidad, al menos el 99 % de identidad, o incluso el 100 % idéntica.

De una manera adecuada, el tercer polipéptido es de 20 aminoácidos o menos (por ejemplo, de 5 a 20, tal como de 10 a 20 residuos), tal como de 18 aminoácidos o menos (por ejemplo, de 5 a 18, tal como de 10 a 18 residuos), de 16 aminoácidos o menos (por ejemplo, de 5 a 16, tal como de 10 a 16 residuos), o de 14 aminoácidos o menos (por

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ejemplo, de 5 a 14, tal como de 10 a 14 residuos).

La sustitución de los residuos hidrofóbicos se puede lograr a través del reemplazo de al menos un (por ejemplo, de al menos 2) aminoácido correspondiente a los residuos 134 a 183 de la SEQ ID NO: 1 con un residuo hidrofílico. En este aspecto, los residuos hidrofílicos adecuados típicamente serán Gln (Q), Asp (D), Glu (E), Asn (N), His (H), Lys (K), Arg (R), Ser (S) o Thr (T).

Es de un interés particular el reemplazo de al menos un (por ejemplo, de al menos 2) aminoácido correspondiente a los residuos 135 a 154 de la SEQ ID NO: 1 con un residuo hidrofílico. En este aspecto, los residuos hidrofílicos adecuados típicamente serán Gln (Q), Asp (D), Glu (E), Asn (N), His (H), Lys (K), Arg (R), Ser (S) o Thr (T).

Los residuos sustituidos pueden ser no contiguos, aunque de una manera adecuada son contiguos.

En un octavo aspecto de la invención, se proporciona una proteína Rv3616c modificada, comprendiendo esta proteína una secuencia de Rv3616c, en donde una porción contigua de al menos 3 aminoácidos (por ejemplo, de al menos 4) a partir de la región correspondiente a los residuos 134-183 de la SEQ ID NO: 1 ha sido sustituida con residuos hidrofílicos.

En algunas realizaciones, la proteína Rv3616c modificada consiste esencialmente en, o de una manera alternativa consiste en una secuencia de Rv3616c, en donde una porción contigua de al menos 3 aminoácidos (por ejemplo, de al menos 4) a partir de la región correspondiente a los residuos 134-183 de la SEQ ID NO: 1 ha sido sustituida con residuos hidrofílicos.

Son de interés las proteínas Rv3616c modificadas particulares que comprenden una secuencia de Rv3616c, en donde una porción contigua de al menos 3 aminoácidos (por ejemplo, de al menos 4) a partir de la región correspondiente a los residuos 135-154 de la SEQ ID NO: 1 ha sido sustituida con residuos hidrofílicos.

La porción contigua sustituida puede ser de al menos 5 aminoácidos (por ejemplo, de 5 a 30, tal como de 5 a 20, o de 5 a 15), en especial de al menos 6 aminoácidos (por ejemplo, de 6 a 30, tal como de 6 a 20, o de 6 a 15), en particular de al menos 7 aminoácidos (por ejemplo, de 7 a 30, tal como de 7 a 20, o de 7 a 15), tal como de al menos 8 aminoácidos (por ejemplo, de 8 a 30, tal como de 8 a 20, o de 8 a 15), o de al menos 10 aminoácidos (por ejemplo, de 10 a 30, tal como de 10 a 20, o de 10 a 15).

En ciertas realizaciones, la porción contigua sustituida puede ser de:

En otras realizaciones, la porción contigua sustituida puede ser de 3 a 10 residuos de aminoácidos, tal como de 4 a 10, por ejemplo, de 4 a 8. El número particular de aminoácidos sustituidos puede ser de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, en especial de 4, 5, 6 u 8.

En otras realizaciones, la porción sustituida puede ser aquélla correspondiente a los residuos 135-138 de la SEQ ID NO: 1, a los residuos 136-138 de la SEQ ID NO: 1, a los residuos 137-138 de la SEQ ID NO: 1, a los residuos 138140 de la SEQ ID NO: 1, a los residuos 138-141 de la SEQ ID NO: 1, a los residuos 152-154 de la SEQ ID NO: 1, o la supresión de los residuos 149-151 de la SEQ ID NO: 1.

La alteración de la hidrofobicidad también se puede lograr mediante la adición de residuos hidrofílicos, por ejemplo, la adición de al menos un residuo de aminoácido hidrofílico (por ejemplo, de al menos 2, tal como de 2 a 10) en una localización entre los residuos correspondientes a los residuos 133 a 184 de la SEQ ID NO: 1. De una manera adecuada, se pueden agregar al menos 3 residuos hidrofílicos (por ejemplo, de 3 a 20, tal como de 3 a 15, en especial de 3 a 10), tal como de al menos 4 residuos (por ejemplo, de 4 a 20, tal como de 4 a 15, en especial de 4 a 10), en particular de al menos 5 residuos (por ejemplo, de 5 a 20, tal como de 5 a 15, en especial de 5 a 10), opcionalmente de al menos 6 residuos (por ejemplo, de 6 a 20, tal como de 6 a 15, en especial de 6 a 10). En este aspecto, los residuos hidrofílicos adecuados típicamente serán Gln (Q), Asp (D), Glu (E), Asn (N), His (H), Lys (K), Arg (R), Ser (S) o Thr (T).

Los residuos hidrofílicos adicionales típicamente se localizarán entre los residuos correspondientes a los residuos 133 a 184 de la SEQ ID NO: 1, en especial entre los residuos correspondientes a los residuos 134 a 155 de la SEQ ID NO: 1 (tal como entre los residuos correspondientes a los residuos 135 a 154 de la SEQ ID NO: 1).

imagen9

Los residuos hidrofílicos adicionales se pueden distribuir en diferentes posiciones entre los residuos correspondientes a los residuos 133 a 184 de la SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, de 1 a 10 localizaciones, tal como de 1 a 5, en particular 1 o 2 localizaciones), teniendo cada localización de 1 a 10 residuos hidrofílicos adicionales, tal como de 1 a 5 residuos adicionales. Los residuos hidrofílicos adicionales se localizarán de una manera adecuada en

5 un grupo contiguo.

En las realizaciones particulares de las proteínas Rv3616c modificadas descritas en los diferentes aspectos anteriores, la proteína Rv3616c modificada no es la SEQ ID NO: 162 (Rv3616cΔ150-160). En otras realizaciones, la proteína Rv3616c modificada no comprende la SEQ ID NO: 162 (Rv3616cΔ150-160).

Las proteínas Rv3616c modificadas se pueden basar en una secuencia de proteína Rv3616c de tipo silvestre a partir

10 de cualquier cepa de M. tuberculosis. Por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOs: 3-7, en particular cualquiera de las SEQ ID NOs: 3-6, puede sustituir a la SEQ ID NO: 1 en las realizaciones anteriores.

Las proteínas de los diferentes aspectos discutidos anteriormente son colectivamente referidas en la presente como proteínas Rv3616c modificadas. También se proporcionan estas proteínas Rv3616c modificadas para utilizarse como medicamentos, tales como un medicamento para el tratamiento o la prevención de tuberculosis (TB).

15 Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende la administración de una proteína Rv3616c modificada.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para el tratamiento, la mejora, o la prevención de tuberculosis (TB), que comprende la administración de una cantidad segura y efectiva de una proteína Rv3616c modificada a un sujeto que lo necesite, en donde este polipéptido induce una respuesta inmunitaria. En un aspecto

20 adicional, el método comprende además inducir una respuesta inmunitaria contra Mycobacterium tuberculosis.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para el tratamiento, la mejora, el retardo, o la prevención de la reactivación de tuberculosis, que comprende la administración de una cantidad efectiva de una proteína Rv3616c modificada a un sujeto que lo necesite, en donde este polipéptido induce una respuesta inmunitaria. En un aspecto adicional, el método comprende además inducir una respuesta inmunitaria contra Mycobacterium

25 tuberculosis.

La presente invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína Rv3616c modificada. También se proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de

30 ácido nucleico que codifica una proteína Rv3616c modificada para utilizarse como un medicamento, tal como un medicamento para el tratamiento, la mejora, o la prevención de tuberculosis (TB).

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende la administración de un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína Rv3616c modificada.

35 Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para el tratamiento, la mejora, o la prevención de tuberculosis (TB), que comprende la administración de una cantidad segura y efectiva de un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína Rv3616c modificada a un sujeto que lo necesite, en donde este polinucleótido induce una respuesta inmunitaria. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para inducir una respuesta inmunitaria contra Mycobacterium tuberculosis.

40 Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para el tratamiento, la mejora, el retardo, o la prevención de la reactivación de tuberculosis, que comprende la administración de una cantidad efectiva de un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína Rv3616c modificada a un sujeto que lo necesite, en donde este polipéptido induce una respuesta inmunitaria. En un aspecto adicional, el método comprende además inducir una respuesta inmunitaria contra Mycobacterium tuberculosis.

45 El uso de un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una proteína Rv3616c modificada en la elaboración de un medicamento para el tratamiento, la mejora, o la prevención de tuberculosis (TB), representa otro aspecto de la invención.

Adicionalmente, se proporciona una composición farmacéutica, que comprende:

(a) una proteína Rv3616c modificada; o

50 (b) un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína Rv3616c modificada; y

(c) un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Además, se proporciona una composición inmunogénica, que comprende:

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(a): una proteína Rv3616c modificada; o

(b): un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína Rv3616c modificada; y

5 (c) un potenciador no específico de la respuesta inmunitaria.

Las células huésped, transformadas con este vector de expresión, forman un aspecto adicional de la invención. Adicionalmente, se proporciona una célula huésped que expresa de una manera recombinante una proteína 10 Rv3616c modificada.

También se proporcionan kits de diagnóstico, que comprenden:

(a) una proteína Rv3616c modificada;

15 (b) un aparato suficiente para poner en contacto la proteína Rv3616c modificada con una muestra (por ejemplo, sangre entera, o de una manera más adecuada, células mononucleares de sangre periférica (PBMC)) a partir de un individuo; y

(c) medios para cuantificar la respuesta de células T de la muestra.

20 (a) una proteína Rv3616c modificada; y

25 (a) poner en contacto una muestra a partir del sujeto mencionado, con una proteína Rv3616c modificada; y

La invención también proporciona un kit de diagnóstico, que comprende:

(a) una proteína Rv3616c modificada, cuya proteína se inmoviliza opcionalmente sobre un soporte sólido; y 30 (b) un reactivo de detección.

35 por M. tuberculosis).

40 invención, puede no haber sido anteriormente vacunado para tuberculosis (por ejemplo, no vacunado contra la infección por M. tuberculosis), tal como que no ha sido vacunado con un Bacillus Calmette-Guerin (BCG).

-tratar la tuberculosis activa; 45 -prevenir la tuberculosis activa (tal como mediante su administración a un sujeto que no esté infectado, o de una

manera alternativa un sujeto que tenga la infección latente) ; -tratar la tuberculosis latente; -prevenir la tuberculosis latente; o -prevenir o retardar la reactivación de tuberculosis (en especial la demora de la reactivación de tuberculosis (TB),

50 por ejemplo, por un período de meses, años, o incluso indefinidamente).

(i) identificar a un sujeto por tener una infección por tuberculosis (TB) latente (por ejemplo, mediante ensayos

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basados en PPD o en células T) ; y

(ii) administrar a este sujeto, una cantidad segura y efectiva de una proteína Rv3616c modificada, o de un polinucleótido que codifique una proteína Rv3616c modificada (tal como en la forma de una composición farmacéutica o de una composición inmunogénica).

El término “especie de Mycobacterium del complejo de tuberculosis” incluye las especies tradicionalmente consideradas como causantes de la enfermedad de tuberculosis, así como las especies medio-ambientales y oportunistas de Mycobacterium que provocan tuberculosis y enfermedad pulmonar en los pacientes inmunocomprometidos, tales como los pacientes con SIDA, por ejemplo, M. tuberculosis, M. bovis, o M. africanum, BCG, M. avium, M. intracellulare, M. celatum, M. genavense, M. haemophilum, M. kansasii, M. simiae, M. vaccae, M. fortuitum, y M. scrofulaceum (véase, por ejemplo, Harrison’s Principles of Internal Medicine, Capítulo 150, páginas 953-966 (16a Edición, Braunwald y col., Editores, 2005). La presente invención se refiere en particular a la infección con M. tuberculosis.

El término “infección activa” se refiere a una infección (por ejemplo, infección por M. tuberculosis) con los síntomas y/o lesiones evidentes de la enfermedad (de una manera adecuada con los síntomas evidentes de la enfermedad).

Los términos “infección inactiva”, “infección en reposo" o "infección latente” se refieren a una infección (por ejemplo, a una infección por M. tuberculosis) sin los síntomas y/o lesiones evidentes de la enfermedad (de una manera adecuada sin los síntomas evidentes de la enfermedad). Un sujeto con la infección latente de una manera adecuada será uno que se pruebe positivo para la infección (por ejemplo, mediante ensayos basados en PPD o en células T), pero el cual no haya demostrado los síntomas y/o lesiones de la enfermedad que estén asociados con una infección activa.

El término “tuberculosis primaria” se refiere a la enfermedad clínica (por ejemplo, la manifestación de los síntomas de la enfermedad) directamente en seguida de la infección (por ejemplo, de la infección por M. tuberculosis). Véase, Harrison’s Principles of Internal Medicine, Capítulo 150, páginas 953-966 (16a Edición, Braunwald y col., Editores, 2005).

Los términos “tuberculosis secundaria" o "tuberculosis post-primaria” se refieren a la reactivación de una infección en reposo, inactiva, o latente (por ejemplo, de una infección por M. tuberculosis). Véase, Harrison’s Principles of Internal Medicine, Capítulo 150, páginas 953-966 (16a Edición, Braunwald y col., Editores, 2005).

El término “reactivación de tuberculosis” se refiere a la manifestación posterior de los síntomas de la enfermedad en un individuo que pruebe ser positivo para la infección (por ejemplo, en una prueba de tuberculina de piel, de una manera adecuada en un ensayo basado en células T in vitro), pero que no tenga los síntomas evidentes de la enfermedad. De una manera adecuada, el individuo no se habrá vuelto a exponer a la infección. La prueba de diagnóstico positiva indica que el individuo está infectado; sin embargo, el individuo puede o no haber manifestado anteriormente los síntomas evidentes de la enfermedad activa, que hubieran sido tratados suficientemente para llevar la tuberculosis hasta un estado inactivo o latente. Se reconocerá que los métodos para la prevención, el retardo, o el tratamiento de la reactivación de tuberculosis, se pueden iniciar en un individuo que manifieste los síntomas de la enfermedad activa.

El término tuberculosis “resistente a fármacos” se refiere a una infección (por ejemplo, a una infección por M. tuberculosis), en donde la cepa infecciosa no se mantiene estática o aniquilada (es decir, es resistente a) uno o más de los denominados como agentes quimioterapéuticos "de la línea frontal" efectivos en el tratamiento de tuberculosis (por ejemplo, isoniazida, rifampina, etambutol, estreptomicina y pirazinamida).

El término tuberculosis “resistente a múltiples fármacos” se refiere a una infección (por ejemplo, a una infección por

M. tuberculosis), en donde la cepa infecciosa es resistente a dos o más de los agentes quimioterapéuticos "de la línea frontal" efectivos en el tratamiento de tuberculosis.

Un “agente quimioterapéutico” se refiere a un agente farmacológico conocido y usado en la técnica, para tratar la tuberculosis (por ejemplo, la infección por M. tuberculosis). Los agentes farmacológicos ejemplificados utilizados para tratar la tuberculosis incluyen, pero no se limitan a, amicacina, ácido amino-salicílico, capreomicina, cicloserina, etambutol, etionamida, isoniazida, kanamicina, pirazinamida, rifamicinas (es decir, rifampina, rifapentina y rifabutina), estreptomicina, ofloxacina, ciprofloxacina, claritromicina, azitromicina y fluoro-quinolonas. Los agentes quimioterapéuticos "de primera línea" o "de línea frontal" utilizados para tratar la tuberculosis que no es resistente a fármacos incluyen isoniazida, rifampina, etambutol, estreptomicina y pirazinamida. Los agentes quimioterapéuticos "de segunda línea" utilizados para tratar la tuberculosis que ha demostrado resistencia al fármaco para uno o más fármacos "de primera línea" incluyen ofloxacina, ciprofloxacina, etionamida, ácido amino-salicílico, cicloserina, amicacina, kanamicina y capreomicina. Estos agentes farmacológicos son revisados en el Capítulo 48 de Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, Hardman y Limbird, Editores, 2001.

Los términos “polipéptido”, “péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en la presente para referirse a un

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polímero de residuos de aminoácidos. Los aminoácidos que se presentan naturalmente son aquéllos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxi-prolina, γcarboxi-glutamato, y O-fosfoserina. De una manera adecuada, un polipéptido de acuerdo con la presente invención consistirá solamente en residuos de aminoácidos que se presentan naturalmente, en especial aquellos aminoácidos codificados por el código genético.

“Ácido nucleico” se refiere a los desoxi-ribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos, ya sea en la forma de una sola cadena o bien de doble cadena. El término "ácido nucleico" se utiliza de una manera intercambiable con gen, ADNc, ARNm, oligonucleótido, y polinucleótido.

Los aminoácidos pueden ser referidos en la presente mediante ya sea sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos, o bien mediante los símbolos de una letra recomendados por la IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Los nucleótidos, de la misma manera, pueden ser referidos mediante sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.

El término ‘secuencia de proteína Rv3616c’, como se utiliza en la presente, significa la secuencia del polipéptido de Rv3616c proporcionada en la SEQ ID NO: 1 o un homólogo de la misma, a partir de una especie de Mycobacterium del complejo de tuberculosis, por ejemplo, una especie tal como M. tuberculosis, M. bovis, o M. africanum, o una especie de Mycobacterium que sea medio-ambiental y oportunista y que provoque infecciones oportunistas, tales como infecciones de pulmón en los huéspedes inmuno-comprometidos (por ejemplo, en los pacientes con SIDA), por ejemplo, BCG, M. avium, M. intracellulare, M. celatum, M. genavense, M. haemophilum, M. kansasii, M. simiae, M. vaccae, M. fortuitum, y M. scrofulaceum (véase, por ejemplo, Harrison’s Principles of Internal Medicine, Capítulo 150, páginas 953-966, 16a Edición, Braunwald y col., Editores, 2005).

Con el fin de asegurar un alto índice de eficacia entre los huéspedes vacunados, los componentes de una vacuna deben estar bien conservados entre las cepas de significado clínico. De una manera adecuada, la proteína Rv3616c se deriva a partir de M. tuberculosis H37Rv (es decir, la secuencia de polipéptido proporcionada en la SEQ ID NO: 1)

o un homólogo de la misma a partir de otra cepa de M. tuberculosis (tal como las cepas CDC1551, F11, Haarlem A y C). Las cepas de M. tuberculosis que están asociadas con resistencia a fármacos (por ejemplo, MDR o en especial XDR) son una base particularmente valiosa para la secuencia de proteína Rv3616c de tipo silvestre. Las cepas de interés incluyen:

CDC1551 -cepa transmisible y virulenta. Familia Haarlem (tal como Haarlem A) -Cepas resistentes al fármaco que se encuentran en las poblaciones humanas populosas. Los miembros de la familia Haarlem de cepas de M. tuberculosis se han encontrado en muchas partes del mundo. El primer representante de la familia fue descubierto en Haarlem, Holanda. KZN4207 -Aislado sensible a fármacos a partir de los pacientes de KwaZulu-Natal, Sudáfrica. KZN1435 -Aislado resistente a múltiples fármacos (MDR) a partir de los pacientes de KwaZulu-Natal, Sudáfrica. KZN605 -Aislado extensamente resistente a fármacos (XDR) a partir de los pacientes de KwaZulu-Natal, Sudáfrica. C -Altamente transmitida en la Ciudad de Nueva York. En un estudio, se encontró que esta cepa es más común entre los usuarios de fármacos en inyección, y es resistente a los intermediarios de nitrógeno reactivo (Friedman y col., J. Infect. Dis. 1997, 176(2) : 478-84) 94_M4241A -aislada en San Francisco en 1994 a partir de un paciente nacido en China. Esta cepa fue anteriormente analizada mediante el análisis de supresión genómica (Gagneux y col., PNAS 2006, 103(8) : 28692873). 02_1987 -aislada en San Francisco en 2002 a partir de un paciente nacido en Corea del Sur. Esta cepa fue anteriormente analizada mediante el análisis de supresión genómica (Gagneux y col., PNAS 2006, 103(8) : 28692873). T92 -aislada en San Francisco en 1999 a partir de un paciente nacido en Las Filipinas. Esta cepa fue publicada en Hirsh y col., PNAS 2004, 101: 4871–4876). T85 -aislada en San Francisco en 1998 a partir de un paciente nacido en China. Esta cepa fue publicada en Hirsh y col., PNAS 2004, 101: 4871–4876). EAS054 -aislada en San Francisco en 1993 a partir de un paciente nacido en India. Esta cepa fue anteriormente analizada mediante el análisis de supresión genómica (Gagneux y col., PNAS 2006, 103(8) : 2869-2873). Gagneux y col., PNAS 2006, 103(8) : 2869-2873 y Herbert y col., Infect. Immun. 2007, 75(12) : 5798-5805 proporcionan valiosos antecedentes sobre la gama de cepas de M. tuberculosis que se sabe que existen. De una manera más adecuada, la proteína Rv3616c se selecciona a partir de la secuencia de polipéptidos proporcionada en las SEQ ID NOs: 1 y 3-7, en particular en las SEQ ID NOs: 1 y 3-6, tal como en la SEQ ID NO:

1. En la Figura 15 se proporciona una alineación de las SEQ ID NOs: 1 y 3-7. Las proteínas Rv3616c modificadas de un interés particular son aquéllas que comprenden (por ejemplo, que consisten en) las SEQ ID NOs: 161-169. Los polinucleótidos de un interés particular son aquéllos derivados a partir de las secuencias de tipo silvestre correspondientes a las cepas de M. tuberculosis discutidas anteriormente, tales como aquéllas derivadas a partir de la SEQ ID NO: 2 o su SEQ ID No: 160 de codones optimizados de E. coli relacionada.

COMBINACIONES

imagen11

Una secuencia que contiene las proteínas Rv3616c modificadas (o los polinucleótidos asociados) de la presente invención puede comprender además otros componentes diseñados para potenciar su inmunogenicidad o para mejorar estos antígenos en otros aspectos. Por ejemplo, se puede facilitar un mejor aislamiento de los antígenos del polipéptido a través de la adición de un estiramiento de residuos de histidina (comúnmente conocido como una

5 marca-His) hacia un extremo del antígeno.

El término “marca-His” se refiere a un cordón de residuos de histidina, típicamente de seis residuos, que se insertan dentro de la secuencia de referencia. Para minimizar la alteración de la actividad asociada con la secuencia de referencia, típicamente se inserta una marca-His en el término-N, usualmente inmediatamente después del residuo de metionina iniciador, o de otra manera, en el término C. Normalmente son heterólogas para la secuencia nativa, 10 pero se incorporan debido a que facilitan el aislamiento al mejorar en enlace de la proteína a las resinas de la cromatografía de afinidad con metal inmovilizado (IMAC). Hablando en términos generales, la presencia o ausencia de una marca-His no es significativa desde el punto de vista de provocar una respuesta inmunitaria deseable contra la proteína de referencia. Sin embargo, con el objeto de evitar el riesgo de una reacción adversa contra la marca-His misma, se considera mejor minimizar la longitud de la marca-His, por ejemplo, hasta cuatro o menos residuos, en

15 particular hasta dos residuos, o excluir el uso de una marca-His enteramente.

Con el fin de mejorar la magnitud y/o amplitud de la respuesta inmunitaria provocada, se pueden preparar composiciones, polipéptidos (y ácidos nucleicos que los codifican) que comprendan múltiples secuencias de Rv3616c modificadas y/o polipéptidos heterólogos adicionales o los polinucleótidos que los codifiquen, a partir de las especies de Mycobacterium (en particular M. tuberculosis).

20 Un experto en la técnica reconocerá que, cuando se utilizan un número de componentes en combinación, se puede variar la presentación precisa. Por ejemplo, se podrían presentar un componente de la secuencia de Rv3616c modificada y una copia adicional del antígeno o un componente de antígeno heterólogo adicional:

(1) como dos componentes de polipéptido individuales;

(2) como una proteína de fusión que comprenda ambos componentes del polipéptido; 25 (3) como un polipéptido y un componente de polinucleótido;

(4): como dos componentes de polinucleótido individuales;

(5): como un solo polinucleótido que codifique dos componentes de polipéptido individuales; o

(6): como un solo polinucleótido que codifique una proteína de fusión que comprenda ambos componentes del polipéptido.

30 Esta flexibilidad se aplica igualmente a las situaciones en donde se utilizan tres o más componentes en combinación. Sin embargo, para mayor conveniencia, con frecuencia es deseable que cuando estén presentes un número de componentes, estén contenidos dentro de una sola proteína de fusión o dentro de un polinucleótido que codifique una sola proteína de fusión. En una realización de la invención, todos los componentes de antígeno se proporcionan como polipéptidos (por ejemplo, dentro de una sola proteína de fusión). En una realización alternativa

35 de la invención, todos los componentes de antígeno se proporcionan como polinucleótidos (por ejemplo, un solo polinucleótido, tal como uno que codifique una sola proteína de fusión).

El término “heterólogas”, cuando se utiliza con referencia a porciones de un ácido nucleico, indica que el ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación una con la otra en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico típicamente se produce de una manera recombinante, que tiene dos o

40 más secuencias a partir de genes no relacionados configurados para la elaboración de un nuevo ácido nucleico funcional, por ejemplo, un promotor a partir de una fuente, y una región codificante a partir de otra fuente. De una manera similar, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación una con la otra en la naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión).

“Polipéptido de fusión" o "proteína de fusión" se refiere a una proteína que tiene al menos dos polipéptidos

45 heterólogos (por ejemplo, al menos dos polipéptidos de Mycobacterium sp.) covalentemente unidos, ya sea directamente o bien por medio de un enlazador de aminoácidos. Los polipéptidos que forman la proteína de fusión típicamente enlazan el extremo C al término-N, aunque también pueden enlazar el extremo C al término-C, el extremo N al término-N, o el extremo N al término-C. Los polipéptidos de la proteína de fusión pueden estar en cualquier orden. Este término también se refiere a las variantes conservadoramente modificadas, las variantes

50 polimórficas, los alelos, los mutantes, los fragmentos inmunogénicos, y los homólogos inter-especies de los antígenos que conforman la proteína de fusión. Los antígenos de Mycobacterium tuberculosis se describen en Cole y col., Nature 393: 537 (1998), el cual da a conocer el genoma entero de Mycobacterium tuberculosis. Se pueden identificar antígenos a partir de otras especies de Mycobacterium que correspondan a los antígenos de M. tuberculosis, por ejemplo, utilizando algoritmos de comparación de secuencias, como se describe en la presente, u

55 otros métodos conocidos por los expertos en este campo, por ejemplo, ensayos de hibridación y ensayos de enlace de anticuerpos.

El término “fusionado” se refiere al enlace covalente entre dos polipéptidos en una proteína de fusión. Los polipéptidos típicamente se unen por medio de un enlace peptídico, ya sea directamente uno al otro, o bien por medio de un enlazador de aminoácidos. Opcionalmente, los péptidos se pueden unir por medio de enlaces

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covalentes no peptídicos conocidos por los expertos en este campo.

Los antígenos de M. tuberculosis de ejemplo que se pueden combinar con una secuencia de Rv3616c modificada incluyen uno o más (por ejemplo, de 1 a 5, tal como de 1 a 3, en particular 1) de los siguientes:

(i): Mtb8.4 (también conocido como DPV y Rv1174c), la secuencia de polipéptido que se describe en la SEQ ID NO: 102 de la Publicación Internacional Número WO97/09428 (ADNc de la SEQ ID NO: 101), y en Coler y col., Journal of Immunology, 1998, 161: 2356-2364. Es de un interés particular la secuencia de Mtb8.4 madura, la cual está ausente del péptido de señal líder (es decir, de los residuos de aminoácidos 15-96 a partir de la SEQ ID NO: 102 de la Publicación Internacional Número WO97/09428). La secuencia del polipéptido de longitud completa para Mtb8.4 se muestra de la SEQ ID NO: 8;

(ii): Mtb9.8 (también conocido como MSL y Rv0287), la secuencia de polipéptido que se describe en la SEQ ID NO: 109 de la Publicación Internacional Número WO98/53075 (los fragmentos de MSL se dan a conocer en las SEQ ID NOs: 110-124 de la Publicación Internacional Número WO98/53075, siendo de un interés particular las SEQ ID NOs: 119 y 120), y también en Coler y col., Vaccine, 2009, 27: 223-233 (en particular los fragmentos reactivos mostrados en la Figura 2 del mismo). La secuencia del polipéptido de longitud completa para Mtb9.8 se muestra de la SEQ ID NO: 9;

(iii) Mtb9.9 (también conocido como Mtb9.9A, MTI, MTI-A y Rv1793), la secuencia de polipéptido que se describe en la SEQ ID NO: 19 de la Publicación Internacional Número WO98/53075, y en Alderson y col., Journal of Experimental Medicine, 2000, 7: 551-559 (los fragmentos de MTI se dan a conocer en las SEQ ID NOs: 17 y 5166 de la Publicación Internacional Número WO98/ 53075, siendo de un interés particular las SEQ ID NOs: 17, 51, 52, 53, 56 y 62-65). Un número de las variantes de polipéptidos de MTI se describen en las SEQ ID NOs: 21, 23, 25, 27, 29 y 31 de la Publicación Internacional Número WO98/53075, y en Alderson y col., Journal of Experimental Medicine, 2000, 7: 551-559. La secuencia del polipéptido de longitud completa para Mtb9.9 se muestra de la SEQ ID NO: 10;

(iv): Ra12 (también conocido como el antígeno C-terminal de Mtb32A), la secuencia de polipéptido que se describe en la SEQ ID NO: 10 de la Publicación Internacional Número WO01/98460, y en Skeiky y col., Journal of Immunology, 2004, 172: 7618-7682. La secuencia del polipéptido de longitud completa para Ra12 se muestra de la SEQ ID NO: 11;

(v): Ra35 (también conocido como el antígeno N-terminal de Mtb32A), la secuencia de polipéptido que se describe en la SEQ ID NO: 8 de la Publicación Internacional Número WO01/98460, y en Skeiky y col., Journal of Immunology, 2004, 172: 7618-7682. La secuencia del polipéptido de longitud completa para Ra35 se muestra de la SEQ ID NO: 12;

(vi): TbH9 (también conocido como Mtb39, Mtb39A, TbH9FL y Rv1196), la secuencia de polipéptido que se describe en la SEQ ID NO: 107 de la Publicación Internacional Número WO97/09428, y también en Dillon y col., Infection and Immunity, 1999, 67(6) : 2941-2950, y en Skeiky y col., Journal of Immunology, 2004, 172: 76187682. La secuencia del polipéptido de longitud completa para TbH9 se muestra de la SEQ ID NO: 13;

(vii) Mtb41 (también conocido como MTCC2 y Rv0915c), la secuencia de polipéptido que se describe en la SEQ ID NO: 142 de la Publicación Internacional Número WO98/53075 (ADNc de la SEQ ID NO: 140), y en Skeiky y col., Journal of Immunology, 2000, 165: 7140-7149. La secuencia del polipéptido de longitud completa para Mtb41 se muestra de la SEQ ID NO: 14;

(viii) ESAT-6 (también conocido como esxA y Rv3875), la secuencia de polipéptido que se describe en la SEQ ID NO: 103 de la Publicación Internacional Número WO97/09428 (ADNc de la SEQ ID NO: 104), y en Sorensen y col. Infection and Immunity, 1995, 63(5) : 1710-1717. La secuencia del polipéptido de longitud completa para ESAT-6 se muestra de la SEQ ID NO: 15.L. Sorensen, S. Nagai, G. Houen, P. Andersen and A.B. Andersen, Purification and characterization of a low-molecular-mass T-cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis, Infect Immun 63 (1995) (5), pp. 1710–1717;

(ix): Antígenos complejos Ag85 (por ejemplo, Ag85A, también conocido como fbpA y Rv3804c; o Ag85B, también conocido como fbpB y Rv1886c), los cuales se discuten, por ejemplo, en Content y col., Infection and Immunity, 1991, 59: 3205-3212, y en Huygen y col., Nature Medicine, 1996, 2(8) : 893-898. La secuencia del polipéptido de longitud completa para Ag85A se muestra de la SEQ ID NO: 16 (siendo de un interés particular la proteína madura de los residuos 43-338, es decir, que carece del péptido de señal). La secuencia del polipéptido de longitud completa para Ag85B se muestra de la SEQ ID NO: 17 (siendo de un interés particular la proteína madura de los residuos 41-325, es decir, que carece del péptido de señal) ;

(x): Alfa-cristalina (también conocida como hspX y Rv2031c), la cual se describe en Verbon y col., Journal of Bacteriology, 1992, 174: 1352-1359, y en Friscia y col., Clinical and Experimental Immunology, 1995, 102: 53-57 (son de un interés particular los fragmentos correspondientes a los residuos 71-91, 21-40, 91-110 y 111-130). La secuencia del polipéptido de longitud completa para la alfa-cristalina se muestra de la SEQ ID NO: 18;

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(xi) Mpt64 (también conocido como Rv1980c), el cual se describe en Roche y col., Scandinavian Journal of Immunology, 1996, 43: 662-670. La secuencia del polipéptido de longitud completa para MPT64 se muestra de la SEQ ID NO: 19 (siendo de un interés particular la proteína madura de los residuos 24-228, es decir, que carece del péptido de señal) :

(xii) Mtb32A, la secuencia de polipéptido que se describe en la SEQ ID NO: 2 (longitud completa), y los residuos 8-330 de la SEQ ID NO: 4 (madura) de la Publicación Internacional Número WO01/ 98460, en especial las variantes que tienen al menos uno de los triads catalíticos mutados (por ejemplo, el residuo de serina catalítico, el cual, por ejemplo, se puede mutar hasta alanina). La secuencia del polipéptido de longitud completa para Mtb32A se muestra de la SEQ ID NO: 20. La forma madura de Mtb32A que tiene una mutación de Ser/Ala se muestra de la SEQ ID NO: 21;

(xiii) TB10.4, la secuencia del polipéptido de longitud completa para TB10.4 se muestra de la SEQ ID NO: 22; .L. Sorensen, S. Nagai, G. Houen, P. Andersen and A.B. Andersen, Purification and characterization of a lowmolecular-mass T-cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis, Infect Immun 63 (1995) (5), pp. 1710– 1717;

(xiv) Rv1753c, la secuencia del polipéptido de longitud completa para Rv1753c a partir de Mycobacterium tuberculosis H37Rv se muestra de la SEQ ID NO: 157;

(xv) Rv2386c, la secuencia del polipéptido de longitud completa para Rv2386c a partir de Mycobacterium tuberculosis H37Rv se muestra de la SEQ ID NO: 158; y/o

(xvi) Rv2707c, la secuencia del polipéptido de longitud completa para Rv2707c a partir de Mycobacterium tuberculosis H37Rv se muestra de la SEQ ID NO: 159;

o las combinaciones de los mismos, tales como:

(a): una combinación de los componentes Ra12, TbH9 y Ra35, por ejemplo, en la forma de una proteína de fusión, tal como Mtb72f. La secuencia de polipéptido de Mtb72f se describe en la SEQ ID NO: 6 de la Publicación Internacional Número WO2006/117240 (ADNc de la SEQ ID NO: 5), y en Skeiky y col., Journal of Immunology, 2004, 172: 7618-7682 (en donde incorpora una marca-His opcional para ayudar a la purificación, cuando se utiliza en la presente invención, de una manera adecuada, Mtb72f está ausente de los residuos opcionales de histidina). La secuencia de polipéptido para Mtb72f se muestra de la SEQ ID NO: 23;

(b): una combinación de los componentes Ra12, TbH9 y Ra35 mutado en Ser/Ala (es decir, en donde el residuo de serina catalítico ha sido reemplazado con alanina), por ejemplo, en la forma de una proteína de fusión, tal como M72. La secuencia de polipéptido de M72 se describe en la SEQ ID NO: 4 de la Publicación Internacional Número WO2006/117240 (ADNc de la SEQ ID NO: 3), en donde incorpora una doble histidina opcional, para ayudar a la elaboración, cuando se utiliza en la presente invención M72 también puede incorporar una doble histidina, aunque, de una manera adecuada, M72 está ausente de la doble histidina opcional (es decir, los residuos 4-725 a partir de la SEQ ID NO: 4 de la Publicación Internacional Número WO2006/117240 son de un interés particular). La secuencia de polipéptido para M72 se muestra de la SEQ ID NO: 24;

(c): una combinación de los componentes Mtb8.4, Mtb9.8, Mtb9.9 y Mtb41, por ejemplo, en la forma de una proteína de fusión, tal como Mtb71f. La secuencia de polipéptido de Mtb71f se describe en la SEQ ID NO: 16 de la Publicación Internacional Número WO99/051748 (ADNc de la SEQ ID NO: 15), en donde incorpora una marca-His opcional para ayudar a la purificación, cuando se utiliza en la presente invención, de una manera adecuada, Mtb71f corresponde a los residuos de aminoácidos 9-710 de la SEQ ID NO: 16 a partir de la Publicación Internacional Número WO99/051748. La secuencia de polipéptido para Mtb71f se muestra de la SEQ ID NO: 25;

(d): una combinación de Mtb72f o M72 (de una manera adecuada sin residuos de histidina opcionales para ayudar a la expresión) con Mtb9.8 y Mtb9.9, por ejemplo, en una proteína de fusión. La secuencia de polipéptido para una fusión de M72-Mtb9.9-Mtb9.8 se muestra de la SEQ ID NO: 26 (fusión de M92), cuando se utilizan en la presente invención, la fusión de M72-Mtb9.9-Mtb9.8 puede incorporar opcionalmente una doble histidina en seguida del residuo de metionina iniciador, para ayudar a la elaboración;

(e): una combinación de Mtb72f o M72 (de una manera adecuada sin residuos de histidina opcionales para ayudar a la expresión) con Ag85B, por ejemplo, en una proteína de fusión, tal como Mtb103f. La secuencia de polipéptido de Mtb103f se describe en la SEQ ID NO: 18 de la Publicación Internacional Número WO03/ 070187 (ADNc de la SEQ ID NO: 10), en donde se incorpora una marca-His opcional para ayudar a la purificación, cuando se utiliza en la presente invención, de una manera adecuada, Mtb103f corresponde a los residuos de aminoácidos 8-1016 de la SEQ ID NO: 18 a partir de la Publicación Internacional Número WO03/070187. También es de un interés particular M103, es decir, Mtb103f que incorpora una mutación de Ser/Ala en el componente Ra35, cuando se utiliza en la presente invención, de una manera adecuada, M103 corresponde a los residuos de aminoácidos 8-1016 de la SEQ ID NO: 18 a partir de la Publicación Internacional Número WO03/070187, en donde el residuo de Ser en la posición 710 ha sido reemplazado con Ala. La secuencia de polipéptido para M103 se muestra de la SEQ ID NO: 27, cuando se utiliza en la presente invención, la fusión de

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M72-Mtb9.9-Mtb9.8 puede incorporar opcionalmente una doble histidina en seguida del residuo de metionina iniciador, para ayudar a la elaboración;

(f): una combinación de Mtb72f o M72 (de una manera adecuada sin residuos de histidina opcionales para ayudar a la expresión) con Mtb41, por ejemplo, en una proteína de fusión, tal como Mtb114f. La secuencia de polipéptido de Mtb114f se describe en la SEQ ID NO: 16 de la Publicación Internacional Número WO03/ 070187 (ADNc de la SEQ ID NO: 9), en donde incorpora una marca-His opcional para ayudar a la purificación, cuando se utiliza en la presente invención, de una manera adecuada, Mtb114f corresponde a los residuos de aminoácidos 8-1154 de la SEQ ID NO: 16 a partir de la Publicación Internacional Número WO03/070187. También es de un interés particular M114, es decir, Mtb114f que incorpora una mutación de Ser/Ala en el componente Ra35, cuando se utiliza en la presente invención, de una manera adecuada, M114 corresponde a los residuos de aminoácidos 81154 de la SEQ ID NO: 16 a partir de la Publicación Internacional Número WO03/070187, en donde el residuo de Ser en la posición 710 ha sido reemplazado con Ala. La secuencia de polipéptido para M114 se muestra de la SEQ ID NO: 28, cuando se utiliza en la presente invención, la fusión de M72-Mtb9.9-Mtb9.8 puede incorporar opcionalmente una doble histidina en seguida del residuo de metionina iniciador, para ayudar a la elaboración;

(g): una combinación de los componentes Ag85B y ESAT-6, tal como en una fusión descrita en Doherty y col., Journal of Infectious Diseases, 2004, 190: 2146–2153; y/o

(h): una combinación de los componentes Ag85B y TB10.4, tal como en una fusión descrita en Dietrich y col., Journal of Immunology, 2005, 174(10) : 6332-6339, 190: 2146–2153.

Las combinaciones de un componente de una secuencia de Rv3616c modificada y un componente de Rv1753c, son de un interés particular. Obviamente estas combinaciones podrían contener opcionalmente otros componentes de antígeno adicionales (por ejemplo, un componente M72).

Otra combinación de interés comprende un componente de una secuencia de Rv3616c modificada y un componente M72.

Una combinación de interés adicional comprende un componente de una secuencia de Rv3616c modificada y un componente Rv2386c.

Otras combinaciones de interés incluyen aquéllas que comprenden un componente de una secuencia de Rv3616c modificada y un componente Rv2707c.

Una combinación de interés adicional comprende un componente de una secuencia de Rv3616c modificada y un componente de alfa-cristalina.

La persona experta reconocerá que las combinaciones no necesitan apoyarse en las secuencias específicas descritas anteriormente en (i) -(xvi) y (a) -(h), y que se pueden utilizar las variantes conservadoramente modificadas (por ejemplo, que tengan al menos el 70 % de identidad, tal como al menos el 80 % de identidad, en particular al menos el 90 % de identidad, y en especial al menos el 95 % de identidad), o los fragmentos inmunogénicos (por ejemplo, de al menos el 20 % del antígeno de longitud completa, tal como de al menos el 50 % del antígeno, en particular de al menos el 70 por ciento, y en especial de al menos el 80 por ciento) de las secuencias descritas para lograr el mismo efecto práctico.

Cada una de las secuencias de antígeno individuales anteriores también se da a conocer en Cole y col., Nature, 1998, 393: 537-544, y en Camus, Microbiology, 2002, 148: 2967-2973. El genoma de M. tuberculosis H37Rv está públicamente disponible, por ejemplo, en el sitio web Welcome Trust Sanger Institute (www.sanger.ac.uk/Projects/M_tuberculosis/), y en cualquier otra parte.

Muchos de los antígenos anteriores también se dan a conocer en las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Números 08/523,435, 08/523,436, 08/658,800, 08/659,683, 08/818,111, 08/818,112, 08/942,341, 08/942,578, 08/858,998, 08/859,381, 09/056,556, 09/072,596, 09/072,967, 09/073,009, 09/073,010, 09/223,040, 09/287,849 y en las Solicitudes de Patente del TCP Números PCT/US98/10407, PCT/US98/10514, PCT/US99/ 03265, PCT/US99/03268, PCT/US99/07717, WO97/09428 y WO97/09429, WO98/16645, WO98/16646, cada una de las cuales se incorpora a la presente como referencia.

Las composiciones, polipéptidos, y ácidos nucleicos de la invención también pueden comprender polipéptidos adicionales a partir de otras fuentes. Por ejemplo, las composiciones y las proteínas de fusión de la invención pueden incluir polipéptidos o ácidos nucleicos que codifiquen los polipéptidos, en donde el polipéptido mejora la expresión del antígeno, por ejemplo, NS1, una proteína de virus de influenza (véanse, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales Números WO99/40188 y WO93/04175).

Los ácidos nucleicos de la invención se pueden diseñar basándose en la preferencia de codones en una especie de elección, por ejemplo, en seres humanos (en el caso de la expresión in vivo) o en una bacteria particular (en el caso de la producción de polipéptidos). La SEQ ID NO: 160, por ejemplo, proporciona un polinucleótido de codones optimizados para la expresión de Rv3616c a partir de H37Rv en E. coli.

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El componente de la secuencia de Rv3616c modificada también se puede administrar con uno o más agentes quimioterapéuticos efectivos contra la tuberculosis (por ejemplo, la infección por M. tuberculosis). Los ejemplos de estos agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a, amicacina, ácido amino-salicílico, capreomicina, cicloserina, etambutol, etionamida, isoniazida, kanamicina, pirazinamida, rifamicinas (es decir, rifampina, rifapentina 5 y rifabutina), estreptomicina, ofloxacina, ciprofloxacina, claritromicina, azitromicina y fluoro-quinolonas. Esta quimioterapia es determinada por el juicio del médico tratante utilizando las combinaciones preferidas de fármacos. Los agentes quimioterapéuticos "de primera línea" utilizados para tratar la tuberculosis (por ejemplo, la infección por

M. tuberculosis) que no es resistente a fármacos, incluyen isoniazida, rifampina, etambutol, estreptomicina y pirazinamida. Los agentes quimioterapéuticos "de segunda línea" utilizados para tratar la tuberculosis (por ejemplo, la infección por M. tuberculosis) que ha demostrado resistencia al fármaco para uno o más fármacos "de primera línea" incluyen ofloxacina, ciprofloxacina, etionamida, ácido amino-salicílico, cicloserina, amicacina, kanamicina y capreomicina.

Los agentes quimioterapéuticos convencionales se administran en términos generales durante un período relativamente largo (de aproximadamente 9 meses). La combinación de los agentes quimioterapéuticos

15 convencionales con la administración de un componente de una secuencia de Rv3616c modificada de acuerdo con la presente invención, puede hacer posible que se reduzca el período de tratamiento quimioterapéutico (por ejemplo, hasta 8 meses, 7 meses, 6 meses, 5 meses, 4 meses, 3 meses, o menos) sin una disminución en la eficacia.

Es de un interés particular el uso de un componente de una secuencia de Rv3616c modificada en conjunto con Bacillus Calmette-Guerin (BCG). Por ejemplo, en la forma de un BCG modificado que exprese de una manera recombinante una proteína Rv3616c modificada. De una manera alternativa, el componente de la secuencia de Rv3616c modificada se puede utilizar para mejorar la respuesta de un sujeto a la vacunación con BCG, ya sea mediante la co-administración o mediante el refuerzo de una vacunación previa con BCG. Cuando se utiliza para potenciar la respuesta de un sujeto a la vacunación con BCG, el componente de la secuencia de Rv3616c modificada se puede proporcionar obviamente en la forma de un polipéptido o de un polinucleótido (opcionalmente

25 en conjunto con componentes antigénicos adicionales, como se describe anteriormente).

La persona experta reconocerá que las combinaciones de los componentes no necesitan administrarse juntas, y se pueden aplicar: por separado o en combinación; al mismo tiempo, en secuencia o dentro de un período corto; a través de las mismas o a través de diferentes vías. No obstante, para mayor conveniencia en general es deseable (en donde los regímenes de administración sean compatibles) administrar una combinación de componentes como una sola composición.

Los polipéptidos, polinucleótidos y composiciones de la presente invención normalmente se administrarán a seres humanos, pero se puede esperar que sean efectivos en otros mamíferos, incluyendo mamíferos domésticos (por ejemplo, perros, gatos, conejos, ratas, ratones, cobayos, hámsters, chinchillas), y mamíferos agrícolas (por ejemplo, reses, cerdos, ovejas, cabras, caballos).

35 VARIANTES

Los epítopos de células T son estiramientos de aminoácidos contiguos cortos que son reconocidos por las células T (por ejemplo, las células T CD4+ o CD8+). La identificación de los epítopos de células T se puede lograr a través de los experimentos de mapeo de epítopos, los cuales son bien conocidos por la persona experta en la materia (véase, por ejemplo, Paul, Fundamental Immunology, 3a Edición, 243-247 (1993) ; Beißbarth y col., Bioinformatics, 2005, 21 (Suplemento 1) : i29-i37). De una manera alternativa, los epítopos se pueden predecir o mapear utilizando los planteamientos discutidos en los Ejemplos.

En una población exógama diversa, tal como en los seres humanos, los diferentes tipos de HLA significan que algunos epítopos particulares pueden no ser reconocidos por todos los miembros de la población. Como un resultado del involucramiento crucial de la respuesta de células T en la tuberculosis, con el fin de maximizar el nivel

45 de reconocimiento y la escala de respuesta inmunitaria, una proteína Rv3616c modificada óptima es una que contiene la mayoría de (o de una manera adecuada todos) los epítopos de células T intactos.

“Variantes" o "variantes conservadoramente modificadas” se aplica a las secuencias tanto de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes conservadoramente modificadas se refieren a los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o en donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, para secuencias esencialmente idénticas.

Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU, codifican todos el aminoácido alanina. Por consiguiente, en cada posición en donde una alanina es especificada por un codón, el codón se puede 55 alterar hasta cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Las variaciones de ácidos nucleicos conducen a las variantes “silenciosas" o "degeneradas”, las cuales son una especie de variaciones conservadoramente modificadas. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente, que codifique un polipéptido, también describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. Un experto en la materia

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reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, el cual es ordinariamente el único codón para metionina, y TGG, el cual es ordinariamente el único codón para triptófano) puede ser modificado para proporcionar una molécula funcionalmente idéntica. De conformidad con lo anterior, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifique un polipéptido es implícita en cada secuencia descrita.

5 Las variaciones no silenciosas son aquéllas que dan como resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos codificada (ya sea a través de la sustitución, supresión o adición de los residuos de aminoácidos). Los expertos en este campo reconocerán que una secuencia de polinucleótido particular puede contener variaciones conservadoras silenciosas y no silenciosas.

Con respecto a las variantes de una secuencia de proteína, la persona experta reconocerá que las sustituciones,

10 supresiones o adiciones individuales al polipéptido, que alteren, agreguen, o supriman un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos, es una “variante conservadoramente modificada” en donde las alteraciones dan como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido funcionalmente similar o la sustitución/supresión/adición de los residuos que no tengan un impacto sustancial sobre la función biológica de la variante.

15 Las tablas de sustituciones conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la materia. Estas variantes conservadoramente modificadas son en adición a, y no excluyen, las variantes polimórficas, los homólogos inter-especies, y los alelos de la invención.

En general, estas sustituciones conservadoras caerán dentro de una de las agrupaciones de aminoácidos especificadas más adelante, aunque, en algunas circunstancias son posibles otras sustituciones sin afectar

20 sustancialmente a las propiedades inmunogénicas del antígeno. Los siguientes ocho grupos contienen cada uno, aminoácidos que son típicamente sustituciones conservadoras unos por otros:

1) Alanina (A), Glicina (G) ; 2) Ácido aspártico (D), ácido glutámico (E) ; 3) Asparagina (N), Glutamina (Q) ;

25 4) Arginina (R), Lisina (K) ; 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V) ; 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W) ; 7) Serina (S), Treonina (T) ; y 8) Cisteína (C), Metionina (M) ;

30 (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins, 1984).

De una manera adecuada, estas sustituciones no se presentan en la región de un epítopo, y, por consiguiente, no tienen un impacto significativo sobre las propiedades inmunogénicas del antígeno.

Las variantes de proteínas también pueden incluir aquéllas en donde se insertan aminoácidos adicionales, comparándose con la secuencia de referencia. De una manera adecuada, estas inserciones no se presentan en la

35 región de un epítopo, y, por consiguiente, no tienen un impacto significativo sobre las propiedades inmunogénicas del antígeno. Un ejemplo de las inserciones incluye un estiramiento corto de los residuos de histidina (por ejemplo, de 2 a 6 residuos) para ayudar a la expresión y/o purificación del antígeno en cuestión.

Las variantes de proteínas incluyen aquéllas en donde se han suprimido aminoácidos, comparándose con la secuencia de referencia. De una manera adecuada, estas supresiones no se presentan en la región de un epítopo,

40 y, por consiguiente, no tienen un impacto significativo sobre las propiedades inmunogénicas del antígeno.

La persona experta reconocerá que una variante de proteína particular puede comprender sustituciones, supresiones y adiciones (o cualquier combinación de las mismas).

Los términos “idéntica” o porcentaje de “identidad”, en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o de polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o sub-secuencias que son iguales o que tienen un porcentaje 45 especificado de residuos de aminoácidos o de nucleótidos que son iguales (es decir, el 70 % de identidad, opcionalmente el 75 por ciento, el 80 por ciento, el 85 por ciento, el 90 por ciento, el 95 por ciento, el 98 % o el 99 % de identidad sobre una región especificada), cuando se comparan y se alinean para una máxima correspondencia sobre una ventana de comparación, o una región designada, como se mide utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias, o mediante alineación manual e inspección visual. Entonces se dice que

50 estas secuencias son “sustancialmente idénticas”. Esta definición también se refiere al cumplimiento de una secuencia de prueba. Opcionalmente, la identidad existe sobre una región que es de al menos aproximadamente 25 a aproximadamente 50 aminoácidos o nucleótidos de longitud, u opcionalmente sobre una región que es de 75 a 100 aminoácidos o nucleótidos de longitud. De una manera adecuada, la comparación se lleva a cabo sobre una ventana correspondiente a la longitud entera de la secuencia de referencia (opuestamente a la secuencia variante).

55 Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen en una computadora las secuencias de prueba y de referencia, se designan las coordenadas de subsecuencias, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmos de secuencias. Se pueden utilizar los parámetros del programa por omisión, o se pueden designar parámetros alternativos. Entonces el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

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5 Una “ventana de comparación”, como se utiliza en la presente, hace referencia a un segmento en donde una secuencia se puede comparar con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que se alinean óptimamente las dos secuencias. Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en este campo. La alineación óptima de secuencias para comparación se puede conducir, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482 (1981), mediante

10 el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci., EUA, 85: 2444 (1988), mediante las implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y col., Editores,

15 1995, Suplemento)).

Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de múltiples secuencias a partir de un grupo de secuencias relacionadas utilizando alineaciones progresivas por pares, para mostrar la relación y el porcentaje de identidad de secuencias. También grafica un árbol o dendograma que muestra las relaciones agrupadas utilizadas para crear la alineación. PILEUP utiliza una simplificación del método de alineación progresiva de Feng y Doolittle, J. 20 Mol. Evol., 35: 351-360 (1987). El método empleado es similar al método descrito por Higgins y Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989). El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de 5,000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de múltiples alineaciones empieza con la alineación por pares de las dos secuencias más similares, produciendo un racimo de dos secuencias alineadas. Este racimo se alinea entonces con la siguiente secuencia o racimo de secuencias alineadas más relacionadas. Dos racimos de secuencias se 25 alinean mediante una simple extensión de la alineación por pares de dos secuencias individuales. La alineación final se logra mediante una serie de alineaciones progresivas por pares. El programa se ejecuta designando las secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o de nucleótidos para las regiones de comparación de secuencias, y designando los parámetros del programa. Utilizando PILEUP, una secuencia de referencia se compara con otras secuencias de prueba para determinar el porcentaje de relación de identidad de secuencias

30 utilizando los siguientes parámetros: peso de hueco por omisión (3,00), peso de longitud de hueco por omisión (0,10), y huecos de extremo ponderados. PILEUP se puede obtener a partir del paquete de software de análisis de secuencias GCG, por ejemplo, versión 7.0 (Devereaux y col., Nuc. Acids Res., 12: 387-395 (1984).

Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencias y la similitud de secuencias, son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, los cuales se describen en Altschul y col., Nuc. Acids Res., 35 25: 3389-3402 (1977), y Altschul y col., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990), respectivamente. El software para llevar a cabo los análisis BLAST está públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information (sitio web en www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo involucra primero identificar los pares de secuencias de alto puntaje (HSPs) mediante la identificación de palabras cortas de una longitud W en la secuencia pedida, las cuales concuerdan o satisfacen algún puntaje umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma 40 longitud en una secuencia de la base de datos. T es referido como el umbral de puntaje de palabra vecina (Altschul y col., supra). Estos impactos de palabra vecina iniciales actúan como semillas para iniciar las búsquedas con el fin de encontrar HPSs más largos que las contengan. Los impactos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia por tanto como se pueda incrementar el puntaje de alineación acumulativo. Los puntajes acumulativos se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótido, los parámetros M (puntaje de recompensa 45 para un par de residuos emparejados; siempre > 0), y N (puntaje de penalidad para los residuos mal emparejados; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular el puntaje acumulativo. La extensión de los impactos de palabras en cada dirección se detiene cuando: el puntaje de alineación acumulativo cae fuera por la cantidad X a partir de su máximo valor alcanzado; el puntaje acumulativo llega a cero o más abajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se llega al 50 final de cualquier secuencia. Los parámetros W, T, y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para las secuencias de nucleótidos) utiliza por omisión una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por omisión una longitud de palabra de 3, y una expectativa

(E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci., EUA, 89: 10915 55 (1989)) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci., EUA, 90: 5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la que se presentaría un emparejamiento entre dos secuencias de nucleótidos o de

60 aminoácidos por azar. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0,2, más preferiblemente menor de aproximadamente 0,01, y de una manera muy preferible menor de aproximadamente 0,001.

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En cualquier caso, las variantes de un secuencia de polipéptido tendrán esencialmente la misma actividad que la secuencia de referencia (en el caso de los polinucleótidos, las secuencias de polinucleótidos variantes codificarán un polipéptido que tendrá esencialmente la misma actividad que la secuencia de referencia). Esencialmente la misma actividad significa al menos el 50 por ciento, de una manera adecuada, al menos el 75 por ciento, y en especial al

5 menos el 90 % de actividad de la secuencia de referencia en un ensayo de reestimulación in vitro de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o de sangre entera con antígenos específicos (por ejemplo, la reestimulación durante un período de entre varias horas y hasta dos semanas, tal como hasta un día, de 1 día a 1 semana, o de 1 a 2 semanas), el cual mide la activación de las células por medio de linfoproliferación, producción de citocinas en el sobrenadante de cultivo (medida mediante ELISA, CBA, etc.), o caracterización de respuestas de células T y B mediante teñido intra-y extra-celular (por ejemplo, utilizando anticuerpos específicos para inmunomarcadores, tales como CD3, CD4, CD8, IL2, TNFa, IFNg, CD40L, CD69, etc.), seguida por análisis con a citómetro de flujo. De una manera adecuada, por esencialmente la misma actividad significa al menos el 50 por ciento, de una manera adecuada, al menos el 75 por ciento, y en especial al menos el 90 % de actividad de la secuencia de referencia en un ensayo de proliferación de células T y/o de producción de IFN-gamma.

15 Como será entendido por los expertos en la materia, los polinucleótidos útiles en la presente invención pueden incluir secuencias genómicas, secuencias extra-genómicas y codificadas por plásmidos, y segmentos genéticos diseñados más pequeños que expresen, o que se puedan adaptar para expresar, proteínas, polipéptidos, péptidos y similares. Estos segmentos se pueden aislar naturalmente, o se pueden modificar sintéticamente mediante la mano del hombre.

Como será reconocido por el experto, los polinucleótidos pueden ser de una sola cadena (codificantes o antisentido)

o de doble cadena, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc, o sintético) o de ARN. Las moléculas de ARN incluyen moléculas de HnARN, que contienen intrones y que corresponden a una molécula de ADN de una manera de una a una, y moléculas de ARNm, que no contienen intrones. Puede haber, pero no necesita haber, secuencias codificantes o no codificantes adicionales presentes dentro de un polinucleótido de la presente invención, y un

25 polinucleótido se puede enlazar, pero no necesita enlazarse, a otras moléculas y/o materiales de soporte.

Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifique un antígeno de Mycobacterium o una porción del mismo), o pueden comprender una variante, o un equivalente biológico o funcional de esta secuencia. Las variantes de polinucleótidos pueden contener una o más sustituciones, adiciones, supresiones y/o inserciones, de tal manera que no disminuye la inmunogenicidad del polipéptido codificado en relación con la proteína de referencia.

IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE POLINUCLEÓTIDOS

Los polinucleótidos se pueden identificar, preparar y/o manipular utilizando cualquiera de una variedad de técnicas bien establecidas. Por ejemplo, un polinucleótido se puede identificar, como se describe con mayor detalle más adelante, mediante el rastreo de un microarreglo de ADNcs. Estos rastreos se pueden llevar a cabo, por ejemplo,

35 utilizando un microarreglo Synteni (Palo Alto, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (y esencialmente como es descrito por Schena y col., Proc. Natl. Acad. Sci., EUA, 93: 10614-10619 (1996), y por Heller y col., Proc. Natl. Acad. Sci., EUA, 94: 2150-2155 (1997)). De una manera alternativa, los polinucleótidos se pueden amplificar a partir del ADNc preparado a partir de las células que expresen las proteínas descritas en la presente, tales como las células de M. tuberculosis. Estos polinucleótidos se pueden amplificar por medio de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para este planteamiento, se pueden diseñar cebadores específicos de la secuencia basándose en las secuencias proporcionadas en la presente, y se pueden comprar o se pueden sintetizar.

Se puede utilizar una porción amplificada de un polinucleótido para aislar un gen de longitud completa a partir de una biblioteca adecuada (por ejemplo, una biblioteca de ADNc de M. tuberculosis) utilizando técnicas bien conocidas. Dentro de estas técnicas, una biblioteca (ADNc o genómico) se rastrea utilizando una o más sondas o

45 cebadores de polinucleótido adecuados para la amplificación. De preferencia, una biblioteca se selecciona por tamaños para incluir las moléculas más grandes. También se pueden preferir las bibliotecas con cebadores aleatorios para identificar las regiones 5’ y corriente arriba de los genes. Se prefieren las bibliotecas genómicas para obtener intrones y para extender las secuencias 5’.

Para las técnicas de hibridación, una secuencia parcial se puede marcar (por ejemplo, mediante traducción de muesca o marcado de extremo con 32P) utilizando técnicas bien conocidas. Entonces se rastrea en términos generales una biblioteca bacteriana o de bacteriófagos mediante filtros de hibridación que contengan colonias bacterianas desnaturalizadas (o prados que contengan placas de fagos) con la sonda marcada (véase Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2000)). Las colonias o placas de hibridación se seleccionan y se expanden, y el ADN se aísla para su análisis adicional. Los clones de ADNc se pueden analizar para determinar la 55 cantidad de secuencia adicional, por ejemplo, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando un cebador a partir de la secuencia parcial, y un cebador a partir del vector. Se pueden generar mapas de restricción y secuencias parciales para identificar uno o más clones traslapados. Entonces se puede determinar la secuencia completa utilizando las técnicas convencionales, las cuales pueden involucrar la generación de una serie de clones de supresión. Entonces se pueden ensamblar las secuencias traslapadas resultantes en una sola secuencia contigua. Se puede generar un ADNc de longitud completa mediante el ligamiento de los fragmentos adecuados,

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utilizando técnicas bien conocidas.

De una manera alternativa, existen numerosas técnicas de amplificación para obtener una secuencia de codificación de longitud completa a partir de una secuencia de ADNc parcial. Dentro de estas técnicas, la amplificación se lleva a cabo en general por medio de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se puede utilizar cualquiera de una

5 variedad de kits comercialmente disponibles para llevar a cabo la etapa de amplificación. Los cebadores se pueden diseñar utilizando, por ejemplo, softwares bien conocidos en la materia. Los cebadores son de preferencia de 22 a 30 nucleótidos de longitud, tienen un contenido de GC de al menos el 50 por ciento, y se templan a la secuencia objetivo a temperaturas de aproximadamente 68°C a 72°C. La región amplificada se puede secuenciar como se describe anteriormente, y las secuencias traslapadas se ensamblan en una secuencia contigua.

10 Una técnica de amplificación es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) inversa (véase Triglia y col., Nucl. Acids Res., 16: 8186 (1988)), la cual utiliza enzimas de restricción para generar un fragmento en la región conocida del gen. El fragmento entonces se circulariza mediante ligamiento intramolecular, y se utiliza como una plantilla para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores divergentes derivados a partir de la región conocida. Dentro de un planteamiento alternativo, se pueden recuperar las secuencias adyacentes a una secuencia parcial

15 mediante amplificación con un cebador para una secuencia enlazadora y un cebador específico para una región conocida. Las secuencias amplificadas típicamente se someten a una segunda ronda de amplificación con el mismo cebador enlazador y un segundo cebador específico para la región conocida. Una variación sobre este procedimiento, que emplea dos cebadores que inician la extensión en direcciones opuestas a partir de la secuencia conocida, se describe en la Publicación Internacional Número WO 96/38591. Otra técnica se conoce como

20 “amplificación rápida de los extremos del ADNc” o RACE. Esta técnica involucra el uso de un cebador interno y un cebador externo, que se hibrida a una región o secuencia de vector poliA, para identificar las secuencias que son 5’ y 3’ de una secuencia conocida. Las técnicas adicionales incluyen reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de captura (Lagerstrom y col., PCR Methods Applic., 1: 111-19 (1991)), y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) caminante (Parker y col., Nucl. Acids. Res., 19: 3055-60 (1991)). También se pueden usar otros métodos que

25 emplean amplificación para obtener una secuencia de ADNc de longitud completa.

En ciertas instancias, es posible obtener una secuencia de ADNc de longitud completa mediante el análisis de secuencias proporcionado en una base de datos de marca de secuencia expresada (EST), tal como aquélla disponible en GenBank. Las búsquedas de las ESTs traslapadas se pueden llevar a cabo en términos generales utilizando programas bien conocidos (por ejemplo, búsquedas en NCBI BLAST), y estas ESTs se pueden utilizar

30 para generar una secuencia contigua de longitud completa. También se pueden obtener secuencias de ADN de longitud completa mediante el análisis de los fragmentos genómicos.

EXPRESIÓN DE POLINUCLEÓTIDOS EN LAS CÉLULAS HUÉSPED

Las secuencias de polinucleótidos o los fragmentos de las mismas que codifican los polipéptidos, o las proteínas de fusión o los equivalentes funcionales de las mismas, se pueden utilizar en las moléculas de ADN recombinante para

35 dirigir la expresión de un polipéptido en las células huésped apropiadas. Debido a la degeneración inherente del código genético, se pueden producir otras secuencias de ADN que codifiquen sustancialmente la misma o una secuencia de aminoácidos funcionalmente equivalente, y estas secuencias se pueden utilizar para clonar y expresar un polipéptido dado.

Como será entendido por los expertos en este campo, puede ser conveniente en algunas instancias producir

40 secuencias de nucleótidos que codifiquen el polipéptido que posean codones que no se presenten naturalmente. Por ejemplo, se pueden seleccionar los codones preferidos por un huésped procariótico o eucariótico particular para aumentar el índice de expresión de proteína, o para producir una transcripción de ARN recombinante que tenga propiedades deseables, tales como una vida media que sea más larga que aquélla de una transcripción generada a partir de la secuencia que se presente naturalmente.

45 Más aún, las secuencias de polinucleótidos se pueden diseñar utilizando métodos generalmente conocidos en la materia, con el objeto de alterar las secuencias que codifiquen el polipéptido por una variedad de razones, incluyendo, pero no limitándose a, alteraciones que modifiquen la clonación, el procesamiento, y/o la expresión del producto genético. Por ejemplo, se puede utilizar la mezcla del ADN mediante fragmentación aleatoria, y el reensamble mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de los fragmentos genéticos y de los

50 oligonucleótidos sintéticos para diseñar las secuencias de nucleótidos. En adición, se puede utilizar mutagénesis dirigida al sitio para insertar nuevos sitios de restricción, para alterar los patrones de glicosilación, para cambiar la preferencia de codones, para producir variantes de empalme, o para introducir mutaciones, y así sucesivamente.

Las secuencias de ácidos nucleicos naturales, modificadas, o recombinantes se pueden ligar con una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión. Por ejemplo, para rastrear las bibliotecas de péptidos con el fin de

55 buscar inhibidores de la actividad del polipéptido, puede ser útil codificar una proteína quimérica que pueda ser reconocida por un anticuerpo comercialmente disponible. También se pueden diseñar una proteína de fusión para contener un sitio de disociación localizado entre la secuencia de codificación del polipéptido y la secuencia de la proteína heteróloga, de tal manera que el polipéptido se pueda disociar y purificar para deshacerse de la fracción heteróloga.

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Las secuencias que codifiquen un polipéptido deseado se pueden sintetizar, del todo o en parte, empleando métodos químicos bien conocidos en la materia (véase Caruthers, M. H. y col., Nucl. Acids Res. Symp. Ser., páginas 215-223 (1980), Horn y col., Nucl. Acids Res. Symp. Ser., páginas 225-232 (1980)). De una manera alternativa, la proteína misma se puede producir utilizando métodos químicos para sintetizar la secuencia de aminoácidos de un

5 polipéptido, o una porción de la misma. Por ejemplo, la síntesis del péptido se puede llevar a cabo utilizando diferentes técnicas en fase sólida (Roberge y col., Science, 269: 202-204 (1995)), y se puede lograr la síntesis automatizada, por ejemplo, utilizando el Sintetizador de Péptidos ABI 431A (Perkin Elmer, Palo Alto, CA).

Un péptido recién sintetizado se puede purificar sustancialmente mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento de preparación (por ejemplo, Creighton, Proteins, Structures and Molecular Principles (1983)) o

10 mediante otras técnicas comparables disponibles en este campo. La composición de los péptidos sintéticos se puede confirmar mediante análisis o secuenciación de aminoácidos (por ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman). Adicionalmente, la secuencia de aminoácidos de un polipéptido, o cualquier parte de la misma, se puede alterar durante la síntesis directa y/o se puede combinar utilizando métodos químicos con secuencias a partir de otras proteínas, o cualquier parte de las mismas, para producir un polipéptido variante.

15 Con el objeto de expresar un polipéptido deseado, las secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido, o los equivalentes funcionales, se pueden insertar en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contenga los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia de codificación insertada. Se pueden emplear los métodos que son bien conocidos por los expertos en este campo para construir vectores de expresión que contengan secuencias que codifiquen un polipéptido de interés y los elementos de control de transcripción y de

20 traducción apropiados. Estos métodos incluyen las técnicas de ADN recombinante in vitro, las técnicas sintéticas, y la recombinación genética in vivo. Estas técnicas se describen en Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2000), y en Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology (actualizado anualmente).

Se pueden utilizar una variedad de sistemas de vector de expresión/huésped para contener y expresar las secuencias de polinucleótidos. Éstos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos, tales como bacterias

25 transformadas con vectores de expresión de ADN recombinante de bacteriófagos, plásmidos, o cósmidos; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas celulares de insectos infectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus) ; sistemas celulares de plantas transformados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus de mosaico de coliflor, CaMV; virus de mosaico de tabaco, TMV), o con vectores de expresión bacteriana (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322) ; o sistemas celulares de animales.

30 Los “elementos de control" o las "secuencias reguladoras” presentes en un vector de expresión son las regiones no traducidas del vector --potenciadores, promotores, regiones no traducidas 5’ y 3’--que interactúan con las proteínas celulares del huésped para llevar a cabo la transcripción y la traducción. Estos elementos pueden variar en su fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema del vector y del huésped utilizado, se puede utilizar cualquier número de elementos de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo,

35 cuando se clona en sistemas bacterianos, se pueden utilizar los promotores inducibles, tales como el promotor híbrido lacZ del fagémido PBLUESCRIPT (Stratagene, la Jolla, Calif.) o el plásmido PSPORT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), y similares. En los sistemas celulares de mamífero, se prefieren en general los promotores a partir de genes de mamífero o a partir de virus de mamífero. Si es necesario generar una línea celular que contenga múltiples copias de la secuencia que codifique un polipéptido, convenientemente se pueden utilizar los vectores

40 basados en SV40 o EBV con un marcador seleccionable apropiado.

En los sistemas bacterianos, se pueden seleccionar un número de vectores de expresión, dependiendo del uso pretendido para el polipéptido expresado. Por ejemplo, cuando se necesitan grandes cantidades, por ejemplo, para la inducción de anticuerpos, se pueden utilizar vectores que dirijan una expresión de alto nivel de las proteínas de fusión que se purifiquen fácilmente. Estos vectores incluyen, pero no se limitan a, los vectores multifuncionales de 45 clonación y expresión de E. coli, tales como BLUESCRIPT (Stratagene), en donde la secuencia que codifica el polipéptido de interés se puede ligar en el vector dentro del marco con las secuencias para la Met amino-terminal y los siguientes 7 residuos de ß-galactosidasa, de tal manera que se produzca una proteína híbrida; vectores pIN (Van Heeke y Schuster, J. Biol. Chem., 264: 5503-5509 (1989)) ; y similares. También se pueden utilizar los vectores pGEX (Promega, Madison, Wis.) para expresar polipéptidos extraños como las proteínas de fusión con S-transferasa

50 de glutationa (GST). En general, estas proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente para deshacerse de las células lisadas, mediante adsorción en perlas de glutationa-agarosa, seguida por elución en la presencia de glutationa libre. Las proteínas hechas en estos sistemas se pueden diseñar para incluir heparina, trombina, o sitios de disociación de proteasa del factor XA, de tal manera que se pueda liberar el polipéptido de interés clonado a partir de la fracción GST como sea deseado.

55 En la levadura, Saccharomyces cerevisiae, se pueden utilizar un número de vectores que contengan promotores constitutivos o inducibles, tales como factor alfa, oxidasa de alcohol, y PGH. Otros vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles incluyen GAP, PGK, GAL y ADH. Para las reseñas, véase Ausubel y col. (supra), y Grant y col., Methods Enzymol., 153: 516-544 (1987), y Romas y col., Yeast, 8 423-88 (1992).

En los casos en donde se utilizan vectores de expresión de plantas, la expresión de las secuencias que codifiquen 60 los polipéptidos se puede impulsar mediante cualquiera de un número de promotores. Por ejemplo, se pueden utilizar los promotores virales, tales como los promotores 35S y 19S de CaMV solos o en combinación con la secuencia líder omega a partir de TMV (Takamatsu, EMBO J. 6: 307-311 (1987)). De una manera alternativa, se pueden utilizar los promotores de plantas, tales como la subunidad pequeña de RUBISCO o los promotores de choque por calor (Coruzzi y col., EMBO J., 3: 1671-1680 (1984) ; Broglie y col., Science, 224: 838-843 (1984) ; y

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5 Winter y col., Results Probl. Cell Differ., 17: 85-105 (1991)). Estas construcciones se pueden introducir en las células de plantas mediante transformación directa del ADN o mediante transfección mediada por patógenos. Estas técnicas se describen en un número de reseñas generalmente disponibles (véase, por ejemplo, Hobbs en McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, páginas 191-196 (1992)).

También se puede utilizar un sistema de insecto para expresar un polipéptido de interés. Por ejemplo, en este

10 sistema, se utiliza el virus de polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como un vector para expresar genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. Las secuencias que codifican el polipéptido se pueden clonar en una región no esencial del virus, tal como el gen de polihedrina, y se colocan bajo el control del promotor de polihedrina. La inserción con éxito de la secuencia que codifique el polipéptido hará que se inactive el gen de polihedrina y produzca una proteína de recubrimiento que carezca del virus recombinante.

15 Entonces se pueden utilizar los virus recombinantes para infectar, por ejemplo, las células de S. frugiperda o las larvas de Trichoplusia, en donde se puede expresar el polipéptido de interés (Engelhard y col., Proc. Natl. Acad. Sci., EUA, 91: 3224-3227 (1994)).

En las células huésped de mamífero, en general hay un número de sistemas de expresión basados en virus disponibles. Por ejemplo, en los casos en donde se utiliza un adenovirus como un vector de expresión, las 20 secuencias que codifiquen un polipéptido de interés se pueden ligar en un complejo de transcripción/traducción de adenovirus que consiste en el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Se puede utilizar la inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma viral, para obtener un virus viable, el cual es capaz de expresar el polipéptido en las células huésped infectadas (Logan y Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci., EUA, 81: 3655-3659 (1984)). En adición, se pueden utilizar potenciadores de transcripción, tales como el potenciador del virus de sarcoma de Rous (RSV),

25 para aumentar la expresión en las células huésped de mamífero. Los métodos y protocolos para trabajar con vectores de adenovirus se revisan en Wold, Adenovirus Methods and Protocols, 1998. Se pueden encontrar referencias adicionales con respecto al uso de los vectores de adenovirus en Adenovirus: A Medical Dictionary, Bibliography, y Annotated Research Guide to Internet References, 2004.

También se pueden utilizar señales de inicio específicas para lograr una traducción más eficiente de las secuencias

30 que codifiquen un polipéptido de interés. Estas señales incluyen el codón de inicio de ATG y las secuencias adyacentes. En los casos en donde se inserten las secuencias que codifiquen el polipéptido, su codón de inicio, y las secuencias corriente arriba en el vector de expresión apropiado, pueden no ser necesarias las señales de control de transcripción o de traducción adicionales. Sin embargo, en los casos en donde solamente se inserte la secuencia de codificación, o una porción de la misma, se deben proporcionar señales de control de traducción exógenas,

35 incluyendo el codón de inicio de ATG. Adicionalmente, el codón de inicio debe estar en el marco de lectura correcto, con el fin de asegurar la traducción del inserto entero. Los elementos de traducción exógenos y los codones de inicio pueden ser de distintos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de la expresión se puede mejorar mediante la inclusión de potenciadores que sean apropiados para el sistema celular particular que se utilice, tal como aquéllos descritos en la literatura (Scharf. y col., Results Probl. Cell Differ., 20: 125-162 (1994)).

40 En adición, se puede seleccionar una cepa de la célula huésped por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada en la forma deseada. Estas modificaciones del polipéptido incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación, y acilación. También se puede utilizar el procesamiento posterior a la traducción, el cual disocia una forma “prepro” de la proteína para facilitar la inserción, el pliegue y/o la función correcta. Se pueden seleccionar diferentes células

45 huésped, tales como CHO, HeLa, MDCK, HEK293, y WI38, las cuales tengan la maquinaria celular específica y los mecanismos característicos para estas actividades posteriores a la traducción, con el fin de asegurar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína extraña.

Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de las proteínas recombinantes, en general se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresen establemente un polinucleótido de interés, se 50 pueden transformar utilizando vectores de expresión, los cuales pueden contener orígenes de réplica virales y/o elementos de expresión endógenos, y un gen marcador seleccionable sobre el mismo vector o sobre un vector separado. En seguida de la introducción del vector, se puede permitir que las células crezcan durante 1 a 2 días en un medio enriquecido antes de cambiarse al medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de las células que expresen con

55 éxito las secuencias introducidas. Los clones resistentes de las células establemente transformadas pueden proliferar utilizando técnicas de cultivo de tejido apropiadas para el tipo de células.

Se puede utilizar cualquier número de sistemas de selección para recuperar las líneas celulares transformadas. Éstos incluyen, pero no se limitan a, los genes de la cinasa de timidina del virus de herpes símplex (Wigler y col., Cell, 11: 223-32 (1977)), y de la fosforribosil-transferasa de adenina (Lowy y col., Cell, 22: 817-23 (1990)), los cuales 60 se pueden emplear en las células tk.sup.-o aprt.sup.-, respectivamente. También, se puede utilizar resistencia a antimetabolitos, antibióticos o herbicidas, como la base para la selección; por ejemplo, dhfr, que confiere resistencia

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al metotrexato (Wigler y col., Proc. Natl. Acad. Sci., EUA, 77: 3567-70 (1980)) ; npt, que confiere resistencia a los aminoglicósidos, a la neomicina, y al G-418 (Colbere-Garapin y col., J. Mol. Biol., 150: 1-14 (1981)) ; y als o pat, que confieren resistencia al clorosulfurón y a la acetil-transferasa de fosfinotricina, respectivamente (Murry, supra). Se han descrito genes seleccionables adicionales, por ejemplo, trpB, que permite que las células utilicen indol en lugar

5 de triptófano, o hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman y Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci., EUA, 85: 8047-51 (1988)). Recientemente, el uso de marcadores visibles ha ganado popularidad con los marcadores tales como antocianinas, ß-glucuronidasa y sus sustrato GUS, y luciferasa y su sustrato luciferina, que se utiliza ampliamente no solo para identificar los transformantes, sino también para cuantificar la cantidad de expresión de proteína transitoria o estable que se pueda atribuir a un sistema de vector específico (Rhodes y col., Methods Mol. Biol., 55: 121-131 (1995)).

Aunque la presencia/ausencia de la expresión del gen marcador sugiere que también está presente el gen de interés, puede no necesitarse confirmar su presencia y expresión. Por ejemplo, si la secuencia que codifica un polipéptido se inserta dentro de una secuencia del gen marcador, se pueden identificar las células recombinantes que contengan las secuencias, por la ausencia de la función del gen marcador. De una manera alternativa, un gen

15 marcador se puede colocar en fila con una secuencia que codifique el polipéptido bajo el control de un solo promotor. La expresión del gen marcador en respuesta a la inducción o selección, usualmente indica la expresión del gen en fila también.

De una manera alternativa, las células huésped que contienen y expresan una secuencia de polinucleótido deseada, se pueden identificar mediante una variedad de procedimientos conocidos por los expertos en este campo. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, hibridaciones de ADN-ADN o ADN-ARN, y técnicas de bioensayo de proteínas o de inmunoensayos, las cuales incluyen las tecnologías basadas en membrana, en solución, o en chip para la detección y/o cuantificación del ácido nucleico o de la proteína.

En la materia se conocen una variedad de protocolos para detectar y medir la expresión de los productos codificados por el polinucleótido, utilizando cualquiera de los anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para el

25 producto. Los ejemplos incluyen el análisis de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), y selección de células activada por fluorescencia (FACS). Para algunas aplicaciones, se puede preferir un inmunoensayo basado en anticuerpos monoclonales, de dos sitios, que utilice anticuerpos monoclonales que reaccionen con dos epítopos que no interfieran sobre un polipéptido dado, pero también se puede emplear un ensayo de enlace competitivo. Estos y otros ensayos se describen, entre otros lugares, en Hampton y col., Serological Methods, a Laboratory Manual (1990), y Maddox y col., J. Exp. Med., 158: 1211-1216 (1983).

Los expertos en la materia conocen una amplia variedad de marcas y técnicas de conjugación, y se puede utilizar en diferentes ensayos de ácidos nucleicos y de aminoácidos. Los medios para producir sondas marcadas de hibridación o de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para detectar las secuencias relacionadas con los polinucleótidos, incluyen oligomarcado, traducción de muesca, marcado de extremos, o amplificación mediante

35 reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando un nucleótido marcado. De una manera alternativa, las secuencias, o cualesquiera porciones de las mismas, se pueden clonar en un vector para la producción de una sonda de ARNm. Estos vectores son conocidos en la materia, están comercialmente disponibles, y se pueden utilizar para sintetizar sondas de ARN in vitro mediante la adición de una polimerasa de ARN apropiada, tal como T7, T3, o SP6 y los nucleótidos marcados. Estos procedimientos se pueden conducir utilizando una variedad de kits comercialmente disponibles. Las moléculas reporteras o marcas adecuadas que se pueden utilizar incluyen radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimiluminiscentes, o cromogénicos, así como sustratos, co-factores, inhibidores, partículas magnéticas, y similares.

Las células huésped transformadas con una secuencia de polinucleótido de interés se pueden cultivar bajo condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína a partir del cultivo celular. La proteína 45 producida mediante una célula recombinante se puede secretar o puede ser contenida intracelularmente, dependiendo de la secuencia y/o del vector utilizado. Como será entendido por los expertos en este campo, los vectores de expresión que contienen polinucleótidos se pueden diseñar para contener secuencias de señales que dirijan la secreción del polipéptido codificado a través de una membrana celular procariótica o eucariótica. Se pueden utilizar otras construcciones recombinantes para unir las secuencias que codifiquen un polipéptido de interés para la secuencia de nucleótidos que codifique un dominio de polipéptido que facilite la purificación de las proteínas solubles. Estos dominios que facilitan la purificación incluyen, pero no se limitan a, péptidos quelantes de metales, tales como módulos de histidina-triptófano, que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, dominios de proteína A, que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación de extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp., Seattle, Wash.). Se puede utilizar la inclusión de las 55 secuencias enlazadoras disociables, tales como aquéllas específicas para el Factor XA o la enterocinasa (Invitrogen. San Diego, Calif.) entre el dominio de purificación y el polipéptido codificado para facilitar la purificación. Uno de estos vectores de expresión proporciona la expresión de una proteína de fusión que contiene un polipéptido de interés y un ácido nucleico que codifica 6 residuos de histidina precediendo a un sitio de disociación de tiorredoxina

o de enterocinasa. Los residuos de histidina facilitan la purificación sobre IMIAC (cromatografía de afinidad de ion de metal inmovilizado), como se describe en Porath y col., Prot. Exp. Purif., 3: 263-281 (1992), mientras que el sitio de disociación de enterocinasa proporciona un medio para la purificación del polipéptido deseado a partir de la proteína de fusión. Se proporciona una discusión de los vectores que contienen las proteínas de fusión en Kroll y col., DNA Cell Biol., 12: 441-453 (1993)).

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TÉCNICAS DE SUMINISTRO DE POLINUCLEÓTIDOS IN VIVO

En las realizaciones adicionales, las construcciones genéticas que comprenden uno o más de los polinucleótidos de la invención se introducen en las células in vivo. Esto se puede lograr utilizando cualquiera de una variedad de 5 planteamientos bien conocidos, algunos de los cuales se ilustran a continuación para el propósito de ilustración.

1. ADENOVIRUS

Uno de los métodos preferidos para el suministro in vivo de una o más secuencias de ácidos nucleicos involucra el uso de un vector de expresión de adenovirus. “Vector de expresión de adenovirus” pretende incluir las construcciones que contienen secuencias de adenovirus suficientes para: (a) soportar el empaque de la

10 construcción, y (b) expresar un polinucleótido que se haya clonado en la misma en una orientación en sentido o antisentido. Desde luego, en el contexto de una construcción antisentido, la expresión no requiere que se sintetice el producto genético.

El vector de expresión comprende una forma genéticamente diseñada de un adenovirus. El conocimiento de la organización genética del adenovirus, un virus de ADN de doble cadena, lineal, de 36 kb, permite la sustitución de 15 grandes pedazos de ADN adenoviral con secuencias extrañas de hasta 7 kb (Grunhaus y Horwitz, 1992). En contraste con el retrovirus, la infección adenoviral de las células huésped no da como resultado la integración cromosómica, debido a que el ADN adenoviral puede replicarse de una manera episomal sin una genotoxicidad potencial. También, los adenovirus son estructuralmente estables, y no se ha detectado ninguna reconfiguración del genoma después de una extensa amplificación. Los adenovirus pueden infectar virtualmente todas las células

20 epiteliales independientemente de la etapa de su ciclo celular. Hasta ahora, la infección adenoviral parece estar vinculada solamente a la enfermedad leve, tal como la enfermedad respiratoria aguda en los seres humanos.

El adenovirus está en particular adecuado para utilizarse como un vector de transferencia genética, debido a su genoma de tamaño mediano, a su facilidad de manipulación, a su alta titulación, a su amplia gama de células objetivo, y a su alta infectividad. Ambos extremos del genoma viral contienen repeticiones invertidas (ITRs) de 100 a 25 200 pares de bases, que son los elementos cis necesarios para la réplica y el empaque del ADN viral. Las regiones temprana (E) y tardía (L) del genoma contienen diferentes unidades de transcripción que se dividen entre el establecimiento de la réplica del ADN viral. La región E1 (E1A y E1B) codifica las proteínas responsables de la regulación de la transcripción del genoma viral y unos cuantos genes celulares. La expresión de la región E2 (E2A y E2B) da como resultado la síntesis de las proteínas para la réplica del ADN viral. Estas proteínas están involucradas 30 en la réplica del ADN, en la expresión genética tardía, y en el cierre de la célula huésped (Renan, 1990). Los productos de los genes tardíos, incluyendo la mayoría de las proteínas de cápsida viral, se expresan solamente después de un procesamiento significativo de una sola transcripción primaria expedida por el promotor tardío mayor (MLP). El MLP, (localizado en 16,8 m.u.) es particularmente eficiente durante la fase tardía de la infección, y todos los ARNms expedidos a partir de este promotor poseen una secuencia líder tripartita-5‘ (TPL), lo cual los convierte

35 en los ARNms preferidos para la traducción.

En un sistema actual, se genera el adenovirus recombinante a partir de la recombinación homóloga entre el vector de mezcla y el vector de provirus. Debido a la posible recombinación entre dos vectores provirales, se puede generar el adenovirus de tipo silvestre a partir de este proceso. Por consiguiente, es crítico aislar un solo clon del virus a partir de una placa individual, y examinar su estructura genómica.

40 La generación y propagación de los vectores de adenovirus actuales, que son deficientes en réplica, dependen de una línea celular auxiliar única, designada como 293, la cual se transformó a partir de células de riñón embrionario humano, mediante fragmentos de ADN Ad5, y expresan constitutivamente las proteínas E1 (Graham y col., 1977). Debido a que se puede prescindir de la región E3 del genoma del adenovirus (Jones y Shenk, 1978), los vectores de adenovirus actuales, con la ayuda de las células 293, llevan el ADN extraño a cualquiera de las regiones E1, D3, o

45 ambas (Graham y Prevec, 1991). En la naturaleza, el adenovirus puede empacar aproximadamente el 105 % del genoma de tipo silvestre (Ghosh-Choudhury y col., 1987), proporcionando capacidad para aproximadamente 2 kB extra de ADN. Combinada con los aproximadamente 5,5 kB de ADN que pueden ser reemplazados en las regiones E1 y E3, la máxima capacidad del vector de adenovirus actual está por debajo de 7,5 kB, o aproximadamente el 15 % de la longitud total del vector. Más del 80 % del genoma viral del adenovirus permanece en la estructura base del

50 vector, y es la fuente de la citotoxicidad surgida del vector. También, la deficiencia en réplica del virus con la E1 suprimida es incompleta. Por ejemplo, se ha observado una fuga de expresión genética viral con los vectores actualmente disponibles en altas multiplicidades de infección (MOI) (Mulligan, 1993).

Las líneas celulares auxiliares se pueden derivar a partir de células humanas, tales como células de riñón embrionario humano, células de músculo, células hematopoyéticas, u otras células mesenquimatosas o epiteliales

55 embrionarias humanas. De una manera alternativa, Las células auxiliares se pueden derivar a partir de las células de otras especies de mamíferos que sean permisivas para el adenovirus humano. Estas células incluyen, por ejemplo, células Vero células u otras células mesenquimatosas o epiteliales embrionarias de mono. Como se menciona anteriormente, la línea celular auxiliar actualmente preferida es la 293.

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Racher y col. (1995) han dado a conocer métodos mejorados para cultivar las células 293, y para propagar el adenovirus. En un formato, se cultivan aglomerados de células naturales mediante la inoculación de las células individuales en matraces centrífugos siliconizados de 1 litro (Techne, Cambridge, Reino Unido) que contienen de 100 a 200 mililitros del medio. En seguida de la agitación a 40 revoluciones por minuto, se estima la viabilidad celular

5 con azul de tripano. En otro formato, se emplean microvehículos Fibra-Cel (Bibby Sterlin, Stone, Reino Unido) (5 gramos/litro) como sigue. Un inóculo celular, resuspendido en 5 mililitros del medio, se agrega al vehículo (50 mililitros) en un matraz Erlenmeyer de 250 mililitros, y se deja estacionario, con agitación ocasional, durante 1 a 4 horas. Entonces se reemplaza el medio con 50 mililitros de medio fresco, y se inicia la agitación. Para la producción del virus, las células se dejan crecer hasta una confluencia de aproximadamente el 80 por ciento; después de cuyo tiempo, se reemplaza el medio (hasta el 25 % del volumen final), y se agrega el adenovirus a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,05. Los cultivos se dejan estacionarios durante la noche, en seguida de lo cual, se aumenta el volumen hasta el 100 por ciento, y se comienza la agitación durante otras 72 horas.

Para algo que no sea el requerimiento de que el vector de adenovirus sea defectuoso en réplica, o al menos condicionalmente defectuoso, no se cree que la naturaleza del vector de adenovirus sea crucial para la práctica con 15 éxito de la invención. El adenovirus puede ser de cualquiera de los 42 diferentes serotipos conocidos o subgrupos A-

F. El Adenovirus tipo 5 del subgrupo C es el material de partida preferido con el fin de obtener un vector de adenovirus defectuoso en réplica condicional, para utilizarse en la presente invención, debido a que el Adenovirus tipo 5 es un adenovirus humano acerca del cual se conoce una gran cantidad de información bioquímica y genética, e históricamente se ha utilizado para la mayoría de las construcciones que emplean adenovirus como un vector.

Como se menciona anteriormente, el vector típico de acuerdo con la presente invención es defectuoso en réplica, y no tendrá la región de adenovirus E1. Por consiguiente, será más conveniente introducir el polinucleótido que codifique el gen de interés en la posición a partir de la cual se hayan removido las secuencias de codificación de E1. Sin embargo, la posición de inserción de la construcción dentro de las secuencias de adenovirus no es crítica para la invención. El polinucleótido que codifique el gen de interés también se puede insertar en lugar de la región E3

25 suprimida en los vectores de reemplazo de E3, como es descrito por Karlsson y col. (1986) o en la región E4 en donde una línea celular auxiliar o un virus auxiliar complemente el defecto de E4.

El adenovirus es fácil de cultivar y manipular, y exhibe una amplia gama de huéspedes in vitro e in vivo. Este grupo de virus se puede obtener en altas titulaciones, por ejemplo, de 109 a 1011 unidades formadoras de placas por mililitro, y son altamente inefectivos. El ciclo de vida del adenovirus no requiere de su integración en el genoma de la célula huésped. Los genes extraños suministrados por los vectores de adenovirus son episomales y, por consiguiente, tienen una baja genotoxicidad para las células huésped. No se han reportado efectos secundarios en los estudios de vacunación con adenovirus de tipo silvestre (Couch y col., 1963; Top y col., 1971), demostrando su seguridad y su potencial terapéutico como vectores de transferencia genética in vivo.

Los vectores de adenovirus se han utilizado en la expresión genética eucariótica (Levrero y col., 1991; Gomez-Foix y

35 col., 1992), y en el desarrollo de vacunas (Grunhaus y Horwitz, 1992; Graham y Prevec, 1992). Recientemente, los estudios con animales sugirieron que se podría utilizar el adenovirus recombinante para la terapia genética (Stratford-Perricaudet y Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet y col., 1990; Rich y col., 1993). Los estudios de la administración del adenovirus recombinante a diferentes tejidos incluyen instilación en la tráquea (Rosenfeld y col., 1991; Rosenfeld y col., 1992), inyección muscular (Ragot y col., 1993), inyecciones intravenosas periféricas (Herz y Gerard, 1993), e inoculación estereotáctica en el cerebro (Le Gal La Salle y col., 1993).

Los vectores de adenovirus se pueden originar a partir del adenovirus humano. De una manera alternativa, se pueden originar a partir de adenovirus de otras especies, por ejemplo, de chimpancé, el cual puede tener la ventaja de que los vectores virales no son neutralizados por los anticuerpos contra el adenovirus humano que circula en muchos sujetos humanos (véase, por ejemplo: Tatsis N y col., Gene, Therapy, 2006, 13: 421-429).

45 El Adenovirus tipo 35, el cual es relativamente poco común y, por consiguiente, existen bajos niveles de inmunidad previamente existente al vector mismo, se ha utilizado como un sistema de suministro en ciertas vacunas de tuberculosis que se están desarrollando (véase, por ejemplo, Radosevic y col., Infection and Immunity, 2007, 75(8) : 4105-4115). El Adenovirus tipo 35 también puede ser de un valor particular en la presente invención como un vector de suministro.

2. RETROVIRUS

Los retrovirus son un grupo de virus de ARN de una sola cadena caracterizados por una capacidad para convertir su ARN en ADN de cadena doble en el ADN de células infectadas mediante un proceso de transcripción inversa (Coffin, 1990). El ADN resultante se integra establemente dentro de los cromosomas celulares como un provirus y dirige la síntesis de proteínas virales. La integración da como resultado la retención de las secuencias del gen viral 55 en la célula receptora y sus descendientes. El genoma retroviral contiene tres genes, gag, pol, y env que codifican para proteínas cápsidas, enzima polimerasa, y componentes de envoltura, respectivamente. Una secuencia encontrada corriente arriba del gen gag contiene una señal para empacar el genoma dentro de viriones. Dos secuencias de repetición terminal larga (LTR) están presentes en los extremos 5’ y 3’ del genoma viral. Estas contienen secuencias de promotor fuerte y mejoradoras y también son requeridas para la integración en el genoma

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de la célula huésped (Coffin, 1990).

Con el fin de construir un vector retroviral, se inserta un ácido nucleico que codifica una o más secuencias de oligonucleótidos o polinucleótidos de interés dentro del genoma viral en el lugar de ciertas secuencias virales para producir un virus que carece de replicación. Con el fin de producir viriones, se construye una línea celular de 5 empaque que contiene los genes gag, pol y env pero sin la LTR y los componentes de empaque (Mann y col., 1983). Cuando un plásmido recombinante que contiene un ADNc, junto con la LTR retroviral y secuencias de empaque se introduce dentro de esta línea celular (mediante precipitación de fosfato de calcio por ejemplo), la secuencia de empaque permite que la transcripción de ARN del plásmido recombinante sea empacada dentro de partículas virales, que se secretan entonces en el medio de cultivo (Nicolas y Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann y col.,

10 1983). El medio que contiene el retrovirus recombinante se recolecta, opcionalmente se concentra, y se usa para transferencia de genes. Los vectores retrovirales pueden infectar una amplia variedad de tipos de células. Sin embargo, la integración y la expresión estable requieren la división de células huéspedes (Paskind y col., 1975).

Un enfoque novedoso diseñado para permitir un direccionamiento específico de vectores de retrovirus recientemente se desarrolló basado en la modificación química de un retrovirus por la adición química de residuos de lactosa a la

15 envoltura viral. Esta modificación podría permitir la infección específica de hepatocitos vía los receptores de sialoglicoproteína.

Se diseñó un enfoque diferente para dirigirse a los retrovirus recombinante en el cual se usaron anticuerpos biotinilados contra una proteína de envoltura retroviral y contra un receptor celular específico. Los anticuerpos se acoplaron vía los componentes de biotina usando estreptavidina (Roux y col., 1989). Usando anticuerpos contra los

20 antígenos clase I y clase II del complejo mayor de histocompatibilidad, ellos demostraron la infección de una variedad de células humanas que llevan esos antígenos de superficie con un virus ecotrópico in vitro (Roux y col., 1989).

3. VIRUS ADENO-ASOCIADOS

AAV (Ridgeway, 1988; Hermonat y Muzycska, 1984) es un parovirus, descubierto como una contaminación de cepas

25 adenovirales. Es un virus ubicuo (los anticuerpos están presentes en el 85 % de la población humana de los Estados Unidos de América) que no se ha relacionado con enfermedad alguna. También se clasifica como un dependovirus, porque su réplica depende de la presencia de un virus auxiliar, tal como un adenovirus. Se han aislado cinco serotipos, de los cuales el AAV-2 es el mejor caracterizado. ASV tiene un ADN lineal de una sola cadena que está encapsidado en proteínas cápsidas VP1, VP2 y VP3 para formar un virión icosahédrico de 20 a 24 nanómetros de

30 diámetro (Muzyczka y McLaughlin, 1988).

El ADN del AAV tiene una longitud aproximada de 4,7 kilobases. Contiene dos marcos de lectura abierta y está flanqueado por dos ITR. Hay dos genes mayores en el genoma AAV: rep y cap. El gen rep codifica para las proteínas responsables de las replicaciones virales, mientras que el cap codifica para la proteína cápsida VP1-3. Cada ITR forma una estructura de pasador de pelo en forma de T. Estas repeticiones terminales son los únicos

35 componentes cis esenciales del AAV para la integración cromosómica. Por lo tanto, el AAV se puede usar como un vector con todas las secuencias de codificación viral removidas y remplazadas por casetes de genes para el suministro. Se han identificado tres promotores virales identificados y nombrados p5, p19, y p40, de acuerdo con su posición en el mapa. La transcripción de p5 y p19 da como resultado la producción de proteínas rep, y la transcripción de p40 produce las proteínas cápsidas (Hermonat y Muzyczka, 1984).

40 Hay varios factores que estimulan a los investigadores a estudiar la posibilidad de usar rAAV como un vector de expresión. Uno es que los requerimientos para entregar un gen para integrarlo en el cromosoma huésped son sorprendentemente pocos. Es necesario tener los ITRx de 145 pares de bases, que son solamente el 6 % del genoma de AAV. Esto deja espacio en el vector para armar una inserción de ADN de 4,5 kilobases. Aunque esta capacidad para acarreo puede evitar que el AAV suministre genes grandes, es ampliamente adecuada para

45 suministrar construcciones antisentido.

El AAV también es una buena elección de vehículos de suministro debido a su seguridad. Hay un mecanismo relativamente complicado de rescate: no solamente el adenovirus del tipo natural, sino también los genes del AAV se requieren para movilizar el rAAV. Igualmente, el AAV no es patógeno y no se asocia con enfermedad alguna. La remoción de las secuencias de codificación virales minimiza las reacciones inmunes a la expresión de genes virales,

50 y por lo tanto, rAAV no evoca una respuesta inflamatoria.

AAV también es una buena elección de vehículos de suministro debido a su seguridad. Hay un mecanismo de rescate relativamente complicado: no solamente el adenovirus del tipo natural sino también los genes de AAV se requieren para movilizar el rAAV. Igualmente, AAV no es patógeno y no está asociado con enfermedad alguna. La remoción de las secuencias de codificación viral minimiza las reacciones inmunes a la expresión de gen viral, y por

55 lo tanto, rAAV no evoca una respuesta inflamatoria.

4. OTROS VECTORES VIRALES COMO CONSTRUCCIONES DE EXPRESIÓN

Se pueden emplear otros vectores virales como construcciones de expresión en la presente invención para la suministro de secuencias de oligonucleótidos o polinucleótidos a una célula huésped. Se pueden emplear vectores derivados de virus tales como el virus de vacuna (Ridgeway, 1988; Coupar y col., 1988), lentivirus, virus de polio y virus de herpes. También se puede esperar que sean útiles otros vectores derivados de virus de viruelas, tales como los vectores derivados de viruela aviaria. Ellos ofrecen varias características atractivas para distintas células de

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5 mamíferos (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Coupar y col., 1988; Horwich y col., 1990).

Con el reciente reconocimiento del virus de hepatitis B defectuoso, se ha obtenido nuevo conocimiento de la relación estructura-función de diferentes secuencias virales. Los estudios in vitro mostraron que el virus puede retener la capacidad para empaque dependiente de auxiliar y a pesar de la transcripción inversa la eliminación de hasta el 80 % de su genoma (Horwich y col., 1990). Esto sugirió que grandes porciones del genoma podrían ser remplazadas 10 con material genético extraño. El hepatotropismo y la persistencia (integración) fueron propiedades particularmente atractivas para la transferencia de genes dirigida por hígado. Chang y col. (1991) introdujeron el gen de cloranfenicol acetil-transferasa (CAT) en el genoma de virus de hepatitis B de pato en lugar de las secuencias de codificación de superficie y pre-superficie que codifican la polimerasa. Fue co-transfectado con virus del tipo natural dentro de una línea celular de hepatoma aviario. Se usaron medios de cultivo que contenían altas titulaciones del virus

15 recombinante para infectar hepatocitos primarios de pato. Se detectó una expresión de gen CAT estable durante al menos 24 días después de la transfección (Chang y col., 1991).

Los vectores ‘virales’ adicionales incluyen partículas que parecen virus (VLPs) y fagos.

5. VECTORES NO VIRALES

Para efectuar la expresión de las secuencias de oligonucleótidos o polinucleótidos de la presente invención, la

20 construcción de expresión debe ser suministrada dentro de una célula. Esta entrega puede llevarse a cabo in vitro, como en procedimientos de laboratorio para transformar líneas celulares, o in vivo o ex vivo, como en el tratamiento de ciertos estados de enfermedad. Como se describe anteriormente, un mecanismo preferido para la entrega es vía infección viral donde la construcción de expresión se encapsula en una partícula viral infecciosa.

En cuanto la construcción de expresión ha sido entregada en la célula el ácido nucleico que codifica las secuencias

25 deseadas de oligonucleótidos o polinucleótidos se puede posicionar y expresar en diferentes sitios. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico que codifica la construcción puede integrarse de manera estable en el genoma de la célula. Esta integración puede ser en el lugar y orientación específicos vía la recombinación homóloga (reemplazo de genes) o puede integrarse en un lugar aleatorio, no específico (aumento de gen). En todavía otras realizaciones, el ácido nucleico se puede mantener establemente en la célula como un segmento episomal, separado de ADN.

30 Estos segmentos de ácido nucleico o “episomas” codifican secuencias suficientes para permitir el mantenimiento y la replicación independientes de o en sincronización con el ciclo de la célula huésped. De qué manera se entrega la construcción de expresión a una célula y dónde en la célula permanece el ácido nucleico depende del tipo de construcción de expresión empleado.

En ciertas realizaciones de la invención, la construcción de la expresión que comprende una o más secuencias de

35 oligonucleótidos o polinucleótidos simplemente puede consistir en plásmidos o ADN recombinante no protegido. Se puede realizar la transferencia de una construcción, por ejemplo, por cualquier método que físicamente o químicamente permeabilice la membrana celular. Esto es particularmente aplicable para la transferencia in vitro pero se puede aplicar al uso in vivo también. Dubensky y col. (1984) inyectaron con éxito ADN de poliomavirus en forma de precipitados de fosfato de calcio en el hígado y bazo de ratones adultos y recién nacidos demostrando la

40 replicación viral activa y la infección aguda. Benvenisty y Reshef (1986) también demostraron que la inyección intraperitoneal directa de plásmidos precipitados de fosfato de calcio da como resultado la expresión de los genes transfectados. Se anticipa que ADN que codifica un gen de interés también se puede transferir de manera similar en vivo y expresar el producto del gen.

Otra realización de la invención para transferir una construcción de expresión de ADN no protegido (naked) puede

45 incluir bombardeo de partículas. Este método depende de la capacidad para acelerar microproyectiles recubiertos de ADN a una alta velocidad permitiéndoles perforar membranas celulares y entrar a las células sin matarlas (Klein y col., 1987). Se han desarrollado varios dispositivos para acelerar partículas pequeñas. Uno de estos dispositivos depende de una descarga de alto voltaje para generar una corriente eléctrica, la cual a su vez proporciona la fuerza motriz (Yang y col., 1990). Los microproyectiles usados han consistido de sustancias biológicamente inertes tales

50 como tungsteno o perlas de oro.

Los órganos seleccionados que incluyen el hígado, piel y tejido muscular de ratas y ratones se han bombardeado en vivo (Yang y col., 1990; Zelenin y col., 1991). Esto puede requerir exposición quirúrgica del tejido o las células, para eliminar cualquier tejido que interviene entre el cañón y el órgano objetivo, es decir, tratamiento ex vivo. De nuevo, el ADN que codifica un gen particular se puede suministrar vía este método y todavía ser incorporado.

55 También se pueden usar bacterias como un método de suministro (por ejemplo listeria, véase WO2004/11048) y en particular BCG.

COMPOSICIONES POLIPEPTÍDICAS

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Se pueden preparar los polipéptidos usando cualquier variedad de técnicas muy conocidas. Los polipéptidos recombinantes codificados por secuencias de ADN como se describe anteriormente se pueden preparar usando cualquiera de una variedad de vectores de expresión conocidos para los expertos en la técnica. Se puede lograr la expresión en cualquier célula huésped que ha sido transformada o transfectada con un vector de expresión que

5 contiene una molécula que codifica un polipéptido recombinante. Los células huéspedes adecuadas incluyen procariotas, levaduras y células eucariotas superiores, tales como células de mamíferos y células vegetales. De preferencia, las células huéspedes empleadas son E. coli, levaduras o una línea celular de mamífero tal como COS o CHO. Los sobrenadantes de sistemas adecuados de huésped/vector que secretan proteína recombinante o polipéptido en medio de cultivo pueden concentrarse primero usando un filtro comercialmente disponible. Después de la concentración, se puede aplicar el concentrado a una matriz de purificación adecuada, tal como una matriz de afinidad o una resina de intercambio de iones. Finalmente, se puede emplear uno o más etapas de HPLC de fase inversa para purificar adicionalmente un polipéptido recombinante.

También se pueden generar polipéptidos más cortos mediante medios sintéticos, usando técnicas muy conocidas para los expertos en la técnica. Por ejemplo, estos polipéptidos se pueden sintetizar usando cualquier técnica de

15 fase sólida disponible comercialmente, tales como el método de síntesis de fase sólida de Merrifield, donde los aminoácidos se añaden secuencialmente a una cadena de aminoácidos creciente. Véase Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2146 (1963). El equipo para la síntesis automatizada de polipéptidos está comercialmente disponible de proveedores como Perkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster City, CA), y se pueden operar de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Dentro de ciertas realizaciones específicas, un polipéptido puede ser una proteína de fusión que comprende múltiples proteínas modificadas Rv3616c como se describe en la presente, o que comprende al menos una proteína Rv3616c modificada como se describe en la presente y una secuencia no relacionada tal como las descritas en (i) a

(xvi) y (a) a (g) en lo anterior.

Un asociado de fusión, por ejemplo, ayuda a proporcionar epítopos auxiliares T (un asociado de fusión

25 inmunológica), de preferencia epítopos auxiliares T reconocidos por humanos, o puede ayudar a expresar la proteína (un realzador de expresión) a rendimientos superiores que la proteína recombinante natural. Ciertos asociados de fusión preferidos son asociados de fusión tanto inmunológicos como realzadores de la expresión. Otros asociados de fusión se pueden seleccionar para aumentar la solubilidad de la proteína o para permitir que la proteína sea destinada a los compartimientos intracelulares deseados. Todavía otros asociados de fusión incluyen marcadores de afinidad, que facilitan la purificación de la proteína.

Las proteínas de fusión generalmente se pueden preparar usando técnicas estándar, incluyendo conjugación química. De preferencia, una proteína de fusión se expresa como una proteína recombinante, permitiendo la producción de niveles aumentados, relativos a una proteína no fusionada, en un sistema de expresión. En resumen, las secuencias de ADN que codifican los componentes del polipéptido se pueden ensamblar por separado y ligarse

35 a un vector de expresión apropiado. El extremo 3’ de la secuencia de ADN que codifica un componente de polipéptido se liga, con o sin un enlazador péptido, al extremo 5’ de una secuencia de ADN que codifica el segundo componente de polipéptido de manera que los cuadros de lectura de las secuencias están en fase. Esto permite la traducción en una sola proteína de fusión que retiene la actividad biológica en ambos polipéptidos componentes.

Se puede emplear una secuencia de enlazador de péptido para separar los asociados de la fusión por una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliegue en sus estructuras secundarias y terciarias. Esta secuencia de enlazador de péptido se incorpora dentro de la proteína de fusión usando técnicas estándares muy conocidas en la técnica. Se pueden elegir secuencias de enlazadores de péptidos adecuadas basándose en los siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que pudiera interactuar con epítopos funcionales en el primero y el segundo polipéptidos; y (3)

45 la falta de residuos hidrofóbicos o cargados que podrían reaccionar con los epítopos funcionales de polipéptidos. Las secuencias de enlazador de péptidos preferidas contienen residuos Gly, Asn y Ser. Otros aminoácidos neutros, tales como Thr y Ala se pueden usar también en la secuencia enlazadora. Las secuencias de aminoácidos que se pueden emplear de manera útil como enlazadores incluyen las dadas a conocer en Maratea y col., Gene 40: 39-46 (1985) ; Murphy y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8258-8262 (1986) ; Patente de Estados Unidos 4,935,233 y Patente de Estados Unidos 4,751,180. No se requieren secuencias enlazadoras cuando el primero y el segundo polipéptidos no tienen regiones amino N-terminales no esenciales que se puedan usar para separar los dominios funcionales y evitar la interferencia estérica.

Dentro de las realizaciones preferidas, un asociado de fusión inmunológica se deriva a partir de la proteína D, una proteína de superficie de la bacteria gram-negativa Haemophilus influenza B (WO 91/18926). De preferencia, un 55 derivado de proteína D comprende aproximadamente el primer tercio de la proteína (por ejemplo, los primeros 100110 aminoácidos de la terminal N), y un derivado de la proteína D puede ser lipidado. Dentro de ciertas realizaciones preferidas, los primeros 109 residuos de un asociado de fusión de la lipoproteína D se incluye en el término N para proporcionar al polipéptido epítopos de células T exógenos adicionales y para aumentar el nivel de la expresión en

E. coli (funcionando de este modo como un realzador de la expresión). La cola de lípido asegura la presentación óptima de las células que presentan antígeno a antígeno. Otros asociados de fusión incluyen la proteína no estructural del virus de influenza, NS1 (hemaglutinina). Típicamente, se usan los 81 aminoácidos N-terminales,

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aunque se pueden usar diferentes fragmentos que incluyen epítopos del auxiliar T.

En otra realización, el asociado de la fusión inmunológica es la proteína conocida como LYTA, o una porción de la misma (de preferencia una porción de la terminal C). LYTA se deriva a partir de Streptococcus pneumoniae, que sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa conocida como amidasa de LYTA (codificada por el gen LytA; Gene 43: 5 265-292 (1986)). LYTA es una autolisina que específicamente degrada ciertos enlaces en la estructura central del peptidoglicano. El dominio de terminal C de la proteína LYTA es responsable de la afinidad a la colina o a algunos análogos de colina tales como DEAE. Esta propiedad ha sido explotada para el desarrollo de plásmidos que expresan C-LYTA de E. coli útiles para la expresión de las proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento de C-LYTA en el término amino (véase Biotechnology 10: 795-798

10 (1992)). Dentro de una realización preferida, una porción de repetición de LYTA se puede incorporar a una proteína de fusión. Una porción de repetición se encuentra en la región terminal C comenzando en el residuo 178. Una porción de repetición preferida incorpora los residuos 188-305.

COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS

En las realizaciones adicionales, el polinucleótido o las composiciones de polinucleótidos dadas a conocer en la

15 presente, se pueden formular en soluciones farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables para su administración a una célula o a un animal, ya sea solos, o en combinación con una u otras realizaciones de terapia. Las composiciones se pueden presentar en forma de polvo (por ejemplo, secadas por congelación) para la reconstitución poco antes del uso, y estas composiciones secas generalmente son más estables durante el almacenamiento.

20 Las composiciones farmacéuticas pueden comprender una proteína de fusión o un polinucleótido que codifica una proteína de fusión, en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Queda entendido también que, si se desea, el segmento de ácido nucleico (por ejemplo ARN o ADN) que expresa un polipéptido como se describe en la presente se puede administrar en combinación con otros agentes también, tales como, por ejemplo otras proteínas o polipéptidos o varios agentes farmacéuticamente activos, incluyendo 25 agentes quimioterapéuticos contra la infección por M. tuberculosis. De hecho, virtualmente no hay límite a otros componentes que también se pueden incluir, dado que los agentes adicionales no causan un efecto adverso significativo al contacto con las células o tejidos huéspedes. Las composiciones así pueden ser suministradas junto con otros varios agentes como se requiera en el caso particular. Estas composiciones se pueden purificar de células huéspedes u otras fuentes biológicas, o alternativamente se pueden sintetizar químicamente como se describe en la

30 presente. Igualmente, estas composiciones además pueden comprender composiciones derivadas de ARN o ADN.

La formulación de soluciones excipientes y vehículo farmacéuticamente aceptables es muy conocida para los expertos en la técnica, como lo es el desarrollo de dosis y regímenes de tratamiento adecuados para el uso de las composiciones particulares descritas en la presente en una variedad de regímenes de tratamiento, incluyendo por ejemplo, la administración y formulación oral, parenteral, intravenoso, intranasal, e intramuscular. Otras vías de

35 administración incluyen vía las superficies de las mucosas.

Típicamente, las formulaciones que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva suministran aproximadamente 0,01 microgramo hasta aproximadamente 1000 microgramos de polipéptido de Rv3616c modificado por administración, más típicamente aproximadamente 0,1 microgramo hasta aproximadamente 100 microgramos de polipéptido por administración (por ejemplo de 0,5 a 50 microgramos). Con respecto a las

40 composiciones de polinucleótidos, estas típicamente suministran aproximadamente 10 microgramos hasta aproximadamente 20 miligramos del polinucleótido de la invención por administración, más típicamente aproximadamente de 0,1 miligramo hasta aproximadamente 10 miligramos del polinucleótido de la invención por administración.

Naturalmente, la cantidad de compuesto(s) activo(s) en cada composición terapéuticamente útil puede prepararse

45 de una manera que se obtendrá una dosis adecuada en cualquier dosis unitaria dada del compuesto. Los factores como la solubilidad, biodisponibilidad, vida media biológica, vía de administración, vida en el estante del producto, así como otras consideraciones farmacológicas serán contempladas por un experto en la técnica de preparar estas formulaciones farmacéuticas, y como tal, puede ser deseable una variedad de dosificaciones y regímenes de tratamiento.

50 1. ADMINISTRACIÓN ORAL

En ciertas aplicaciones, las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en la presente se pueden administrar por vía oral a un animal. Como tal, estas composiciones se pueden formular con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o pueden incluirse en cápsulas de gelatina de corteza dura o blanda, o pueden comprimirse en tabletas, o pueden incorporarse directamente con la comida de la dieta.

55 Los compuestos activos se pueden incorporar con excipientes y ser usados en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes obleas, y similares (Mathiowitz y col., 1997; Hwang y col., 1998; Patente de Estados Unidos 5,641,515; Patente de Estados Unidos 5,580,579 y Patente de Estados Unidos 5,792,451, cada una específicamente incorporada en la presente mediante referencia por entero). Las tabletas, trociscos, píldoras, cápsulas y similares también pueden contener lo siguiente: un aglutinante, como goma de tragacanto, acacia, almidón de maíz, o gelatina; excipientes, tales como di-fosfato de calcio; un agente desintegrante, tal como almidón de maíz, almidón de papa, ácido algínico y similares; un lubricante, tal como

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5 estearato de magnesio; y un agente edulcorante, tal como sacarosa, lactosa o sacarina se puede añadir o un agente saborizante, tal como menta, aceite de gaulteria o cereza. Cuando la unidad forma de dosis unitaria es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un vehículo líquido. Otros distintos materiales pueden estar presentes como recubrimientos o para modificar de otra manera la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, las tabletas, píldoras o cápsulas se pueden recubrir con goma laca, azúcar o ambas. Un jarabe o elíxir puede contener el compuesto activo, sacarosa como un agente edulcorante, metil-y propil-parabenos como conservadores, un tinte y saborizante, tal como sabor a cereza o a naranja. Desde luego, cualquier material usado para preparar cualquier forma de dosis unitaria deberá ser farmacéuticamente pura y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, los compuestos activos se pueden incorporar en preparaciones y formulaciones de liberación sostenida.

15 Para la administración oral las composiciones de la presente invención se pueden incorporar alternativamente con uno o más excipientes de administración en formulación administrada oralmente o sublingualmente en forma de un enjuague bucal, dentífrico, tableta bucal, aspersor oral. Por ejemplo, se puede preparar un enjuague bucal incorporando el ingrediente activo en la cantidad adecuada en un solvente apropiado, tal como solución de borato de sodio (Solución de Dobell). Alternativamente, el ingrediente activo puede incorporarse en una solución oral tal como una que contenga borato de sodio, glicerina y bicarbonato de potasio, o disperso en un dentífrico, o añadido en un cantidad terapéuticamente efectiva a una composición que puede incluir agua, aglutinantes, abrasivos, agentes saborizantes, agentes formadores de espuma y humectantes. Alternativamente las composiciones se pueden modelar en una forma de tableta o solución que se pueda colocar bajo la lengua o disolverse de otro modo en la boca.

25 2. ADMINISTRACIÓN INYECTABLE

En general puede ser deseable suministrar las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en la presente por vía parenteral, intravenosa, intramuscular, intradérmica, o hasta intraperitoneal. como se describe en la patente de Estados Unidos 5.543.158; patente de Estados Unidos 5.641.515 y patente de Estados Unidos 5.399.363.

Las soluciones de los compuestos activos son de bases libres o sales farmacológicamente aceptables se pueden preparar en agua convenientemente mezclada con un tensoactivo, tal como hidroxi-propil-celulosa. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, glicoles de polietileno líquido, y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservador para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas o dispersiones estériles y

35 polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables (Patente de Estados Unidos 5,466,468, específicamente incorporada en la presente mediante referencia por entero).

En todos los casos la forma debe ser estéril y debe ser fluida al grado que fácilmente exista la posibilidad de usar una jeringa. Debe ser estable bajo condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de los microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un solvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y/o aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensoactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede facilitar por varios agentes antibacterianos y anti hongos, por ejemplo, parabenos,

45 clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, puede ser preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede producir mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasen la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución deberá ser convenientemente regulada, si es necesario, y el diluyente líquido primero volverse isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. En conexión a esto, un medio acuoso estéril que se pueda emplear será conocido por los expertos en la técnica a la luz de la presente divulgación. Por ejemplo, una dosis se puede disolver en 1 mililitro de solución de NaCl isotónica y ya sea añadirla a 1000 mililitros de fluido hipodermoclisis o inyectarla en

55 el sitio propuesto de infusión (ver, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 15ª Edición, páginas 10351038 y 1570-1580). Alguna variación en dosificación necesariamente ocurrirá dependiendo de la condición del sujeto que está siendo tratado. La persona responsable de la administración, en cualquier caso, determinará la dosis apropiada para el sujeto individual. Más aún, para la administración humana, las preparaciones deberán satisfacer la esterilidad, pirogenicidad, y las normas generales de seguridad y pureza requeridas por las normas de la Oficina de Productos Biológicos de la Administración de Alimentos y Fármacos (FDA) de los Estados Unidos de América.

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Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el solvente apropiado con varios de los demás ingredientes enumerados anteriormente, como se requiera, seguido por esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los distintos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos

5 de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son las técnicas de secado al vacío y secado congelado que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente estéril por filtración del mismo.

Las composiciones dadas a conocer en la presente se pueden formular en una forma neutra o de sal. Las sales

10 farmacéuticamente aceptables, incluyen las sales de adición ácida (formadas con los grupos amono libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como el ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de las bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, de potasio, de amonio, de calcio, o férrico, y bases orgánicas como isopropil-amina, trimetil-amina, histidina, procaína y

15 similares. Después de la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosis y en tal cantidad como sea terapéuticamente efectiva. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosis tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármacos y similares.

Como se usa en el presente documento, “vehículo” incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicas, agentes isotónicos y retardantes de la

20 absorción, reguladores, soluciones vehículo, suspensiones, coloides y similares. El uso de estos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es muy conocido en la técnica. Siempre y cuando algún medio o agente sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar ingredientes activos suplementarios en las composiciones.

La frase “farmacéuticamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una

25 reacción alérgica o adversa similar cuando se administra a un humano. La preparación de una composición acuosa que contiene una proteína como un ingrediente activo es muy conocida en la técnica. Típicamente, estas composiciones se preparan como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, líquido antes de una inyección. La preparación también se puede emulsionar.

30 3. ADMINISTRACIÓN NASAL Y BUCAL

En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar mediante aspersores intranasales, aspersores bucales, inhalación, y/u otros vehículos de administración en aerosol. Los métodos para suministrar composiciones de genes, ácidos nucleicos, y péptidos directamente a los pulmones por ejemplo vía aspersores en aerosol nasal y bucal se han descrito, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos 5,756,353 y Patente de Estados

35 Unidos 5,804,212.

Igualmente, la administración de fármacos usando resinas de micropartículas intranasales (Takenaga y col., 1998) y compuestos de lisofosfatidil-glicerol (patente de Estados Unidos 5.725.871, específicamente incorporada en la presente mediante referencia por entero) también son muy conocidos en la técnica farmacéutica. Asimismo, la administración de fármacos transmucosales en forma de una matriz de soporte de poli-tetrafluoro-etileno se describe

40 en la Patente de Estados Unidos 5,780,045 (específicamente incorporada en la presente mediante referencia por entero).

4. ADMINISTRACIÓN MEDIADA POR LIPOSOMAS, NANOCÁPSULAS, Y MICROPARTÍCULAS

En ciertas realizaciones, los inventores contemplan el uso de liposomas, nanocápsulas, micropartículas, micro esferas, partículas de lípidos, vesículas y similares para la introducción de las composiciones de la presente 45 invención en células huéspedes adecuadas. en particular, las composiciones de la presente invención se pueden formular para su administración encapsuladas en una partícula de lípido, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera,

o una nanopartícula o similar.

Estas formulaciones se pueden preferir para la introducción de formulaciones farmacéuticamente aceptables de los ácidos nucleicos o construcciones descritos en la presente. La formación y el uso de liposomas es conocido 50 generalmente para los expertos en la técnica (véase por ejemplo, Couvreur y col., 1977; Couvreur, 1988; Lasic, 1998; que describe el uso de liposomas y nanocápsulas de la terapia de antibiótico dirigida para infecciones y enfermedades bacterianas intracelulares). Recientemente, se descubrieron liposomas con estabilidad en suero y medios tiempos de circulación mejorados (Gabizon y Papahadjopoulos, 1988; Allen y Choun, 1987; Patente de Estados Unidos 5,741,516, específicamente incorporada en la presente mediante referencia por entero). Además, 55 han sido revisados varios métodos de liposomas y preparaciones parecidas a liposomas como vehículos potenciales de fármacos (Takakura, 1998; Chandran y col., 1997; Margalit, 1995; Patente de Estados Unidos 5,567,434; Patente de Estados Unidos 5,552,157; Patente de Estados Unidos 5,565,213; Patente de Estados Unidos 5,738,868 y Patente de Estados Unidos 5,795,587, cada una específicamente incorporada en la presente mediante referencia

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por entero).

Los liposomas se han usado con éxito con muchos tipos de células que normalmente son resistentes a la transfección mediante otros procedimientos que incluyen suspensiones con células T, cultivos de hepatocitos primarios y células PC 12 (Renneisen y col., 1990; Muller y col., 1990). En adición, los liposomas están libres de 5 restricciones en la longitud de ADN que son típicas de los sistemas de administración basado en virus. Los liposomas se han usado con efectividad para introducir genes, fármacos (Heath y Martin, 1986; Heath y col., 1986; Balazsovits y col., 1989; Fresta y Puglisi, 1996), agentes radioterapéuticos (Pikul y col., 1987), enzimas (Imaizumi y col., 1990a; Imaizumi y col., 1990b), virus (Faller y Baltimore, 1984), factores de la transcripción y efectores aloestéricos (Nicolau y Gersonde, 1979) en una variedad de líneas celulares cultivadas y animales. En adición,

10 varios ensayos clínicos exitosos que examinaron la efectividad de la administración de fármacos mediados por liposomas se han completado (Lopez-Berestein y col., 1985a; 1985b; Coune, 1988; Sculier y col., 1988). Además, varios estudios sugieren que el uso de liposomas no se asocia con las respuestas autoinmunes, la toxicidad o localización gonadal después de la administración sistémica (Mori y Fukatsu, 1992).

Los liposomas se forman de fosfolípidos que están dispersos en un medio acuoso y espontáneamente forman

15 vesículas bicapa concéntricas multilamelar (también denominadas vesículas multilamelares (MLVs). Las vesículas multilamelares generalmente tienen diámetros de 25 nanómetros a 4 micras. La sonicación de las vesículas multilamelares da como resultado la formación de pequeñas vesículas unilamelares (SUVs) con diámetros en el intervalo de variación de 200 a 500 Å, que contienen una solución acuosa en el núcleo.

Los liposomas se parecen a las membranas celulares y se contemplan para su uso en relación con la presente

20 invención como vehículos para las composiciones de péptidos. Son ampliamente adecuados como sustancias solubles tanto en agua como en lípidos pueden ser atrapadas, es decir, en los espacios acuosos y dentro de la bicapa misma, respectivamente. Es posible que los liposomas que llevan fármacos aún puedan emplearse para administración específica al sitio o agentes activos modificando selectivamente la formulación liposomal.

Además de las enseñanzas de Couvreur y col. (1977; 1988), se puede utilizar la siguiente información para generar

25 formulaciones liposomales. Los fosfolípidos pueden formar una variedad de estructuras distintas de los liposomas cuando se dispersan en agua, dependiendo de la razón molar del lípido contra el agua. A razones bajas el liposoma es la estructura preferida. Las características físicas de los liposomas dependen en el pH, la fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes. Los liposomas pueden mostrar baja permeabilidad a las sustancias iónicas y polares, pero a temperaturas elevadas sufren una transición de fases que altera marcadamente su permeabilidad.

30 La transición de fases involucra un cambio de una estructura ordenada, estrechamente empaquetada, conocida como estado de gel, a una estructura menos ordenada, empaquetada sin apretar, conocida como el estado fluido. Esto ocurre a una temperatura de transición de fases característica y da como resultado un aumento en la permeabilidad a iones, azúcares y fármacos.

En adición a la temperatura, la exposición a las proteínas puede alterar la permeabilidad de los liposomas. Ciertas

35 proteínas solubles, tales como el citocromo c, enlazan, deforman y penetran la bicapa, causando mediante esto cambios en la permeabilidad. El colesterol inhibe esta penetración de proteínas, evidentemente empaquetando los fosfolípidos más estrechamente. Esto se interpreta como que las formaciones de liposomas más útiles para la administración de antibiótico e inhibidor contendrán colesterol.

La capacidad para atrapar solutos varía entre diferentes tipos de liposomas. Por ejemplo las vesículas

40 multilamelares son moderadamente atrapando solutos, pero las vesículas unilamelares pequeñas son extremadamente ineficientes. Las vesículas unilamelares pequeñas ofrecen la ventaja de homogeneidad y reproducibilidad en distribución de tamaño, sin embargo, y un compromiso ente la eficiencia de atrapado y tamaño es ofrecido por las vesículas unilamelares grandes (LUVs). Estas se preparan por la evaporación de éter y son de tres a cuatro veces más eficientes en atrapar solutos que las vesículas multilamelares.

45 En adición a las características de los liposomas, un determinante importante para atrapar compuestos es las propiedades fisicoquímicas del mismo compuesto. Los compuestos polares son atrapados en espacios acuosos y los compuestos no polares se enlazan a la bicapa de lípido de la vesícula. Los compuestos polares son atrapados en los espacios acuosos y los compuestos no polares se enlazan a la bicapa de lípido de la vesícula. Los compuestos polares son liberados a través de la permeación o cuando se rompe la bicapa, pero los compuestos no

50 polares permanecen afiliados con la bicapa a menos que se desorganice por la temperatura o exposición a lipoproteínas. Ambos tipos muestran las tasas de eflujo máximas a la temperatura de transición de fases.

Los liposomas interactúan con las células por medio de cuatro mecanismos diferentes: endocitosis por células fagocíticas del sistema retículo endotelial tales como macrófagos y neutrófilos; adsorción a la superficie celular, ya sea por fuerzas electrostáticas o hidrofóbicas débiles no específicas, o por interacciones específicas con

55 componentes en la superficie celular; la fusión con la membrana celular de plasma por inserción de la bicapa de lípido del liposoma en la membrana de plasma, con liberación simultánea de contenido liposomal dentro del citoplasma; y por transferencia de lípidos liposomales a las membranas celular o subcelular, o viceversa, sin asociación alguna del contenido del liposoma. Frecuentemente es difícil determinar cuál mecanismo es operativo y más de uno puede operar al mismo tiempo.

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El destino y disposición de los liposomas inyectados intravenosamente dependen de sus propiedades físicas, tales como tamaño, fluidez y carga de superficie. Pueden persistir en tejidos por horas o días, dependiendo de su composición, y sus vidas medias en la sangre varían de minutos a varias horas. Los liposomas más grandes, tales como las vesículas multilamelares y las vesículas unilamelares grandes, se absorber rápidamente por las células

5 fagocíticas del sistema retículo-endotelial, pero la fisiología del sistema circulatorio restringe la salida de estas especies grandes en la mayoría de los sitios. Pueden salir solamente en lugares donde existen grandes aberturas o poros en el endotelio apilar, tal como las sinusoides del hígado o bazo. Así, estos órganos son el sitio predominante de absorción. Por otro lado, las vesículas unilamelares pequeñas muestran una distribución de tejido más amplia, pero todavía quedan secuestradas en gran medida en el hígado y bazo. En general, este comportamiento en vivo limita el destino potencial de los liposomas solamente a esos órganos y tejidos accesibles a su tamaño grande. Estos incluyen la sangre, el hígado, el bazo, la médula ósea y los órganos linfoides.

La focalización generalmente no es una limitación en términos de la presente invención. Sin embargo, si se desea focalización específica, hay métodos disponibles para que esto se lleve a cabo. Los anticuerpos se pueden usar para enlazar la superficie del liposoma y dirigir el anticuerpo y su contenido de fármaco a los receptores antigénicos

15 específicos en una superficie de tipo de célula particular. Los determinantes de carbohidratos (los componentes en la superficie celular de glicoproteínas o glicolípidos que representan un papel en el reconocimiento, interacción y adhesión de célula a célula) pueden ser usados como sitios de reconocimiento ya que tienen el potencial para dirigir los liposomas a tipos de células particulares. En su mayor parte, se contempla que se usaría la inyección intravenosa de las preparaciones liposomales, pero otras vías de administración también son concebibles.

Alternativamente, la invención proporciona formulaciones de nanocápsulas farmacéuticamente aceptables de las composiciones de la presente invención. Las nanocápsulas generalmente pueden atrapar compuestos de una manera estable y reproducible (Henry-Michelland y col., 1987; Quintanar-Guerrero y col., 1998; Douglas y col., 1987). Para evitar los efectos secundarios debidos a la sobrecarga polimérica intracelular, estas partículas ultrafinas (de un tamaño aproximado de 0,1 m) deberán diseñarse usando polímeros capaces de ser degradados en vivo.

25 Las nanopartículas de cianoacrilato de polialquilo biodegradables que satisfacen estos requerimientos se contemplan para su uso en la presente invención. Estas partículas se pueden hacer fácilmente, como se describe en (Couvreur y col., 1980; 1988; zur Muhlen y col., 1998; Zambaux y col. 1998; Pinto-Alphandry y col., 1995 y Patente de Estados Unidos 5,145,684, específicamente incorporadas en la presente mediante referencia por entero).

También se pueden usar parches dérmicos para la administración transcutánea.

COMPOSICIONES INmunogÉnicAS

En ciertas realizaciones de la presente invención, se proporcionan composiciones inmunogénicas. Las composiciones inmunogénicas comprenderán una o más secuencias de la Rv3616c modificadas (polipéptidos o polinucleótidos) como los comentados anteriormente, en combinación con un inmunoestimulante.

Las composiciones inmunogénicas también pueden comprender una proteína de fusión o un polinucleótido que 35 codifica una proteína de fusión, en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Un inmunoestimulante puede ser cualquier sustancia que aumenta o potencia una respuesta inmunitaria (anticuerpo y/o mediado pro célula) a un antígeno exógeno. Los ejemplos de los inmuno-estimulantes incluyen a los adyuvantes.

La preparación de composiciones inmunogénicas generalmente se describe en, por ejemplo, Powell y Newman, Editores, Vaccine Design (en enfoque de subunidad y adyuvante) (1995). Las composiciones farmacéuticas y las composiciones inmunogénicas dentro del alcance de la presente invención también pueden contener otros compuestos, que pueden ser biológicamente activos o inactivos. Por ejemplo, pueden estar presentes una o más porciones inmunogénicas de otros antígenos de M. tuberculosis, ya sea incorporadas en un polipéptido de fusión o como un componente separado, dentro de la composición farmacéutica o inmunogénica.

Las composiciones inmunogénicas ilustrativas pueden contener un polinucleótido (por ejemplo ADN) que codifica

45 uno o más de los polipéptidos como se describe en lo anterior, de manera que el polipéptido es generado en el sitio /provocando mediante esto una respuesta inmunitaria). Como se notó anteriormente, el ADN puede estar presente dentro de cualquier variedad de sistemas de liberación conocidos para los expertos en la técnica, incluyendo sistemas de expresión de ácido nucleico, sistemas de expresión de bacterias y virus. Muchas técnicas de liberación de genes son muy conocidas en la técnica, como las descritas por Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems

15: 143-198 (1998), y las referencias citadas en la misma. Los sistemas de expresión de ácido nucleico apropiados contienen las secuencias de ADN necesarias para la expresión en el paciente (tal como un promotor y señal de terminación adecuadas). Los sistemas de liberación bacterianos incluyen la administración de una célula huésped de bacteria (por ejemplo, una cepa de Mycobacterium, Bacillus o Lactobacillus, incluyendo el Bacillus-Calmette-Guerin

o el Lactococcus lactis) que expresa al polipéptido (por ejemplo en su superficie o secreta el polipéptido) (véase, por

55 ejemplo, Ferreira, y col., An Acad Bras Cienc (2005) 77: 113-124; y Raha, y col., Appl Microbiol Biotechnol (2005) PubMedID 15635459). En una realización preferida, el ADN puede ser introducido usando un sistema de expresión viral (por ejemplo, vacuna u otro virus de viruela, retrovirus o adenovirus), lo cual puede incluir el uso de un virus competente de replicación no patógeno (defectuoso). Los sistemas adecuados se dan a conocer, por ejemplo, en Fisher-Hoch y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 317-321 (1989) ; Flexner y col., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569: 86-103 (1989) ; Flexner y col., Vaccine 8: 17-21 (1990) ; Patentes de los Estados Unidos de América Números 4,603,112, 4,769,330, y 5,017,487; WO 89/01973; Patentes Números US4,777,127; GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6: 616-627 (1988) ; Rosenfeld y col., Science 252: 431-434 (1991) ; Kolls y col.,

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5 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 215-219 (1994) ; Kass-Eisler y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11498-11502 (1993) ; Guzman y col., Circulation 88: 2838-2848 (1993) ; y Guzman y col., Cir. Res. 73: 1202-1207 (1993). Las técnicas para incorporar ADN en estos sistemas de expresión son muy conocidas para las personas con experiencia ordinaria en la técnica. El ADN también puede ser “no protegido”, como se describe, por ejemplo, en Ulmer y col., Science 259: 1745-1749 (1993) y revisado por Cohen, Science 259: 1691-1692 (1993). La absorción del ADN no protegido puede aumentarse recubriendo el ADN sobre cuentas biodegradables, que son eficientemente transportadas dentro de las células. Será evidente que una composición inmunogénica puede comprender tanto un componente de polinucleótido como un polipéptido. Esta composición inmunogénica puede proporcionar una respuesta inmunitaria aumentada.

Será evidente que una composición inmunogénica puede contener sales farmacéuticamente aceptables de los

15 polinucleótidos y polipéptidos proporcionados en la presente. Estas sales se pueden preparar de bases no tóxicas farmacéuticamente aceptables, incluyendo bases orgánicas (por ejemplo, sales de aminas primarias, secundarias y terciarias y aminoácidos básicos) y bases inorgánicas (por ejemplo, sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio y magnesio).

Aunque se puede emplear cualquier vehículo conocido para las personas con experiencia ordinaria en la técnica en las composiciones inmunogénicas de la presente invención, el tipo de vehículo variará dependiendo del modo de administración, incluyendo por ejemplo la administración tópica, oral, nasal, intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Para la administración parenteral, tal como la inyección subcutánea, el vehículo de preferencia comprende agua, solución salina, alcohol, una cera o un regulador. Para la administración oral, se puede emplear cualquiera de los vehículos anteriores o un vehículo sólido tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de

25 magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, y carbonato de magnesio. También se pueden emplear microesferas biodegradables (por ejemplo polilactato, poliglicolato) como vehículos de las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Las microesferas biodegradables adecuadas se dan a conocer, por ejemplo en las Patentes de los Estados Unidos de América Números 4,897,268; 5,075,109; 5,928,647; 5,811,128; 5,820,883; 5,853,763; 5,814,344 y 5,942,252. También se puede emplear un vehículo que comprende los complejos de proteína en partículas descritos en la Patente de Estados Unidos 5,928,647, los cuales son capaces de inducir respuestas de linfocitos T citotóxicos restringidos clase I en un huésped.

Estas composiciones también pueden comprender reguladores (por ejemplo, solución salina regulada neutra o solución salina regulada de fosfato), carbohidratos (por ejemplo, glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes, bacteriostatos, agentes quelantes tales

35 como EDTA o glutatión, adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio), solutos que vuelven la formulación isotónica, hipotónica o débilmente hipertónica con la sangre de un receptor, agentes de suspensión, agentes espesantes y/o conservadores. Alternativamente, las composiciones de la presente invención se pueden formular como liofilizados. Los compuestos pueden también ser encapsulados con liposomas usando tecnología muy conocida.

Cualquiera de una variedad de inmunoestimulantes se puede emplear en las composiciones inmunogénicas de la presente invención. Por ejemplo, se puede incluir un adyuvante. Un adyuvante se refiere a los componentes en una vacuna o composición terapéutica que aumenta la respuesta inmunitaria específica al antígeno (véase, por ejemplo, Edelman, AIDS Res. Hum Retrovirus 8: 1409-1411 (1992)). Los adyuvantes inducen las respuestas inmunitarias de la respuesta tipo Th-1 y tipo Th-2. Las citocinas del tipo Th-1 (por ejemplo, IFN-γ, IL-2, y IL-12) tienden a favorecer la

45 inducción de la respuesta inmunitaria mediada por la célula a un antígeno administrado, mientras que las citocinas del tipo Th-2 (por ejemplo, IL-4, IL-5, Il-6, IL-10) tienden a favorecer la inducción de las respuestas inmunitarias humorales.

Dentro de las composiciones inmunogénicas proporcionadas en la presente, la composición adyuvante de preferencia se diseña para inducir una respuesta inmunitaria predominantemente del tipo Th1.

Las composiciones adyuvantes adecuadas incluyen emulsiones de aceite en agua. En particular una emulsión de aceite en agua que comprende de 0,5 a 10 miligramos de aceite metabolizable (por ejemplo, escualeno), 0,5 a 11 miligramos de tocol (por ejemplo alfa-tocoferol) y 0,1 a 4 miligramos de agente emulsionante (por ejemplo monooleato de polioxietilen-sorbitán) por dosis humana. Véase, por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO2008/043774 la cual se incorpora mediante referencia por la presente.

55 Un adyuvante alternativo comprende una fracción de saponina inmunológicamente activa derivada de la corteza de Quillaja Saponaria Molina (tal como la fracción purificada HPLC conocida como QS21, como se describe en la Patente de Estados Unidos 5,057,540) presentada en la forma de un liposoma y un lipopolisacárido (tal como monofosforilo-lípido A 3-des-O-acilado). Estas composiciones además pueden comprender un esterol (por ejemplo colesterol), de manera que en donde la proporción de saponina: esterol es de 1: 1 a 1: 100 peso/peso (por ejemplo la proporción de saponina: esterol es de 1: 1 a 1: 10 peso/peso). Particularmente adecuados son aquellos adyuvantes en donde el QS21 y el monofosforilo-lípido A 3-des-O-acilado están presentes en una proporción de QS21: 3D-MPL de 1: 1 peso /peso y ambos están presentes en una dosis humana a un nivel por debajo de 30 microgramos. Estas composiciones de adyuvantes se describen, por ejemplo, en la Publicación Internacional Número WO2007/068907 y en la Patente de Estados Unidos 2008279926, las cuales se incorporan mediante la

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5 presente por referencia.

Otros sistemas adyuvantes de interés incluyen los basados en las sales de aluminio junto con el lipopolisacárido monofosforilo-lípido A 3-des-O-acilado. El antígeno y el monofosforilo-lípido A 3-des-O-acilado se pueden coadsorber a las mismas partículas de sal metálica o se pueden adsorber a distintas partículas de sal metálica. Véanse, por ejemplo, WO00/23105, US7357936 y US2008 0226672A1, las cuales se incorporan mediante la

10 presente por referencia, las cuales describen las composiciones inmunogénicas que comprenden un enlace de antígeno a una primera partícula de sal metálica (en particular fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio) y monofosforilo-lípido A 3-des-O-acilado el cual se enlaza a una segunda partícula de sal metálica (en particular fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio).

Cualquier composición inmunogénica proporcionada en la presente se puede preparar usando métodos muy

15 conocidos que dan como resultado una combinación de antígeno, aumentador de la respuesta inmunitaria y un vehículo o excipiente adecuado (conforme sea necesario).

Cualquiera de una variedad de vehículos de liberación se puede emplear dentro de las composiciones farmacéuticas y composiciones inmunogénicas para facilitar la producción de una respuesta inmunitaria específica de antígeno.

Los vehículos de liberación incluyen células que presentan antígeno (APCs), tales como células dendríticas,

20 macrófagos, células B, monocitos y otras células que se pueden diseñar genéticamente para ser APCs eficientes. Estas células, pueden, pero no necesitan, ser modificadas genéticamente para aumentar la capacidad para presentar el antígeno, para mejorar la activación y/o mantenimiento de la respuesta de la célula T y/o ser inmunológicamente compatible con el receptor (es decir, haplotipo HLA emparejado). Las APCs generalmente se pueden aislar de cualquier variedad de fluidos y órganos biológicos y pueden ser células autólogas, alogénicas,

25 singénicas o xenogénicas.

Ciertas realizaciones de la presente invención usan células dendríticas o progenitoras de las mismas como células que presentan antígeno. Las células dendríticas son APCs muy potentes (Banchereau y Steinman, Nature 392: 245251 (1998)) y se ha demostrado que son efectivas como adyuvante fisiológico para provocar inmunidad profiláctica o terapéutica (véase Timmerman y Levy, Ann. Rev. Med. 50: 507-529 (1999)). En general, las células dendríticas se 30 pueden identificar con base en su forma típica (estrellada in situ, con procesos citoplásmicos marcados (dendritas) visibles in vitro), su capacidad para absorber, procesar y presentar antígenos con alta eficiencia y su capacidad para activar respuestas de células T sencillas. Las células dendríticas pueden, desde luego, ser diseñadas genéticamente para expresar receptores de superficie celular específicos o ligandos que no se encuentran comúnmente en las células dendríticas in vivo o ex vivo, y estas células dendríticas modificadas son contempladas por la presente

35 invención. Como una alternativa a las células dendríticas, se pueden usar células dendríticas cargadas de antígeno de vesículas secretadas (llamadas exosomas) dentro de una composición inmunogénica (véase Zitvogel y col., Nature Med. 4: 594-600 (1998)).

Las células dendríticas y progenitoras se pueden obtener de la sangre periférica, médula ósea, ganglios linfáticos, bazo, piel, sangre del cordón umbilical o cualquier otro ejido o fluido adecuado. Por ejemplo, las células dendríticas

40 se pueden diferenciar ex vivo añadiendo una combinación de citocinas tales como GM-CSF, IL-4, IL-13 y/o TNF a cultivos de monocitos cosechados de sangre periférica. De manera alternativa, las células positivas CD34 cosechadas de la sangre periférica, sangre del cordón umbilical o médula ósea se pueden diferenciar en células dendríticas añadiendo a medio de cultivo combinaciones de GM-CSF, IL-3, TNF, ligando CD40, LPS, ligando flt3 y/o otros compuestos que inducen diferenciación, maduración y proliferación de las células dendríticas.

45 Las células dendríticas se categorizan convenientemente como células “inmaduras” y “maduras”, lo cual permite una manera simple de discriminar entre dos fenotipos bien caracterizados. Sin embargo, esta nomenclatura no deberá considerarse que excluya todas las etapas de diferenciación intermedias. Las células dendríticas inmaduras se caracterizan como APC con una alta capacidad para absorción y procesamiento de antígeno, lo cual se correlaciona con la alta expresión del receptor Fc y el receptor de manosa. El fenotipo maduro se caracteriza típicamente por

50 una expresión más baja de estos marcadores, pero una expresión alta de las moléculas de la superficie celular responsables de la activación de las células T tales como las MHC de clase I y clase II, las moléculas de adhesión (por ejemplo, CD54 y CD11) y las moléculas co-estimulantes (por ejemplo, CD40, CD80, CD86 y 4-1BB).

Las APCs generalmente se pueden transfectar con un polinucleótido que codifica una proteína (o porción u otra variante de la misma) de manera que el polipéptido se expresa sobre la superficie de la célula. Esta transfección se 55 puede llevar a cabo ex vivo, y se puede usar una composición farmacéutica o una composición inmunogénica que comprende estas células transfectadas, como se describe en la presente. Alternativamente, puede ser administrado a un paciente un vehículo de liberación de genes que se dirige a una célula dendrítica o que presenta antígeno, dando como resultado una transfección que ocurre en vivo. La transfección en vivo y ex vivo de las células dendríticas, por ejemplo, generalmente se puede realizar usando cualquier método de transfección conocido en la

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técnica, tal como los descritos en la Publicación Internacional Número WO 97/24447, o el enfoque de cañón de genes descrito por Mahvi y col., Immunology y Cell Biology 75: 456-460 (1997). La carga de antígenos de las células dendríticas se puede lograr incubando células dendríticas o células progenitoras con el polipéptido, ADN (sin protección o con un vector plásmido) o ARN; o con bacteria o virus recombinante que expresa antígeno (por

5 ejemplo, vectores de vacuna, viruela aviaria, adenovirus o lentivirus). Antes de la carga, el polipéptido se puede conjugar covalentemente a un asociado inmunológico que proporciona ayuda de célula T (por ejemplo, una molécula vehículoa). Alternativamente, se puede pulsar una célula dendrítica con un asociado inmunológico no conjugado, por separado o en la presencia del polipéptido.

Las composiciones inmunogénicas y las composiciones farmacéuticas se pueden presentar en contenedores de

10 dosis unitaria o dosis múltiple, tales como ampollas o frascos sellados. Estos contenedores de preferencia se sellan herméticamente para conservar la esterilidad de la formulación hasta su uso. En general, las formulaciones se pueden almacenar como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos. Alternativamente, una composición inmunogénica o una composición farmacéutica se pueden almacenar en una condición secacongelada que requiere solamente la adición de un vehículo líquido estéril inmediatamente antes del uso.

15 En algunas realizaciones, un “cebado” o primera administración de una proteína Rv3616c modificada (incluyendo las proteínas de fusión), o polinucleótido que codifica a esa proteína, es seguido por una o más administraciones subsiguientes o de “refuerzo” de una proteína Rv3616c modificada (incluyendo las proteínas de fusión) o polinucleótido que codifica esa proteína (método de “cebado y refuerzo”). Por ejemplo, una primera administración con un polipéptido de Rv3616c modificado (incluyendo las proteínas de fusión) o polinucleótido que codifica la

20 proteína es seguido por una o más administraciones subsiguientes de un polipéptido de Rv3616c codificado (incluyendo las proteínas de fusión) o un polinucleótido que codifica a este polipéptido.

En una realización, una primera administración con una proteína Rv3616c modificada o polinucleótido es seguida por una o más administraciones subsiguientes de una proteína Rv3616c modificada. En una realización, una primera administración con una proteína Rv3616c modificada o polinucleótido es seguida por una o más administraciones 25 subsiguientes de un polinucleótido de Rv3616c modificado. Usualmente la primera administración o “cebado” y la segunda administración o “refuerzo” se dan con una separación de aproximadamente 2 a 12 semanas, o hasta de 4 a 6 meses. Las subsiguientes administraciones de “refuerzo” se dan aproximadamente con una separación de 6 meses, o tanto como una separación de 1, 2, 3, 4 o 5 años. El tratamiento de refuerzo convencional (por ejemplo, una administración de cebado de proteína seguida por una administración de refuerzo de proteína) también puede

30 ser útil para prevenir o tratar la tuberculosis (por ejemplo prevenir o tratar la tuberculosis latente, en particular prevenir o retardar la reactivación de la tuberculosis).

DIAGNÓSTICOS

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para usar uno o más de las proteínas Rv3616c modificadas descritas anteriormente para diagnosticar la tuberculosis, tal como la tuberculosis latente (por ejemplo

35 usando ensayos basados en respuesta de células T o ensayos basados en anticuerpos de formato convencional).

Por ejemplo, se proporciona un método para determinar la infección por M. tuberculosis latente en un individuo, que comprende:

(a) obtener una muestra del individuo;

(b) poner en contacto la muestra con una proteína Rv3616c modificada; 40 (c) cuantificar la respuesta de la muestra.

La muestra puede ser, por ejemplo, sangre entera o células purificadas. De manera conveniente, la muestra contendrá células mononucleadas de sangre periférica (PBMC). En una realización de la invención el individuo será seropositivo. En una segunda realización de la invención el individuo será seronegativo.

Convenientemente el individuo no habrá sido previamente vacunado contra la infección por M. tuberculosis (por 45 ejemplo convenientemente el individuo no habrá sido vacunado previamente con una BCG).

La respuesta de la muestra puede ser cuantificada por una variedad de medios conocidos para los expertos en la técnica, incluyendo el monitoreo de la proliferación de linfocitos o la producción de citocinas específicas o anticuerpos. Por ejemplo se puede usar el ELISPOT de células T para monitorear las citocinas tales como el interferón gamma (IFNγ), interleucina 2 (IL2) y la interleucina 5 (IL5). Se puede usar ELLISPOT de células B para

50 monitorear la estimulación de antígenos específicos de M. tuberculosis. La respuesta celular puede también caracterizarse por el uso de teñido intra y extracelular y análisis mediante citómetro de flujo.

Los métodos para cuantificar una respuesta de proliferación de muestra incluyen:

(i) pulsar las células cultivadas con una radio-marca (por ejemplo timidina tritiada) y monitorear la absorción de tritio (por ejemplo, centelleo de gas);

55 (ii) etiquetamiento con succinimidil-éster de diacetato de carboxi-fluoresceína (CFSE) y monitoreo de fluorescencia de la división celular usando citometría de flujo.

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La cuantificación de una muestra de respuesta de citocina incluye en particular monitorear la producción de interferón gamma.

Cuando se usan estos métodos de cuantificación, se puede definir una respuesta a un antígeno mediante una proporción señal a ruido (proporción S/N) de al menos 2: 1 (por ejemplo, al menos 3: 1 o al menos 5: 1).

5 En otro aspecto de la presente invención se proporcionan métodos para diagnosticar la infección por M. tuberculosis latente usando una prueba de piel. Como se usa en el presente documento, una “prueba de piel” es un ensayo realizado directamente sobre un paciente en el cual se mide una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) (tal como hinchazón, enrojecimiento o dermatitis) después de la inyección intradérmica de una proteína Rv153c como se describe anteriormente. Esta inyección se puede lograr usando cualquier dispositivo adecuado

10 suficiente para poner en contacto combinaciones del antígeno con las células dérmicas del paciente, tal como una jeringa de tuberculina o una jeringa de 1 mililitro. La reacción se mide después de un periodo de tiempo, por ejemplo al menos 48 horas después de la inyección, especialmente de 48 a 72 horas.

La reacción DTH es una respuesta inmunitaria mediada por células, que es mayor en los pacientes que han sido expuestos anteriormente al antígeno de la prueba. La respuesta se puede medir visualmente, usando una regla. En

15 general, una respuesta que es mayor que aproximadamente 0,5 centímetros de diámetro, especialmente mayor que aproximadamente 1,0 centímetros de diámetro, es una respuesta positiva, indicadora de una infección anterior de M. tuberculosis que puede o no manifestarse como una enfermedad activa.

Para su uso en una prueba de piel, el componente de proteína Rv3616c se formula convenientemente como una composición farmacéutica que contiene un vehículo fisiológicamente aceptable. De manera conveniente, el vehículo

20 empleado en estas composiciones farmacéuticas es una solución salina con conservadores apropiados, tales como fenol y/o Tween 80MR.

La presente invención además proporciona kits para su uso dentro de cualquiera de los métodos de diagnóstico anteriores. Estos kits típicamente comprenden dos o más componentes necesarios para realizar una prueba de diagnóstico. Los componentes pueden ser compuestos, reactivos, contenedores y/o equipo. Por ejemplo, un

25 contenedor dentro de un kit puede contener una proteína Rv3616c modificada. Esta proteína se puede proporcionar unida a un material de soporte. Estos kits también pueden contener un reactivo de detección que contenga un grupo reportero adecuado para la detección directa o indirecta del enlace de anticuerpo.

Otros kits de diagnóstico incluyen los diseñados para la detección de respuestas mediadas por células (que pueden por ejemplo) usarse en los métodos de diagnóstico de la presente invención). Estos kits típicamente comprenderán:

30 (i) un aparato para obtener una muestra de célula apropiada de un sujeto;

(ii) medios para estimular a la muestra de célula con un polipéptido de Rv3616c (o una variante del mismo, fragmentos inmunogénicos del mismo, o ADN que codifique estos polipéptidos) ;

(iii) medios para detectar o cuantificar la respuesta celular a la estimulación.

Los medios adecuados para cuantificar la respuesta celular incluyen un kit ELISPOT de células B o alternativamente 35 un kit ELISPOT de células T, los cuales son conocidos por los expertos en la técnica.

Un kit posible comprende:

(a): un polipéptido de la invención; y

(b): un reactivo de detección adecuado para la detección directa o indirecta de enlace de anticuerpos.

De particular interés son los kits personalizados para cuantificar respuestas de células T:

40 Un kit de diagnóstico que comprende:

(a): un polipéptido de la invención; y

(b): un aparato suficiente para poner en contacto el polipéptido con las células dérmicas de un individuo.

Un kit de diagnóstico que comprende:

(a) un polipéptido de la invención;

45 (b) un aparato suficiente para poner en contacto al polipéptido con una muestra (por ejemplo sangre entera o más convenientemente PBMC) de un individuo, y

(c) medios para cuantificar la respuesta de las células T (por ejemplo la proliferación de la producción del IFNgamma).

EJEMPLOS

50 Los siguientes ejemplos se proporcionan a manera de ilustración solamente y no a manera de limitación. Los expertos en la técnica fácilmente reconocerán una variedad de parámetros no críticos que podrían cambiarse o modificarse para producir esencialmente los mismos resultados.

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Ejemplo 1 – Identificación de Rv3616c como un objetivo de vacuna de TB latente

El gen Rv3616c codifica para una proteína rica en alanina y glicina hipotética conservada.

Se seleccionó la Rv3616c basada en un análisis amplio de genoma de los genes de Mycobacterium tuberculosis asociados con el mantenimiento e inefectividad de la fase latente como en Murphy y Brown BMC.Infect. Dis. 2007 7:

5 84-99. Los objetivos de genes de latencia potencial en Mycobacterium tuberculosis fueron jerarquizados a través de un meta-análisis de bioinformática de conjuntos de bases de ADN de ámbito genoma publicados de la expresión de genes bacterianos bajo condiciones simuladas de latencia. La localización subcelular de las proteínas de M. tuberculosis codificados por genes, se llevó a cabo posteriormente en el genoma entero para identificar los objetivos de vacuna.

10 En resumen, las condiciones en los modelos de latencia fueron bastante variados de manera que se desarrolló un sistema de puntuación de cero a cinco para normalizar estos datos con base en dos criterios: 1) la relevancia de las condiciones experimentales al estado latente y 2) el orden de jerarquía de la expresión. La puntuación máxima para un conjunto de datos particular se ajustó con base en la relevancia potencial a la ocurrencia clínica de las infecciones de M. tuberculosis en fase latente. La Tabla 1 muestra los conjuntos de datos recolectados para la etapa

15 1 junto con las puntuaciones máximas ajustadas para cada conjunto de datos. Los conjuntos de datos adicionales sobre la esencialidad de los genes para el crecimiento se obtuvieron de los estudios publicados usando experimentos de eliminación genética basados en transposón (TraSH). Los genes que no tuvieron efecto sobre el crecimiento recibieron una calificación de cero.

Tabla 1 – Fuentes, modelos experimentales, y criterios de puntuación para eliminación genética en todo el 20 genoma y la expresión de gen en el microarreglo de ADN de M. tuberculosis (esencialmente en fase decrecimiento).

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Voskuil MI y col. Tuberculosis.(Edimb.) 2004 84: 218227: Modelo de hipoxia de Wayne# 30 y 80d: 5 14 y 20d: 4 10 y 12d: 3 6 y 8d: 2

Schnappinger D y col. J. Exp. Med. 2003 198: 693-704: Infección de macrófagos de ratón +/-γ-INF 24 y 48h: 5

imagen35

(continuación)

Referencia: Modelo Experimental Punto del Tiempo: Punto máximoa

Karakousis PC y col. J. Exp. Med. 2004 200: 647-657: Implante subcutáneo de fibra hueca en ratones 10d: 3

Talaat AM y col. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 2004, 101: 4602-4607: Infección de ratones. MTB cosechado de pulmónb 28d: 3

Sassetti CM y col. Mol. Microbiol. 2003 48: 77-84: Bibliotecas mutadas de TraSH cultivadas en medio sólido 14d: 5

Rengarajan J y col. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 2005, 102: 8327-8332: Infección de macrófagos de ratón, +/-γ-INF con bibliotecas mutadas de TraSH de M. tuberculosis 7d: 5

Sassetti CM y col. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 2003 100: 12989-12994: Ratones C57BL/6J infectados con bibliotecas mutadas de TraSH de M. tuberculosis 7, 14, 28 y 56d: 5

aPuntuación máxima basada en la relevancia como modelo de latencia; h = hora ; d = día. bProporción de M. tuberculosis a partir de pulmón de Balb/c contra MTB en cultivo aireado durante 28 días. # Wayne LG y Hayes LG Infect. Immun. 1996 64: 2062-2069

Etapa 2 – Para aplicar el segundo criterio, el orden de jerarquía de la expresión del gen, las puntuaciones de gen a partir de cada conjunto de datos se ordenaron del más alto al más bajo basado en la proporción de la expresión 5 (doblar la expresión en la condición experimental contra las células en el cultivo líquido en fase log). El gen de puntuación más alta recibió la puntuación máxima para ese conjunto de datos particular (enlistado en la columna 3 de la Tabla 1, (por ejemplo. 5, 4…, 1 punto). La puntuación disminuyó en 0,005 puntos para cada gen en orden hasta cero, o se alcanzó el final del conjunto de datos. Así, cuando la puntuación máxima fue de 4 puntos, el gen en rango 100 recibiría una puntuación de 3.500. Para una puntuación máxima de 5 puntos, 1000 genes o 25 % del

10 genoma de M. tuberculosis recibió una puntuación. Para experimentos donde se recolectaron los datos de múltiples puntos del tiempo, se usó como puntuación final la puntuación máxima a través de todos los puntos del tiempo.

En la etapa 3 las puntuaciones para cada gen en cada una de las condiciones experimentales se recolectaron en una base de datos de Acceso de Microsoft. Se añadieron los campos de Referencia para facilitar la jerarquización, tales como la Refseq ID, función de Genbank, nota de Genbank, clasificación de Tuberculist, y vínculos KEGG y

15 Sanger Center. Al combinar los datos de diferentes estudios y fuentes, se logró una vista de consenso sobre los genes y sendas particulares más críticas para la supervivencia en el estado latente.

En la etapa 4, se derivó una lista jerarquizada de objetivos terapéuticos utilizando los 400 genes con mayor puntuación (~10 % del genoma) suplementados por análisis computacional y manual experto de sendas bioquímicas, enzimología, rastreabilidad de fármacos, homología con genes humanos y otros conocimientos

20 anteriores. La gran mayoría de los genes con mayor puntuación vinieron del subconjunto donde dos o tres de los grupos se intersectan.

En la etapa 5, se llevó a cabo en el genoma entero la identificación de la localización subcelular de las proteínas de

M. tuberculosis codificadas por genes. La heurística usada para la predicción de la membrana se describe en

Chalker y col. J. Bacteriol. 2001 183: 1259-1268. Los perfiles promedio de hidropatía (H) (von Heijne G J. Mol. Biol. 25 1992 225: 487-494) se generaron usando valores de hidropatía GES (Engelman DM y col. Annu. Rev. Biophys.

imagen36

Biophys. Chem. 1986 15: 321-353) ponderados usando una ventana trapezoide. Usando un proceso similar a las etapas iniciales del algoritmo TopPred II (Claros MG y col. Comput. Appl. Biosci. 1994 10: 685-686), se pronosticaron los segmentos de transmembrana helicoidal (TMS) para cada secuencia de péptidos seleccionando 19 aminoácidos centrados en el valor H más alto (MaxH), enmascarando estos de más consideración, y repitiendo el 5 proceso hasta que no quedaron picos con una H de >0,5. Se asignaron los lugares subcelulares basándose en el valor MaxH pico, el número de segmentos con una H de >1,0, y distribución y valores H pico del TMS supuesto. Se eligió un corte MaxH de 1,15 para maximizar la discriminación entre dos Swiss Protein que liberaron 34 conjuntos de datos de prueba que contenían transmembrana y proteínas citoplásmicas, respectivamente (Boyd D y col. Protein Sci. 1998 7: 201-205). Las proteínas con una MaxH de <1,15 se clasificaron como citoplásmica, mientras que

10 aquellas con una MaxH de >1,15 y al menos tres posibles TMS se clasificaron como proteínas de membrana. Se definieron proteínas ancladas como teniendo exactamente dos TMS, uno comenzando antes del aminoácido (aa) 35 y uno teniendo una H de >1,15 con la otra teniendo una H no menor que 0,5. Se usó específicamente SignalP con escenarios Gram positivos para M. bacterium para identificar las proteínas secretadas entre aquéllas clasificadas como ya sea citoplásmicas o “desconocidas” en el análisis heurístico (Nielsen H y col. Protein Eng. 1997 10: 1-6).

15 La Rv3616c quedó en un lugar muy alto como antígeno de vacuna de acuerdo con varios criterios:

(i) Rv3616c es regulada ascendentemente de manera consistente a través de todos los modelos de latencia. Entre el acervo entero de 3999 genes calificados en el meta-análisis, Rv3616c quedó en el cuartil superior de los genes sobre-expresados a través de todos los modelos de latencia. La puntuación regulada ascendente para Rv3616c fue de 6,52 lo cual se comparó favorablemente con la puntuación superior de genes de 22,28.

20 (ii) Rv3616c se clasificó como que es muy esencial para la supervivencia en el modelo de infección de bazo de ratón (calificando 4,945, de una calificación posible de 5).

(iii) La localización subcelular pronosticó que la proteína Rv3616c es una proteína de enlace de membrana y así tiene exposición extracelular significativa, indicando conveniencia como un objetivo de vacuna.

(iv) Rv3616c puede provocar una respuesta protectora contra la amenaza inicial de tuberculosis.

25 (v) Rv3616c es ampliamente reconocida como un antígeno.

Ejemplo 2 – Predicción de epítopo de Rv3616c

Método

La predicción del epítopo de la célula T se basó en los siguientes enfoques:

Predicción: Nombre URL/Referencias

CD4 y CD8: Multipred website: antigen.i2r.a-star.edu.sg/multipred/ Zhang,G.L., Khan,A.M., Srinivasan,K.N., August,J.T. y Brusic,V. (2005) “MULTIPRED: a computational system for prediction of promiscuous HLA binding peptides” Nucleic Acids Res. 33, W172 -W179.

SVMHC: website: www-bs.informatik.uni-tuebingen.de/SVMHC “Prediction of MHC class I binding peptides, using SVMHC.” Pierre Dönnes y Arne Elofsson in: BMC Bioinformatics 2002 3: 25

imagen37

(continuación) (continuación)

Predicción: Nombre URL/Referencias

CD4: ProPred website: www.imtech.res.in/raghava/propred/ Singh,H. y Raghava,G.P.S.(2001) “ProPred: Prediction of HLA-DR binding sites.” Bioinformatics,17(12), 1236-37.

Tepitope2: Programa de la casa basado en: H. Bian, J. Hammer (2004) “Discovery of promiscuous HLA-IIrestricted T cell epitopes with TEPITOPE.” Methods 34 : 468-75

nHLA: website: www.imtech.res.in/raghava/nhlapred/ Bhasin M. y Raghava G P S (2006) “A hybrid approach for predicting promiscuous MHC class I restricted T cell epitopes”; J. Biosci. 32: 3142

CD8: NetCTL website: www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/ “An integrative approach to CTL epitope prediction. A combined algorithm integrating MHC-I binding, TAP transport efficiency, y proteasomal cleavage predictions.” Larsen M.V., Lundegaard C., Kasper Lamberth, Buus S,. Brunak S., Lund O., y Nielsen M. European Journal of Immunology. 35(8) : 2295-303. 2005

Epijen: website: www.jenner.ac.uk/EpiJen/ Doytchinova, I. A., P. Guan, D. R. Flower. “EpiJen: a server for multistep T cell epitope prediction.” BMC Bioinformatics, 2006, 7, 131.

Syfpeithi: website: www.syfpeithi.de/Scripts/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm Hans-Georg Rammensee, Jutta Bachmann, Niels Nikolaus Emmerich, Oskar Alexander Bachor, Stefan Stevanovic: “SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs.” Immunogenetics (1999) 50: 213-219

imagen38

Predicción: Nombre URL/Referencias

PredTAP: website: antigen.i2r.a-star.edu.sg/predTAP/ Zhang,G.L., Petrovsky,N., Kwoh,C.K., August,J.T. y Brusic,V. (2006) “PREDTAP: a system for prediction of peptide binding to the human transporter associated with antigen processing.” Immunome Res. 2(1), 3.

PAPROC: http: //www.paproc2.de/paproc1/paproc1.html C. Kuttler, A.K. Nussbaum, T.P. Dick, H.-G. Rammensee, H. Schild, K.P. Hadeler, “An algorithm for the prediction of proteasomal cleavages”, J. Mol. Biol. 298 (2000), 417-429 A.K. Nussbaum, C. Kuttler, K.P. Hadeler, H.-G. Rammensee, H. Schild, “PAProC: A Prediction Algorithm for Proteasomal Cleavages available on the WWW”, Immunogenetics 53 (2001), 87-94

Resultados

Tabla 2 – Epítopos de células T CD4+ humanas de Rv3616c supuesta

Número de epítopo delCD4 Supuesto: Posición dl aminoácido Secuencia del epítopo SEQ ID No: Alelo HLA

1: 5 FIIDPTISA SEQ ID No: 29 DRB1_0301, DRB1_0401, DRB1_1101

2: 31 ILYSSLEYF SEQ ID No: 30 DRB1_0301

3: 36 LEYFEKALE SEQ ID No: 31 DRB1_1301

4: 63 YAGKNRNHV SEQ ID No: 32 DRB1_0801

5: 87 LIHDQANAV SEQ ID No: 33 DRB1_0301, DRB1_0401

6: 111 FVRPVAVDL SEQ ID No: 34 DRB1_0101

imagen39

(continuación)

7: 119 LTYIPVVGH SEQ ID No: 35 DRB1_0401

8: 121 YIPVVGHAL SEQ ID No: 36 DRB1_0101

9: 151 YLVVKTLIN SEQ ID No: 37 DRB1_0401

10: 152 LVVKTLINA SEQ ID No: 38 DRB1_1301

11: 154 VKTLINATQ SEQ ID No: 39 DRB1_0401

12: 164 LKLLAKLAE SEQ ID No: 40 DRB1_0301, DRB1_0801, DRB1_1101, DRB1_1301

13: 173 LVAAAIADI SEQ ID No: 41 DRB1_0301, DRB1_1101, DRB1_1301

14: 181 IISDVADII SEQ ID No: 42 DRB1_0301

15: 197 WEFITNALN SEQ ID No: 43 DRB1_0401

16: 252 LFGAAGLSA SEQ ID No: 44 DRB1_1501

17: 264 LAHADSLAS SEQ ID No: 45 DRB1_0401

18: 270 LASSASLPA SEQ ID No: 46 DRB1_0401

19: 288 FGGLPSLAQ SEQ ID No: 47 DRB1_0401

imagen40

Tabla 3 – Epítopos de células T CD8+ humanas de Rv3616c supuesta (continuación) (continuación) (continuación) (continuación)

Número del epítopo de CD8 supuesto: Posición del amino ácido Secuencia del epítopo SEQ ID No: Alelo HLA

1: 5 FIIDPTISA SEQ ID No: 48 A2

2: 6 IIDPTISAI SEQ ID No: 49 A_0101, A2

3: 9 PTISAIDGL SEQ ID No: 50 A2, A_0201, B7, B8

4: 10 TISAIDGLY SEQ ID No: 51 A1, A_0101, A3, A_0301

5: 12 SAIDGLYDL SEQ ID No: 52 A2, B_3501

6: 13 AIDGLYDLL SEQ ID No: 53 A_0101, A_0201, B44

7: 17 LYDLLGIGI SEQ ID No: 54 A24

8: 25 IPNQGGILY SEQ ID No: 55 B7, A_0101, B_3501, B51

9: 30 GILYSSLEY SEQ ID No: 56 A1, A_0101, A3, A_0301

10: 33 YSSLEYFEK SEQ ID No: 57 A1, A_0301

11: 35 SLEYFEKAL SEQ ID No: 58 A_0201, B7, Cw_0401, Cw_0602

12: 38 YFEKALEEL SEQ ID No: 59 A24, A_2402, B8, Cw_0401, Cw_0602

13: 39 FEKALEELA SEQ ID No: 60 B44, B_4403

14: 69 NHVNFFQEL SEQ ID No: 61 A24, Cw_0602

15: 76 ELADLDRQL SEQ ID No: 62 A_0201

16: 77 LADLDRQLI SEQ ID No: 63 A_0101, B51

17: 79 DLDRQLISL SEQ ID No: 64 A_0101, A_0201

18: 80 LDRQLISLI SEQ ID No: 65 A24, B7, B51

19: 94 AVQTTRDIL SEQ ID No: 66 B7

imagen41

20: 103 EGAKKGLEF SEQ ID No: 67 A24, B7

21: 107 KGLEFVRPV SEQ ID No: 68 A_0201, B51

22: 108 GLEFVRPVA SEQ ID No: 69 A_0101, A_0301

23: 109 LEFVRPVAV SEQ ID No: 70 B44

24: 111 FVRPVAVDL SEQ ID No: 71 B7, B8, B_3501

25: 113 RPVAVDLTY SEQ ID No: 72 B7, A_0101, B_3501, B51

26: 116 AVDLTYIPV SEQ ID No: 73 A2, A_0201

27: 120 TYIPVVGHA SEQ ID No: 74 A24

28: 121 YIPVVGHAL SEQ ID No: 75 A_0101, A2, A_0201, B7, B8

29: 129 LSAAFQAPF SEQ ID No: 76 A1, B7, B_3501

30: 130 SAAFQAPFC SEQ ID No: 77 A_0201

31: 131 AAFQAPFCA SEQ ID No: 78 A_0301, B_3501

32: 133 FQAPFCAGA SEQ ID No: 79 A2, A_0201

33: 135 APFCAGAMA SEQ ID No: 80 B7, B_3501

34: 136 PFCAGAMAV SEQ ID No: 81 A3

35: 141 AMAVVGGAL SEQ ID No: 82 A2, A_0201, A24, B7

36: 143 AVVGGALAY SEQ ID No: 83 A1, A3, A_0301, B7

37: 147 GALAYLVVK SEQ ID No: 84 A3, A_0301

38: 149 LAYLVVKTL SEQ ID No: 85 B8, B44, B51

imagen42

39: 150 AYLVVKTLI SEQ ID No: 86 A24

40: 155 KTLINATQL SEQ ID No: 87 A_0201, A2, A_0301, A24

41: 156 TLINATQLL SEQ ID No: 88 A2, A_0201, A3, A_0101, Cw_0401

42: 158 INATQLLKL SEQ ID No: 89 B7, B8, Cw_0602

43: 159 NATQLLKLL SEQ ID No: 90 A_2402, B7, B_3501, B44, Cw_0401, Cw_0602

44: 162 QLLKLLAKL SEQ ID No: 91 A2, A_0201, A_0301, A_2402, B8, Cw_0401, Cw_0602

45: 165 KLLAKLAEL SEQ ID No: 92 A2, A_0201, A_0301, B7, B8, Cw_0602

46: 166 LLAKLAELV SEQ ID No: 93 A2, A_0201, A_0101, B8

47: 169 KLAELVAAA SEQ ID No: 94 A2

48: 170 LAELVAAAI SEQ ID No: 95 A1, A24, B51

49: 173 LVAAAIADI SEQ ID No: 96 B7, B51

50: 177 AIADIISDV SEQ ID No: 97 A2, A_0201, Cw_0602

51: 178 IADIISDVA SEQ ID No: 98 A_0101, B_3501

52: 182 ISDVADIIK SEQ ID No: 99 A1, A_0301

53: 192 TLGEVWEFI SEQ ID No: 100 A2, A_0201

54: 199 FITNALNGL SEQ ID No: 101 A2

55: 202 NALNGLKEL SEQ ID No: 102 B51, A_2402, B_3501, Cw_0602

56: 213 KLTGWVTGL SEQ ID No: 103 A2, A_0201

imagen43

57: 214 LTGWVTGLF SEQ ID No: 104 A1, A_0101, A24

58: 225 GWSNLESFF SEQ ID No: 105 A24

59: 228 NLESFFAGV SEQ ID No: 106 A2, A_0201

60: 231 SFFAGVPGL SEQ ID No: 107 A2, A_0201, A24, Cw_0401

61: 238 GLTGATSGL SEQ ID No: 108 A2, A_0201

62: 246 LSQVTGLFG SEQ ID No: 109 A1, B8

63: 247 SQVTGLFGA SEQ ID No: 110 A2

64: 258 LSASSGLAH SEQ ID No: 111 A1, A3, B7, B8

65: 260 ASSGLAHAD SEQ ID No: 112 A1, A3, A_0301

66: 262 SGLAHADSL SEQ ID No: 113 A_0201

67: 263 GLAHADSLA SEQ ID No: 114 A_0101, A_0201, A_0301

68: 269 SLASSASLP SEQ ID No: 115 A_0201, A_0301

69: 271 ASSASLPAL SEQ ID No: 116 B7

70: 286 SGFGGLPSL SEQ ID No: 117 A2, A_0201, B51

71: 291 LPSLAQVHA SEQ ID No: 118 B7, B_3501, B51

72: 298 HAASTRQAL SEQ ID No: 119 B7, B8, B_3501

73: 301 STRQALRPR SEQ ID No: 120 A3, A_0301

74: 307 RPRADGPVG SEQ ID No: 121 B7, B_0702, B8, B51

75: 319 EQVGGQSQL SEQ ID No: 122 B7, B44

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76: 350 GASKGTTTK SEQ ID No: 123 A3, A_0301

77: 351 ASKGTTTKK SEQ ID No: 124 A3, A_0301

78: 353 KGTTTKKYS SEQ ID No: 125 A_0301, B8

79: 368 TEDAERAPV SEQ ID No: 126 B44

Como puede verse a partir de las Tablas 2 y 3, la Rv3616c contiene un número pronosticado de epítopos de células T CD4+ y CD8. Además, esta información sugiere que la proteína lleva epítopos que pueden ser reconocidos por HLAs, lo cual ocurre en todo el mundo (esto es HLAs de individuos caucásicos, africanos, asiáticos o

5 latinoamericanos, véase el sitio web en www.allelefrequencies.net).

Ejemplo 3 – Identificación del epítopo de RV3616C

Se preparó una gama de 30 péptidos traslapados que cubrían la longitud completa de la Rv3616c (Véase la Figura 1 para conocer los detalles, y las SEQ ID NOs: 127-156), y se probaron para determinar su capacidad para estimular las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de cuatro donantes de PPD+.

10 Los datos, mostrados en la Figura 2, revelan que los péptidos 1-7 y 17-30 fueron inmunogénicos para estos individuos. Estos péptidos están adecuadamente presentes dentro de la secuencia de las proteínas Rv3616c modificadas de la invención.

Se debe observar que los péptidos 8-16 (residuos de aminoácidos 92-215) pueden ser inmunogénicos en otros individuos de diferente tipo de HLA.

15 Ejemplo 4 – homólogos de Rv3616c H37Rv

Las secuencias de Rv3616c a partir de un número de cepas de M. tuberculosis y BCG se identificaron utilizando las búsquedas BLASTP de GenBank (número de acceso de secuencia de referencia H37Rv: NP_218133.1) :

Cepa: Número de acceso % de identidad

CDC1551: NP_338263.1 99

F11: YP_001289574.1 99

Haarlem: ZP_02248979.1 99

C: ZP_00877472.1 99

BCG: YP_979759.1 99

La alineación de las secuencias homólogas indica un alto nivel de identidad. 20 ENSAYOS BIOLÓGICOS

61

imagen45

Cuantificación de las respuestas de células T a Rv3616c

Los polipéptidos se pueden rastrear para determinar su capacidad para activar las células T (inducción de proliferación y/o producción de citocinas) en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o en preparaciones de sangre entera a partir de los individuos infectados (tal como latentemente infectados).

5 Los individuos latentemente infectados usualmente se identifican mediante una prueba de piel que tiene un diámetro mayor de 10 milímetros, y sin síntomas, sin cultivo positivo para Mtb, con un esputo negativo, y sin lesiones (como se detectan mediante rayos-X del pecho).

Se pueden utilizar un número de ensayos in vitro basados en muestras de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o en sangre entera: después de la reestimulación en la presencia del antígeno (o del fragmento

10 variante/inmunogénico del mismo, como sea apropiado), se puede determinar la proliferación de las células (como se mide mediante CFSE/citometría de flujo), o se puede cuantificar la producción de citocinas (presentes en las células del sobrenadante de cultivo y medidas mediante ELISA, o; después del teñido intracelular de las células T CD4 y CD8 y el análisis mediante citometría de flujo).

Por ejemplo, las muestras de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se pueden obtener a partir de

15 sangre entera heparinizada mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque siguiendo los procedimientos convencionales. Las células entonces se pueden lavar y se pueden crioconservar en nitrógeno líquido hasta la prueba (para otros detalles, véase Lalvani A y col., J. Infect. Dis., 1999, 180: 1656-1664).

Proliferación de células T

La respuesta inmunitaria específica se puede caracterizar llevando a cabo un análisis de proliferación de linfocitos

20 utilizando la timidina tritiada. Esta técnica evalúa la expansión celular después de la estimulación in vitro a un antígeno. En la práctica, la proliferación celular se determina mediante la estimación de la incorporación de timidina tritiada en el ADN, un proceso estrechamente relacionado con los cambios subyacentes en el número de células.

De una manera más adecuada, la proliferación de linfocitos se puede llevar a cabo utilizando el succinimidil-éster de diacetato de carboxi-fluoresceína (CFSE). El succinimidil-éster de diacetato de carboxi-fluoresceína (CFSE) se 25 acopla de una manera espontánea e irreversible con las proteínas tanto intracelulares como de superficie celular, mediante la reacción con las cadenas laterales de lisina y otros grupos amina disponibles. Cuando se dividen las células de linfocitos, el marcado con succinimidil-éster de diacetato de carboxi-fluoresceína (CFSE) se distribuye igualmente entre las células hijas, las cuales, por consiguiente, son la mitad de fluorescentes que las progenitoras. Como un resultado, el llevar a la mitad la intensidad de fluorescencia celular marca a cada generación sucesiva de

30 una población de células proliferantes, y es fácilmente seguida por la citometría de flujo (para otros detalles, véase Hodgkins, PD y col., J. Exp. Med., 1996, 184: 277-281).

Prácticamente, después de la descongelación, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se pueden lavar y teñir con el succinimidil-éster de diacetato de carboxi-fluoresceína (CFSE) antes de cultivarse (2 x 105 células) durante 72 horas con 10 microgramos/mililitro de antígeno en el medio de cultivo (RPMI-1640 35 complementado con glutamina, aminoácido no esencial, piruvato, y suero AB humano inactivado por calor). Las células entonces se pueden cosechar, y se puede caracterizar su fenotipo utilizando teñido superficial para identificar las células T CD8 y CD4+ de memoria. Subsiguientemente, se puede utilizar el análisis de citometría de flujo para indicar el grado de proliferación de linfocitos en respuesta a cada antígeno (proporción de células con una disminución en la intensidad del succinimidil-éster de diacetato de carboxi-fluoresceína (CFSE) después de la

40 estimulación in vitro).

Producción de citocina

La producción de IFN-γ (o la producción de otras citocinas, tales como, por ejemplo, IL2, TNF-alfa, IL5, IL12, etc.) se puede medir utilizando un análisis de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Las placas ELISA se pueden recubrir con un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido hacia el IFN-γ humano (PharMingen, San Diego, CA) en 45 suero regulado con fosfato (PBS) durante cuatro horas a temperatura ambiente. Entonces los pozos se bloquean con suero regulado con fosfato (PBS) que contiene leche deshidratada y descremada al 5 % (peso/volumen) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan entonces, por ejemplo, seis veces en suero regulado con fosfato (PBS) /TWEEN-20 al 0,2 por ciento, y las muestras se diluyen a 1: 2 en el medio de cultivo, y las placas ELISA se incuban durante la noche a temperatura ambiente. Las placas se lavan nuevamente, y se puede agregar a cada 50 pozo, un suero con IFN-γ policlonal de conejo anti-humano, por ejemplo, diluido a 1: 3,000 en suero regulado con fosfato (PBS) /suero de cabra normal al 10 por ciento. Las placas se incuban entonces durante dos horas a temperatura ambiente, se lavan, y se puede agregar IgG anti-conejo acoplada con peroxidasa de radícula roja (Sigma Chemical So., St. Louis, MO), por ejemplo, a una dilución de 1: 2,000 en suero regulado con fosfato (PBS) /leche deshidratada y no descremada al 5 por ciento. Después de una incubación durante dos horas adicionales a 55 temperatura ambiente, las placas se lavan, y se agrega el sustrato de TMB. La reacción se puede interrumpir después de 20 minutos con ácido sulfúrico 1 N. Entonces se puede determinar la densidad óptica a 450 nanómetros utilizando 570 nanómetros como una longitud de onda de referencia. Típicamente, se pueden considerar positivas las fracciones que den como resultado que ambas réplicas den una OD dos veces mayor que la OD promedio a

imagen46

partir de las células cultivadas en el medio solo.

Ejemplo 5 – Inmunogenicidad de la Rv3616c en ratones CB6F1

La inmunogenicidad del antígeno se evaluó en ratones CB6F1 (cruza de la primera generación de ratones BALB/c y C57BL/6).

Los ratones CB6F1 se inmunizaron intramuscularmente tres veces (en el día 0, en el día 14, y en el día 28) con 0,5 microgramos de antígeno de proteína en combinación con el Sistema Adyuvante AS01E (una formulación adyuvante liposomal que comprende 3D-MPL y QS21).

El diseño experimental fue como sigue:

Grupo: Día 0 Día 14 Día 28

1: 0,5 µg Rv3616c/AS01E 0,5 µg Rv3616c/AS01E 0,5 µg Rv3616c/AS01E

10 Se utilizó un total de 24 ratones en el grupo del protocolo.

Se recolectaron linfocitos de sangre periférica (PBL) y se reservaron en el día 21 (es decir, 7 días después de la segunda inmunización), y en el día 35 (es decir, 7 días después de la tercera inmunización), y se midieron las respuestas de células T CD4 y CD8 específicas del antígeno (como se determinaron mediante las células T CD4 o CD8 que produjeron IL-2 y/o IFN-gamma y/o TNF-alfa) mediante citometría de flujo después de la reestimulación in

15 vitro durante la noche con reservas de los péptidos 15mer que cubrían las secuencias de interés. La detección de las células T de ratón que expresan IL-2 y/o IFN-gamma y/o TNF-alfa se hizo utilizando amplificación de la expresión de citocina in vitro impulsada por el antígeno a corto plazo.

Dicho de una manera breve, se agregó la solución PharmLyse (BD-Pharmingen) a la sangre periférica de ratón heparinizada, con el objeto de lisar los glóbulos rojos sanguíneos. Los PBLs (linfocitos de sangre periférica)

20 obtenidos se lavaron, y entonces se incubaron en la presencia de una reserva de péptidos 15-mer -traslapándose por 11 aminoácidos -que cubrían la secuencia del antígeno de interés, y de 1 microgramo/mililitro de anticuerpos para CD28 y CD49d (BD-Pharmingen). Cada péptido 15-mer se utilizó en una concentración final de 1 microgramo/mililitro. Los controles con el medio también se estimularon con anticuerpos para CD28 y CD49d.

El compuesto bloqueador de la secreción de citocina de brefeldina-A (BD-Pharmingen) se agregó 2 horas después

25 del establecimiento de los cultivos a 37°C, con CO2 al 5 por ciento, y las células se mantuvieron a 37°C, con CO2 al 5 % durante 4 horas adicionales, seguido por la incubación durante la noche a +4°C.

Las células entonces se cosecharon y se tiñeron con anticuerpos anti-CD4 acoplados con Pacific Blue (BD – clon RM4-5, BD-Pharmingen), y anticuerpos anti-CD8 alfa acoplados con cianina5.5 (Cy5.5) de proteína de peridininclorofila A (PerCp) (clon 53-6.7, BD-Pharmingen).

30 Las células luego se lavaron, se fijaron, se permeabilizaron (kit Cytofix-cytoperm, BD-Pharmingen), y se tiñeron con anticuerpos anti-IFN-g acoplados con aloficocianina (clon XMG1.2, BDPharmingen), anticuerpos anti-IL-2 acoplados con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (clon JES 6-5H4, Beckman Coulter), y anticuerpos anti-TNF alfa acoplados con ficoeritrina (PE) (clon MP6-XT22, BD-Pharmingen). Después de los lavados finales, las células teñidas se analizaron en un citómetro de flujo LSR II (Beckton-Dickinson). Se adquirió un número mínimo de 10,000 células en

35 el subconjunto CD8+. Para mayores antecedentes, véase Walzer T y col., Cell Immunol., 2000, 206(1) : 16-25 y Maecker HT y col., J. Immunol. Methods, 2001, 255(1-2) : 27-40.

Como controles negativos, algunas células también se cultivaron durante la noche in vitro en el medio de cultivo (no estimulado). Las respuestas específicas del antígeno se calcularon sustrayendo la respuesta de citocina promedio producida por las células no estimuladas a partir de la respuesta de citocina promedio producida por las células

40 estimuladas por el péptido.

En cada punto del tiempo y para cada grupo, los datos se recolectaron a partir de 4 reservas de 6 ratones cada una. Los datos que se encuentran a continuación se presentan como el porcentaje de células T CD4 o CD8 productoras de IL-2 y/o IFN-gamma y/o TNF-alfa. Se grafica cada reserva individual de ratones (triángulos), así como el valor promedio del grupo (barra).

45 La Figura 3 muestra que, en el día 21 (es decir, 7 días después de la segunda inmunización), se detectan las respuestas de células T CD4 y CD8 específicas de Rv3616c en los ratones inmunizados con 0,5 microgramos de la Rv3616c/AS01E.

La Figura 4 muestra el perfil de citocinas de la respuesta de células T CD4 a partir de los linfocitos de sangre periférica (PBL) estimulados por la reserva del péptido de Rv3616c (sin remover el medio) en el día 21 (es decir, 7 días después de la segunda inmunización).

imagen47

La Figura 5 muestra el perfil de citocinas de la respuesta de células T CD8 a partir de los linfocitos de sangre periférica (PBL) estimulados por la reserva del péptido de Rv3616c (sin remover el medio) en el día 21 (es decir, 7 5 días después de la segunda inmunización).

La Figura 6 muestra que en el día 35 (es decir, 7 días después de la tercera inmunización), se detectan las respuestas de células T CD4 y CD8 específicas de Rv3616c en los ratones inmunizados con 0,5 microgramos de la Rv3616c/AS01E. La tercera dosis aumenta la respuesta de células T CD4 pero no la respuesta de células T CD8. Debido a las dificultades técnicas, solamente hubo datos disponibles para una sola reserva.

10 La Figura 7 muestra el perfil de citocinas de la respuesta de células T CD4 a partir de los linfocitos de sangre periférica (PBL) estimulados por la reserva del péptido de Rv3616c (sin remover el medio) en el día 35 (es decir, 7 días después de la tercera inmunización). Debido a las dificultades técnicas, solamente hubo datos disponibles para una sola reserva.

La Figura 8 muestra el perfil de citocinas de la respuesta de células T CD8 a partir de los linfocitos de sangre

15 periférica (PBL) estimulados por la reserva del péptido de Rv3616c (sin remover el medio) en el día 35 (es decir, 7 días después de la tercera inmunización). Debido a las dificultades técnicas, solamente hubo datos disponibles para una sola reserva.

Ejemplo 6 – Inmunogenicidad de la Rv3616c EN RATONES C57BL/6

La inmunogenicidad del antígeno también se evaluó en ratones C57BL/6.

20 Los ratones C57BL/6 se inmunizaron intramuscularmente tres veces (en el día 0, en el día 14, y en el día 28) con 1 microgramo de antígeno de proteína en combinación con un Sistema Adyuvante AS01E (una formulación adyuvante liposomal que comprende 3D-MPL y QS21).

El diseño experimental fue el siguiente:

Grupo: Día 0 Día 14 Día 28

1: 1 µg Rv3616c/AS01E 1 µg Rv3616c/AS01E 1 µg Rv3616c/AS01E

25 Se recolectaron linfocitos de sangre periférica (PBL) y se reservaron en el día 21 (es decir, 7 días después de la segunda inmunización), y en el día 35 (es decir, 7 días después de la tercera inmunización), y se midieron las respuestas de células T CD4 y CD8 específicas del antígeno (como se determinan mediante las células T CD4 o CD8 productoras de IL-2 y/o IFN-gamma y/o TNF-alfa) mediante citometría de flujo después de la reestimulación in vitro durante la noche con reservas de péptidos 15mer que cubrían las secuencias de interés. El procedimiento

30 seguido fue como se describe anteriormente.

Como controles negativos, algunas células también se cultivaron durante la noche in vitro en el medio de cultivo (no estimulado). Las respuestas específicas del antígeno se calcularon sustrayendo la respuesta de citocina promedio producida por las células no estimuladas a partir de la respuesta de citocina promedio producida por las células estimuladas por el péptido.

35 En cada punto del tiempo y para cada grupo, los datos se recolectaron a partir de 4 reservas de 6 ratones cada una. Los datos que se encuentran a continuación, se presentan como el porcentaje de células T CD4 o CD8 productoras de IL-2 y/o IFN-gamma y/o TNF-alfa. Se grafica cada reserva individual de ratones (triángulos), así como el valor promedio del grupo (barra).

La Figura 9 muestra que en el día 21 (es decir, 7 días después de la segunda inmunización), se detectan las

40 respuestas de células T CD4 y CD8 específicas de Rv3616c en los ratones inmunizados con 1 microgramo de la Rv3616c/AS01E, aunque la respuesta de células T CD8 específicas del antígeno es muy baja (por consiguiente, no se muestran los datos del perfil de citocinas).

La Figura 10 muestra el perfil de citocinas de la respuesta de células T CD4 a partir de los linfocitos de sangre periférica (PBL) estimulados por la reserva del péptido de Rv3616c (sin remover el medio) en el día 21 (es decir, 7

45 días después de la segunda inmunización).

La Figura 11 muestra que en el día 35 (es decir, 7 días después de la tercera inmunización), se detectan las respuestas de células T CD4 y CD8 específicas de Rv3616c en los ratones inmunizados con 1 microgramo de la Rv3616c/AS01E. Una tercera dosis de inmunización aumenta las respuestas de células T CD4, pero solo ligeramente la respuesta de células T CD8.

imagen48

La Figura 12 muestra el perfil de citocinas de la respuesta de células T CD4 a partir de los linfocitos de sangre periférica (PBL) estimulados por la reserva del péptido de Rv3616c (sin remover el medio) en el día 35 (es decir, 7 días después de la tercera inmunización).

5 La Figura 13 muestra el perfil de citocinas de la respuesta de células T CD8 a partir de los linfocitos de sangre periférica (PBL) estimulados por la reserva del péptido de Rv3616c (sin remover el medio) en el día 35 (es decir, 7 días después de la tercera inmunización).

Ejemplo 7 – reconocimiento in vitro de la Rv3616c por PBMC a partir de seres humanos con TB latente

Los experimentos se llevaron a cabo con el objeto de evaluar la respuesta de células T periféricas específica para el

10 antígeno de la invención en 4 adultos saludables limpios de tuberculosis (TB) (prueba de piel PPD = 0 milímetros), y 8 adultos saludables latentemente infectados por tuberculosis (TB) (prueba de piel PPD = 15 milímetros o más) de Sudáfrica.

Datos de la prueba cutánea PPD

Número ID del Individuo Diámetro de Induración (mm)

4 0

5 0

33 0

38 0

36 15

46 15

13 15

7 16

58 25

74 26

8 53

60 55

15

La respuesta inmunitaria mediada por células (CMI) se evaluó mediante la medición de citocinas sobre las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) aisladas mediante un ensayo de teñido de citocina intracelular (ICS).

El teñido de citocina intracelular (ICS) llevado a cabo fue una adaptación de la metodología anteriormente descrita (véase Von Eschen y col., Hum. Vaccin., 2009, 5(7)). Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se 20 estimularon in vitro mediante una reserva de péptidos 15-mer -traslapados por 11 aminoácidos -que cubrían la secuencia entera del antígeno de interés. Las células se estimularon con los péptidos durante 2 horas, se cultivaron adicionalmente durante la noche en la presencia de Brefeldina A, se procesaron para el teñido de citocina intracelular (ICS), y se analizaron utilizando citometría de flujo. Se midieron las frecuencias de las células T CD3+CD4+ o CD3+CD8+ específicas del antígeno que expresan IFN-gamma y/o TNF-alfa y/o IL-17. Se sustrajeron

25 las respuestas de las células estimuladas por el medio a partir de las respuestas obtenidas en las células estimuladas por las reservas de péptidos.

ICS: anticuerpos

PO Anti-CD3 (Invitrogen – cat CD0330)

PB Anti-CD4 (BD -cat 558116)

30 APC-H7 Anti-CD8 (BD – cat 641400) AF700 Anti-IFNg (BD-Pharmingen – cat 557995) PE-Cy7 Anti-TNF (BD-Pharmingen – cat 557647) AF647 Anti-IL17 (BD-Pharmingen – cat 51-7178-71) Los resultados se presentan como el número de células T CD3+CD4+ específicas del antígeno que expresan TNFalfa e IFN-gamma, por millón de células T CD3+CD4+, debido a que estas células representan la principal población de las células T CD4 específicas del antígeno (se remueve el nivel de respuesta del fondo debido al medio). No se detectaron células T CD3+CD8+ específicas del antígeno. La Figura 14 muestra que se mide una respuesta de

imagen49

5 células T CD4 específicas del antígeno en 6 de los 8 individuos latentemente infectados (y no en los individuos números 7 y 74) cuando se compara con la respuesta de células T CD4 no específicas, medida en los individuos limpios.

Ejemplo 8 – producción de secuencias de rv3616c modificadas

(i) Clonación

10 La secuencia de nucleótidos de Rv3616 de Mycobacterium tuberculosis H37Rv se optimizó en sus codones para la expresión en E. coli y se sintetizó el gen. El inserto obtenido en seguida de la subclonación se clonó en pET21b+ (Novagen) utilizando un sitio de restricción NdeI en el extremo N y un sitio de restricción Xhol en el término C. Para generar las construcciones de Rv3616c modificadas, se llevaron a cabo una serie de amplificaciones con reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando diferentes cebadores, con el objeto de suprimir los residuos de

15 nucleótidos específicos dentro de la Rv3616c. Los insertos modificados se clonaron entonces en pET26b+ y/o pET19b (Novagen).

Clon que se va a generar: Cebadores utilizados

pET26_Rv3616Δ136-183His: CAN1001/1004 CAN1003/1002

pET26_Rv3616Δ150-160His: CAN1001/1006 CAN1005/1002

pET26_Rv3616Δ136-154His: CAN1001/1008 CAN1007/1002

pET26_Rv3616Δ166-182His: CAN1001/1010 CAN1009/1002

pET19_Rv3616Δ136-183His: CAN1001/1004 CAN1003/1002

pET19_Rv3616Δ150-160His: CAN1001/1006 CAN1005/1002

pET19_Rv3616Δ136-154His: CAN1001/1008 CAN1007/1002

pET19_Rv3616Δ166-182His: CAN1001/1010 CAN1009/1002

pET26_Rv3616Δ135-139His: CAN1001/1065 CAN1064/1002

pET26_Rv3616Δ142-145His: CAN1001/1067 CAN1066/1002

pET26_Rv3616Δ145-152His: CAN1001/1069 CAN1068/1002

imagen50

(continuación) (continuación)

Clon que se va a generar: Cebadores utilizados

pET26_Rv3616Δ138-145His: CAN1001/1071 CAN1070/1002

pET26_Rv3616Δ149-154His: CAN1001/1073 CAN1072/1002

Cebador: Secuencia de Cebador Sitio de Restricción

CAN1001: ggaattccatatgagccgtgcctttattattgatccgac Nde1

CAN1002: ccg ctc gag cac cac att gcg aac cag aac Xho1

CAN1003: ctg agc gca gca ttt cag gca ccg atg tgg ccg ata tta tta aag ninguno

CAN1004: ctttaataatatcggccacatcggtgcctgaaatgctgcgctcag ninguno

CAN1005: gttgtgggtggtgctctgacccagctgctgaaactg ninguno

CAN1006: cagtttcagcagctgggtcagagcaccacccacaac ninguno

CAN1007: ctgagcgcagcatttcaggcgaaaaccctgattaatgcaac ninguno

CAN1008: gttgcattaatcagggttttcgcctgaaatgctgcgctcag ninguno

CAN1009: gcaacccagctgctgaaatccgatgtggccgatattattaaag ninguno

CAN1010: ctttaataatatcggccacatcggatttcagcagctgggttgc ninguno

CAN1064: ctgagcgcagcatttcagggtgcaatggcagttgtg ninguno

CAN1065: cacaactgccattgcaccctgaaatgctgcgctcag ninguno

CAN1066: caatggcagttgtgggtggtgctaaaaccctgattaatgcaac ninguno

CAN1067: gttgcattaatcagggttttagcaccacccacaactgccattg ninguno

CAN1068: ccgttttgtgccggtgcaggtggtgctctggcatatc ninguno

CAN1069: gatatgccagagcaccacctgcaccggcacaaaacgg ninguno

imagen51

Cebador: Secuencia de Cebador Sitio de Restricción

CAN1070 CAN1071 CAN1072 CAN1073: gccggtgcaatggcagttgttgtgaaaaccctgattaatg cattaatcagggttttcacaacaactgccattgcaccggc gcatttcaggcaccgtttggtggtgctctggcatatc gatatgccagagcaccaccaaacggtgcctgaaatgc ninguno ninguno ninguno ninguno

(ii) Expresión de las proteínas recombinantes

Cepa huésped: E.coli competente en T7 Express (New England Biolabs : derivado BL21 mejorado.

La transformación de Escherichia coli T7 Express con el ADN del plásmido se llevó a cabo mediante los métodos convencionales con células tratadas con CaCl2 (Hanahan D. « Plasmid transformation by Simanis. » en Glover, D.

M. (Editor), DNA Cloning. IRL Press, Londres. (1985) : páginas 109-135).

ID de Plásmidos Recombinantes: Cepa Huésped Agar de Placa

pET21_Rv3616His: T7 ExpressA Placa de agar LB con Phytone y 100 µg/ml CarbenicilinaB

pET26_Rv3616Δ136-183His: T7 ExpressA Placa de agar LB con Phytone y 100 µg/ml KanamicinaC

pET26_Rv3616Δ150-160His: T7 ExpressA Placa de agar LB con Phytone y 100 µg/ml KanamicinaC

pET26_Rv3616Δ136-154His: T7 ExpressA Placa de agar LB con Phytone y 100 µg/ml KanamicinaC

pET26_Rv3616Δ166-182His: T7 ExpressA Placa de agar LB con Phytone y 100 µg/ml KanamicinaC

pET19_Rv3616Δ136-183His: T7 ExpressA Placa de agar LB con Phytone y 100 µg/ml CarbenicilinaB

pET19_Rv3616Δ150-160His: T7 ExpressA Placa de agar LB con Phytone y 100 µg/ml CarbenicilinaB

pET19_Rv3616Δ136-154His: T7 ExpressA Placa de agar LB con Phytone y 100 µg/ml CarbenicilinaB

pET19_Rv3616Δ166-182His: T7 ExpressA Placa de agar LB con Phytone y 100 µg/ml CarbenicilinaB

imagen52

(continuación)

ID de Plásmidos Recombinantes: Cepa Huésped Agar de Placa

pET26_Rv3616Δ135-139His: T7 ExpressA Placa de agar LB con Phytone y 100 µg/ml KanamicinaC

pET26_Rv3616Δ142-145His: T7 ExpressA Placa de agar LB con Phytone y 100 µg/ml KanamicinaC

pET26_Rv3616Δ145-152His: T7 ExpressA Placa de agar LB con Phytone y 100 µg/ml KanamicinaC

pET26_Rv3616Δ138-145His: T7 ExpressA Placa de agar LB con Phytone y 100 µg/ml KanamicinaC

pET26_Rv3616Δ149-154His: T7 ExpressA Placa de agar LB con Phytone y 100 µg/ml KanamicinaC

A: NEB (número de catálogo: C2566H) B: Teknova, CA, EUA (número de catálogo L1092) C: Teknova, CA, EUA (número de catálogo L1096)

Se utilizó una placa de agar confluente inoculada con T7 Express de E. coli transformado + plásmido, con el fin de inocular 800 mililitros de caldo LB APS + 50 g/ml de antibiótico, para obtener la O.D.600nm de entre 0,05 y 0,1. Los cultivos se incubaron a 37°C, a 250 revoluciones por minuto hasta una O.D.600nm de alrededor de 0,8.

5 La expresión de la proteína recombinante se indujo mediante la adición de 1 mM final de isopropil-ß-D-1tiogalactopiranosida (IPTG; EMD Chemicals Inc) al medio de cultivo en crecimiento. La inducción se mantuvo durante 3 horas a 37 ºC (o durante la noche a 16°C).

(iii) Purificación

El cultivo bacteriano se centrifugó durante 15 minutos, a 4°C, a 8000g. Los aglomerados del cultivo bacteriano se

10 volvieron a suspender en regulador de lisis (regulador Tris 20 mM (pH de 8,0), y una mezcla de cóctel de inhibidores de proteasa (Complete sin EDTA). Las bacterias se lisaron con el sistema de alteración Constant Cell (Constant System). Los componentes solubles (sobrenadante) e insolubles (aglomerado) se separaron mediante centrifugación a 20,000g durante 20 minutos a 4°C.

Los componentes insolubles (aglomerados) se volvieron a solubilizar en regulador HEPES 20 mM que contenía

15 guanidina HCl 6M, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM, pH de 8,0. El sobrenadante se cargó entonces sobre una columna IMAC de 5 mililitros (BioRad). Después de los lavados, se llevó a cabo la elución utilizando un regulador HEPES 20 mM (pH de 8,0) que contenía Guanidina-HCl 6M, NaCl 500 mM, e imidazol 250 mM.

Se llevaron a cabo dos etapas de diálisis en membrana 12-14000 MWCO (SpectraPor) : primaria en un regulador de urea 8M que contenía HEPES 20mM, NaCl 150 mM a un pH de 8,0, seguida por una segunda diálisis en suero

20 regulado con fosfato (PBS), urea 4M, pH de 7,4.

(iv) SDS-PAGE

Se recolectaron muestras a partir de cultivos no inducidos e inducidos, para determinar el perfil de expresión, y se analizaron mediante SDS-PAGE.

imagen53

Dicho de una manera breve, las muestras se trataron con regulador de muestreo NUPAGE 4X LDS (Invitrogen), se redujeron utilizando DTT 0,05M, y se calentaron a 70°C durante 10 minutos. Las muestras entonces se centrifugaron a la máxima velocidad durante 2 minutos, y se cargaron en gel Bis-Tris al 4-12 % NUPAGE Novex (Invitrogen). La migración se llevó a cabo a 200V durante 35 minutos en Regulador de Ejecución 1X NUPAGE MES (Invitrogen), y el

5 gel se tiñó para permitir la visualización de las proteínas separadas, cuyos resultados se muestran en las Figuras 17 y 18.

Cuando se compara con la expresión del tipo silvestre H37Rv, las construcciones Rv3616Δ138-145, Rv3616Δ136154, Rv3616Δ150-160, Rv3616Δ166-182, Rv3616Δ149-154 y Rv3616Δ135-139 mejoraron notoriamente.

La construcción Rv3616Δ136-183 contuvo un codón de PARO erróneo dentro de la secuencia, y en consecuencia, 10 la expresión de la secuencia no procedió como se pretendía.

Ejemplo 9 –Producción adicional de secuencias Rv3616c modificadas

Empleando una metodología análoga a la descrita en el Ejemplo 8, en donde se utilizó la cepa BL21 (DE3) en lugar de T7 Express, y se utilizó la placa de agar confluente para inocular 25 mililitros de caldo LB APS con antibiótico, se llevaron a cabo tres ejecuciones de expresión (empezando a partir de la misma placa de transformación) con

15 respecto a una gama de construcciones de Rv3616c modificadas.

Los productos de las ejecuciones de expresión se analizaron mediante SDS-PAGE, y se proporciona un gel representativo a partir de una de las ejecuciones de expresión en la Figura 19. Se encontró que Rv3616Δ138-145 ofrece la mejor expresión de proteína, seguida cercanamente por Rv3616Δ149-154 y Rv3616Δ136-154, mostrando la Rv3616Δ135-139 también una buena expresión.

20 La cuantificación de la banda correspondiente a la proteína objetivo se llevó a cabo utilizando el software ImageQuant TL. Dicho de una manera breve, los geles SDS-PAGE se tiñeron utilizando el teñido InstantBlue (Novexin), y se escanearon con un UVP BioImaging System en un formato de archivos TIFF. Las bandas entonces se analizaron utilizando el software ImageQuantTL 7,0 de GE Healthcare. Se utilizó la proteína no inducida Rv3616 como el control para la expresión negativa, debido a que no se observó ninguna reactividad con el anticuerpo (Ab)

25 anti-marca His.

Construcción: % Banda: Gel 1 % Banda: Gel 2 % Banda: Gel 3 % Banda promedio

Rv3616 no inducida: 9 8 7 8

Rv3616: 8 8 8 8

Rv3616Δ150-160: 8 10 12 10

Rv3616Δ136-154: 22 28 29 26

Rv3616Δ166-182: 10 10 9 10

Rv3616Δ135-139: 15 16 17 16

Rv3616Δ142-145: 9 9 8 9

Rv3616Δ145-152: 10 9 10 10

Rv3616Δ149-154: 26 28 31 28

Rv3616Δ138-145: 23 25 21 23

imagen54

(continuación)

% Banda: medida del volumen de la banda dividido entre el volumen total de todas las bandas en la pista.

En el porcentaje de banda, las proteínas Rv3616Δ149-154, Rv3616Δ138-145 y Rv3616Δ136-154 se expresan todas en niveles notoriamente más altos, comparándose con la secuencia natural o con la construcción de Rv3616Δ1505 160 conocida. Rv3616Δ135-139 también se expresó en un alto nivel.

Ejemplo 10 – Inmunogenicidad de rv3616δ138-145 en ratones CB6F1

Se evaluó la inmunogenicidad de Rv3616Δ138-145 en ratones CB6F1.

Los ratones CB6F1 se inmunizaron intramuscularmente tres veces (en el día 0, en el día 14, y en el día 28) con 50 microlitros de la vacuna de prueba que contenía un intervalo de dosis (8 microgramos, 2 microgramos, y 0,5 10 microgramos) de Rv3616Δ138-145 en combinación con el Sistema Adyuvante AS01E (una formulación adyuvante liposomal que comprende 3D-MPL y QS21). Las formulaciones también contenían urea (4M) y arginina (500 mM).

El diseño experimental fue el siguiente:

Grupo: Día 0 Día 14 Día 28

1: 8 µg Rv3616Δ138-145 /AS01E 8 µg Rv3616Δ138-145 /AS01E 8 µg Rv3616Δ138-145 /AS01E

2: 2 µg Rv3616Δ138-145 /AS01E 2 µg Rv3616Δ138-145 /AS01E 2 µg Rv3616Δ138-145 /AS01E

3: 0,5 µg Rv3616Δ138-145 /AS01E 0,5 µg Rv3616Δ138-145 /AS01E 0,5 µg Rv3616Δ138-145 /AS01E

Se utilizaron un total de 20 ratones en cada grupo de inmunización. 10 ratones recibieron solución salina como un 15 grupo de control negativo (no se muestran los datos).

Se recolectaron linfocitos de sangre periférica (PBL) y se reservaron en los días 21 (es decir, 7 días después de la segunda inmunización), y 35 (es decir, 7 días después de la tercera inmunización), y se midieron las respuestas de células T CD4 y CD8 específicas del antígeno (como se determinaron por las células T CD4 o CD8 productoras de IL-2 y/o IFN-gamma y/o TNF-alfa) mediante citometría de flujo después de una reestimulación in vitro durante 6

20 horas con las reservas de péptidos 15mer que cubrían la secuencia completa del antígeno de Rv3616c. La detección de las células T de ratón que expresaron IL-2 y/o IFN-gamma y/o TNF-alfa se hizo utilizando una amplificación de la expresión de citocina in vitro

Dicho de una manera breve, se agregó la solución PharmLyse (BD-Pharmingen) a la sangre periférica de ratón heparinizada, con el objeto de lisar los glóbulos rojos sanguíneos. Los PBLs (linfocitos de sangre periférica) 25 obtenidos se lavaron, y entonces se incubaron en la presencia de una reserva de péptidos 15-mer -traslapados por 11 aminoácidos -que cubrían la secuencia del antígeno de interés, y de 1 microgramo/mililitro de anticuerpos para CD28 y CD49d (BD-Pharmingen). Cada péptido 15-mer se utilizó en una concentración final de 1 microgramo/mililitro. Los pozos de control con el medio también se estimularon con anticuerpos para CD28 y CD49d.

El compuesto bloqueador de la secreción de citocina Brefeldina-A (BD-Pharmingen) se agregó 2 horas después del

30 establecimiento de los cultivos a 37°C, con CO2 al 5 por ciento, y las células se mantuvieron a 37°C, con CO2 al 5 % durante 4 horas adicionales, seguidas por su almacenamiento durante la noche a +4°C.

Las células entonces se cosecharon y se tiñeron con anticuerpos anti-CD4 acoplados con Pacific Blue (clon RM4-5, BD-Pharmingen), y anticuerpos anti-CD8 alfa acoplados con cianina5.5 (Cy5.5) de proteína de peridinina-clorofila (PerCp) (clon 53-6.7, BD-Pharmingen).

35 Las células luego se lavaron, se fijaron, se permeabilizaron (kit Cytofix-cytoperm, BD-Pharmingen), y se tiñeron con

Claims

imagen1

REIVINDICACIONES

1. Una proteína Rv3616c modificada, en la que se ha alterado la hidrofobicidad de los residuos de aminoácidos correspondientes a los residuos 134-183 de la secuencia de H37Rv, comprendiendo dicha proteína Rv3616c modificada un primer polipéptido y un segundo polipéptido, estándo el primer polipéptido localizado hacia el extremo

5 N con respecto al segundo polipéptido, y en la que:

(i)

el primer polipéptido es una secuencia que tiene al menos una identidad del 98 % con los residuos 1-134 de la SEQ ID NO: 1; y

(ii)

el segundo polipéptido es una secuencia que tiene al menos una identidad del 98 % con los residuos 155392 de la SEQ ID NO: 1;

10 en la que los primero y segundo polipéptidos están directamente unidos o indirectamente unidos por medio de un tercer polipéptido, teniendo dicho tercer polipéptido al menos una identidad del 80 % con una secuencia que corresponde a los residuos 135-154 de la SEQ ID NO: 1, en la que se ha suprimido una porción contigua de al menos 3 aminoácidos.
2. La proteína Rv3616c modificada de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el enlace peptídico es indirecto.

15 3. La proteína Rv3616c modificada de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el tercer polipéptido es una secuencia que tiene al menos una identidad del 95 % con una secuencia correspondiente a los residuos 135-154 de la SEQ ID NO: 1, en la que se ha suprimido una porción contigua de al menos 3 aminoácidos.
4. La proteína Rv3616c modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la porción contigua suprimida de los residuos correspondientes a 135-154 en la SEQ ID NO: 1 es de al menos 4 aminoácidos.

20 5. La proteína Rv3616c modificada de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la porción contigua suprimida de los residuos correspondientes a 135-154 en la SEQ ID NO: 1 es de al menos 5 aminoácidos.
6. La proteína Rv3616c modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el tercer polipéptido tiene 20 aminoácidos o menos de longitud.
7. La proteína Rv3616c modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, teniendo dicha 25 proteína menos de 500 residuos de aminoácidos de longitud.
8.

La proteína Rv3616c modificada de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 163.
9.

La proteína Rv3616c modificada de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 165.

30 10. La proteína Rv3616c modificada de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 166.
11. La proteína Rv3616c modificada de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 167.
12. La proteína Rv3616c modificada de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia de 35 aminoácidos de SEQ ID NO: 168.
13.

La proteína Rv3616c modificada de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 169.
14.

La proteína Rv3616c modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que dicha

proteína consiste en un primer polipéptido y un segundo polipéptido, estando el primer polipéptido localizado hacia el 40 extremo N con respecto al segundo polipéptido, y en la que:

(i)

el primer polipéptido es una secuencia que tiene al menos una identidad del 98 % con los residuos 1-134 de la SEQ ID NO: 1; y

(ii)

el segundo polipéptido es una secuencia que tiene al menos una identidad del 98 % con los residuos 155-392 de la SEQ ID NO: 1;

45 en la que los primero y segundo polipéptidos están directamente unidos o indirectamente unidos por medio de un tercer polipéptido, teniendo dicho tercer polipéptido al menos una identidad del 80 % con una secuencia que corresponde a los residuos 135-154 de la SEQ ID NO: 1, en la que se ha suprimido una porción contigua de al menos 3 aminoácidos.
15. Un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína Rv3616c 50 modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

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imagen2
16.

El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 15, que comprende una secuencia que codifica un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID NO: 163 o 165 a 169.
17.

La proteína Rv3616c modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 15 o 16 para su uso como medicamento.

5 18. Uso de una proteína Rv3616c modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 15 o 16 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento, la mejora o la prevención de TB.
19. Una composición inmunogénica, que comprende:

(a) una proteína Rv3616c modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o un

10 polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 15 o 16; y

(b) un potenciador no específico de la respuesta inmunitaria.

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