JP4633931B2 - 結核診断試験 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、マイコバクテリウムの感染、特に、結核菌（マイコバクテリウム ツベルクローシス、Mycobacteriu tuberculosis)の感染を診断する方法に関する。本発明はまた、この診断方法を実施するのに使用可能なペプチドおよびキットに関する。
【０００２】
結核症に対する現在の診断方法は、時間がかかるか、または信頼性がないかのいずれかである。マイコバクテリウムの培養には8週間必要であるので、結核を引き起こすマイコバクテリウムの同定に依拠する試験は時間がかかる。細菌を培養することが不可能な場合もある。更に、マイコバクテリウムの存在を検出するためのサンプルを取得するのに、多くの場合、観血的手順が必要である。
【０００３】
代替試験には、マイコバクテリウムの精製タンパク質誘導体の皮内投与に対する遅延型過敏性(DTH)応答の検出に基づくツベルクリン皮膚試験(TST)またはマントー試験がある。この試験は、マイコバクテリウムの同定に依拠する試験よりも短い時間で済むが、結核に対するワクチンとしてBCGが広範に使用されているため、信頼性はより低い。BCGは、結核菌との関連性が強く、従って、BCG接種を受けた個体は、TSTに対して陽性の反応を示す可能性がある。更に、活動性結核に罹患している人々の大部分は、皮膚免疫アネルギーが原因で、TSTによって検出されない。従って、TSTの特異性および感度は低い。
【０００４】
T細胞からのIFN-γの放出を検出するアッセイを用いて、本発明者らは、結核菌のESAT-6タンパク質に由来する8種のペプチドが、結核に罹患している大部分の患者のT細胞によって認識されること、特に、配列番号1で表されるペプチドが、試験した患者の57%および試験した健常接触者の68%で認識されることを見いだした。これらの接触者は、開放性肺結核に暴露された。本発明者らは、これらのペプチドを組み合わせることにより、診断試験で一緒に使用した場合に91.5%の特異性および96%の感度を示すペプチドのパネルを作製した。本発明者らはまた、ESAT-6に由来する3種の他のペプチドが、結核に罹患している患者のT細胞によって認識され、診断試験の感度を増大するのに使用可能であることを見いだした。
【０００５】
有利なことに、BCGはESAT-6遺伝子をもたず、従って、TSTを含めて従来の試験とは異なり、本診断試験では、結核に罹患している患者と、BCG接種を受けた患者とを区別することができる。
【０００６】
Brandt et al. (1996), Journal of Immunology, 157, 3527-33には、マウスによって認識されるESAT-6由来のエピトープが開示されている。しかしながら、マウスで認識されるエピトープに基づいてどのエピトープがヒトで認識されるかを予測することはできない。エピトープのプロセシング、提示および認識に差異があるほかに、マウスはヒトと異なるMHC分子を有する。従って、マウスは、ヒトと異なるエピトープを認識すると推測される。このことは、次の事実によって実証される。すなわち、Brandtらは、ヒトで認識されることが本発明者らによって見いだされていないエピトープの認識をマウスで見いだしている。
【０００７】
発明の概要
本発明は、(i) 宿主に由来するT細胞の集団を、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10もしくは11で表されるペプチドおよび該ペプチドのいずれかを認識するT細胞受容体に結合することのできるそれらの類似体から選択される1種以上のペプチドまたは類似体のうち、(a) 配列番号3もしくは5またはそれらの類似体単独、及び(b) 配列番号3および5ならびにそれらの類似体から選択されるペプチドおよび／または類似体の組み合わせを除いた、1種以上のペプチドまたは類似体に接触させることと、(ii) 該T細胞集団のT細胞が該ペプチドおよび／または類似体を認識するか否かを判定することとを含む、ESAT-6を発現するマイコバクテリウムの宿主への感染、またはマイコバクテリウムの宿主への暴露を診断する方法を提供する。好ましくは、少なくとも配列番号1で表されるペプチドまたはその類似体が用いられる。他の好ましい実施形態では、少なくとも配列番号1、5、6および8で表されるペプチド、または配列番号1〜8で表されるペプチドがすべて用いられる。
【０００８】
本発明はまた、１種以上の上記ペプチドまたは類似体と、場合により、T細胞による該ペプチドの認識を検出する手段とを含む、本方法を実施するためのキットを提供する。
【０００９】
このほか、本発明は、配列番号1、2、4、6、7、8、9、10もしくは11の配列を有するペプチドまたはその類似体、およびこのペプチドまたは類似体を提供するように発現を行うことのできるポリヌクレオチドを提供する。
【００１０】
発明の詳細な説明
配列番号1〜11の配列を以下に示す。
【００１１】
配列番号1: MTEQQWNFAGIEAAA (ES1)
配列番号2: SAIQGNVTSIHSLLD (ES4)
配列番号3: QKWDATATELNNALQ (ES12)
配列番号4: NNALQNLARTISEAG (ES14)
配列番号5: NLARTISEAGQAMAS (ES15)
配列番号6: WNFAGIEAAASAIQG (ES2)
配列番号7: EGKQSLTKLAAAWGG (ES7)
配列番号8: YQGVQQKWDATATEL (ES11)
配列番号9: NVTSIHSLLDEGKQS (ES5)
配列番号10: IEAAASAIQGNVTSI (ES3)
配列番号11: TATELNNALQNLART (ES13)
宿主は、一般的には、ヒトであるが、動物、典型的には、マイコバクテリウムが自然にまたは人工的に感染し得る動物であってもよい。宿主は、霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、アナグマなどの哺乳動物であってもよいし、マウスまたはラットなどの齧歯動物であってもよい。宿主は、典型的には、活動性または潜在性マイコバクテリウム感染症に罹患しているか、または最近、そのような感染症に罹患していた。宿主は、典型的には社会経済的な理由によりマイコバクテリウム感染症にかかる危険性を有するものであってもよいし、マイコバクテリウム感染症に対して遺伝的または後天的素因を有するものであってもよい。
【００１２】
宿主は、マイコバクテリウムに暴露された健常接触者であってよい。典型的には、暴露は、喀痰a.f.b.(抗酸性桿菌)塗抹陽性である「開放性」肺結核のような肺結核に対して行われる。従って、このような結核感染症に罹患している個体の健常接触者を追跡するために本発明の方法を用いることが可能である。また、集団調査を実施して集団の中でマイコバクテリウム感染症を有する個体または健常接触者である個体の数を調べることも可能である。
【００１３】
マイコバクテリウムはESAT-6を発現する。一般的には、ESAT-6は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10もしくは11で表される1種以上の配列、またはこれらの配列の1種以上の相同体を含む配列を有する。このような相同体は、それに対応する配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または11で表されるペプチドを認識するT細胞受容体への結合、および／または、この対応するペプチドのT細胞受容体への結合の阻害が可能である。
【００１４】
マイコバクテリウムは、一般的には、結核菌である。マイコバクテリウムは、マイコバクテリウム マリヌム（M.marinum）またはマイコバクテリウム カンサシ(M.kansasii）であってもよい。臨床的症状のパターンを用いて、これらの2種の生物および結核菌を区別することができる。マイコバクテリウムはウシ型結核菌（マイコバクテリウム ボビス、M.bovis）であってもよい。これはヒトに感染可能である。
【００１５】
本方法においてペプチドを認識するT細胞は、一般的には、マイコバクテリウムに由来する抗原にin vivoで感作されたT細胞である。抗原感作後のこれらのT細胞は、一般的には、マイコバクテリウムに暴露された宿主の末梢血中に、106個の末梢血単核細胞(PBMC)中に1個〜103個の末梢血単核細胞中に1個の出現頻度で存在する。T細胞は、CD4および／またはCD8 T細胞であってよい。
【００１６】
本明細書中で使用される「ペプチド」という用語には、文脈上他の解釈が必要にならない限り、そのペプチドの類似体も含まれるとみなされる(これは、その用語が通常使用されるときに定義されるペプチドでなくてもよい)。
【００１７】
本方法では、T細胞をin vitroでまたはin vivoでペプチドに接触させることが可能であり、そしてT細胞がペプチドを認識するか否かの判定をin vitroでまたはin vivoで行うことが可能である。かくして、本発明は、人体または動物体を対象に実施される診断の方法を提供する。本発明はまた、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10もしくは11で表されるペプチドおよび該ペプチドのいずれかを認識するT細胞受容体に結合することのできるそれらの類似体から選択された1種以上のペプチドまたは類似体のうち、(a) 配列番号3もしくは5またはそれらの類似体単独、及び(b) 配列番号3および5ならびにそれらの類似体から選択されたペプチドおよび／または類似体の組み合わせを除いた、1種以上のペプチドまたは類似体を提供し、それらは、ESAT-6を発現するマイコバクテリウムの宿主への感染、またはマイコバクテリウムの宿主への暴露を診断するのに用いられ、その方法には、宿主のT細胞がペプチドおよび／または類似体を認識するか否かを判定することが含まれる。
【００１８】
T細胞がペプチドを認識するか否かの判定は、一般的には、ペプチドの存在下でT細胞の状態の変化を検出することによって、またはT細胞がペプチドに結合するか否かを調べることによって行われる。状態の変化は、一般的には、T細胞受容体がペプチドに結合した後、T細胞の抗原特異的機能活性により誘発される。一般的には、T細胞受容体に結合する場合、ペプチドは、典型的には抗原提示細胞(APC)の表面上に存在するMHCクラスII分子に結合する。
【００１９】
T細胞の状態変化は、T細胞由来の物質、例えば、サイトカイン、特に、IFN-γ、IL-2またはTNF-αの分泌の開始または増加であってよい。IFN-γの分泌を調べることが特に好ましい。この物質は、典型的には、特異的結合剤に結合させてから特異的結合剤/物質複合体の存在を測定することによって検出可能である。特異的結合剤は、典型的には、ポリクロナール抗体またはモノクロナール抗体のような抗体である。サイトカインに対する抗体は市販されているか、または標準的な技法を用いて作製可能である。
【００２０】
典型的には、特異的結合剤は、固形担体上に固定される。物質を結合させた後、場合により、固形担体を洗浄することにより、この薬剤に特異的に結合していない物質を除去することができる。複合体に結合する第二の結合剤を用いて薬剤/物質複合体を検出してもよい。典型的には、第二の薬剤は、第一の薬剤に結合する部位とは異なる部位で物質に結合する。第二の薬剤は、好ましくは、抗体であり、検出可能な標識により直接的にまたは間接的に標識化されている。
【００２１】
この場合、典型的には、検出可能な標識により直接的にまたは間接的に標識化されている第三の薬剤によって第二の薬剤を検出してもよい。例えば、第二の薬剤には、ストレプトアビジン部分と典型的には検出可能な標識としてアルカリ性ホスファターゼとを含む第三の薬剤による検出を可能にするビオチン部分が含まれていてもよい。
【００２２】
一実施形態において、使用される検出系は、WO 98/23960に記載のex-vivo ELISPOTアッセイである。このアッセイでは、固形担体に固定された第一のIFN-γ特異的抗体を、T細胞から分泌されたIFN-γに結合させる。次いで、検出可能な標識で標識化された第二のIFN-γ特異的抗体を用いて、結合されたIFN-γを検出する。このような標識化抗体は、MABTECH (Stockholm, Sweden)から入手可能である。使用し得る他の検出可能な標識について、以下で説明する。
【００２３】
測定可能なT細胞の状態変化は、T細胞による物質の取り込み、例えば、チミジンの取り込みの増大であってよい。この状態変化は、T細胞のサイズの増大、もしくはT細胞の増殖、またはT細胞上の細胞表面マーカーの変化であってよい。
【００２４】
一般的には、本方法で接触させるT細胞は、宿主の血液サンプル中から採取されるが、T細胞を含有する他のタイプのサンプルを使用することも可能である。サンプルは、アッセイに直接供してもよいし、最初に処理を施してもよい。典型的には、この処理には、水や緩衝液などでサンプルを希釈することが含まれていてもよい。典型的は、サンプルは、1.5〜100倍、例えば、2〜50倍または5〜10倍に希釈される。
【００２５】
処理には、サンプルの成分を分離することが含まれていてもよい。典型的には、単核細胞(MC)がサンプルから分離される。MCには、T細胞およびAPCが含まれる。従って、本方法では、分離されたMC中に存在するAPCは、T細胞にペプチドを提示することができる。もう一つの実施形態において、T細胞だけ、例えば、CD4 T細胞だけ、またはCD8 T細胞だけをサンプルから精製することができる。PBMC、MCおよびT細胞は、当技術分野で周知の技法、例えば、Lalvani et al (1997) J. Exp. Med. 186, p859-865に記載の技法を用いて分離することができる。
【００２６】
好ましくは、アッセイに使用されるT細胞は、未処理のサンプルもしくは希釈されたサンプルの形態であるか、またはex vivoで直接使用される新たに単離されたT細胞(例えば、新たに単離されたMCもしくはPBMCの形態のT細胞)である。すなわち、それらは、本方法に使用する前に培養されていない。しかしながら、T細胞は、使用前に、例えば、1種以上のペプチド、および一般的にはこのほかに外因性の増殖を促進するサイトカインの存在下で培養することが可能である。培養中、ペプチドは、典型的には、本方法で使用されるAPCのようなAPCの表面上に存在する。T細胞を前培養すると、本方法の感度が増大し得る。かくして、T細胞を短期細胞系などの細胞系に変換することができる(例えば、Ota et al (1990) Nature 346, p183-187に記載の細胞系)。
【００２７】
本方法において一般に存在するAPCは、T細胞と同じ宿主に由来するものであってもよいし、異なる宿主に由来するものであってもよい。APCは、天然に存在するAPCであってもよいし、人工のAPCであってもよい。APCとは、T細胞にペプチドを提示することのできる細胞である。それは、典型的には、B細胞、樹枝状細胞またはマクロファージである。それは、典型的には、T細胞と同じサンプルから分離され、そして典型的には、T細胞と同時に精製される。この場合、APCは、MCまたはPBMC中に存在していてもよい。APCは、典型的には、新たに単離されたex vivo細胞または培養細胞である。それは、短期細胞系または固定化細胞系のような細胞系の形態であってよい。APCは、その表面上で未結合の（empty）MHCクラスII分子を発現してもよい。
【００２８】
典型的には、本方法では、サンプルから誘導されたT細胞を、試験に用いるべく意図されたすべてのペプチド(すなわち、ペプチドのプール)と一緒にアッセイに供することができるか(適合パネル)、またはT細胞を分けて、それぞれ1種以上のペプチドを含有する個別のアッセイに供することができる。好ましくは、本方法をin vitroまたはin vivoの形態で行う場合、少なくとも配列番号1で表されるペプチドまたはその類似体が使用される。典型的には、配列番号2、3、4、5および6、好ましくは更に7および／または8、ならびに一実施形態では更に9および／または10および／または11で表される1種以上またはすべてのペプチドもまた本発明の方法で使用され、その結果、感度の増大した方法が提供される。もう一つの実施形態では、配列番号1、2、3、4、5、6、8および9で表されるペプチドだけが本方法で使用される。
【００２９】
本発明はまた、同時個別使用または逐次使用を目的として(例えば、in vivo使用を目的として)、本明細書中に記載の2種以上の任意のペプチド(例えば、本明細書中に記載の任意の組み合わせ)などの複数種のペプチドを提供する。
【００３０】
一実施形態では、ペプチドそのものが、T細胞およびAPCを含むアッセイに直接供される。先に述べたように、T細胞およびAPCは、このようなアッセイにおいてMCの形態をとることが可能である。APCによる提示を必要とすることなくT細胞によって認識可能なペプチドを用いる場合、APCは不要である。MHC分子に結合される元のペプチドを模倣した類似体は、そのようなペプチドの例である。
【００３１】
一実施形態において、ペプチドは、T細胞の不在下でAPCに提供される。次に、このAPCは、典型的にはT細胞の表面にペプチドを存在できるようにした後で、T細胞に提供される。ペプチドはAPCの内部に取り込み、そして提示するようにしてもよいし、APCの内部に進入させることなく表面上に取り込んでもよい。
【００３２】
ペプチドをT細胞に接触させる時間は、ペプチドの認識を調べるのに用いられる方法に依存して変化する。典型的には、105〜107個、好ましくは5×105〜106個のPBMCが各アッセイに供される。ペプチドがアッセイに直接供される場合、その濃度は、10-1〜103μg/ml、好ましくは0.5〜50μg/mlまたは1〜10μg/mlである。
【００３３】
典型的には、ペプチドと一緒にT細胞をインキュベートとする時間の長さは、4〜24時間、好ましくは6〜16時間である。ex vivo PBMCを使用する場合、37℃において、10μg/mlのペプチド中で0.3×106個のPBMCを12時間でインキュベートできることが判明した。
【００３４】
T細胞がペプチドを認識するか否かの判定は、T細胞へのペプチドの結合を測定することによって行うことが可能である。典型的には、ペプチドに結合するT細胞は、この結合に基づいて、例えば、FACS装置を用いて、選別することが可能である。ペプチドを用いて選別された細胞の出現頻度が「対照」の値を超えた場合、ペプチドを認識するT細胞が存在しているとみなされるであろう。抗原感作後のT細胞の出現頻度は、一般的には、106個中1個〜103個中1個であり、従って、選別された細胞が、抗原感作後のT細胞であるか否かを判定することができる。
【００３５】
T細胞によるペプチドの認識の判定は、in vivoで行うことが可能である。典型的には、ペプチドを宿主に投与し、次いで、ペプチドの認識を示唆する応答を測定することが可能である。一実施形態において、ペプチドは、典型的にはマントー試験と同じように皮内投与される。ペプチドは表皮投与してもよい。ペプチドは、典型的には、注射による場合のように針を用いて投与されるが、バリスティック法のような他の方法、例えば、核酸を送達するのに使用されてきたバリスティック法により投与することも可能である。EP-A-0693119には、ペプチドを投与するのに一般に使用可能な方法が記載されている。典型的には、0.001〜1000μg、例えば、0.01〜100μgまたは0.1〜10μgのペプチドが投与される。
【００３６】
このほか、in vivoでペプチドを提供可能な薬剤を投与することができる。この場合、ペプチドを発現可能なポリヌクレオチドを、典型的にはペプチドの投与に対して先に述べたいずれかの方法で投与することができる。このポリヌクレオチドは、典型的には、本発明によって提供される以下に記載のポリヌクレオチドの特性のいずれかを有している。ペプチドはin vivoでポリヌクレオチドから発現され、そしてin vivoでのペプチドの認識が測定される。典型的には、0.001〜1000μg、例えば、0.01〜100μgまたは0.1〜10μgのポリヌクレオチドが投与される。
【００３７】
in vivoでのペプチドの認識は、典型的には、DTH応答の発生によって示唆される。これは、一般的には、ペプチドの投与部位を目視検査して、炎症の存在、例えば、硬化、紅斑または水腫の存在を調べることによって測定される。
【００３８】
本方法に使用可能な類似体は、それに対応する配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または11で表されるペプチドを認識するT細胞受容体に結合することができる。従って、一般的には、類似体をそれに対応するペプチドの存在下で、典型的には、更にAPCの存在下でT細胞に添加した場合、類似体は、それに対応するペプチドの認識を阻害する。このT細胞受容体への類似体の結合は、標準的な技法により試験することができる。例えば、ペプチドを認識することが分かっているT細胞からT細胞受容体を単離することができる(例えば、本発明の方法を用いて)。次に、類似体に結合する物質、例えば、類似体に対する抗体への類似体の結合をT細胞受容体が阻害するか否かを調べることによって、類似体がT細胞受容体に結合することを実証することができる。典型的には、類似体は、このような結合阻害アッセイでは、MHC分子中に結合する。
【００３９】
典型的には、類似体は、T細胞受容体へのペプチドの結合を阻害する。この場合、類似体の存在下でT細胞受容体に結合することのできるペプチドの量は減少する。なぜなら、類似体はT細胞受容体に結合することができるため、T細胞受容体への結合に対してペプチドと拮抗するからである。
【００４０】
上記の結合実験に使用されるT細胞は、マイコバクテリウム感染症に罹患している患者から、例えば、本発明の方法を利用して、単離することができる。ESAT-6全体は、ペプチドを認識するT細胞受容体に結合することができないので、「類似体」という用語に包含されない。
【００４１】
類似体の他の結合特性もまた、ペプチドのものと同じである。従って、典型的には、類似体は、ペプチドが結合するときと同じMHCクラスII分子に結合する。配列番号1で表されるペプチドの類似体は、典型的には、HLA-DR1およびHLA-DR7に結合する。類似体は、典型的には、ペプチドに特異的な抗体に結合するので、このような抗体へのペプチドの結合を阻害する。
【００４２】
類似体は典型的にはペプチドである。それは、それに対応する配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または11のうちの一つで表される元のペプチドとの相同性を有していてよい。もう一つのペプチドに相同的なペプチドは、典型的には、少なくとも15個、好ましくは少なくとも30個、例えば、少なくとも40、60もしくは100個またはそれ以上の隣接アミノ酸の領域にわたり、もう一つのペプチドに対して少なくとも70%の相同性、好ましくは少なくとも80%または90%、より好ましくは少なくとも95%、97%または99%の相同性を有する。タンパク質の相同性を測定する方法は、当技術分野で周知であり、本発明に関して、相同性は、アミノ酸同一性(「ハードな相同性（hard homology）」と呼ばれることもある)に基づいて計算される。例えば、UWGCGパッケージには、相同性を計算するのに使用可能なBESTFITプログラムが用意されている(例えば、そのデフォルト設定で使用する) (Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395)。
【００４３】
相同性ペプチドは、典型的には、置換、挿入または欠失により、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8個またはそれ以上の置換、欠失または挿入により差異を生じており、こうした差異は、NもしくはC末端または配列中の任意の他の位置で生じうる。置換は、好ましくは「保存的」である。これらは、以下の表に従って定義される。第二列の同一の枠内のアミノ酸、および好ましくは第三列の同一の行内のアミノ酸は、互いに置換可能である。
【００４４】
類似体の長さは、典型的には、アミノ酸8〜80個、例えば、10〜60個または12〜50個、好ましくは15〜30個または20〜25個である。典型的には、MHC分子との結合に寄与するか、またはT細胞受容体による認識に関与する元のペプチド中のアミノ酸に対応する位置にある類似体中のアミノ酸は、同じであるか、または保存されている。
【００４５】
典型的には、類似体ペプチドには、天然の翻訳後改変または人工的な改変であってよい1個以上の改変が含まれる。改変により、アミノ基、アセチル基、ヒドロキシ基もしくはハロゲン(例えば、フッ素)基または炭水化物基などの化学的部分を(典型的には、水素の置換、例えば、C-H結合の置換によって)提供することが可能である。典型的には、改変は、NもしくはC末端に存在する。
【００４６】
類似体には、1種以上の非天然アミノ酸、例えば、天然アミノ酸と異なる側鎖を有するアミノ酸が含まれていてもよい。一般的には、非天然アミノ酸は、N末端および／またはC末端を有するであろう。非天然アミノ酸は、L-アミノ酸であってよい。
【００４７】
類似体は、典型的には、元のペプチドと実質的に同じような形状、サイズ、可撓性または電子配置を有する。
【００４８】
一実施形態において、類似体は、MHCクラスII分子に結合した元のペプチドであるかまたはそれを模倣したものである。類似体は、互いに会合または結合した2、3、4個またはそれ以上のMHCクラスII分子に結合した元のペプチドであってもよいし、それを模倣したものであってもよい。これらのMHC分子は、ビオチン/ストレプトアビジンをベースとした系を用いて互いに結合させることが可能であり、この場合、典型的には、2、3または4個のビオチンで標識化されたMHC分子は、ストレプトアビジン部分に結合する。この類似体は、典型的には、ペプチド/MHCクラスII複合体が該複合体に特異的なT細胞受容体または抗体に結合するのを阻害する。類似体は、典型的には、抗体または抗体のフラグメント、例えば、Fabまたは(Fab)2フラグメントである。
【００４９】
固形担体に類似体を固定してもよく、この場合、特に、MHC分子に結合したペプチドを模倣した類似体が用いられる。
【００５０】
類似体は、典型的には、計算手段によりデザインされ、次いで、当技術分野で周知の方法を用いて合成される。このほか、化合物のライブラリーから類似体を選択することも可能である。ライブラリーは、組合せライブラリー（combinatorial library）または展示ライブラリー（display library）、例えば、ファージ展示ライブラリーであってよい。化合物のライブラリーは、元のペプチドが結合するMHC分子のようなMHCクラスII分子に結合した形態でディスプレイライブラリー中で発現可能である。類似体は、一般的には、元のペプチドの結合特性を模倣する能力に基づいてライブラリーから選択される。この場合、元のペプチドを認識するT細胞受容体または抗体に結合する能力に基づいて選択を行ってもよい。
【００５１】
本発明はまた、1種以上のペプチドまたは類似体と、場合により、T細胞がペプチドを認識するか否かを検出する手段とを含む、本方法を実施するためのキットを提供する。典型的には、ペプチドは、同時使用、個別使用または逐次使用を行うべく提供される。典型的には、認識を検出する手段は、上記の技法に基づく検出を可能にするかまたは助長する。
【００５２】
従って、この手段は、認識後にT細胞により分泌された物質の検出を可能にするものであってよい。この場合、キットには更に、この物質に特異的な結合剤、例えば、抗体が含まれていてもよい。この薬剤は、典型的には、IFN-γに特異的である。薬剤は、典型的には、固形担体に固定されている。このことは、この物質が、薬剤に結合した後、それを分泌したT細胞の近くに残存するであろうことを意味する。かくして、物質/薬剤複合体の「スポット」が担体上に形成され、そして各スポットは、該物質を分泌しているT細胞を表すことになる。スポットの定量および典型的には対照との比較を行うことによって、ペプチドの認識を調べることが可能になる。
【００５３】
キットにはまた、物質/薬剤複合体を検出する手段が含まれていてもよい。物質に結合させた後、薬剤そのものに色変化のような検出可能な変化を起こしてもよい。このほか、スポットの測定を可能にすべく、検出を目的に直接的または間接的に標識化された第二の薬剤を物質/薬剤複合体に結合させてもよい。先に述べたように、第二の薬剤は、物質に特異的であってもよいが、その結合の対象となる物質上の位置は、第一の薬剤の場合と異なる。
【００５４】
固定化担体は、ウェルを有するプレート、例えば、マイクロタイタープレートであってよい。従って、プレート内の個別のウェル中で各アッセイを行うことができる。
【００５５】
キットにはこのほかに、検出段階で使用すべく、T細胞用培地、検出薬剤または洗浄用緩衝液が含まれていてもよい。キットには更に、サンプルからの分離、例えば、サンプルからのPBMCまたはT細胞の分離を行うのに好適な薬剤が含まれていてもよい。サンプルの成分の分離をまったく必要とすることなくサンプル中のT細胞を直接検出できるように、キットをデザインしてもよい。
【００５６】
キットには、ペプチドの投与、例えば、皮内投与または表皮投与を可能にする器具が含まれていてもよい。典型的には、このような器具は、1本以上の針を備えている。この器具により、ペプチドのバリスティック送達を可能にしてもよい。キット中のペプチドは、医薬組成物の形態であってよい。
【００５７】
キットにはまた、陽性対照または陰性対照のような対照が含まれていてもよい。陽性対照を用いて検出系を試験できるようにしてもよい。この場合、陽性対照は、典型的には、上記の方法のいずれにおいてもペプチドの認識を模倣するものである。典型的には、in vitroで認識を調べるようにデザインされたキットでは、陽性対照はサイトカインである。ペプチドの認識をin vivoで検出するようにデザインされたキットでは、陽性対照は、ほとんどの個体が応答を示すと考えられる抗原であってよい。
【００５８】
キットにはまた、宿主に由来するT細胞を含有するサンプル、例えば、血液サンプルを採取する手段が含まれていてもよい。キットには、宿主に由来するサンプルから単核細胞またはT細胞を分離する手段が含まれていてもよい。
【００５９】
本発明はまた、配列番号1、2、4、6、7、8、9、10もしくは11の配列を有するペプチドまたはその類似体を提供する。本発明は、1種以上のペプチドを典型的には先に記載した組み合わせで含む診断用の生成物またはパネルを提供する。この生成物は、典型的には、医薬組成物のような組成物である。
【００６０】
本発明はまた、配列番号1、2、4、6、7、8、9、10もしくは11の配列を有するペプチドまたはその類似体を提供するように発現することのできるポリヌクレオチドを提供する。典型的には、ポリヌクレオチドは、DNAまたはRNAであり、そして一本鎖または二本鎖である。従って、ポリヌクレオチドには、配列番号1、2、4、6、7、8、9、10または11の配列をコードする配列が含まれる。このコード配列の5’側および3’側に、本発明のポリヌクレオチドは、ESAT-6遺伝子中のこれらの配列の5’側および3’側にある配列またはコドンと異なる配列またはコドンを有している。従って、本発明のポリヌクレオチドには、配列番号1、2、4、6、7、8、9、10または11で表されるフラグメントをコードする配列を除いて、ESAT-6の全体またはESAT-6のフラグメントをコードする配列は含まれていない。
【００６１】
ペプチドをコードする配列の5’側および／または3’側に、ポリヌクレオチドはコード配列または非コード配列を有する。コード配列の5’側および／または3’側の配列には、ペプチドをコードする配列の発現、例えば、転写および／または翻訳を助長する配列が含まれていてもよい。ポリヌクレオチドは、原核細胞中または真核細胞中でペプチドを発現できるものであってよい。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、ヒト、霊長類または齧歯動物の細胞のような哺乳動物の細胞中でペプチドを発現することができる。
【００６２】
ポリヌクレオチドは、複製可能なベクター中に組み込んでもよい。このようなベクターは、好適な細胞中で複製できる。該ベクターは、発現ベクターであってよい。このようなベクターの場合、本発明のポリヌクレオチドはポリヌクレオチドの発現を誘導できる制御配列に機能しうる形で連結される。ベクターには、アンピシリン耐性遺伝子のような選択可能なマーカーが含まれていてもよい。
【００６３】
本発明のポリヌクレオチド、ペプチドまたは抗体(以下を参照されたい)、あるいは本発明の方法に用いられる薬剤(例えば、T細胞から分泌された物質の検出に用いる薬剤)は、検出可能な標識を有していてよい。場合により光学的拡大手段を利用して目視検査により分泌物質を検出することを可能にする検出可能な標識が好ましい。このような系は、基質中で色調変化を起こす酵素標識、例えば、基質中で色調変化を起こすアルカリホスファターゼに基づくものが典型的である。このような基質は、例えばBioRadなどから市販されている。このほかの好適な標識としては、ペルオキシダーゼのような他の酵素、もしくはビオチンのようなタンパク質標識、または32Pもしくは35Sのような放射性同位元素が挙げられる。以上の標識は、公知の技法を用いて検出可能である。
【００６４】
本発明のポリヌクレオチド、ペプチドまたは抗体(以下を参照されたい)は、実質的に精製された形態であってよい。それらは、実質的に単離された形態であってよく、この場合、一般的には、調製物中に、ポリヌクレオチド、ペプチドまたは抗体を、(例えば、約または少なくとも)90%、具体的には(例えば、約または少なくとも)95、97もしくは99%含むであろう。ペプチドでない(この用語が通常の意味で定義された場合)実質的に単離されたペプチドは、一般的には、調製物の乾燥重量の(例えば、約または少なくとも)90%、具体的には(例えば、約または少なくとも)95、97もしくは99%を占める。ポリヌクレオチドまたはペプチドは、典型的には、他の細胞成分から実質的に遊離しているか、または他のマイコバクテリウム細胞成分から実質的に遊離している。ポリヌクレオチドまたはペプチドは、本発明の方法において、このような実質的に単離、精製または遊離した形態であってよく、あるいはキット中において、このような形態で存在させてもよい。
【００６５】
人体または動物体を対象として実施される診断の方法への使用のためにペプチドまたはペプチドの任意の組み合わせ(例えば、本明細書中に記載の組み合わせ)が提供される。ペプチドの組み合わせは、該方法において、同時に、個別に、または連続的に使用するために提供される。
【００６６】
ペプチドまたはポリヌクレオチドは、ペプチドまたはポリヌクレオチドと、製薬上許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物の形態であってよい。好適な担体および希釈剤としては、等張生理食塩溶液、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水が挙げられる。典型的には、その組成物は、皮内投与または上皮投与あるいはバリスティック(ballistic)法により適用するために処方される。従って、バリスティック送達のための担体粒子とペプチドまたはポリヌクレオチドを会合させてもよい。
【００６７】
本発明のペプチドは、標準的な合成化学の技法を用いて、例えば、自動合成装置を用いて作製可能である。
【００６８】
ペプチドは、典型的には、より長いポリペプチド、例えば、融合タンパク質から作製される。このポリペプチドには、典型的には、ペプチドの配列が含まれている。ペプチドは、例えば、プロテアーゼなどを用いてポリペプチドを加水分解するか、またはポリペプチドを物理的に破壊することによって、ポリペプチドから得てもよい。ポリペプチドは、典型的には、ESAT-6であり、遺伝子組換え技術により発現させたものでよい。
【００６９】
ペプチドはまた、ポリヌクレオチドの発現を含むプロセスにおいて、例えば、本発明のポリヌクレオチドを発現させることによって、調整することもできる。発現されたポリペプチドを更に処理することにより、本発明のペプチドを生成してもよい。この場合、先に記載の発現ベクターで形質転換またはトラスンフェクトした細胞を、ペプチドの調整に使用できるペプチドまたはポリペプチドを発現する条件下で培養することを含むプロセスにおいて、ペプチドを調整してもよい。本発明のポリヌクレオチドは、標準的な技法を用いて、例えば、合成装置を用いて調整可能である。
【００７０】
本発明はまた、ペプチドに特異的な抗体を作製するための本発明のペプチドまたは類似体の使用を提供する。この抗体または本明細書中に記載のあらゆる抗体は、宿主動物中で抗体を発生させることによって、産生させてもよい。このような抗体は、ペプチドに特異的であるか、または抗体に結合する先に記載した物質に特異的であろう。該ペプチドまたは該物質は、本明細書中では以下「免疫原」と記す。モノクロナール抗体およびポリクロナール抗体を作製する方法は周知である。ポリクロナール抗体を作製する方法には、好適な宿主動物、例えば、実験動物を免疫原で免疫すること、および血清から免疫グロブリンを単離することが含まれる。従って、動物に免疫原を接種し、続いて動物から血液を採取し、そしてIgG画分を精製してもよい。モノクロナール抗体を作製する方法には、所望の抗体を産生する細胞を不死化することが含まれる。接種された実験動物に由来する脾細胞を腫瘍細胞に融合することによって、ハイブリドーマ細胞を作製できる(Kohler and Milstein (1975) Nature 256, 495-497)。
【００７１】
所望の抗体を産生する不死化細胞は、従来の手順により選択可能である。ハイブリドーマは、培養により増殖させてもよいし、あるいは腹水を生成するように腹腔内に注入するかまたは同種宿主もしくは免疫学的易感染性宿主の血流中に注入してもよい。ヒト抗体は、ヒトリンパ球のin vitro免疫化、それに続くEpstein-Barrウイルスを用いたリンパ球の形質転換によって調製可能である。
【００７２】
モノクロナール抗体とポリクロナール抗体の両方を産生する目的では、実験動物としてヤギ、ウサギ、ラットまたはマウスが好適である。所望により、免疫原が例えば一つのアミノ酸残基の側鎖を介して好適な担体に結合されているコンジュゲートとして免疫原を投与してもよい。担体分子は、典型的には、生理学的に許容される担体である。得られた抗体を単離し、所望により、精製してもよい。
【００７３】
以下の実施例により本発明を具体的に説明する。
【００７４】
実施例 1
研究対象被験者
患者および対照者は、Northwick Park and St Mark’s NHS Trust, LondonおよびOxford Radcliffe NHS Trust, Oxfordの病院において、1997年10月から16ヶ月間にわたり見込みのある人を対象に募集した。各被験者からヘパリン添加血液サンプルを1回採取した。
【００７５】
臨床所見とX線撮影結果とが一致し、結核菌(M.tuberculosis)に対する培養で陽性であることが1個以上の臨床検体から細菌学的に確認された患者を結核患者として募集した。47人中29人の患者(62%)は、瀉血の時点で治療を受けていないかまたは治療を受けた期間が1ヶ月未満であり、残りの患者は、治療期間がそれよりも長かった。
【００７６】
対照の患者は、民族性、年齢(4歳以内)および性別が他のグループと一致するように選び、また、対照の患者には、広範にわたる感染、炎症、肉芽腫、自己免疫および新生物の状態を有する個人が含まれていた(表4)。これらの中には、結核および結核のように原因不明の発熱を起こす可能性のある他の疾患と臨床的に区別することが困難である可能性のある病気が含まれていた。過去に結核を患ったことのある患者、および結核であることが判明している者に最近接触したことが報告された患者は、除外した。結核の患者も対照の患者も、HIV感染を示す臨床上の徴候はなかった。
【００７７】
実施例 2
ELISPOT アッセイを用いた結果
ELISPOTアッセイを用いて、ex vivoで抗原感作後のESAT-6特異的CD4 T細胞の検出を行った。固相f-moc化学(Research Genetics, Alabama,USA and Zinsser Analytical Frankfurt, Germany)により、ESAT-6分子の長さをカバーする17種のペプチドを合成した。各ペプチドは、アミノ酸15個の長さであり、隣のペプチドと10残基の重なりを有していた。マススペクトロメトリーにより同一性を確認し、そして高速液体クロマトグラフィーにより純度を確認した。8種のペプチドは、エピトープとして頻繁に確認されたものであった。ESAT-6に由来する17種のペプチドのいずれかに応答を示したすべての被験者が、同様に、配列番号1〜8で表される8種のペプチドのパネルの少なくとも1つに応答を示した。タンパク質の配列すべてを公開しているSwissProtデータベースおよび翻訳Gen-Bankデータベースを用いて配列相同性を調べた結果、これらのペプチドの配列が結核菌(M.tuberculosis)複合体のESAT-6タンパク質に比類なく特定されることが確認された。このパネル中の1種以上のペプチドに対する応答を個別に試験して評価したところ、結核菌(M.tuberculosis)の感染が示唆された。
【００７８】
患者は配列番号9〜11で表されるペプチドに対しても応答を示すことが判明した。
【００７９】
単一細胞 IFN- γ放出に対する ex vivo ELISPOT アッセイ : 末梢血由来の循環性 ESAT-6 ペプチド特異的 T 細胞の計数
サンドイッチ捕捉ELISAの原理に基づいて、ELISPOTアッセイでは、比較的高濃度のうちに、分泌したT細胞のすぐ近くでIFN-γの捕捉および検出が行われる。従って、発色後、得られた各スポットは、個々の抗原特異的IFN-γ分泌T細胞またはスポット形成細胞(SFC)の「フットプリント」を表す。IFN-γに対するex vivo ELISPOTアッセイは、事前のin vitro刺激ステップを必要とすることなく末梢血から直接的に抗原特異的T細胞を検出するのに十分な感度がある(Lalvani et al (1997) J. Exp. Med. 186 p859-865)。更に、ex vivo ELISPOTアッセイでは迅速なエフェクター機能を有する抗原特異的T細胞が計数されるので、必要なインキュベーション時間はごく僅かである。
【００８０】
Lalvaniらの文献(上記を参照されたい)に記載の標準的な手段により、12 mlの血液から末梢血単核細胞(PBMC)を分離し、そしてL-グルタミン2 mM、ペニシリン100iu/mlおよび10%熱不活性化ウシ胎仔血清(Sigma, St. Louis, MO, USA)を補充したRPMI中に懸濁させた(R10)。
【００８１】
抗IFN-γ mAB 1-D1K (MABTECH, Stockholm)が15μg/mlでプレコートされた96ウェルのポリビニリデンジフルオリド(PVDF)裏打ち(backed)プレート(Millipore)をRPMI培地1640で洗浄し、そして室温において1時間にわたりR10でブロックした。
【００８２】
プレコートされたプレートに3×105個のPBMCを100μl R10/ウェルで添加し、そして最終濃度が10μg/mlとなるようにペプチドを個別に各ウェルに添加した。また、PPD (Batch RT49, Staatens Seruminstitut, Copenhagen, Denmark)を20μg/mlで添加した。陽性対照ウェルにはフィトヘマグルチニン(ICN Biomedicals, Aurora, OH, USA)を5μg/mlで添加し、そして陰性対照ウェルにはペプチドをまったく添加しなかった。
【００８３】
37℃、5% CO2で分析物を6〜12時間インキュベートし、そしてPBS 0.05% Tween-20 (Sigma, St. Louis, MO, USA)で6回洗浄することによって停止させた。次に、1μg/mlのビオチニル化抗IFN-γ mAb 7-B6-1ビオチン(Mabtech, Stockholm, Sweden)を100μl添加した。室温で2時間インキュベートした後、再びプレートを6回洗浄し、ストレプトアビジン-アルカリフォスファターゼコンジュゲート(Mabtech, Stockholm, Sweden)の1:1000希釈液をウェルに添加し、そしてプレートを更に1時間インキュベートした。次に、再びウェルを6回洗浄し、そして脱イオン水で1:25に希釈された発色性アルカリホスファターゼ基質(Biorad, Hercules, CA, USA)を添加した。30分後、水道水で洗浄することにより比色反応を停止させ、そしてプレートを乾燥させた。
【００８４】
試験ウェルの方が陰性対照ウェルよりもIFN-γ SFCが多く、少なくとも5個は含まれており、しかもこの数が陰性対照ウェル中の数の少なくとも2倍であるときに限り、応答が陽性であると評価した。このカットオフポイント(PBMC 3×105個あたりIFN-γ SFC 5個)は、下側検出限界値がPBMC 100万個あたりペプチド特異的T細胞17個、すなわち、1/59,000 PBMCであることに相当する。アッセイの実施者は、患者の結核の状態について分からなかったわけではないが、SCFの読み取りは定量的であり、陽性応答に対する我々の判定基準は厳格であり、しかも陰性対照でのSFCのバックグラウンド応答は常に3個未満であったので、陽性応答は客観的かつ明瞭であった。いずれの場合においても、陽性応答および陰性応答は、拡大鏡を用いて正確に計数する前にプレートを直接調べることによって直ちに識別できた。
【００８５】
活動性(active)結核の診断に適用する際、ESAT-6ペプチドに基づく試験の確度を計算し、そして感度、特異性(標準的な二項式から計算した信頼区間)および尤度比として表現した。次に、後者を、試験前に結核であると診断できる確率が20%であるとみなされる典型的な臨床シナリオに適用した。
【００８６】
また、上記のアッセイでペプチドのプールを用いたところ、これらのペプチドを別々のアッセイで個別に試験した場合と同じように有効に応答が検出されることが判明した。
【００８７】
実施例 3
患者および対照の人工統計学的および臨床的特徴
英国では、結核の患者は、広範にわたり民族的に混成である結核の特徴を示し、インド亜大陸(ISC)から来た人々および黒人の場合に罹患率が高い(表2)。民族学的血統、年齢および性別の比率をよく一致させるように対照の患者を選んだ(表2)。また、対照の患者の診断結果は表4に列挙されている。結核の患者は、結核菌(M.tuberculosis)によって引き起こされる臨床的に広範にわたる疾患を示し、47人中22人は肺外結核に罹患していた(表3)。肺結核の患者では、25人中6人が抗酸性桿菌に対して喀痰塗抹陰性であった。従って、47人中28人(60%)の患者に対しては、喀痰顕微鏡法による直接予測診断はできなかった。
【００８８】
血中の ESAT-6 特異的 T 細胞の検出による結核菌 (M.tuberculosis) 感染の迅速診断
IFN-γに対するex vivo ELISPOTアッセイにおいて、47人中45人(96%)の結核患者が、表1に示されている8種のペプチドのパネル中の一つ以上に応答した。ES1に応答した患者の割合は異常に高かった。本発明者らは、このペプチドがHLA DR1およびDR7に結合することを示した。
【００８９】
ESAT-6ペプチド特異的IFN-γ分泌T細胞の出現頻度は一般的に高く、その中央値はPBMC 100万個あたりESAT-6ペプチド特異的T細胞200個であった(四分位間の範囲(inter-quartile range)は105〜596個)。表1中の8種のペプチドのそれぞれに特異的なIFN-γ SFCは、主にCD4 T細胞である。なぜなら、T細胞系は、これらのペプチドのそれぞれに対してin vitroで生成され、ペプチド特異的応答は、CD4 T細胞の特異的免疫磁気デプリーションによって除去されたからである。ESAT-6ペプチド特異的CD8 T細胞もまた、CD8エピトープを含有するパネル中のペプチド(例えば、ES14)により検出される。
【００９０】
結核症を有していない対照では、47人中4人だけが、8種のESAT-6由来のペプチドのパネル中の一つ以上に応答した。これらの4人の応答者におけるペプチド特異的IFN-γ分泌T細胞の出現頻度は、結核患者の場合に見られる出現頻度と類似していた。残りの対照はいずれも、すべてのペプチドに対してまったく応答しなかった。ESAT-6の全長をカバーする17種のペプチドの拡張セットを用いた場合、8種の大まかな免疫原性エピトープのパネルを用いて観測された結果と同等な結果が得られた。
【００９１】
2人の非応答者は、疾患の進行した肺結核患者であり、2人共、治療前に試験を行った。それらの臨床結果について、考察の中で概説する。応答を示した4人の対照のうち、2人は急性肺炎であり、1人は急性気管支炎であり、そして4人目は蜂巣炎であった。また、4人の患者はいずれも、IFN-γに対するELISPOTアッセイにおいて、PPDに対する強いex vivo応答を示したため、ツベルクリンに感作されていることが示唆される。
【００９２】
ESAT-6 特異的 T 細胞応答と PPD に対する応答との比較
1 TUのPPD (NHS供給品)を皮内接種することにより、26人の結核患者に対してツベルクリン皮膚試験を行った。72時間後の皮膚硬結を物差しで測定し、直径が5mm以上の硬結は慣例に従って陽性とみなした。これらの患者のうち、18人(69%)だけは、TSTに関して陽性の結果を示した。IFN-γに対するex vivo ELISPOTアッセイでは、これに対して、３分の１多く、すなわち、26人中24人(92%)が陽性応答を示し、そして全体では、ex vivo ELISPOTで、47人中45人(96%)が陽性応答を示した。対照の患者はツベルクリン皮膚試験を受けなかったが、ex vivo ELISPOTアッセイで、47人中26人(55%)がPPDに対して陽性応答を示したため、これらのCD4 T細胞はPPD中の抗原に過去に感作されていたことが示唆される。
【００９３】
IFN-γに対するESAT-6ペプチドベースのELISPOTアッセイの臨床的有用性
本研究におけるこのアッセイの性能特性を表5に示す。これらの尤度比を見ると、試験前と試験後の確率の変化が大きいことが分かる。例えば、試験前に結核であると診断できる確率が20%であるとみなされる仮想的な患者に適用すると、試験結果が陽性の場合は陽性予測値が74%になり、そして試験結果が陰性の場合は陰性予測値が1%になるであろう。
【００９４】
考察
我々は、結核菌(M.tuberculosis)感染を迅速に検出するための非常に正確な血液試験を開発した。このex vivoアッセイの成功は、結核菌(M.tuberculosis)に極めて特異的な免疫原性の高い抗原を用いる抗原特異的T細胞の高感度な検出に基づいている。細菌学的に確認された活動性結核に対する診断試験として適用する場合、患者集団研究において、このアッセイは、96%の感度および91.5%の特異性を与える(表5)。結核患者は民族的に広範に混成しており、英国における結核の疫学を反映している。また、民族学的に対応させた対照の患者の中には、結核と区別することが困難である可能性のある多くの一般的な病気が含まれていた。従って、このアッセイの性能特性(表5)は、英国における臨床診療への一般的な適用が可能であると考えられる。この試験は、静脈血サンプル一つを必要とし、容易かつ迅速に行われ、特別な実験設備をまったく必要とせず、しかも翌日までに結果が得られるので、通常の病院の試験室にうまく適合すると考えられ、しかも容易に自動化しうる。
【００９５】
AFBに対するTSTおよび喀痰鏡検法は、一般的に結核の直接的予測診断を行うための唯一の試験である。TSTの感度は、この方法で試験した26人の結核患者では、わずか69%であり、ESAT-6に基づくex vivo ELISPOTの感度96%よりも著しく低い(p=0.002)。TSTには大きな制限が多数あることを考えると、ex vivo ELISPOTアッセイは、結核菌(M.tuberculosis)感染を迅速に検出する優れた手段であると考えられる。我々の一連の患者において、喀痰鏡検法ではわずか40%の患者が検出されたのに対して、ex vivo ELISPOTでは96%であり、また、後者では喀痰塗抹(sputum smear)陰性の肺結核の患者6人がすべて検出された。更に、喀痰鏡検法では、結核菌(M.tuberculosis)と非定型マイコバクテリウムとを識別できない。esat-6遺伝子は結核菌(M.tuberculosis)複合体、ミコバクテリウム・カンサシイ(M.kansasii)、ミコバクテリウム・マリヌム(M.marinum)およびミコバクテリウム・ズルゲイ(M.szulgei) (これらのうち、ミコバクテリウム・カンサイだけは、臨床的に結核と類似した病気を引き起こす可能性がある)に限定されるので、我々のESAT-6に基づく試験は、喀痰鏡検法よりも特異的であることは明らかであろう。
【００９６】
結核を診断することを目的とした様々な血液試験がこれまでに開発されてきたが、感度、特異性および定常的使用における簡便性が十分なものはない。血液学的アッセイは、ESAT-6と同じように種特異的である標的抗原が欠損しており、特に、急性の結核(肺結核、粟粒性結核および胸膜結核)では、これらのアッセイの感度が一般に満足すべきものではないという問題を抱えている。PBMC中の循環性結核菌(M.tuberculosis)複合体DNAのPCRが、結核を診断する方法として研究されてきた。肺結核の場合、感度は研究者により異なるが33%〜95%の範囲であり、細菌学的に確認された76人のHIV陰性患者からなる最も大きな系では、感度は41%〜27%であった。肺外結核の場合、血液に基づくPCRの感度は、わずか4〜27%であった。
【００９７】
47人中2人の結核患者は、ex vivo ELISPOTアッセイで応答を示さなかった。2人共、進行した疾患を有する肺結核患者であり、診断前の数ヶ月間にわたり重度に症候的であり、そしていずれも悪液質であった。20歳のアジア人男性1名は、胸膜の関与した拡延性喀痰塗抹陽性空洞性疾患を有しており、TSTにアネルギーを示し、他の22歳のアフリカ人女性1名は、喀痰塗抹陰性であり、X線撮影で気管支肺炎パターンを有し、そしてTSTに関して陽性であった。興味深いことに、両方の患者でリンパ球が減少していたが、両者共HIV陰性であり治療に対する応答は良好であった。慢性の進行した結核は非特異的な免疫抑制を引き起こす。この免疫抑制は、検出可能なESAT-6特異的IFN-γ分泌T細胞がこれらの患者に欠損していることが原因であると考えられるが、皮膚アネルギーと関連づけられることの多い重症の粟粒性疾患を有する4人の患者はいずれも、ex vivo ELISPOTアッセイで応答を示した。現時点では、なぜ上記2人の患者が応答を示さず真偽陰性(true false negative)を示すのかは明らかでない。
【００９８】
結核症に罹患していない対照患者47人中33人(70%)はBCG接種を受けていたにもかかわらず(傷跡の存在から示唆される)、47人中わずか4人だけがex vivo ELISPOTアッセイで応答を示し、そしてこのうち3人はBCG接種を受けていなかった。従って、このアッセイは、BCG接種者と結核菌(M.tuberculosis)感染患者の識別に成功した初めてのものである。応答を示した4人の対照患者はいずれも、結核を示唆する臨床的特徴もX線撮影における特徴も有しておらず、2人は急性肺炎であり、1人は急性気管支炎であり、そして1人は蜂巣炎であり、そして4人共、最も有効な抗生物質に対して応答を示した。また、4人の患者はいずれも、IFN-γに対するELISPOTアッセイにおいてPPDに対して強力なex vivo応答を示したことから、ツベルクリンに感作されていることが示唆される。重要な点として、4人全員が結核に関して地方病性の高い国の出身であったこと、3人がケニアから英国へのアジア系移民者であり(そして全員が定期的にケニアに戻ること)、ならびに4人目がエチオピアからの来訪者であったことが挙げられる。従って、この4人はいずれも結核菌(M.tuberculosis)に暴露される危険率が高かった。これとは対照的に、英国生まれの対照患者22人はいずれも陽性応答を示さなかった。4人の応答者は実際に結核菌(M.tuberculosis)に感染していたが明らかに活動性(active)疾患ではないと思われる。この場合、活動性結核の診断試験としてアッセイを適用すれば、これらの応答者は偽陽性を示すにもかかわらず、生物学的には真陽性であると考えられる。その理由としては、この試験では、結核菌(M.tuberculosis)感染が正確に検出されたためである。残念ながら、この結論は、正式に実証することはできない。なぜなら、暴露された無症候性接触者について準臨床的結核菌(M.tuberculosis)感染を確認する決定的な手段が存在しないからである。ESAT-6ペプチドとは対照的に、PPDに対するex vivo ELISPOT応答は、対照グループ全体にわたって一般的に見られたことから(47人中26人)、それらのCD4 T細胞が過去にPPD中の抗原にin vivoで感作されたことが示唆される。これは恐らく、BCG接種または周囲のマイコバクテリウムへの暴露の結果であると思われる。
【００９９】
ESAT-6に基づくex vivo ELISPOTが他の設定条件下で高度な感度および特異性を保持するかどうかを知るには、更なる研究が必要であろう。結核が風土病のようになっていて結核菌(M.tuberculosis)に潜在的に感染している健常者の割合が有意に高い国では、結核菌(M.tuberculosis)感作細胞免疫系の検出に基づくアッセイの特異性は、本研究の場合よりも低いと思われる。しかしながら、ex vivo ELISPOTの感度が高いということは、この方法を用いれば結核の診断を確実に行える可能性が存在することを意味する。結核が一般に初感染でありしかも急速に発症する子供の場合についてもこのアッセイの有効性を実証する必要があるだろう。ESAT-6特異的細胞免疫応答の動物での研究では、初感染の初期にESAT-6が特に顕著に認識されることが明らかになっている。従って、我々のアッセイは、成人の場合と同じように子供の場合にも有効であることが実証されるはずである。最後に、HIV感染結核患者を対象にした別の研究で、ex vivo ELISPOTを評価する必要がある。
【０１００】
実施例 4
健常接触者における CD4 T 細胞応答の検出
配列番号1〜8で示されるペプチドからなるパネルを用いて、喀痰塗抹陽性の肺結核を有する指標患者の健常家庭接触者26人における応答を検出した。接触者のうちの22人で応答が検出されたことから、このパネルは無症候性の結核菌(M.tuberculosis)感染の検出に必要な感度を有することが示唆される。
【０１０１】
また、26人の健常志願者(このうち22人がBCG接種を受けていた)についても試験を行ったが、いずれのペプチドにも応答を示さなかった。従って、このパネルを用いて、無症候性感染接触者と健常BCG被接種者とをうまく識別することが可能である。
【０１０２】
実施例 5
健常接触者における異なるパネルを用いた CD4 T 細胞応答の検出
先の実施例で使用したパネルとは異なるパネルを用いて、健常接触者におけるELISPOTアッセイにより応答を検出した。パネルは、配列番号1〜5、8および9で示されるペプチドで構成されていた。
【０１０３】
塗抹陽性の開放性肺結核を有する陽性Heaf試験のグレードが3または4である指標患者に対して、すべての接触者を長期間にわたり接触させた。接触者の1人は、工場で指標者と同じ部屋(および同じシフト)で仕事をしている。1人の接触者は、数日間、指標者と同じ病院病棟にいた。他のすべての接触者は、指標者と同じ家庭に住んでいる者であった。
【０１０４】
試験した接触者22人のうち20人がこのパネルに対して陽性であった。試験した接触者のうち15人がES1に対して陽性であった。
【０１０５】
実施例 6
パネルの感度と全 ESAT-6 を用いたときの感度との比較
結核を有する多くの患者は、ESAT-6に特異的なCD8 T細胞応答だけを示し、この抗原に対してCD4 T細胞応答を示さないことが判明した。診断試験において、ESAT-6は、CD4 T細胞に由来する応答だけを顕在化し、CD8 T細胞に由来する応答を顕在化しないので、このような患者(CD8 T細胞応答だけを示す患者)は、全ESAT-6に基づく診断試験を用いて検出できなかった。しかしながら、ペプチドは、CD4 T細胞およびCD8 T細胞に由来する応答を両方顕在化するので、本発明のペプチドを用いてこれらの患者を検出することが可能である。従って、このようなペプチドを用いると、診断試験の感度が高くなる。
【０１０６】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
本発明は、マイコバクテリウムの感染、特に、結核菌（マイコバクテリウム ツベルクローシス、Mycobacteriu tuberculosis)の感染を診断する方法に関する。本発明はまた、この診断方法を実施するのに使用可能なペプチドおよびキットに関する。
【０００２】
結核症に対する現在の診断方法は、時間がかかるか、または信頼性がないかのいずれかである。マイコバクテリウムの培養には8週間必要であるので、結核を引き起こすマイコバクテリウムの同定に依拠する試験は時間がかかる。細菌を培養することが不可能な場合もある。更に、マイコバクテリウムの存在を検出するためのサンプルを取得するのに、多くの場合、観血的手順が必要である。
【０００３】
代替試験には、マイコバクテリウムの精製タンパク質誘導体の皮内投与に対する遅延型過敏性(DTH)応答の検出に基づくツベルクリン皮膚試験(TST)またはマントー試験がある。この試験は、マイコバクテリウムの同定に依拠する試験よりも短い時間で済むが、結核に対するワクチンとしてBCGが広範に使用されているため、信頼性はより低い。BCGは、結核菌との関連性が強く、従って、BCG接種を受けた個体は、TSTに対して陽性の反応を示す可能性がある。更に、活動性結核に罹患している人々の大部分は、皮膚免疫アネルギーが原因で、TSTによって検出されない。従って、TSTの特異性および感度は低い。
【０００４】
T細胞からのIFN-γの放出を検出するアッセイを用いて、本発明者らは、結核菌のESAT-6タンパク質に由来する8種のペプチドが、結核に罹患している大部分の患者のT細胞によって認識されること、特に、配列番号1で表されるペプチドが、試験した患者の57%および試験した健常接触者の68%で認識されることを見いだした。これらの接触者は、開放性肺結核に暴露された。本発明者らは、これらのペプチドを組み合わせることにより、診断試験で一緒に使用した場合に91.5%の特異性および96%の感度を示すペプチドのパネルを作製した。本発明者らはまた、ESAT-6に由来する3種の他のペプチドが、結核に罹患している患者のT細胞によって認識され、診断試験の感度を増大するのに使用可能であることを見いだした。
【０００５】
有利なことに、BCGはESAT-6遺伝子をもたず、従って、TSTを含めて従来の試験とは異なり、本診断試験では、結核に罹患している患者と、BCG接種を受けた患者とを区別することができる。
【０００６】
Brandt et al. (1996), Journal of Immunology, 157, 3527-33には、マウスによって認識されるESAT-6由来のエピトープが開示されている。しかしながら、マウスで認識されるエピトープに基づいてどのエピトープがヒトで認識されるかを予測することはできない。エピトープのプロセシング、提示および認識に差異があるほかに、マウスはヒトと異なるMHC分子を有する。従って、マウスは、ヒトと異なるエピトープを認識すると推測される。このことは、次の事実によって実証される。すなわち、Brandtらは、ヒトで認識されることが本発明者らによって見いだされていないエピトープの認識をマウスで見いだしている。
【０００７】
発明の概要
本発明は、(i) 宿主に由来するT細胞の集団を、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10もしくは11で表されるペプチドおよび該ペプチドのいずれかを認識するT細胞受容体に結合することのできるそれらの類似体から選択される1種以上のペプチドまたは類似体のうち、(a) 配列番号3もしくは5またはそれらの類似体単独、及び(b) 配列番号3および5ならびにそれらの類似体から選択されるペプチドおよび／または類似体の組み合わせを除いた、1種以上のペプチドまたは類似体に接触させることと、(ii) 該T細胞集団のT細胞が該ペプチドおよび／または類似体を認識するか否かを判定することとを含む、ESAT-6を発現するマイコバクテリウムの宿主への感染、またはマイコバクテリウムの宿主への暴露を診断する方法を提供する。好ましくは、少なくとも配列番号1で表されるペプチドまたはその類似体が用いられる。他の好ましい実施形態では、少なくとも配列番号1、5、6および8で表されるペプチド、または配列番号1〜8で表されるペプチドがすべて用いられる。
【０００８】
本発明はまた、１種以上の上記ペプチドまたは類似体と、場合により、T細胞による該ペプチドの認識を検出する手段とを含む、本方法を実施するためのキットを提供する。
【０００９】
このほか、本発明は、配列番号1、2、4、6、7、8、9、10もしくは11の配列を有するペプチドまたはその類似体、およびこのペプチドまたは類似体を提供するように発現を行うことのできるポリヌクレオチドを提供する。
【００１０】
発明の詳細な説明
配列番号1〜11の配列を以下に示す。
【００１１】
配列番号1: MTEQQWNFAGIEAAA (ES1)
配列番号2: SAIQGNVTSIHSLLD (ES4)
配列番号3: QKWDATATELNNALQ (ES12)
配列番号4: NNALQNLARTISEAG (ES14)
配列番号5: NLARTISEAGQAMAS (ES15)
配列番号6: WNFAGIEAAASAIQG (ES2)
配列番号7: EGKQSLTKLAAAWGG (ES7)
配列番号8: YQGVQQKWDATATEL (ES11)
配列番号9: NVTSIHSLLDEGKQS (ES5)
配列番号10: IEAAASAIQGNVTSI (ES3)
配列番号11: TATELNNALQNLART (ES13)
宿主は、一般的には、ヒトであるが、動物、典型的には、マイコバクテリウムが自然にまたは人工的に感染し得る動物であってもよい。宿主は、霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、アナグマなどの哺乳動物であってもよいし、マウスまたはラットなどの齧歯動物であってもよい。宿主は、典型的には、活動性または潜在性マイコバクテリウム感染症に罹患しているか、または最近、そのような感染症に罹患していた。宿主は、典型的には社会経済的な理由によりマイコバクテリウム感染症にかかる危険性を有するものであってもよいし、マイコバクテリウム感染症に対して遺伝的または後天的素因を有するものであってもよい。
【００１２】
宿主は、マイコバクテリウムに暴露された健常接触者であってよい。典型的には、暴露は、喀痰a.f.b.(抗酸性桿菌)塗抹陽性である「開放性」肺結核のような肺結核に対して行われる。従って、このような結核感染症に罹患している個体の健常接触者を追跡するために本発明の方法を用いることが可能である。また、集団調査を実施して集団の中でマイコバクテリウム感染症を有する個体または健常接触者である個体の数を調べることも可能である。
【００１３】
マイコバクテリウムはESAT-6を発現する。一般的には、ESAT-6は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10もしくは11で表される1種以上の配列、またはこれらの配列の1種以上の相同体を含む配列を有する。このような相同体は、それに対応する配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または11で表されるペプチドを認識するT細胞受容体への結合、および／または、この対応するペプチドのT細胞受容体への結合の阻害が可能である。
【００１４】
マイコバクテリウムは、一般的には、結核菌である。マイコバクテリウムは、マイコバクテリウム マリヌム（M.marinum）またはマイコバクテリウム カンサシ(M.kansasii）であってもよい。臨床的症状のパターンを用いて、これらの2種の生物および結核菌を区別することができる。マイコバクテリウムはウシ型結核菌（マイコバクテリウム ボビス、M.bovis）であってもよい。これはヒトに感染可能である。
【００１５】
本方法においてペプチドを認識するT細胞は、一般的には、マイコバクテリウムに由来する抗原にin vivoで感作されたT細胞である。抗原感作後のこれらのT細胞は、一般的には、マイコバクテリウムに暴露された宿主の末梢血中に、106個の末梢血単核細胞(PBMC)中に1個〜103個の末梢血単核細胞中に1個の出現頻度で存在する。T細胞は、CD4および／またはCD8 T細胞であってよい。
【００１６】
本明細書中で使用される「ペプチド」という用語には、文脈上他の解釈が必要にならない限り、そのペプチドの類似体も含まれるとみなされる(これは、その用語が通常使用されるときに定義されるペプチドでなくてもよい)。
【００１７】
本方法では、T細胞をin vitroでまたはin vivoでペプチドに接触させることが可能であり、そしてT細胞がペプチドを認識するか否かの判定をin vitroでまたはin vivoで行うことが可能である。かくして、本発明は、人体または動物体を対象に実施される診断の方法を提供する。本発明はまた、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10もしくは11で表されるペプチドおよび該ペプチドのいずれかを認識するT細胞受容体に結合することのできるそれらの類似体から選択された1種以上のペプチドまたは類似体のうち、(a) 配列番号3もしくは5またはそれらの類似体単独、及び(b) 配列番号3および5ならびにそれらの類似体から選択されたペプチドおよび／または類似体の組み合わせを除いた、1種以上のペプチドまたは類似体を提供し、それらは、ESAT-6を発現するマイコバクテリウムの宿主への感染、またはマイコバクテリウムの宿主への暴露を診断するのに用いられ、その方法には、宿主のT細胞がペプチドおよび／または類似体を認識するか否かを判定することが含まれる。
【００１８】
T細胞がペプチドを認識するか否かの判定は、一般的には、ペプチドの存在下でT細胞の状態の変化を検出することによって、またはT細胞がペプチドに結合するか否かを調べることによって行われる。状態の変化は、一般的には、T細胞受容体がペプチドに結合した後、T細胞の抗原特異的機能活性により誘発される。一般的には、T細胞受容体に結合する場合、ペプチドは、典型的には抗原提示細胞(APC)の表面上に存在するMHCクラスII分子に結合する。
【００１９】
T細胞の状態変化は、T細胞由来の物質、例えば、サイトカイン、特に、IFN-γ、IL-2またはTNF-αの分泌の開始または増加であってよい。IFN-γの分泌を調べることが特に好ましい。この物質は、典型的には、特異的結合剤に結合させてから特異的結合剤/物質複合体の存在を測定することによって検出可能である。特異的結合剤は、典型的には、ポリクロナール抗体またはモノクロナール抗体のような抗体である。サイトカインに対する抗体は市販されているか、または標準的な技法を用いて作製可能である。
【００２０】
典型的には、特異的結合剤は、固形担体上に固定される。物質を結合させた後、場合により、固形担体を洗浄することにより、この薬剤に特異的に結合していない物質を除去することができる。複合体に結合する第二の結合剤を用いて薬剤/物質複合体を検出してもよい。典型的には、第二の薬剤は、第一の薬剤に結合する部位とは異なる部位で物質に結合する。第二の薬剤は、好ましくは、抗体であり、検出可能な標識により直接的にまたは間接的に標識化されている。
【００２１】
この場合、典型的には、検出可能な標識により直接的にまたは間接的に標識化されている第三の薬剤によって第二の薬剤を検出してもよい。例えば、第二の薬剤には、ストレプトアビジン部分と典型的には検出可能な標識としてアルカリ性ホスファターゼとを含む第三の薬剤による検出を可能にするビオチン部分が含まれていてもよい。
【００２２】
一実施形態において、使用される検出系は、WO 98/23960に記載のex-vivo ELISPOTアッセイである。このアッセイでは、固形担体に固定された第一のIFN-γ特異的抗体を、T細胞から分泌されたIFN-γに結合させる。次いで、検出可能な標識で標識化された第二のIFN-γ特異的抗体を用いて、結合されたIFN-γを検出する。このような標識化抗体は、MABTECH (Stockholm, Sweden)から入手可能である。使用し得る他の検出可能な標識について、以下で説明する。
【００２３】
測定可能なT細胞の状態変化は、T細胞による物質の取り込み、例えば、チミジンの取り込みの増大であってよい。この状態変化は、T細胞のサイズの増大、もしくはT細胞の増殖、またはT細胞上の細胞表面マーカーの変化であってよい。
【００２４】
一般的には、本方法で接触させるT細胞は、宿主の血液サンプル中から採取されるが、T細胞を含有する他のタイプのサンプルを使用することも可能である。サンプルは、アッセイに直接供してもよいし、最初に処理を施してもよい。典型的には、この処理には、水や緩衝液などでサンプルを希釈することが含まれていてもよい。典型的は、サンプルは、1.5〜100倍、例えば、2〜50倍または5〜10倍に希釈される。
【００２５】
処理には、サンプルの成分を分離することが含まれていてもよい。典型的には、単核細胞(MC)がサンプルから分離される。MCには、T細胞およびAPCが含まれる。従って、本方法では、分離されたMC中に存在するAPCは、T細胞にペプチドを提示することができる。もう一つの実施形態において、T細胞だけ、例えば、CD4 T細胞だけ、またはCD8 T細胞だけをサンプルから精製することができる。PBMC、MCおよびT細胞は、当技術分野で周知の技法、例えば、Lalvani et al (1997) J. Exp. Med. 186, p859-865に記載の技法を用いて分離することができる。
【００２６】
好ましくは、アッセイに使用されるT細胞は、未処理のサンプルもしくは希釈されたサンプルの形態であるか、またはex vivoで直接使用される新たに単離されたT細胞(例えば、新たに単離されたMCもしくはPBMCの形態のT細胞)である。すなわち、それらは、本方法に使用する前に培養されていない。しかしながら、T細胞は、使用前に、例えば、1種以上のペプチド、および一般的にはこのほかに外因性の増殖を促進するサイトカインの存在下で培養することが可能である。培養中、ペプチドは、典型的には、本方法で使用されるAPCのようなAPCの表面上に存在する。T細胞を前培養すると、本方法の感度が増大し得る。かくして、T細胞を短期細胞系などの細胞系に変換することができる(例えば、Ota et al (1990) Nature 346, p183-187に記載の細胞系)。
【００２７】
本方法において一般に存在するAPCは、T細胞と同じ宿主に由来するものであってもよいし、異なる宿主に由来するものであってもよい。APCは、天然に存在するAPCであってもよいし、人工のAPCであってもよい。APCとは、T細胞にペプチドを提示することのできる細胞である。それは、典型的には、B細胞、樹枝状細胞またはマクロファージである。それは、典型的には、T細胞と同じサンプルから分離され、そして典型的には、T細胞と同時に精製される。この場合、APCは、MCまたはPBMC中に存在していてもよい。APCは、典型的には、新たに単離されたex vivo細胞または培養細胞である。それは、短期細胞系または固定化細胞系のような細胞系の形態であってよい。APCは、その表面上で未結合の（empty）MHCクラスII分子を発現してもよい。
【００２８】
典型的には、本方法では、サンプルから誘導されたT細胞を、試験に用いるべく意図されたすべてのペプチド(すなわち、ペプチドのプール)と一緒にアッセイに供することができるか(適合パネル)、またはT細胞を分けて、それぞれ1種以上のペプチドを含有する個別のアッセイに供することができる。好ましくは、本方法をin vitroまたはin vivoの形態で行う場合、少なくとも配列番号1で表されるペプチドまたはその類似体が使用される。典型的には、配列番号2、3、4、5および6、好ましくは更に7および／または8、ならびに一実施形態では更に9および／または10および／または11で表される1種以上またはすべてのペプチドもまた本発明の方法で使用され、その結果、感度の増大した方法が提供される。もう一つの実施形態では、配列番号1、2、3、4、5、6、8および9で表されるペプチドだけが本方法で使用される。
【００２９】
本発明はまた、同時個別使用または逐次使用を目的として(例えば、in vivo使用を目的として)、本明細書中に記載の2種以上の任意のペプチド(例えば、本明細書中に記載の任意の組み合わせ)などの複数種のペプチドを提供する。
【００３０】
一実施形態では、ペプチドそのものが、T細胞およびAPCを含むアッセイに直接供される。先に述べたように、T細胞およびAPCは、このようなアッセイにおいてMCの形態をとることが可能である。APCによる提示を必要とすることなくT細胞によって認識可能なペプチドを用いる場合、APCは不要である。MHC分子に結合される元のペプチドを模倣した類似体は、そのようなペプチドの例である。
【００３１】
一実施形態において、ペプチドは、T細胞の不在下でAPCに提供される。次に、このAPCは、典型的にはT細胞の表面にペプチドを存在できるようにした後で、T細胞に提供される。ペプチドはAPCの内部に取り込み、そして提示するようにしてもよいし、APCの内部に進入させることなく表面上に取り込んでもよい。
【００３２】
ペプチドをT細胞に接触させる時間は、ペプチドの認識を調べるのに用いられる方法に依存して変化する。典型的には、105〜107個、好ましくは5×105〜106個のPBMCが各アッセイに供される。ペプチドがアッセイに直接供される場合、その濃度は、10-1〜103μg/ml、好ましくは0.5〜50μg/mlまたは1〜10μg/mlである。
【００３３】
典型的には、ペプチドと一緒にT細胞をインキュベートとする時間の長さは、4〜24時間、好ましくは6〜16時間である。ex vivo PBMCを使用する場合、37℃において、10μg/mlのペプチド中で0.3×106個のPBMCを12時間でインキュベートできることが判明した。
【００３４】
T細胞がペプチドを認識するか否かの判定は、T細胞へのペプチドの結合を測定することによって行うことが可能である。典型的には、ペプチドに結合するT細胞は、この結合に基づいて、例えば、FACS装置を用いて、選別することが可能である。ペプチドを用いて選別された細胞の出現頻度が「対照」の値を超えた場合、ペプチドを認識するT細胞が存在しているとみなされるであろう。抗原感作後のT細胞の出現頻度は、一般的には、106個中1個〜103個中1個であり、従って、選別された細胞が、抗原感作後のT細胞であるか否かを判定することができる。
【００３５】
T細胞によるペプチドの認識の判定は、in vivoで行うことが可能である。典型的には、ペプチドを宿主に投与し、次いで、ペプチドの認識を示唆する応答を測定することが可能である。一実施形態において、ペプチドは、典型的にはマントー試験と同じように皮内投与される。ペプチドは表皮投与してもよい。ペプチドは、典型的には、注射による場合のように針を用いて投与されるが、バリスティック法のような他の方法、例えば、核酸を送達するのに使用されてきたバリスティック法により投与することも可能である。EP-A-0693119には、ペプチドを投与するのに一般に使用可能な方法が記載されている。典型的には、0.001〜1000μg、例えば、0.01〜100μgまたは0.1〜10μgのペプチドが投与される。
【００３６】
このほか、in vivoでペプチドを提供可能な薬剤を投与することができる。この場合、ペプチドを発現可能なポリヌクレオチドを、典型的にはペプチドの投与に対して先に述べたいずれかの方法で投与することができる。このポリヌクレオチドは、典型的には、本発明によって提供される以下に記載のポリヌクレオチドの特性のいずれかを有している。ペプチドはin vivoでポリヌクレオチドから発現され、そしてin vivoでのペプチドの認識が測定される。典型的には、0.001〜1000μg、例えば、0.01〜100μgまたは0.1〜10μgのポリヌクレオチドが投与される。
【００３７】
in vivoでのペプチドの認識は、典型的には、DTH応答の発生によって示唆される。これは、一般的には、ペプチドの投与部位を目視検査して、炎症の存在、例えば、硬化、紅斑または水腫の存在を調べることによって測定される。
【００３８】
本方法に使用可能な類似体は、それに対応する配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または11で表されるペプチドを認識するT細胞受容体に結合することができる。従って、一般的には、類似体をそれに対応するペプチドの存在下で、典型的には、更にAPCの存在下でT細胞に添加した場合、類似体は、それに対応するペプチドの認識を阻害する。このT細胞受容体への類似体の結合は、標準的な技法により試験することができる。例えば、ペプチドを認識することが分かっているT細胞からT細胞受容体を単離することができる(例えば、本発明の方法を用いて)。次に、類似体に結合する物質、例えば、類似体に対する抗体への類似体の結合をT細胞受容体が阻害するか否かを調べることによって、類似体がT細胞受容体に結合することを実証することができる。典型的には、類似体は、このような結合阻害アッセイでは、MHC分子中に結合する。
【００３９】
典型的には、類似体は、T細胞受容体へのペプチドの結合を阻害する。この場合、類似体の存在下でT細胞受容体に結合することのできるペプチドの量は減少する。なぜなら、類似体はT細胞受容体に結合することができるため、T細胞受容体への結合に対してペプチドと拮抗するからである。
【００４０】
上記の結合実験に使用されるT細胞は、マイコバクテリウム感染症に罹患している患者から、例えば、本発明の方法を利用して、単離することができる。ESAT-6全体は、ペプチドを認識するT細胞受容体に結合することができないので、「類似体」という用語に包含されない。
【００４１】
類似体の他の結合特性もまた、ペプチドのものと同じである。従って、典型的には、類似体は、ペプチドが結合するときと同じMHCクラスII分子に結合する。配列番号1で表されるペプチドの類似体は、典型的には、HLA-DR1およびHLA-DR7に結合する。類似体は、典型的には、ペプチドに特異的な抗体に結合するので、このような抗体へのペプチドの結合を阻害する。
【００４２】
類似体は典型的にはペプチドである。それは、それに対応する配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または11のうちの一つで表される元のペプチドとの相同性を有していてよい。もう一つのペプチドに相同的なペプチドは、典型的には、少なくとも15個、好ましくは少なくとも30個、例えば、少なくとも40、60もしくは100個またはそれ以上の隣接アミノ酸の領域にわたり、もう一つのペプチドに対して少なくとも70%の相同性、好ましくは少なくとも80%または90%、より好ましくは少なくとも95%、97%または99%の相同性を有する。タンパク質の相同性を測定する方法は、当技術分野で周知であり、本発明に関して、相同性は、アミノ酸同一性(「ハードな相同性（hard homology）」と呼ばれることもある)に基づいて計算される。例えば、UWGCGパッケージには、相同性を計算するのに使用可能なBESTFITプログラムが用意されている(例えば、そのデフォルト設定で使用する) (Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395)。
【００４３】
相同性ペプチドは、典型的には、置換、挿入または欠失により、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8個またはそれ以上の置換、欠失または挿入により差異を生じており、こうした差異は、NもしくはC末端または配列中の任意の他の位置で生じうる。置換は、好ましくは「保存的」である。これらは、以下の表に従って定義される。第二列の同一の枠内のアミノ酸、および好ましくは第三列の同一の行内のアミノ酸は、互いに置換可能である。
【００４４】
【００４５】
典型的には、類似体ペプチドには、天然の翻訳後改変または人工的な改変であってよい1個以上の改変が含まれる。改変により、アミノ基、アセチル基、ヒドロキシ基もしくはハロゲン(例えば、フッ素)基または炭水化物基などの化学的部分を(典型的には、水素の置換、例えば、C-H結合の置換によって)提供することが可能である。典型的には、改変は、NもしくはC末端に存在する。
【００４６】
類似体には、1種以上の非天然アミノ酸、例えば、天然アミノ酸と異なる側鎖を有するアミノ酸が含まれていてもよい。一般的には、非天然アミノ酸は、N末端および／またはC末端を有するであろう。非天然アミノ酸は、L-アミノ酸であってよい。
【００４７】
類似体は、典型的には、元のペプチドと実質的に同じような形状、サイズ、可撓性または電子配置を有する。
【００４８】
一実施形態において、類似体は、MHCクラスII分子に結合した元のペプチドであるかまたはそれを模倣したものである。類似体は、互いに会合または結合した2、3、4個またはそれ以上のMHCクラスII分子に結合した元のペプチドであってもよいし、それを模倣したものであってもよい。これらのMHC分子は、ビオチン/ストレプトアビジンをベースとした系を用いて互いに結合させることが可能であり、この場合、典型的には、2、3または4個のビオチンで標識化されたMHC分子は、ストレプトアビジン部分に結合する。この類似体は、典型的には、ペプチド/MHCクラスII複合体が該複合体に特異的なT細胞受容体または抗体に結合するのを阻害する。類似体は、典型的には、抗体または抗体のフラグメント、例えば、Fabまたは(Fab)2フラグメントである。
【００４９】
固形担体に類似体を固定してもよく、この場合、特に、MHC分子に結合したペプチドを模倣した類似体が用いられる。
【００５０】
類似体は、典型的には、計算手段によりデザインされ、次いで、当技術分野で周知の方法を用いて合成される。このほか、化合物のライブラリーから類似体を選択することも可能である。ライブラリーは、組合せライブラリー（combinatorial library）または展示ライブラリー（display library）、例えば、ファージ展示ライブラリーであってよい。化合物のライブラリーは、元のペプチドが結合するMHC分子のようなMHCクラスII分子に結合した形態でディスプレイライブラリー中で発現可能である。類似体は、一般的には、元のペプチドの結合特性を模倣する能力に基づいてライブラリーから選択される。この場合、元のペプチドを認識するT細胞受容体または抗体に結合する能力に基づいて選択を行ってもよい。
【００５１】
本発明はまた、1種以上のペプチドまたは類似体と、場合により、T細胞がペプチドを認識するか否かを検出する手段とを含む、本方法を実施するためのキットを提供する。典型的には、ペプチドは、同時使用、個別使用または逐次使用を行うべく提供される。典型的には、認識を検出する手段は、上記の技法に基づく検出を可能にするかまたは助長する。
【００５２】
従って、この手段は、認識後にT細胞により分泌された物質の検出を可能にするものであってよい。この場合、キットには更に、この物質に特異的な結合剤、例えば、抗体が含まれていてもよい。この薬剤は、典型的には、IFN-γに特異的である。薬剤は、典型的には、固形担体に固定されている。このことは、この物質が、薬剤に結合した後、それを分泌したT細胞の近くに残存するであろうことを意味する。かくして、物質/薬剤複合体の「スポット」が担体上に形成され、そして各スポットは、該物質を分泌しているT細胞を表すことになる。スポットの定量および典型的には対照との比較を行うことによって、ペプチドの認識を調べることが可能になる。
【００５３】
キットにはまた、物質/薬剤複合体を検出する手段が含まれていてもよい。物質に結合させた後、薬剤そのものに色変化のような検出可能な変化を起こしてもよい。このほか、スポットの測定を可能にすべく、検出を目的に直接的または間接的に標識化された第二の薬剤を物質/薬剤複合体に結合させてもよい。先に述べたように、第二の薬剤は、物質に特異的であってもよいが、その結合の対象となる物質上の位置は、第一の薬剤の場合と異なる。
【００５４】
固定化担体は、ウェルを有するプレート、例えば、マイクロタイタープレートであってよい。従って、プレート内の個別のウェル中で各アッセイを行うことができる。
【００５５】
キットにはこのほかに、検出段階で使用すべく、T細胞用培地、検出薬剤または洗浄用緩衝液が含まれていてもよい。キットには更に、サンプルからの分離、例えば、サンプルからのPBMCまたはT細胞の分離を行うのに好適な薬剤が含まれていてもよい。サンプルの成分の分離をまったく必要とすることなくサンプル中のT細胞を直接検出できるように、キットをデザインしてもよい。
【００５６】
キットには、ペプチドの投与、例えば、皮内投与または表皮投与を可能にする器具が含まれていてもよい。典型的には、このような器具は、1本以上の針を備えている。この器具により、ペプチドのバリスティック送達を可能にしてもよい。キット中のペプチドは、医薬組成物の形態であってよい。
【００５７】
キットにはまた、陽性対照または陰性対照のような対照が含まれていてもよい。陽性対照を用いて検出系を試験できるようにしてもよい。この場合、陽性対照は、典型的には、上記の方法のいずれにおいてもペプチドの認識を模倣するものである。典型的には、in vitroで認識を調べるようにデザインされたキットでは、陽性対照はサイトカインである。ペプチドの認識をin vivoで検出するようにデザインされたキットでは、陽性対照は、ほとんどの個体が応答を示すと考えられる抗原であってよい。
【００５８】
キットにはまた、宿主に由来するT細胞を含有するサンプル、例えば、血液サンプルを採取する手段が含まれていてもよい。キットには、宿主に由来するサンプルから単核細胞またはT細胞を分離する手段が含まれていてもよい。
【００５９】
本発明はまた、配列番号1、2、4、6、7、8、9、10もしくは11の配列を有するペプチドまたはその類似体を提供する。本発明は、1種以上のペプチドを典型的には先に記載した組み合わせで含む診断用の生成物またはパネルを提供する。この生成物は、典型的には、医薬組成物のような組成物である。
【００６０】
本発明はまた、配列番号1、2、4、6、7、8、9、10もしくは11の配列を有するペプチドまたはその類似体を提供するように発現することのできるポリヌクレオチドを提供する。典型的には、ポリヌクレオチドは、DNAまたはRNAであり、そして一本鎖または二本鎖である。従って、ポリヌクレオチドには、配列番号1、2、4、6、7、8、9、10または11の配列をコードする配列が含まれる。このコード配列の5’側および3’側に、本発明のポリヌクレオチドは、ESAT-6遺伝子中のこれらの配列の5’側および3’側にある配列またはコドンと異なる配列またはコドンを有している。従って、本発明のポリヌクレオチドには、配列番号1、2、4、6、7、8、9、10または11で表されるフラグメントをコードする配列を除いて、ESAT-6の全体またはESAT-6のフラグメントをコードする配列は含まれていない。
【００６１】
ペプチドをコードする配列の5’側および／または3’側に、ポリヌクレオチドはコード配列または非コード配列を有する。コード配列の5’側および／または3’側の配列には、ペプチドをコードする配列の発現、例えば、転写および／または翻訳を助長する配列が含まれていてもよい。ポリヌクレオチドは、原核細胞中または真核細胞中でペプチドを発現できるものであってよい。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、ヒト、霊長類または齧歯動物の細胞のような哺乳動物の細胞中でペプチドを発現することができる。
【００６２】
ポリヌクレオチドは、複製可能なベクター中に組み込んでもよい。このようなベクターは、好適な細胞中で複製できる。該ベクターは、発現ベクターであってよい。このようなベクターの場合、本発明のポリヌクレオチドはポリヌクレオチドの発現を誘導できる制御配列に機能しうる形で連結される。ベクターには、アンピシリン耐性遺伝子のような選択可能なマーカーが含まれていてもよい。
【００６３】
本発明のポリヌクレオチド、ペプチドまたは抗体(以下を参照されたい)、あるいは本発明の方法に用いられる薬剤(例えば、T細胞から分泌された物質の検出に用いる薬剤)は、検出可能な標識を有していてよい。場合により光学的拡大手段を利用して目視検査により分泌物質を検出することを可能にする検出可能な標識が好ましい。このような系は、基質中で色調変化を起こす酵素標識、例えば、基質中で色調変化を起こすアルカリホスファターゼに基づくものが典型的である。このような基質は、例えばBioRadなどから市販されている。このほかの好適な標識としては、ペルオキシダーゼのような他の酵素、もしくはビオチンのようなタンパク質標識、または32Pもしくは35Sのような放射性同位元素が挙げられる。以上の標識は、公知の技法を用いて検出可能である。
【００６４】
本発明のポリヌクレオチド、ペプチドまたは抗体(以下を参照されたい)は、実質的に精製された形態であってよい。それらは、実質的に単離された形態であってよく、この場合、一般的には、調製物中に、ポリヌクレオチド、ペプチドまたは抗体を、(例えば、約または少なくとも)90%、具体的には(例えば、約または少なくとも)95、97もしくは99%含むであろう。ペプチドでない(この用語が通常の意味で定義された場合)実質的に単離されたペプチドは、一般的には、調製物の乾燥重量の(例えば、約または少なくとも)90%、具体的には(例えば、約または少なくとも)95、97もしくは99%を占める。ポリヌクレオチドまたはペプチドは、典型的には、他の細胞成分から実質的に遊離しているか、または他のマイコバクテリウム細胞成分から実質的に遊離している。ポリヌクレオチドまたはペプチドは、本発明の方法において、このような実質的に単離、精製または遊離した形態であってよく、あるいはキット中において、このような形態で存在させてもよい。
【００６５】
人体または動物体を対象として実施される診断の方法への使用のためにペプチドまたはペプチドの任意の組み合わせ(例えば、本明細書中に記載の組み合わせ)が提供される。ペプチドの組み合わせは、該方法において、同時に、個別に、または連続的に使用するために提供される。
【００６６】
ペプチドまたはポリヌクレオチドは、ペプチドまたはポリヌクレオチドと、製薬上許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物の形態であってよい。好適な担体および希釈剤としては、等張生理食塩溶液、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水が挙げられる。典型的には、その組成物は、皮内投与または上皮投与あるいはバリスティック(ballistic)法により適用するために処方される。従って、バリスティック送達のための担体粒子とペプチドまたはポリヌクレオチドを会合させてもよい。
【００６７】
本発明のペプチドは、標準的な合成化学の技法を用いて、例えば、自動合成装置を用いて作製可能である。
【００６８】
ペプチドは、典型的には、より長いポリペプチド、例えば、融合タンパク質から作製される。このポリペプチドには、典型的には、ペプチドの配列が含まれている。ペプチドは、例えば、プロテアーゼなどを用いてポリペプチドを加水分解するか、またはポリペプチドを物理的に破壊することによって、ポリペプチドから得てもよい。ポリペプチドは、典型的には、ESAT-6であり、遺伝子組換え技術により発現させたものでよい。
【００６９】
ペプチドはまた、ポリヌクレオチドの発現を含むプロセスにおいて、例えば、本発明のポリヌクレオチドを発現させることによって、調整することもできる。発現されたポリペプチドを更に処理することにより、本発明のペプチドを生成してもよい。この場合、先に記載の発現ベクターで形質転換またはトラスンフェクトした細胞を、ペプチドの調整に使用できるペプチドまたはポリペプチドを発現する条件下で培養することを含むプロセスにおいて、ペプチドを調整してもよい。本発明のポリヌクレオチドは、標準的な技法を用いて、例えば、合成装置を用いて調整可能である。
【００７０】
本発明はまた、ペプチドに特異的な抗体を作製するための本発明のペプチドまたは類似体の使用を提供する。この抗体または本明細書中に記載のあらゆる抗体は、宿主動物中で抗体を発生させることによって、産生させてもよい。このような抗体は、ペプチドに特異的であるか、または抗体に結合する先に記載した物質に特異的であろう。該ペプチドまたは該物質は、本明細書中では以下「免疫原」と記す。モノクロナール抗体およびポリクロナール抗体を作製する方法は周知である。ポリクロナール抗体を作製する方法には、好適な宿主動物、例えば、実験動物を免疫原で免疫すること、および血清から免疫グロブリンを単離することが含まれる。従って、動物に免疫原を接種し、続いて動物から血液を採取し、そしてIgG画分を精製してもよい。モノクロナール抗体を作製する方法には、所望の抗体を産生する細胞を不死化することが含まれる。接種された実験動物に由来する脾細胞を腫瘍細胞に融合することによって、ハイブリドーマ細胞を作製できる(Kohler and Milstein (1975) Nature 256, 495-497)。
【００７１】
所望の抗体を産生する不死化細胞は、従来の手順により選択可能である。ハイブリドーマは、培養により増殖させてもよいし、あるいは腹水を生成するように腹腔内に注入するかまたは同種宿主もしくは免疫学的易感染性宿主の血流中に注入してもよい。ヒト抗体は、ヒトリンパ球のin vitro免疫化、それに続くEpstein-Barrウイルスを用いたリンパ球の形質転換によって調製可能である。
【００７２】
モノクロナール抗体とポリクロナール抗体の両方を産生する目的では、実験動物としてヤギ、ウサギ、ラットまたはマウスが好適である。所望により、免疫原が例えば一つのアミノ酸残基の側鎖を介して好適な担体に結合されているコンジュゲートとして免疫原を投与してもよい。担体分子は、典型的には、生理学的に許容される担体である。得られた抗体を単離し、所望により、精製してもよい。
【００７３】
以下の実施例により本発明を具体的に説明する。
【００７４】
実施例 1
研究対象被験者
患者および対照者は、Northwick Park and St Mark’s NHS Trust, LondonおよびOxford Radcliffe NHS Trust, Oxfordの病院において、1997年10月から16ヶ月間にわたり見込みのある人を対象に募集した。各被験者からヘパリン添加血液サンプルを1回採取した。
【００７５】
臨床所見とX線撮影結果とが一致し、結核菌(M.tuberculosis)に対する培養で陽性であることが1個以上の臨床検体から細菌学的に確認された患者を結核患者として募集した。47人中29人の患者(62%)は、瀉血の時点で治療を受けていないかまたは治療を受けた期間が1ヶ月未満であり、残りの患者は、治療期間がそれよりも長かった。
【００７６】
対照の患者は、民族性、年齢(4歳以内)および性別が他のグループと一致するように選び、また、対照の患者には、広範にわたる感染、炎症、肉芽腫、自己免疫および新生物の状態を有する個人が含まれていた(表4)。これらの中には、結核および結核のように原因不明の発熱を起こす可能性のある他の疾患と臨床的に区別することが困難である可能性のある病気が含まれていた。過去に結核を患ったことのある患者、および結核であることが判明している者に最近接触したことが報告された患者は、除外した。結核の患者も対照の患者も、HIV感染を示す臨床上の徴候はなかった。
【００７７】
実施例 2
ELISPOT アッセイを用いた結果
ELISPOTアッセイを用いて、ex vivoで抗原感作後のESAT-6特異的CD4 T細胞の検出を行った。固相f-moc化学(Research Genetics, Alabama,USA and Zinsser Analytical Frankfurt, Germany)により、ESAT-6分子の長さをカバーする17種のペプチドを合成した。各ペプチドは、アミノ酸15個の長さであり、隣のペプチドと10残基の重なりを有していた。マススペクトロメトリーにより同一性を確認し、そして高速液体クロマトグラフィーにより純度を確認した。8種のペプチドは、エピトープとして頻繁に確認されたものであった。ESAT-6に由来する17種のペプチドのいずれかに応答を示したすべての被験者が、同様に、配列番号1〜8で表される8種のペプチドのパネルの少なくとも1つに応答を示した。タンパク質の配列すべてを公開しているSwissProtデータベースおよび翻訳Gen-Bankデータベースを用いて配列相同性を調べた結果、これらのペプチドの配列が結核菌(M.tuberculosis)複合体のESAT-6タンパク質に比類なく特定されることが確認された。このパネル中の1種以上のペプチドに対する応答を個別に試験して評価したところ、結核菌(M.tuberculosis)の感染が示唆された。
【００７８】
患者は配列番号9〜11で表されるペプチドに対しても応答を示すことが判明した。
【００７９】
単一細胞 IFN- γ放出に対する ex vivo ELISPOT アッセイ : 末梢血由来の循環性 ESAT-6 ペプチド特異的 T 細胞の計数
サンドイッチ捕捉ELISAの原理に基づいて、ELISPOTアッセイでは、比較的高濃度のうちに、分泌したT細胞のすぐ近くでIFN-γの捕捉および検出が行われる。従って、発色後、得られた各スポットは、個々の抗原特異的IFN-γ分泌T細胞またはスポット形成細胞(SFC)の「フットプリント」を表す。IFN-γに対するex vivo ELISPOTアッセイは、事前のin vitro刺激ステップを必要とすることなく末梢血から直接的に抗原特異的T細胞を検出するのに十分な感度がある(Lalvani et al (1997) J. Exp. Med. 186 p859-865)。更に、ex vivo ELISPOTアッセイでは迅速なエフェクター機能を有する抗原特異的T細胞が計数されるので、必要なインキュベーション時間はごく僅かである。
【００８０】
Lalvaniらの文献(上記を参照されたい)に記載の標準的な手段により、12 mlの血液から末梢血単核細胞(PBMC)を分離し、そしてL-グルタミン2 mM、ペニシリン100iu/mlおよび10%熱不活性化ウシ胎仔血清(Sigma, St. Louis, MO, USA)を補充したRPMI中に懸濁させた(R10)。
【００８１】
抗IFN-γ mAB 1-D1K (MABTECH, Stockholm)が15μg/mlでプレコートされた96ウェルのポリビニリデンジフルオリド(PVDF)裏打ち(backed)プレート(Millipore)をRPMI培地1640で洗浄し、そして室温において1時間にわたりR10でブロックした。
【００８２】
プレコートされたプレートに3×105個のPBMCを100μl R10/ウェルで添加し、そして最終濃度が10μg/mlとなるようにペプチドを個別に各ウェルに添加した。また、PPD (Batch RT49, Staatens Seruminstitut, Copenhagen, Denmark)を20μg/mlで添加した。陽性対照ウェルにはフィトヘマグルチニン(ICN Biomedicals, Aurora, OH, USA)を5μg/mlで添加し、そして陰性対照ウェルにはペプチドをまったく添加しなかった。
【００８３】
37℃、5% CO2で分析物を6〜12時間インキュベートし、そしてPBS 0.05% Tween-20 (Sigma, St. Louis, MO, USA)で6回洗浄することによって停止させた。次に、1μg/mlのビオチニル化抗IFN-γ mAb 7-B6-1ビオチン(Mabtech, Stockholm, Sweden)を100μl添加した。室温で2時間インキュベートした後、再びプレートを6回洗浄し、ストレプトアビジン-アルカリフォスファターゼコンジュゲート(Mabtech, Stockholm, Sweden)の1:1000希釈液をウェルに添加し、そしてプレートを更に1時間インキュベートした。次に、再びウェルを6回洗浄し、そして脱イオン水で1:25に希釈された発色性アルカリホスファターゼ基質(Biorad, Hercules, CA, USA)を添加した。30分後、水道水で洗浄することにより比色反応を停止させ、そしてプレートを乾燥させた。
【００８４】
試験ウェルの方が陰性対照ウェルよりもIFN-γ SFCが多く、少なくとも5個は含まれており、しかもこの数が陰性対照ウェル中の数の少なくとも2倍であるときに限り、応答が陽性であると評価した。このカットオフポイント(PBMC 3×105個あたりIFN-γ SFC 5個)は、下側検出限界値がPBMC 100万個あたりペプチド特異的T細胞17個、すなわち、1/59,000 PBMCであることに相当する。アッセイの実施者は、患者の結核の状態について分からなかったわけではないが、SCFの読み取りは定量的であり、陽性応答に対する我々の判定基準は厳格であり、しかも陰性対照でのSFCのバックグラウンド応答は常に3個未満であったので、陽性応答は客観的かつ明瞭であった。いずれの場合においても、陽性応答および陰性応答は、拡大鏡を用いて正確に計数する前にプレートを直接調べることによって直ちに識別できた。
【００８５】
活動性(active)結核の診断に適用する際、ESAT-6ペプチドに基づく試験の確度を計算し、そして感度、特異性(標準的な二項式から計算した信頼区間)および尤度比として表現した。次に、後者を、試験前に結核であると診断できる確率が20%であるとみなされる典型的な臨床シナリオに適用した。
【００８６】
また、上記のアッセイでペプチドのプールを用いたところ、これらのペプチドを別々のアッセイで個別に試験した場合と同じように有効に応答が検出されることが判明した。
【００８７】
実施例 3
患者および対照の人工統計学的および臨床的特徴
英国では、結核の患者は、広範にわたり民族的に混成である結核の特徴を示し、インド亜大陸(ISC)から来た人々および黒人の場合に罹患率が高い(表2)。民族学的血統、年齢および性別の比率をよく一致させるように対照の患者を選んだ(表2)。また、対照の患者の診断結果は表4に列挙されている。結核の患者は、結核菌(M.tuberculosis)によって引き起こされる臨床的に広範にわたる疾患を示し、47人中22人は肺外結核に罹患していた(表3)。肺結核の患者では、25人中6人が抗酸性桿菌に対して喀痰塗抹陰性であった。従って、47人中28人(60%)の患者に対しては、喀痰顕微鏡法による直接予測診断はできなかった。
【００８８】
血中の ESAT-6 特異的 T 細胞の検出による結核菌 (M.tuberculosis) 感染の迅速診断
IFN-γに対するex vivo ELISPOTアッセイにおいて、47人中45人(96%)の結核患者が、表1に示されている8種のペプチドのパネル中の一つ以上に応答した。ES1に応答した患者の割合は異常に高かった。本発明者らは、このペプチドがHLA DR1およびDR7に結合することを示した。
【００８９】
ESAT-6ペプチド特異的IFN-γ分泌T細胞の出現頻度は一般的に高く、その中央値はPBMC 100万個あたりESAT-6ペプチド特異的T細胞200個であった(四分位間の範囲(inter-quartile range)は105〜596個)。表1中の8種のペプチドのそれぞれに特異的なIFN-γ SFCは、主にCD4 T細胞である。なぜなら、T細胞系は、これらのペプチドのそれぞれに対してin vitroで生成され、ペプチド特異的応答は、CD4 T細胞の特異的免疫磁気デプリーションによって除去されたからである。ESAT-6ペプチド特異的CD8 T細胞もまた、CD8エピトープを含有するパネル中のペプチド(例えば、ES14)により検出される。
【００９０】
結核症を有していない対照では、47人中4人だけが、8種のESAT-6由来のペプチドのパネル中の一つ以上に応答した。これらの4人の応答者におけるペプチド特異的IFN-γ分泌T細胞の出現頻度は、結核患者の場合に見られる出現頻度と類似していた。残りの対照はいずれも、すべてのペプチドに対してまったく応答しなかった。ESAT-6の全長をカバーする17種のペプチドの拡張セットを用いた場合、8種の大まかな免疫原性エピトープのパネルを用いて観測された結果と同等な結果が得られた。
【００９１】
2人の非応答者は、疾患の進行した肺結核患者であり、2人共、治療前に試験を行った。それらの臨床結果について、考察の中で概説する。応答を示した4人の対照のうち、2人は急性肺炎であり、1人は急性気管支炎であり、そして4人目は蜂巣炎であった。また、4人の患者はいずれも、IFN-γに対するELISPOTアッセイにおいて、PPDに対する強いex vivo応答を示したため、ツベルクリンに感作されていることが示唆される。
【００９２】
ESAT-6 特異的 T 細胞応答と PPD に対する応答との比較
1 TUのPPD (NHS供給品)を皮内接種することにより、26人の結核患者に対してツベルクリン皮膚試験を行った。72時間後の皮膚硬結を物差しで測定し、直径が5mm以上の硬結は慣例に従って陽性とみなした。これらの患者のうち、18人(69%)だけは、TSTに関して陽性の結果を示した。IFN-γに対するex vivo ELISPOTアッセイでは、これに対して、３分の１多く、すなわち、26人中24人(92%)が陽性応答を示し、そして全体では、ex vivo ELISPOTで、47人中45人(96%)が陽性応答を示した。対照の患者はツベルクリン皮膚試験を受けなかったが、ex vivo ELISPOTアッセイで、47人中26人(55%)がPPDに対して陽性応答を示したため、これらのCD4 T細胞はPPD中の抗原に過去に感作されていたことが示唆される。
【００９３】
IFN-γに対するESAT-6ペプチドベースのELISPOTアッセイの臨床的有用性
本研究におけるこのアッセイの性能特性を表5に示す。これらの尤度比を見ると、試験前と試験後の確率の変化が大きいことが分かる。例えば、試験前に結核であると診断できる確率が20%であるとみなされる仮想的な患者に適用すると、試験結果が陽性の場合は陽性予測値が74%になり、そして試験結果が陰性の場合は陰性予測値が1%になるであろう。
【００９４】
考察
我々は、結核菌(M.tuberculosis)感染を迅速に検出するための非常に正確な血液試験を開発した。このex vivoアッセイの成功は、結核菌(M.tuberculosis)に極めて特異的な免疫原性の高い抗原を用いる抗原特異的T細胞の高感度な検出に基づいている。細菌学的に確認された活動性結核に対する診断試験として適用する場合、患者集団研究において、このアッセイは、96%の感度および91.5%の特異性を与える(表5)。結核患者は民族的に広範に混成しており、英国における結核の疫学を反映している。また、民族学的に対応させた対照の患者の中には、結核と区別することが困難である可能性のある多くの一般的な病気が含まれていた。従って、このアッセイの性能特性(表5)は、英国における臨床診療への一般的な適用が可能であると考えられる。この試験は、静脈血サンプル一つを必要とし、容易かつ迅速に行われ、特別な実験設備をまったく必要とせず、しかも翌日までに結果が得られるので、通常の病院の試験室にうまく適合すると考えられ、しかも容易に自動化しうる。
【００９５】
AFBに対するTSTおよび喀痰鏡検法は、一般的に結核の直接的予測診断を行うための唯一の試験である。TSTの感度は、この方法で試験した26人の結核患者では、わずか69%であり、ESAT-6に基づくex vivo ELISPOTの感度96%よりも著しく低い(p=0.002)。TSTには大きな制限が多数あることを考えると、ex vivo ELISPOTアッセイは、結核菌(M.tuberculosis)感染を迅速に検出する優れた手段であると考えられる。我々の一連の患者において、喀痰鏡検法ではわずか40%の患者が検出されたのに対して、ex vivo ELISPOTでは96%であり、また、後者では喀痰塗抹(sputum smear)陰性の肺結核の患者6人がすべて検出された。更に、喀痰鏡検法では、結核菌(M.tuberculosis)と非定型マイコバクテリウムとを識別できない。esat-6遺伝子は結核菌(M.tuberculosis)複合体、ミコバクテリウム・カンサシイ(M.kansasii)、ミコバクテリウム・マリヌム(M.marinum)およびミコバクテリウム・ズルゲイ(M.szulgei) (これらのうち、ミコバクテリウム・カンサイだけは、臨床的に結核と類似した病気を引き起こす可能性がある)に限定されるので、我々のESAT-6に基づく試験は、喀痰鏡検法よりも特異的であることは明らかであろう。
【００９６】
結核を診断することを目的とした様々な血液試験がこれまでに開発されてきたが、感度、特異性および定常的使用における簡便性が十分なものはない。血液学的アッセイは、ESAT-6と同じように種特異的である標的抗原が欠損しており、特に、急性の結核(肺結核、粟粒性結核および胸膜結核)では、これらのアッセイの感度が一般に満足すべきものではないという問題を抱えている。PBMC中の循環性結核菌(M.tuberculosis)複合体DNAのPCRが、結核を診断する方法として研究されてきた。肺結核の場合、感度は研究者により異なるが33%〜95%の範囲であり、細菌学的に確認された76人のHIV陰性患者からなる最も大きな系では、感度は41%〜27%であった。肺外結核の場合、血液に基づくPCRの感度は、わずか4〜27%であった。
【００９７】
47人中2人の結核患者は、ex vivo ELISPOTアッセイで応答を示さなかった。2人共、進行した疾患を有する肺結核患者であり、診断前の数ヶ月間にわたり重度に症候的であり、そしていずれも悪液質であった。20歳のアジア人男性1名は、胸膜の関与した拡延性喀痰塗抹陽性空洞性疾患を有しており、TSTにアネルギーを示し、他の22歳のアフリカ人女性1名は、喀痰塗抹陰性であり、X線撮影で気管支肺炎パターンを有し、そしてTSTに関して陽性であった。興味深いことに、両方の患者でリンパ球が減少していたが、両者共HIV陰性であり治療に対する応答は良好であった。慢性の進行した結核は非特異的な免疫抑制を引き起こす。この免疫抑制は、検出可能なESAT-6特異的IFN-γ分泌T細胞がこれらの患者に欠損していることが原因であると考えられるが、皮膚アネルギーと関連づけられることの多い重症の粟粒性疾患を有する4人の患者はいずれも、ex vivo ELISPOTアッセイで応答を示した。現時点では、なぜ上記2人の患者が応答を示さず真偽陰性(true false negative)を示すのかは明らかでない。
【００９８】
結核症に罹患していない対照患者47人中33人(70%)はBCG接種を受けていたにもかかわらず(傷跡の存在から示唆される)、47人中わずか4人だけがex vivo ELISPOTアッセイで応答を示し、そしてこのうち3人はBCG接種を受けていなかった。従って、このアッセイは、BCG接種者と結核菌(M.tuberculosis)感染患者の識別に成功した初めてのものである。応答を示した4人の対照患者はいずれも、結核を示唆する臨床的特徴もX線撮影における特徴も有しておらず、2人は急性肺炎であり、1人は急性気管支炎であり、そして1人は蜂巣炎であり、そして4人共、最も有効な抗生物質に対して応答を示した。また、4人の患者はいずれも、IFN-γに対するELISPOTアッセイにおいてPPDに対して強力なex vivo応答を示したことから、ツベルクリンに感作されていることが示唆される。重要な点として、4人全員が結核に関して地方病性の高い国の出身であったこと、3人がケニアから英国へのアジア系移民者であり(そして全員が定期的にケニアに戻ること)、ならびに4人目がエチオピアからの来訪者であったことが挙げられる。従って、この4人はいずれも結核菌(M.tuberculosis)に暴露される危険率が高かった。これとは対照的に、英国生まれの対照患者22人はいずれも陽性応答を示さなかった。4人の応答者は実際に結核菌(M.tuberculosis)に感染していたが明らかに活動性(active)疾患ではないと思われる。この場合、活動性結核の診断試験としてアッセイを適用すれば、これらの応答者は偽陽性を示すにもかかわらず、生物学的には真陽性であると考えられる。その理由としては、この試験では、結核菌(M.tuberculosis)感染が正確に検出されたためである。残念ながら、この結論は、正式に実証することはできない。なぜなら、暴露された無症候性接触者について準臨床的結核菌(M.tuberculosis)感染を確認する決定的な手段が存在しないからである。ESAT-6ペプチドとは対照的に、PPDに対するex vivo ELISPOT応答は、対照グループ全体にわたって一般的に見られたことから(47人中26人)、それらのCD4 T細胞が過去にPPD中の抗原にin vivoで感作されたことが示唆される。これは恐らく、BCG接種または周囲のマイコバクテリウムへの暴露の結果であると思われる。
【００９９】
ESAT-6に基づくex vivo ELISPOTが他の設定条件下で高度な感度および特異性を保持するかどうかを知るには、更なる研究が必要であろう。結核が風土病のようになっていて結核菌(M.tuberculosis)に潜在的に感染している健常者の割合が有意に高い国では、結核菌(M.tuberculosis)感作細胞免疫系の検出に基づくアッセイの特異性は、本研究の場合よりも低いと思われる。しかしながら、ex vivo ELISPOTの感度が高いということは、この方法を用いれば結核の診断を確実に行える可能性が存在することを意味する。結核が一般に初感染でありしかも急速に発症する子供の場合についてもこのアッセイの有効性を実証する必要があるだろう。ESAT-6特異的細胞免疫応答の動物での研究では、初感染の初期にESAT-6が特に顕著に認識されることが明らかになっている。従って、我々のアッセイは、成人の場合と同じように子供の場合にも有効であることが実証されるはずである。最後に、HIV感染結核患者を対象にした別の研究で、ex vivo ELISPOTを評価する必要がある。
【０１００】
実施例 4
健常接触者における CD4 T 細胞応答の検出
配列番号1〜8で示されるペプチドからなるパネルを用いて、喀痰塗抹陽性の肺結核を有する指標患者の健常家庭接触者26人における応答を検出した。接触者のうちの22人で応答が検出されたことから、このパネルは無症候性の結核菌(M.tuberculosis)感染の検出に必要な感度を有することが示唆される。
【０１０１】
また、26人の健常志願者(このうち22人がBCG接種を受けていた)についても試験を行ったが、いずれのペプチドにも応答を示さなかった。従って、このパネルを用いて、無症候性感染接触者と健常BCG被接種者とをうまく識別することが可能である。
【０１０２】
実施例 5
健常接触者における異なるパネルを用いた CD4 T 細胞応答の検出
先の実施例で使用したパネルとは異なるパネルを用いて、健常接触者におけるELISPOTアッセイにより応答を検出した。パネルは、配列番号1〜5、8および9で示されるペプチドで構成されていた。
【０１０３】
塗抹陽性の開放性肺結核を有する陽性Heaf試験のグレードが3または4である指標患者に対して、すべての接触者を長期間にわたり接触させた。接触者の1人は、工場で指標者と同じ部屋(および同じシフト)で仕事をしている。1人の接触者は、数日間、指標者と同じ病院病棟にいた。他のすべての接触者は、指標者と同じ家庭に住んでいる者であった。
【０１０４】
試験した接触者22人のうち20人がこのパネルに対して陽性であった。試験した接触者のうち15人がES1に対して陽性であった。
【０１０５】
実施例 6
パネルの感度と全 ESAT-6 を用いたときの感度との比較
結核を有する多くの患者は、ESAT-6に特異的なCD8 T細胞応答だけを示し、この抗原に対してCD4 T細胞応答を示さないことが判明した。診断試験において、ESAT-6は、CD4 T細胞に由来する応答だけを顕在化し、CD8 T細胞に由来する応答を顕在化しないので、このような患者(CD8 T細胞応答だけを示す患者)は、全ESAT-6に基づく診断試験を用いて検出できなかった。しかしながら、ペプチドは、CD4 T細胞およびCD8 T細胞に由来する応答を両方顕在化するので、本発明のペプチドを用いてこれらの患者を検出することが可能である。従って、このようなペプチドを用いると、診断試験の感度が高くなる。
【０１０６】
【表１】
Claims (25)
- ESAT-6を発現するマイコバクテリウムのヒトへの感染または該マイコバクテリウムのヒトへの暴露を判定する方法であって、
(i) ヒトに由来するT細胞の集団を、配列番号1で表されるペプチドに接触させるステップ、ならびに
(ii) 該T細胞集団のT細胞が該ペプチドを認識するか否かをin vitroで判定するステップ、
を含む、前記方法。 - 配列番号1で表されるペプチドに加え、配列番号2〜11で表されるペプチドから選択される1種以上のペプチドから構成されるペプチドパネルを利用する、請求項１に記載の方法。
- 少なくとも配列番号1〜8で表されるペプチドを利用する、請求項２に記載の方法。
- 配列番号9、10および11で表されるペプチドから選択される1種以上の更なるペプチドを利用する、請求項３に記載の方法。
- 前記T細胞のペプチドに対する認識を、T細胞に由来するサイトカインの分泌を判定することによって判定する、請求項１〜４のいずれか1項に記載の方法。
- T細胞からのIFN-γ分泌を判定する、請求項５に記載の方法。
- T細胞からのIFN-γ分泌を、分泌されたIFN-γをこのサイトカインに特異的な固定化抗体に結合させてから抗体/サイトカイン複合体の存在を検出することによって判定する、請求項６に記載の方法。
- T細胞が、末梢血から新たに単離されたex vivo細胞である、請求項１〜７のいずれか1項に記載の方法。
- T細胞を前記ペプチドと一緒にin vitroで前培養する、請求項１〜７のいずれか1項に記載の方法。
- T細胞を、配列番号1〜8で表されるペプチドのパネルに接触させる、請求項８または９に記載の方法。
- 配列番号9〜11のペプチドから選択される1種以上の更なるペプチドを追加的に含むためにパネルが拡張されている、請求項１０に記載の方法。
- ペプチドがプールされている、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の方法。
- ESAT-6を発現するマイコバクテリウムの存在の判定を、該マイコバクテリウムへの暴露が疑われる健康な接触者を対象に行う、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
- マイコバクテリウムが結核菌(M.tuberculosis)またはマイコバクテリウム・ボビス(M.bovis)である、請求項１〜１３のいずれか1項に記載の方法。
- ESAT-6を発現するマイコバクテリウムのヒトへの感染または該マイコバクテリウムのヒトへの暴露を判定するのに用いられる組成物を調製するための、配列番号1で表されるペプチドの使用であって、該判定が、該ヒトのT細胞が該ペプチドを認識するか否かを判定することを含む、前記使用。
- 配列番号1で表されるペプチドに加え、配列番号2〜11で表されるペプチドから選択される1種以上のペプチドから構成されるペプチドパネルを利用するものである、請求項１５に記載の使用。
- 少なくとも配列番号1〜8で表されるペプチドを利用する、請求項１６に記載の使用。
- 配列番号9、10および11で表されるペプチドから選択される1種以上の更なるペプチドを利用する、請求項１７に記載の使用。
- マイコバクテリウムが結核菌(M.tuberculosis)またはマイコバクテリウム・ボビス(M.bovis)である、請求項１５〜１８のいずれか1項に記載の使用。
- 請求項１〜１４のいずれか1項に記載の方法を実施するためのキットであって、配列番号1で表されるペプチドと、配列番号2〜11で表されるペプチドから選択される1種以上のペプチドとから構成されるペプチドパネルを含む、前記キット。
- IFN-γに対する抗体を含む、請求項２０に記載のキット。
- 抗体が固体担体に固定されており、該キットが抗体/IFN-γ複合体を検出する手段を含む、請求項２１に記載のキット。
- ESAT-6を発現するマイコバクテリウムのヒトへの感染または該マイコバクテリウムのヒトへの暴露を判定するのに用いられる組成物を調製するための、配列番号1で表されるペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用であって、該判定が、該ヒトのT細胞が該ペプチドを認識するか否かを判定することを含む、前記使用。
- 配列番号2〜11で表されるペプチドから選択される1種以上のペプチドをコードする1種以上のポリヌクレオチドをさらに使用する、請求項２３に記載の使用。
- ESAT-6を発現するマイコバクテリウムのヒトへの感染または該マイコバクテリウムのヒトへの暴露を判定するためのキットであって、該判定が、該ヒトのT細胞が配列番号1で表されるペプチドと配列番号2〜11で表されるペプチドから選択される1種以上のペプチドとを認識するか否かを判定することを含み、該キットが、配列番号1で表されるペプチドをコードするポリヌクレオチド、および配列番号2〜11で表されるペプチドから選択される1種以上のペプチドをコードする1種以上のポリヌクレオチドを含む、前記キット。
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