CN109890411A - 结核病组合物和治疗或预防结核病的方法 - Google Patents

结核病组合物和治疗或预防结核病的方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了包含结核分枝杆菌(Mtb)抗原的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子、包含核酸分子的载体、包含它们的组合物以及引发针对结核病的免疫应答的方法。

Description

结核病组合物和治疗或预防结核病的方法
技术领域
本公开部分涉及包含结核分枝杆菌(Mtb)抗原的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子、包含核酸分子的载体、包含它们的组合物以及引发针对结核病的免疫应答的方法。
背景技术
结核病(TB)是每年导致8百万新病例和2百万死亡的全球健康问题。多重耐药性和完全耐药性TB菌株的出现只会使这一问题更严重。Mtb的生命周期具有3个阶段。在初始感染后的急性期,细菌在宿主中复制并表达毒力因子,从而导致宿主产生免疫应答。随着免疫应答开始控制感染,Mtb进入潜伏的无症状状态,其中细菌变得不复制并被包裹在肉芽肿中。细菌可在感染的个体中以这种潜伏状态存在多年,从而使得疾病的诊断和治疗变得困难。在一些情况下,细菌被重新活化并再次开始复制,从而导致回至疾病状态。再活化可出于多种原因发生,包括由诸如HIV的疾病引起的免疫抑制、诸如化学疗法的治疗或由于衰老所致的免疫系统的减弱。在世界范围内估计20亿人潜伏感染Mtb,并且潜伏Mtb的再活化产生活动性TB疾病的大多数新病例。再活化与肺部的炎症、坏死和成洞相关联,这一过程导致病灶排出至支气管中。当患有支气管病变的个体咳嗽时产生的气溶胶导致将Mtb生物体传播至未感染、易患病的个人,并且传输循环因而得以维持。
抗御TB的目前唯一可用的疫苗(牛分枝杆菌(卡介苗)(BacilleCalmette-Guérin,BCG))首次在1921年引入。BCG已经广泛地利用并且虽然研究表明对于一些用途,BCG是有效的(例如,针对散播性TB),但是已知它对于预防潜伏TB的发展、持续和再活化是无效的。持续需要开发针对TB的改进的、更有效的疫苗。特别地,需要开发可提供针对潜伏结核病感染的发展、保持和/或再活化的保护的疫苗。由于Mtb的整个基因组序列的可用性以及Mtb抗原的生物信息学和实验分析工具,近年来已经鉴别了许多新的潜在Mtb疫苗候选物。这些包括参与急性感染、潜伏期维持或Mtb再活化的抗原。存在临床开发中的一系列递送策略,所述递送策略由这些和其他抗原的组合组成并且已在动物模型中进行了测试并且目前或即将处于临床试验。
虽然疫苗常常有效地使个体针对病原体感染或人疾病预防性或治疗性免疫,但是仍需要改进的疫苗。还需要产生增强的免疫应答的组合物和方法。同样,虽然一些免疫治疗剂可用于调节患者的免疫应答,但是仍需要改进的免疫治疗组合物和方法。
发明内容
本公开描述了可用于产生包含特定结核分枝杆菌(Mtb)抗原的结核疫苗的抗原盒(和特定变体)。本公开还描述了抗原的策略性组合,所述抗原以提供通向抗原递送的匹配组合的基质的途径以获得优化的免疫应答的这样一种方式结合到多种递送平台中。本文描述的主题可用作预防性或治疗性TB疫苗。用于包含在可用盒中的抗原的初始选择是基于许多参数,包括例如文献的全面综述、表达数据、人T细胞的应答、人免疫原性区的包含、小鼠保护研究以及在具有全基因组序列的大多数TB菌株中序列的保守。然后探测特异性抗原以确保它们能够在多种系统(BCG、蛋白质、病毒载体、核酸)中表达,它们具有免疫原性并且它们可被制备为蛋白质或其他载体中的融合体以简化下游制造业问题。然后,所有选择的抗原在小鼠中显示出免疫原性,无论是单独使用还是以多种组合使用,以达成本申请。
本文描述的构建体已被整合到指定范围的递送平台中,所述递送平台包括以下类别(但并非详尽)的代表性递送平台:1)病毒载体递送系统,2)重组BCG,3)重组纯化蛋白质融合体,4)DNA质粒载体系统,以及5)RNA载体系统。这些递送平台可以单独单一平台使用或者作为匹配的抗原初免-加强方法组合使用。此外,在单一rBCG载体系统中使用这些抗原,所述载体系统被设想作为抗原匹配的引发用于用上述任何模式加强,包括蛋白质、病毒载体、核酸等。
本公开提供了融合蛋白,所述融合蛋白包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原。
本公开还提供了编码融合蛋白的核酸分子,所述融合蛋白包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原。
本公开还提供:包含所述融合蛋白和药学上可接受的载体的组合物;编码所述融合蛋白的载体;包含所述载体和药学上可接受的载体的组合物;包含所述载体的细胞;包含所述细胞和药学上可接受的载体的组合物。
本公开还提供了组合物,所述组合物包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原和药学上可接受的载体。
本公开还提供了组合物,所述组合物包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原,其中所述组合物包含至少一种编码所述Mtb抗原中的至少一种的核酸分子和药学上可接受的载体。
本公开还提供了在哺乳动物中引发针对结核分枝杆菌的免疫应答的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用免疫学上足够量的一种或多种融合蛋白,所述融合蛋白包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原。
本公开还提供了在哺乳动物中引发针对结核分枝杆菌的免疫应答的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用免疫学上足够量的组合物,所述组合物包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原和药学上可接受的载体。
本公开还提供了在哺乳动物中引发针对结核分枝杆菌的免疫应答的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用免疫学上足够量的组合物,所述组合物包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原和药学上可接受的载体,其中所述组合物包含至少一种编码所述Mtb抗原中的至少一种的核酸分子。
本公开还提供了用于制备用于治疗或预防结核分枝杆菌感染的药物的融合蛋白,其中所述融合蛋白包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原。
本公开还提供了用于治疗或预防结核分枝杆菌感染的药物的融合蛋白,其中所述融合蛋白包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原。
本公开还提供了融合蛋白在制备用于治疗或预防结核分枝杆菌感染的药物中的用途,其中所述融合蛋白包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原。
本公开还提供了融合蛋白在治疗或预防结核分枝杆菌感染中的用途,其中所述融合蛋白包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原。
本公开还提供了用于制备用于治疗或预防结核分枝杆菌感染的药物的组合物,其中所述组合物包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原和药学上可接受的载体。
本公开还提供了用于治疗或预防结核分枝杆菌感染的组合物,其中所述组合物包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原和药学上可接受的载体。
本公开还提供了组合物在制备用于治疗或预防结核分枝杆菌感染的药物中的用途,其中所述组合物包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原和药学上可接受的载体。
本公开还提供了组合物在治疗或预防结核分枝杆菌感染中的用途,其中所述组合物包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原和药学上可接受的载体。
本公开还提供了用于制备用于治疗或预防结核分枝杆菌感染的药物的组合物,其中所述组合物包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原和药学上可接受的载体;其中所述组合物包含至少一种编码所述Mtb抗原中的至少一种的核酸分子。
本公开还提供了用于治疗或预防结核分枝杆菌感染的组合物,其中所述组合物包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原和药学上可接受的载体,其中所述组合物包含至少一种编码所述Mtb抗原中的至少一种的核酸分子。
本公开还提供了组合物在制备用于治疗或预防结核分枝杆菌感染的药物中的用途,其中所述组合物包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原和药学上可接受的载体,其中所述组合物包含至少一种编码所述Mtb抗原中的至少一种的核酸分子。
本公开还提供了组合物在治疗或预防结核分枝杆菌感染中的用途,其中所述组合物包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原和药学上可接受的载体,其中所述组合物包含至少一种编码所述Mtb抗原中的至少一种的核酸分子。
本公开还提供了基本上如参考所附实施例和/或附图描述的如本文所述的融合蛋白、组合物、细胞、载体、方法和用途。
附图说明
图1示出Ag85B、Ag85A、Rv3407构建体和编码所述构建体的重组BCG的重组蛋白形式的小鼠免疫原性数据。
图2示出Ag85B、Ag85A、Rv3407构建体和编码所述构建体的重组BCG的重组蛋白形式的小鼠功效数据。
图3示出编码Ag85B、Ag85A、Rv3407抗原且具有重组BCG的Ad5的小鼠免疫原性数据。
图4示出使用DNA疫苗构建体产生的几种Mtb抗原的小鼠免疫原性数据。
具体实施方式
本文所使用的术语仅仅出于描述具体实施方案的目的,并且不意图是限制性的。
除非上下文另外清楚地指示,否则如本文所用,单数形式“一个/种(a/an)”和“所述”包括复数个指示物。
对于本文的数值范围的叙述来说,明确地涵盖具有相同精确度的介于其间的每个中间数字。例如,对于6-9的范围来说,除6和9之外,还涵盖数字7和8,并且对于范围6.0-7.0来说,明确地涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
如本文所用,“佐剂”是指添加至本文所述的任何组合以增强Mtb抗原的免疫原性的任何分子。
如本文所用,“编码序列”或“编码核酸”是指包含编码Mtb抗原的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列还可包含可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号,所述调控元件包括能够在施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中指导表达的启动子和聚腺苷酸化信号。
如本文所用,“共有”或“共有序列”是指基于特定Mtb抗原的多种亚型的比对的分析的多肽序列。可制备编码共有多肽序列的核酸序列。包含Mtb抗原可被用来诱导针对特定抗原的多种亚型或血清型的广泛免疫,所述疫苗包含编码此类抗原的共有序列和/或核酸分子。
如本文所用,“电穿孔”是指使用跨膜电场脉冲来诱导生物膜中的微观途径(孔隙);所述微观途径的存在允许生物分子如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子以及水从细胞膜的一侧穿至另一侧。
如本文所用,相对于核酸序列的“片段”是指编码与全长野生型Mtb抗原交叉反应的能够在哺乳动物中引发免疫应答的Mtb抗原的一部分的核酸序列或其一部分。所述片段可以选自编码下文所述的蛋白质片段的各种核苷酸序列中的至少一种的DNA片段。
如本文所用,关于多肽序列的“片段”或“免疫原性片段”是指与全长野生型毒株Mtb抗原交叉反应的能够在哺乳动物中引发免疫应答的MTB抗原的一部分。共有或野生型Mtb抗原的片段可包含共有或野生型Mtb抗原的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%。在一些实施方案中,共有蛋白的片段可包含共有或野生型蛋白的至少20个氨基酸或更多、至少30个氨基酸或更多、至少40个氨基酸或更多、至少50个氨基酸或更多、至少60个氨基酸或更多、至少70个氨基酸或更多、至少80个氨基酸或更多、至少90个氨基酸或更多、至少100个氨基酸或更多、至少110个氨基酸或更多、至少120个氨基酸或更多、至少130个氨基酸或更多、至少140个氨基酸或更多、至少150个氨基酸或更多、至少160个氨基酸或更多、至少170个氨基酸或更多、至少180个氨基酸或更多。
如本文所用,“遗传构建体”是指包含编码Mtb抗原的核苷酸序列的DNA或RNA分子。所述编码序列包含可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号,所述调控元件包括能够在施用核酸分子的个体的细胞中指导表达的启动子和聚腺苷酸化信号。
如本文所用,“可表达形式"是指含有可操作连接至编码Mtb抗原的编码序列的必需调控元件的基因构建体,以使得当存在于个体的细胞中时,编码序列将被表达。
如本文使用,“同源性”是指互补程度。可存在部分同源性或完全同源性(即,同一性)。至少部分地抑制完全互补序列杂交于靶核酸的部分互补序列是使用功能术语“基本上同源”来提及。当关于如cDNA或基因组克隆的双链核酸序列使用时,术语“基本上同源”是指探针可在低严格性条件下杂交于双链核酸序列的链。当关于单链核酸序列使用时,术语“基本上同源”是指探针可在低严格性条件下杂交于单链核酸模板序列(即,是单链核酸模板序列的互补序列)。
如本文所用,在两种或更多种核酸或多肽序列的背景下“相同的”或“同一性”是指序列具有指定百分比的在指定区上相同的残基。可通过以下来计算所述百分比:最优比对两个序列,在指定区域上比较两个序列,确定在两个序列中出现相同残基的位置的数目以产生匹配位置的数目,用匹配位置的数目除以指定区中的位置的总数目,并且将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。在两个序列具有不同的长度或者比对产生一个或多个交错的末端并且比较的指定区域仅包含单个序列的情况下,单个序列的残基被包括在计算的分母中而不是分子中。当比较DNA和RNA时,胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)残基可被认为是等同的。同一性可手动地或者通过使用计算机序列算法如BLAST或者BLAST 2.0来执行。
如本文所用,“免疫应答”是指响应于Mtb抗原的引入,宿主的免疫系统(例如,哺乳动物的免疫系统)的活化。免疫应答可以是细胞应答或体液应答或两者的形式。
如本文所用,“Mtb抗原”是指来自结核分枝杆菌的抗原,其可以是分离的抗原,或与一种或多种其他抗原形成融合蛋白的一部分的抗原。
如本文所用,“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”是指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描绘也定义了互补链的序列。因此,核酸还涵盖所描绘的单链的互补链。核酸的许多变体可用于与给定核酸相同的目的。因此,核酸还涵盖了基本上相同的核酸及其补体。单链提供可在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此,核酸还涵盖了在严格杂交条件下杂交的探针。核酸可以是单链的或者双链的,或可含有双链序列和单链序列两者的部分。核酸可以是DNA、基因组和cDNA两者、RNA或杂合体,其中所述核酸可含有脱氧核糖核苷酸与核糖核苷酸的组合,以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌啉、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可通过化学合成方法或者通过重组方法来获得。
如本文所用,“可操作地连接”是指基因的表达在与之在空间上连接的启动子的控制下。启动子可位于受其控制的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子与基因之间的距离可与所述启动子与其所控制的基因(即启动子的来源基因)之间的距离大约相同。如本领域所已知,这个距离的变化可在没有失去启动子功能的情况下进行调整。
如本文所用,“启动子”是指能够在细胞中赋予、活化或增强核酸的表达的合成或天然来源的分子。启动子可包含一个或多个特异性转录调控序列以进一步增强表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。启动子还可包含远端增强子或阻遏子元件,它们可位于与转录起始位点相距多达数千个碱基对处。启动子可源自包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫以及动物的来源。启动子可调控基因组分相对于其中发生表达的细胞、组织或器官或相对于发生表达所处的发育阶段或响应于外部刺激(如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂)而组成型地或差异性地表达。
如本文所用,可互换使用的“信号肽”和“前导序列”是指可被连接在本文所述的Mtb抗原蛋白的氨基末端的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指导蛋白质的定位。本文所用的信号肽/前导序列优选地促进蛋白质从产生其将其锚定在膜中的细胞中分泌。信号肽/前导序列常常从蛋白质的剩余部分裂解,所述蛋白质在从细胞分泌后经常被称为成熟蛋白质。信号肽/前导序列连接在所述蛋白质的N末端。
如本文所用,“严格杂交条件”是指在其下第一核酸序列(例如,探针)将与第二核酸序列(例如,靶标)如在核酸的复杂混合物中杂交的条件。严格的条件是序列依赖性的并且在不同的环境中将是不同的。严格条件可经选择比限定离子强度pH下特定序列的热熔点(Tm)低约5℃至10℃。Tm可以是在所述温度下处于平衡时50%互补于靶标的探针杂交于靶标序列(因为靶标序列过量存在,所以在Tm下,在平衡时50%的探针被占据)的温度(在限定的离子强度、pH以及核酸浓度下)。严格条件可以是那些条件,即其中盐浓度小于约1.0M的钠离子,如在pH 7.0至8.3下约0.01至1.0M的钠离子浓度(或其它盐),并且温度对于短的探针(例如,约10至50个核苷酸)为至少约30℃且对于长的探针(例如,大于约50个核苷酸)为至少约60℃。严格条件还可通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。对于选择的或特定的杂交,阳性信号可以是背景杂交的至少2至10倍。示例性严格杂交条件包括以下:50%甲酰胺、5xSSC以及1%SDS,在42℃下孵育;或者5x SSC、1%SDS,在65℃下孵育,在65℃下用0.2x SSC和0.1%SDS洗涤。
如本文所用,“基本上互补”是指第一序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸的区域内与第二序列的补体至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%相同,或者是指两个序列在严格杂交条件下杂交。
如本文所用,“基本上相同”是指第一序列和第二序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸区域内是至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%相同的,或者就核酸而言,如果第一序列与第二序列的补体基本上互补,则第一序列和第二序列基本上相同。
如本文所用,关于核酸的“变体”是指i)参考核苷酸序列的一部分或片段;ii)参考核苷酸序列或其部分的补体;iii)与参考核酸或其互体大致上相同的核酸;或者iv)在严格条件下与参考核酸、其补体或与其大致上相同的序列杂交的核酸。
如本文所用,关于肽或多肽的“变体”是指所述肽或多肽因氨基酸的插入、缺失或保守取代而在氨基酸序列上不同但保留至少一种生物活性。变体还可指具有与参考蛋白质大致上相同的氨基酸序列的蛋白质,所述参考蛋白质具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守性取代,即用具有类似性质(例如,亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸置换氨基酸,在本领域中被认为通常涉及微小变化。可与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于所述氨基酸的相对类似性,并且特别是那些氨基酸的侧链的相对类似性,如通过疏水性、亲水性、电荷、大小及其他性质所揭示。
如本文所用,“载体”是指含有复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体。
本公开提供了融合蛋白,所述融合蛋白包含至少两种结核分枝杆菌(Mtb)抗原。在一些实施方案中,所述融合蛋白包含至少三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原。在一些实施方案中,所述融合蛋白包含至少四种结核分枝杆菌(Mtb)抗原。在一些实施方案中,所述融合蛋白包含至少五种结核分枝杆菌(Mtb)抗原。
在一些实施方案中,编码任何特定Mtb抗原的核酸分子可以是分枝杆菌序列、细菌密码子优化的序列(如大肠埃希氏菌优化的序列)或哺乳动物优化的序列(如人优化的序列)。大肠埃希氏菌优化的序列可例如用于产生融合蛋白。人优化的序列可用于例如病毒载体中。密码子优化的方法(无论是用于细菌还是哺乳动物)是本领域技术人员所熟知的。
在一些实施方案中,所述Mtb抗原是Rv1009(也称为RpfB)、Rv3136(也称为PPE51)、Rv3615c(也称为EspC)、Rv2628、Rv2034、Rv3136N-末端、Ag85A、Ag85B(也称为Rv1886c)、Rv3407、Rv1733、Rv2626c、RpfA、RpfC或RpfD。
编码Rv1009的核苷酸序列(包括信号序列)在表1中示出为SEQ ID NO:1,并且Rv1009的氨基酸序列(包括信号序列)在表1中示出为SEQ ID NO:2。编码Rv1009的核苷酸序列(无信号序列)在表1中示出为SEQ ID NO:3,并且Rv1009的氨基酸序列(无信号序列)在表1中示出为SEQ ID NO:4。
编码Rv3136的核苷酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:5(分枝杆菌序列;未密码子优化的)、SEQ ID NO:6(大肠埃希氏菌优化的)和SEQ ID NO:7(人优化的),并且Rv3136的氨基酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:8。
编码Rv3615c的核苷酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:9(分枝杆菌序列;未密码子优化的)和SEQ ID NO:10(人优化的),并且Rv3615c的氨基酸序列在表1中示出为SEQ IDNO:11。
编码Rv2628的核苷酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:12(分枝杆菌序列;未密码子优化的)和SEQ ID NO:13(人优化的),并且Rv2628的氨基酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:14。
编码Rv2034的核苷酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:15,并且Rv2034的氨基酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:16。
编码Rv3136N-末端(Rv3136Nt)的核苷酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:17,并且Rv3136N-末端(Rv3136Nt)的氨基酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:18。
编码Ag85A的核苷酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:19,并且Ag85A的氨基酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:20。
编码Ag85B的核苷酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:21(分枝杆菌序列;未密码子优化的)、SEQ ID NO:22(大肠埃希氏菌优化的)和SEQ ID NO:23(人优化的),并且Ag85B的氨基酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:24(分枝杆菌序列)和SEQ ID NO:25(大肠埃希氏菌和人优化的)。
编码Rv3407的核苷酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:26,并且Rv3407的氨基酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:27。
编码Rv1733的核苷酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:28,并且Rv1733的氨基酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:29。
编码Rv2626c的核苷酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:30,并且Rv2626c的氨基酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:31。
编码RpfA的核苷酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:32,并且RpfA的氨基酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:33。
编码RpfC的核苷酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:34,并且RpfC的氨基酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:35。
编码RpfD的核苷酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:36,并且RpfD的氨基酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:37。
表1中所示的氨基酸和核苷酸序列源自H37Rv。
表1
在一些实施方案中,所述融合蛋白包含至少两种结核分枝杆菌(Mtb)抗原。在一些实施方案中,所述融合蛋白包含至少三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原。在一些实施方案中,所述融合蛋白包含至少四种结核分枝杆菌(Mtb)抗原。在一些实施方案中,所述融合蛋白包含至少五种Mtb抗原。在一些实施方案中,所述融合蛋白包含至少六种Mtb抗原。在一些实施方案中,所述融合蛋白包含至少两种到至少六种Mtb抗原。在一些实施方案中,所述融合蛋白包含至少三种到至少六种Mtb抗原。在一些实施方案中,所述融合蛋白包含至少三种到至少五种Mtb抗原。在一些实施方案中,所述融合蛋白包含至少三种或至少四种Mtb抗原。在一些实施方案中,所述融合蛋白包含至少四种到至少六种Mtb抗原。在一些实施方案中,所述融合蛋白包含至少四种或至少五种Mtb抗原。
在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Rv1009、Rv3615c和Rv3136Mtb抗原。在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Rv1009、Rv2034和Rv3136Mtb抗原。在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Rv1009、Rv2628、Rv3615c和Rv3136Mtb抗原。在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Rv1009、Rv3615c、Rv2034和Rv2628Mtb抗原。在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Rv2034、Rv3615c、Rv2628和Rv3136Mtb抗原。在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Rv1009、Rv2034、Rv2628、Rv3615c和Rv3136Mtb抗原。在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Rv1009、Rv3136Nt、Rv2628、Rv2034和Rv3615c Mtb抗原。在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Ag85A、Ag85B和Rv3407Mtb抗原。在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Rv1733和Rv2626cMtb抗原。在一些实施方案中,所述融合蛋白包含RfpA、RpfC和RpfD Mtb抗原。
在本文列出的融合蛋白的任何实施方案中,单独Mtb抗原可以任何顺序存在。例如,对于包含Rv3615c、Rv2034、Rv2628和Rv1009Mtb抗原的融合蛋白,第一(或N-末端)抗原可以是Rv3615c、Rv2034、Rv2628或Rv1009;第二抗原可以是Rv3615c、Rv2034、Rv2628或Rv1009(无论哪一个都不是第一Mtb抗原);第三抗原可以是Rv3615c、Rv2034、Rv2628或Rv1009(无论哪一个都不是第一或第二Mtb抗原);并且第四(或C-末端)抗原可以是Rv3615c、Rv2034、Rv2628或Rv1009(无论哪一个都不是第一、第二或第三Mtb抗原)。同样对于本文公开的每种融合蛋白。
单独Mtb抗原可以C-末端至N-末端或N-末端至C-末端方式连接在一起而无任何接头。或者,接头可存在于本文公开的任何融合蛋白内的任何两种Mtb抗原之间。在一些实施方案中,所述接头是任选地含有一个或多个限制性位点的DNA或RNA的区段,其中所述接头插入编码本文公开的任何融合蛋白的两种Mtb抗原的核酸分子之间。
在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Rv1009-Rv3615c-Rv3136(构建体A;参见表2)。核苷酸序列是SEQ ID NO:38(插入的EcoRI和HindIII限制性位点加粗),并且相应氨基酸序列是SEQ ID NO:39。
在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Rv1009-Rv2034-Rv3136(构建体B;参见表2)。核苷酸序列是SEQ ID NO:40(插入的SacI和HindIII限制性位点加粗),并且相应氨基酸序列是SEQ ID NO:41。
在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Rv1009-Rv2628-Rv3615c-Rv3136(构建体C;参见表2)。核苷酸序列是SEQ ID NO:42(插入的EcoRI、SacI和HindIII限制性位点加粗),并且相应氨基酸序列是SEQ ID NO:43。
在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Rv1009-Rv2034-Rv2628-Rv3615c-Rv3136(构建体D;参见表2)。核苷酸序列是SEQ ID NO:44(插入的BamHI、EcoRI、SacI和HindIII限制性位点加粗),并且相应氨基酸序列是SEQ ID NO:45。
在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Rv2034-Rv1009-Rv3136(构建体E;参见表2)。核苷酸序列是SEQ ID NO:46(插入的EcoRI和HindIII限制性位点加粗),并且相应氨基酸序列是SEQ ID NO:47。
在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Rv3136-Rv2034-Rv1009(构建体F;参见表2)。核苷酸序列是SEQ ID NO:48(插入的SacI和HindIII限制性位点加粗),并且相应氨基酸序列是SEQ ID NO:49。
在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Rv1009-Rv3615c-Rv2034-Rv2628(构建体G;参见表2)。核苷酸序列是SEQ ID NO:50(插入的EcoRI、SacI和HindIII限制性位点加粗),并且相应氨基酸序列是SEQ ID NO:51。
在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Rv3615c-Rv2034-Rv2628-Rv1009(构建体H;参见表2)。核苷酸序列是SEQ ID NO:52(插入的BamHI、EcoRI和HindIII限制性位点加粗),并且相应氨基酸序列是SEQ ID NO:53。
在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Rv2034-Rv3615c-Rv2628-Rv3136(构建体I;参见表2)。核苷酸序列是SEQ ID NO:54(插入的EcoRI、SacI和HindIII限制性位点加粗),并且相应氨基酸序列是SEQ ID NO:55。
在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Rv3136-Rv2628-Rv3615c-Rv2034(构建体J;参见表2)。核苷酸序列是SEQ ID NO:56(插入的EcoRI、SacI和HindIII限制性位点加粗),并且相应氨基酸序列是SEQ ID NO:57。
在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Rv1009-Rv3136Nt-Rv2628-Rv2034-Rv3615c(构建体K;参见表2)。核苷酸序列是SEQ ID N O:58(插入的BamHI、EcoRI、SacI和HindIII限制性位点加粗),并且相应氨基酸序列是SEQ ID NO:59。
在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Rv2034-Rv3615c-Rv3136Nt-Rv2628-Rv1009(构建体L;参见表2)。核苷酸序列是SEQ ID N O:60(插入的BamHI、EcoRI、SacI和HindIII限制性位点加粗),并且相应氨基酸序列是SEQ ID NO:61。
在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Rv3615c-Rv2628-Rv1009-Rv3136Nt-Rv2034(构建体M;参见表2)。核苷酸序列是SEQ ID NO:62(插入的BamHI、EcoRI、SacI和HindIII限制性位点加粗),并且相应氨基酸序列是SEQ ID NO:63。
在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Ag85A-Ag85B-Rv3407(构建体N;参见表2)。核苷酸序列是SEQ ID NO:64,并且相应氨基酸序列是SEQ ID NO:65。
在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Rv1733-Rv2626c(构建体O;参见表2)。核苷酸序列是SEQ ID NO:66,并且相应氨基酸序列是SEQ ID NO:67。
在一些实施方案中,所述融合蛋白包含RpfA-RpfC-RpfD(构建体P;参见表2)。核苷酸序列是SEQ ID NO:68,并且相应氨基酸序列是SEQ ID NO:69。
在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Rv1009-Rv2628-Rv3136Nt-Rv2034-Rv3615c(构建体Q;参见表2)。核苷酸序列是SEQ ID NO:70(插入的BamHI、EcoRI、SacI和HindIII限制性位点加粗),并且相应氨基酸序列是SEQ ID NO:71。
在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Rv2628-Rv3136Nt-Rv1009-Rv2034-Rv3615c(构建体R;参见表2)。核苷酸序列是SEQ ID N O:72(插入的BamHI、EcoRI、SacI和HindIII限制性位点加粗),并且相应氨基酸序列是SEQ ID NO:73。
在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Rv2628-Rv3136Nt-Rv2034-Rv3615c-Rv1009(构建体S;参见表2)。核苷酸序列是SEQ ID N O:74(插入的BamHI、EcoRI、SacI和HindIII限制性位点加粗),并且相应氨基酸序列是SEQ ID NO:75。
表2
任何Mtb抗原(包括本文所述的任何融合蛋白内的任何Mtb抗原)可具有与表1和2中列出的特定氨基酸序列100%或70%至99.9%相同的氨基酸序列。任何单独Mtb抗原(包括本文所述的任何融合蛋白内的任何Mtb抗原)的氨基酸序列可与表1和2中列出的特定氨基酸序列至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同。关于氨基酸或核苷酸序列的同一性或相似性在本文中定义为在比对所述序列并且如果必要引入空位以实现最大序列同一性百分比后,特定Mtb抗原中与表1和2中所示的Mtb抗原的氨基酸或核苷酸序列相同(即,相同残基)的氨基酸残基(或视情况而定的核苷酸残基)的百分比。序列同一性百分比可通过例如使用Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.,1981,2,482-489)的算法的Gap程序(Wisconsin SequenceAnalysis Package,Version 8for Unix,Genetics Computer Group,UniversityResearch Park,Madison WI)使用默认设置来测定。以同一性%计算的任何氨基酸数目可根据具体情况向上或向下舍入到最接近的整数。
任何Mtb抗原(包括本文所述的任何融合蛋白内的任何Mtb抗原)可以是表1中列出的特定氨基酸序列的片段。任何单独Mtb抗原(包括本文所述的任何融合蛋白内的任何Mtb抗原)的氨基酸序列可缺失构成表1中列出的特定氨基酸序列的至少20%、至少15%、至少10%、至少5%、至少4%、至少3%、至少2%或至少1%的连续氨基酸。省略的连续氨基酸可来自抗原的C-末端或N-末端部分。或者,省略的连续氨基酸可来自抗原的内部部分,因此至少保留所述抗原的其C-末端和N-末端氨基酸。
与表1中列出的特定氨基酸序列相比,任何Mtb抗原(包括本文所述的任何融合蛋白内的任何Mtb抗原)可具有一个或多个氨基酸添加、缺失或取代。与表1中列出的特定氨基酸序列相比,任何单独Mtb抗原(包括本文所述的任何融合蛋白内的任何Mtb抗原)可具有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个或至少十二个氨基酸添加、缺失或取代。与表1中列出的特定氨基酸序列相比,任何单独Mtb抗原(包括本文所述的任何融合蛋白内的任何Mtb抗原)可具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个氨基酸添加、缺失或取代。氨基酸添加、缺失或取代可在Mtb抗原内的任何氨基酸位置发生。
当特定Mtb抗原(包括本文所述的任何融合蛋白内的任何Mtb抗原)包含至少一个或多个取代时,所述一个或多个取代的氨基酸可各自独立地是任何天然存在的氨基酸或任何非天然存在的氨基酸。因此,特定Mtb抗原可包含为天然存在的氨基酸的一个或多个氨基酸取代和/或为非天然存在的氨基酸的一个或多个氨基酸取代。单独氨基酸取代选自以下中的任一种:1)具有非极性侧链的氨基酸组,例如Ala、Cys、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Val;2)具有带负电荷的侧链的氨基酸组,例如Asp、Glu;3)具有带正电荷的侧链的氨基酸组,例如Arg、His、Lys;以及4)具有不带电荷的极性侧链的氨基酸组,例如,Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr,其中添加了Cys、Gly、Met和Phe。本文考虑了用同一类别的另一成员取代一种类别的成员。天然存在的氨基酸包括例如,丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。非天然存在的氨基酸包括例如,正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其他氨基酸残基类似物,诸如Ellman等人,Meth.Enzym.,1991,202,301-336中所描述的那些。为产生此类非天然存在氨基酸残基,可使用Noren等人,Science,1989,244,182和Ellman等人,同上的程序。简言之,这些程序涉及用非天然存在氨基酸残基化学活化抑制因子tRNA,接着体外转录和翻译RNA。
如本文所述进行修饰的Mtb抗原(包括本文所述的任何融合蛋白中的任何Mtb抗原)保留其引发针对结核分枝杆菌的免疫应答的能力。也就是说,特定Mtb抗原(包括本文所述的任何融合蛋白内的任何Mtb抗原)的修饰仍将允许所得Mtb抗原或包含所述Mtb抗原的融合蛋白引发针对结核分枝杆菌的免疫应答。
本公开还提供了编码本文所述的任何融合蛋白的核酸分子,所述融合蛋白包含至少三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原。本文以及表1和2中描述的核酸分子是代表性的。表1中列举的特定序列仅是可编码融合蛋白内的特定Mtb抗原的核酸分子的一个实例。具有遗传密码知识的本领域技术人员可常规地制备和设计编码同一Mtb抗原的大量核酸分子。任何特定核酸分子的长度和核苷酸含量由编码的Mtb抗原的所需氨基酸序列决定。表1和2中所示的核酸分子序列是DNA,尽管也考虑了RNA核酸分子。
本公开还提供了编码任何Mtb抗原(包括本文所述的任何融合蛋白内的Mtb抗原,包括本文所述的任何修饰型式)的载体。所述载体可能能够以在哺乳动物中有效引发免疫应答的量在哺乳动物的细胞中表达Mtb抗原。所述载体可以是重组的。所述载体可包含编码所述抗原的异源核酸。所述载体可以是质粒。在一些实施方案中,所述质粒是DNA质粒,如pVAX主链载体。所述载体可适用于用编码Mtb抗原的核酸来转染细胞,所述转化的宿主细胞在其中发生抗原表达的条件下培养并维持。
在一些实施方案中,编码序列可针对稳定性和高水平的表达进行优化。在一些情况下,选择密码子来减少RNA二级结构的形成,如由于分子内键而形成的二级结构。
在一些实施方案中,所述载体可包含用于核酸的编码序列的基因表达的调控元件。所述调控元件可以是启动子、增强子、起始密码子、终止密码子或聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中,所述载体可包含编码Mtb抗原的异源核酸,并且还可包含在抗原编码序列上游的起始密码子和在抗原编码序列下游的终止密码子。起始密码子和终止密码子与抗原编码序列同框。
所述载体还可包含可操作地连接至抗原编码序列的启动子。可操作地连接至Mtb抗原编码序列的启动子可以是来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼(Moloney)病毒启动子、鸟类白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子如CMV立即早期启动子、爱巴二氏(Epstein Barr)病毒(EBV)启动子或劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子等。所述启动子还可以是来自人基因的启动子,所述人基因如人肌动蛋白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白。所述启动子还可以是组织特异性启动子,如天然或合成的肌肉或皮肤特异性启动子。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、乳糖操纵基因启动子、tac启动子、分枝杆菌Hsp60启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子和CMVIE启动子。
载体还可包含聚腺苷酸化信号,其可位于抗原编码序列的下游。所述聚腺苷酸化信号可以是SV40聚腺苷酸化信号、LTR聚腺苷酸化信号、CMV聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)聚腺苷酸化信号或人β-球蛋白聚腺苷酸化信号。所述SV40聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4载体(Invitrogen,San Diego,CA)的聚腺苷酸化信号。
所述载体还可包含在共有BoNT-A、BoNT-B、BoNT-E和BoNT-F抗原序列上游的增强子。增强子可以是DNA表达所必需的。所述增强子可以是人肌动蛋白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或病毒增强子,如来自CMV、HA、RSV或者EBV的一种增强子。多核苷酸功能增强子描述于美国专利号5,593,972、5,962,428以及WO94/016737中。
所述载体还可包含哺乳动物复制起点,以便将载体维持在染色体外并在细胞中产生载体的多个拷贝。所述载体可以是来自Invitrogen(San Diego,CA)的pVAX1、pCEP4或者pREP4,其可包含爱巴二氏病毒复制起点和核抗原EBNA-1编码区域,这可在没有整合的情况下产生高拷贝附加型复制。所述载体可以是具有变化的pVAX1或者pVax1变体,如本文所述的变体质粒。所述变体pVax1质粒是主链载体质粒pVAX1(Invitrogen,Carlsbad CA)的2998碱基对变体。所述CMV启动子位于碱基137-724处。T7启动子/引发位点位于碱基664-683处。多克隆位点位于碱基696-811处。牛GH聚腺苷酸化信号位于碱基829-1053处。卡那霉素(Kanamycin)抗性基因位于碱基1226-2020处。pUC起点位于碱基2320-2993处。
所述载体还可包含调控序列,所述调控序列可非常适合在施用所述载体的哺乳动物或人细胞中的基因表达。共有编码序列可包含密码子,所述密码子可允许在宿主细胞中更有效地转录编码序列。
所述载体可以是pSE420(Invitrogen,San Diego,Calif.)或pET28b(EMDMillipore,Billerca,Mass.),其可用于在大肠埃希氏菌(E.coli)中产生蛋白质。所述载体可以是pYES2(Invitrogen,San Diego,Calif.),其可用于在酵母的酿酒酵母菌株中产生蛋白质。所述载体还可以具有MAXBACTM完整的杆状病毒表达系统(Invitrogen,San Diego,Calif.),其可用于在昆虫细胞中产生蛋白质。所述载体还可以是pcDNA I或者pcDNA3(Invitrogen,San Diego,Calif.),其可用于在哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生蛋白质。所述载体可以是通过常规技术和容易可得的起始材料来产生蛋白质的表达载体或系统,所述技术和起始材料包括Sambrook等人,Molecular Cloning and LaboratoryManual,第2版,Cold Spring Harbor(1989)。
在其他实施方案中,所述载体是病毒载体。合适的病毒载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体(例如像痘苗病毒载体)、副粘病毒载体、禽痘病毒载体、减毒黄热病载体(例如像YFV-17D)、甲病毒载体、逆转录病毒载体(例如像慢病毒载体)、仙台病毒载体和巨细胞病毒(CMV)载体。合适的腺病毒载体包括但不限于腺病毒4、腺病毒5、黑猩猩腺病毒3、黑猩猩腺病毒63和黑猩猩腺病毒68。合适的痘苗病毒载体包括但不限于修饰的痘苗安卡拉(MVA)。合适的副粘病毒载体包括但不限于修饰的副流感病毒(PIV2)和重组人副流感病毒(rHPIV2)。合适的CMV载体包括但不限于恒河猴猕猴CMV(RhCMV)载体和人CMV(HCMV)载体。在一些实施方案中,所述载体存在于包含药学上可接受的载体的组合物中。本领域技术人员容易地熟悉许多载体,所述载体中的许多是可商购的。
在一些实施方案中,所述载体是非病毒载体。在一些实施方案中,所述非病毒载体是RNA,如mRNA。在一些实施方案中,所述mRNA是鱼精蛋白复合的mRNA,其中所述Mtb抗原或融合蛋白由所述mRNA编码,并且所述鱼精蛋白复合物提供强烈的免疫刺激信号。示例性mRNA载体平台是(CureVac Inc)。
本公开还提供了宿主细胞,所述宿主细胞包含本文公开的核酸分子或载体中的任一种。所述宿主细胞可用于例如表达Mtb抗原或其片段。所述Mtb抗原或其片段也可在体内细胞中表达。进行转化(例如,转染)以产生Mtb抗原或其片段的宿主细胞可以是永生化的哺乳动物细胞系,如淋巴来源的那些细胞系(例如,骨髓瘤、杂交瘤、三源杂交瘤或四源杂交瘤细胞系)。所述宿主细胞还可包括通过用病毒(例如,埃-巴二氏病毒)转化而永生化的正常淋巴样细胞,如B细胞。
在一些实施方案中,所述宿主细胞包括但不限于:细菌细胞,如大肠埃希氏菌、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、链霉菌属物种(Streptomyces species)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium);酵母细胞,如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica);昆虫细胞系,如来自草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)的那些(例如,Sf9和Sf21细胞系,以及expresSFTM细胞(Protein SciencesCorp.,Meriden,CT,USA)),果蝇属(Drosophila)S2细胞和High 细胞中的粉纹夜蛾属(Trichoplusia)(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA);以及哺乳动物细胞,如COS1和COS7细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0骨髓瘤细胞、NIH 3T3细胞、293细胞、Procell92S、perC6、HEPG2细胞、HeLa细胞、L细胞、HeLa、MDCK、HEK293、WI38、鼠ES细胞系(例如,来自菌株129/SV、C57/BL6、DBA-1、129/SVJ)、K562、Jurkat细胞和BW5147。其他有用的哺乳动物细胞系是众所周知的并且可从美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)(Manassas,VA,USA)和CoriellCell Repositories(Camden,NJ,USA)的美国国立综合医学科学研究所(NIGMS)人类遗传细胞库中容易地获得。在一些实施方案中,所述细胞是重组BCG。这些细胞类型仅具有代表性,并且不意味着是详尽列表。
在其他考虑因素中,其中一些如上所述,可针对其以所需方式加工所表达的Mtb抗原或其片段的能力选择宿主细胞株。多肽的翻译后修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、羧基化、磷酸化、脂化和酰化,并且本公开的一个方面是提供具有这些翻译后修饰中的一种或多种的其Mtb抗原。
在一些实施方案中,所述重组BCG已进行遗传工程改造以表达功能性溶内体蛋白质,所述蛋白质在接近中性的pH值(例如约pH 6-8或约6.5至7.5)下具有生物活性。溶内体蛋白质在含有分枝杆菌的内体中是活性的,其通常具有接近中性的内部pH。由rBCG产生的溶内体蛋白质的活性导致内体的破坏,从而允许rBCG从内体逃逸并进入细胞的细胞质中。
在一些实施方案中,通过遗传工程改造引入rBCG中的溶内体蛋白质是来自产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的产气荚膜梭菌溶素(Perfringolysin)O(PfoA)或其突变体,如PfoAG137Q,如WO2007/058663中所描述。
在一些实施方案中,分枝杆菌是减毒的,如由BCG所例示。然而,本领域技术人员将认识到存在其他减毒和非减毒的分枝杆菌,其也适用于本文。另外类型的分枝杆菌的实例包括但不限于结核分枝杆菌菌株CDC1551、结核分枝杆菌菌株Beijing、结核分枝杆菌菌株H37Ra(ATCC#:25177)、结核分枝杆菌菌株H37Rv(ATCC#:25618)、牛分枝杆菌(M.bovis)(ATCC#:19211和27291)、偶然分枝杆菌(M.fortuitum)(ATCC#:15073)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)(ATCC#:12051和12549)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)(ATCC#:35772和13209)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)(ATCC#:21982和35775)、鸟分枝杆菌(M.avium)(ATCC#:19421和25291)、鸡分枝杆菌(M.gallinarum)(ATCC#:19711)、母牛分枝杆菌(M.vaccae)(ATCC#:15483和23024)、麻风分枝杆菌(M.leprae)(ATCC#:)、海洋分枝杆菌(M.marinarum)(ATCC#:11566和11567)以及田鼠分枝杆菌(M.microtti)(ATCC#:11152)。
减毒分枝杆菌菌株的实例包括但不限于,结核分枝杆菌泛酸营养缺陷型菌株、结核分枝杆菌rpoV突变体菌株、结核分枝杆菌亮氨酸营养缺陷型菌株、BCG丹麦菌株(ATCC#35733)、BCG日本菌株(ATCC#35737)、BCG芝加哥菌株(ATCC#27289)、BCG哥本哈根菌株(ATCC#:27290)、BCG巴斯德菌株(ATCC#:35734)、BCG葛兰素菌株(ATCC#:35741)、BCG康诺特菌株(ATCC#35745)、BCG蒙特利尔(ATCC#35746)、BCG1331菌株、BCG东京菌株、BCG莫罗菌株、BCG-巴斯德地区和BCG莫斯科菌株。
在一些实施方案中,包含一种或多种载体的细胞存在于包含药学上可接受的载体的组合物内。
在一些实施方案中,所述Mtb抗原或其片段用可检测标记物标记。可检测标记物包括但不限于放射性同位素(如P32何S35)、酶(如辣根过氧化物酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(β-gal)等)、荧光染料、发色团、胶体金、染料和生物素。标记的Mtb抗原或其片段可用于在多种细胞或组织类型中进行诊断程序。对于体外或体内的成像程序,所述Mtb抗原可用另外的剂标记,如NMR造影剂、X射线造影剂或量子点。用于使可检测剂连接至多肽的方法是本领域中已知的。所述Mtb抗原也可连接至不溶性载体(如珠粒、玻璃或塑料载玻片等)上。
在一些实施方案中,所述Mtb抗原或其片段可与治疗剂缀合,所述治疗剂包括但不限于放射性同位素(如111In或90Y)、毒素(如破伤风类毒素或蓖麻毒素)、类毒素和化学治疗剂。
在一些实施方案中,所述Mtb抗原或其片段可与成像剂缀合。成像剂包括例如,标记部分(如生物素、荧光部分、放射性部分、组氨酸标签或其他肽标签)以便于分离或检测。
本公开还提供了组合物,所述组合物包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原。在一些实施方案中,所述至少两种或三种Mtb抗原不存在于融合蛋白中。在一些实施方案中,所述至少两种或三种Mtb抗原呈蛋白质形式并且不是编码所述Mtb抗原的核酸分子。
在一些实施方案中,所述Mtb抗原是Rv1009、Rv3136、Rv3615c、Rv2628、Rv2034、Rv3136N-末端、Ag85A、Ag85B(也称为Rv1886c)、Rv3407、Rv1733、Rv2626c、RpfA、RpfC或RpfD。在一些实施方案中,所述组合物包含至少两种Mtb抗原。在一些实施方案中,所述组合物包含Rv1733和Rv2626c Mtb抗原。在一些实施方案中,所述组合物包含至少三种Mtb抗原。在一些实施方案中,所述组合物包含Rv1009、Rv3615c和Rv3136Mtb抗原。在一些实施方案中,所述组合物包含Rv1009、Rv2034和Rv3136Mtb抗原。在一些实施方案中,所述组合物包含Ag85A、Ag85B和Rv3407Mtb抗原。在一些实施方案中,所述组合物包含RpfA、RpfC和RpfD Mtb抗原。在一些实施方案中,所述组合物包含至少四种Mtb抗原。在一些实施方案中,所述组合物包含Rv1009、Rv2628、Rv3615c和Rv3136Mtb抗原。在一些实施方案中,所述组合物包含Rv1009、Rv3615c、Rv2034和Rv2628Mtb抗原。在一些实施方案中,所述组合物包含Rv2034、Rv3615c、Rv2628和Rv3136Mtb抗原。在一些实施方案中,所述组合物包含至少五种Mtb抗原。在一些实施方案中,所述组合物包含Rv1009、Rv2034、Rv2628、Rv3615c和Rv3136Mtb抗原。在一些实施方案中,所述组合物包含Rv1009、Rv3136Nt、Rv2628、Rv2034和Rv3615c Mtb抗原。在一些实施方案中,所述组合物还包含药学上可接受的载体。
本公开还提供了组合物,所述组合物包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原,其中所述组合物包含至少一种编码所述Mtb抗原中的至少一种的核酸分子。在一些实施方案中,所述组合物包含呈蛋白质形式的一种Mtb抗原和一种或两种编码两种Mtb抗原的核酸分子。在一些实施方案中,所述组合物包含呈蛋白质形式的两种Mtb抗原(任选地作为融合蛋白)和一种编码一种Mtb抗原的核酸分子。因此,本发明的组合物是一种或多种蛋白质Mtb抗原和一种或多种编码一种或多种Mtb抗原的核酸分子的混合物。
在一些实施方案中,至少两种Mtb抗原由一种或多种载体内的一种或多种核酸分子编码。在一些实施方案中,所述一种或多种载体是一种或多种病毒载体。在一些实施方案中,所述一种或多种病毒载体是以下中的一种或多种:腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体(例如像痘苗病毒载体)、副粘病毒载体、禽痘病毒载体、减毒黄热病载体(例如像YFV-17D)、甲病毒载体、逆转录病毒载体(例如像慢病毒载体)、仙台病毒载体和CMV载体。在一些实施方案中,所述腺病毒载体是腺病毒4、腺病毒5、黑猩猩腺病毒3、黑猩猩腺病毒63或黑猩猩腺病毒68。在一些实施方案中,所述痘苗病毒载体是MVA。在一些实施方案中,所述副粘病毒载体是PIV2或rHPIV2。在一些实施方案中,所述CMV载体是RhCMV载体或HCMV载体。在一些实施方案中,所述载体存在于包含药学上可接受的载体的组合物中。在一些实施方案中,所述至少两种Mtb抗原由与融合蛋白相同的表达载体内的单个核酸分子编码。在一些实施方案中,所述一种或多种载体是非病毒载体。在一些实施方案中,所述非病毒载体是RNA,如mRNA。在一些实施方案中,所述mRNA是鱼精蛋白复合的mRNA。示例性mRNA载体平台是(CureVac Inc)。
在一些实施方案中,当rBCG用作媒介物以递送Mtb抗原、或融合蛋白、或包含或编码所述Mtb抗原的核酸和或载体时,Dos R调节子的全部或部分的表达未在rBCG中上调。在一些实施方案中,以下Dos R调节子抗原中的一种或多种未在rBCG中上调:Rv1738、Rv2623、Rv2031c、Rv2032、Rv2626c、Rv2005c、Rv3127、Rv1733c、Rv1996、Rv2628c、Rv0079、Rv3130c、Rv3131、Rv1813c、Rv2006、Rv2029c、Rv2627c、Rv2030c、Rv3132c以及Rv2629。在一些实施方案中,所述rBCG不包含以下各项的上调:1)一种或多种Mtb抗原,包括“经典”Mtb抗原,如85A、
85B和TB 10.4;2)选自Rv0867c、Rv1009、Rv1884c、Rv2389c、Rv2450c、Rv0288、Rv1009、Rv0685、Rv0824c、Rv1349、Rv2744c、Rv3347c、Rv1130和Rv1169c的至少一种Mtb复活抗原。在一些实施方案中,所述rBCG不包括以下组合的表达:经典抗原Rv1886c、Rv3804c;
复活抗原Rv0867c、Rv1884c、Rv2389c;以及Mtb特异性抗原Rv3407。在一些实施方案中,所述rBCG不包括以下组合的表达:Rv3804c、Rv1886c和Rv3407,或者与Rv3133c一起,以及与Rv0867c、Rv1884c和Rv2389c的组合。在一些实施方案中,所述rBCG不包括以下组合的表达:TB10.4、Ag85B、Ag85A和Rv3407。在一些实施方案中,所述细胞不是rBCG。
本公开还提供了组合物,所述组合物包含融合蛋白、Mtb抗原、编码Mtb抗原的核酸分子(包括其融合蛋白)、细胞和/或载体)中的任何一种或多种和药学上可接受的载体。组合物包括例如药物组合物。药学上可接受的载体是指通常用于施用活性成分的药物制剂的至少一种组分。因此,载体可含有本领域中使用的任何药物赋形剂和任何形式的用于施用的媒介物。载体包括但不限于磷酸盐缓冲盐水、生理盐水、水、柠檬酸盐/蔗糖/吐温制剂和乳液,例如像油/水乳液。
所述组合物还可包含活性治疗剂和各种其他药学上可接受的组分。参见Remington’s Pharmaceutical Science(第15版,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania(1980))。所需的形式取决于预期的施用模式和治疗应用。所述组合物还可根据所需制剂包含药学上可接受的无毒载体或稀释剂,所述载体或稀释剂被定义为通常用于配制用于动物或人施用的药物组合物的媒介物。选择稀释剂以免影响组合的生物活性。此类稀释剂的实例包括但不限于蒸馏水、生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和汉克氏溶液。此外,所述药物组合物或制剂还可包含其他载体、佐剂或无毒非治疗性非免疫原性稳定剂等。
用于口服施用的组合物的固体制剂可含有合适的载体或赋形剂,如玉米淀粉、明胶、乳糖、阿拉伯胶、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸二钙、碳酸钙、氯化钠或海藻酸。可使用的崩解剂包括但不限于微晶纤维素、玉米淀粉、羟基乙酸淀粉钠和海藻酸。可使用的片剂粘合剂包括阿拉伯胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮(PovidoneTM)、羟丙基甲基纤维素、蔗糖、淀粉和乙基纤维素。可使用的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、硅油、滑石、蜡、油和胶体二氧化硅。另外的赋形剂包括例如,着色剂、掩味剂、助溶剂、悬浮剂、压缩剂、肠溶包衣、持续释放助剂等。
在一些实施方案中,所述组合物可以储库注射液或植入制剂的形式施用,所述储库注射液或植入制剂可以允许持续释放的这样一种方式配制。示例性组合物包含在水性缓冲液中配制的本文所述的组合物中的任何一种或多种。
在一些实施方案中,在水或其他水性媒介物中制备的用于口服施用的药物组合物的液体制剂可含有各种悬浮剂,如甲基纤维素、藻酸盐、黄芪胶、果胶、藻胶钠(kelgin)、角叉菜胶、阿拉伯胶、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇。药物组合物的液体制剂还可包括含有润湿剂、甜味剂以及着色剂和调味剂连同一种或多种活性化合物的溶液、乳液、糖浆和酏剂。所述药物组合物的各种液体和粉末制剂可通过常规方法制备以用于吸入待治疗的哺乳动物的肺部中。
在一些实施方案中,用于注射的药物组合物的液体制剂可包含各种载体,如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇、多元醇例如像甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等。在一些实施方案中,所述组合物包含柠檬酸盐/蔗糖/吐温载体。对于静脉内注射,可通过滴注方法施用水溶性形式的组合物,由此输注含有抗真菌剂和生理学上可接受的赋形剂的药物制剂。生理学上可接受的赋形剂可包括例如5%葡萄糖、0.9%盐水、林格氏溶液或其他合适的赋形剂。可于水性基质或药学上可接受的油基质(如长链脂肪酸的酯,例如像油酸乙酯)中的悬浮液形式制备并施用组合物的合适的不溶性形式。
所述组合物可以是例如,可注射溶液、水性悬浮液或溶液、非水性悬浮液或溶液、固体和液体口服制剂、药膏、凝胶、软膏、皮内贴剂、乳膏、气雾剂、洗剂、片剂、胶囊、持续释放制剂等。在一些实施方案中,对于局部应用,可将药物组合物配制成合适的软膏。在一些实施方案中,局部半固体软膏制剂通常在载体(如药物乳膏基质)中包含约1%至20%或5%至10%的活性成分的浓度。用于局部使用的组合物的制剂的一些实例包括但不限于含有活性成分和各种载体和媒介物的滴剂、酊剂、洗剂、乳膏、溶液和软膏。
通常,组合物被制备为呈液体溶液或悬浮液形式的可注射物;也可制备适于在注射之前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式。制剂也可于脂质体或微粒(如聚丙交酯、聚乙交酯或共聚物)中乳化或囊封以获得增强的佐剂作用(参见Langer,Science,1990,249,1527和Hanes,Advanced Drug Delivery Reviews,1997,28,97)。还可制备无菌可注射制剂,例如像无菌可注射水性或油性悬浮液。这种悬浮液可根据本领域中已知的技术,使用合适的分散剂、润湿剂和悬浮剂来配制。在一些实施方案中,所述药物组合物可在微囊化装置中递送,以减少或预防针对蛋白质的宿主免疫应答。
在一些实施方案中,本文所述的Mtb抗原、构建体、载体或细胞或包含所述Mtb抗原、构建体、载体或细胞的组合物可组合成单一治疗或预防方案。例如,在一些实施方案中,抗原匹配的BCG可与重组蛋白疫苗组合或一起使用。
在一些实施方案中,本文所述的Mtb抗原、构建体、载体或细胞或包含所述Mtb抗原、构建体、载体或细胞的组合物可作为气雾剂施用于哺乳动物。在一些实施方案中,气雾剂接种物包含盐水。常规的气雾剂递送装置包括但不限于加压计量剂量吸入器(pMDI)和干粉吸入器(DPI)(两者都递送干粉末制剂);以及雾化器如PARI eFlow装置,所述装置递送呈细雾形式的水性剂量。在一些实施方案中,气雾剂递送装置是连接至递送面罩的ParieFlow便携式电子气雾剂递送平台。在一些实施方案中,平均粒度是约1μm至约10μm、约1μm至约5μm、约3μm至约5μm、约4μm至约5μm或约3.9μm至约4.9μm。在一些实施方案中,气雾剂的体积是约0.1ml至约5ml、约0.1ml至约2ml、约0.1ml至约1.5ml、约0.5ml至约1.5ml、约0.5ml至约1.2ml、约0.7ml至约1.2ml或约1ml。
用于治疗病状的本公开的组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化,所述因素包括施用方式、靶位点、受试者的生理状态、受试者为人还是动物、所施用的其他药物和治疗为预防性还是治疗性。通常,受试者是人,但是也可治疗非人哺乳动物,包括转基因哺乳动物。
在一些实施方案中,所述组合物可通过使用标准方法通过静脉内、皮下、腹膜内、肌内、髓内、脑室内、脑膜内、动脉内、血管内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、脊柱内、肿瘤内、颅内、肠内、肺部、透粘膜、子宫内、舌下或在炎症或肿瘤生长部位局部注射施用于受试者。或者,所述组合物可通过包括口服、经鼻、眼部、直肠或局部的途径施用于受试者。最典型的施用途径是血管内、皮下或肌内,但其他途径可以是有效的。在一些实施方案中,组合物以持续释放组合物或装置(如MedipadTM装置)的形式施用。所述组合物还可经由呼吸道施用,例如使用干粉吸入装置、雾化器或计量剂量吸入器。所述组合物还可通过传统注射器、无针注射装置、“微粒轰击基因枪”或其他物理方法诸如电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”或超声施用。
在一些实施方案中,所述组合物可通过持续释放施用、通过诸如在手术期间直接施加的可侵蚀植入物的储库注射液或通过将输注泵或生物相容性持续释放植入物植入受试者中的方式施用于受试者。或者,所述组合物可通过可注射储库施用途径,如通过使用1个月、3个月或6个月的储库可注射或生物可降解的材料和方法,或通过向受试者的皮肤施加含有所述组合物的透皮贴剂并使所述贴剂与受试者的皮肤接触通常每片贴剂1至5小时来施用于受试者。
在一些实施方案中,所述组合物包含约1纳克至约10mg的核酸。在一些实施方案中,所述组合物包含:1)至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克,或至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95,100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克,或至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg或更多;以及2)至多且包括15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克,或至多且包括1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95,100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克,或至多且包括1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg。
在一些实施方案中,所述组合物包含约5纳克至约10mg的核酸分子。在一些实施方案中,所述组合物包含约25纳克至约5mg的核酸分子。在一些实施方案中,所述组合物含有约50纳克至约1mg的核酸分子。在一些实施方案中,所述组合物含有约0.1至约500微克的核酸分子。在一些实施方案中,所述组合物含有约1至约350微克的核酸分子。在一些实施方案中,所述组合物含有约5至约250微克的核酸分子。在一些实施方案中,所述组合物含有约10至约200微克的核酸分子。在一些实施方案中,所述组合物含有约15至约150微克的核酸分子。在一些实施方案中,所述组合物含有约20至约100微克的核酸分子。在一些实施方案中,所述组合物含有约25至约75微克的核酸分子。在一些实施方案中,所述组合物含有约30至约50微克的核酸分子。在一些实施方案中,所述组合物含有约35至约40微克的核酸分子。在一些实施方案中,所述组合物含有约100至约200微克的核酸分子。在一些实施方案中,所述组合物包含约10至约100微克的核酸分子。在一些实施方案中,所述组合物包含约20至约80微克的核酸分子。在一些实施方案中,所述组合物包含约25至约60微克的核酸分子。在一些实施方案中,所述组合物包含约30纳克至约50微克的核酸分子。在一些实施方案中,所述组合物包含约35纳克至约45微克的核酸分子。在一些实施方案中,所述组合物含有约0.1至约500微克的核酸分子。在一些实施方案中,所述组合物含有约1至约350微克的核酸分子。在一些实施方案中,所述组合物含有约25至约250微克的核酸分子。在一些实施方案中,所述组合物含有约100至约200微克的核酸分子。
在一些实施方案中,本文所述的递送平台可以单独单一施用使用或者作为匹配的抗原初免-加强方法组合使用。此外,在单一载体系统中使用这些抗原,所述载体系统被设想作为抗原匹配的引发用于用上述任何模式加强,包括蛋白质、病毒载体、核酸等。例如,相同的Mtb抗原构建体可用作初免和加强两者。在其他实施方案中,第一Mtb抗原构建体可用作初免,并且第二不同的Mtb抗原构建体可用作加强(即,异源初免-加强)。在一些实施方案中,初免是DNA或RNA(如mRNA)初免,并且加强是病毒载体加强。在一些实施方案中,初免是病毒载体初免,并且加强是DNA或RNA(如mRNA)加强。
可根据待使用的施用模式来配制组合物。在组合物为可注射药物组合物的情况下,它们是灭菌、无致热原和无颗粒的。可使用等渗制剂。一般来说,用于等渗性的添加剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情况下,等渗溶液如磷酸缓冲盐水是合适的。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方案中,将血管收缩剂添加到制剂中。
所述组合物还可包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是作为媒介物、佐剂、载体或稀释剂的功能分子。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂,其可包括表面活性剂如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰基脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物、囊泡如角鲨烯和角鲨烷、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子或其他已知的转染促进剂。
转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子,包括聚-L-谷氨酸(LGS)或脂质。转染促进剂是聚-L-谷氨酸,并且更合适地,聚-L-谷氨酸以小于6mg/ml的浓度存在于组合物中。转染促进剂还可包括表面活性剂如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰酯A)、胞壁肽、醌类似物和囊泡如角鲨烯和角鲨烷,并且透明质酸也可与遗传构建体结合施用。在一些实施方案中,质粒组合物还可包含转染促进剂如脂质、脂质体,包括卵磷脂脂质体或本领域中已知的其他脂质体,如DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640)、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒,或其他已知的转染促进剂。在一些实施方案中,转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子,包括聚-L-谷氨酸(LGS)或脂质。转染剂在所述组合物中的浓度是小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。
药学上可接受的赋形剂可以是佐剂。佐剂可以是在替代质粒中表达或以蛋白质形式与以上质粒组合递送的其他基因。佐剂可选自由以下组成的组:α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达的趋化因子(TECK)、粘膜相关的上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86(包括缺失信号序列并任选地包含来自IgE的信号肽的IL-15)。佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。
可以是有用的佐剂的其他基因包括编码以下的那些:MCP-1、MIP-la、MIP-1p、IL-8、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、失活NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素反应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及其功能片段。
本公开还提供了包含本文所述的Mtb抗原、其片段、融合蛋白、核酸分子、载体或细胞的药盒。所述药盒可包括例如一个或多个容器、一个或多个包装或一个或多个分配器以及用于施用或使用的标签和说明书。
本公开还提供了在哺乳动物中引发针对结核分枝杆菌的免疫应答的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用免疫学上足够量的一种或多种融合蛋白,所述融合蛋白包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原。可施用本文所述的任何融合蛋白。在一些实施方案中,所述融合蛋白包含至少三种Mtb抗原。在一些实施方案中,所述融合蛋白包含至少四种Mtb抗原。在一些实施方案中,所述融合蛋白包含至少五种Mtb抗原。
本公开还提供了在哺乳动物中引发针对结核分枝杆菌的免疫应答的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用免疫学上足够量的组合物,所述组合物包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原和药学上可接受的载体。可施用包含两种或更多种Mtb抗原的组合物中的任一种。在一些实施方案中,所述组合物包含至少三种Mtb抗原。在一些实施方案中,所述组合物包含至少四种Mtb抗原。在一些实施方案中,所述组合物包含至少五种Mtb抗原。
本公开还提供了在哺乳动物中引发针对结核分枝杆菌的免疫应答的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用免疫学上足够量的组合物,所述组合物包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原和药学上可接受的载体;其中所述组合物包含至少一种编码所述Mtb抗原中的至少一种的核酸分子。可施用包含一种或多种Mtb抗原蛋白和编码本文所述的一种或多种Mtb抗原的一种或多种核酸分子的混合物的任何组合物。
本文所述的融合蛋白和组合物可用于治疗或预防结核病。在一些实施方案中,所述方法包括向人施用治疗或预防有效量的本文所述的融合蛋白或组合物中的任一种,以使得减轻或预防结核感染。
在一些实施方案中,所治疗的受试者先前已被诊断为患有结核病。因此,此类受试者将已被诊断为需要这种治疗。或者,所述治疗可意图用于预防尚未患有结核病的受试者的结核感染或用于前往结核病普遍存在的区域的受试者。
可使用标准方法监测患有结核病的受试者的治疗。一些方法需要在施用一定剂量的剂之前确定例如受试者中抗体水平或分布的基线值,并将所述基线值与治疗后的分布或水平的值进行比较。显著增加,例如像大于同一样品的重复测量中的实验误差的典型容限(表示为与所述水平或分布的值的此类测量的平均值的一个标准偏差)表示阳性治疗结果(即,所述剂的施用已经实现了所需应答)。如果免疫应答的值未显著变化或降低,则指示阴性治疗结果。
在其他实施方案中,确定对照群体的水平或分布的对照值,如平均值和标准偏差。通常,对照群体中的个体尚未接受过先前治疗。然后将施用治疗剂后受试者中的水平或分布的测量值与对照值进行比较。相对于对照值的显著增加(如大于平均值的一个标准偏差)表示阳性或足够的治疗结果。缺乏显著增加或减少表明阴性或不足的治疗结果。通常继续施用治疗剂,同时水平相对于对照值增加。如前所述,相对于对照值达到平台期是可停止或减少剂量和/或频率的治疗施用的指标。
在其他实施方案中,水平或分布的对照值(如平均值和标准偏差)是从已经用治疗剂治疗并且其水平或分布已经响应于治疗而平稳的个体的对照群体确定的。将受试者中的水平或分布的测量值与对照值进行比较。如果受试者中的测量水平与对照值没有显著差异(如超过一个标准偏差),则可停止治疗。如果受试者中的水平显著低于对照值,则保证持续施用剂。如果受试者中的水平持续低于对照值,则可指示治疗的变化。
在其他实施方案中,监测目前未接受治疗但已经历前一疗程的受试者的抗体水平或分布,以确定是否需要恢复治疗。可将受试者中测量的水平或分布与前一疗程之后在所述受试者中先前实现的值进行比较。相对于前一测量值的显著降低(如大于同一样品的重复测量中的典型误差容限)是可恢复治疗的指示。或者,可将受试者中测量的值与在经历疗程后的受试者群体中确定的对照值(平均值加标准偏差)进行比较。或者,可将受试者中的测量的值与保持无疾病症状的预防性治疗的受试者群体或显示疾病特征的改善的治疗性治疗的受试者群体中的对照值进行比较。在所有这些情况下,相对于对照水平的显著降低(如超过标准偏差)是治疗应在受试者中恢复的指标。
在一些方法中,在施用前进行受试者中针对给定抗原的抗体的基线测量,此后不久进行第二测量以确定峰值抗体水平,并且间隔进行一次或多次另外测量以监测抗体水平的衰减。当抗体的水平已经下降到基线或减去基线的峰值的预定百分比(如50%、25%或10%)时,施用另外剂量的抗原。在一些实施方案中,将减去背景的峰值或随后测量的水平与先前经确定来构成其他受试者的有益的预防性或治疗性治疗方案的参考水平进行比较。如果测量的抗体水平显著小于参考水平(如小于平均值减去受益于治疗的受试者群体中的参考值的一个标准偏差),则指示另外剂量的抗原的施用。
在一些实施方案中,可通过上述方法治疗的一个或多个受试者是动物,包括哺乳动物和非哺乳动物。合适的哺乳动物包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物(包括大鼠、小鼠、仓鼠和豚鼠)、牛、马、绵羊、獾、负鼠、山羊、猪、狗和猫。在大多数情况下,哺乳动物是人。在一些实施方案中,非哺乳动物是鱼。用本文所述的任何一种或多种疫苗免疫动物可预防人畜共患传播(即疾病如TB从动物传播至人)。
本公开还提供了用于制备用于治疗或预防结核分枝杆菌感染的药物的融合蛋白,其中所述融合蛋白包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原。
本公开还提供了用于治疗或预防结核分枝杆菌感染的药物的融合蛋白,其中所述融合蛋白包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原。
本公开还提供了融合蛋白在制备用于治疗或预防结核分枝杆菌感染的药物中的用途,其中所述融合蛋白包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原。
本公开还提供了融合蛋白在治疗或预防结核分枝杆菌感染中的用途,其中所述融合蛋白包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原。
本公开还提供了用于制备用于治疗或预防结核分枝杆菌感染的药物的组合物,其中所述组合物包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原和药学上可接受的载体。
本公开还提供了用于治疗或预防结核分枝杆菌感染的组合物,其中所述组合物包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原和药学上可接受的载体。
本公开还提供了组合物在制备用于治疗或预防结核分枝杆菌感染的药物中的用途,其中所述组合物包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原和药学上可接受的载体。
本公开还提供了组合物在治疗或预防结核分枝杆菌感染中的用途,其中所述组合物包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原和药学上可接受的载体。
本公开还提供了用于制备用于治疗或预防结核分枝杆菌感染的药物的组合物,其中所述组合物包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原和药学上可接受的载体,其中所述组合物包含至少一种编码所述Mtb抗原中的至少一种的核酸分子。
本公开还提供了用于治疗或预防结核分枝杆菌感染的组合物,其中所述组合物包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原和药学上可接受的载体,其中所述组合物包含至少一种编码所述Mtb抗原中的至少一种的核酸分子。
本公开还提供了组合物在制备用于治疗或预防结核分枝杆菌感染的药物中的用途,其中所述组合物包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原和药学上可接受的载体,其中所述组合物包含至少一种编码所述Mtb抗原中的至少一种的核酸分子。
本公开还提供了组合物在治疗或预防结核分枝杆菌感染中的用途,其中所述组合物包含至少两种或三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原和药学上可接受的载体,其中所述组合物包含至少一种编码所述Mtb抗原中的至少一种的核酸分子。
本公开还提供了本文所述的任何融合蛋白、或本文所述的任何组合物、或本文所述的任何细胞、或本文所述的任何载体、或本文所述的任何方法、或本文描述的任何用途,基本上如参考所附实施例和/或附图所描述的。
提出以下代表性实施方案:
实施方案1.一种组合物或融合蛋白,其包含至少三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原,其中所述Mtb抗原选自Rv1009、Rv3136、Rv3615c、Rv2628、Rv2034和Rv3136N-末端。
实施方案2.根据实施方案1所述的组合物或融合蛋白,其中Rv1009包含SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列。
实施方案3.根据实施方案1所述的组合物或融合蛋白,其中Rv1009由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中列出的核苷酸序列编码。
实施方案4.根据实施方案1所述的组合物或融合蛋白,其中Rv3136包含SEQ IDNO:8中列出的氨基酸序列。
实施方案5.根据实施方案1所述的组合物或融合蛋白,其中Rv3136由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7中列出的核苷酸序列编码。
实施方案6.根据实施方案1所述的组合物或融合蛋白,其中Rv3615c包含SEQ IDNO:11中列出的氨基酸序列。
实施方案7.根据实施方案1所述的组合物或融合蛋白,其中Rv3615c由SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中列出的核苷酸序列编码。
实施方案8.根据实施方案1所述的组合物或融合蛋白,其中Rv2628包含SEQ IDNO:14中列出的氨基酸序列。
实施方案9.根据实施方案1所述的组合物或融合蛋白,其中Rv2628由SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13中列出的核苷酸序列编码。
实施方案10.根据实施方案1所述的组合物或融合蛋白,其中Rv2034包含SEQ IDNO:16中列出的氨基酸序列。
实施方案11.根据实施方案1所述的组合物或融合蛋白,其中Rv2034由SEQ ID NO:15中列出的核苷酸序列编码。
实施方案12.根据实施方案1所述的组合物或融合蛋白,其中Rv3136Nt包含SEQ IDNO:18中列出的氨基酸序列。
实施方案13.根据实施方案1所述的组合物或融合蛋白,其中Rv3136Nt由SEQ IDNO:17中列出的核苷酸序列编码。
实施方案14.根据实施方案1至13中任一项所述的组合物或融合蛋白,其包含至少四种结核分枝杆菌(Mtb)抗原。
实施方案15.根据实施方案1至13中任一项所述的组合物或融合蛋白,其包含至少五种结核分枝杆菌(Mtb)抗原。
实施方案16.根据实施方案1所述的组合物或融合蛋白,其包含:Rv1009、Rv3615c和Rv3136Mtb抗原;Rv1009、Rv2034和Rv3136Mtb抗原;Rv1009、Rv3615c和Rv3136Mtb抗原;Rv1009、Rv2628、Rv3615c和Rv3136Mtb抗原;Rv1009、Rv3615c、Rv2034和Rv2628Mtb抗原;Rv2034、Rv3615c、Rv2628和Rv3136Mtb抗原;Rv1009、Rv2034、Rv2628、Rv3615c和Rv3136Mtb抗原;Rv1009、Rv3136Nt、Rv2628、Rv2034和Rv3615c Mtb抗原;或Rv2034、Rv3615c、Rv3136Nt、Rv2628和Rv1009Mtb抗原。
实施方案17.根据实施方案16所述的组合物或融合蛋白,其中:Rv1009包含SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列;Rv3136包含SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列;Rv3615c包含SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列;Rv2628包含SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列;Rv2034包含SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列;并且Rv3136Nt包含SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列。
实施方案18.根据实施方案16所述的组合物或融合蛋白,其中:Rv1009由SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3中列出的核苷酸序列编码;Rv3136由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQID NO:7中列出的核苷酸序列编码;Rv3615c由SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中列出的核苷酸序列编码;Rv2628由SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13中列出的核苷酸序列编码;Rv2034由SEQ ID NO:15中列出的核苷酸序列编码;并且Rv3136Nt由SEQ ID NO:17中列出的核苷酸序列编码。
实施方案19.根据实施方案1所述的融合蛋白,其包含:Rv1009-Rv3615c-Rv3136;Rv1009-Rv2034-Rv3136;Rv1009-Rv2628-Rv3615c-Rv3136;Rv1009-Rv2034-Rv2628-Rv3615c-Rv3136;Rv2034-Rv1009-Rv3136;Rv3136-Rv2034-Rv1009;Rv1009-Rv3615c-Rv2034-Rv2628;Rv3615c-Rv2034-Rv2628-Rv1009;Rv2034-Rv3615c-Rv2628-Rv3136;Rv3136-Rv2628-Rv3615c-Rv2034;Rv1009-Rv3136Nt-Rv2628-R v2034-Rv3615c;Rv2034-Rv3615c-Rv3136Nt-Rv2628-Rv1009;Rv3615c-Rv2628-Rv1009-Rv3136Nt-Rv2034;Rv1009-Rv2628-Rv3136Nt-Rv2034-Rv3615c;Rv2628-Rv3136Nt-Rv1009-Rv2034-Rv3615c;或Rv2628-Rv3136Nt-Rv2034-Rv3615c-Rv1009。
实施方案20.根据实施方案19所述的融合蛋白,其中:Rv1009包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列;Rv3136包含SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列;Rv3615c包含SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列;Rv2628包含SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列;Rv2034包含SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列;并且Rv3136Nt包含SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列。
实施方案21.根据实施方案19所述的融合蛋白,其中:Rv1009由SEQ ID NO:1或SEQID NO:3中列出的核苷酸序列编码;Rv3136由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7中列出的核苷酸序列编码;Rv3615c由SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中列出的核苷酸序列编码;Rv2628由SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13中列出的核苷酸序列编码;Rv2034由SEQ IDNO:15中列出的核苷酸序列编码;并且Rv3136Nt由SEQ ID NO:17中列出的核苷酸序列编码。
实施方案22.根据实施方案19所述的融合蛋白,其中:Rv1009-Rv3615c-Rv3136包含SEQ ID NO:39中列出的氨基酸序列;Rv1009-Rv2034-Rv3136包含SEQ ID NO:41中列出的氨基酸序列;Rv1009-Rv2628-Rv3615c-Rv3136包含SEQ ID NO:43中列出的氨基酸序列;Rv1009-Rv2034-Rv2628-Rv3615c-Rv3136包含SEQ ID NO:45中列出的氨基酸序列;Rv2034-Rv1009-Rv3136包含SEQ ID NO:47中列出的氨基酸序列;Rv3136-Rv2034-Rv1009包含SEQID NO:49中列出的氨基酸序列;Rv1009-Rv3615c-Rv2034-Rv2628包含SEQ ID NO:51中列出的氨基酸序列;Rv3615c-Rv2034-Rv2628-Rv1009包含S EQ ID NO:53中列出的氨基酸序列;Rv2034-Rv3615c-Rv2628-Rv3136包含SEQ ID NO:55中列出的氨基酸序列;Rv3136-Rv2628-Rv3615c-Rv2034包含SEQ ID NO:57中列出的氨基酸序列;Rv1009-Rv3136Nt-Rv2628-Rv2034-Rv3615c包含SEQ ID NO:59中列出的氨基酸序列;Rv2034-Rv3615c-Rv3136Nt-Rv2628-Rv1009包含SEQ ID NO:61中列出的氨基酸序列;Rv3615c-Rv2628-Rv1009-Rv3136Nt-Rv2034包含SEQ ID NO:63中列出的氨基酸序列;Rv1009-Rv2628-Rv3136Nt-Rv2034-Rv3615c包含SEQ ID NO:71中列出的氨基酸序列;Rv2628-Rv3136Nt-Rv1009-Rv2034-Rv3615c包含SEQ ID NO:73中列出的氨基酸序列;Rv2628-Rv3136Nt-Rv2034-Rv3615c-Rv1009包含SE Q ID NO:75中列出的氨基酸序列。
实施方案23.根据实施方案19所述的融合蛋白,其中:Rv1009-Rv3615c-Rv3136由SEQ ID NO:38中列出的核苷酸序列编码;Rv1009-Rv2034-Rv3136由SEQ ID NO:40中列出的核苷酸序列编码;R v1009-Rv2628-Rv3615c-Rv3136由SEQ ID NO:42中列出的核苷酸序列编码;Rv1009-Rv2034-Rv2628-Rv3615c-Rv3136由SEQ ID NO:44中列出的核苷酸序列编码;Rv2034-Rv1009-Rv3136由SEQ ID NO:46中列出的核苷酸序列编码;Rv3136-Rv2034-Rv1009由SEQ ID N O:48中列出的核苷酸序列编码;Rv1009-Rv3615c-Rv2034-Rv2628由SEQ IDNO:50中列出的核苷酸序列编码;Rv3615c-Rv2034-Rv2628-Rv1009由SEQ ID NO:52中列出的核苷酸序列编码;Rv2034-Rv3615c-Rv2628-Rv3136由SEQ ID NO:54中列出的核苷酸序列编码;Rv3136-Rv2628-Rv3615c-Rv2034由SEQ ID NO:56中列出的核苷酸序列编码;Rv1009-Rv3136Nt-Rv2628-Rv2034-Rv3615c由SEQ ID NO:58中列出的核苷酸序列编码;Rv2034-Rv3615c-Rv3136Nt-Rv2628-Rv1009由SEQ ID NO:60中列出的核苷酸序列编码;Rv3615c-Rv2628-Rv1009-Rv3136Nt-Rv2034由SEQ ID NO:62中列出的核苷酸序列编码;Rv1009-Rv2628-Rv3136Nt-Rv2034-Rv3615c由SEQ ID NO:70中列出的核苷酸序列编码;Rv2628-Rv3136Nt-Rv1009-Rv2034-Rv3615c由SEQ ID NO:72中列出的核苷酸序列编码;并且Rv2628-Rv3136N t-Rv2034-Rv3615c-Rv1009由SEQ ID NO:74中列出的核苷酸序列编码。
实施方案24.一种组合物或融合蛋白,其包含至少两种结核分枝杆菌(Mtb)抗原,其中所述Mtb抗原是Rv1733和Rv2626c。
实施方案25.根据实施方案24所述的组合物或融合蛋白,其中Rv1733包含SEQ IDNO:29中列出的氨基酸序列。
实施方案26.根据实施方案24所述的组合物或融合蛋白,其中Rv1733由SEQ IDNO:28中列出的核苷酸序列编码。
实施方案27.根据实施方案24所述的组合物或融合蛋白,其中Rv2626c包含SEQ IDNO:31中列出的氨基酸序列。
实施方案28.根据实施方案24所述的组合物或融合蛋白,其中Rv2626c由SEQ IDNO:30中列出的核苷酸序列编码。
实施方案29.根据权利要求24所述的融合蛋白,其包含Rv1733-Rv2626c。
实施方案30.根据实施方案29所述的融合蛋白,其中:Rv1733包含SEQ ID NO:29中列出的氨基酸序列;并且Rv2626c包含SEQ ID NO:31中列出的氨基酸序列。
实施方案31.根据实施方案29所述的融合蛋白,其中:Rv1733由SEQ ID NO:28中列出的核苷酸序列编码;并且Rv2626c由SEQ ID NO:30中列出的核苷酸序列编码。
实施方案32.根据实施方案29所述的融合蛋白,其中Rv1733-Rv2626c包含SEQ IDNO:67中列出的氨基酸序列。
实施方案33.根据实施方案29所述的融合蛋白,其中Rv1733-Rv2626c由SEQ IDNO:66中列出的核苷酸序列编码。
实施方案34.一种组合物或融合蛋白,其包含至少三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原,其中所述Mtb抗原选自Ag85A、Ag85B、Rv3407、RpfA、RpfC和RpfD。
实施方案35.根据实施方案34所述的组合物或融合蛋白,其中Ag85A包含SEQ IDNO:20中列出的氨基酸序列。
实施方案36.根据实施方案34所述的组合物或融合蛋白,其中Ag85A由SEQ ID NO:19中列出的核苷酸序列编码。
实施方案37.根据实施方案34所述的组合物或融合蛋白,其中Ag85B包含SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:25中列出的氨基酸序列。
实施方案38.根据实施方案34所述的组合物或融合蛋白,其中Ag85B由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23中列出的核苷酸序列编码。
实施方案39.根据实施方案34所述的组合物或融合蛋白,其中Rv3407包含SEQ IDNO:27中列出的氨基酸序列。
实施方案40.根据实施方案34所述的组合物或融合蛋白,其中Rv3407由SEQ IDNO:26中列出的核苷酸序列编码。
实施方案41.根据实施方案34所述的组合物或融合蛋白,其中RpfA包含SEQ IDNO:33中列出的氨基酸序列。
实施方案42.根据实施方案34所述的组合物或融合蛋白,其中RpfA由SEQ ID NO:32中列出的核苷酸序列编码。
实施方案43.根据实施方案34所述的组合物或融合蛋白,其中RpfC包含SEQ IDNO:35中列出的氨基酸序列。
实施方案44.根据实施方案34所述的组合物或融合蛋白,其中RpfC由SEQ ID NO:34中列出的核苷酸序列编码。
实施方案45.根据实施方案34所述的组合物或融合蛋白,其中RpfD包含SEQ IDNO:37中列出的氨基酸序列。
实施方案46.根据实施方案34所述的组合物或融合蛋白,其中RpfD由SEQ ID NO:36中列出的核苷酸序列编码。
实施方案47.根据实施方案34所述的组合物或融合蛋白,其包含:Ag85A、Ag85B和Rv3407Mtb抗原;或RpfA、RpfC和RpfD Mtb抗原。
实施方案48.根据实施方案47所述的组合物或融合蛋白,其中:Ag85A包含SEQ IDNO:20中列出的氨基酸序列;Ag85B包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25中列出的氨基酸序列;Rv3407包含SEQ ID NO:27中列出的氨基酸序列;RpfA包含SEQ ID NO:33中列出的氨基酸序列;RpfC包含SEQ ID NO:35中列出的氨基酸序列;并且RpfD包含SEQ ID NO:37中列出的氨基酸序列。
实施方案49.根据实施方案47所述的组合物或融合蛋白,其中:Ag85A由SEQ IDNO:19中列出的核苷酸序列编码;Ag85B由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23中列出的核苷酸序列编码;Rv3407由SEQ ID NO:26中列出的核苷酸序列编码;RpfA由SEQ IDNO:32中列出的核苷酸序列编码;RpfC由SEQ ID NO:34中列出的核苷酸序列编码;并且RpfD由SEQ ID NO:36中列出的核苷酸序列编码。
实施方案50.根据实施方案34所述的融合蛋白,其包含:Ag85A-Ag85B-Rv3407;或RpfA-RpfC-RpfD。
实施方案51.根据实施方案50所述的融合蛋白,其中:Ag85A包含SEQ ID NO:20中列出的氨基酸序列;Ag85B包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25中列出的氨基酸序列;Rv3407包含SEQ ID NO:27中列出的氨基酸序列;RpfA包含SEQ ID NO:33中列出的氨基酸序列;RpfC包含SEQ ID NO:35中列出的氨基酸序列;并且RpfD包含SEQ ID NO:37中列出的氨基酸序列。
实施方案52.根据实施方案50所述的融合蛋白,其中:Ag85A由SEQ ID NO:19中列出的核苷酸序列编码;Ag85B由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23中列出的核苷酸序列编码;Rv3407由SEQ ID NO:26中列出的核苷酸序列编码;RpfA由SEQ ID NO:32中列出的核苷酸序列编码;RpfC由SEQ ID NO:34中列出的核苷酸序列编码;并且RpfD由SEQ IDNO:36中列出的核苷酸序列编码。
实施方案53.根据实施方案50所述的融合蛋白,其中:Ag85A-Ag85B-Rv3407包含SEQ ID NO:65中列出的氨基酸序列;并且RpfA-RpfC-RpfD包含SEQ ID NO:69中列出的氨基酸序列。
实施方案54.根据实施方案50所述的融合蛋白,其中:Ag85A-Ag85B-Rv3407由SEQID NO:64中列出的核苷酸序列编码;并且RpfA-RpfC-RpfD由SEQ ID NO:68中列出的核苷酸序列编码。
实施方案55.一种药物组合物,其包含根据实施方案1至54中任一项所述的组合物或融合蛋白以及药学上可接受的载体。
实施方案56.一种载体,其编码根据实施方案1至54中任一项所述的融合蛋白。
实施方案57.根据实施方案56所述的载体,其是病毒载体。
实施方案58.根据实施方案57所述的载体,其中所述病毒载体选自腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、副粘病毒载体、禽痘病毒载体、减毒黄热病载体、甲病毒载体、逆转录病毒载体、仙台病毒载体以及CMV载体。
实施方案59.根据实施方案58所述的载体,其中所述腺病毒载体是腺病毒4、腺病毒5、黑猩猩腺病毒3、黑猩猩腺病毒63或黑猩猩腺病毒68。
实施方案60.根据实施方案58所述的载体,其中所述痘病毒载体是痘苗病毒载体。
实施方案61.根据实施方案60所述的载体,其中所述痘苗病毒载体是修饰的痘苗安卡拉(MVA)。
实施方案62.根据实施方案58所述的载体,其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。
实施方案63.根据实施方案58所述的载体,其中所述CMV载体是RhCMV载体或HCMV载体。
实施方案64.根据实施方案58所述的载体,其中所述副粘病毒载体是PIV2或rHPIV2。
实施方案65.根据实施方案56所述的载体,其是非病毒载体。
实施方案66.根据实施方案65所述的载体,其中所述非病毒载体是mRNA。
实施方案67.一种细胞,其包含根据实施方案56至66中任一项所述的载体。
实施方案68.根据实施方案67所述的细胞,其是重组BCG。
实施方案69.一种在哺乳动物中引发针对结核分枝杆菌的免疫应答的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用免疫学足够量的根据实施方案1至54中任一项所述的组合物或融合蛋白。
实施方案70.一种在哺乳动物中引发针对结核分枝杆菌的免疫应答的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用免疫学足够量的根据实施方案55所述的组合物。
实施方案71.一种在哺乳动物中引发针对结核分枝杆菌的免疫应答的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用免疫学足够量的根据实施方案56至66中任一项所述的载体。
为了使本文公开的主题可得到更有效的理解,以下提供了实施例。应理解,这些实施例仅出于说明性目的且不应解释为以任何方式限制所要求保护的主题。在这些实施例中,分子克隆反应和其他标准重组DNA技术是使用可商购的试剂根据Maniatis等人,Molecular Cloning-A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Press(1989)中描述的方法进行的,除非另有说明。
实施例
实施例1:融合蛋白的克隆、过表达和纯化
呈融合蛋白形式的抗原盒及其变体的制备
克隆:为了克隆Rv1009-Rv3615c-Rv3136,使用添加限制性位点的引物从MtbH37Rv PCR扩增编码蛋白质抗原的基因。在无N-末端信号序列的情况下扩增Rv1009。经由指定的限制酶位点将扩增的基因克隆到pET28b载体(Novagen)中,从而产生N-末端6xHis-标记的融合蛋白。所述基因在没有间隔子序列、只有每个基因之间的限制酶位点的情况下克隆。将pET28b构建体克隆在大肠埃希氏菌克隆菌株中,通过限制性消化筛选并测序以验证每种构建体。融合体的DNA和氨基酸序列显示Rv1009减去其N-末端信号序列。
为了克隆Rv1009-Rv2034-Rv3136,使用添加限制性位点的引物从Mtb H37Rv PCR扩增编码蛋白质抗原的基因。在无N-末端信号序列的情况下扩增Rv1009。经由指定的限制酶位点将扩增的基因克隆到pET28b载体(Novagen)中,从而产生N-末端6xHis-标记的融合蛋白。所述基因在没有间隔子序列、只有每个基因之间的限制酶位点的情况下克隆。将pET28b构建体克隆在大肠埃希氏菌克隆菌株中,通过限制性消化筛选并测序以验证每种构建体。融合体的DNA和氨基酸序列显示Rv1009减去其N-末端信号序列。
为了克隆Rv1009-Rv2628-Rv3615c-Rv3136,使用添加限制性位点的引物从MtbH37Rv PCR扩增编码蛋白质抗原的基因。在无N-末端信号序列的情况下扩增Rv1009。经由指定的限制酶位点将扩增的基因克隆到pET28b载体(Novagen)中,从而产生N-末端6xHis-标记的融合蛋白。所述基因在没有间隔子序列、只有每个基因之间的限制酶位点的情况下克隆。将pET28b构建体克隆在大肠埃希氏菌克隆菌株中,通过限制性消化筛选并测序以验证每种构建体。融合体的DNA和氨基酸序列显示Rv1009减去其N-末端信号序列。
为了克隆Rv1009-Rv2034-Rv2628-Rv3615c-Rv3136,使用添加限制性位点的引物从Mtb H37Rv PCR扩增编码蛋白质抗原的基因。在无N-末端信号序列的情况下扩增Rv1009。经由指定的限制酶位点将扩增的基因克隆到pET28b载体(Novagen)中,从而产生N-末端6xHis-标记的融合蛋白。所述基因在没有间隔子序列、只有每个基因之间的限制酶位点的情况下克隆。将pET28b构建体克隆在大肠埃希氏菌克隆菌株中,通过限制性消化筛选并测序以验证每种构建体。融合体的DNA和氨基酸序列显示Rv1009减去其N-末端信号序列。
为了克隆Rv2034-Rv1009-Rv3136,使用添加限制性位点的引物从Mtb H37Rv PCR扩增编码蛋白质抗原的基因。在无N-末端信号序列的情况下扩增Rv1009。经由指定的限制酶位点将扩增的基因克隆到pET28b载体(Novagen)中,从而产生N-末端6xHis-标记的融合蛋白。所述基因在没有间隔子序列、只有每个基因之间的限制酶位点的情况下克隆。将pET28b构建体克隆在大肠埃希氏菌克隆菌株中,通过限制性消化筛选并测序以验证每种构建体。融合体的DNA和氨基酸序列显示Rv1009减去其N-末端信号序列。
为了克隆Rv3136-Rv2034-Rv1009,使用添加限制性位点的引物从Mtb H37Rv PCR扩增编码蛋白质抗原的基因。在无N-末端信号序列的情况下扩增Rv1009。经由指定的限制酶位点将扩增的基因克隆到pET28b载体(Novagen)中,从而产生N-末端6xHis-标记的融合蛋白。所述基因在没有间隔子序列、只有每个基因之间的限制酶位点的情况下克隆。将pET28b构建体克隆在大肠埃希氏菌克隆菌株中,通过限制性消化筛选并测序以验证每种构建体。融合体的DNA和氨基酸序列显示Rv1009减去其N-末端信号序列。
为了克隆Rv1009-Rv3615c-Rv2034-Rv2628,使用添加限制性位点的引物从MtbH37Rv PCR扩增编码蛋白质抗原的基因。在无N-末端信号序列的情况下扩增Rv1009。经由指定的限制酶位点将扩增的基因克隆到pET28b载体(Novagen)中,从而产生N-末端6xHis-标记的融合蛋白。所述基因在没有间隔子序列、只有每个基因之间的限制酶位点的情况下克隆。将pET28b构建体克隆在大肠埃希氏菌克隆菌株中,通过限制性消化筛选并测序以验证每种构建体。融合体的DNA和氨基酸序列显示Rv1009减去其N-末端信号序列。
为了克隆Rv3615c-Rv2034-Rv2628-Rv1009,使用添加限制性位点的引物从MtbH37Rv PCR扩增编码蛋白质抗原的基因。在无N-末端信号序列的情况下扩增Rv1009。经由指定的限制酶位点将扩增的基因克隆到pET28b载体(Novagen)中,从而产生N-末端6xHis-标记的融合蛋白。所述基因在没有间隔子序列、只有每个基因之间的限制酶位点的情况下克隆。将pET28b构建体克隆在大肠埃希氏菌克隆菌株中,通过限制性消化筛选并测序以验证每种构建体。融合体的DNA和氨基酸序列显示Rv1009减去其N-末端信号序列。
为了克隆Rv2034-Rv3615c-Rv2628-Rv3136,使用添加限制性位点的引物从MtbH37Rv PCR扩增编码蛋白质抗原的基因。在无N-末端信号序列的情况下扩增Rv1009。经由指定的限制酶位点将扩增的基因克隆到pET28b载体(Novagen)中,从而产生N-末端6xHis-标记的融合蛋白。所述基因在没有间隔子序列、只有每个基因之间的限制酶位点的情况下克隆。将pET28b构建体克隆在大肠埃希氏菌克隆菌株中,通过限制性消化筛选并测序以验证每种构建体。
为了克隆Rv3136-Rv2628-Rv3615c-Rv2034,使用添加限制性位点的引物从MtbH37Rv PCR扩增编码蛋白质抗原的基因。在无N-末端信号序列的情况下扩增Rv1009。经由指定的限制酶位点将扩增的基因克隆到pET28b载体(Novagen)中,从而产生N-末端6xHis-标记的融合蛋白。所述基因在没有间隔子序列、只有每个基因之间的限制酶位点的情况下克隆。将pET28b构建体克隆在大肠埃希氏菌克隆菌株中,通过限制性消化筛选并测序以验证每种构建体。融合体的DNA和氨基酸序列显示Rv1009减去其N-末端信号序列。
为了克隆Rv1009-Rv3136Nt-Rv2628-Rv2034-Rv3615c,使用添加限制性位点的引物从Mtb H37Rv PCR扩增编码蛋白质抗原的基因。在无N-末端信号序列的情况下扩增Rv1009。经由指定的限制酶位点将扩增的基因克隆到pET28b载体(Novagen)中,从而产生N-末端6xHis-标记的融合蛋白。所述基因在没有间隔子序列、只有每个基因之间的限制酶位点的情况下克隆。将pET28b构建体克隆在大肠埃希氏菌克隆菌株中,通过限制性消化筛选并测序以验证每种构建体。融合体的DNA和氨基酸序列显示Rv1009减去其N-末端信号序列。
为了克隆Rv1009-Rv3136Nt-Rv2628-Rv2034-Rv3615c,使用添加限制性位点的引物从Mtb H37Rv PCR扩增编码蛋白质抗原的基因。在无N-末端信号序列的情况下扩增Rv1009。经由指定的限制酶位点将扩增的基因克隆到pET28b载体(Novagen)中,从而产生N-末端6xHis-标记的融合蛋白。所述基因在没有间隔子序列、只有每个基因之间的限制酶位点的情况下克隆。将pET28b构建体克隆在大肠埃希氏菌克隆菌株中,通过限制性消化筛选并测序以验证每种构建体。融合体的DNA和氨基酸序列显示Rv1009减去其N-末端信号序列。
为了克隆Rv2034-Rv3615c-Rv3136Nt-Rv2628-Rv1009,使用添加限制性位点的引物从Mtb H37Rv PCR扩增编码蛋白质抗原的基因。在无N-末端信号序列的情况下扩增Rv1009。经由指定的限制酶位点将扩增的基因克隆到pET28b载体(Novagen)中,从而产生N-末端6xHis-标记的融合蛋白。所述基因在没有间隔子序列、只有每个基因之间的限制酶位点的情况下克隆。将pET28b构建体克隆在大肠埃希氏菌克隆菌株中,通过限制性消化筛选并测序以验证每种构建体。融合体的DNA和氨基酸序列显示Rv1009减去其N-末端信号序列。
为了克隆Rv3615c-Rv2628-Rv1009-Rv3136Nt-Rv2034,使用添加限制性位点的引物从Mtb H37Rv PCR扩增编码蛋白质抗原的基因。在无N-末端信号序列的情况下扩增Rv1009。经由指定的限制酶位点将扩增的基因克隆到pET28b载体(Novagen)中,从而产生N-末端6xHis-标记的融合蛋白。所述基因在没有间隔子序列、只有每个基因之间的限制酶位点的情况下克隆。将pET28b构建体克隆在大肠埃希氏菌克隆菌株中,通过限制性消化筛选并测序以验证每种构建体。融合体的DNA和氨基酸序列显示Rv1009减去其N-末端信号序列。
为了克隆Rv1009-Rv2628-Rv3136Nt-Rv2034-Rv3615c,使用添加限制性位点的引物从Mtb H37Rv PCR扩增编码蛋白质抗原的基因。在无N-末端信号序列的情况下扩增Rv1009。经由指定的限制酶位点将扩增的基因克隆到pET28b载体(Novagen)中,从而产生N-末端6xHis-标记的融合蛋白。所述基因在没有间隔子序列、只有每个基因之间的限制酶位点的情况下克隆。将pET28b构建体克隆在大肠埃希氏菌克隆菌株中,通过限制性消化筛选并测序以验证每种构建体。融合体的DNA和氨基酸序列显示Rv1009减去其N-末端信号序列。
为了克隆Rv2628-Rv3136N-Rv1009-Rv2034-Rv3615c,使用添加限制性位点的引物从Mtb H37Rv PCR扩增编码蛋白质抗原的基因。在无N-末端信号序列的情况下扩增Rv1009。经由指定的限制酶位点将扩增的基因克隆到pET28b载体(Novagen)中,从而产生N-末端6xHis-标记的融合蛋白。所述基因在没有间隔子序列、只有每个基因之间的限制酶位点的情况下克隆。将pET28b构建体克隆在大肠埃希氏菌克隆菌株中,通过限制性消化筛选并测序以验证每种构建体。融合体的DNA和氨基酸序列显示Rv1009减去其N-末端信号序列。
为了克隆Rv2628-Rv3136Nt-Rv2034-Rv3615c-Rv1009,使用添加限制性位点的引物从Mtb H37Rv PCR扩增编码蛋白质抗原的基因。在无N-末端信号序列的情况下扩增Rv1009。经由指定的限制酶位点将扩增的基因克隆到pET28b载体(Novagen)中,从而产生N-末端6xHis-标记的融合蛋白。所述基因在没有间隔子序列、只有每个基因之间的限制酶位点的情况下克隆。将pET28b构建体克隆在大肠埃希氏菌克隆菌株中,通过限制性消化筛选并测序以验证每种构建体。融合体的DNA和氨基酸序列显示Rv1009减去其N-末端信号序列。
表达:将编码融合蛋白的质粒转化到大肠埃希氏菌BL21(Novagen)和T7Express(New England Biolabs)中。挑取每个融合构建体的多个菌落,并在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)(Sigma)中在37℃下振荡生长过夜。将过夜培养物在TSB中1:100稀释,并在37℃下振荡生长至OD600=0.6。用1mM IPTG诱导培养物并在37℃下振荡生长3小时。将诱导的和未诱导的每种培养物的等分试样在4%-12%Bis/Tris SDS-PAGE凝胶上运行以验证融合蛋白的诱导。将表达每种融合蛋白的菌落在-80℃下在TSB+20%甘油中冷冻作为研究储备液。
融合蛋白的纯化:从融合构建体的甘油储备液接种10ml培养物,并在37℃下振荡生长过夜。将过夜培养物在250ml TSB中1:100稀释,并在37℃下振荡生长至OD600=0.6。用1mM IPTG诱导培养物并在37℃下振荡生长3小时。将诱导的样品的等分试样在4%-12%Bis/Tris SDS-PAGE凝胶上运行以确认蛋白质的诱导。将诱导的培养物以6,000×g离心10分钟并将团块在-80℃下冷冻。将团块解冻并重新悬浮于10ml BPER缓冲液(ThermoScientific)中,并且取得等分试样用于测试(裂解物)。添加溶菌酶(20U/ml)和DNA酶I(25U/ml)以帮助完成细胞裂解。将裂解的细胞以12,000×g离心10分钟,并收集上清液(可溶性级分)。将不溶性团块重新悬浮于10ml BPER缓冲液中,并且除去100μl等分试样(不溶性级分)。将重新悬浮的团块中的细胞用10ml 10%BPER缓冲液稀释,并将悬浮液以12,000×g离心10分钟。丢弃上清液,并将团块用10ml 10%BPER缓冲液再次洗涤3次。裂解物、可溶性和不溶性级分和洗涤液在4%-12%Bis/Tris SDS-PAGE凝胶上运行以确认表达并确定蛋白质的亚细胞定位。发现融合蛋白定位于包涵体中的不溶性团块。将不溶性团块重新悬浮于10ml变性结合缓冲液(DBB)(8M尿素,92mM Na2HPO4,7mM NaH2PO4,10mM Tris)pH 7.8中。通过超声处理裂解包涵体,并且通过以12,000×g离心20分钟清除裂解物中的碎片。
通过柱纯化对蛋白质进行纯化。用DBB平衡五(5)ml HisPur钴树脂(ThermoScientific),并与5ml澄清的裂解物一起孵育。将混合物在室温下搅拌90分钟。然后将裂解物/树脂混合物负载到30ml柱上,并且用25体积的变性洗涤缓冲液(8M尿素、25mM Na2HPO4、75mM NaH2PO4、10mM Tris、12mM脱氧胆酸钠,pH 7.8)洗涤。通过用50、100、350、500和1000mM咪唑的洗脱缓冲液(8M尿素、10mM Tris、5%甘油)pH 8.0洗脱来从Co+柱洗脱His标记的蛋白质。将洗脱的蛋白质在4%-12%Bis/Tris SDS-PAGE凝胶上运行,并将清洁级分从8M尿素、10mM Tris、5%甘油逐步渗析至10mM Tris、5%甘油。通过SDS-PAGE分析渗析的蛋白质的纯度,对每种抗原的存在进行蛋白质印迹,并测定残留内毒素的存在。将具有<0.25U内毒素/ml的纯样品等分并在-80℃下冷冻。
实施例2:小鼠免疫原性和功效
检查了抗原匹配的重组BCG(422M,其过表达Ag85B、Ag85A和Rv3407)和与佐剂PIKA组合的重组蛋白疫苗(rBARv;由Ag85B、Ag85A和Rv3407组成)的免疫原性和功效。在第0周,用大约2x 106CFU的BCG或422M在颈部的颈背中对小鼠进行免疫。在第6周和第8周,小鼠接受PBS中的1μg的rBARv与100μg的PIKA佐剂的加强免疫,也在颈部的颈背中皮下施用。
免疫原性:最后一次疫苗接种后两周,处死一亚组小鼠并收获脾细胞用于ELISpot测定。如图1中所示,用rBARv和422M两者疫苗接种均诱导针对Ag85B和Ag85A两者的中度免疫应答。此外,422M和BARV的组合诱导有效免疫应答。
功效:最后一次免疫后四周,用50至100CFU的Mtb HN878激发来自初次接受实验、BCG、422M、BCG+BARv和422M+BARv组的一亚组小鼠(15)。在激发后第4周、第12周和第20周,处死每组5只小鼠并评价肺和脾中的细菌负荷(参见图2)。在每个时间点,与初次接受实验的小鼠相比,接种疫苗的小鼠显示出显著程度的保护。然而,相对于BCG显示保护作用的显著增加的唯一组是第12周的BCG+BARv组。
实施例3:小鼠免疫原性
检测了抗原匹配的重组BCG(422M;其过表达Ag85B、Ag85A和Rv3407)与重组腺病毒血清型5(Ad5-C;编码Ag85B、Ag85A和Rv3407)的免疫原性。这一研究在常用于TB研究的两种小鼠品系(C57BL/6小鼠(BL6)和CB6F1小鼠)中进行。在第0周,用大约2x 106CFU的BCG或422M在颈部的颈背中对小鼠进行免疫。在第6周,用1x 109个Ad5-C病毒颗粒对小鼠进行疫苗接种。在第8周,处死小鼠并收获脾细胞以用于细胞内细胞因子染色测定。如上文图3中所示,用Ad5-C免疫诱导有效的T细胞应答,所述T细胞应答可用BCG或rBCG初免显著增强。已经观察到PanAd、Ad4和ChAd63的类似免疫原性数据(数据未示出)。
实施例4:小鼠免疫原性
在两项研究(NBL12-11和NBL12-12)中检查了作为质粒DNA(pVAX主链)递送的几种Mtb抗原的免疫原性。NBL12-12包括某些抗原的修饰,包括添加分泌前导序列(sec)或除去跨膜结构域(mod)。在第0周、第2周和第4周用单独抗原对小鼠进行免疫。在第6周,处死小鼠并收获脾细胞以用于ELISpot测定。在一些情况下,a)在肽不可获得的情况下,蛋白质用于刺激,和b)如果两者都可获得,则使用两者。最强烈的应答者包括Ag85B、PPE51和Rv2626(参见图4)。还针对ESAT6、Rv3407、Rv2628、PPE15和PE3检测到适度应答(参见图4)。
除本文所述的那些修改之外,所描述主题的各种修改也将为本领域的技术人员根据以上描述所显而易知。此类修改也意图属于所附权利要求书的范围内。本申请中引用的每个参考文献(包括但不限于杂志文章、美国专利和非美国专利、专利申请公布、国际专利申请公布、基因库登录号等)以引用的方式整体并入本文。
序列表
<110> Aeras基金会
<120> 结核病组合物和治疗或预防结核病的方法
<130> 189107.01602
<140>
<141>
<150> 62/350,837
<151> 2016-06-16
<160> 75
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 1089
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Rv1009
<400> 1
atgttgcgcc tggtagtcgg tgcgctgctg ctggtgttgg cgttcgccgg tggctatgcg 60
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<211> 362
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Rv1009
<400> 2
Met Leu Arg Leu Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val Leu Ala Phe Ala
1 5 10 15
Gly Gly Tyr Ala Val Ala Ala Cys Lys Thr Val Thr Leu Thr Val Asp
20 25 30
Gly Thr Ala Met Arg Val Thr Thr Met Lys Ser Arg Val Ile Asp Ile
35 40 45
Val Glu Glu Asn Gly Phe Ser Val Asp Asp Arg Asp Asp Leu Tyr Pro
50 55 60
Ala Ala Gly Val Gln Val His Asp Ala Asp Thr Ile Val Leu Arg Arg
65 70 75 80
Ser Arg Pro Leu Gln Ile Ser Leu Asp Gly His Asp Ala Lys Gln Val
85 90 95
Trp Thr Thr Ala Ser Thr Val Asp Glu Ala Leu Ala Gln Leu Ala Met
100 105 110
Thr Asp Thr Ala Pro Ala Ala Ala Ser Arg Ala Ser Arg Val Pro Leu
115 120 125
Ser Gly Met Ala Leu Pro Val Val Ser Ala Lys Thr Val Gln Leu Asn
130 135 140
Asp Gly Gly Leu Val Arg Thr Val His Leu Pro Ala Pro Asn Val Ala
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Gly Leu Leu Ser Ala Ala Gly Val Pro Leu Leu Gln Ser Asp His Val
165 170 175
Val Pro Ala Ala Thr Ala Pro Ile Val Glu Gly Met Gln Ile Gln Val
180 185 190
Thr Arg Asn Arg Ile Lys Lys Val Thr Glu Arg Leu Pro Leu Pro Pro
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Asn Ala Arg Arg Val Glu Asp Pro Glu Met Asn Met Ser Arg Glu Val
210 215 220
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225 230 235 240
Ala Glu Val Asn Gly Val Glu Thr Gly Arg Leu Pro Val Ala Asn Val
245 250 255
Val Val Thr Pro Ala His Glu Ala Val Val Arg Val Gly Thr Lys Pro
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Gly Thr Glu Val Pro Pro Val Ile Asp Gly Ser Ile Trp Asp Ala Ile
275 280 285
Ala Gly Cys Glu Ala Gly Gly Asn Trp Ala Ile Asn Thr Gly Asn Gly
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Tyr Tyr Gly Gly Val Gln Phe Asp Gln Gly Thr Trp Glu Ala Asn Gly
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Gly Leu Arg Tyr Ala Pro Arg Ala Asp Leu Ala Thr Arg Glu Glu Gln
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Ile Ala Val Ala Glu Val Thr Arg Leu Arg Gln Gly Trp Gly Ala Trp
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<211> 1023
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> 无信号序列的Rv1009
<400> 3
gcatgcaaaa cggtgacgtt gaccgtcgac ggaaccgcga tgcgggtgac cacgatgaaa 60
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tga 1023
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<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> 无信号序列的Rv1009
<400> 4
Ala Cys Lys Thr Val Thr Leu Thr Val Asp Gly Thr Ala Met Arg Val
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Thr Thr Met Lys Ser Arg Val Ile Asp Ile Val Glu Glu Asn Gly Phe
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Ser Leu Asp Gly His Asp Ala Lys Gln Val Trp Thr Thr Ala Ser Thr
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Val Asp Glu Ala Leu Ala Gln Leu Ala Met Thr Asp Thr Ala Pro Ala
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Ala Ala Ser Arg Ala Ser Arg Val Pro Leu Ser Gly Met Ala Leu Pro
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Val Val Ser Ala Lys Thr Val Gln Leu Asn Asp Gly Gly Leu Val Arg
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Gly Val Pro Leu Leu Gln Ser Asp His Val Val Pro Ala Ala Thr Ala
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Pro Ile Val Glu Gly Met Gln Ile Gln Val Thr Arg Asn Arg Ile Lys
165 170 175
Lys Val Thr Glu Arg Leu Pro Leu Pro Pro Asn Ala Arg Arg Val Glu
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Asp Pro Glu Met Asn Met Ser Arg Glu Val Val Glu Asp Pro Gly Val
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Glu Ala Val Val Arg Val Gly Thr Lys Pro Gly Thr Glu Val Pro Pro
245 250 255
Val Ile Asp Gly Ser Ile Trp Asp Ala Ile Ala Gly Cys Glu Ala Gly
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Gly Asn Trp Ala Ile Asn Thr Gly Asn Gly Tyr Tyr Gly Gly Val Gln
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Phe Asp Gln Gly Thr Trp Glu Ala Asn Gly Gly Leu Arg Tyr Ala Pro
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Thr Arg Leu Arg Gln Gly Trp Gly Ala Trp Pro Val Cys Ala Ala Arg
325 330 335
Ala Gly Ala Arg
340
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<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Rv3136
<400> 5
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taa 1143
<210> 6
<211> 1146
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<400> 6
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gcggcgctgc tgaccccgtt tagcccgccg cgccagacca ccaacccggc gggcctgacc 540
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gaattt 1146
<210> 7
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<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
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<223> Rv3136
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gagaagaccc agcaaaccgc tattcaggcc agagctgccg ccctggcctt cgaacaggcc 300
tacgctatga cactcccccc ccctgtcgtg gctgccaata ggatccagct cctggccctc 360
atcgccacca acttcttcgg ccaaaacacc gctgccatcg ctgccaccga agcccagtac 420
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gctgctctgc tcacaccctt cagccccccc aggcaaacaa ccaaccctgc cggactgaca 540
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gacgctatct tcgctggcta cgccaccgtg ggcgtgacac aagacgtcga gtccttcgtc 720
gccggcacaa tcggagccga gtccaacctc ggactcctca acgtcggcga cgaaaatccc 780
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<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Rv3136
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Ser Leu Ala Ala Glu Leu Ala Thr Thr Ala Glu Ala Tyr Gly Ser Val
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Leu Ser Gly Leu Ala Ala Leu His Trp Arg Gly Pro Ala Ala Glu Ser
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Met Ala Val Thr Ala Ala Pro Tyr Ile Gly Trp Leu Tyr Thr Thr Ala
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Ala Gln Asp Ala Ala Ala Met Tyr Gly Tyr Ala Thr Ala Ser Ala Ala
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Ala Gly Tyr Ala Thr Val Gly Val Thr Gln Asp Val Glu Ser Phe Val
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Ala Gly Thr Ile Gly Ala Glu Ser Asn Leu Gly Leu Leu Asn Val Gly
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Asp Glu Asn Pro Ala Glu Val Thr Pro Gly Asp Phe Gly Ile Gly Glu
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Leu Val Ser Ala Thr Ser Pro Gly Gly Gly Val Ser Ala Ser Gly Ala
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Gly Gly Ala Ala Ser Val Gly Asn Thr Val Leu Ala Ser Val Gly Arg
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Ala Asn Ser Ile Gly Gln Leu Ser Val Pro Pro Ser Trp Ala Ala Pro
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Pro Gly Thr Asp Val Ala Glu His Gly Met Pro Gly Val Pro Gly Val
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Pro Val Ala Ala Gly Arg Ala Ser Gly Val Leu Pro Arg Tyr Gly Val
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<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Rv3615c
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<220>
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taa 363
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<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Rv2628
<400> 13
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<220>
<223> Rv2628
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<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Rv2034
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<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Rv2034
<400> 16
Val Ser Thr Tyr Arg Ser Pro Asp Arg Ala Trp Gln Ala Leu Ala Asp
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Gly Thr Arg Arg Ala Ile Val Glu Arg Leu Ala His Gly Pro Leu Ala
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Val Gly Glu Leu Ala Arg Asp Leu Pro Val Ser Arg Pro Ala Val Ser
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Ala Gly Thr Arg Arg Val Tyr Gln Leu Asp Pro Thr Gly Leu Ala Ala
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<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Rv3136 N-末端
<400> 17
atggatttcg cactgttacc accggaagtc aactccgccc ggatgtacac cggccctggg 60
gcaggatcgc tgttggctgc cgcgggcggc tgggattcgc tggccgccga gttggccacc 120
acagccgagg catatggatc ggtgctgtcc ggactggccg ccttgcattg gcgtggaccg 180
gcagcggaat cgatggcggt gacggccgct ccctatatcg gttggctgta cacgaccgcc 240
gaaaagacac agcaaacagc gatccaagcc agggcggcag cgctggcctt cgagcaagca 300
tacgcaatga ccctgccgcc accggtggta gcggccaacc ggatacagct gctagcactg 360
atcgcgacga acttcttcgg ccagaacact gcggcgatcg cggccaccga ggcacagtac 420
gccgagatgt gggcccagga cgccgccgcg atgtacggtt acgccaccgc ctcagcggct 480
gcggccctgc tgacaccgtt ctccccgccg cggcagacca ccaacccggc cggcctgacc 540
<210> 18
<211> 180
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Rv3136 N-末端
<400> 18
Met Asp Phe Ala Leu Leu Pro Pro Glu Val Asn Ser Ala Arg Met Tyr
1 5 10 15
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145 150 155 160
Ala Ala Leu Leu Thr Pro Phe Ser Pro Pro Arg Gln Thr Thr Asn Pro
165 170 175
Ala Gly Leu Thr
180
<210> 19
<211> 1017
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Ag85A
<400> 19
atgcagcttg ttgacagggt tcgtggcgcc gtcacgggta tgtcgcgtcg actcgtggtc 60
ggggccgtcg gcgcggccct agtgtcgggt ctggtcggcg ccgtcggtgg cacggcgacc 120
gcgggggcat tttcccggcc gggcttgccg gtggagtacc tgcaggtgcc gtcgccgtcg 180
atgggccgtg acatcaaggt ccaattccaa agtggtggtg ccaactcgcc cgccctgtac 240
ctgctcgacg gcctgcgcgc gcaggacgac ttcagcggct gggacatcaa caccccggcg 300
ttcgagtggt acgaccagtc gggcctgtcg gtggtcatgc cggtgggtgg ccagtcaagc 360
ttctactccg actggtacca gcccgcctgc ggcaaggccg gttgccagac ttacaagtgg 420
gagaccttcc tgaccagcga gctgccgggg tggctgcagg ccaacaggca cgtcaagccc 480
accggaagcg ccgtcgtcgg tctttcgatg gctgcttctt cggcgctgac gctggcgatc 540
tatcaccccc agcagttcgt ctacgcggga gcgatgtcgg gcctgttgga cccctcccag 600
gcgatgggtc ccaccctgat cggcctggcg atgggtgacg ctggcggcta caaggcctcc 660
gacatgtggg gcccgaagga ggacccggcg tggcagcgca acgacccgct gttgaacgtc 720
gggaagctga tcgccaacaa cacccgcgtc tgggtgtact gcggcaacgg caagccgtcg 780
gatctgggtg gcaacaacct gccggccaag ttcctcgagg gcttcgtgcg gaccagcaac 840
atcaagttcc aagacgccta caacgccggt ggcggccaca acggcgtgtt cgacttcccg 900
gacagcggta cgcacagctg ggagtactgg ggcgcgcagc tcaacgctat gaagcccgac 960
ctgcaacggg cactgggtgc cacgcccaac accgggcccg cgccccaggg cgcctag 1017
<210> 20
<211> 338
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Ag85A
<400> 20
Met Gln Leu Val Asp Arg Val Arg Gly Ala Val Thr Gly Met Ser Arg
1 5 10 15
Arg Leu Val Val Gly Ala Val Gly Ala Ala Leu Val Ser Gly Leu Val
20 25 30
Gly Ala Val Gly Gly Thr Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly
35 40 45
Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Ala Asn Ser Pro Ala Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Phe Ser Gly Trp Asp Ile
85 90 95
Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Asp Gln Ser Gly Leu Ser Val Val
100 105 110
Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Gln Pro
115 120 125
Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Pro Gly Trp Leu Gln Ala Asn Arg His Val Lys Pro
145 150 155 160
Thr Gly Ser Ala Val Val Gly Leu Ser Met Ala Ala Ser Ser Ala Leu
165 170 175
Thr Leu Ala Ile Tyr His Pro Gln Gln Phe Val Tyr Ala Gly Ala Met
180 185 190
Ser Gly Leu Leu Asp Pro Ser Gln Ala Met Gly Pro Thr Leu Ile Gly
195 200 205
Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala Ser Asp Met Trp Gly
210 215 220
Pro Lys Glu Asp Pro Ala Trp Gln Arg Asn Asp Pro Leu Leu Asn Val
225 230 235 240
Gly Lys Leu Ile Ala Asn Asn Thr Arg Val Trp Val Tyr Cys Gly Asn
245 250 255
Gly Lys Pro Ser Asp Leu Gly Gly Asn Asn Leu Pro Ala Lys Phe Leu
260 265 270
Glu Gly Phe Val Arg Thr Ser Asn Ile Lys Phe Gln Asp Ala Tyr Asn
275 280 285
Ala Gly Gly Gly His Asn Gly Val Phe Asp Phe Pro Asp Ser Gly Thr
290 295 300
His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala Met Lys Pro Asp
305 310 315 320
Leu Gln Arg Ala Leu Gly Ala Thr Pro Asn Thr Gly Pro Ala Pro Gln
325 330 335
Gly Ala
<210> 21
<211> 977
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Ag85B
<400> 21
atgacagacg tgagccgaaa gattcgagct tggggacgcc gattgatgat cggcacggca 60
gcggctgtag tccttccggg cctggtgggg cttgccgcgg agcggcaacc gcgggcgcgt 120
tctcccggcc ggggctgccg gtcgagtacc tgcaggtgcc gtcgccgtcg atgggccgcg 180
acatcaaggt tcagttccag agcggtggga acaactcacc tgcggtttat ctgctcgacg 240
gcctgcgcgc ccaagacgac tacaacggct gggatatcaa caccccggcg ttcgagtggt 300
actaccagtc gggactgtcg atagtcatgc cggtcggcgg gcagtccagc ttctacagcg 360
actggtacag cccggcctgc ggtaaggctg gctgccagac ttacaagtgg gaaaccttcc 420
tgaccagcga gctgccgcaa tggttgtccg ccaacagggc cgtgaagccc accggcagcg 480
ctgcaatcgg cttgtcgatg gccggctcgt cggcaatgat cttggccgcc taccaccccc 540
agcagttcat ctacgccggc tcgctgtcgg ccctgctgga cccctctcag gggatggggc 600
ctagcctgat cggcctcgcg atgggtgacg ccggcggtta caaggccgca gacatgtggg 660
gtccctcgag tgacccggca tgggagcgca acgaccctac gcagcagatc cccaagctgg 720
tcgcaaacaa cacccggcta tgggtttatt gcgggaacgg caccccgaac gagttgggcg 780
gtgccaacat acccgccgag ttcttggaga acttcgttcg tagcagcaac ctgaagttcc 840
aggatgcgta caacgccgcg ggcgggcaca acgccgtgtt caacttcccg cccaacggca 900
cgcacagctg ggagtactgg ggcgctcagc tcaacgccat gaagggtgac ctgcagagtt 960
cgttaggcgc cggctga 977
<210> 22
<211> 858
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Ag85B
<400> 22
atgtttagcc gtcctggcct gccagttgaa tacctgcaag ttccgagccc gtccatgggt 60
cgtgacatta aggtgcagtt ccagagcggc ggtaacaata gcccggctgt gtacctgctg 120
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agcgattggt acagcccggc atgcggcaag gctggttgcc aaacctacaa gtgggaaact 300
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agcgctgcta ttggcctgtc catggccggc agcagcgcga tgatcttggc ggcataccat 420
ccgcagcagt ttatctacgc cggtagcctg agcgcattgc tggacccgag ccaaggcatg 480
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tggggcccat ctagcgaccc ggcatgggag cgtaatgacc cgacccagca aattccgaaa 600
ctggtggcga ataacacgcg cctgtgggtc tactgtggca atggtacgcc gaacgagctg 660
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ttccaggacg cgtataacgc agccggtggt cacaatgcgg ttttcaattt cccgccaaat 780
ggcactcata gctgggagta ctggggtgcg cagttgaacg caatgaaagg cgatctgcaa 840
tcctctctgg gtgcgggc 858
<210> 23
<211> 858
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Ag85B
<400> 23
atgttctcca ggcccggcct gcctgtcgag tatctgcagg tcccctcccc ctccatgggc 60
agagacatca aggtgcagtt ccaatccgga ggcaacaaca gccccgccgt gtatctcctc 120
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tggtactacc agtccggact gagcatcgtc atgcccgtgg gcggccagag ctccttctac 240
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agctccctgg gagctgga 858
<210> 24
<211> 325
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Ag85B
<400> 24
Met Thr Asp Val Ser Arg Lys Ile Arg Ala Trp Gly Arg Arg Leu Met
1 5 10 15
Ile Gly Thr Ala Ala Ala Val Val Leu Pro Gly Leu Val Gly Leu Ala
20 25 30
Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val
35 40 45
Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Val
50 55 60
Gln Phe Gln Ser Gly Gly Asn Asn Ser Pro Ala Val Tyr Leu Leu Asp
65 70 75 80
Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Tyr Asn Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro
85 90 95
Ala Phe Glu Trp Tyr Tyr Gln Ser Gly Leu Ser Ile Val Met Pro Val
100 105 110
Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Ser Pro Ala Cys Gly
115 120 125
Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu
130 135 140
Leu Pro Gln Trp Leu Ser Ala Asn Arg Ala Val Lys Pro Thr Gly Ser
145 150 155 160
Ala Ala Ile Gly Leu Ser Met Ala Gly Ser Ser Ala Met Ile Leu Ala
165 170 175
Ala Tyr His Pro Gln Gln Phe Ile Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala Leu
180 185 190
Leu Asp Pro Ser Gln Gly Met Gly Pro Ser Leu Ile Gly Leu Ala Met
195 200 205
Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala Ala Asp Met Trp Gly Pro Ser Ser
210 215 220
Asp Pro Ala Trp Glu Arg Asn Asp Pro Thr Gln Gln Ile Pro Lys Leu
225 230 235 240
Val Ala Asn Asn Thr Arg Leu Trp Val Tyr Cys Gly Asn Gly Thr Pro
245 250 255
Asn Glu Leu Gly Gly Ala Asn Ile Pro Ala Glu Phe Leu Glu Asn Phe
260 265 270
Val Arg Ser Ser Asn Leu Lys Phe Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Ala Gly
275 280 285
Gly His Asn Ala Val Phe Asn Phe Pro Pro Asn Gly Thr His Ser Trp
290 295 300
Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala Met Lys Gly Asp Leu Gln Ser
305 310 315 320
Ser Leu Gly Ala Gly
325
<210> 25
<211> 286
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Ag85B
<400> 25
Met Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser
1 5 10 15
Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Asn
20 25 30
Asn Ser Pro Ala Val Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp
35 40 45
Tyr Asn Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Tyr Gln
50 55 60
Ser Gly Leu Ser Ile Val Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr
65 70 75 80
Ser Asp Trp Tyr Ser Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr
85 90 95
Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gln Trp Leu Ser Ala
100 105 110
Asn Arg Ala Val Lys Pro Thr Gly Ser Ala Ala Ile Gly Leu Ser Met
115 120 125
Ala Gly Ser Ser Ala Met Ile Leu Ala Ala Tyr His Pro Gln Gln Phe
130 135 140
Ile Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala Leu Leu Asp Pro Ser Gln Gly Met
145 150 155 160
Gly Pro Ser Leu Ile Gly Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys
165 170 175
Ala Ala Asp Met Trp Gly Pro Ser Ser Asp Pro Ala Trp Glu Arg Asn
180 185 190
Asp Pro Thr Gln Gln Ile Pro Lys Leu Val Ala Asn Asn Thr Arg Leu
195 200 205
Trp Val Tyr Cys Gly Asn Gly Thr Pro Asn Glu Leu Gly Gly Ala Asn
210 215 220
Ile Pro Ala Glu Phe Leu Glu Asn Phe Val Arg Ser Ser Asn Leu Lys
225 230 235 240
Phe Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Ala Gly Gly His Asn Ala Val Phe Asn
245 250 255
Phe Pro Pro Asn Gly Thr His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu
260 265 270
Asn Ala Met Lys Gly Asp Leu Gln Ser Ser Leu Gly Ala Gly
275 280 285
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<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Rv3407
<400> 26
atgcgtgcta ccgttgggct tgtggaggca atcggaatcc gagaactaag acagcacgca 60
tcgcgatacc tcgcccgggt tgaagccggc gaggaacttg gcgtcaccaa caaaggaaga 120
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<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Rv3407
<400> 27
Met Arg Ala Thr Val Gly Leu Val Glu Ala Ile Gly Ile Arg Glu Leu
1 5 10 15
Arg Gln His Ala Ser Arg Tyr Leu Ala Arg Val Glu Ala Gly Glu Glu
20 25 30
Leu Gly Val Thr Asn Lys Gly Arg Leu Val Ala Arg Leu Ile Pro Val
35 40 45
Gln Ala Ala Glu Arg Ser Arg Glu Ala Leu Ile Glu Ser Gly Val Leu
50 55 60
Ile Pro Ala Arg Arg Pro Gln Asn Leu Leu Asp Val Thr Ala Glu Pro
65 70 75 80
Ala Arg Gly Arg Lys Arg Thr Leu Ser Asp Val Leu Asn Glu Met Arg
85 90 95
Asp Glu Gln
<210> 28
<211> 633
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Rv1733
<400> 28
atgatcgcca caacccgcga tcgtgaagga gccaccatga tcacgtttag gctgcgcttg 60
ccgtgccgga cgatactgcg ggtgttcagc cgcaatccgc tggtgcgtgg gacggatcga 120
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gccgcggccg gcaccgcagt ccaggattcc cgcagccacg tctatgccca ccaggcccag 240
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accgccacgt cagcgccgcc gcgcacgaag atcaccgtgc ctgcccgatg ggtcgtgaac 360
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<210> 29
<211> 210
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Rv1733
<400> 29
Met Ile Ala Thr Thr Arg Asp Arg Glu Gly Ala Thr Met Ile Thr Phe
1 5 10 15
Arg Leu Arg Leu Pro Cys Arg Thr Ile Leu Arg Val Phe Ser Arg Asn
20 25 30
Pro Leu Val Arg Gly Thr Asp Arg Leu Glu Ala Val Val Met Leu Leu
35 40 45
Ala Val Thr Val Ser Leu Leu Thr Ile Pro Phe Ala Ala Ala Ala Gly
50 55 60
Thr Ala Val Gln Asp Ser Arg Ser His Val Tyr Ala His Gln Ala Gln
65 70 75 80
Thr Arg His Pro Ala Thr Ala Thr Val Ile Asp His Glu Gly Val Ile
85 90 95
Asp Ser Asn Thr Thr Ala Thr Ser Ala Pro Pro Arg Thr Lys Ile Thr
100 105 110
Val Pro Ala Arg Trp Val Val Asn Gly Ile Glu Arg Ser Gly Glu Val
115 120 125
Asn Ala Lys Pro Gly Thr Lys Ser Gly Asp Arg Val Gly Ile Trp Val
130 135 140
Asp Ser Ala Gly Gln Leu Val Asp Glu Pro Ala Pro Pro Ala Arg Ala
145 150 155 160
Ile Ala Asp Ala Ala Leu Ala Ala Leu Gly Leu Trp Leu Ser Val Ala
165 170 175
Ala Val Ala Gly Ala Leu Leu Ala Leu Thr Arg Ala Ile Leu Ile Arg
180 185 190
Val Arg Asn Ala Ser Trp Gln His Asp Ile Asp Ser Leu Phe Cys Thr
195 200 205
Gln Arg
210
<210> 30
<211> 432
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Rv2626c
<400> 30
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ctcgccagct ag 432
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<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Rv2626c
<400> 31
Met Thr Thr Ala Arg Asp Ile Met Asn Ala Gly Val Thr Cys Val Gly
1 5 10 15
Glu His Glu Thr Leu Thr Ala Ala Ala Gln Tyr Met Arg Glu His Asp
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Ile Gly Ala Leu Pro Ile Cys Gly Asp Asp Asp Arg Leu His Gly Met
35 40 45
Leu Thr Asp Arg Asp Ile Val Ile Lys Gly Leu Ala Ala Gly Leu Asp
50 55 60
Pro Asn Thr Ala Thr Ala Gly Glu Leu Ala Arg Asp Ser Ile Tyr Tyr
65 70 75 80
Val Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gln Glu Met Leu Asn Val Met Glu Glu
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His Gln Val Arg Arg Val Pro Val Ile Ser Glu His Arg Leu Val Gly
100 105 110
Ile Val Thr Glu Ala Asp Ile Ala Arg His Leu Pro Glu His Ala Ile
115 120 125
Val Gln Phe Val Lys Ala Ile Cys Ser Pro Met Ala Leu Ala Ser
130 135 140
<210> 32
<211> 1224
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> RpfA
<400> 32
atgagtggac gccaccgtaa gcccaccaca tccaacgtca gcgtcgccaa gatcgccttt 60
accggcgcag tactcggtgg cggcggcatc gccatggccg ctcaggcgac cgcggccacc 120
gacggggaat gggatcaggt ggcccgctgc gagtcgggcg gcaactggtc gatcaacacc 180
ggcaacggtt acctcggtgg cttgcagttc actcaaagca cctgggccgc acatggtggc 240
ggcgagttcg ccccgtcggc tcagctggcc agccgggagc agcagattgc cgtcggtgag 300
cgggtgctgg ccacccaggg tcgcggcgcc tggccggtgt gcggccgcgg gttatcgaac 360
gcaacacccc gcgaagtgct tcccgcttcg gcagcgatgg acgctccgtt ggacgcggcc 420
gcggtcaacg gcgaaccagc accgctggcc ccgccgcccg ccgacccggc gccacccgtg 480
gaacttgccg ctaacgacct gcccgcaccg ctgggtgaac ccctcccggc agctcccgcc 540
gacccggcac cacccgccga cctggcacca cccgcgcccg ccgacgtcgc gccacccgtg 600
gaacttgccg taaacgacct gcccgcaccg ctgggtgaac ccctcccggc agctcccgcc 660
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cccgccgacc tggcgccacc cgcgcccgcc gacctggcac cacccgtgga acttgccgta 780
aacgacctgc ccgcgccgct gggtgaaccc ctcccggcag ctcccgccga actggcgcca 840
cccgccgatc tggcacccgc gtccgccgac ctggcgccac ccgcgcccgc cgacctggcg 900
ccacccgcgc ccgccgaact ggcgccaccc gcgcccgccg acctggcacc acccgctgcg 960
gtgaacgagc aaaccgcgcc gggcgatcag cccgccacag ctccaggcgg cccggttggc 1020
cttgccaccg atttggaact ccccgagccc gacccccaac cagctgacgc accgccgccc 1080
ggcgacgtca ccgaggcgcc cgccgaaacg ccccaagtct cgaacatcgc ctatacgaag 1140
aagctgtggc aggcgattcg ggcccaggac gtctgcggca acgatgcgct ggactcgctc 1200
gcacagccgt acgtcatcgg ctga 1224
<210> 33
<211> 407
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> RpfA
<400> 33
Met Ser Gly Arg His Arg Lys Pro Thr Thr Ser Asn Val Ser Val Ala
1 5 10 15
Lys Ile Ala Phe Thr Gly Ala Val Leu Gly Gly Gly Gly Ile Ala Met
20 25 30
Ala Ala Gln Ala Thr Ala Ala Thr Asp Gly Glu Trp Asp Gln Val Ala
35 40 45
Arg Cys Glu Ser Gly Gly Asn Trp Ser Ile Asn Thr Gly Asn Gly Tyr
50 55 60
Leu Gly Gly Leu Gln Phe Thr Gln Ser Thr Trp Ala Ala His Gly Gly
65 70 75 80
Gly Glu Phe Ala Pro Ser Ala Gln Leu Ala Ser Arg Glu Gln Gln Ile
85 90 95
Ala Val Gly Glu Arg Val Leu Ala Thr Gln Gly Arg Gly Ala Trp Pro
100 105 110
Val Cys Gly Arg Gly Leu Ser Asn Ala Thr Pro Arg Glu Val Leu Pro
115 120 125
Ala Ser Ala Ala Met Asp Ala Pro Leu Asp Ala Ala Ala Val Asn Gly
130 135 140
Glu Pro Ala Pro Leu Ala Pro Pro Pro Ala Asp Pro Ala Pro Pro Val
145 150 155 160
Glu Leu Ala Ala Asn Asp Leu Pro Ala Pro Leu Gly Glu Pro Leu Pro
165 170 175
Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ala Pro Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala
180 185 190
Pro Ala Asp Val Ala Pro Pro Val Glu Leu Ala Val Asn Asp Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Leu Gly Glu Pro Leu Pro Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ala Pro
210 215 220
Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala
225 230 235 240
Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Val
245 250 255
Glu Leu Ala Val Asn Asp Leu Pro Ala Pro Leu Gly Glu Pro Leu Pro
260 265 270
Ala Ala Pro Ala Glu Leu Ala Pro Pro Ala Asp Leu Ala Pro Ala Ser
275 280 285
Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Pro
290 295 300
Ala Glu Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Ala
305 310 315 320
Val Asn Glu Gln Thr Ala Pro Gly Asp Gln Pro Ala Thr Ala Pro Gly
325 330 335
Gly Pro Val Gly Leu Ala Thr Asp Leu Glu Leu Pro Glu Pro Asp Pro
340 345 350
Gln Pro Ala Asp Ala Pro Pro Pro Gly Asp Val Thr Glu Ala Pro Ala
355 360 365
Glu Thr Pro Gln Val Ser Asn Ile Ala Tyr Thr Lys Lys Leu Trp Gln
370 375 380
Ala Ile Arg Ala Gln Asp Val Cys Gly Asn Asp Ala Leu Asp Ser Leu
385 390 395 400
Ala Gln Pro Tyr Val Ile Gly
405
<210> 34
<211> 531
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> RpfC
<400> 34
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atcatcaacg agatcatttg ggcaggcatt caggcaagta ttccgcgctg a 531
<210> 35
<211> 176
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> RpfC
<400> 35
Val His Pro Leu Pro Ala Asp His Gly Arg Ser Arg Cys Asn Arg His
1 5 10 15
Pro Ile Ser Pro Leu Ser Leu Ile Gly Asn Ala Ser Ala Thr Ser Gly
20 25 30
Asp Met Ser Ser Met Thr Arg Ile Ala Lys Pro Leu Ile Lys Ser Ala
35 40 45
Met Ala Ala Gly Leu Val Thr Ala Ser Met Ser Leu Ser Thr Ala Val
50 55 60
Ala His Ala Gly Pro Ser Pro Asn Trp Asp Ala Val Ala Gln Cys Glu
65 70 75 80
Ser Gly Gly Asn Trp Ala Ala Asn Thr Gly Asn Gly Lys Tyr Gly Gly
85 90 95
Leu Gln Phe Lys Pro Ala Thr Trp Ala Ala Phe Gly Gly Val Gly Asn
100 105 110
Pro Ala Ala Ala Ser Arg Glu Gln Gln Ile Ala Val Ala Asn Arg Val
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Leu Ala Glu Gln Gly Leu Asp Ala Trp Pro Thr Cys Gly Ala Ala Ser
130 135 140
Gly Leu Pro Ile Ala Leu Trp Ser Lys Pro Ala Gln Gly Ile Lys Gln
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Ile Ile Asn Glu Ile Ile Trp Ala Gly Ile Gln Ala Ser Ile Pro Arg
165 170 175
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<211> 465
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> RpfD
<400> 36
atgacaccgg gtttgcttac tactgcgggt gctggccgac cacgtgacag gtgcgccagg 60
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<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> RpfD
<400> 37
Met Thr Pro Gly Leu Leu Thr Thr Ala Gly Ala Gly Arg Pro Arg Asp
1 5 10 15
Arg Cys Ala Arg Ile Val Cys Thr Val Phe Ile Glu Thr Ala Val Val
20 25 30
Ala Thr Met Phe Val Ala Leu Leu Gly Leu Ser Thr Ile Ser Ser Lys
35 40 45
Ala Asp Asp Ile Asp Trp Asp Ala Ile Ala Gln Cys Glu Ser Gly Gly
50 55 60
Asn Trp Ala Ala Asn Thr Gly Asn Gly Leu Tyr Gly Gly Leu Gln Ile
65 70 75 80
Ser Gln Ala Thr Trp Asp Ser Asn Gly Gly Val Gly Ser Pro Ala Ala
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Ala Ser Pro Gln Gln Gln Ile Glu Val Ala Asp Asn Ile Met Lys Thr
100 105 110
Gln Gly Pro Gly Ala Trp Pro Lys Cys Ser Ser Cys Ser Gln Gly Asp
115 120 125
Ala Pro Leu Gly Ser Leu Thr His Ile Leu Thr Phe Leu Ala Ala Glu
130 135 140
Thr Gly Gly Cys Ser Gly Ser Arg Asp Asp
145 150
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<211> 2487
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Rv1009-Rv3615c-Rv3136
<400> 38
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<400> 39
Met Ala Cys Lys Thr Val Thr Leu Thr Val Asp Gly Thr Ala Met Arg
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Val Thr Thr Met Lys Ser Arg Val Ile Asp Ile Val Glu Glu Asn Gly
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Val His Asp Ala Asp Thr Ile Val Leu Arg Arg Ser Arg Pro Leu Gln
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Ile Ser Leu Asp Gly His Asp Ala Lys Gln Val Trp Thr Thr Ala Ser
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Thr Val Asp Glu Ala Leu Ala Gln Leu Ala Met Thr Asp Thr Ala Pro
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Ala Ala Ala Ser Arg Ala Ser Arg Val Pro Leu Ser Gly Met Ala Leu
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Pro Val Val Ser Ala Lys Thr Val Gln Leu Asn Asp Gly Gly Leu Val
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Arg Thr Val His Leu Pro Ala Pro Asn Val Ala Gly Leu Leu Ser Ala
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Ala Gly Val Pro Leu Leu Gln Ser Asp His Val Val Pro Ala Ala Thr
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Ala Pro Ile Val Glu Gly Met Gln Ile Gln Val Thr Arg Asn Arg Ile
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Lys Lys Val Thr Glu Arg Leu Pro Leu Pro Pro Asn Ala Arg Arg Val
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Glu Asp Pro Glu Met Asn Met Ser Arg Glu Val Val Glu Asp Pro Gly
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His Glu Ala Val Val Arg Val Gly Thr Lys Pro Gly Thr Glu Val Pro
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Pro Val Ile Asp Gly Ser Ile Trp Asp Ala Ile Ala Gly Cys Glu Ala
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Gly Gly Asn Trp Ala Ile Asn Thr Gly Asn Gly Tyr Tyr Gly Gly Val
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Gln Phe Asp Gln Gly Thr Trp Glu Ala Asn Gly Gly Leu Arg Tyr Ala
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Pro Arg Ala Asp Leu Ala Thr Arg Glu Glu Gln Ile Ala Val Ala Glu
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Val Thr Arg Leu Arg Gln Gly Trp Gly Ala Trp Pro Val Cys Ala Ala
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Arg Ala Gly Ala Arg Glu Phe Met Thr Glu Asn Leu Thr Val Gln Pro
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Ala Ser Ser Gly Val Glu Ala Ala Ala Gly Leu Gly Glu Ser Val Ala
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Tyr Leu Thr Ala His Asn Ala Leu Gly Ser Ser Leu His Thr Ala Gly
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Ser Leu Ala Ala Glu Leu Ala Thr Thr Ala Glu Ala Tyr Gly Ser Val
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Leu Ser Gly Leu Ala Ala Leu His Trp Arg Gly Pro Ala Ala Glu Ser
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Asn Arg Ile Gln Leu Leu Ala Leu Ile Ala Thr Asn Phe Phe Gly Gln
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Leu Ser Leu Leu Ile Glu Thr Val Thr Gln Ala Leu Gln Ala Leu Thr
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Leu Val Ser Ala Thr Ser Pro Gly Gly Gly Val Ser Ala Ser Gly Ala
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Pro Val Ala Ala Gly Arg Ala Ser Gly Val Leu Pro Arg Tyr Gly Val
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<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
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<211> 832
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
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<223> Rv1009-Rv2034-Rv3136
<400> 41
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Val Glu Thr Gly Arg Leu Pro Val Ala Asn Val Val Val Thr Pro Ala
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Trp Ala Ala Pro Ser Thr Arg Pro Val Ser Ala Leu Ser Pro Ala Gly
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Leu Thr Thr Leu Pro Gly Thr Asp Val Ala Glu His Gly Met Pro Gly
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Ser Gly Val Leu Pro Arg Tyr Gly Val Arg Leu Thr Val Met Ala
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20 25 30
Phe Ser Val Asp Asp Arg Asp Asp Leu Tyr Pro Ala Ala Gly Val Gln
35 40 45
Val His Asp Ala Asp Thr Ile Val Leu Arg Arg Ser Arg Pro Leu Gln
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Ile Ser Leu Asp Gly His Asp Ala Lys Gln Val Trp Thr Thr Ala Ser
65 70 75 80
Thr Val Asp Glu Ala Leu Ala Gln Leu Ala Met Thr Asp Thr Ala Pro
85 90 95
Ala Ala Ala Ser Arg Ala Ser Arg Val Pro Leu Ser Gly Met Ala Leu
100 105 110
Pro Val Val Ser Ala Lys Thr Val Gln Leu Asn Asp Gly Gly Leu Val
115 120 125
Arg Thr Val His Leu Pro Ala Pro Asn Val Ala Gly Leu Leu Ser Ala
130 135 140
Ala Gly Val Pro Leu Leu Gln Ser Asp His Val Val Pro Ala Ala Thr
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165 170 175
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435 440 445
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<220>
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<400> 52
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<212> DNA
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<400> 55
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Met Thr Asp Thr Ala Pro Ala Ala Ala Ser Arg Ala Ser Arg Val Pro
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Leu Ser Gly Met Ala Leu Pro Val Val Ser Ala Lys Thr Val Gln Leu
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Asn Asp Gly Gly Leu Val Arg Thr Val His Leu Pro Ala Pro Asn Val
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Ala Gly Leu Leu Ser Ala Ala Gly Val Pro Leu Leu Gln Ser Asp His
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Val Val Pro Ala Ala Thr Ala Pro Ile Val Glu Gly Met Gln Ile Gln
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Val Thr Arg Asn Arg Ile Lys Lys Val Thr Glu Arg Leu Pro Leu Pro
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325 330 335
Arg Asn Ala Ser Trp Gln His Asp Ile Asp Ser Leu Phe Cys Thr Gln
340 345 350
Arg
<210> 68
<211> 2217
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> RpfA-RpfC-RpfD
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<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> RpfA-RpfC-RpfD
<400> 69
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Gly Glu Phe Ala Pro Ser Ala Gln Leu Ala Ser Arg Glu Gln Gln Ile
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Glu Leu Ala Ala Asn Asp Leu Pro Ala Pro Leu Gly Glu Pro Leu Pro
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Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala
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Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Val
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Glu Leu Ala Val Asn Asp Leu Pro Ala Pro Leu Gly Glu Pro Leu Pro
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Ala Ala Pro Ala Glu Leu Ala Pro Pro Ala Asp Leu Ala Pro Ala Ser
275 280 285
Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Pro
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Ala Glu Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Ala
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Val Asn Glu Gln Thr Ala Pro Gly Asp Gln Pro Ala Thr Ala Pro Gly
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Gly Pro Val Gly Leu Ala Thr Asp Leu Glu Leu Pro Glu Pro Asp Pro
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<213> 结核分枝杆菌
<220>
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<400> 70
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Lys Lys Val Thr Glu Arg Leu Pro Leu Pro Pro Asn Ala Arg Arg Val
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<220>
<223> Rv2628-Rv3136Nt-Rv1009-Rv2034-Rv3615c
<400> 73
Met Ser Thr Gln Arg Pro Arg His Ser Gly Ile Arg Ala Val Gly Pro
1 5 10 15
Tyr Ala Trp Ala Gly Arg Cys Gly Arg Ile Gly Arg Trp Gly Val His
20 25 30
Gln Glu Ala Met Met Asn Leu Ala Ile Trp His Pro Arg Lys Val Gln
35 40 45
Ser Ala Thr Ile Tyr Gln Val Thr Asp Arg Ser His Asp Gly Arg Thr
50 55 60
Ala Arg Val Pro Gly Asp Glu Ile Thr Ser Thr Val Ser Gly Trp Leu
65 70 75 80
Ser Glu Leu Gly Thr Gln Ser Pro Leu Ala Asp Glu Leu Ala Arg Ala
85 90 95
Val Arg Ile Gly Asp Trp Pro Ala Ala Tyr Ala Ile Gly Glu His Leu
100 105 110
Ser Val Glu Ile Ala Val Ala Val Gly Phe Met Asp Phe Ala Leu Leu
115 120 125
Pro Pro Glu Val Asn Ser Ala Arg Met Tyr Thr Gly Pro Gly Ala Gly
130 135 140
Ser Leu Leu Ala Ala Ala Gly Gly Trp Asp Ser Leu Ala Ala Glu Leu
145 150 155 160
Ala Thr Thr Ala Glu Ala Tyr Gly Ser Val Leu Ser Gly Leu Ala Ala
165 170 175
Leu His Trp Arg Gly Pro Ala Ala Glu Ser Met Ala Val Thr Ala Ala
180 185 190
Pro Tyr Ile Gly Trp Leu Tyr Thr Thr Ala Glu Lys Thr Gln Gln Thr
195 200 205
Ala Ile Gln Ala Arg Ala Ala Ala Leu Ala Phe Glu Gln Ala Tyr Ala
210 215 220
Met Thr Leu Pro Pro Pro Val Val Ala Ala Asn Arg Ile Gln Leu Leu
225 230 235 240
Ala Leu Ile Ala Thr Asn Phe Phe Gly Gln Asn Thr Ala Ala Ile Ala
245 250 255
Ala Thr Glu Ala Gln Tyr Ala Glu Met Trp Ala Gln Asp Ala Ala Ala
260 265 270
Met Tyr Gly Tyr Ala Thr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Leu Leu Thr Pro
275 280 285
Phe Ser Pro Pro Arg Gln Thr Thr Asn Pro Ala Gly Leu Thr Glu Phe
290 295 300
Met Ala Cys Lys Thr Val Thr Leu Thr Val Asp Gly Thr Ala Met Arg
305 310 315 320
Val Thr Thr Met Lys Ser Arg Val Ile Asp Ile Val Glu Glu Asn Gly
325 330 335
Phe Ser Val Asp Asp Arg Asp Asp Leu Tyr Pro Ala Ala Gly Val Gln
340 345 350
Val His Asp Ala Asp Thr Ile Val Leu Arg Arg Ser Arg Pro Leu Gln
355 360 365
Ile Ser Leu Asp Gly His Asp Ala Lys Gln Val Trp Thr Thr Ala Ser
370 375 380
Thr Val Asp Glu Ala Leu Ala Gln Leu Ala Met Thr Asp Thr Ala Pro
385 390 395 400
Ala Ala Ala Ser Arg Ala Ser Arg Val Pro Leu Ser Gly Met Ala Leu
405 410 415
Pro Val Val Ser Ala Lys Thr Val Gln Leu Asn Asp Gly Gly Leu Val
420 425 430
Arg Thr Val His Leu Pro Ala Pro Asn Val Ala Gly Leu Leu Ser Ala
435 440 445
Ala Gly Val Pro Leu Leu Gln Ser Asp His Val Val Pro Ala Ala Thr
450 455 460
Ala Pro Ile Val Glu Gly Met Gln Ile Gln Val Thr Arg Asn Arg Ile
465 470 475 480
Lys Lys Val Thr Glu Arg Leu Pro Leu Pro Pro Asn Ala Arg Arg Val
485 490 495
Glu Asp Pro Glu Met Asn Met Ser Arg Glu Val Val Glu Asp Pro Gly
500 505 510
Val Pro Gly Thr Gln Asp Val Thr Phe Ala Val Ala Glu Val Asn Gly
515 520 525
Val Glu Thr Gly Arg Leu Pro Val Ala Asn Val Val Val Thr Pro Ala
530 535 540
His Glu Ala Val Val Arg Val Gly Thr Lys Pro Gly Thr Glu Val Pro
545 550 555 560
Pro Val Ile Asp Gly Ser Ile Trp Asp Ala Ile Ala Gly Cys Glu Ala
565 570 575
Gly Gly Asn Trp Ala Ile Asn Thr Gly Asn Gly Tyr Tyr Gly Gly Val
580 585 590
Gln Phe Asp Gln Gly Thr Trp Glu Ala Asn Gly Gly Leu Arg Tyr Ala
595 600 605
Pro Arg Ala Asp Leu Ala Thr Arg Glu Glu Gln Ile Ala Val Ala Glu
610 615 620
Val Thr Arg Leu Arg Gln Gly Trp Gly Ala Trp Pro Val Cys Ala Ala
625 630 635 640
Arg Ala Gly Ala Arg Glu Leu Val Ser Thr Tyr Arg Ser Pro Asp Arg
645 650 655
Ala Trp Gln Ala Leu Ala Asp Gly Thr Arg Arg Ala Ile Val Glu Arg
660 665 670
Leu Ala His Gly Pro Leu Ala Val Gly Glu Leu Ala Arg Asp Leu Pro
675 680 685
Val Ser Arg Pro Ala Val Ser Gln His Leu Lys Val Leu Lys Thr Ala
690 695 700
Arg Leu Val Cys Asp Arg Pro Ala Gly Thr Arg Arg Val Tyr Gln Leu
705 710 715 720
Asp Pro Thr Gly Leu Ala Ala Leu Arg Thr Asp Leu Asp Arg Phe Trp
725 730 735
Thr Arg Ala Leu Thr Gly Tyr Ala Gln Leu Ile Asp Ser Glu Gly Asp
740 745 750
Asp Thr Lys Leu Met Thr Glu Asn Leu Thr Val Gln Pro Glu Arg Leu
755 760 765
Gly Val Leu Ala Ser His His Asp Asn Ala Ala Val Asp Ala Ser Ser
770 775 780
Gly Val Glu Ala Ala Ala Gly Leu Gly Glu Ser Val Ala Ile Thr His
785 790 795 800
Gly Pro Tyr Cys Ser Gln Phe Asn Asp Thr Leu Asn Val Tyr Leu Thr
805 810 815
Ala His Asn Ala Leu Gly Ser Ser Leu His Thr Ala Gly Val Asp Leu
820 825 830
Ala Lys Ser Leu Arg Ile Ala Ala Lys Ile Tyr Ser Glu Ala Asp Glu
835 840 845
Ala Trp Arg Lys Ala Ile Asp Gly Leu Phe Thr
850 855
<210> 74
<211> 2580
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Rv2628-Rv3136Nt-Rv2034-Rv3615c-Rv1009
<400> 74
atgtccacgc aacgaccgag gcactccggt attcgggctg ttggccccta cgcatgggcc 60
ggccgatgtg gtcggatagg caggtggggg gtgcaccagg aggcgatgat gaatctagcg 120
atatggcacc cgcgcaaggt gcaatccgcc accatctatc aggtgaccga tcgctcgcac 180
gacgggcgca cagcacgggt gcctggtgac gagatcacta gcaccgtgtc cggttggttg 240
tcggagttgg gcacccaaag cccgttggcc gatgagcttg cgcgtgcggt gcggatcggc 300
gactggcccg ctgcgtacgc aatcggtgag cacctgtccg ttgagattgc cgttgcggtc 360
ggattcatgg atttcgcact gttaccaccg gaagtcaact ccgcccggat gtacaccggc 420
cctggggcag gatcgctgtt ggctgccgcg ggcggctggg attcgctggc cgccgagttg 480
gccaccacag ccgaggcata tggatcggtg ctgtccggac tggccgcctt gcattggcgt 540
ggaccggcag cggaatcgat ggcggtgacg gccgctccct atatcggttg gctgtacacg 600
accgccgaaa agacacagca aacagcgatc caagccaggg cggcagcgct ggccttcgag 660
caagcatacg caatgaccct gccgccaccg gtggtagcgg ccaaccggat acagctgcta 720
gcactgatcg cgacgaactt cttcggccag aacactgcgg cgatcgcggc caccgaggca 780
cagtacgccg agatgtgggc ccaggacgcc gccgcgatgt acggttacgc caccgcctca 840
gcggctgcgg ccctgctgac accgttctcc ccgccgcggc agaccaccaa cccggccggc 900
ctgaccgaat tcgtgtccac ttacagatca ccggatcgcg cttggcaggc gctggcggac 960
ggcactcgcc gggccatcgt ggagcggctg gcgcacggcc cgctggccgt cggcgagttg 1020
gcccgcgacc tgcccgtcag ccgacccgcg gtgtcacagc acctcaaagt gctcaagacc 1080
gccaggctgg tgtgcgaccg ccccgcggga acacgccgcg tctaccagct cgacccgaca 1140
ggccttgcgg cattgcgcac cgacctcgac cggttctgga cacgcgccct gactggctac 1200
gcgcagctca tcgactccga aggagacgac acagagctca tgacggaaaa cttgaccgtc 1260
cagcccgagc gtctcggtgt actggcgtcg caccatgaca acgcggcggt cgatgcctcc 1320
tcgggcgtcg aagctgccgc tggcctaggc gaatctgtgg cgatcactca cggtccgtac 1380
tgctcacagt tcaacgacac gttaaatgtg tacttgactg cccacaatgc cctgggctcg 1440
tccttgcata cggccggtgt cgatctcgcc aaaagtcttc gaattgcggc gaagatatat 1500
agcgaggccg acgaagcgtg gcgcaaggct atcgacgggt tgtttaccaa gcttatggca 1560
tgcaaaacgg tgacgttgac cgtcgacgga accgcgatgc gggtgaccac gatgaaatcg 1620
cgggtgatcg acatcgtcga agagaacggg ttctcagtcg acgaccgcga cgacctgtat 1680
cccgcggccg gcgtgcaggt ccatgacgcc gacaccatcg tgctgcggcg tagccgtccg 1740
ctgcagatct cgctggatgg tcacgacgct aagcaggtgt ggacgaccgc gtcgacggtg 1800
gacgaggcgc tggcccaact cgcgatgacc gacacggcgc cggccgcggc ttctcgcgcc 1860
agccgcgtcc cgctgtccgg gatggcgcta ccggtcgtca gcgccaagac ggtgcagctc 1920
aacgacggcg ggttggtgcg cacggtgcac ttgccggccc ccaatgtcgc ggggctgctg 1980
agtgcggccg gcgtgccgct gttgcaaagc gaccacgtgg tgcccgccgc gacggccccg 2040
atcgtcgaag gcatgcagat ccaggtgacc cgcaatcgga tcaagaaggt caccgagcgg 2100
ctgccgctgc cgccgaacgc gcgtcgtgtc gaggacccgg agatgaacat gagccgggag 2160
gtcgtcgaag acccgggggt tccggggacc caggatgtga cgttcgcggt agctgaggtc 2220
aacggcgtcg agaccggccg tttgcccgtc gccaacgtcg tggtgacccc ggcccacgaa 2280
gccgtggtgc gggtgggcac caagcccggt accgaggtgc ccccggtgat cgacggaagc 2340
atctgggacg cgatcgccgg ctgtgaggcc ggtggcaact gggcgatcaa caccggcaac 2400
gggtattacg gtggtgtgca gtttgaccag ggcacctggg aggccaacgg cgggctgcgg 2460
tatgcacccc gcgctgacct cgccacccgc gaagagcaga tcgccgttgc cgaggtgacc 2520
cgactgcgtc aaggttgggg cgcctggccg gtatgtgctg cacgagcggg tgcgcgctga 2580
<210> 75
<211> 859
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Rv2628-Rv3136Nt-Rv2034-Rv3615c-Rv1009
<400> 75
Met Ser Thr Gln Arg Pro Arg His Ser Gly Ile Arg Ala Val Gly Pro
1 5 10 15
Tyr Ala Trp Ala Gly Arg Cys Gly Arg Ile Gly Arg Trp Gly Val His
20 25 30
Gln Glu Ala Met Met Asn Leu Ala Ile Trp His Pro Arg Lys Val Gln
35 40 45
Ser Ala Thr Ile Tyr Gln Val Thr Asp Arg Ser His Asp Gly Arg Thr
50 55 60
Ala Arg Val Pro Gly Asp Glu Ile Thr Ser Thr Val Ser Gly Trp Leu
65 70 75 80
Ser Glu Leu Gly Thr Gln Ser Pro Leu Ala Asp Glu Leu Ala Arg Ala
85 90 95
Val Arg Ile Gly Asp Trp Pro Ala Ala Tyr Ala Ile Gly Glu His Leu
100 105 110
Ser Val Glu Ile Ala Val Ala Val Gly Phe Met Asp Phe Ala Leu Leu
115 120 125
Pro Pro Glu Val Asn Ser Ala Arg Met Tyr Thr Gly Pro Gly Ala Gly
130 135 140
Ser Leu Leu Ala Ala Ala Gly Gly Trp Asp Ser Leu Ala Ala Glu Leu
145 150 155 160
Ala Thr Thr Ala Glu Ala Tyr Gly Ser Val Leu Ser Gly Leu Ala Ala
165 170 175
Leu His Trp Arg Gly Pro Ala Ala Glu Ser Met Ala Val Thr Ala Ala
180 185 190
Pro Tyr Ile Gly Trp Leu Tyr Thr Thr Ala Glu Lys Thr Gln Gln Thr
195 200 205
Ala Ile Gln Ala Arg Ala Ala Ala Leu Ala Phe Glu Gln Ala Tyr Ala
210 215 220
Met Thr Leu Pro Pro Pro Val Val Ala Ala Asn Arg Ile Gln Leu Leu
225 230 235 240
Ala Leu Ile Ala Thr Asn Phe Phe Gly Gln Asn Thr Ala Ala Ile Ala
245 250 255
Ala Thr Glu Ala Gln Tyr Ala Glu Met Trp Ala Gln Asp Ala Ala Ala
260 265 270
Met Tyr Gly Tyr Ala Thr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Leu Leu Thr Pro
275 280 285
Phe Ser Pro Pro Arg Gln Thr Thr Asn Pro Ala Gly Leu Thr Glu Phe
290 295 300
Val Ser Thr Tyr Arg Ser Pro Asp Arg Ala Trp Gln Ala Leu Ala Asp
305 310 315 320
Gly Thr Arg Arg Ala Ile Val Glu Arg Leu Ala His Gly Pro Leu Ala
325 330 335
Val Gly Glu Leu Ala Arg Asp Leu Pro Val Ser Arg Pro Ala Val Ser
340 345 350
Gln His Leu Lys Val Leu Lys Thr Ala Arg Leu Val Cys Asp Arg Pro
355 360 365
Ala Gly Thr Arg Arg Val Tyr Gln Leu Asp Pro Thr Gly Leu Ala Ala
370 375 380
Leu Arg Thr Asp Leu Asp Arg Phe Trp Thr Arg Ala Leu Thr Gly Tyr
385 390 395 400
Ala Gln Leu Ile Asp Ser Glu Gly Asp Asp Thr Glu Leu Met Thr Glu
405 410 415
Asn Leu Thr Val Gln Pro Glu Arg Leu Gly Val Leu Ala Ser His His
420 425 430
Asp Asn Ala Ala Val Asp Ala Ser Ser Gly Val Glu Ala Ala Ala Gly
435 440 445
Leu Gly Glu Ser Val Ala Ile Thr His Gly Pro Tyr Cys Ser Gln Phe
450 455 460
Asn Asp Thr Leu Asn Val Tyr Leu Thr Ala His Asn Ala Leu Gly Ser
465 470 475 480
Ser Leu His Thr Ala Gly Val Asp Leu Ala Lys Ser Leu Arg Ile Ala
485 490 495
Ala Lys Ile Tyr Ser Glu Ala Asp Glu Ala Trp Arg Lys Ala Ile Asp
500 505 510
Gly Leu Phe Thr Lys Leu Met Ala Cys Lys Thr Val Thr Leu Thr Val
515 520 525
Asp Gly Thr Ala Met Arg Val Thr Thr Met Lys Ser Arg Val Ile Asp
530 535 540
Ile Val Glu Glu Asn Gly Phe Ser Val Asp Asp Arg Asp Asp Leu Tyr
545 550 555 560
Pro Ala Ala Gly Val Gln Val His Asp Ala Asp Thr Ile Val Leu Arg
565 570 575
Arg Ser Arg Pro Leu Gln Ile Ser Leu Asp Gly His Asp Ala Lys Gln
580 585 590
Val Trp Thr Thr Ala Ser Thr Val Asp Glu Ala Leu Ala Gln Leu Ala
595 600 605
Met Thr Asp Thr Ala Pro Ala Ala Ala Ser Arg Ala Ser Arg Val Pro
610 615 620
Leu Ser Gly Met Ala Leu Pro Val Val Ser Ala Lys Thr Val Gln Leu
625 630 635 640
Asn Asp Gly Gly Leu Val Arg Thr Val His Leu Pro Ala Pro Asn Val
645 650 655
Ala Gly Leu Leu Ser Ala Ala Gly Val Pro Leu Leu Gln Ser Asp His
660 665 670
Val Val Pro Ala Ala Thr Ala Pro Ile Val Glu Gly Met Gln Ile Gln
675 680 685
Val Thr Arg Asn Arg Ile Lys Lys Val Thr Glu Arg Leu Pro Leu Pro
690 695 700
Pro Asn Ala Arg Arg Val Glu Asp Pro Glu Met Asn Met Ser Arg Glu
705 710 715 720
Val Val Glu Asp Pro Gly Val Pro Gly Thr Gln Asp Val Thr Phe Ala
725 730 735
Val Ala Glu Val Asn Gly Val Glu Thr Gly Arg Leu Pro Val Ala Asn
740 745 750
Val Val Val Thr Pro Ala His Glu Ala Val Val Arg Val Gly Thr Lys
755 760 765
Pro Gly Thr Glu Val Pro Pro Val Ile Asp Gly Ser Ile Trp Asp Ala
770 775 780
Ile Ala Gly Cys Glu Ala Gly Gly Asn Trp Ala Ile Asn Thr Gly Asn
785 790 795 800
Gly Tyr Tyr Gly Gly Val Gln Phe Asp Gln Gly Thr Trp Glu Ala Asn
805 810 815
Gly Gly Leu Arg Tyr Ala Pro Arg Ala Asp Leu Ala Thr Arg Glu Glu
820 825 830
Gln Ile Ala Val Ala Glu Val Thr Arg Leu Arg Gln Gly Trp Gly Ala
835 840 845
Trp Pro Val Cys Ala Ala Arg Ala Gly Ala Arg
850 855

Claims (25)

1.一种组合物或融合蛋白,其包含至少三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原,其中所述Mtb抗原选自Rv1009、Rv3136、Rv3615c、Rv2628、Rv2034和Rv3136N-末端。
2.根据权利要求1所述的组合物或融合蛋白,其中:
Rv1009包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列;
Rv3136包含SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列;
Rv3615c包含SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列;
Rv2628包含SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列;
Rv2034包含SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列;或者
Rv3136Nt包含SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的组合物或融合蛋白,其中:
Rv1009由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中列出的核苷酸序列编码;
其中Rv3136由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7中列出的核苷酸序列编码;
Rv3615c由SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中列出的核苷酸序列编码;
Rv2628由SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13中列出的核苷酸序列编码;
Rv2034由SEQ ID NO:15中列出的核苷酸序列编码;或者
Rv3136Nt由SEQ ID NO:17中列出的核苷酸序列编码。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物或融合蛋白,其包含至少四种或五种结核分枝杆菌(Mtb)抗原。
5.根据权利要求1所述的组合物或融合蛋白,其包含:
Rv1009、Rv3615c和Rv3136Mtb抗原;
Rv1009、Rv2034和Rv3136Mtb抗原;
Rv1009、Rv3615c和Rv3136Mtb抗原;
Rv1009、Rv2628、Rv3615c和Rv3136Mtb抗原;
Rv1009、Rv3615c、Rv2034和Rv2628Mtb抗原;
Rv2034、Rv3615c、Rv2628和Rv3136Mtb抗原;
Rv1009、Rv2034、Rv2628、Rv3615c和Rv3136Mtb抗原;
Rv1009、Rv3136Nt、Rv2628、Rv2034和Rv3615c Mtb抗原;或者
Rv2034、Rv3615c、Rv3136Nt、Rv2628和Rv1009Mtb抗原。
6.根据权利要求5所述的组合物或融合蛋白,其中:
Rv1009包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列;
Rv3136包含SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列;
Rv3615c包含SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列;
Rv2628包含SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列;
Rv2034包含SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列;并且
Rv3136Nt包含SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列。
7.根据权利要求5所述的组合物或融合蛋白,其中:
Rv1009由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中列出的核苷酸序列编码;
Rv3136由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7中列出的核苷酸序列编码;
Rv3615c由SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中列出的核苷酸序列编码;
Rv2628由SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13中列出的核苷酸序列编码;
Rv2034由SEQ ID NO:15中列出的核苷酸序列编码;并且
Rv3136Nt由SEQ ID NO:17中列出的核苷酸序列编码。
8.根据权利要求1所述的融合蛋白,其包含:
Rv1009-Rv3615c-Rv3136;
Rv1009-Rv2034-Rv3136;
Rv1009-Rv2628-Rv3615c-Rv3136;
Rv1009-Rv2034-Rv2628-Rv3615c-Rv3136;
Rv2034-Rv1009-Rv3136;
Rv3136-Rv2034-Rv1009;
Rv1009-Rv3615c-Rv2034-Rv2628;
Rv3615c-Rv2034-Rv2628-Rv1009;
Rv2034-Rv3615c-Rv2628-Rv3136;
Rv3136-Rv2628-Rv3615c-Rv2034;
Rv1009-Rv3136Nt-Rv2628-Rv2034-Rv3615c;
Rv2034-Rv3615c-Rv3136Nt-Rv2628-Rv1009;
Rv3615c-Rv2628-Rv1009-Rv3136Nt-Rv2034;
Rv1009-Rv2628-Rv3136Nt-Rv2034-Rv3615c;
Rv2628-Rv3136Nt-Rv1009-Rv2034-Rv3615c;或者
Rv2628-Rv3136Nt-Rv2034-Rv3615c-Rv1009。
9.根据权利要求8所述的融合蛋白,其中:
Rv1009包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列;
Rv3136包含SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列;
Rv3615c包含SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列;
Rv2628包含SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列;
Rv2034包含SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列;并且
Rv3136Nt包含SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列。
10.根据权利要求8所述的融合蛋白,其中:
Rv1009由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中列出的核苷酸序列编码;
Rv3136由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7中列出的核苷酸序列编码;
Rv3615c由SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中列出的核苷酸序列编码;
Rv2628由SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13中列出的核苷酸序列编码;
Rv2034由SEQ ID NO:15中列出的核苷酸序列编码;并且
Rv3136Nt由SEQ ID NO:17中列出的核苷酸序列编码。
11.根据权利要求8所述的融合蛋白,其中:
Rv1009-Rv3615c-Rv3136包含SEQ ID NO:39中列出的氨基酸序列;
Rv1009-Rv2034-Rv3136包含SEQ ID NO:41中列出的氨基酸序列;
Rv1009-Rv2628-Rv3615c-Rv3136包含SEQ ID NO:43中列出的氨基酸序列;
Rv1009-Rv2034-Rv2628-Rv3615c-Rv3136包含SEQ ID NO:45中列出的氨基酸序列;
Rv2034-Rv1009-Rv3136包含SEQ ID NO:47中列出的氨基酸序列;
Rv3136-Rv2034-Rv1009包含SEQ ID NO:49中列出的氨基酸序列;
Rv1009-Rv3615c-Rv2034-Rv2628包含SEQ ID NO:51中列出的氨基酸序列;
Rv3615c-Rv2034-Rv2628-Rv1009包含SEQ ID NO:53中列出的氨基酸序列;
Rv2034-Rv3615c-Rv2628-Rv3136包含SEQ ID NO:55中列出的氨基酸序列;
Rv3136-Rv2628-Rv3615c-Rv2034包含SEQ ID NO:57中列出的氨基酸序列;
Rv1009-Rv3136Nt-Rv2628-Rv2034-Rv3615c包含SEQ ID NO:59中列出的氨基酸序列;
Rv2034-Rv3615c-Rv3136Nt-Rv2628-Rv1009包含SEQ ID NO:61中列出的氨基酸序列;
Rv3615c-Rv2628-Rv1009-Rv3136Nt-Rv2034包含SEQ ID NO:63中列出的氨基酸序列;
Rv1009-Rv2628-Rv3136Nt-Rv2034-Rv3615c包含SEQ ID NO:71中列出的氨基酸序列;
Rv2628-Rv3136Nt-Rv1009-Rv2034-Rv3615c包含SEQ ID NO:73中列出的氨基酸序列;并且
Rv2628-Rv3136Nt-Rv2034-Rv3615c-Rv1009包含SEQ ID NO:75中列出的氨基酸序列。
12.根据权利要求8所述的融合蛋白,其中:
Rv1009-Rv3615c-Rv3136由SEQ ID NO:38中列出的核苷酸序列编码;
Rv1009-Rv2034-Rv3136由SEQ ID NO:40中列出的核苷酸序列编码;
Rv1009-Rv2628-Rv3615c-Rv3136由SEQ ID NO:42中列出的核苷酸序列编码;
Rv1009-Rv2034-Rv2628-Rv3615c-Rv3136由SEQ ID NO:44中列出的核苷酸序列编码;
Rv2034-Rv1009-Rv3136由SEQ ID NO:46中列出的核苷酸序列编码;
Rv3136-Rv2034-Rv1009由SEQ ID NO:48中列出的核苷酸序列编码;
Rv1009-Rv3615c-Rv2034-Rv2628由SEQ ID NO:50中列出的核苷酸序列编码;
Rv3615c-Rv2034-Rv2628-Rv1009由SEQ ID NO:52中列出的核苷酸序列编码;
Rv2034-Rv3615c-Rv2628-Rv3136由SEQ ID NO:54中列出的核苷酸序列编码;
Rv3136-Rv2628-Rv3615c-Rv2034由SEQ ID NO:56中列出的核苷酸序列编码;
Rv1009-Rv3136Nt-Rv2628-Rv2034-Rv3615c由SEQ ID NO:58中列出的核苷酸序列编码;
Rv2034-Rv3615c-Rv3136Nt-Rv2628-Rv1009由SEQ ID NO:60中列出的核苷酸序列编码;
Rv3615c-Rv2628-Rv1009-Rv3136Nt-Rv2034由SEQ ID NO:62中列出的核苷酸序列编码;
Rv1009-Rv2628-Rv3136Nt-Rv2034-Rv3615c由SEQ ID NO:70中列出的核苷酸序列编码;
Rv2628-Rv3136Nt-Rv1009-Rv2034-Rv3615c由SEQ ID NO:72中列出的核苷酸序列编码;并且
Rv2628-Rv3136Nt-Rv2034-Rv3615c-Rv1009由SEQ ID NO:74中列出的核苷酸序列编码。
13.一种组合物或融合蛋白,其包含至少两种结核分枝杆菌(Mtb)抗原,其中所述Mtb抗原是Rv1733和Rv2626c。
14.根据权利要求13所述的融合蛋白,其包含Rv1733-Rv2626c。
15.一种组合物或融合蛋白,其包含至少三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原,其中所述Mtb抗原选自Ag85A、Ag85B、Rv3407、RpfA、RpfC和RpfD。
16.根据权利要求15所述的组合物或融合蛋白,其包含:
Ag85A、Ag85B和Rv3407Mtb抗原;或者
RpfA、RpfC和RpfD Mtb抗原。
17.根据权利要求16所述的融合蛋白,其包含:
Ag85A-Ag85B-Rv3407;或者
RpfA-RpfC-RpfD。
18.一种药物组合物,其包含根据权利要求1至17中任一项所述的组合物或融合蛋白以及药学上可接受的载体。
19.一种载体,其编码根据权利要求1至17中任一项所述的融合蛋白。
20.一种细胞,其包含根据权利要求19所述的载体。
21.一种在哺乳动物中引发针对结核分枝杆菌的免疫应答的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用免疫学足够量的根据权利要求1至17中任一项所述的组合物或融合蛋白。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述组合物或融合蛋白以气雾剂的形式施用至所述哺乳动物。
23.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物或融合蛋白在制备用于在哺乳动物中引发针对结核分枝杆菌的免疫应答的药物中的用途。
24.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物或融合蛋白用于在哺乳动物中引发针对结核分枝杆菌的免疫应答的用途。
25.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物或融合蛋白,其用于在哺乳动物中引发针对结核分枝杆菌的免疫应答。
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